CZ280694B6 - Způsob přípravy lidského insulinu - Google Patents

Abstract

Příprava lidského insulinu z derivátu lidského insulinu, který vznikne jako prekursor při kondenzaci desoktapeptidu insulinu s karboxyterminálním oktapeptidem B-řetězce, jenž má .SIGMA.-aminoskupinu v posici Lys.sup.B29 .n.chráněnou skupinu fenyloctovou, za katalysy trypsinem v částečně nevodném prostředí. Prekursor se od reakční směsi oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a podrobí se štěpení penecilinamidohydrolasou, která je v nerozpustné formě zakotvena na interním nosiči, přičemž se odštěpí fenoloctová kyselina z .SIGMA.-aminoskupiny lysinu a vznikne lidský insulin, který se od ostatních komponent oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Derivát lidského insulinu, který má .SIGMA.-aminoskupinu Lys.sup.B29 .sup..n.chráněnou fenyloctovou kyselinou.ŕ

Description

Způsob přípravy lidského inzulínu

Oblast techniky

Vynález popisuje způsob semisyntetické přípravy derivátu lidského inzulínu a lidského inzulínu.

Dosavadní stav techniky

Dosavadní způsoby semisyntetické přípravy lidského inzulínu z desoktapeptidu B23-B30 inzulínu (DOI) a C-koncového oktapeptidu B-řetězce lidského inzulínu vycházejí z oktapeptidu, který má Lys v poloze B29 chráněný skupinami terč, butylkarbonyl, florenylmethyloxykarbonyl, benzyloxykarbonyl, odštěpitelnými v kyselém prostředí (HF, HC1) (Inouye K., Watanabe K., Morihara K., Tochino Y., Kanaya T., Emura J., Sakakibara S. (1979) J. Am. Chem. Soc. 101, 751 až 752). Kyselému prostředí je ovšem vystavena celá molekula inzulínu, což se může projevit v nižších výtěžcích biologicky aktivního lidského inzulínu.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob přípravy lidského inzulínu, který spočívá v tom, že se kondenzací desoktapeptidu inzulínu s karboxyterminálním oktapeptidem B řetězce vzorce I

Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys(Pac)-L-Thr (I) kde Pac je fenylacetylové skupina, za katalýzy trypsinem v částečně nevodném prostředí, obsahujícím maximálně 50 % hmot, vody, připraví derivát lidského inzulínu s e-aminoskupinou Lys chráněnou fenylacetylovou skupinou, potom se derivát lidského inzulínu oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií a podrobí se štěpení penicilinamidohydrolazou v nerozpustné formě, zakotvenou na inertním nosiči, přičemž se odštěpí fenylacetylové skupina z e-aminoskupiny lysinu a vznikne lidský inzulín, který se od reakční směsi oddělí, s výhodou vysokoúčinnou kapalinovou chromatograf ií .

Metodika přípravy karboxyterminálního oktapeptidu B-řetězce npq lidského inzulínu s e-aminoskupinou Lys chráněnou fenylacetylovou skupinou je popsána v CZ patentu 280 690.

Výhodou tohoto způsobu přípravy je v použití mírného prostředí, kdy se chráněná skupina Pac odštěpí z postranního řetězce lysinu zakotvenou penicilinamidohydrolazou. Tento způsob byl popsán v CZ patentu 280 690.

-1CZ 280694 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Příprava lidského (Pac)-Lys^B29-inzulinu (Pac = fenylacetyl)

100 mg oktapeptidu I se rozpustí v 30 μΐ dimethylformamidu (DMF) a 130 μΐ 50 mM roztoku octanu vápenatého. Potom se přidá 100 mg desoktapeptid B23-B30-inzulinu (DOI) a 20 mg trypsinu v 100 μΐ 50 mM roztoku octanu vápenatého. pH (zdánlivé, měřeno kombinovanou elektrodou skleněná-kalomelová) bylo upraveno pomocí 30 μΐ 4-methylmorfolinu na hodnotu 6,8. Výsledná koncentrace vody byla 40 % obj. (měřeno coulometrickou metodou podle Karla Fischera). Roztok byl slabě míchán za teploty 20 °C po dobu 7 hodin. Reakce byla zastavena přidáním 5 ml 10 % obj. kyseliny octové. Tento roztok byl nasazen na kolonou Sephadexu G-50f (3x70 cm). Chromatograf ie probíhala v 10 % obj. kys. octové při teplotě 20 °C rychlostí 0,9 ml/min. Frakce obsahující analog inzulínu a DOI byly spojeny a lyofilizovány. Získáno bylo 46 mg. část této směsi byla rozdělena pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) na koloně Vydac C18 (1x25 cm) při gradientu acetonitrilu v 0,1 % obj. trifluoroctové kyseliny (TFA).

n o Q

Získáno bylo 2 mg čistého lidského (PAc)-Lys -inzulínu. Tento produkt byl homogenní za podmínek RP-HPLC a kapilární elektroforézy v kyselém i zásaditém prostředí. Složení produktu bylo ověřeno aminokyselinovou analýzou i hmot, spektrometrií (5926 Da).

Příklad 2

DQQ

Lidský inzulín s e-aminoskupinou Lys chráněnou fenyloctovou skupinou (1 mg) byl rozpuštěn v 0,1 ml 8 M močoviny a k vzniklému roztoku bylo přidáno 0,7 ml 50 nM Na-fosfátového pufru o pH 6,5. Tento roztok pomocí peristaltického čerpadla cirkuloval při pokojové teplotě přes kolonku s 200 mg porézního skla s 5 mg imobilizované a předem purifikované penicilinamidohydrolazy (Barth a kol. CS 275 449). Do systému byla dále zapojena kolonka s 4 mg Dowexu 1x8 (Strongly Basic Anion Exchanger, Fluka, Buchs, SRN). Tento silný anex byl použit za účelem vychytávání vznikající fenyloctové kyseliny, která jako produkt hydrolytické reakce inhibuje aktivitu enzymu. Obě kolonky byly před pokusem promyty 50 mM Na-fosfátovým pufrem o pH 6,5. Průběh reakce byl sledován pomocí RP-HPLC na koloně Vydac C18 (1x25 cm) při gradientu acetonitrilu v 0,1 obj. TFA. Po zhruba 230 minutách reakce byl substrát konvertován v nechráněný lidský inzulín.

Claims (1)

1. Způsob přípravy lidského inzulínu, vyznačený tím, že se kondenzací desoktapeptidu inzulínu s karboxyterminálním oktapeptidem B řetězce vzorce I

   Gly-L-Phe-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys(Pac)-L-Thr (I) kde Pac je fenylacetylová skupina, za katalýzy trypsinem v částečně nevodném prostředí, obsahujícím maximálně 50 % hmot, vody,

   XI O Q připraví derivát lidského inzulínu s e-aminoskupinou Lys chráněnou fenylacetylovou skupinou, potom se derivát lidského inzulínu oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii a podrobí se štěpení penicilinamidohydrolazou v nerozpustné formě, zakotvenou na inertním nosiči, přičemž se odštěpí fenylacetylová skupina z e-aminoskupiny lysinu, a vznikne lidský inzulín, který se od reakční směsi oddělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii.