CZ280025B6 - Způsob imobilizace biomolekul - Google Patents

Abstract

Způsob imobilizace biomolekul na vodivém substrátu, při kterém se připravuje roztok alespoň jednoho druhu nanášené biomolekuly dostatečně pufrovaný k předcházení denaturace biomolekul a k dosažení stejného znaménka elektrického náboje. Do roztoku se ponoří biosensorová elektroda a elektroda s opačným nábojem, mezi oběma elektrodami se vytvoří potenciálový rozdíl menší než 1 V, přičemž se potenciál mění k udržení v podstatě konstantního proudu mezi elektrodami, dostatečného k vytvoření migrace biomolekul a k jejich nanášení na biosensorovou elektrodu v požadované tloušťce filmu.ŕ

Description

Způsob přípravy elektronické biosenzorové elektrody s biomolekulární složkou

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu imobilizace biomolekul na vodivém substrátu. Především se vynález týká způsobu elektrodepozice biomolekul, jako jsou enzymy a protilátky, na vodivém substrátu s následujícím chemickým sesítěnim biomolekul za vytvořeni ve vodě nerozpustné hmoty.

Dosavadní stav techniky

Imobilizace biomolekul na substrátu je důležitá pro četné běžné analytické nebo průmyslové účely využívající biomolekul. Imobilizací se převádějí typicky ve vodě rozpustné biomolekuly, jako jsou enzymy nebo protilátky, na komplexy ve vodě nerozpustné vázáním alespoň nějakých molekul na fyzikální nosičový materiál, nerozpustný ve vodě. Takto imobilizovaných biomolekul se často může používat pro četné účely beze změny jejich koncentrace nebo účinnosti v závislosti na čase. Imobilizace má tu přídavnou výhodu, že se biomolekuly mohou uchovávat jen ve specificky žádaných oblastech zařízení nebo čidla /=senzoru/ za minimalizace materiálových nákladů a za maximalizace zjistitelné biologické účinnosti .

Důležité analytické použiti imobilizovaných biomolekul, například enzymů, protilátek nebo glykoproteinú jako licitinů, je v biosenzorech, kterých se používá pro zjišťování přítomnosti nebo koncentrace vybraných fyziologických molekul jako výsledek vzájemného působení fyziologického ligandu a imobilizovaných biomolekul. Dosud bylo však obtížné přizpůsobit známé imobilizační techniky se zřetelem na použiti ve spojení s miniaturními elektrochemickými biosenzory, vyráběnými běžnými způsoby výroby polovodičů. Současné techniky z oblasti polovodičů umožňují výrobu čidla s povrchem tak malým, jako je 0,1 μη². Tento malý rozměr představuje při konstrukci čidla obtíže, protože výroba biosenzorů obecné vyžaduje ukládání biomolekuly jedině na povrchu pracovní elektrody, které se používá k monitorováni produktu enzymatické reakce. Biomolekuly, uložené na jiném povrchu biosenzoru, by reagovaly za vzniku produktu, který by nemohl být stanoven, čímž přicházejí nazmar často drahé biomolekuly.

Způsobem předcházení problémům při ukládání biomolekul je elektroforeza k podpoře migrace nabitých biomolekul, například proteinů, amfipatických lipidů nebo nukleinové kyseliny. Ve vhodném prostředí mají takové biomolekuly positivně nebo negativně nabitý podíl, který je přitahován na pole s opačným nábojem ve vytvořeném elektrickém poli. Migrace biomolekul v prostředí směrem k elektrodě s opačným nábojem, než má biomolekula a její ukládání na takové elektrodě je podporována vytvořením potenciálu v prostředí mezi dvěma elektrodami.

Způsoby elektroforetického ukládání popisuje například Ikariyama a kol., J. Elektrochem. Soc. , 136/6/, str. 702 až 706, 1939/. Při tomto popisovaném způsobu se současně ukládají platinové částice a glukosoxidasa jako enzym. Při hodnotě pH, při kte-1CZ 280025 B6 ré dochází normálně k platinizaci, má glukosoxidasa čistě pozitivní náboj, jelikož hodnota pH je nižší než její isoelektrický bod 4,3. Glukosoxidasa je proto přitahována k elektrodě s opačným nábojem spolu s ionty platiny. K podpoře stability uloženého enzymu se čidlo ponoří do roztoků albuminu a glutaraldehydu k sesítění molekul. Tento způsob však muže vést k desaktivaci enzymu, protože se pro podporu současného ukládáni enzymu používá poměrně nízké hodnoty pH.

Aizawa a kol., J. Chem. Soc. Japan /Nippon Kagaku Kaishi, 11, str. 2210 až 2213, 1987/ popisují vývoj způsobu elektrolytického ukládání glukosoxidasy. Glukosoxidasa se absorbuje na povrch platinové elektrody za řízeného potenciálu z vodného roztoku. Jako optimální podmínky pro ukládáni glukosoxidasy se uvádí 0,1 V, Ag/AgCl a pH 3. Maximální tloušťka, dosahovaná tímto způsobem, jako vrstvy tlusté 4 molekuly glukosoxidasy, což je ekvivalentní tloušťce filmu glukosoxidasy přibližně maximálně 56 χ 10~⁹ m. Způsob se zkoušel při hodnotách pH 3 až 9, přičemž se optimálního ukládáni dosáhlo při hodnotě pH 3. Mimořádné tenká vrstva, nanesená tímto způsobem, je nepřiměřená pro mnohé účely, kdy se vyžaduje vzájemné působení ligandu a biomolekuly nijak omezenou reakci. Dalším nedostatkem je omezená životnost a nová použitelnost tenkých vrstev imobilizovaných molekul.

Úkolem vynálezu je proto vyvinout způsob ukládáni a imobilizace poměrné tlusté vrstvy molekul na vodivém substrátu pro dosažení neomezeného působení ligandu a biomolekuly.

Úkolem vynálezu je také vyvinout způsob reprodukovatelného a přesného ukládání a imobilizace biomolekul na miniaturních elektronických čidlech. Také je úkolem vynálezu vyvinout způsob současného ukládání a imobilizace četných různých biomolekul na vodivém substrátu.

Přídavně je úkolem vynálezu vyvinout způsob ukládání a imobilizace biomolekul způsobem, který by vedl k vrstvám a tloušťce 10’³ až 10^-5 m.

Podstata vynálezu

Podstata způsobu imobilizace biomolekul a zvláště přípravy biosenzorové elektrody s biomolekulárni složkou podle vynálezu spočívá v tom, že se připravuje roztok alespoň jednoho druhu biomolekuly určené k nanášení, dostatečně pufrovaný k předcházení denaturace biomolekul a na hodnotu, kdy všechny biomolekuly, určené k nanášení, mají stejné znaménku čistého elektrického náboje v důsledku svých isoelektrických bodů, do roztoku se ponoří biosenzorová elektroda a elektroda s opačným nábojem, mezi biosenzorovou elektrodou a elektrodou s opačným nábojem se vytvoří potenciální rozdíl menší než 1 V, přičemž se potenciál méní k vytvoření v podstatě konstantního proudu mezi elektrodami, dostatečného k vytvořeni migrace biomolekul určených pro ukládání na biosenzorové elektrodě a na hromaděni na ní.

Mezi oběma elektrodami se vytváří potencionálový rozdíl 100 minivoltú až 1 volt. Když se na biosenzorové elektrodě dosáhne žádané tloušťky nánosu, může se stabilita naneseného filmu biomo-2CZ 280025 B6 lekul podpořit jeho sesítěnim vhodným sesíťujicím činidlem.

Při výhodných provedeních způsobu podle vynálezu je roztok, obsahující biomolekuly vodný a proud mezi biosenzorovou elektrodou a elektrodou s opačným nábojem se volí přibližně 5 mA/cm². Napětí se upravuje směrem nahoru v průběhu procesu ukládání k udržení konstantního proudu přesto, že vzrůstá elektrický odpor biosenzorové elektrody v důsledku ukládáni biomolekulárního filmu. Ukládání biomolekul pokračuje tak dlouho, až je střední tloušťka filmu na biosenzorové elektrodě větší než 5 mikrometrů.

Výhodou způsobu podle vynálezu je jeho široká použitelnost pro vodivé substráty s nej různější geometrií. Protože je ukládání biomolekul na elektroforetickém základu, mohou se biomolekuly ukládat skutečně na jakémkoliv vodiči nebo polovodiči, nezávisle na jeho tvaru nebo topografii. Například se mohou rovnoměrně bioraolekulárním filmem povlékat povrchy velmi drsného vodiče nebo se mohou velmi snadno biomolekuly ukládat uvnitř vodivého materiálu například v platinové trubce a mohou se vkládat do systému pro analytické účely. Na rozdíl od mnohých jiných způsobu ukládání filmu je u takových elektroforetických způsobů ukládání biomolekul lokalizováno, přičemž se žádaná biomolekula ukládá jen v blízkosti vodivého substrátu.

Jinou výhodou způsobu podle vynálezu jsou poměrné tlusté vrstvy biomolekul, které se mohou ukládat na biosenzorovou elektrodu. Mnohá fyziologická použití zahrnují vzájemné působení mezi relativné velkým množstvím zvláštního fyziologického ligandu, který se má zajistit, s biomolekulou, uloženou na biosensorové elektrodě. Velmi tenké monomolekulární filmy nebo filmy mající tloušťku mnohem menši než 1 mikrometr, mohou způsobit reakci mezi fyziologickým ligandem a biomolekulou omezenou v důsledku malého množství biomolekul dostupných pro reakci, v důsledku klesající citlivosti senzoru a pro nelineární vztah vzájemného působení /mezi biomolekulou a ligandem/, což vše může znesnadňovat stanovení množství ligandu, obsaženého v roztoku.

Jiná výhoda způsobu podle vynálezu vyplývá z použití konstantního proudu v průběhu ukládání na biosensorovou elektrodu. To vede ke stálému ukládáni biomolekul na biosensorové elektrodě i když biomolekulární nános blokuje povrch elektrody a nejdále vzroste elektrický odpor. Protože odpor biosensorové elektrody vzrůstá v průběhu procesu ukládání, jak proud, tak rychlost ukládání biomolekuly by zpravidla klesaly pokud by se postupné nezvyšovalo napětí. Tento pokles rychlosti ukládání by pokračoval tak dlouho, až by již k žádnému ukládáni nedocházelo, i kdyby byl ukládaný film méně tlustý, než je požadováno. Na rozdíl od toho zůstává proud konstantní a způsob podle vynálezu umožňuje zvyšováni napětí se vzrůstajícím odporem tak dlouho až se napětí přiblíží hodnotě, při které se voda buď oxiduje, nebo redukuje za vzniku plynových bublinek, čímž se podporuje vytváření filmů o tloušťce větší než 10 mikrometrů.

Jinou přednosti způsobu podle vynálezu je použitelnost při hodnotách pH srovnatelných s fyziologickými hodnotami pH, při kterých se biomolekula vytváří. Velmi tlusté filmy bílkovinových biomolekul, například enzymů, se mohou ukládat při fyziologických hodnotách pH /7,4/ ve vodných roztocích, čímž se snižuje na mini-3CZ 280025 B6 mum nebezpečí ztráty účinnosti nebo denaturace enzymu, k čemuž může docházet při jiných způsobech ukládání enzymových filmů.

Výhody a přednosti způsobu podle vynálezu vyplynou pracovníkům oboru také z následujícího popisu příkladných provedení, která však vynález nijak neomezují.

Pro názornost je na obr. 1 schéma zařízení pro elektrodepozici biomolekul na biosensorovou elektrodu, ponořenou do kapaliny, obsahující nanášenou biomolekulu. Na obr. 1 je zařízení 10 pro elektrodepozici, vhodné pro provádění způsobu podle vynálezu. Zařízení 10 zahrnuje nádobu 12, určenou pro kapalinu 30. Kapalinou 30 může být bud roztok, nebo suspenze obsahující biomolekulu, určenou k nanášení. Zdroj 14 elektrické energie má +vodič 1β, spojený s biosensorovou elektrodou 22 a -vodič 18, spojený s elektrodou 20 s opačným nábojem, který dodává v podstatě konstantní proud mezi elektrodou 20 a elektrodou 22. Biosensorová elektroda 22 vytváří část biosenzorové jednotky 25, která zahrnuje biosensorovou elektrodu 22 a elektricky nevodivý substrát 24. +Vodič 16 a -vodič 18 jsou elektricky stíněny nevodivým materiálem, schopným vydržet ponoření do kapaliny 30.

Směr toku proudu se může obrátit popřípadě přepnutím spojů +vodiče 16 a -vodiče 18 na zdroji 14 elektrické energie, čímž získá +vodič 16 negativní náboj a -vodič 18 positivní náboj. Protože je jak +vodič 16 tak -vodič 18 stíněn a substrát 24 , obklopující biosensorovou elektrodou je konstruován z nevodivého materiálu, ukládání biomolekulárních látek, obsažených v kapalině 30, probíhá jen na elektrodě 20 nebo na elektrodě 22 s opačným nábojem než je náboj biomolekuly v kapalině 30.

Jako biomolekuly, vhodné pro ukládání na elektrodě 20 nebo na elektrodě 22 se uvádějí, nikoliv vsak jako nějaké omezení, ale příkladně, následující třídy přírodně se vyskytujících nebo uměle syntetizovaných molekul nebo molekulových seskupení, která mohou být složkami biologických systémů: peptidy, oligopeptidy, bílkoviny, apoproteiny, glykoproteiny, antigeny a jejich protilátky, fragmenty protilátek, hapteny a jejich protilátky, receptory a jiné membránové proteiny, analogy proteinů, ve kterých alespoň jedna nepeptidová vazba nahrazuje peptidovou vazbu, enzymy a enzymové prekursory, koenzymy, enzymové inhibitory, aminokyseliny a jejich deriváty, hormony, lipidy, fosfolipidy, glykolipidy, liposomy, nukleotidy, oligonukleotidy, polynukleotidy a jejich oboru známé a biologicky účinné analogy a deriváty včetně například: methylovaných polynukleotidú a nukleotidových analogů majících fosforthioátové vazby; plasmidú, kosmidů, umělých chromosomú, jiných vektorů nukleinových kyselin; antisenspolynukleotidů včetně v podstatě komplementárních k alespoň jedné endogenní nukleinové kyselině nebo majících sekvence opačné se zřetelem k alespoň částem vybraných virálnich nebo retrovirálních genomů a jakýchkoliv jiných biologicky aktivních molekul. Všechny shora uvedené biomolekuly, mající slabou nebo neexistující polaritu nebo indukovatelnou polaritu za podmínek zařízení 10, se mohou kovalentně vázat na nosič se vhodným nábojem za vzniku komplexu s nábojem, který se může ukládat na elektrodě 20 nebo na elektrodě 2 2 .

-4CZ 280025 B6

Jednotlivé ze shora uvedených tříd biomolekul a jejich jakékoliv kombinace se mohou vnášet do roztoku nebo do suspenze jako koloidní částice do kapaliny 30 způsobem závislým na složeni kapaliny 30. Obecné je kapalinou 30 vodný roztok, jako je fyziologický roztok, schopný vést elektrický proud. Popřípadě se do kapaliny £0 mohou přidávat přísady, jako jsou povrchově aktivní látky a protipénicí přísady.

Směr, rychlost, migrace a rychlost ukládání biomolekul původně v roztoku nebo suspendovaných v kapalině 30 na elektrodu 20 a na elektrodu 22 se muže řídit velmi citlivě vhodným nastavením hodnoty pH kapaliny 30 . Toto zařízení je založeno na použití běžných elektroforetických technik použitelných na permanentně nabité podíly, což poskytuje biomolekule čistý náboj v kapalině 30 v závislosti na hodnotě pH kapaliny 30. Hodnota pH, při které má molekula nulový čisti negativní náboj a proto neraigruje působením elektrického pole, je definována jako její isoelektrický bod. Při větší hodnotě pH, než je isoelektrický bod, má molekula čistý negativní náboj; naopak při hodnotě pH menší, než je isoelektrický bod, má molekula čistý pozitivní náboj, Proto se v zařízeních podle obr. 1 hodnota pH kapaliny 30 nastavuje na hodnotu vyšší než isoelektrický bod nebo na hodnotu nižší než isoelektrický bod příslušné biomolekuly, která se má ukládat na elektrodu 20 nebo 22. Toto nastavení hodnoty je možné použitím o sobě známých kyselin nebo alkálií.

Sesíťujíci činidla se do roztoku zavádějí buď současně s biomolekulou, nebo po jejím uložení na elektrodě 20 nebo 22 a jsou vhodné pro podporu vytvoření v podstatě ve vodě nerozpustných nanesených hmot na elektrodách. Sesitujicí činidla zahrnuji obecné polyfunkční mústkovaci skupiny, schopné kovalentní vazby s žádanou biomolekulou, mohou však také zahrnovat ozáření nebo jiná činidla, která podporují vytvořeni kovalentní vazby mezi biomolekulami bez skupin vytvářejících, můstky. Druh používaného sesítujícího činidla závisí na případné nanášené biomolekule; jako příklady sesíťujících činidel se uvádějí: silanová činidla, alkylaminová kopulační činidla, isothiokyanátová kopulační činidla, triazinová kopulační činidla, azokopulační činidla, fenylhydrazínová kopulační činidla, karbodiimidová kopulační činidla a kopulační činidla na bázi chloridu kyseliny. Při způsobu podle vynálezu je obzvláště vhodné používání glutaraldehydu, jakkoliv se může používat jiných kopulačních činidel ze souboru zahrnujícího například 4-azidofenacylbromid, benzofenon-3,3'-4-4¹-tetrakarboxylovou kyselinu ve formě dianhydridu, biotin-N-hydroxysukcinimidester, biotin-4-nitrofenylester, 2,2'-bichinolon-4,4'-dikarboxylovou kyselinu, bis/4-fluor-3-nitrofenyl/sulfon, 1,5-bis/sukcinimidoxykarbonyloxy/pentan, 4-/BOC-aminomethyl/fenylisothiokyanát, N-BOC-1,6-diaminohexanhydrochlorid , brompyroh.ro znovou kyselinu, kyanurchlorid, 4,4'-diazidostilben-2,2'-disulfonovou kyselinu ve formě dvojsodné soli, dianhydrid diethylentriaminpentaoctové kyseliny, diethylenpyrokarbonát, 1,5-difluor-2,4-dinitrobenzen, 1,6-diisokyanohexan, 4,4'-diisothiokyanátstilben-2,2’-disulfonovou kyselinu ve formě dvojsodné soli, dimethyladipimidátdihydrochlorid, N-/dimethylaminopropyl/-N’-ethylkarbodiimidhydrochlorid, dimethyl-3,3'-dithiodipropionimidátdihydrochloríd, dimethylpumelindiimidátdíhydrochlorid, dimethylsuberimidátdihydrochlorid, 3,3'-dithiodipropionová kyselina ve formě bis/N-hydroxysukcininidester/u, 4-fluor-3-nítrofenylazid, _5_ formaldehyd, fumaronitril, glutaraldehyd, glutaronitril, glykolaldehyd, hexamethylendiisokyanát, 6-hydroxy-2-naftyldisulfid, 3-/4-hydroxyfenyl/propionová kyselina ve formě N-hydroxysukcinimidesteru, 2-iminothiolanhydrochlorid, 4-meleimidobutyraminomethylpolystyren, N,N'-/1,4-fenylen/dimaleimid, polyethylenglykol-60Q-dikyselina, N-sukcinimidyl-3-/2-pyridylthio/propionát, N-sukcinimidyl-3-maleimidobenzoát, N-sukcinimidyl-4-maleimidobutyrát, N-sukcinimidyl-6-maleimidokaproát, N-sukcinimidyl-3-maleimidopropionát, thiodiethylenglykol, toluylen-2, 4-diisokyanát a m-xylylendiisokyanát. Uvedených bivalentních sesiťovacích činidel lze tedy používat.

Biosensorových elektrod, vyrobených způsobem podle vynálezu, lze používat pro nejrúznějši molekulární detekční systémy včetně amperometrických elektrochemických biosensorů, kalorimetrických, akustických, potenciometrických a optických biosensorů a biosenzorů na bázi ISFET.

Vynález blíže objasňuji, nijak vsak neomezuji následující příklady praktického provedeni.

Příklady provedení vynálezu

Přiklad 1

Připraví se hmot. 5% roztok glukosoxidaxy za použití fosfátem pufrovaného solankového roztoku /hodnota pH 7,4/ jako rozpouštědla. Glukosoxidasa se pečlivé rozpustí v solankovém roztoku za mírného míchání, přičemž se míchání pečlivě provádí, aby se předešlo pěnění roztoku, které by mohlo vést k denaturaci glukosoxidasy. Elektrodepozični zařízení se naplní připraveným roztokem a do roztoku se ponoří biosensorová elektroda, na kterou se má enzym ukládat, spolu s elektrodou s opačným nábojem. Provede se elektrické propojení s galvanostatem a proud se udržuje na konstantní hustotě 5 mA/cm² na povrchu elektrody. Tok proudu se řídí ve směru, který vede k pozitivnímu čistému náboji na povrchu elektrody k vázání negativně nabitých molekul glukosoxidasy. Proud je zapojen na dvě minuty. V průběhu ukládáni nemá napětí přestoupit 0,5 V. Elektroda se potom vyjme z enzymového roztoku a ponoří se do deionizované, destilované vody bez míchání na dobu 5 sekund k odstranění zbytkové glukosoxidasy.

Elektroda se potom ponoří do roztoku obsahujícího objemově

2,5 % glutaraldehydu v solance pufrované fosfátem /hodnota pH 7,4/ na dobu 30 minut ke kovalentnimu sesítěni glukosových molekul a k vytvořeni hmoty nerozpustné ve vodě. Elektroda se potom ponoří do deionizované, destilované vody na dobu 5 sekund a nechá se schnout na vzduchu po dobu 30 minut.

Zjištěno po zaschnutí, že vrstva glukosoxidasy, uložená na elektrodě, má tlouštku přibližné 1,5 |im. Následující zkouškou zjištěno, že sesítěni glutaraldehydem je účinné k předcházeni převodu glukosoxidasy zpět do roztoku. Zjišťuje se, že v tomto bodu je enzymatická složka biosensorů funkční.

-6CZ 280025 B6

Příklad 2

Je také možné současné ukládání dvou nebo několika biomolekul na povrchu elektrody za podmínky, že jejich isoelektrické body jsou vždy vyšší nebo nižší než hodnota pH depozičního roztoku. V tomto případě se připraví solankový roztok pufrovaný fosfátem /hodnota pH 7,4/, obsahující hmotnostně 5 % glukosoxidasy a 5 % albuminu. Glukosoxidasa a albumin mají hodnoty isoelektrického bodu 4,3 a 4,7, takže obě molekuly mají negativní náboj při hodnotě pH roztoku 7,4. Na elektrodě se použije hustoty proudu 5 mA/cm² po dobu dvou minut při jejím ponoření do roztoku glukosoxidasy a albuminu. Molekuly se sesítí v glutaraldehydovém roztoku, jak je popsáno v příkladu 1, potom se elektroda opláchne a vysuší. Vzniklá vrstva glukosoxidasy a albuminu má tloušťku přibližně 5 μιη. Při dlouhodobé zkoušce glukosoxidasové účinnosti se pozoruje, že vrstva glukosoxidasy a albuminu je výrazně stálejší než vrstva jenom glukosoxidasy, vytvořená způsobem podle příkladu 1.

Příklad 3

Připraví se roztok 2,4 mg/ml králičí antifluoresceinové protilátky /afinita čištěno/ za použiti borátového pufrového roztoku /hodnota pH 9,0/. Hodnota ph se volí se zřetelem na udržení maximální pojící účinnosti protilátky. Elektrodepozični nádoba se naplní připraveným roztokem a vloží se biosensorová elektroda, na které se má ukládat protilátka a do roztoku se také ponoří elektroda s opačným nábojem. Provede se elektrické propojení s galvanostatem a proud se udržuje na konstantní hustotě 5 mA/cm² na povrchu elektrody. Tok proudu se směřuje ve směru, který vede k negativnímu čistému náboji na povrchu biosensorové elektrody k přitahování pozitivně nabitých molekul protilátky. Proud se aplikuje po dobu 50 minut. Elektroda se potom vyjme z roztoku protilátky a ponoří se do deionizované, destilované vody bez jakéhokoliv míchání na dobu 5 sekund k odstranění zbytkové protilátky.

Elektroda se potom ponoří do roztoku obsahujícího objemové

2,5 % glutaraldehydu v solance pufrované fosfátem /hodnota pH 7,4/ na dobu 30 minut ke kovalentnirau sesítění molekul protilátky a k vytvoření hmoty nerozpustné ve vodě. Elektroda se opět ponoří do deionizované, destilované vody na dobu 5 sekund a nechá se schnout na vzduchu po dobu 30 minut. Vyšetřením elektrody zjištěno, že elektrodepozici vzniklá vrstva protilátky má po zaschnutí tloušťku přibližně 5,5 μιη.

Jakkoliv je tedy vynález blíže objasněn shora uvedenými příklady praktického provedeni, jsou pracovníkům v oboru jasné možnosti jeho variací a modifikaci v rámci vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Zlepšený způsob výroby biosensorových elektrod, kterých lze používat pro nejrúznějsí molekulární detekční systémy.

Claims (7)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob přípravy elektronické biosensorové elektrody s bionolekulární složkou, vyznačující se tím, že se připravuje biomolekulární roztok alespoň jednoho druhu biomolekuly volené ze souboru zahrnujícího peptidy, oligopeptidy, proteiny, apoproteiny, glykoproteiny, antigeny a jejich protilátky, fragmenty protilátek, hapteny a jejich protilátky, receptory, enzymy, prekursory enzymů, koenzymy, inhibitory enzymů, aminokyseliny, hormony, lipidy, fosfolipidy, glykolipidy, liposomy, nukleotidy, oligonukleotidy, polynukleotidy a jejich biologicky funkční analogy a deriváty, určené k nanášeni na biosensorovou elektrodu, rozpuštěné v prvním vodném roztoku o hodnotě pH, volené tak, aby všechny druhy nanášených biomolekul měly stejné znaménko čistého elektrického náboje v důsledku svých isoelektrických bodů, do biomolekulárního roztoku se ponoří biosensorová elektroda a elektroda s opačným nábojem, aplikuje se proměnlivý potenciál 100 milivolt až 1 volt přes biosensorovou elektrodu a elektrodu s opačným nábojem za vytvoření konstantního proudového toku mezi biosensorovou elektrodu a elektrodou s opačným nábojem, přičemž se proud orientuje ve směru ustavení pozitivního čistého náboje na povrchu biosensorové elektrody za vytvoření migrace biomolekul k jejich ukládání na biosensorové elektrodě a udržuje se konstantní proud mezi elektrodami do vytvoření filmu biomolekul na biosensorové elektrodě.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se zavádí biosensorová elektroda s naneseným povlakem bioraolekul do sesíťujícího roztoku obsahujícího sesíťujíci činidlo, rozpuštěné ve druhém vodném roztoku a biosensorová elektroda se udržuje v sesiťujícim roztoku do sesítění biomolekul za vytvořeni ve vodě nerozpustného filmu biomolekul na biosensorové elektrodě.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že sesíťujícím činidlem je glutaraldehyd.
4. 4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že se proud nastavuje k vytvoření konstantní hustoty 5 mA/cm² na povrchu bioelektrody.
5. 5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že výsledný ve vodě nerozpustný film biomolekul má tloušťku

   1,5 až 5,5 mikrometrů.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje přípravu roztoku obsahujícího ukládaný protein.
7. 7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že ukládaným proteinem je enzym.