CZ280196A3 - Immunotherapeutical agent and application thereof - Google Patents

Description

Oblast techniky

Tento vynález se týká imuna^herapeutických činidel·, použitelných při zpožďování vývoje nebo i pni prevenci růstu tumorů.

Dosavadní stav techniky

Byl již vysloven názor, že imunitní systém je schopen působit prevenčné na růst tumorů, případně zpoždovst jejich růst při nejmensím v některých případech, s některá studie mají' snahu skutečně podporovat tento názor» Tak Coley YÍ.B. v Treatment of Inoperable Malignant Tumours v/ith toxins of erysipelas and the Bacillus prodigiosus” popsal tes imunotherapeutický způsob, který se zdá být účinný proti omezenému počtu tumorů mesodermálního původu, a to vyvoláním nekrotizujícího mechanismu podobného onomu, který hraje roli v Kochově xmunotherapii v případě tuberkulosy. Od té doby bylo zaznamenáno mnoho pokusů v oboru imunotherapie rakoviny na podkladu vyvolání rychlé nekrosy tkáně podobně, jak to v některých případech dosáhl Coley.

Je známo, že jsou nejméně dva typy zrání pomocných I buněk, označovaných jako TH1 a TH2_o Prvé z nich jsou spojeny se vznikem interleukinu 2 (IL2), interferonu (TPN-y), cytotoxických T buněk (CTLs), se sníženým vznikem antilátek a regulováním vzniku buněk TH2 směrem dolů. Druhé z nich produkují IL4, IL5, podporují produkci antilátek a buněk regulujících TH1 směrem dolů₀ Koch-ův fenomenon, pravděpodobně vyvolán Coley

- · j ϋioxinem, je pravděpodobně výsledkem směsi vyzrálých buněk TK1 + TH2.

Bylo zjištěno, že jsou dvě kategorie imunitní reaktivity, jež mohou pravděpodobně spolupůsobit při kontrolování tumorů a v obou případech je možné jejich vyvolání vakcinou 3CC- (Bacillus Calmette-C-uerin) □ Prvý z těchto mechanismů je spojen s destrukcí tkáně, jak je to patrné z příkladů imunotherapie dle

-2Koch-a a Coley-e, jakož i plyne z imunotherapie tumorů použitím TNF ok , a pravděpodobně zahrnuje poškození tkáně, způsobené cytokininem na zánětlivých místech, vhodně k tomu uzpůsobených Koch-ovým jevem v závislosti na T-bunkách, Zdá se, že tento mechanismus je účinný proti cumorům mesodermálního původu. Druhý z mechanismů, založený na imunitní odezvě vlastních tumorových buněk, může být účinný proti tumorům jakéhokoli původu. Nepřímý důkaz existence nespecifických THl na podkladu antitumorového mechanismu je dán úspěchem použití rekombinantního interleukinu 12, velmi mocného induktoru THl, při experimentech s rakovinovými tkáněmi.

Zlá se za to, že Mycobakterie, to při použití, jež vyloučí indukování Koch-ova mechanismu, mohou být schopné ihned rozeznat utlumené autologní buňky cestou epitopů tepelně šokovaných proteinů a epitopů dalších proteinů s vysoce uchovanými sekvencemi, což vede k selektivní destrukci tumorových buněk, Máme za to, že proměnlivá účinnost imunotherapie BCG v minulosti byla poplatná selhání představy, že by BCG měly snahu zvýšit stav původní odezvy, jak je to patrné ze studií odpovídajících účinností při ochraně proti tuberkulose a leprose.

3CG jako vakcina proti mycobakteriálním onemocněním (jak tuberkulosy, tak 1 lepry) se vyznačuje velmi proměnlivou učinnosí, což je patrné z různých studií s výsledkem kolem 80% až po 0% z hlediska ochrany dosažené. Je tedy podstatné, že je-li BCG aplikován při porádu, má se za to, že obecné chrání před leukémií v dětském věku pouze v těch geografických rozmístěních, kde chrání rovněž proti tuberkulose (Grange J_om., Stanford J.L., BCG vaccination and cancer, Tubercle 71, 61-64 (1990) Takže to znamená, že chrání proti oběma těmto jevům v těch místech, kde vyvolá odezvu na mykobakterilní antigeny, jež není spojena s nekrotisací tkáně a není známým Koch-ovým fenomenem.

Četné tumorové buňky mohou mít . oa svém povrchu bakteriomimetika, sacharidy, antigeny a epitopy stresových proteinu i další vysoce uchované proteiny ve vztahu k histokompatibilním komplexům (MHO), skupiny 1 a 2_O Za podmínek Vysoké produkce antilátek, původní antisacharidické antilátky mohou působit proti bakterielním sacharidům a snad IgA v takovém typu může pokrýt tumorové buňky a blokovat jejich povrch i složky to-3hoto povrchu před buněčným imunitním útokem.

Jak jsme již upozornili v naší PCT/G393/004-63, pak imunotherapie pomocí M_ovaccae vyvolá převážně THl-typ odezvy s aktivováním makrofágů působením IPH-^ a velmi malý vznik antilátek» Je známo, že takové odezvy TH1 urychlují generování VTLs_o Patrné snížení produkce antilátek spolu se zvýšeným počtem CTLs způsobí to, že tumorové buňky jsou uzpůsobeny k útoku jak působením nakrofágů, aktivovaných poté, co byly vázány na bakteriomimetické sacharidy a povrchy tumorových buněk, tak i proteiny, které rozeznaly stres CTLs a působením dalších, vysoce uchovaných proteinů a jejich epitopů v skupině 1 MHC₀ Má se za to, že mechanismus tkáňové nekrosy cestou Koch-ova fenoménu je vysoce potlačen použitím přípravků na podkladu M.Vaccae.

Lze tedy očekávat, že imunotherapis pomocí M.vaccae bude účinná proti tumorům mesodermálního, endodermálního a ektodermálního původu, počítaje v to plicní a průduskové tumory, a to jak z hlediska prevence, tak i zdržení růstu či rozšíření takových tumorůo

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je tedy použití antigenních a/nebo imunoregulujících materiálů na podkladu Mycobacterium vaccae pro přípravu léků, použitelných při zpožďování nebo prevenci růstu a rozšíření se tumorůo Takový materiál lze pak podávat postiženému v množství dostaČujícícm při nejmenším k pozdržení nebo i prevenci růstu a rozšíření se tumoruo oroto

Therapeuticky účinné činidlo obsahuje obvykle a i s výhodou mrtvé buňky M.vaccae, nejvýhodněji buňky, jež byly usmereny autoklávovánímo Imunotherapeutická činidlo obsahuje óbvykle nad 10 mikroorganizmů na ml ředidla a

Q _o s výhodou 10 až 1Ο^υυ usmrcených mikroorganismů M_ovaccae >oo

-4na 1 ml ředidla. Vynález zahrnuje do svého rozsahu antigenní a/nebo imunoregulační materiály na podkladu M.vaccae k použití v lékařství k pozdržení či prevenci růstu či šíření se tumoru.

Ředidlem může být solanka pro injekční účely, prostá pyrogenních činidel, to v borátovém pufru o pH 8,0. Ředidlo musí být sterilní. Jako vhodný borátový pufr lze uvést toto složení:

Na₂B Ογ.ΙΟ H^O ^H3^B03

3,63 g 5,25 g

KaCl é,l9 g tweeen 0,0005% destilovaná voda dopl₀ na litr

Výhodným knemem M.vaccae je onen, označený jako R877R po izolaci z vzorků bahna okrsku Lango ze střední Ugandy (viz Stanford J.L. a Paul R_OC., Ann.Soc.Belge Med,Trop 53. 141-389 (1973). Kmen je stabilní odolnou variantou a může být identifikován jako náležející do skupiny N_ovaccae na podkladu biochemických a antigenních kriterií(viz Bonicke R., Juhasz S.S., Zentralblatt BakterioloParasitenkd.Infection skr.Hgy., Abt.l, Orig. 192. 133 (1964).

Kmen s označením R377R byl uložen v National Collection of Type Culturae (NOTO) Central Public Health Laboratory, Colindale Avenue, London N7Í9 5HT, Velká Britanie, 13.02.1984 pod označením KCTC 11659).

Při přípravě imunotherapeutického Činidla se nechá růst MoVaccae na vhodném pevném prostředí. Za výhodné lze označ⁷-? Sauton^z-ovo kapalné prostředí, viz Boyden S_OV., Sorkin B., J, Immunol. 75., 15 (1955), zpevněné agarem. Výhodné pevné prostředí obsahuje 1,3% agaru.

Prostředí očkované mikroorganismem se inkuguje ₈erobně tak, aby se umožnil růst mikroorganismh, obvykle za teploty 32°C po 10 dnůo Organismus se potom sklidí, zváží a suspenduje v ředidle. Ředidlem může být nepufrovaná solanka, ale ta se s výhodou pufruje za použití borátového pufru a obsahuje povrchově aktivní činidlo, jako je Tween 80, jak to bylo uvedeno výše.

-5Suspense se pak zředí tak, aby obsahovala 100 mg mikroorganismu na ml. Pro další zředění se s výhodou použije solanka, pufrovaná borátem, a to tak, že suspense obsahuje mg za vlhka hmotnostně mikroorganismu na 1 ml ředidla.

Suspensi lze potom dále používat v multidosních ampulkách po 5 ml. Ačkoliv mikroorganismus v ampulkách lze usmrtit 60* použitím záření, například z Cobalt za dávkování 2,5 megarad či použitím jiných prostředků, například chemicky, je výhodné usmrtit mikroorganismus autoklavováním, například 10 minut za teploty 115-125°C a tlaku 68,761 kPa. Bylo zjištěno, že při autoklávování se získá účinnější přípravek než za použití ozáření.

Imunotherapeutické činidlo se obvykle podává injekcemi za noužití objemů od 0,1 do 0,1 ml, s výhodou 0,1 ml za intra 7 dermálního podávání. Jediná dávka obvykle obsahuje 10 sž

ΙΟ^θ usmrcených buněk N.vaccae. Je výhodné oodávat oacientcvi , 8-9 * - * jedinou dávku s obsahem 10 az 10 usmrcených buněk M.vaccae. Ovšem dávku lze opakovat, to v závislosti na stavu pacienta.

Ačkoliv se imunotherapeutické činidlo obvykle podává intraoermálními injekcemi, jsou možné i jiné postupy a lze tedy použít i orální podávání,,

Vynález zahrnuje ve svém rozsahu zppsob zdržování či prevence růstu či šíření se tumorů, a zahrnuje podávání postiženým tumorem antigenní a/nebo imunoregulující materiál na podkladu Mycobacterium vaccae v množství dostačujícím k provokování imuno-odezvy, účinné ke zpoždění ceba prevenci růstu či šíření se tumoru.

Může být výhodné a spadá to do rozsahu tohoto vynálezu použít více než jeden kmenfíf?vaccae a/nebo zahrnout do therapeutiokého činidla další mykobakterielní antigeny. Může se jednat i o tuberkuiin.

Therapeutické činidlo může obsahovat i BCC- vakcinu (Basillus Calmette-C-uerin), zvláště pak lyofilizovanou ve formě vakciny, což podporuje její účinek.

Therapeutické Činidlo může obsahovat další složky,

-6jako jsou adjuvancia, konzervační činidla, stabilizátory a pod_o Může se podávat ve formě sterilních injikovatelných kapalin nebo ve sterilních lyofilizovatelných formách, které se před použitím rekonstituují.

M.vsccse se může použít jako takové nebo ve formě extraktu či frakcionováných dávek organismu k přípravě therapeutických činidel podle tohoto vynálezu.

Vynález je dále popsán formou připojených příkladů.

Příklady

Příklad 1

M.Vaccae se ponechá růst na pevném prostředí, obsahujícím modifikované Sauton^-ovo prostředí zpevněné přidáním 1,3 % agaru₃ Medium se očkuje mikroorganismam a inkubuje po 10 dnů za teploty 32°C, což umožní růst mikroorganismu.

Ten se potom sklidí, a po zvážení suspenduje do ředidla tak, aby 100 ml mikroorganismu odpovídalo 1 mi ředidla. Suspense se dále zředí pufrovanou solankou s tím, že se takte získá suspense, obsahující 10 mg hmotnosti (za vlhka) mikroorganismu na ml ředidla a ví, e se rozdělí do multidosních ampulek po 5 mlo Tyto pak s obsahem živého mikroorganismu se autoklávují po 10 minut za tlaku 68,761 kPa, tím se mikroorganismus usmrtí a získá se tak imunotherapeutické činidlo podle tohoto vynálezu, které se může - je-li to žádoucí - dále ředit k použití.

Této imunotherapeutické činidlo se může podávat intradermálními injekcemi způsobem, jak zde již byl popsán.

Příklad 2

Injekce M.vaccae byly podány několika pacientům, postiženým tumory. Výsledky, jak jich bylo dosaženo, jsou tyto:

Rakovina hrudníku

1) V National Institute of Hygiene and Epidemiology in Ha.ooi, Vietnam, kde byla provedena celá řada studií při

-7imunotherapii za využiti Mycobacterium vaccae, se vyvinul u jedné ženy karcinom hrudníku se sekundárními projevy v podpaždío Po operativním odstranění jí byla doporučena BCC- imunotherapie. Protože postižená viděla podobný režim léčení u ostatních, nebála se akcentovat BCC- a žádala si podávání M.vaccae. Standardizované injekce 10 usmrcených MoVaccae byly tedy podávány a po dobu nejméně 3 let byla pacientka v pořádku, cítila se dobře bez jakýchkoli náznaků dalších tumorůo

2) V době několika týdnů podávání injekcí M.vaccae při léčbě persistentní pityriasis bylo zjištěno rutinní mammograíií, že tato žena stáří 50 let na v hrudníku nádore Bičpsií bylo zjištěno, že nádor je maligní, byl odstraněn lumpektomií histopathologií pak by Iq. nalezeno, patrná sinus histiocytosis podél axilárních lymfatických pakostičních modulů, které byly prosté tumorů. Po asi 9 měsících později se pityriasis vrátila, byla podána druhá dávka 1.vaccae s témř okamžitou ulevou z hlediska pityriasis. Nebyly zde žádné náznaky sekundárních jevů po 21 měsíců po odstranění tumoru.

3) Žena v začátcích svých sedmdesátin byla ve stavu po odstranění tumorů z hrudníku několik let předtím. Trpěla po řadu let páteřními bolestmi v důsledku srthritidy a dostala injekci lí_ovaccae při pokusu ulevit jí₀ Krátce nato bylo zjištěno použitím X-paprsků, že v páteři je určitý počet lesí, o kterých se mělo za to, že jsou sekundárním podkladem tumoru a byla odkázána na radiotherapiio Po prodlení 8 týdnů se hlasila na radiotherepii a po opakování tohoto postupu bylo zjištěno, že zde nejsou žádné náznaky sekundárních jevů. Radiotherapie se tedy osvědčila ε po dvou a půl letech později bylo zjištěno, že je v pořádku bez jakéhokoli zoětného návratu tumorůo

4) Praktický lékař stáří 55 let se hlásil po 2 dnech se stavem, který byl vyhodnocen jako akutní absces hrud·

-8níku. Operativním řezem bylo zjištěno, že v tomto případě jde a velmi rychle rostoucí karcinom se sekundárními jevy v podpaždí. Nádor byl ihned operativně odstraněn, bezprostředně po skončené hospitalisaci byly podány injekce M.vaccae, další pak následovaly v intervalech po 3 měsících. Operativní zákrok byl vyhodnocen kladně a po roce nebyl zde žádný náznak sekundárních projevů u pacienta, kde byl již zjištěn prudký postup onemocnění.

5) U ošetřovatelky, která se ztěžovala na .bolesti v boku po dobu jednoho roku, bylo diagnosou zjištěno, že trpí sekundárními projevy na kostech v důsledku malého tumoru v hrudníku. Po počáteční injekci M.vaccae byl zaznamenán dobrý postup, chemotherapii snášela velmi dobře a dostala druhou injekci M.vaccae₀ Dopadla dobře_o

Nádory olicní

1) U ženy stáří 55 let v vyvinuly v říjnu 1993 dýchací potíže a bylo zjištěno, že jsou zaviněny několika neoperovatelnými nádory plic. Mělo se za to, že jsou to sekundární nádory nezjištěného prvého tumoru. Se souhlasem onkologa byla podána injekce M.vaccae a byl tak zahájen postup chemotherapie a rad^otherapie,, Postižený obstála, s pozoruhodně malými postranními jevy a nepotřebovala již podání druhé injekce M.vaccae, když se o tom uvažovalo po β měsících. Za 10 měsíců po presentaci se stav její nemoci zhoršil, therapie, lépe chemotherapie byla obnovena, ale byl zaznamenán jen malý postup zlepšení stavu pacienta, takže začátkem října 1994 byla podána druhá injekce M.vaccae. Stav pacientky se zlepšil, dostala další dvě injekce v prosinci 1994 jednu a další 1.03.1995. Stav pacienta byl nejen mnohem lepší, než se očekávalo, ale snesla 20 chemotherapeutivních zákroků bez jakýchkoli nesnázío

-9Dalši nesnáze

1) Zubař stáří 30 let v konečném stadiu maligní teratomie dostal injekci M.vaccae těsně předtím, než byl poslán domů tamže zemříto Během jednoho či dvou dnů zaznaA menal zkepšení a o 3 týdny později bylo zjištěno, že velikost tumorů se zmenšila a poprvé po několika týdnech mohl opět jíst_o

2) U ženy stáří 36 let se vyvinul adenokarcinom žaludku kolem vředu, který byl dán infekcí Helicobacter pylorio Navzdory chemotherapii se projevilo několik rychle se šířících sekundárních jevů. Dostala prvou injekci M.vaccae a uvažuje se o pokračování injikování v intervalech 2 měsícůo gumoizy sno je né s HIV

1) Pacient po počáteční fázi AIDS s četnými

Kaposi-ho ssrkomaty dostal v listopadu 1993 injekci I.í_o vaccae. Další tumory se pak již neobjevily a byly zde náznaky, že stávající tumory mizío Druhou injekci dostal v prosinci 1994, když se u něho již projevily sekundární infekce, podmíněné HIV₀ Je odkázán na opětované injekce lá.vaccae každé 2 měsíce₀

2) Pacient takřka bez buněk GD4ale bez zjevných příznaků AIDS dostal v červnu 1994 injekci M_ovaccae a za několik m/lo týdnů bylo zjištěno, že má malou KS lesi o tlouštce asi 0,5 cm v pjfeůměruo Další injekce M_ovaccae byla podána za 2 měsíce v březnu 1995, aniž se objevily další lese a aniž se projevil vzestup velikosti lese počáteční,,

3) Muž stáří 48 let s násobnými opakujícími se oropharyngeálními karcinomaty dostal injekciHj>.vaccae v Červnu 1994 z další injekce v intervalech 2 měsícůo V březnu 1995 by3.0 zjištěno, že výskyt tumorů je nulovýo

Historky, uvedené výše, Iflají podpořit léčení tumorů použitím M.vaccae s tím, že toto použití není soogeno s -ϊokvriikoll neoříznivzmi oostranními ucinkv«

-10Ve skutečnosti bylo dosaženo pomoci v případě nejméně dvou z uvedených pacientů tím, že se tak snížily toxické účinky chemotherapie. Tato praktická včasná pozorování podporují theoretické předpoklady a naznačují velmi ceněnou antitumotovou účinnost

Příklad 3

Byl proveden předběžný pokus za použití myši Balb/c, provokované maším prsním karcinomem,kmen MM3.

Tři skuniny po 10 myších byly provokovány buňkami γ

MM3. týden později nrvá skuoina dostala injekcemi

Q

M.vaccoe, druhá skupina dostala 10⁷ M.vaccae a třetí byla ponechána jako kontrolní» Za 40 dní po provokaci byla zvířátka usmrcena a zjištěn stav vývoj tumorů»

LígVaccae íví.vaccae kontrolní tumory vyvinuté

P s 0,056 bez tumorů

Claims (9)

1. Ιο Použití antigenního a/nebo imunoregulačního materiálu na podkladu z Mycohacterium vaccae k přípravě léku, použitelného při pozdržení nebo prevenci růstu či síření se tumor ů₀
2. 2. Použití antigenního a/nebo imunoregulaoního materiálu podle nároku 1, kde uvedený materiál z II.vaccae obsahuje mrtvé buňky H.vaccae.
3. 3. Použití antigenního a/nebo imunoregulačního materiálu podle nároku 2, kde mrtvé buňky z Ll.vaccae byly usmrceny a u t o kl ávo vání m.
4. 4o Použití antigenního a/nebo imunoregulaoního materiálu podle kteréhokoli z předchozích nároků, kde materiál na podkladu Ií.vaccae byl převzat z kmene, uloženého v Hational Collection oř Type Cultures (HCTS) Central Public Health Laborstory, Colindale Avenue, London ΙΓ.79 5HT, Velká Britanie, 13.12.1954 pod číslem HCTC 11 659.
5. 5 o Použití antigenního a/nebo imunoregulačního materiálu podle kteréhokoli z předchozích nároků, kdy materiál převzatý z !.vaccae, je v léku v množství ίο'' až ΙΟ^θ mikroorganismů na dávku.
6. 6. Použití antigenního a/nebo imunoregulaoního mateři lu podle kteréhokoli z předchozích nároků k léčbě tumorů, jako je hrudníkový nebo průduskový tumor.
7. 7. Barmaceutický přípravek, obsahující materiál na podkladě Hycobacterium vaccae k použití při pozdržování nebo prevenci růstu či síření se tumoru.
8. 8. Barmaceutický přípravek podle nároku 7, obsahující materiál na oodkladu II.vaccae, jak byl definován v nárocích

   3 5.

   -129. Imunotherapeutické činidlo, obsahující antigenní a/nebo imunoregulační materiál na podkladu Mycobacterium vaccae k použití v therapii k pozdržení nebo prevenci růstu či šíření se tumoru.
9. 10. Imunotherapeutické činidlo podle nároku 9, obsahující materiál na podkladu M.vaccae, jak byl definován v nárocích 2 až 5.