CZ280848B6 - Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech - Google Patents
Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech Download PDFInfo
- Publication number
- CZ280848B6 CZ280848B6 CZ94460A CZ46094A CZ280848B6 CZ 280848 B6 CZ280848 B6 CZ 280848B6 CZ 94460 A CZ94460 A CZ 94460A CZ 46094 A CZ46094 A CZ 46094A CZ 280848 B6 CZ280848 B6 CZ 280848B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- mol
- mmol
- concentration
- activation
- carried out
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 230000004913 activation Effects 0.000 title claims description 61
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 36
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims description 35
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 title description 3
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims abstract description 56
- YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N glutathione disulfide Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CSSC[C@@H](C(=O)NCC(O)=O)NC(=O)CC[C@H](N)C(O)=O YPZRWBKMTBYPTK-BJDJZHNGSA-N 0.000 claims abstract description 29
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims abstract description 26
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims abstract description 18
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 claims abstract description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims abstract description 3
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 claims description 30
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 claims description 10
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 claims description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 9
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 5
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000003398 denaturant Substances 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 3
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 claims description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims 1
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 abstract description 32
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 abstract description 32
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 11
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 abstract description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 abstract description 4
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 241000589776 Pseudomonas putida Species 0.000 abstract description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 abstract description 2
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 abstract 3
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 abstract 1
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 60
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 25
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 22
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 22
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 20
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 18
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 18
- 238000010405 reoxidation reaction Methods 0.000 description 18
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 17
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N Acetamide Chemical compound CC(N)=O DLFVBJFMPXGRIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 4
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 4
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N N-methylformamide Chemical compound CNC=O ATHHXGZTWNVVOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 2
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 2
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N N,N'-dimethylurea Chemical compound CNC(=O)NC MGJKQDOBUOMPEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- HTHVSMTZYMMWKO-UHFFFAOYSA-N formamide Chemical compound NC=O.NC=O HTHVSMTZYMMWKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- -1 glutathione sulfide Chemical compound 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N propionamide Chemical compound CCC(N)=O QLNJFJADRCOGBJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940080818 propionamide Drugs 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 101100126625 Caenorhabditis elegans itr-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- XZOWIJDBQIHMFC-UHFFFAOYSA-N butanamide Chemical compound CCCC(N)=O.CCCC(N)=O XZOWIJDBQIHMFC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- BDRXWKQHYVODTF-UHFFFAOYSA-N ethylurea Chemical compound CCNC(N)=O.CCNC(N)=O BDRXWKQHYVODTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 235000003969 glutathione Nutrition 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- KNXPUKOZGDCUHL-UHFFFAOYSA-N methylurea Chemical compound CNC(N)=O.CNC(N)=O KNXPUKOZGDCUHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000029983 protein stabilization Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000006176 redox buffer Substances 0.000 description 1
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006277 sulfonation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N urea urea Chemical compound NC(N)=O.NC(N)=O ZJHHPAUQMCHPRB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Způsoby aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, postup spočívá v tom, že se reaktivace provádí při pH 9 - 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/l, při koncentraci GSSG 0,01 až 3 mmol/l a při koncentraci denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.ŕ
Description
Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech.
Dosavadní stav techniky
Při expresi heterologních bílkovin v prokaryotických organismech vytváří tyto bílkoviny v cílových buňkách často inaktivní, nesnadno rozpustné agregáty, tzv. refraktivní těliska (refractile bodies), která jsou mimoto znečištěna bílkovinami, vlastními cílovým buňkám. Je pravděpodobné, že tvorba těchto tělísek je důsledkem vysoké koncentrace bílkovin v buňce při expresi. Je známo, že při tvorbě velkých množství enzymů v buňce dojde v důsledku tohoto stavu v buňce ke shlukování enzymů na nerozpustné, vysokomolekulárni a z větší části neúčinné částice. Než je možno tyto bílkoviny užít např. k léčebným účelům, je zapotřebí je čistit a převést z neúčinné formy na formu účinnou.
Podle známých postupů je možno dosáhnout aktivace různým způsobem v několika stupních, jak bylo například popsáno v publikacích B.R.Jaenicko, FEBS Federation of European Biochemical Societies, sv. 52 (1979) 187 až 198, R.Rudolph, Biochemistry 18 (1979) 5572 až 5575.
V prvním stupni se dosáhne rozpustnosti bílkovin přidáním silného denaturačniho prostředku, např. guanidin-hydrochloridu nebo močoviny ve vysoké koncentraci, nebo přidáním silně kyselých činidel, např. směsi glycinu a kyseliny fosforečné. Jako další pomocná látka padají v úvahu reakční činidla, která obsahují skupiny SH-, například dithioerythritol nebo EDTA, zejména při renaturaci LDH. Jakmile je bílkovina znečištěna bílkovinami cílových buněk, je nutno provést v následujícím stupni čištění běžným způsobem, například chromatografií na gelu nebo na iontoměniči. Pak se získaný materiál silně zředí, čímž se sníží koncentrace denaturačního činidla. Při použití guanidinhydrochloridu je nutno vzorec zředit až na hodnoty nižší než 0,5 mol/1. V případě enzymů s volnými SH-skupinami je účelné přidat činidlo, které tyto skupiny chrání, jak bylo popsáno například v publikaci B.R.Jaenicke, Journal Polymer Science, sv. C 16 (1967) 2143 až 2160.
V Evropské patentové přihlášce č. 114 506 je popsán postup pro izolaci, čištění a aktivaci heterologního produktu exprese z bakteriálních kultur. K aktivaci se užije roztoků refraktivních tělísek v silném denaturačním činidle, které se a) přímo převedou na roztoky ve slabším denaturačním činidle a pak se tyto roztoky oxidují k zajištění zpětné tvorby disulfidových můstků, b) bílkovina se podrobí sulfonací, načež se převede do roztoku ve slabším denaturačním činidle a S-sulfonátové skupiny se převedou na redukovanou a oxidovanou formu, například působením GSH/GSSG za vzniku skupin -S-S-, nebo se c) roztok ve slabém denaturačním činidle přímo zpracovává působením reakčního činidla sulfhydrylového typu,
-1CZ 280848 B6 např. směsí GSH/GSSG. Typickým příkladem, u něhož dochází ke svrchu uvedeným problémům, je t-PA.
Hlavní složka bílkovinové matrice krve je polymerní fibrin. Tato bílkovina se rozpouští působením plasminu, který se tvoří z plasminogenu aktivací tzv. aktivátory plasminogenu, například působením t-PA (tkáňový aktivátor plasminogenu, tissue-type plasminogen activator). Enzymatická účinnost přírodního nebo genetickou technologií z eukaryotických organismů získaného t-PA je v nepřítomnosti fibrinu nebo štěpných produktů fibrinu (FSF) velmi nízká, je však možno ji zvýšit přidáním svrchu uvedených stimulátorů, a to více než desetkrát. Tato tzv. stimulovatelnost účinnosti je velkou výhodou t-PA ve srovnání s jinými známými aktivátory plasminogenu, jako je například urokinasa nebo streptokinasa, jak bylo popsáno např. v publikacích M. Heylaerts a další, J. Biol. Chem. 257, (1982) 2912 až 2019, Nieuwenhiuzen a další, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 35.
Zásadně je možno vytvořit neglykosilovaný produkt typu t-PA také v prokaryotických organismech genetickou manipulací při použití c-DNA. Při použití tohoto produktu však nepadá v úvahu stimulovatelnost účinnosti jako v případě t-PA z eukaryotických organismů. Příčinou je patrně ta skutečnost, že různé podmínky, zejména redukce a oxidace, se natolik liší v prokaryotické buňce a v eukaryotické buňce, z níž pochází gen, že se od počátku tvoří neúčinný produkt, což patrné spočívá ve špatné tvorbě můstku SS, které přírodní molekula obsahuje, nebo se tyto můstky vůbec netvoří, popřípadě jsou vázány nevhodným způsobem. Při léčebném použití t-PA však se nepožaduje pouze enzymatická účinnost t-PA, avšak také enzymatická stimulovatelnost tohoto produktu jako taková. Na skutečnost, že buňky prokaryotických organismů obvykle nevytváří účinné bílkoviny, jejichž původem jsou eukaryotické organismy, se poukazuje například také v publikaci The AMBO Journal 4. č. 3 (1985) 755 až 780.
V Evropské patentové přihlášce č. 93 619 se při aktivaci t-PA buněčné pelety, získané z E. coli, uvedou do suspenze v guanidinhydrochloridu o koncentraci 6 mol/1, rozruší se ultrazvukem, získaný materiál se inkubuje a pak se dialysuje 4 hodiny proti roztoku tris-HCL o pH 8,0 ve směsi s chloridem sodným, kyselinou ethylendiamintetraoctovou s prostředkem Tween 80. Po dialýze se materiál odstředí, přičemž v supernatantu je možno prokázat aktivátor plasminogenu. Tímto způsobem získaný t-PA je proteolyticky účinný, není ho však možno stimulovat štěpnými produktý po působeni kyanidu bromu na fibrin (BrCN-FSP), jak bylo popsáno v publikaci J.H.Verheijen, Tromb. Haemostas, 48, (3), 260-269 (1982).
Pro aktivaci denaturovaných bílkovin není v literatuře popsán žádný všeobecně použitelný postup. To platí zejména pro t-PA, protože přírodní bílkovina má velmi složitou stavbu. Obsahuje volnou thielovou skupinu a 17 SS-můstků, které jsou teoreticky spojeny na 2,2 χ 1020 způsoby, přičemž pouze jediná z těchto struktur odpovídá přírodnímu stavu. Způsoby pro aktivaci t-PA, které jsou známé z literatury, vedou k získání proteolyticky účinného t-PA, který však nevykazuje žádnou měřitelnou stimulovatelnost. Není znám žádný postup aktivace, který by vedl k získáni stimulovatelného t-PA.
-2CZ 280848 B6
Vynález si klade za úkol navrhnout způsob úplné aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, přičemž se v reaktivačním stupni jako denaturační činidlo užije arginin nebo guanidinhydrochlorid v koncentraci v rozmezí 0,1 až 1,0 mol/1, s výhodou v rozmezí 0,25 až 0,8 mol/1 a/nebo alespoň jedna sloučenina obecného vzorce I
R2 - CO - NRR1 (I), kde
R a R-j_ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, a
R2 znamená atom vodíku, zbytek NHR^ nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku, v koncentraci v rozmezí 0,5 až 4 mol/1, s výhodou 1 až 3,5 mol/1, a reaktivace se provádí při pH 8 až 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/1 a při koncentraci GSSG 0,01 až 3 mmol/1, vyznačený tím, že se v reaktivačním stupni postup provádí v přítomnosti koncentrace denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.
Výhodná provedení podle způsobu budou dále popsána.
Z denaturačních činidel je možno při provádění způsobu podle vynálezu užit činidla, běžné užívaná pro aktivaci za oxidačních podmínek, nebo argininu. Výhodným denaturačním činidlem je guanidinhydrochlorid, močovina nebo deriváty těchto látek. Dalším vhodným činidlem je arginin. Je rovněž možno použit směsi svrchu uvedených denaturačních činidel.
S výhodou se aktivační stupeň provádí také za přítomnosti cizorodé bílkoviny,která není proteolyticky účinná, s výhodou albumin ze séra skotu (BSA), například v množství 1 až 3 mg/ml. Přídavek BSA má za následek malé zvýšeni výtěžku a současné stabilizaci bílkovin (pravděpodobné chrání proti denaturaci povrchu a/nebo proti proteolytickému odbouráváni).
Další podmínky způsobu podle vynálezu odpovídají podmínkám reaktivace, známým z literatury. Aktivace (inkubace) trvá s výhodou 20 až 48 hodin při teplotě místnosti. Poločas aktivace je za přítomnosti 0,5 mmol/1 redukovaného GSH a oxydovaného GSSG glutationu v rozmezí přibližné 10 až 15 hodin při teplotě 20 °C.
Při další inkubaci, například 48 hodin za reoxidačních podmínek obvykle stimulovatelnost klesá v důsledku CNDr-FSP. Akti
-3CZ 280848 B6 vační stupeň se s výhodou provádí za přítomnosti kyseliny ethylendiamintetraoctové, s výhodou v koncentraci 1 mmol/1.
Stupně aktivačního postupu reoxidace a aktivace nebo předcházející a následující stupně, například rozrušení buněk, rozpouštění a popřípadě jeden nebo větší stupeň aktivace a/nebo následující čištění je možno provádět podle známého stavu techniky, tak jak byl popsán například v Evropských patentových přihláškách Č. 114 506 a 93 619.
Z hlediska vysokých výtěžků a dobré aktivace je však účelné provádět jednotlivé stupně nebo všechny stupně s ohledem na svrchu popsané podmínky postupu.
Zvláště je možno provádět stupně způsobu podle vynálezu, spočívající v aktivaci směsi, získané rozrušením buněk bez předchozí denaturace a/nebo redukce, výtěžky jsou však dosti nízké. K expresi se používá prokaryotických organismů, s výhodou P. putida a zejména E. coli, způsob podle vynálezu je však možno provádět i v dalších prokaryotických organismech, jako jsou například Bacilli, v nichž je rovněž možno dosáhnout exprese požadované bílkoviny.
Rozrušení buněk je možno provádět známými způsoby, například působením ultrazvuku, dispergováním za zvýšeného tlaku nebo působením lysozymu. Jako prostředí pro suspenzi se s výhodou použije roztok pufru, který dovoluje nastaveni neutrálního až slabě kyselého pH, například 0,1 mol/1 tris-HCl. Po rozrušení buněk se nerozpustné součásti těchto buněk, tzv. refraktivní tělíska, oddělí libovolným způsobem, s výhodou energickým odstředěním při delší době odstředováni, nebo filtrací. Po promytí látkami, které nerozrušují t-PA, avšak pokud možno rozpouštějí cizorodé buněčné bílkoviny, jako je například voda, popřípadě fosfátový pufr s případným obsahem mírných smáčedel, jako je triton, se sraženina nebo peleta podrobí solubilizaci za redukčních podmínek. Solubilizace se provádí v alkalickém pH, zejména při pH 8,6 ± 0,4 za přítomnosti redukčního činidla ze skupiny merkaptanů a denaturačního činidla.
Jako denaturační činidlo je možno užít činidla, známá z literatury, například z Evropské patentové přihlášky č. 114 506 pro solubilizaci, zejména běží o guanidinhydrochlorid nebo o močovinu. Guanidinhydrochlorid se s výhodou užije v koncentraci 6 mol/1, močovina v koncentraci 8 mol/1. Stejně dobře je možno užít sloučeniny obecného vzorce I,
R2 - CO - NRRT (I) , kde
R a Rj_ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, a
R2 znamená atom vodíku, zbytek NHR-^ nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku.
Jako redukční činidla ze skupiny merkaptanů je možno použít například redukovaný glutathion GSH nebo 2-merkaptoethanol, například koncentraci 50 až 400 mmol/1 dithioethereitonu a/nebo
-4CZ 280848 B6 dithrioerythritol (DTE) nebo dithiothreitol (DTT) například v koncentraci 80 až 400 mmol/1. Solubilizace se s výhodou provádí při teplotě místnosti po dobu jedné nebo většího počtu hodin, s výhodou dvě hodiny. K zábraně oxidace redukčního činidla vzduš- . ným kyslíkem může být účelné přidat k reakční směsi ještě EDTA. Kromě solubilizace a redukce má tento stupeň také čisticí účinek, protože většina materiálu, který není zkřížen imunologicky s t-PA, zejména cizorodých bílkovin, nepřichází do roztoku.
Po solubilizaci a před aktivací je možno zařadit běžné čisticí stupně. Z čisticích postupů přicházejí v úvahu např. sterická chromatografie (SEC) za přítomnosti guanidinhydrochloridu nebo močoviny, nebo iontoměniče za přítomnosti močoviny nebo jejího derivátu. Je možno také užít nespecifickou reoxidaci, které je možno zabránit například 2-merkaptoethanolem nebo nastavením pH na hodnotu 4,5 nebo nižší, jak bylo popsáno v publikaci R.Rudolph, Biochem. Soc. Transactions 13 (1985) 308 až 311. Jakmile je solubilizační stupeň ukončen, je zapotřebí použitý DTE případně odstranit v čisticím stupni.
Čistění je možno provádět například na gelu Sephadex G 100 za přítomnosti guanidinhydrochloridu a redukčního činidla, například glutathions GSH při pH 1 až 4, tímto způsobem je možno oddělit velké množství cizorodé bílkoviny, nebo je možno oddělit denaturační a redukční prostředek odstraněním solí na gelu Sephadex G 25 v 0,01 mol/1 kyselině chlorovodíkové nebo 0,1 mol/1 kyselině octové. Oddělení denaturačního/redukčního činidla je možno uskutečnit také dialýzou.
Další čisticí stupeň může následovat po reaktivačním stupni. Toto čištění se zpravidla provádí dialýzou nebo izolací aktivovaného t-PA, například afinitní chromatografií, např. na Lys-Sepharose.
Způsobem podle vynálezu je tedy možné aktivovat t-PA z prokaryatických organismu tak, že se nejen dosáhne aktivace na obvyklou biologickou účinnost, nýbrž navíc se dosáhne stimulovátelnosti ve svrchu uvedeném významu, a to v množství, které převyšuje daleko stimulovatelnost t-PA při faktoru vyšším než 10, někdy až 50.
Další bílkovinou z eukaryotických organismů, které je možno aktivovat způsobem podle vynálezu po expresi v prokaryatických organismech, je β-interferon.
Praktické provedení způsobu podle vynálezu bude osvětleno v následujících příkladech. Není-li uvedeno jinak, vztahují se procentuální údaje na hmotnostní procento a teplotní údaje na stupně Celsia.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
a) Příprava refraktilních tělisek
100 g vlhké buněčné hmoty E. coli v 1,5 litrech tris/HCl
-5CZ 280848 B6 o koncentraci 0,1 mol/1, pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA se 10 sekund homogenizuje na zařízení Ultra-Turray a pak se přidá 0,25 mg/ml lysozomu. Po 30 minutách inkubace při teplotě místnosti se směs znovu homogenizuje a zchladí na teplotu 3 °C. Buňky se rozruší dispergováním za vysokého tlaku 550 kg/cm2. Pak se přidá 300 ml tris-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA. Po odstředění (Servali GSA, 2 hodiny při 13 000 otáčkách za min., 21 000 g, 4 °C) se peleta smísí s 1,2 litry tris-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA a 2,5 % Triton-X-100 a pak se homogenizuje. Pak se materiál opakovaně odstředí (Servali GSA, 30 min. při 13 000 ot./min., 27 000 g, 4 °C) peleta se smísí s 1,3 litry tris-HCl o pH 6,5 a koncentraci 0,1 mol/1 a 20 mmol/1 EDTA s 0,5 % Triton-X-100 a materiál se homogenizuje. Pak se materiál ještě jednou odstředí (Servali GSA, 30 min. při 13 000 ot./min., 27 000 g, 4 °C) a pelety se homogenizují v 1 litru tris-HCl o koncentraci 0,1 mol/1 při pH 6,5 a 20 mmol/1 EDTA, toto odstředění se provádí třikrát.
Obsah t-PA v refraktilních tělískách se ve výsledném materiálu zjišťuje při použití SDS-Page, pásy s obsahem t-PA se identifikují způsobem Western-blotting a kvantitativně se stanoví denz itometricky.
Při použití tohoto způsobu je možno prokázat silný pás s obsahem t-PA a molekulovou hmotností přibližně 60 jednotek. Podíl t-PA v celkové bílkovině refraktilních tělísek je přibližně 21 %.
b) Solubilizace/redukce refraktivních tělísek
Refraktivní tělíska s koncentrací bílkovin 1 až 5 mg/ml se inkubují v 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 guanidinchloridu, 0,15 až 0,4 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTA po dobu 2 až 3 hodin při teplotě místnosti. Pak se nerozpustný materiál, například buněčné fragmenty a pod., oddělí odstředěním (například Servali 34, 30 minut při teplotě 4 °C, při 15 000 až 20 000 otáčkách/minutu a při 35 000 až 50 000 g). Hodnota pH supernatantu se upraví koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na pH 3. Denaturační a redukční prostředky se oddělí dialýzou proti 0,01 mol/1 kyseliny chlorovodíkové při teplotě 4 °C.
c) Reoxidace/aktivace
Reoxidace/aktivace se provádí při ředění 1 : 50 až 1 : 200 v roztoku, který obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,5 mol/1 1-argininu, 2 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG. Po 17 až 24 hodinách aktivace při teplotě přibližné 20 °C se stanoví účinnost ve srovnání s účinností nativního glykosylovaného t-PA z eukaryotických organismů a výtěžek této látky.
Výtěžek, vztažený na celkový obsah bílkoviny v refraktivních tělískách, se pohybuje v rozmezí:
2,5 ± 0,5 % stimulovatelnost je 10 ± 5.
-6CZ 280848 B6
Výtěžek, vztažený na podíl t-PA v refraktivních tělískách, je přibližně 12 %.
d) Reoxidace/aktivace bez oddělení denaturačního/redukčního činidla
Refraktivní tělíska se inkubují při koncentraci bílkovin 1,25 mg/ml ve směsi, která obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 guanidinchloridu, 0,2 mol/1 DTE a 1 mmol/1 EDTAS 2 hodiny při teplotě místnosti. Okamžité potom se provádí reoxidace při ředění 1 : 100 v roztoku, který obsahuje 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 0,3 mol/1 1-argininu a takové množství GSSG, jako je uvedeno v následující tabulce. Mimo to se stanoví v aktivační směsi zbytek koncentrace guanidinchloridu, který je 0,06 mol/1 a DTE, s hodnotou 2 mmol/1.
Závislost výtěžku aktivace na koncentraci GSSG při aktivaci bez oddělení denaturačního/redukčního činidla.
GSSG (mmol/1)
Výtěžek (%)
Stimulovatelnost (faktor)
| 0,2 | 0 |
| 1 | 0,13 |
| 5 | 1,49 |
| 6 | 1,28 |
| 7 | 1,04 |
| 9 | 0,98 |
| 10 | 1,77 |
| 15 | 0 |
| 20 | 0 |
4,0
1.4
5.4
5,8
5,2
10,0
Výtěžek s čárkou = výtěžek účinného t-PA, vztaženo na celkový obsah bílkoviny v refraktivních tělískách.
Příklad 2
V následujících tabulkách je shrnut vliv různých parametrů způsobu podle vynálezu na aktivaci a stimulovatelnost t-PA. V těchto reoxidačních pokusech byla solubilizovaná, redukovaná bílkovina užita bez předběžného čištění.
Redukovaná bílkovina v 0,01 mol HC1 byla aktivována zředěním 1 : 10 až 1 : 500 v reoxidačnim pufru. Aktivace byla prokazována při teplotě místnosti po inkubaci 22 až 48 hodin při téže teplotě .
Účinnost reoxidované bílkoviny se vztahuje na standardní reoxidaci, která je pokládána za 100 % v roztoku s obsahem
0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-argininu + 1, mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH (redukovaný glutathion) + 0,5 mmol/1 GSSG (glutathionsulfid).
-7CZ 280848 B6
Stimulovátelnost se vypočítává jako E+CNBrFSP/E-CNBrFSP způsobem, popsaným v publikaci W. Nieuwenhuizon a další, Biochemica et Biophysica Acta 755 (1983) 531 až 533. Účinnost v % a stimulovatelnost jako faktor se stanoví způsobem podle publikace J.H. Verheijen Thromb. Haemostas. 48(3), 266-269 (1982).
Výsledky:
1. Závislost výtěžku aktivace na přísadách 1-argininu a guanidinhydrochloridu.
Reakce ve směsi
| 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 | stimulovátelnost (faktor) | |
| + 1 mmol/1 EDTA + 1, mg/ml BSA +0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG a) 1-arginin 1-arginin (mol/1) | účinnost (%) | |
| 0 | 4 | 2,5 |
| 0,25 | 98 | 7,5 |
| 0,5 | 100 | 21,9 |
| 0,75 | 27 | 16,3 |
| 1,0 | 23 | 3,5 |
Při tomto pokusu je nutno uvážit, že 1-arginin působí inhibici t-PA. Pokles výtěžku aktivace při vyšší koncentraci této látky je tedy nutno přičíst inhibici.
b) Guanidin-hydrochlorid (Gdn.HCl) (Gdn.HCl) účinnost (mol./l) (%)
| 0 | 11 |
| 0,25 | 22 |
| 0,5 | 53 |
| 0,75 | 58 |
| 1,0 | 12 |
2. Závislost výtěžku aktivace na přidání močoviny nebo jejích derivátů
Reoxidace ve směsi 0,1 mol/1 tris o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH, a 0,2 mmol/1 GSSG.
a) Močovina
-8CZ 280848 B6
| močovina (mol/1) | účinnost (%) |
| 0, | 1 . |
| 0,5 | 20 |
| 1 | 59 |
| 1/5 | 126 |
| 2 | 162 |
| 2,5 | 141 |
| 3 | 72 |
| 4 | 12 |
| 5 | 0 |
| b) Methylmočovina | |
| methylmočovina | účinnost |
| (mol/1) | (%) |
| 0,5 | 22 |
| 1 | 174 |
| 1,5 | 313 |
| 2 | 375 |
| 2,5 | 332 |
| 3 | 215 |
| 4 | 12 |
| 5 | 0 |
| c) Ethylmočovina | |
| ethylmočovina | účinnost |
| (mol/1) | (%) |
| 0,5 | 46 |
| 1* | 212 |
| 1,5 | 323 |
| 2 | 300 |
| 2,5 | 107 |
| 3 | 19 |
| 4 | 0 |
| 5 | 0 |
d) Dimethylmočovina
| dimethylmočovina (mol/1) | účinnost (%) | stimulovatelnost (faktor) |
| 0,5 | 167 | 8,8 |
| 1 | 256 | 8,9 |
| 1,5 | 283 | 9,4 |
| 2 | 177 | 7,7 |
| 2,5 | 78 | 8,9 |
| 3 | 23 | 9,9 |
| 4 | 4 | 8,6 |
| 5 | 2 | 3,5 |
3. Závislost výtěžku aktivace na přidání amidů alifatických kyselin:
-9CZ 280848 B6
Reoxidace se provádí ve směsi 0,1 mol/1 tris o pH 10,5, 1 mmol/1 EDTA, 1 mg/ml BSA, 5 mmol/1 GSH a 0,2 mmol/1 GSSG.
| a) Formamid | - |
| formamid (mol/1) | účinnost (%) |
| 0 0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 | 42 59 175 245 325 423 444 416 341 |
b) Methylformamid
| methylformamid (mol/1) | účinnost (%) |
| 0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 | 100 135 304 389 466 452 425 121 |
c) Acetamid
| acetamid (mol/1) | účinnost (%) |
| 0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 | 72 134 207 261 204 237 198 141 |
d) Propionamid
| propionamid (mol/1) | účinnost (%) |
| 0,5 1 1.5 2 2.5 3 4 5 | 95 99 207 261 204 237 198 141 |
-10CZ 280848 B6
c) Butyramid butyramid (mol/1) účinnost (%)
| 0,5 | 55 |
| 1 | 52 |
| 1,5 | 17 |
| 2 | 0 |
4. Závislost na výtěžku aktivace na hodnotě pH
Reoxidace se provádí ve směsi + + + + +
0,1 mol/1 tris/HCl mmol/1 EDTA
0,5 mol/1 1-arginin mg/ml BSA
0,5 mmol/1 GSH
0,5 mmol/1 GSSG
| PH | účinnost (%) | stimulovatelnost (faktor) |
| 7 | 1 | - |
| 8 | 22 | 3,0 |
| 9 | 89 | 13,6 |
| 10 | 105 | 20,3 |
| 11 | 95 | 21,3 |
Závislost výtěžku na koncentraci GSH/GSSG
5.
Reoxidace se provádí ve směsi
0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-arginin + 1 mg/ml BSA
a) + 1 mmol/1 GSH
| GSSG (mmol/1) | účinnost (%) | stimulovatelnost (faktor) |
| 0,1 | 239 | 14,9 |
| 0,2 | 273 | 15,3 |
| 0,5 | 193 | 13,3 |
| 1 | 198 | 12,5 |
| 5 | 17 | 2,1 |
| 10 | 0 | - |
| 20 | 0 | — |
| b) + 0,2 mmol/1 GSSG | ||
| GSSG | účinnost | stimulovatelnost |
| (mmol/1) | (%) | (faktor) |
-11CZ 280848 B6
| 0,05 | 15 | 2,2 | |
| 0,1 | 40 | 3,8 | |
| 0,2 | 112 | 6,8 | |
| 0,5 | 142 | * | 7,4 |
| 1 | 273 | 6,8 | |
| 5 | 260 | 7,9 | |
| 10 | 143 | 6,3 | |
| 20 | 55 | 5,1 |
6. Závislost výtěžku aktivace na koncentraci bílkoviny při reoxidaci (ředění 1 : 20 až 1 : 500)
Reoxidace se provádí ve směsi
0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 1 mg/ml BSA + 0,5 mol/1 1-arginin + 0,5 mmol/1 GSH + 0,5 mmol/1 GSSG zředění účinnost stimulovatelnost (%) (faktor)
| 1 | 10 | 29 | 15,3 |
| 1 | 20 | 45 | 25,4 |
| 1 | 50 | 69 | 37,9 |
| 1 | 100 | 100 | 37,9 |
| 1 | 200 | 79 | 52,7 |
| 1 | 500 | 29 | 28,7 |
7. Závislost výtěžku aktivace na přidání BSA
Reoxidace se provádí ve směsi
0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol 1-argininu +0,5 mmol/1 GSH +0,5 mmol/1 GSSG
| BSA (mg/ml) | účinnost (%) |
| 0 0,5 1 3 | 47 83 100 102 |
Na obr. 1 a 2 je znázorněna účinnost při přidání a bez přidání CNBr-FSP ve standardním pokusu po 17 hodinách reoxidace při teplotě místnosti, ve směsi 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5 + 1 mmol/1 EDTA + 0,5 mol/1 1-argininu + 1 mg/ml BSA + 0,5 mmol/1 GSH +0,5 mmol/1 GSSG.
-12CZ 280848 B6
Na obr. 1 a 2 znamená křivka A účinnost za přítomnosti CNBr-FSP a křivka B účinnost bez CNBr-FSP.
Přiklad 3
Aktivace β-interferonu, získaného genetickým inženýrstvím
Refrakturní tělíska byla získána svrchu uvedeným způsobem. Redukce/solubilizace těchto tělísek byly uskutečněny následujícím způsobem:
peleta byla inkubována 3 hodiny při teplotě 25 °C v 10 ml směsi 9,1 mol tris/HCl o pH 8,6, 6 mol/1 Gdn/HCl, 1 mmol/1 EDTA a 0,2 mol/1 DTE a po 30 minutách byla směs odstředěna při teplotě 4 °C a při 48 000 g a pH supernatantu bylo upraveno na hodnotu 3 přidáním koncentrované kyseliny chlorovodíkové. Pak byla prováděna filtrace na gelu Sephadex G25 F v 0,01 mol/1 HC1.
Eluát byl sledován při 280 nm koncentrace bílkovin a reaktivita.
a byla stanovena extinace,
Aktivace standardu (100%) se
0,1 mol/1 tris/HCl o pH 10,5, 1 mmol/1
0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/1 1-argininu.
provádí ve směsi s obsahem mmol/1 GSH,
EDTA,
a) Závislost aktivace na čase
Eluát se zředí v poměru 1 : 50
0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol/1
0,5 mmol/1 GSSG a 0,25 mol/1 1-argininu.
směsi, EDTA, která obsahuje mmol/1 GSH, doba aktivace (h) účinnost (%)
b) závislost výtěžku aktivace na přidání 1-argininu
Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 mol/1 tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol/1 EDTA, 5 mmol/1 GSH, 0,5 mmol/1 GSSG a pak se směs aktivuje 20 hodin při teplotě 0 °C.
Závislost aktivace na množství 1-argininu
1-arginin (N)
0,
0,25
0,5
0,75
c) Závislost výtěžku aktivace na množství močoviny
Byl užit roztok z odstavce b), aktivace byla prováděna 17 hodin při teplotě 0 C.
-13CZ 280848 B6
| Závislost aktivace | na močovině |
| močovina (M) | účinnost (%) |
| 0 0,5 1 1,5 | 13 100 200 100 |
d) Závislost výtěžku aktivace na množství formamidu
Aktivace se provádí ve stejné směsi jako v odstavci b) , vzorky se sledují po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 °C.
| Závislost aktivace | na formamidu |
| formamid (M) | účinnost (%) |
| 0 1 2 3 4 | 13 13 13 0 0 |
e) Závislost výtěžku aktivace na redox-pufru
Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mmol EDTA a 0,25 M 1-argininu a vzorky se sledují po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 °C.
Závislost aktivace na poměru GHS/GSSG
| GSH (mM) | GSSG (nM) účinnost (%) |
| 1 5 10 20 5 5 5 5 | 0,5 6 0,5 13 0,5 25 0,5 25 0,1 13 0,5 13 1,0 13 5 6 |
f) Závislost výtěžku aktivace na koncentraci bílkoviny až 1
EDTA, 5 provádí
Eluát byl zředěn v poměru 1 : 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mM a 0,25 m 1-argininu, stanovení se při teplotě 0 °C.
: 100 směsí s obsahem mM GSH, 0,5 mM GSSG po aktivaci 17 hodin
Závislost aktivace cp cp (mg/ml) účinnost (%)
0,018
0,036
0,072
0,108
0,180
-14CZ 280848 B6
g) Závislost výtěžku aktivace na přidání BSA
Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 M tris/HCl o pH 8,5, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG a 0,25 M 1-argininu a výsledek se odečítá po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 ”C.
Závislost aktivace na BSA
BSA (mg/ml) účinnost (%)
h) Závislost výtěžku aktivace na pH
Eluát se zředí v poměru 1 : 50 směsí s obsahem 0,1 M tris/HCl, 1 mM EDTA, 5 mM GSH, 0,5 mM GSSG a 0,25 M 1-argininu a výsledek se odečítá po 17 hodinách aktivace při teplotě 0 C.
Claims (5)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech rozrušením buněk, solubilizací za denaturačních a redukčních podmínek s následnou reaktivací za oxidačních podmínek v přítomnosti GSH/GSSG, přičemž se v reaktivačnim stupni jako denaturační činidlo užije arginin nebo guanidinhydrochlorid v koncentraci v rozmezí 0,1 až 1,0 mol/1, s výhodou v rozmezí 0,25 až 0,8 mol/1 a/nebo alespoň jedna sloučenina obecného vzorce IR2 - CO - NRRr (I), kdeR a R^ znamenají atom vodíku nebo alkylový zbytek o 1 až 4 atomech uhlíku, aR2 znamená atom vodíku, zbytek NHRX nebo alkylový zbytek o 1 až 3 atomech uhlíku,-15CZ 280848 B6 v koncentraci v rozmezí 0,5 až 4 mol/1, s výhodou 1 až 3,5 mol/1, a reaktivace se provádí při pH 8 až 12, při koncentraci GSH 0,1 až 20 mmol/1 a při koncentraci GSSG 0,01 až3 mmol/1, vyznačující se tím, že se v reaktivačním stupni postup provádí v přítomnosti koncentrace denaturačního činidla, při níž ještě nedochází k denaturaci.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se postup provádí v přítomnosti guanidinhydrochloridu a/nebo sloučeniny obecného vzorce I jako denaturačního činidla.
- 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že guanidinhydrochlorid užije v koncentraci 6 mol/1 a sloučenina obecného vzorce I v koncentraci 8 mol/1.
- 4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že se postup provádí v přítomnosti DTE, beta-merkaptoethanolu, cysteinu nebo GSH.
- 5. Způsob podle nároků 1 až 4, vyznačující se tím, že se čištění a oddělení denaturačního činidla provádí sterickou chromatografií nebo dialýzou.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ94460A CZ280848B6 (cs) | 1986-10-17 | 1986-10-17 | Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ94460A CZ280848B6 (cs) | 1986-10-17 | 1986-10-17 | Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ46094A3 CZ46094A3 (en) | 1996-04-17 |
| CZ280848B6 true CZ280848B6 (cs) | 1996-04-17 |
Family
ID=5461735
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ94460A CZ280848B6 (cs) | 1986-10-17 | 1986-10-17 | Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ280848B6 (cs) |
-
1986
- 1986-10-17 CZ CZ94460A patent/CZ280848B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ46094A3 (en) | 1996-04-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ280727B6 (cs) | Způsob aktivace genetickou technologií získaných, heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryontického původu po expresi v prokaryotických organismech | |
| US5453363A (en) | Process for the activation of t-PA or Ing after genetic expression in prokaryotes | |
| Hillson et al. | Formation and isomerization of disulfide bonds in proteins: protein disulfide-isomerase | |
| US5077392A (en) | Process for activation of recombinant protein produced by prokaryotes | |
| US5223256A (en) | Thrombolytically active non-glycosylated protein | |
| Stief et al. | Oxidized fibrin (ogen) derivatives enhance the activity of tissue type plasminogen activator | |
| Owen et al. | Evidence for an ester bond between thrombin and heparin cofactor | |
| AU620927B2 (en) | A preparation of plasminogen activator expressed in prokaryotes | |
| CZ280848B6 (cs) | Způsob aktivace genetickou technologií získaných heterologních bílkovin s obsahem disulfidových můstků eukaryotického původu po expresi v prokaryotických organismech | |
| CA2092158A1 (en) | Method of activating a blood coagulation factor | |
| JP5830524B2 (ja) | 折り畳まれたプレトロンビンまたはその誘導体の生産方法 | |
| Bergström et al. | Large-scale production of intermediate-purity, soluble human plasminogen | |
| CZ282035B6 (cs) | Derivát tkáňového aktivátoru plasminogenu, kódový řetězec, způsob výroby derivátu, způsob výroby plasmidu a prostředek k rozpouštění krevních sraženin | |
| JPH07100032B2 (ja) | 高純度組織性プラスミノ−ゲン活性化因子の製法 | |
| JPS6226298A (ja) | ジスルフイド架橋を含有する蛋白質を折り畳む改良方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20061017 |