CZ280595A3

CZ280595A3 - Viable bacterium

Info

Publication number: CZ280595A3
Application number: CZ952805A
Authority: CZ
Inventors: David Kirk Rodham; John Burnett Cantwell
Original assignee: Zeneca Ltd
Priority date: 1993-04-28
Filing date: 1994-04-18
Publication date: 1996-02-14
Also published as: AU6510494A; CA2161220A1; BG100105A; CN1121731A; PL311297A1; SK134695A3; NZ263867A; JPH08509374A; EP0696316A1; HUT72846A; AU684072B2; HU9503064D0; BR9406488A; GB9308734D0; KR960701986A; WO1994025564A1; GB9406552D0

Description

Vynález popisuje způsob přípravy komposic obsahujících mikrobiální buňky ve stabilisovaném stavu, těchto komposicí a živých kultur, které jsou z nich následně připraveny.

Dosavadní stav techniky.

Skladování životaschopných kultur je v současné době uznávaným problémem. Například, v US 3 897 307 se popisuje (i) použití kombinace askorbátu a glutamátu nebo aspartátu jakožto stabilisátorů pro bakteriální buňky produkující kyselinu mléčnou a (ii) používání určitých cukrů, zvláště inositolu v koncentracích 25 mg/ml roztoku, jako látek chránících buňky před škodlivým působením teplot pod bodem mrazu všude tam, kde jsou tyto bakteriální buňky lyofilisovány.

Mugnier a další, Applied and Enviromental Microbiology, 1985, strana 108 až 114, popisují použití polysacharidových gelů v kombinaci s určitými živinami, například Cj až C₃ a C₆až C₁₂ sloučeninami, jako matric pro lyof ilisované bakteriální buňky. Bylo zjištěno, že polysacharidy schopné tvořit gel se při lyofilisaci nehroutí.

Redway a další, Cryobiology, 1974, 11, strana 73 až 79 zkoušel určité monosacharidy (v koncentracích až do 150 mg/ 2 ml vzorku) a příbuzné sloučeniny jako media pro dlouhodobé přežití lyofilisovaných bakterií.

Zjistili jsme, že jsou-li mikrobiální buňky suspendovány v určité matrici zde popsaným způsobem a vysušeny za určitých podmínek, je zvýšena jejich krátkodobá životaschopnost, a že jsou-li tyto vysušené systémy skladovány a rehydratovány při určitých podmínkách zde

-2definovaných, pak je rovněž zvýšena dlouhodobá životaschopnost těchto mikrobiálních buněk.

Dále bylo překvapivě zjištěno, že zhroucení matrice v níž jsou mikrobiální buňky suspendovány nemá za následek nízkou krátkodobou životaschopnost.

Vynález popisuje přípravu stabilní vysušené komposice obsahující mikrobiální buňky ve stabilisovaném stavu suspendované ve zhroucené matrici.

Slovem stabilní se rozumí skutečnost, že je snížena degradace mikrobiálních buněk (degradace by vedla ke ztrátě obnovy životaschopnosti buněk).

Slovem stabilisovaný stav se rozumí skutečnost, že buňky nemetabolisují, nedělí se a nerostou (ale tyto jejich funkce lze obnovit, jestliže jsou vystaveny působení vhodných podmínek).

Spojením životaschopnost buněk” se rozumí schopnost buněk růst a dělit se, jestliže jsou vystaveny působení vhodných podmínek (to jest rehydratace a zdroj živin).

Spojením životaschopné buňky se rozumí buňky schopné růst a dělit se, jestliže jsou vystaveny působení vhodných podmínek (to jest rehydratace a zdroj živin).

Slovem zhroucené se rozumí skutečnost, že

i) matrice se smrštila, stala se méně porézní a umožňuje jen nepatrné pronikání nízkomolekulárních difusivních látek, například, při vystavení působení účinkům vlhkého vzduchu absorbuje jen nepatrné množství vodní páry; a/nebo ii) matrice byla vystavena teplotám přesahujícím teplotu jejího skelného přechodu (Tg), přičemž nastalý

3plastický tok způsobil podstatné snížení poměru povrch/objem a zapouzdření buněk do málo porézního ochranného pouzdra.

Vynález dále popisuje způsob přípravy stabilní vysušené komposice obsahující mikrobiální buňky ve stabilisovaném stavu suspendované v matrici, sestávájící z následujících kroků:

A: smíšení mikrobiálních buněk s vodným mediem obsahujícím materiál z něhož bude odvozena matrice

B: vysušení směsi za takových podmínek, aby došlo k plastickému toku materiálu a ke zhroucení matrice, ale ne k přílišnému poškození buněk.

Komposice připravené podle kroku B je výhodné skladovat při teplotách nižších než je Tg matrice, to znamená, že komposice má Tg vyšší, než je předpokládaná skladovací teplota.

U komposice připravené podle kroku B je výhodné provést ještě další sušení, takzvané sekundární sušení, za účelem zvýšení Tg matrice, aby byla komposice stabilní ve větším rozsahu skladovacích podmínek, to jest, aby mohla být skladována při vyšší teplotě.

Buňky obsažené ve stabilní vysušené komposici podle vynálezu jsou nejlépe bakteriální buňky, nicméně nelze vyloučit možnost využití jiných druhů mikrobiálních buněk, například hub, kvasinek a tak dále. Jestliže použité mikrobiální buňky jsou buňky bakteriální, pak vhodnější jsou gram-negativní bakteriální buňky, ačkoliv nelze vyloučit ani použití gram-positivních bakterií. Jako příklad takových gram-negativních bakterií můžeme uvést Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli a hlízkovité bakterie.

-4Koncentrace mikrobiálních buněk ve směsi připravené podle kroku A podle vynálezu se pohybuje v rozmezí 10⁴/ ml až 10^:3/ml, nejlépe však v rozmezí od 10¹⁰/ml do 10^u/ml.

Materiálem, který je smíchán s mikrobiálními buňkami způsobem podle kroku A podle vynálezu, je libovolná polyhydroxylové sloučenina, například polyalkohol jako je manitol, inositol, sorbitol, galacitol, nebo výhodněji cukr a zejména pak některý sacharid.

Tam, kde je jako materiál použit sacharid, může se jednat o disacharid, trisacharid, oligosacharid nebo výhodně o monosacharíd. Jako příklad monosacharidů mohou být zmíněny hexosy, například rhamosa, xvlosa, fruktosa, glukosa, manosa a galaktosa. Jako příklad disacharidů můžeme zmínit maltosu, laktosu, trehalosu a sacharosu. Jako příklad trisacharidů můžeme zmínit rafinosu. Jako příklad oligosacharidů můžeme zmínit maltodextriny.

Koncentrace polyhydroxylové sloučeniny použité ve směsi v kroku A podle vynálezu se pohybuje v rozmezí 10 mg/10¹⁰ a 1000 mg/10¹⁰ buněk, nejlépe však v rozmezí 200 mg/10¹⁰ buněk až 400 mg/10¹⁰ nelze vyloučit buněk. Odborník bude schopen pomocí jednoduchého experimentu zjistit optimální koncentrace jednotlivých polyhydroxylových sloučenin použitých k přípravě zhroucené matrice. Zjistili jsme například, že optimální koncentrace inositolu se pohybuje kolem 45 mg/ml, a že inositol v koncentracích nad 60 mg/ml způsobuje značné poškození buněk a při koncentracích nižších než přibližně 25 mg/ml nedochází ke zhroucení matrice.

Některé polyhydroxylové sloučeniny vykazují ochranné vlastnosti v širokém rozmezí koncentrací, kdežto jiné mají škodlivý vliv v koncentracích vyšších než je kritická koncentrace, která jak se zdá souvisí s rozpustností dané polyhydroxylové sloučeniny ve vodném roztoku.

-5Vynález je dále ilustrován prostřednictvím přiložených obrázků, které ukazují komposice podle vynálezu a jsou pouze jejich neomezujícími příklady.

Popis obrázků

Obrázek 1 ilustruje formou grafu změnu životaschopnosti bakterií Pseudomonas fluorescens v závislosti na koncentraci (přidávaného) inositolu při lyofilisaci z vodného roztoku inositolu nebo roztoku inositolu v 0,04M MgS04. Svislá osa representuje životaschopnost v jednotkách počet částic na miliardu (to jest 1Ε+09=10^θ ppb, 1E+O8=1O⁸ ppb, a tak dále) a vodorovná osa representuje koncentraci přidávané látky v miligramech na vzorek. Černé čtverečky () v grafu odpovídají inositolu v síranu hořečnatém a kroužky ( O ) odpovídají inositolu ve vodě.

Obrázky 2 až 7 ilustrují formou grafů změnu životaschopnosti lyofilisovaných bakterií Pseudomonas fluorescens v závislosti na koncentraci monosacharidu pro řadu monosacharidu. Svislá osa representuje životaschopnost v jednotkách počet částic (v miliardách) na miliardu (to jest 1E+O=1 miliarda, 5E-l=0,5 miliardy, 2E-l=0,2 miliardy a tak dále) a vodorovná osa representuje koncentraci cukru v miligramech na vzorek. Použité monosacnaridy jsou :

Obrázek 2

Obrázek 3

Obrázek 4 galaktosa fruktosa glukosa

Obrázek

Obrázek xylosa rhamosa manosa

Obrázek 8 ilustruje formou grafu změnu četnosti mrtvých buněk (kj v závislosti na Tg matrice a změnu Tg v závislosti na relativní vlhkosti. Levá svislá osa representuje k_x, pravá svislá osa representuje Tg (’C) a vodorovná osa representuje relativní vlhkost (%) . Černé čtverečky () spojené plnou čárou odpovídají četnosti mrtvých buněk (k,) a kosočtverce

-6skelného spojené přerušovanou čárou odpovídají teplotě přechodu (Tg).

Na obrázcích je životaschopnost vyjádřena jako počet životaschopných bakterií na 10⁹ životaschopných bakterií v původní suspenzi, to jest počet přeživších bakterií z každé miliardy původně životaschopných bakterií. Životaschopnost je vyjádřena v jednotkách počet částic na miliardu (ppb), to jest 10⁹ ppb odpovídá přežití 100% jedinců, 10³ odpovídá přežití 10% jedinců a tak dále.

Z obrázku 1 můžeme vidět, že při nízkých koncentracích inositolu je zachována vysoká životaschopnost buněk, kdežto při vyšších koncentracích, například vyšších než 100 mg/vzorek (což odpovídá 50 mg/ml), se počet životaschopných buněk s rostoucí koncentrací rychle snižuje.

Z obrázků 2 až 7 můžeme vidět, že některé monosacharidy chrání buňky před poškozením v nízkých koncentracích, například nižších než 10 mg/vzorek (což odpovídá 5 mg/ml), a že tento ochranný efekt je v podstatě zachován i při vyšších koncentracích, například kolem 400 mg/vzorek (což odpovídá 130 mg/ml).

Z obrázku 8 můžeme vidět, že tam, kde Tg klesne pod teplotu skladování (representována horní vodorovnou čárou při 21 až 22°C) dochází k podstatnému zvýšení četnosti mrtvých buněk (kl), což dokazuje důležitost udržování skelného stavu v průběhu skladování.

Koncentrace, při níž je použitý materiál účinný, to jest hroutí se, aniž by přílišně poškozoval buňky, je závislá na řadě faktorů, zahrnujících mezi jinými : objem frakce buněk v suspenzi v kroku A; vlastní teplotu skelného přechodu polyhydroxylové sloučeniny; změnu teploty skelného přechodu matrice jako funkci koncentrace vody v ní přítomné; teplotu, které je matrice vystavena v průběhu lyofilisace a po ní.

že polyhydroxylová sloučenina

Je nutno si uvědomit, při

Izt r o lzo/H Ί -ΐ ττότη

JDLtHKj £-*Χ,Κ_\_Λ xJ ÍVVO4X -X v y m muže fungovat (i

11ΧΔ JS.y k_,H t ep lot aCu jako l3tka ΟπΓ^ΠΙΟΙ r,vř o nHn rt τ m W^U-LUL

Ή o»n 1 ot C. C τοοΗ ’η/·\/*ίοττ rr*v*·^X> d <-. 1ll XllJ-Cll vfrT_á§t§ proti poškození způsobeným částicemi ledu během lyofilisace; a/nebo { ii ) jako látka chránící buňky proti poškození způsobeném ztrátou vody během sušení a/nebo skladování; a/nebo ( iii ) jako zdroj výživy během regenerace buněk.

Mikrobiální buňky používané ve způsobu podle vynálezu mohou být pěstovány v obvyklých růstových mediích, například v živném bujónu nebo v tryptickém sojovém bujónu. Tyto buňky i -J mohou byt odebraný behem jakékoliv vhodné táze jejich rustu, r/rřiOrloQ TTo->b y íí^juuC vccin.

cuac.xuiiui.mx xuxx.

Například, kultura může být pěstována v nebo na vhodném mediu, nanříklad v kenelném mediu nebo ne nlotnách s živnou * - - » - x -- X ' X půdou, až je dosaženo žádané koncentrace buněk. Buňky jsou isolovány obvykle centrifugací. Dále jsou suspendovány ve vodném mediu, které obsahuje jednak materiál z něhož se potě vytvoří matrice, a jednak nepovinně další přísady, jak je zde zmiňováno.

TTAk Λ pj*·. X 4 _ «,4 A 7 ~ 4 V-.,-. A V» - Zí A A ~ , v ynauuc jouu ul-l aauu xaxiii k?uiij\.y ^OUbivaiíc v c óuuouvuu /Λ ΐο,οΊοττΑοτί ru® o t οττΛΡί o m O’1 Πυ-Ότί /4 ,^ττΆ η τ r τγ ^CaxS VyiiUiCl.a XJU J_d v činy t* XUdUaVCiia iuCua-lcí / »j v tAAl_y v χ*/, 7tG ln i

0bS3hUj í CÍj nol vhvrlr^wl d u. Jř **jr d xx J -¹- d V d m β 1 ruTGOm i mi vhodná přísady a tak dála a vysušeny. Nicméně nevylučujeme možnost/ že polyhydroxylová sloučenina a vhodné přísady, a tak dále jsou přidány k buňkám v růstovém mediu a teprve výsledná směs je vysušena. Tam, kde jsou buňky suspendovány, jsou suspendovány ve vhodném vodném mediu, například vodném roztoku MgS04 nebo ještě lépe ve vodě, obsahujícím poiynydroxylovou sloučeninu.

Sušení podle kroku B ve způsobů podle vynálezu může

V·* ·*V τ »4 X w-1 —\ X 4 b J -Λ A —k 1 /» Λ 1· -r ·> z> -V» —> « z* vyt yid v o.kAtdiikJ napi a aaguí jcxa.<j cvapOLabC/ — Q_ nebo v následujícím. kroku je

O UÚCil X _Λ -i 1 A v. x-s ucj±cpc t rr\ F-? 1 ? c· » o -l- J -u -U J- -L· *J uoo. <

Během sušení (krok B) nezbytné dosáhnout v předchozím textu.

plastického toku tak, jak je řečeno

Obsah vody v komposici vysušené podle kroku obvykle nižší než 15 hmotnostních procent (w/wj.

B je

Tam, x_y uxx xxoauc / ttH <-sz-4r> /rr»H ni V XX\>K«4XX_y C/XX £> J kde ob :sad se susem podle kroku . , x 4 x\

OCU1U J o kompos:

x\V\t tt 1 o oxj v_y axc

B provádí jako *->/-> Ά ττί o jcUuu ííztxjuv vxuc

ToVti t-i η b-1 ttVn m vr/“»V> 4 OpcJ m/i % πτπ/~\ mz oCiívo kz J- j_ iv ClUt V v x ic/vxxx y Ci x xyj_ x O CLv^ xnux. \_χχχ^ xn<.

ηγ·θ2ΐι jako látky chnánici působonim toplot pod bodem πΐΓΞζυ_ζ nepřikled cukny nebo polymerní sloučeniny jako například pol vvi nvl a 1 koho! , polyvinylpyrrolidon; látky chránící buňky proti poškození způsobeném ztrátou vody, například cukry nebo polymerní sloučeniny jako například polyvinylalkohol, polyethylenglykol; nebo ještě lépe antioxidanty nebo takzvané potencující látky jako například askorbát nebo glutamát. Nevylučujeme ani možnost, že mohou být přítomny i jiné hn n Vv nřoH Jt* *_ $ Vt\H 1 7 ΤΓΤΤΤ — — - J * px AOCtdy y kv»· n 1 4 e~* , ί —< 4 z·» 4

X^ O OGXXOUJ XUX ncmcih ? nVcibn

ZS.4 1.7 >4 uayix hxciu > li jCx zoytnujici látky, například jako n3.pjui.kl3d močovina/13?imotbyiamin~N~oxid/ pvo 1 in._z m -n r> -? +- x-\ 7 χα,πχ ucx / napniklad <5a -rV-oc? ď n iy uixC3.ii u._y

Vynález je dále následujících příkladů.

ilustrován orostřednictvím d*í izi -v^Tr 1 u χχΛ.χαχγ x

Tyto příklady ilustrují komposice podle vynálezu, v nichž matrice obsahuje rhamosu.

Pseudomonas fluoroscens byly pěstovány ve standardním mediu (dvojnásobně koncentrovaný živný bujón) a isolovány centrifugací v časné stacionární fázi rustu. Buněčný

-9koncentrát byl suspendován ve sterilní vodě a dále byl přidán koncentrovaný roztok rhamosy sterilisovaný v autoklávu, v objemu dostačujícím k přípravě přibližně 200 alikvotů o výsledné koncentraci 200 mg cukru na 2x1010 buněk v celkovém objemu 4 ml vody. Alikvoty byly umístěny do lyofilisačních lahviček o objemu 5 ml.

Lahvičky byly vloženy do komor lyofilisátoru a teplota v komorách nastavena na -30 °C, přičemž nejprve došlo ke zmrznutí obsahu lahviček a následně v průběhu dvou hodin k poklesu teploty jejich obsahu na -28 °C až -30 °C. Poté byly zavedeno vysoké vakuum a primární sušení probíhalo celkem 48 hodin. Teplota v komorách byla zvýšena na 0 °C a sekundární sušení probíhalo celkem 24 hodin. Nakonec byly lahvičky vytemperovány na pokojovou teplotu a před vyjmutím z lyofilisátoru byly pod vakuem zapečetěny.

Lahvičky byly skladovány při 4 °C ve vakuu (příklad 1) nebo na vzduchu s kontrolovanou vlhkostí při 21 °C (příklady 2 až 6) .

Vzorky byly rehydratovány ve sterilní vodě a počet životaschopných bakteriálních buněk byl stanoven metodou postupného zřeďování s následným výsevem na King s B růstové medium. Počet buněk schopných vytvořit kolonie (colony forming units, cfu) na plotnách s největším zředěním byl použit ke zjištění počtu bakteriálních buněk které přežily lyofilisaci a podmínky skladování v jednotce objemu.

Okamžitě po lyofilisaci byla životaschopnost buněk 3xlO^a ppb.

Výsledky získané použitím bakterií skladovaných při 4°C ve vakuu jsou uvedeny v tabulce 1.

-10Tabulka 1

Příklad číslo	Životaschopnost (ppb)
skladování po dobu (týdnů)
30	50
1	ND	5x10⁸
CTI	0	-

ND: nestanoveno

CTI je srovnávací test bez přítomnosti rhamosy.

Z tabulky 1 je patrné, že přítomnost rhamosové matrice podstatně zlepšila životaschopnost bakterií.

Výsledky získané použitím bakterií skladovaných při 21 °C v komůrkách s kontrolovanou vlhkostí vzduchu jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2

Příklad číslo:	Relativní vlhkost (RH%)	Životaschopnost (ppb)
skladování po dobu (dnů)
13	27	3
2	1	8 x 10⁷	3 x 10⁷	4 x 10⁷
3	4	3 x 10⁷	7 x 10⁷	2 x 10⁷
4	9	9 x 10⁷	5 x 10⁷	4 x 10⁷
5	23	4 x 10⁷	4 x 10⁷	8 x 10⁷
6	44	3 x 10⁷	1 x 10⁷	3 x 10⁷
CT2	1	10³

CT2 je srovnávací test bez přítomnosti rhamosy.

Z tabulky 2 můžeme vidět, že přítomnost cukru podstatně zlepšila životaschopnost bakterií dokonce při nízké relativní vlhkosti, což je patrné ze srovnání příkladu 2 s CT2.

-11Příklady 7 až 10

Tyto příklady ilustrují komposice podle vynálezu, v nichž matrice obsahuje rhamosu a síran hořečnatý.

Postup byl stejný jako v příkladech 1 až 6 až na skutečnost, že buněčný koncentrát byl namísto ve sterilní vodě suspendován v 0,04M síranu horečnatém a teprve poté byl přidán roztok rhamosy.

Okamžitě po lyofilisaci byla životaschopnost buněk 5x10³ ppb.

Lyofilisované buňky byly skladovány při různých teplotách a po různě dlouhou dobu jak je uvedeno v tabulce 3.

Tabulka 3

Příklad číslo:	Teplota skladování	Životaschopnost (ppb) po dnech
50	100	175	365
7	-20	5 χ 10^a	5 χ 10³	5 x 10®	5 x 10®
8	4	2 χ 10⁸	2 χ 10⁸	1 χ 10®
9	15	2 χ 10⁸	1 x 10®	5 x 10®
10	20	2 χ 10³	2 x 10®

Z tabulky 3 můžeme vidět, že tyto směsi poskytují podstatnou ochranu v celém rozsahu teplot.

Příklady 11 až 15

Tyto příklady ilustrují komposice podle vynálezu, v nichž matrice obsahuje askorbát sodný a glutamát sodný.

Postup byl stejný jako v příkladech 1 až 6 vyjma skutečnosti, že k buněčnému koncentrátu a rhamose byly přidány vodné roztoky askorbátu sodného a glutamátu sodného.

-12Okamžitě po lyorrlisaci byla životaschopnost buněk 2x10® ppb.

Vzorky byly skladovány na vlhkém vzduchu při teplotě

21°C.

Tabulka 4

Příklad	Relativní	Životaschopnost (ppb)	Tg
číslo:	vlhkost	skladování po dobu (dnů)
	(RH%)			°c
		34	128
11	0	1 x 10³	1 x 10⁸	25
12	14	1 x 10³	1 x 10⁸	24
13	30	1 x 10³	4 x 10⁷	14
14	40	9 x 10'	5 x 10^s	12
15	53	3 x 10⁷	3 x 10³	8

Z příkladů 11 a 12 a v tabulce 4 můžeme vidět, že skladování vysušených buněk při teplotách nižších než je Tg matrice stabilisuje buňky během dlouhého období.

Výsledky naznačují, že kombinace zhroucené matrice ve skelném stavu a přítomnost antioxidantú poskytují matrici, která může na dlouhou dobu zachovat životaschopné buňky a to i při relativně nepříznivých podmínkách.

Příklad 16 gramy pelety Pseudomonas fluorescens obsahující 5.10¹² životaschopných buněk byly centrifugací odděleny od růstového media a smíchány se 14 gramy maltodextrinu komerční kvality (Glucidex IT19) a 1,6 gramy askorbátu sodného a tento materiál byl vysoušen za sníženého tlaku nejdříve při pokojové teplotě, přičemž odpařená voda kondenzovala ve vymrazovací kapse, kde byly teplota udržována na -50 “C.

-13Sušení bylo ukončeno přibližně po 18 hodinách, když hodnota vakua dosahovala řádově 1 mbar.

Vzorky byly rehydratovány v čisté vodě a vysety na živný agar, který obvykle vykazuje 50 až 90% přežití původně životaschopných buněk.

Materiály připravené tímto způsobem se jeví jako zhroucené amorfní matrice se skelným přechodem vyšším než 20 °C (jestliže byly vzorky vystaveny standardním laboratorním relativním vlhkostem).

Claims

1. Stabilisovaná, vysušená komposice vyznačuj ící se tím, že obsahuje mikrobiální buňky v stabilisovanémním stavu suspendované ve zhroucené matrici, přičemž mikrobiální buňky jsou gram-negativní bakterie.

2. Komposice podle nároku 1 vyznačující se tím, že gram-negativní buňky jsou Pseudomonas fluorescens, Escherichia coli nebo hlízkovité bakterie.

3. Způsob přípravy stabilisované, vysušené komposice obsahující mikrobiální buňky vyznačuj ící se tím, že mikrobiální buňky jsou gram-negativní bakterie ve stabilizovaném stadiu suspendované v matrici, přičemž tento způsob zahrnuje tyto kroky:

A: smíšení mikrobiálních buněk s vodným roztokem, obsahujícím hmotu, ze které je odvozena matrice

B: sušení této směsi za podmínek, za kterých dochází k viskósnímu toku hmoty matrice tak, že dojde ke zhroucení matrice, přičemž buňky nejsou příliš poškozeny.

4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že komposice připravená v kroku B je dále vysoušena tak, aby se dosáhlo zvýšení teploty skelného přechodu hmoty matrice, čímž je komposice stabilisována v širším rozsahu skladovacích podmínek.

5. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že koncentrace mikrobiálních buněk ve směsi připravené v kroku A je v rozsahu mezi 10⁴/ml a 10¹³/ml.

-15£^UBSrmjTE~sm^

6. Způsob podle nároku 5 vyznačující se tím, že koncentrace mikrobiálních buněk A je v rozsahu mezi 10¹⁰/ml a 10^u/ml.

7. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že hmota, která je v kroku A smíšena s bakteriálními buňkami, je polyhydroxylová sloučenina.

8. Způsob podle nároku 7 vyznačující se tím, že polyhydroxylová sloučenina je monosacharid.

9. Způsob podle nároku 7 tím, že koncentrace použité ve směsi podle

10 mg/10¹⁰ buněk a 1000 mg/10 buněk.

vyznačující se polynydroxylové sloučeniny kroku A je rozsahu mezi

10. Způsob podle nároku 9 vyznačující se tím, že koncentrace polyhydroxy sloučeniny je v rozsahu mezi 200 mg/10¹⁰ buněk a 400 mg/10¹⁰ buněk. ¹¹

11. Komposice připravená podle nároku 3 vyznačující se tím, že teplota jejího skelného přechodu je vyšší než předpokládaná skladovací teplota.