CZ284871B6 - Linie stromálních buněk z lidské kostní dřeně a její použití - Google Patents

Abstract

Linie stromálních buněk lidské kostní dřeně, které po ozáření, jež vede k zastavení jejich růstu, zůstavají adherentní a hodí se jako živná vrstva k podpoře proliferace krevních buněk. ŕ

Description

(57) Anotace:

Linie v růstu zastavených adherentních stromálních buněk lidské kostní dřeně L87/4 (DSM ACC2055) a L88/5 (DSM ACC2056) uložené podle Budapešťské smlouvy jako kultura pod číslem DSM ACC2055 a DSM ACC2056, které po ozáření, Jež vede k zastavení jejich růstu, zůstávají adherentní a hodí se jako živná vrstva k podpoře proliferace krevních buněk.

CZ 284 871 B6

Linie v růstu zastavených adherentních stromálních buněk lidské kostní dřeně, způsob její produkce a její použití

Oblast techniky

Vynález se týká nových stromálních buněčných linií, jež se vyznačují tím, že zůstávají adherentní po ionizačním ozáření dávkami až do 20 Gy i více k zastavení růstu. To je činí obzvlášť užitečnými jako živné buňky podporující dlouhodobou proliferaci buněk závislých na živné vrstvě.

Dosavadní stav techniky

Udržování a diferenciace krvetvorných progenitorů a kmenových buněk v dlouhodobé kultuře kostní dřeně (long-term bine marow culture -LTBMC) závisí rozhodujícím způsobem na přítomnosti funkční vrstvy adherentních stromálních buněk (Dexter T. M.: Stromal cell associated haemopoiesis [Krvetvorba související se stromálními buňkami], J. Cell. Physiol. 1, str. 87, 1982 (suppl); Allen T. D., Dexter T. M.: The essential cells of the haemopoietic microenviroment [Nezbytné buňky krvetvorného mikroprostředí], Exp. Hematol 12, str. 517, 1984; Dexter T. M., Allen T. D., Lajtha L. G.: Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro [Podmínky řídící proliferaci krvetvorných kmenových buněk in vitro], J. Cell Physiol 91, str. 335, 1977; Gartner S., Kaplan H. S.: Long-term culture of human bone marrow cells [Dlouhodobá kultura buněk lidské kostní dřeně], Proč. Nati. Acad Sci USA 77, str. 4756, 1980; Hocking W. G., Golde D. W.: Long-term human bone marrow cultures [Dlouhodobé kultury lidské kostní dřeně] Blood 56:117, 1980; Toogood I. R. G., Dexter T. M., Allen T. D., Suda T., Lajtha L. G.: The development of liquid culture systém for the growth of human bone marrow [Vývoj systému tekuté kultury k pěstování lidské kostní dřeně], Leuk. Res. 4:449, 1980). Přesná úloha stromálních buněk v krvetvorbě nebyla dosud plně objasněna. Stromální buňky jsou však významným zdrojem mediátorů potřebných k řízení diferenciaci a proliferaci progenitorových buněk (Kaushansky K., Lin N., Adamson J. W.: Interleukin 1 simulates fibroblasts to synthetize granulocyte-macrophage and granulocyte colony-stimulating factors, J. Clin. Invest. 81, str. 92, 1988; Fibbe W. E., van Damme J., Bilau A., Goselink Η. M., Voogt P. J., van Eeden G., Ralph P., Altrock B. W., Falkenburg J. H. F.: Interleukin-1 induced human marrow stromal cells in long-terc. marrow culture to produce granulocyte colony-stimulating factor and macrophage colony-stimulating factor [Interleukinem-1 indukované lidské stromální buňky kostní dřeně v dlouhodobé dřeňové kultuře k vytváření faktoru stimulujícího kolonii granulocytů a makrofágu], Blood 71, str. 430, 1988). Heterogenní buněčné složení této stromální vrstvy, včetně makrofágů, fibroblastů, adipocytů a endotheliálních buněk (Dexter T. M.: Stromal cell associated haemopoiesis [Krvetvorba související se stromálními buňkami], J. Cell. Physiol. 1, str. 87, 1982 (suppl); Allen T. D., Dexter T. M.: The essential cells of the haemopoietic microenviroment [Nezbytné buňky krvetvorného mikroprostředí], Exp. Hematol 12, str. 517, 1984; Dexter T. M., Allen T. D., Lajtha L. G.: Conditions controlling the proliferation of haemopoietic stem cells in vitro [Podmínky řídící proliferaci krvetvorných kmenových buněk in vitro], J. Cell Physiol 91, str. 335, 1977), extrémně ztěžuje možnost analyzovat úlohu každého buněčného typu ve vývoji krvetvorby.

Stanovené stromální buněčné linie kostní dřeně jsou užitečným nástrojem k analýze diskrétních stromálních funkcí. Ačkoli byly popsány imortalizované myší stromální buněčné řady (Hunt O., Robertson D., Weiss D., Rennick D., Lee F., Witte O. N.: A single bone marrow-derived stroma cell type supports the in vitro growth of early lymphoid and myeloid cells Cell, 48, str. 997, 1987; Quesenberry P., Song Z., McGratz E., McNiece I., Shadduck R., Waheed A., Baber G., Kleeman E., Kaiser D.: Mulilineage synergistic activity produced by murine adherent narrow cell line, Blood 69, str. 827, 1987; Collins L. S., Dorshkind K.: A stromal cell line from myeloid

-1 CZ 284871 B6 long-term bone marrow cultures can support myelopoiesis and lymphopoiesis, J. Immunol. 138, str. 1082, 1987) snahy o stanovení odpovídajících lidských řad selhaly (Lanotte M., Allen T. D., Dexter T. M.: Histochemical and ultrastructural characteristics of a cell line from human bone marrow stroma, J. Cell. Sci. 50, str. 281, 1981). Lidské stromální buněčné linie kostní dřeně popisuje také K. Thalmeieer a kol. (K. Thalmeier a kol. Establishment and characterization of human bone marrow stromal cell lineš, Exp. Hematology (1992) 815). Nepopisuje však žádné buněčné řady, které zůstávají adherentní po ozáření.

Některé problémy, spojené se stanovením lidských stromálních buněčných linií, jsou řešeny zavedením DNA do buněčného genomu kódováním SV40 široké T-Ag (Harigaya K., Handa H.: Generation of functional clonal cell lineš from human bone marrow stroma, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, str. 3477, 1985; Novotný J. R., Dueshen U., Welch K., Layton J. E., Cebon J. S., Boyd A. W.: Cloned stromal cell lineš derived from human Whitlock/Wittetype long-term bone marrow cultures, Exp. Hematol. 18, str. 775, 1990; Singer J. W., Charbord P., Keating A., Nemunaitis J., Raugi G., With T. N., Lopez J. A., Roth G. J., Dow L. W., Fialkow P. J.: Simian virus 40-transformed adherent cells from human long-term marrow cultures: Cloned cell lineš produce cells with stromal and hematopoietic characteristics, Blood 70, str. 64, 1987; Aizawa S., Yaguchi M., Nakano M., Inokuchi S., Handa H., Toyama K.: Establishment of a variety of human bone marrow stromal cell lineš by the recombinant SV40-adenovirus vector, J. Cell. Physiol. 148, str. 345-251, 1991; Ciuttini F. M., Martin M., Salvaris E., Ashman L., Begley C.

G. , Novotný J., Maher D., Boyd A. W.: Support of human cord blood pogenitor cells on human stromal cell lineš transformed by SV40 large T-antigen under the influence of am inducible (metallothionein) promotér, Blood 80, str. 102-112, 1992). To bylo provedeno řadou metod genového přenosu včetně precipitace Ca-fosfátu (Harigaya K., Handa H.: Generation of functional clonal cell lineš from human bone marrow stroma, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, str. 3477, 1985), elektroporace rekombinantních konstruktů SV40 (Novotný J. R., Dueshen U., Welch K., Layton J. E., Cebon J. S., Boyd A. W.: Cloned stromal cell lineš derived from human Whitlock/Wittetype long-term bone marrow cultures, Exp. Hematol. 18, str. 775, 1990; Singer J.W., Charbord P., Keating A., Nemunaitis J., Raugi G., With T. N., Lopez J. A., Roth G. J., Dow L. W., Fialkow P. J.: Simian virus 40-transformed adherent cells from human long-term marrow cultures: Cloned cell lineš produce cells with stromal and hematopoietic characteristics, Blood 70, str. 64, 1987; Aizawa S., Yaguchi M., Nakano M., Inokuchi S., Handa

H. , Toyama K.: Establishment of a variety of human bone marrow stromal cell lineš by the recombinant SV40-adenovirus vector, J. Cell. Physiol. 148, str. 345-251, 1991; Ciuttini F. M., Martin M., Salvaris E., Ashman L., Begley C. G., Novotný J., Maher D., Boyd A. W.: Support of human cord blood progenitor cells on human stromal cell lineš transformed by SV40 large Tantigen under the influence of an inducible (metallothionein) promotér, Blood 80, str. 102-112, 1992) a infekcí virů SV40 divokého typu (19. Singer J. W., Charbord P., Keating A., Nemunaitis J., Raugi G., With T. N., Lopez J. A., Roth G. J., Dow L. W., Fialkow P. J.: Simian virus 40transformed adherent cells from human long-term marrow cultures: Cloned cell lineš produce cells with stromal and hematopoietic characteristics, Blood 70, str. 64, 1987; Aizawa S., Yaguchi M., Nakano M., Inokuchi S., Handa H., Toyama K.: Establishment of a variety of human bone marrow stromal cell lineš by the recombinant SV40-adenovirus vector, J. Cell. Physiol. 148, str. 345-251, 1991). Těchto stromálních buněčných linií bylo použito jako modelových systémů k analyzování interakcí stromálních buněk s progenitorovými buňkami (Yang Y-C, Tsai S., Wong G. G., Clark S. C.: Interleukin-1 regulation of hematopoietic growth factor production by human stromal fibroblasts, J. Cell. Physiol. 134, str. 292-296, 1988; Kohama T., Handa H., Harigaya K-i: A burst-promoting activity derived from the human bone marrow stromal cell line KM-102 is identical to the granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, Exp. Hematol. 16, str. 603-608, 1988; Nemunaitis J., Andrews D. F., Crittenden C., Kaushansky K., Singer J. W.: Response of simian virus 40 (SV40)-transformed, cultured human marrow stromal cells to hematopoietic growth factors, J. Clin. Invest. 83, str. 593-601, 1989; Nemunaitis J., Andrews D. F., Mochizuki D. Y., Lilly Μ. B., Singer J. W.: Human marrow stromal cells: Response to interleukin-6 (IL-6) and control of IL-6 expression, Blood 74, str. 1929-1935, 1989; Slack J. L., ~>

Nemunaitis J., Andrews ΙΠ D. F., Singer J. W.: Regulation of cytokine and growth factor gene expression in human bone marrow stroma cells transformed with simian virus 40, Blood 75, str. 2319-2327, 1990). Nicméně použití SV40-imortalizováných stromálních buněčných linií jako podpůrných živných vrstev vLTBMC má stále dva významné nedostatky. Předně buňky imortalizované SW40 rostou rychle až do 100 buněčných generací (Neufeld D. S., Ripley S., Henderson A., Ožer H.: Immortalization of human fibroblasts transformed by origin-defective simian virus 40, Molecular Biology 7 (8), str. 2794-2802, 1987) a pak vstupují do charakteristické krize vedoucí k umrtvení buněk (Singer J. W., Charbord P., Keating A., Nemunaitis J., Raugi G., With T. N., Lopez J. A., Roth G. J., Dow L. W., Fialkow P. J.: Simian virus 40transformed adherent cells from human long-term marrow cultures: Cloned cell lineš produce cells with stromal and hematopoietic characteristics, Blood 70, str. 64, 1987). Za druhé nemůže být růst stromálních buněk imortalizovaných SW40 inhibován ozářením nebo mitomycinem C bez oddělení z kulturních baněk (Ciuttini F. M., Martin M., Salvaris E., Ashman L., Begley C. G., Novotný J., Maher D., Boyd A. W.: Support of human cord blood progenitor cells on human stromal cell lineš transformed by SV40 large T-antigen under the influence of an inducible (metallothionein) promotér, Blood 80, str. 102-112, 1992).

V tomto vynálezu jsou popsány nové linie stromálních buněk lidské kostní dřeně a jejich použití. Tyto buněčné linie proliferují vysokou rychlostí a mohou být ve svém růstu zastaveny ozářením aniž se oddělí. Funkční kapacita buněčných linií podle vynálezu jakožto živných buněk je doložena jejich schopností podporovat dlouhodobou proliferaci například progenitorových lidských krevních buněk obohacených CD34⁺ a klonogenickým růstem buněčné linie BL70 závislé na vyživování.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je linie v růstu zastavených adherentních stromálních buněk lidské kostní dřeně L87/4 (DSM ACC2055) a L88/5 (DSM ACC2056) uložená podle Budapešťské smlouvy jako kultura pod číslem DMS ACC 2055 a DSM ACC 2056.

Způsob produkce in vitro v růstu zastavených adherentních stromálních buněk lidské kostní dřeně L87/4 (DSM ACC2055) a L88/5 (DSM ACC2056), spočívá podle vynálezu v tom, že se buňky, které jsou transfektovány použitím SV40, kultivují až do dosažení slinutí, stromální vrstva sestávající z těchto buněk, se podrobí opakovaně pasážování až do dosažení u buněk růstové krize a buňky, které se dělí velmi pomalou rychlostí nebo buňky, jež se vůbec nedělí, se ze svého podkladu odstraní, nahradí se novou kulturou a ozáří se tak, že jsou adherentní a ve svém růstu zastavené.

Vynález se dále týká použití v růstu inhibované adherentní stromální buněčné linie z lidské kostní dřeně a použití takové stromální buněčné linie z lidské kostní dřeně a použití takové stromální buněčné linie jako živné vrstvy pro kultivaci krevních buněk.

Vynález se týká linie stromálních buněk z lidské kostní dřeně, jež ve svém genomu obsahují virové sekvence DNA opičího viru 40 (SV40), jež jsou charakterizovány tím, že původ replikace viru SV40 je vadný. Podle výhodného provedení vynálezu je část posledních genů SV40, které kódují pro shluklé („packaging“) proteiny, vypuštěna.

Je dále výhodném že linie stromálních buněk podle vynálezu obsahuje nejméně virové sekvence DNA opičího viru 40, které kódují pro T-antigen.

Vynález se také týká linie stromálních buněk L87/4 (DSM ACC 2055) a L88/5 (DSM ACC 2056), které jsou uloženy v Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Německo.

-3 CZ 284871 B6

Vynález se ještě týká použití linie stromálních buněk podle vynálezu jako živné vrstvy pro krevní buňky, s výhodou krvetvorné buňky nebo prekurzorové buňky, například osteoklasty. Vynález se přídavně týká použití linie stromálních buněk podle vynálezu k produkci růstových faktorů/ cytokinů.

Vynález se také týká použití linie stromálních buněk podle vynálezu jako expresní buněčné linie pro geny klonované ve vektorech, přičemž geny replikují za řízení velkého T-antigenu SV40.

Vynález blíže objasňuje následující popis doplněný obrázky.

Obr. 1 Citlivost linií stromálních buněk L87/4 a L88/5 na ozáření:

buňky se nanesou v hustotě 5 x 10⁵/ml do baněk o obsahu 75 cm² v médiu LTC a ozáří se 5 až 20 Gy. Po ozáření se médium úplně vymění a buňky se inkubují po dobu 7 dní (37 °C, 5 % oxid uhličitý) v médiu LTC. Osmého dne se stanoví počet adherentních a neadherentních buněk (A, B) a buňky se pěstují v agaru obsahujícím GCT-CM. Čtrnáctého dne se agarové kolonie sečtou v C a D. Na obr. 1A, IB, 1C a ID platí sloupky s tenkými čárkami pro neadherentní buňky a s tlustými čarami pro adherentní buňky.

Obr. 2 Analysa mezního rozředění odezvy buněk BL70 na různé živné buňky.

Za mezních podmínek zředění se očkují buňky BL70 v přítomnosti (A) buněk L87/4 (kroužky) nebo buněk L88/5 (čtverečky). Výsledkem statistického vyhodnocení je frekvence f=13,5 v přítomnosti buněk L87/4 (r= -0,951; y_o = 0,925) a f=l,5 v přítomnosti buněk L87/5 (r= -0,990; y_o=l,04). Pro porovnání ukazuje (B) analýzu mezního zředění buněk BL70 očkovaných v přítomnosti buněk MRC5 (hvězdičky; f = 5,7; r = -0,996; y₀ = 1,00) nebo primární stroma kostní dřeně (trojúhelníčky; f=2,5; r = -0,996; y₀ = 0,98). Na ose x je vždy počet naočkovaných buněk na důlek a na ose y frakce negativních kultur.

Obr. 3 Podpora krevních buněk „cord-blood“ GM-CFCs liniemi stromálních buněk L87/4 kosočtverečky) a L88/5 (čtverečky) (plast kolečka).

Neadherení krevní buňky cord-blood, produkované na liniích stromálních buněk L87/ a L88/5, se týdně shromažďují po 2. kultivačním týdnu a zkoumají se v methylcelulozových kulturách na myeloidové progenitory. Kolonie (> 50 buněk) se sčítají 14 dní po nanesení. Výsledky představují dva reprezentativní a nezávislé pokusy. Na ose x je vždy počet týdnů v kultuře, na ose y je v prvních diagramech vždy počet buněk x 1000/důlek, na druhých GM-CFC/důlek.

Obr. 4 Sekrece G-CSF, IL-6 a GM-CSF IL-Ια a/nebo dexamethasonem zpracovaných buněk L87/4 a L88/5

Buňky se inkubují 24 hodin v médiu LTC bez hydrokortizonu nebo v médiu LTC doplněním buď IL-la (10 U/ml), a/nebo dexamethasonem (ΙΟ^-6 Μ). V supematantech se testuje aktivita IL-6 se 7TD1 a aktivita G-CSF indikátorem NFS60 buněčné linie testem MTT. Aktivita GM-CSF v supematantech se měří RIA.

Obr. 5 Sekrece G-CSF a IL-6 ozářených buněčných linií L87/4 a L87/5

Buňky rostou v souběhu v médiu LTC a ozáří se 0-20 Gy. Po ozáření se médium úplně vymění, buněčné supematanty se shromáždí po 24 hodinách inkubace a testují se na aktivitu IL-6 (7TD1) a G-CSF (NFS60) testem MTT.

-4CZ 284871 B6

Obr. 6 ukazuje použitý transfekční vektor (psV IN-1) známý od Cohena a kol. J. Virol. 51 (1984) str. 91 až 96.

Obr. 7 ukazuje druhý z něho odvoditelný vektor (pUC IN-1 wt). Zde byl SV40-DNA vyťat z pSVIN-1 a štěpná místa Bam/Pst a nukleotidové sekvence bp 1988-2533 byly odstraněny. Pak zrušený SV40-DNA se klonuje do štěpného místa pUC 12 Bam/Pst.

Na rozdíl od všech stromálních buněčných linií lidské kostní dřeně podle současného stavu techniky, mají buněčné linie podle vynálezu následující výhody:

a) Homogenitu:

Na rozdíl od primární stromy sestávají buněčné linie z přesně definované rovnoměrné buněčné populace. Tím je tudíž vyloučeno experimentální kolísání, vyskytující se při použití primárních buněk z proměnlivých pásem.

b) Stálost:

Primární stromální buňky a většina imortalizovaných buněčných linií SV-40 umírá po omezeném počtu dělení. Stromální linie podle vynálezu jsou schopné neomezeného počtu dělení (jsou „imortalizovány“).

c) Inhibice růstu ozářením:

Při pokusech, kde se stromálních buněk používá jako „živné vrstvy“ (=feeder cells) pro krvetvorné progenitory, musí být růst stromálních buněk inhibován a současně musejí buňky přilnout k buněčné kultivační misce. Dříve se popsané imortalizované linie SV40 po ozáření oddělovaly od své podložky, zatímco buněčné linie podle vynálezu přestanou růst a zůstanou též adherentní (přilnuté).

d) Produkce krvetvorných růstových faktorů:

Živné buňky (feeder cells) pro krvetvorné prekurzorové buňky ovládají růst a jeho diferenciaci, mezi jiným vytvářením růstových faktorů. Buněčné linie podle vynálezu jsou schopné produkovat velké množství těchto růstových faktorů, přičemž činitel produkce může být ovlivněn jak ozářením, tak stimulací interleukinem-1.

e) Jsou vyloučeniny spontánní změny buněčných linií způsobené produkcí virů.

Může se použít také jiných vektorů, které obsahují alespoň virové sekvence DNA opičího viru SN40, které kódují pro T-antigen a pro něž je replikační původ viru SV40 defektní. Vektory, ve kterých jsou dodatečně vypuštěny pozdní geny viru SV40, které kódují pro obálkové proteiny („envelope protein“), jsou rovněž vhodné. Primární ulpělé buňky z lidské kostní dřeně se transfekují pomocí takového plasmidového vektoru SV40. Transfekce může být provedena liposomy. DNA transfekovaná v průběhu lipofekce dosahuje jádra buněk kostní dřeně a tam integruje do chromosomální DNA. Místo integrace vektoru není zde možno předvídat, což znamená, že se vyskytuje nahodile. Exprese SV40 T-antigenu integrovaného do buněčného genomu způsobuje imortalizaci těchto buněk.

Takto ustavené linie jsou imortalizovány, vykazují velmi krátkou dobu zdvojování a vytvářejí homogenní buněčnou populaci.

Použití vektory pUC 12 a pBR 322 stejně jako virové sekvence DNA opičího viru SV40 jsou obchodně dostupné.

-5CZ 284871 B6

Po ozáření, které vede k zastavení růstu, zůstávají buněčné linie podle vynálezu přilnuté. Při tom zůstávají buňky živé, nejsou však nadále schopny dělení. Vytvářejí velké množství krvetvorných růstových faktorů/cytokinů.

Ozařování stromálních buněčných linií se provádí běžným způsobem známým pracovníkům v oboru (například Ciuttini F. M., Martin M., Salvaris E., Ashman L., Begley C. G., Novotný J., Maher D., Boyd A. W.: Support of human cord blood progenitor cells on human stromal cell lineš transformed by SV40 large T-antigen under the influence of an inducible (metallothionein) promotér, Blood 80, str. 102-112, 1992). Obvykle se provádí ionizačním zářením 5 až 20 Gray (Gy). Před ozářením je účelné nechat buňky přilnout k povrchu použité nádoby (konfluence). Po ozáření zůstanou přežívající buňky přilnuté (více než přibližně 80 %). Usmrcené buňky se od povrchu oddělí a touto cestou je lze snadno oddělit od buněk podle vynálezu, například výměnou média.

Přilnuté (adherované) buňky' jsou živé po dlouhou dobu, takže jsou schopné nést pěstované buňky závislé na živné vrstvě, jako například krvetvorné progenitorové buňky okolní krve. Typicky zůstává po 7 dnech nejméně 90 % a po dvou nebo třech týdnech 50 % přilnutých buněk stále živých. Jako kultivační médium (také pro spolupěstování s krevními buňkami) se dá použít kteréhokoli známého kultivačního média pracovníkům v oboru, vhodného pro stromální buňky.

Pod označením stromální buňky podle vynálezu se míní také aktivní membrány obsahující jejich subbuněčné fragmenty, které obdobně jako úplné buňky podporují proliferaci a/nebo diferenciaci krevních buněk. Takovými fragmenty mohou být například subbuněčné vehikuly, které se získají hypotonickým šokem buněk prosté membránové vehikuly, které lze získat například inkubací s cytochalasinem B. Vhodný je také eluát z buněk podle vynálezu, který může být znovu získán například po inkubaci s chloridem sodným a citrátem sodným. Takové frakce buněk podle vynálezu mohou být dále čištěny běžnými způsoby, známými pracovníkům v oboru, například chromatograficky, kde aktivita frakce (vhodně jako živné vrstvy) musí být zkoumána po každé čisticí operaci.

Membránové vehikuly se připravují například způsobem, který popsal Maul a kol. (Technics Insomatic Cell Genetics (1982), Et. S. W. Shay, Plenům Press, New York). Jiný způsob popsal Jett a kol. (J. Biol. Chem 252, str. (1977) 2134-2142, 1977). Po promytí buněk v EARLově pufru se k buňkám přidá glycerol v konečné koncentraci 30 % ve třech dávkách po 15 minutách. Po odstředění se provede lýze, provede se vícenásobné odstředění a vehikulová frakce se obohatí. Obohacené frakce se zkoumají z hlediska schopnosti podporovat proliferaci krevních buněk, s výhodou krvetvorných prekurzorových buněk nebo kmenových buněk.

Pojmem „podporování proliferace buněk“ se zde míní, že buňky podle vynálezu podporují přežití, bujení a možní i produkci krve/růstových faktorů/cytokinů krevními buňkami. Při tom buňky buněčných linií podle vynálezu jsou adherentně vázány k povrchu (s výhodou kultivační baňky). Baňky závislé na živné vrstvě se usazují na této živné vrstvě a jsou podporovány v růstu a/nebo diferenciaci. Živná vrstva zásobuje krevní buňky růstovými faktory, jako cytokiny a adhezními molekulami.

Pojmem „podporování diferenciace“ se zvláště míní podpora diferenciace buněk, jež nejsou konečně diferencované (nejsou na konci dráhy diferenciace). Příklady takových buněk jsou pluripotentní kmenové buňky a krevní progenitorové buňky.

Krevními buňkami se rozumí například krvetvorné kmenové buňky, krvetvorné progenitorové buňky nebo periferální krevní buňky. Příkladem jsou lidské cord-blood progenitorové buňky CD34~ nebo také lymfoidní buňky (modelovými buňkami jsou buněčné linie BL 70 [35])

-6CZ 284871 B6 i kmenové buňky izolované z kostní dřeně, lidská umbilická cord-blood nebo periferální krev, progenitorové buňky jako granulocyty, erythroidní nebo megakaryotidní progenitorové buňky.

Typicky se aplikuje hustota buněk 5 x 10⁵ buněk/ml na povrch 75 cm².

Podle výhodného provedení vynálezu pro pěstování buněk závislých na živné vrstvě se buněčné linie podle vynálezu nechají napřed růst dokud nedosáhnou slinutí a pak se ozáří. Po ozáření se médium vymění a tím se také odstraní zabité a nepřilnuté buňky. Takto připravených buněk lze použít přímo jako živné vrstvy. Je však výhodné před použitím buňky pěstovat po dobu několika hodin v médiu prostém séra.

Podle výhodného provedení vynálezu je možno stromálních buněk podle vynálezu použít k podpoře expanze krvetvorných kmenových buněk bez diferenciace. Podmínky pro takovou expanzi popsal M. R. Koller a kol. (Large scale expansion of human stem and progenitor cells from bone marrow mononuclear cells in continuous perfusion culture, Blood 82 (2), str. 378-384, 1933).

Taková expanze kmenových buněk bez diferenciace je obzvlášť užitečná k proliferaci kmenových buněk, jež jsou ex vivo geneticky modifikovány transdukcí. Takových modifikovaných kmenových buněk je možno použít v genové terapii. Transdukce může být provedena podle stavu techniky, například pomocí retrovirů nebo DNA a liposomů. Jelikož výtěžek takové transdukce je velmi nízký mají expadované transdukované kmenové buňky velkou hodnotu v genové terapii ex vivo.

Při přípravě ve svém růstu zastavených adherentních stromálních buněk z buněčné linie je výhodné pěstovat buňky stromální buněčné linie dokud nedosáhnou slinutí a opakovaně pasážovat stromální vrstvu, dokud buňky nevstoupí do růstové krize. K tomu dochází obvykle po 25 až 30 cyklech. Potom se shromáždí buňky, které se dělí jen velmi malou rychlostí, nebo které se v podstatě už vůbec nedělí, například trypsinizací a v nové kultuře se nahradí čerstvým médiem. Tyto buňky se ozáří jak shora uvedeno. Ulpělé stromální buňky, zaražené ve svém růstu, zůstávají přilnuté, zatímco zářením usmrcené buňky se oddělí a tímto způsobem se snadno odstraní.

S překvapením se zjistilo, že stromální buněčné linie podle vynálezu produkují ve velké míře růstový faktor. Tato produkce může být indukována ozářením různé intenzity (s výhodou 5 až 20 Gy) a/nebo přidáním IL-1 (5 až 50 J/ml, s výhodou 5 až 15 J/ml) a/nebo dexamethasonu (0,5 až 2 x lOAnol/l). Indukce ozářením vede hlavně ke zvýšené produkci G-CSF (na přibližně 50 ng/ml kultury a produkce IL-6 na přibližně 100 J/ml při až 20 Gy). IL-1 stimuluje při přidání produkci GM-CSF. Růstové faktory, produkované tímto způsobem buňkami, mohou být čištěny způsoby pracovníkům v oboru známými.

Při transfekci buněk kostní dřeně se provádí následující postup:

Buňky kostní dřeně se pěstují 2 až 3 týdny v dlouhodobém médiu (McCoy 5a doplněným 12,5 % zárodečného telecího séra, 12,5 % koňského séra, 1 % hydrogenuhličitanu sodného, 1 % MEM neesenciálním aminokyselinovým roztokem, 1 % L-glutaminu (20mM), 1 % penicilinstreptomycinového roztoku - všechny roztoky od Gibco - ΙΟ^-4 M α-thioglycerolu, ΙΟ^-6 M hydrokortizonu) (5 % oxidu uhličitého; 37 °C) dokud stromální vrstva nedosáhne subslinutí. Jeden den před transfekováním se ulpělé stromální buňky shromáždí trypsinizací a vnesou se do 25 cm² kultivačních baněk při hustotě buněk 5 x 10⁵ buněk/ml. Transfekce se provede chloridem cesia vyčištěným plasmidem DNA (psV-INl a pUCIN-lwt).

-7CZ 284871 B6

Transfekce se provede v souhlase s transfekčním protokolem firmy Serva (IBF Instruction Sheet č. 2942 10) takto:

Semislinuté buňky se promyjí jednou PBS, jednou McCoysovým 5a a inkubují se 5 až 18 hodin s čerstvě připravenou směsí plasmid/transfectam v 8 ml séra prostého dlouhodobého kultivačního média v 25 cm² kultivačních baňkách. Po transfekci se buňky promyjí dvakrát PBS/10 % FCS a pěstují se v mediu LTC do slinutí. Transfekované buňky se vyberou opakovaným pasážováním stromální vrstvy při poměru 1 : 2. Po přibližně 25 až 30 pasážích nastane u imortalizovaných buněk tak zvaná růstová krize. Této krizi se čelí tím, že buňky, které se dělí jen pomalu nebo se nedělí vůbec, se oddělí od své podložky trypsinizací a přemístí se do nové kultivační baňky. Baňky zpracované tímto způsobem se spontánně zotaví z krize a představují imortalizovaný fenotyp.

Stromální buněčné linie L87/4 a L88/5 se liší v následujících vlastnostech:

Exprese T-antigenu:

L87/4: nízká exprese (pasáž 14)

L88/5: silná exprese (pasáž 14)

Místa integrace ve virové DNA: různá místa integrace v genomu

Produkce konstitutivního faktoru:

L87/4: konstitutivní produkce G-CSF a IL-6

L88/5: nízká konstitutivní produkce G-CSF a IL-6

Produkce G-CSF a IL-6 je indukovatelná v obou buněčných liniích ozářením.

Dále se uvádí několik příkladů použití buněčných linií.

Stromální buněčné linie podle vynálezu a zejména buněčné linie L87/4 a L88/5 lze aplikovat ve všech pokusech, kde se mají pěstovat buňky rostoucí v závislosti na živné vrstvě. To jsou všechny krvetvorné prekurzorové buňky a kmenové buňky stejně jako prekurzorové buňky tvorby kostí (osteoklasty). Existují také pozitivní výsledky pro růst starších, na živné půdě závislých, B-nádorových buněk (BL70) na linii 88/5 i na linii 87/4.

Vedle kultivace normálních krvetvorných prekurzorových buněk může být použito buněčných linií, zejména buněčné linie L87/4 a L88/5 k analýze maligních buněk kostní dřeně od pacientů trpících leukémií (CML, AML, ALL) za vlivu léčiv, což má speciální význam z hlediska autogolozní transplantace kostní dřeně. Vyloučeny mají být experimentální úchylky, jež se dosud objevily díky použití primárních živných buněk od různých zkušebních osob.

Vedle toho, že se hodí jako živné buňky, může být buněčných linií podle vynálezu a s výhodou buněčných linií L87/4 a L88/5 použito jako produkujících linií pro řadu růstových faktorů. Zde zaslouží pozornost extrémně vysoká konstitutivní produkce G-CSF u linie L87/4 a IL-6 u linie L88/5. Kromě toho může být poukázáno na dosud nedefinovaný vysoce stimulující účinek buněk L88/5 na růst buněk 7TD1 a NFS60 v kondiciovaném médiu (=supematantu buněčné kultury).

Je také možné použití jako expresní buněčné linie pro geny klonované do vektorů, jež replikují za řízení velké T-Ag SV40. Jako příklad se zde uvádějí buňky COS.

Následující příklady vynálezu objasňují, nijak ho však neomezují, jelikož jeho skutečný rozsah je vyjádřen v patentových nárocích. Je zřejmé, že jsou možné modifikace uvedených postupů bez újmy na podstatě vynálezu.

-8CZ 284871 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ustavení permanentních stromálních buněčných linií lidské kostní dřeně s dlouhodobou živnou kapacitou po ozáření

a) Materiály a metody

Kostní dřeň

Získají se buňky kostní dřeně pro dlouhodobou kultivaci a transfekční pokusy z čerstvě resekovaných žeber hematologicky zdravých pacientů. Všechny vzorky se získají s informovaným souhlasem a podle protokolů schválených institucionální etickou komisí.

Dlouhodobá kultivace

Buňky kostní dřeně se izolují z žeber aspirací ve fosfátem pufrované solance (PBS). Nanesou se bez dalšího čištění v hustotě 2xl0⁶ buněk/ml do baněk 75 cm² (Nunc) do dlouhodobého kultivačního média kostní dřeně typu Dexter (LTC médium: médium McCoy 5a doplněné 12.5 % preselektovaného zárodečného telecího séra (FCS), 12,5 % preselektovaného koňského séra, 1 % hydrogenuhličitanu sodného, 0,4 % MEM neesencionálního aminokyselinového roztoku, 0,8 MEM esenciálního aminokyselinového roztoku, 1 % roztoku vitaminu, 1 % Lglutaminu (200 mM), 1 % penicilinstreptomycinového roztoku (všechny roztoky od Gibco), 10^-4 M cc-thioglycerolu, ΙΟ⁶ M hydrokortizonu). Kultury se inkubují při teplotě 37 °C ve vlhké atmosféře při obsahu 5 % oxidu uhličitého a týdně se vyživují výměnou poloviny média.

Stanovení stromálních buněčných linií lidské kostní dřeně

Buňky kostní dřeně se pěstují 2 až 3 týdny v médiu LTC, dokud stromální vrstvy nedosáhnou slinutí. Přilnuté (adherentní) stromální buňky se shromáždí trypsinizací a nahradí se do kultivačních baněk 25 cm* v hustotě 5xl0⁵ buněk/ml. K transfekčním pokusům se použije gradient chloridu česného čištěných plasmidových vektorů pSVIN-1 (origin-defektivní genom SV40 klonovaný v pBR322) a pUCIN-1 (origin-defektivní genom SV40 klonovaný vpUC12, pozdější geny částečně vypuštěny). Transfekce pomocí liposomů se provede v podstatě podle popisu ve výrobcově (Serva, Heidelberg) transfekčním protokolu. V podstatě se poloslinuté ulpělé buňky promyjí jednou PBS, jednou činidlem McCoy 5a a inkubují se po dobu 5 až 18 hodin s čerstvě připravenou směsí plasmid/transfectan v 8 ml média LTC prostého séra v baňkách 25 cm². Po transfekci se buňky promyjí dvakrát systémem PBS/10 % FCS a kultivují se v 10 ml média LTC do slinutí. Po latentní periodě přibližně 6 týdnů začnou transfekované buňky přerůstat primární stromální buňky a pasážují se kontinuálně při poměru 1 :2. Transfekované buňky se udržují v médiu LTC při teplotě 37 °C ve vlhkém inkubátoru při obsahu 5 % oxidu uhličitého.

Jižní kapkové (Southem blot) pokusy

Po nejméně 6 buněčných pasážích se čistí DNA transfekovaných buněk gradientem chloridu česného odstředěním (Sambrook I., Fritsch E. F., Maniatis T.: Molecular cloning. A laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989), digestují se vybranými enzymy a podrobí se elektroforéze na 0,8% agarozovém gelu. DNA se nakape na filtry Hybond N (Amersham, Buchler, Braunschweig) a hybridizuje se s radioaktivně značeným fragmentem BamHI/pSVIN-1 kódujícím SV40 velký T-antigen.

-9CZ 284871 B6

Severní kapkové (Northem blot) pokusy

Celkové množství RNA transfekovaných buněk se izoluje metodou guanidiniumizothiokynátové extrakce (Chirgwin J., Przybala A., Mac Donald R., Rutter W.: Isolation of biologically active ribonucleic acid from sources enriched in ribonuclease, Biochemistry 18, str. 5294-5299, 1979) glykosyluje se a frakcionuje na 1% agarosovém gelu (20 pg na štěrbinu). RNA se nakape na filtry Hybond N (Amersham, Buchler, Braunschweig) a hybridizuje se s radioaktivně značeným fragmentem BamHI plasmidu pSVIN-1 kódujícím pro SV40 velký T-antigen.

Test citlivosti na záření

Transfekované buňky se vnesou v hustotě 5 x 10⁵/ml do baněk 75 cm² v médiu LTC a nechají se růst 18 hodin. Nato se ozáří 5 až 20 Gy pomocí gamazářiče cesium-137 (Atomic Energy of Canada, Ontario, Kanada). Po ozáření se médium úplně vymění a buňky se inkubují po dobu 7 dní (37 °C, 5 % oxidu uhličitého) v médiu LTC. Osmého dne se přilnuté a nepřilnuté buňky shromáždí trypsinizací, sečtou se počty buněk a potenciál ozářených buněk tvořící kolonii se měří sečtením kolonie 14. dne v agaru.

Test tvoření kolonií

K vyzkoušení klonogenického potenciálu transformovaných stromálních buněčných linií se shromáždí ulpělé buňky trypsinizací (0,25% trypsin, Gibco) a nanesou se na pevné agarové kultury (Mergenthaler H. G., Bríihl P., Dormer P.: Kinetics of myeloid progenitor cells in human micro long-term bone marrow cultures, Exp. Hematol. 16, str. 145-149, 1988). V podstatě se stromální buňky nanesou trojmo v koncentraci 1 x 10⁵ buněk/ml použitím stejných množství 0,6% Bactoagaru (Difco, Detroit, Michigan) a dvojnásobně silného Iscovem modifikovaného média Dulbecco (IMDME; Gibco) obsahujícího 40 % preselektovaného FCS. Růst kolonie se stimuluje objemově 10% tumor-kondiciovaným médiem obřích buněk (GCT-CM; Američan Type Culture Collection, Rockwille, Maryland). Kultury se inkubují po dobu 14 dní při teplotě 37 °C v navlhčené atmosféře a s 5 % oxidu uhličitého ve vzduchu. Fibroblastové kolonie se 14. dne sečtou pomocí invertního mikroskopu při 32 násobném zvětšení.

Imunofluorescenční zabarvení pro fenotyping (tabulka I)

a) Nepřímé imunofluorescenční zabarvení

Buňky L88/5 a L87/4 se pěstují na sklíčkách omytých vápníku prostým PBS (PBSd) a fixují se po dobu 10 minut ve směsi 1 : 1 ledově studeného methanolu a acetonu. Po opláchnutí sklíček PBSd se na sklíčka nanese zředěné králičí antisérum proti antigenu odvozenému z faktoru VIH (Behring; 100 μΐ antiséra + 1,5 ml PBSd). Sklíčka se pak inkubují 30 minut při teplotě 37 °C v mlžné komoře, oplachované PBSd a překryjí se sekundární anti-králičí protilátkou značenou FITC. Po 30 minutové inkubaci při 37 °C se sklíčka omyjí PBSd, povléknou se směsí glycerolu a PBSd (1 : 1) a překryjí se krycím sklíčkem.

b) Imunofluorescenční zabarvení pro analysu FACS

Z kultivační baňky se oddělí ulpělé stromální buňky inkubací systémem collagenáza (0,1 U/ml) /dispáza (0,8 U/ml) 15 minut při teplotě 37 °C. Buňky se promyjí PBSd, suspendují se v pufru IF (PBSd s 1 % „sodium acid“ a s 2 % FCS) a značí se po dobu 30 minut při teplotě 4 °C první protilátkou, která byla buď konjugovaná FITC, konjugovaná PE, nebo neznačená. Buňky se pak promyjí dvakrát 1 ml pufru IF a v případě neznačené první protilátky se zpracují jak shora

- 10CZ 284871 B6 popsáno druhým FITC nebo PE-značenou protilátkou. Obarvené buňky se suspendují v 1 ml pufru IF a analyzují se průtokovým cytometrem FACScan (Becton Dickinson).

Cytochenické barvení pro fenotyping (tabulka I)

Buňky se pěstují na sklíčkách omytých PBSd a osušených na vzduchu a obarví se systémem chloracetát-esteráza nebo α-naftyl-esterázou, jak popsáno v instrukcích výrobce (Sigma).

Mezní zředění

Ulpělé živné buňky se naočkují do 96-důlkových destiček, nechají se růst do slinutí a ozáří se MRC5, 50 Gy; MB feeder, 50 Gy; L88/5, 15 Gy; L87/4, 20 Gy) zdrojem gama-záření Csl37 (Atomic Energy of Canada, LTD). Po 24 hodinách se buňky BL70 promyjí dvakrát médie prostým séra a přidají se ve vyznačených hustotách do nejméně 24 důlkových destiček. Destičky se využívají dvakrát týdně a nárůst kolonií se sleduje až do 40. dne. Veškeré experimenty mezního zředění se provádějí v RPMI1640 doplněným 5 % FCS, 2 mM glutaminu a antibiotiky. Buňky BL70 se udržují vtémže médiu v přítomnosti ozářených (50 Gy) buněk MRC5. Buňky MRC5 se kultivují v Dulbecově MEM doplněném 10% FCS, 2mM L-glutaminu a antibiotiky.

Pokusy kokultur s lidskými buňkami cord-blood obohacenými CD34

Percolem separované mononukleámí baňky cord-blood se obarví buď monoklonální protilátkou anti-CD34 (Dianova, Hamburg) přímo konjugovanou k fluoresceinisokyanátu (FITC) a pak se rozčlení na FACStarPlus (BD FACS Systems; Becton Dickinson) pro vysokou expresi CD34, nebo se CD34 pozitivní buňky izolují pomocí Dynabeads M-450 přímo povlečených mAb BI-3C5 (Smeland E. S:, Funderud S., Kvalheim G., Gaudemack G., Rasmussen A. M., Rusten L., Wang Μ. Y., Tindle R. W., Blomhoff Η. K., Egeland T.: Isolation and characterization of human hemopoietic progenitor cells: An effective method for positive selection of CD34⁺ cells, Leukemia 6, str. 845-852, 1992).

CD34⁺ buňky cord-blood se nanesou na 24-důlkové destičky (5 x 10^J buněk cord-blood/důlek) na ozářený semikonfluent L87/4 (20 Gy) a L88/5 (15 Gy) stromálních buněk v médiu LTC. Kultury se udržují na teplotě 37 °C po dobu 5 týdnů s polovičními výměnami média týdně po 2. týdnu. Neulpělé buňky se zkoumají v polopevném médiu na přítomnost erytroidu (BFU-E) a myeloidu (GM-CFC, 1 % BSA, ΙΟ“⁴ M a-thioglycerolu, 5 % PHA-LCM, 0,98 % methylcelulózy, 3 J/ml EPO - všechny látky od Terry Fox Laboratories - a 100 mg/ml kit-ligandu. Kultury se nanesou v objemech 1 ml na 35 mm destičky s tkáňovou kulturou v 5 % oxidu uhličitém při teplotě 37 °C a kolonie se sečtou 14. dne.

b) Stanovení a charakteristika stromálních buněčných linií lidské kostní dřeně starší pasáže

V 25 cm² baňce se pěstují buňky kostní dřeně 70 letého hematologicky normálního pacienta v běžném LRBMC Dexterova typu po dobu 3 týdnů. Konfluentní stromální vrstvy se nechají jednou pasážovat a transfekují se buď pSV-INl, nebo pUCENl plasmidovým vektorem lipofekcí. O obou plasmidech obsahujících sekvence kódující pro T-antigen SV40 je známo, že jsou transferujícím činitelem (Kuhar S., Lehman J. M.: T-antigen a p53 in pre- and postcrisis simian virus 40 transformed human cell lineš, Oncogene 6, str. 1499-1506, 1991; Chang S. E.: In vitro transformation of human epithelial cells, Biochim, Biophys Acta 823 (3), str. 161-194, 1986). Vyčlení se 10 pasážovatelných buněčných linií jejich růstovou výhodou oproti primární stromě po lipofekcí. Ve 20 % kultivačních baněk se pozoruje spontánní přerůstání neulpělých B-buněk imortalizováných EBV.

-11 CZ 284871 B6

K dalšímu studiu se vyčlení 10 buněčných linií označených L87/4, L88/5, L90/7, L91/8 a L87/ 12. Všechny buněčné linie vykazují fibroblastoidní morfologii, zakotvují stabilně integrované konstrukty SV40 a exprimují SV40 velké T-Ag jak stanoveno skvrnami Northem (data neudána). Integrační místo plasmidového vektoru je odlišné v každé buněčné linii. Tři z pěti 5 buněčných linií jsou klonální po šesti pasážích, zatímco 2 jsou oligoklonální. Buněčné řady transformované SV40 rostou poměrně vysokou rychlostí po 25 až 30 buněčných pasážích a pak se dostávají do krize. Dvě z pěti linií se následně zotaví (linie L88/5 a L87/4). Nyní se udržují v kontinuální kultuře po více než 70 pasážích (18 měsíců). Všechny další pokusy se provádějí s klonálními pokritickými buněčnými liniemi L87/4 a L88/5.

U předkrizových a pokrizových buněk se udržuje řada parametrů včetně místa integrace SV40, exprese SV40 T-Ag, exprese CD68 v L87/4 a odezvy na ozáření na stálé úrovni. U pokrizových buněk zůstává stálost po více než 30 pasážích. Buněčné linie podle vynálezu mohou být zachovány jako ulpělé, v růstu zastavené buněčné vrstvy po ozáření dávkami až do 20 Gy. Je 15 pozoruhodné, že dokonce vyšší dávky ionizačního záření jsou tolerovány, jsou-li tyto buňky včas doplněny umbilikálními buňkami cord-blood obohacenými CD34 při nízkých hustotách.

Podle výhodného provedení vynálezu vykazují buněčné linie expresi CD10 a CD13 a neexpresi krvetvorných markérů (viz tabulku Π). Obzvlášť výhodné jsou buněčné řady, které exprimují 20 makrofágový markér CD68. Obr. 2 ilustruje charakteristické fenotypy buněčných linií podle vynálezu.

Buněčné linie podle vynálezu mají také živnou kapacitu v pokrizových pasážích (například pasáž 60). To je demonstrováno jejich schopností zachovat klonogenickou buněčnou proliferaci 25 BL-buněčných linií závislých na stromálních buňkách (například BL70) po více než 5 týdnů.

Test BL70 jasně ukazuje, že buněčné linie produkují veškeré faktory nutné k proliferaci maligních B-buněk. To nevylučuje možnost, že produkují stejně dobře další cytokiny podporující růst a diferenciaci ostatních buněčných typů. Jak ukazuje analýza PCR, produkují buněčné linie podle vynálezu řadu krvetvorných růstových faktorů, včetně IL-6, IL-7, IL-8 IL-10, IL-11, 30 K.L, LIF, G-CSF, GM-CSF a M-CSF. Tento cytokinový profil ukazuje, že buněčné linie podle vynálezu jsou schopné podporovat dlouhodobé kultivování normálních primárně krvetvorných progenitorových buněk, například vývoj GM-CFCs (obr. 6) a BFU-Es kultur cord-blood obohacených CD34⁺.

Charakterizace stromálních buněčných linií L88/5 a L87/4

Fázovým kontrastem vykazuje morfologie obou pokrizových buněčných linií fibroblastoidní morfologii. Buňky se dělí rychle, s jednodenní dobou dvojení u L88/5 a L87/4. Buňky vykazují kontaktní inhibici a nevytvářejí zárodky v tekuté kultuře. Jsou-li vneseny do polopevného agaru 40 v přítomnosti 1 % GCM-CM, rostou do fibroblastoidních kolonií.

Obě buněčné linie jsou pozitivní v expresi SV40 T-antigenu a vykazují stejná genomická integrační místa SV40, jak bylo prve pozorováno u předkrizových buněk L87/4 a L88/5. Jak je doloženo imunofluorescencí, exprimují L/87/4 a L88/5 povrchové markéry stromálních buněk 45 CD10 a CD13, přičemž neexprimují řadu markérů krvetvorných buněk (tabulka I). Nicméně může být L87/4 od L88/5 rozlišeno exprimováním makrofágového markéru CD68.

Radiační citlivost buněk L88/5 a L87/4

Buňky L88/5 a L87/4 se pěstují a ozařují, jak vyznačeno na obr. 4 a jak je shora popsáno ve stati a). Obě buněčné linie mohou být ozářeny až 15 Gy bez oddělování. Proliferace vytváření kolonií L88/5 ustává při dávkách záření přesahujících 15 Gy, zatímco buňky L87/4 si uchovávají svou schopnost růstu a vytvářejí kolonie v měkkém agaru. L87/4 musí být ozářena dávkou 20 Gy ke zrušení proliferace v suspenzní kultuře a klonálního růstu v měkkém agaru (obr. 1).

- 12CZ 284871 B6

Linie buněk P87/4 může být ozářena ještě vyššími dávkami aniž dojde k oddělování buněk, jsou-li vrstvy buněk v průběhu 24 hodin znovu nabity nízkým počtem (5xl0³/ml) CD34-pozitivních pupečníkových cord-blood buněk.

Náhrada fibroblastových a MB živných buněk buňkami L88/5 a L87/4

Řada buněčných linií Burkitt lymphoma (BL) závisí na živné vrstvě ozářených lidských fibroblastů, jsou-li pěstovány v nízkých buněčných hustotách za nízkých sérových podmínek. Při velkých hustotách buněk nepotřebují vrstvy živných buněk. Živná funkce v tomto systému může být zajišťována řadou primárních lidských a hlodavcových fibroblastových buněk. Avšak četné dostupné SV40-imortalizované lidské fibroblastové buněčné linie konstantně selhávají v podpoře proliferace linie modelů BL, BL70 (Falk Μ. H., Hiiltner L., Milner A., Gregory C. D., Bomkamm G. W.: Irradiated fibroblasts protéct Burkitt Lymphoma cells from apoptosis by mechanism independent of BLC-2, Int. J. Cancer v tisku, 1993). Jak patrno z obr. 2, podporují ozářené buňky L88/5 (15Gy) a ozářené buňky L87/4 (20Gy) klonogenický růst buněk BL70 ještě lépe než primárně ozářené stromální buňky kostní dřeně a lidské fibroblasty MRC5. Buňky BL70 odumírající ve dvou dnech, mohou být v přítomnosti živných buněk udrženy na ozářených živných vrstvách L88/5 a L87/4 déle než 5 týdnů. Grafické vyjádření zkoušek mezního ředění BL70 (obr. 5) naznačují kinetiku. To dokazuje, že buňky L88/5 a L87/4 (stejně jako buňky MRC5 nebo primární stroma kostní dřeně) poskytují veškeré činitele potřebné k optimální proliferaci buněk BL70.

Buňky L87/4 a L88/5 podporují dlouhodobou krvetvorbu lidských progenitorů cord-blood

Poloslité ozářené buňky L87/4 (20Gy) a L88/5 (15 Gy) naočkované na 24-důlkové destičky se doplní lidskými cord-blood buňkami CD34⁺ (5 x 10³ buněk CD34⁺/důlek) a pěstují se 5 týdnů v médiu LTC. Až do 5. týdne kultivace podporují stromální vrstvy proliferaci neulpělých buněk cord-blood s maximálním počtem buněk pozorovatelným dva až tři týdny po ozáření kultur. Počet neulpělých buněk se znásobí přibližně 200-krát v průběhu kultivační periody v porovnání s počtem vnesených cord-blood buněk. V neulpělé frakci buněk je přítomno velké množství kolonií odvozených od myleoidu (GM-CFC, obr. 3) a erythroidu (BFU-E) do 5. týdne po ozáření kultury, jak se zjišťuje testem tvoření methylcelulózové kolony.

Tabulka I

Fenotypy pokrizových stromálních buněčných linií L87/4 a L88/5

L87/4

L88/5 c-kit

HLA-DR

CDlla, CDllb, CD14

CD23, CD32, CD33

CD34, CD36, CD38

CD56, CD61,CD64

CD10

CD13

CD68

CD71 antigen odvozený od faktoru VIII chloracetatesteráza + +++ +

4-H-

- 13CZ 284871 B6

α-naftylesteráza

SV40 T-Ag aktin typu hladkého svalstva

Laminin

Fibronectin

Vitronectin

Příklad 2

Konstitutivní a modulovaná exprese cytokinů v buněčných liniích podle vynálezu

Buněčná kultura

Jako pozitivních kontrol pro analýzu RNA se použije řady buněčných linií a primárních buněk. Jsou to: buňky U937 (ATCC: CRL1593; lidská histiocitická lymfona), buňky HL60 (ATCC: CCL240; lidská promyelocytická leukemia), buňky K562 (ATCC: CCL243; lidské CML), MelJuso (dar Dr. Johnosona z imunologického oddělení; LMU Mnichov) a buňky 5637 (ATCC: HTB9; lidské karcinoma žlučníku), pěstované vRPMI 1640/10% FCS ve vlhkém inkubátoru (37 °C, 5 % oxidu uhličitého). Všechny buněčné linie se subkultivují dvakrát týdně.

Do kulturou aktivovaných T-buněk se separují mononukleámí buňky periferální krve zdravých dobrovolníků Percoll gradientem a inkubují se vIMDM/10% FCS doplněným fytohemagglutininem (objemově 1 %) a forbol-12-myristát-13 acetátem (10 ng/ml). Po 8 hodinové inkubaci se buňky shromáždí a připraví se RNA způsobem guanidiniumisothyokyanátovou extrakce (Kuhar S., Lehman J. M.: T-antigen a p53 in pre- and postcrisis simian virus 40 transformed human cell lineš, Oncogene 6, str. 1499-1506, 1991).

Primární stromální linie se ustaví jak popsáno v příkladu 1.

Vystavení buněk L87/4 a L88/5 působení Π_-1α a dexamethasonu

Do kultivačních baněk 25 cm² (Nunc) se vnesou buňky L87/4 (pasáž 96) a L88/5 (pasáž 98) v hustotách 2 x 10⁵ buněk/ml a inkubují se po dobu 24 hodin v médiu LTC. Médium se úplně odstraní a nahradí se čerstvým médiem LTC bez hydrokortizonu nebo médiem LTC doplněným buď IL-Ια (lOJ/ml), a/nebo dexamethasondem (10~^&M). Buňky se pak inkubují dalších 24 hodin (37 °C, 5 % oxidu uhličitého) před extrakcí RNA. Supematanty kultury se shromáždí k cytokinovým biotestům a RIA.

Kvantifikace uvolňování stromálních cytokinů biotesty

Testuje se proliferaci usnadňující aktivita surového kondiciovaného média stromálních buněk (L87/4 a L88/5) testy MTT (Mosman T.: Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: Application to proliferation and cvtoxity assays, J. Immunol. Methods 65, str. 55-63, 1983). K testování produkce IL-6 se použije buněk 7TD1. Aktivita G-CSF se měří vysoce responsivní sublinií NFS60. Specifické odezvy buněčných linií se kontrolují přidáním příslušných neutralizujících protilátek.

Kvantifikace uvolňování stromálních cytokinů zkouškami RLA

Surové kondiciované médium stromálních buněk (L87/4 a L88/5) se testuje na koncentraci IL1β a GM-CSF (Mortensen B. T., Schifter S., Pedersen L. B., Jensen A. N., Hovgaard D., Nissen N. I.: Development and application of sensitive radioimmunoassay for human granulocyte

- 14CZ 284871 B6 macrophage colony-stimulating factor able to measure normál concentrtions in blood, Exp. Hematol. 21, str. 1366-1370, 1993).

Z příkladů tedy vyplývá, že dvě permanentní linie stromálních buněk podle vynálezu (L87/4 aL88/5) produkují řadu cytokinů, o nichž se má zato, že přispívají k udržení krvetvorných progenitorů, přičemž tento model produkce cytokinů je částečně zvyšován a částečně potlačován ozářením a působením glykokortikoidů (obr. 4 a 5).

Průmyslová využitelnost

Nové stromální buněčné linie, charakterizované tím, že zůstávají přilnuté po ionizačním ozáření dávkami až více než 20 Gy k zastavení růstu. Jsou proto obzvlášť užitečné jako živné buňky podporující dlouhodobou proliferaci buněk závislých na živné vrstvě.

Claims (9)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Linie v růstu zastavených adherentních stromálních buněk lidské kostní dřeně L87/4 (DSM ACC2055) a L88/5 (DSM ACC2056) uložené podle Budapešťské smlouvy jako kultura pod číslem DSM ACC 2055 a DSM ACC 2056.
2. 2. Způsob produkce in vitro v růstu zastavených adherentních stromálních buněk lidské kostní dřeně L87/4 (DSM ACC2055) a L88/5 (DSM ACC2056), vyznačující se tím, že se buňky, které jsou transfektovány použitím SV40, kultivují až do dosažení slinutí, stromální vrstva, sestávající z těchto buněk, se podrobí opakovaně pasážování až do dosažení u buněk růstové krize a buňky, které se dělí velmi pomalou rychlostí nebo buňky, jež se vůbec nedělí, se ze svého podkladu odstraní, nahradí se novou kulturou a ozáří se tak, že jsou adherentní a ve svém růstu zastavené.
3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že odstranění buněk z podkladu se provádí trypsinizací.
4. 4. Použití in vitro stromálních buněk, jež jsou ve svém růstu zastaveny a jsou adherentní, získaných podle nároku 2 nebo 3, jako živné vrstvy ke stimulaci proliferace a/nebo diferenciace krevních buněk v buněčné kultuře.
5. 5. Použití in vitro stromálních buněk získaných podle nároku 2 nebo 3 ke kultivaci buněk závislých na živné vrstvě.
6. 6. Použití in vitro stromálních buněk získaných podle nároku 2 nebo 3 ke kultivaci buněk závislých na živné vrstvě kokultivací těchto buněk s v růstu zastavenými adherentními stromálními buňkami.
7. 7. Použití in vitro stromálních buněčných linií podle nároku 1 pro produkci krvetvorných růstových faktorů.
8. 8. Použití in vitro podle nároku 7 linie stromálních buněk zastavených ve svém růstu vlivem ozáření.

   - 15 CZ 284871 B6
9. 9. Použití in vitro stromálních buněčných linií podle nároku 7 nebo 8 v přítomnosti IL1 a/nebo dexamethasonu v množství podporujícím produkci krvetvorných růstových faktorů.