CZ285499A3

CZ285499A3 - Léčebné činidlo pro lymfatické nádory, protilátka, chimerní protilátka a pozměněná protilátka

Info

Publication number: CZ285499A3
Application number: CZ19992854A
Authority: CZ
Inventors: Yasuo Koishihara; Yasushi Yoshimura
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1998-02-12
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2000-01-12

Abstract

Léčebné činidlo pro lymfatické nádoiy/kromě rryelorrů/, které obsahujejako svou aktivní složku protilátku, která se specificky váže k proteinu,jehož aminokyselinová sekvenceje uvedena v SEQ IDNO: 1 akterámá cytotoxickou aktivitu

Description

Předkládaný vynález se vztahuje k léčebným činidlům pro lymfatické nádory (vyjma myelomů), která obsahují jako aktivní složku protilátky, jež se specificky vážou k proteinům, exprimovaným těmito lymfatickými nádory. Předkládaný vynález se také vztahuje k léčebným činidlům pro nádory T buněk nebo B buněk (vyjma myelomů).

Dále se předkládaný vynález vztahuje k protilátkám, jež se specificky vážou k proteinům, exprimovaným v lymfatický nádorech a které mají cytotoxickou aktivitu.

Dosavadní stav techniky

Lymfatické buňky jsou hlavně zodpovědné za imunitu živých organizmů. Všechny lymfatické buňky jsou odvozeny od stejných krvetvorných kmenových buněk, jež jsou uvolňovány do periferní krve po opakované diferenciaci, která probíhá pod vlivem působení různých diferenciaci indukujících faktorů nebo růstových faktorů v kostním morku nebo jiných orgánech. Následkem rozdílů v průběhu této diferenciace se lymfocyty dělí na B buňky a T buňky. Za B buňky jsou považovány ty, které mají schopnost produkovat protilátky, zatímco za T buňky jsou považovány ty, které mají schopnost prezentace antigenů, působí cytotoxicky a podobně. Když tyto buňky projdou nádorovými změnami z nějakého důvodu nebo během určitých stádií své diferenciace a začnou nekontrolovatelným způsobem proliferovat v kostním morku, lymfatických tkáních, krvi a podobně, je tento stav nazýván lymfatickým nádorem.

V důsledku zavádění nových technologií, zvláště pokročilých technologií, které užívají monoklonální protilátky proti diferenciačním antigenům na povrchu buněk, se stalo možným určit původ anebo diferenciační stav lymfatických buněk. Současně s tím se také stalo možným určit nejen zda jsou takové nádorové buňky odvozeny z T buněk nebo B buněk, ale též určit stupeň zralosti nádorových buněk.

Základní klasifikace lymfatických nádorů je na nádory B buněk a na nádory T buněk, což je založeno původu a stupni zralosti nádorových buněk. Na základě stupně zralosti nádorových buněk jsou nádory B buněk klasifikovány jako akutní B lymfatická leukémie (B-ALL), chronická B lymfatické leukémie (B-CLL), pre-B lymfom, Burkittův lymfom, folikulární lymfom, lymfom folikulárního obalu, difúzní lymfom a podobně. Na

druhé straně jsou nádory T buněk na základě stupně zralostí nádorových buněk klasifikovány na akutní T lymfatickou leukémii (T-ALL), chronickou T lymfatickou leukémii (T-CLL), leukémii zralých T buněk (ATL), non-ATL periferní T lymfom (PNTL) a podobné (Zukai Rinsho (GAN) (lllustrated Clinical: Cancer), série č.17 Leukemia and lymphoma, Takashi Sugimura a kol., Medical View Co., Ltd., 1987, B cell tumors, Kiyioshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991).

Je pravdou, že bez ohledu na nedávné pokroky v lékařských technikách, léčení lymfatických nádorů není uspokojivé. Např. procento vyléčení akutní lymfatické leukémie (ALL) je stále 20% nebo nižší a u lymfomů je v pokročilém stavu asi 50%, ačkoli se říká, že procento vyléčení u B lymfomů je relativně vysoké, díky pokroku v multidrogové léčbě. Navíc T lymfom je odolnější a jeho procento vyléčení je asi 30 %, procento úspěšného vyléčení u leukémie dospělých T buněk (ATL) je v současné době menší než 10 %.

Na druhé straně Goto, T. a kol. popsali monoklonální protilátku (protilátka antiHM1.24), která byla získána imunizací myší lidskými myelomovými buňkami (Blood (1994) 84, 1922-1930). Když byla podána myši s transplantovanými lidskými myelomovými buňkami, protilátka se hromadila specifickým způsobem v nádorové tkáni (Masaaki Kosaka a kol., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, 627-635), což naznačuje, že protilátka anti-HM1.24 může být používána při diagnóze umístění nádoru pomocí radioizotopového značení, při cílených terapiích jako je radioimunoterapie apod. Není však známo, zda je možno použít protilátku anti-HM1.24 pro léčení ostatních lymfatických nádorů.

Podstata vynálezu

Léčebné metody u lymfatických nádorů, které jsou v současnosti používané, zahrnují různé druhy chemoterapií, transplantaci kostního morku a podobně. Jak bylo výše uvedeno, žádná z nich však není dostatečně uspokojivá, a tedy se stále očekává vznik převratných léčebných činidel nebo metod, které budou schopny mírnit lymfatické nádory a prodloužit dobu přežití pacienta.

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnout nové léčebné činidlo pro lymfatické nádory, kromě myelomů.

Aby bylo možno poskytnout takové léčebné činidlo, vynálezci prováděli rozsáhlé in vitro studie, včetně analýzy pomocí průtokové cytometrie (FCM), určování

4 4 4 4 · 4 4 ·· · · • · · «··· 4 4 4 4 • ··· 4 · · 4 · · · ί 4444444444444 · 4 4 4 4 4

444 444 444 44 44 44 cytotoxických aktivit jako je ADCC aktivita, CDC aktivita atd. a in vivo studie protinádorových účinků za pomoci protilátek anti-HM1.24 (Goto, T. a kol., Blood (1994) 84, 1922-1939) a studie izolace antigenního proteinu, k němuž se protilátka antiHM1.24 specificky váže. Výsledkem bylo zjištění, že antigenní protein, rozpoznávaný protilátkou anti-HM1.24 je exprimován na lymfatických nádorech a že protilátka antiHM1.24 má protinádorový účinek na lymfatické nádory a to tvoří materiál předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález tedy popisuje léčebné činidlo pro lymfatické nádory (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje protilátku, která se specificky váže k proteinu, jež má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedeno v SEQ ID No: 1 a která má cytotoxickou aktivitu.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje protilátku, která se specificky váže k proteinu, jež má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedeno v SEQ ID No: 1 a která má cytotoxickou aktivitu.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje monoklonální protilátku, která se specificky váže k proteinu, jež má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedeno v SEQ ID No: 1 a která má cytotoxickou aktivitu.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje monoklonální protilátku, která se specificky váže k proteinu, jež má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedeno v SEQ ID No: 1 a která má jakožto svoji cytotoxickou aktivitu ADCC aktivitu nebo CDC aktivitu.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje monoklonální protilátku, která se specificky váže k proteinu, jež má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedeno v SEQ ID No: 1, která má cytotoxickou aktivitu a které má jako konstantní oblast Cy z lidské protilátky.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje chimemí protilátku nebo pozměněnou protilátku, která se specificky váže • •9 99·· ····

9999 99 9 9 99 · • ·· 9 · 99 999 999 · 9 9 · · · k proteinu, jež má aminokyselinovou sekvenci, jak je uvedeno v SEQ ID No: 1 a která má cytotoxickou aktivitu.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje protilátku, která se specificky váže kepitopu, rozpoznávanému protilátkou anti-HM1.24.

Předkládaný vynález také popisuje léčebné činidlo pro nádory T buněk nebo léčebné činidlo pro nádory B buněk (vyjma myelomů), které jako svojí aktivní součást obsahuje protilátku anti-HM1.24.

Dále se předkládaný vynález vztahuje k protilátce, která se specificky váže k proteinu, exprimovanému na lymfatických nádorech a která má cytotoxickou aktivitu. Postupy, použité při provedení vynálezu.

1. Příprava protilátek

1-1. Příprava hybridomů

Hybridomy produkující protilátky, používané v předkládaném vynálezu, mohou být v podstatě vytvořeny pomocí známého postupu, popsaného níže. Tedy antigenní protein HM1.24 nebo buňky, které jej exprimují, mohou být použity jako senzibilizující antigen a jsou použity k imunizaci, provedené běžným imunizačním postupem. Takto získané imunní buňky jsou pak fúzovány se známými rodičovskými buňkami, za použití běžného způsobu buněčné fúze, poté je provedeno hromadné vyšetření běžným hromadně vyšetřovacím postupem, aby byly selektovány buňky, produkující monoklonální protilátky.

Přesněji řečeno, monoklonální protilátky mohou být získány následujícím způsobem. Např. jako buňky exprimující HM1.24 antigen, který je sensibilizující antigen pro získání protilátky, může být použita buněčná linie KPMM2 z mnohočetného myelomů (Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-236475) nebo buněčná linie KPC-32 (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 3, 1400). Popřípadě může být jako sensibilizující antigen použit protein, který má aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v SEQ ID No: 1, nebo peptid či polypeptid, obsahující epitop rozpoznávaný protilátkou anti-HM1.24.

Zde je to provedeno tak, že cDNA, kódující protein, který má aminokyselinovou sekvenci, která je uvedena v SEQ ID No: 1, byl vložen do štěpného místa pro Xbal vektoru pUC19, čímž byl zkonstruován plazmid pRS38-pUC19. E. coli, obsahující tento • · • · plazmid byla uložena pro mezinárodní použití podle ustanovení Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) 5. října 1993 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-4434 (viz Japanese Unexamined Patent Publication (Kokai) No. 7-196694). Fragment cDNA, obsažený v tomto plazmidu pRS38-pUC19, může být použit při využití technologie genetického inženýrství, pro přípravu peptidu nebo polypeptidu, obsahujícího epitop rozpoznávaný protilátkou anti-HM1.24.

Pro imunizaci sensibilizujícím antigenem jsou používáni převážně savci a při výběru se bere v úvahu jejich kompatibilita s rodičovskými buňkami při buněčné fúzi. Obecně se jedná, mimo jiné, o hlodavce jako jsou myši, krysy a podobně.

Imunizace savců sensibilizujícím antigenem se provádí běžně známými postupy. Obecný postup, např. zahrnuje intraperitoneální nebo subkutánní podání sensibilizujícího antigenu savci. Přesněji řečeno, sensibilizující antigen, který byl zředěn a suspendován ve vhodném množství solného roztoku pufrovaného fosfátem (PBS) nebo fyziologického solného roztoku atd., je smíchán jak je požadováno, s vhodným množstvím kompletního Freudova adjuvans. Po emulgaci je s výhodou podáván savcům několikrát každé 4 až 21 dnů. Alternativně je možno použít v době imunizace se sensibilizujícím antigenem vhodný nosič.

Po imunizaci a potvrzení, že došlo ke zvýšení hladiny požadovaných protilátek v séru, jsou imunní buňky ze zvířete odebrány a je s nimi provedena buněčná fúze, při které se přednostně jako imunní buňky užívají buňky sleziny.

Jako savčí myelomové buňky, jakožto druhé rodičovské buňky, se kterými je prováděna buněčná fúze s výše uvedenými imunními buňkami, se přednostně užívají různé známé buněčné linie, jako jsou P3X63AG8.653) (J. Immunol. (1979) 123: 15481550), P3X63AG8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7) NS-1 (Kohler, G. a Milstein, C., Eur. J. Immunol. (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies, D.H. a kol., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. a kol., Nátuře (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S.F. a kol., J. Immunol. Methods (1980) 35: 121), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. a kol., Nátuře (1979) 277:131-133) a podobné.

• · · · » · · 4 • · · 1

Buněčná fúze mezi výše uvedenými imunními buňkami a myelomovými buňkami může být v podstatě provedena podle známého postupu, jaký je popsán v Milstein a kot, (Kohler, G. a Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) či podobného.

Přesněji řečeno, výše uvedená buněčná fúze je provedena v běžném živném bujónu, za přítomnosti, např. urychlovače buněčné fúze. Jako urychlovač buněčné fúze, může být použit např. polyetylenglykol (PEG), virus Sendai (HVJ) a navíc může být pro zvýšení efektivity fúze přidán adjuvans, jako je dimethylsulfoxid atd.

Výhodný poměr imunních a myelomových buněk, který se má použít, je např. jedenkrát až desetkrát více imunních buněk než myelomových buněk. Příklady kultivačních médií, která se používají pro výše uvedenou buněčnou fúzi, jsou médium RPM11640 a médium MEM, vhodná pro růst výše uvedených myelomových buněčných linií a běžné kultivační médium, užívané pro tento typ buněčné kultury, kromě toho může být přidáno jako doplněk sérum, jako např. fetální telecí sérum (FCS).

Při buněčné fůzi jsou smíchána předem stanovená množství imunních buněk a myelomových buněk důkladně promíchány v uvedeném kultivačním médiu, k němuž byl přidán roztok PEG, předem zahřátý na 37 °C, např. roztok PEG s průměrnou molekulovou hmotností 1000 až 6000, je přidán v koncentraci 30 až 60 % (w/v) a míchány, až se dosáhne požadované fúze buněk (hybridomy). Poté opakováním postupného přidávání vhodného kultivačního média a centrifugací, po které se odstraní supernatant, může být odstraněno činidlo, podporující buněčnou fůzi, které je však nežádoucí pro růst hybridomů.

Uvedené hybridomy jsou vybírány pomocí kultivace v běžném selektivním médiu, např. kultivační médium HAT (kultivační roztok obsahující hypoxantin, aminopterin a tymidin). Kultivace v uvedeném kultivačním médiu HAT probíhá obecně po dobu, dostatečnou pro usmrcení buněk, jiných než požadované hybridomy (nezfúzované buňky), což je obecně několik dnů až několik týdnů. Pak se provede běžná metoda koncového ředění, pomocí níž jsou vybrány hybridomy, které produkují požadované protilátky, a jsou dále monoklonálně klonovány.

Vedle získávání výše uvedených hybridomů pomocí imunizace živočichů jiných než je člověk s pomocí antigenu, je také možno senzibilizovat lidské lymfocyty in vitro pomocí antigenu nebo pomocí buněk, exprimujících antigen HM1.24 a výsledné senzibilizované lymfocyty jsou fúzovány s lidskými myelomovými buňkami, např. s U266, aby byla získána požadovaná lidská protilátka, mající schopnost vázat se • · • · · · k antigenů HM1.24 nebo k buňkám, exprimujícím antigen HM1.24 (viz Japanese Postexamined Patent Publication (Kohoku) No. 1-59878). Další možností je, že transgenní živočich, který má soubor všech lidských proti látkových genů, je imunizován antigenem, tj. HM1.24 nebo buňkami exprimujícími antigen HM1.24, čímž je získána požadovaná lidská protilátka, jak bylo již dříve popsáno (viz International Patent Applications WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/ 25585, WO 96/34096 a WO 96/33735).

Takto konstruované hybridomy produkující monoklonální protilátky, mohou být kultivovány v běžném kultivačním médiu nebo mohou být uloženy po dlouhou dobu v tekutém dusíku.

Pro získání monoklonálních protilátek z uvedených hybridomů lze uvést postup, při kterém je hybridom kultivován běžným způsobem a protilátky jsou získány v supernatantu, nebo postup při kterém je hybridom podán a kultivován v těle živočicha, jež je kompatibilní pro uvedený hybridom a protilátky jsou získány z ascitů. Prvně uvedený postup je vhodný pro získání vysoce čistých protilátek, zatímco druhý je vhodný pro produkci protilátek ve velkém množství.

Přesněji řečeno, hybridomy produkující protilátky anti-HM1.24, mohou být zkonstruovány způsobem podle Goto T. a kol., (Blood (1994) 84: 1922-1930). Toto může být provedeno tím způsobem, že hybridom produkující protilátky anti-HM1.24, který byl uložen pro mezinárodní použití za podmínek Budapešťské smlouvy jako FERM BP-5233 dne 14. září 1995 organizací National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, je intraperitoneálně podán myši BALB/c (vypěstována v CLEA Japan) aby byl získán ascitus, ze kterého je purifikována protilátka anti-HM1.24: nebo způsobem, kdy výše uvedený hybridom je kultivován ve vhodném kultivačním médiu jako je médium RPMI 1640, obsahující 10 % fetálního telecího séra a 5 % BM-Condimed H1 (vyrobeno Boehringer-Mannheim), médium pro hybridomy SFM (vyrobeno GIBCI-BRL), médium PFHM-II (vyrobeno GIBCI-BRL) či v podobných a protilátky mohou být purifikovány ze supernatantu.

1-2. Rekombinantní protilátky

Rekombinantní protilátka, která byla produkována pomocí rekombinantní genové technologie, při níž protilátkový gen byl klonován z hybridomů a zabudován do vhodného vektoru jež byl pak vnesen do hostitele, může být v předkládaném vynálezu '« * «·«·· 9 99 99 • 99 9 9 · 9 · ) 99999999999

9 9 99 99 999 999 · 9 9 9 9 9 •99 999 999 99 99 99 ι

použita jako monoklonální protilátka (viz např. Carl, A. K., Borrebaeck, and James, W. Larrick, THERAPEUTICAL MONOCLONAL ANTIBODIES, publikováno v MACMILLAN PUBLISHERS LTD. 1990, Velká Británie).

Přesněji řečeno, mRNA kódující variabilní oblast (V oblast, V region) požadované protilátky je izolována z hybridomu, který tuto protilátku produkuje. Izolace mRNA je provedena tak, že se připraví celková RNA pomocí např. známého postupu jako je guanidinová ultracentrifugační metoda (Chirgwin, J. M. a kol., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC metodou (Chomczynski, P. a kol., Analytical Biochemistry (1987) 162,156-159) a poté je mRNA z celkové RNA purifikována pomocí soupravy mRNA Purification kit (vyrobeno Pharmacia) nebo podobně. Jinou možností je připravit mRNA pomocí soupravy Quick Prep mRNA kit (vyrobeno Pharmacia).

cDNA pro V oblast protilátky může být nasyntetizována z takto získané mRNA pomocí reverzní transkriptázy. cDNA může být nasyntetizována pomocí soupravy AMV Reverse Transkriptase First-strand cDNA Synthesis Kit či podobně. Jinou možností je pro syntézu a amplifikaci cDNA použít soupravu 5'-Ampli FINDER RACE Kit (vyrobeno Clontech) a lze použít metodu 5'-RACE (Frohman, M. A. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavski, A. a kol., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 29192932), která využívá polymerázovou řetězovou reakci (PCR). Požadovaný fragment DNA je ze získaného PCR produktu vyčištěn a může být ligován do vektorové DNA. Z toho je dále konstruován rekombinantní vektor a ten je poté vnesen do E. coli atd., z jejíchž vybraných kolonií je požadovaný rekombinantní vektor připraven. Nukleotidová sekvence požadované DNA může být potvrzena pomocí známé metody, jako je např. dideoxy metoda.

Jakmile je jednou DNA, kódující V oblast požadované protilátky získána, může být ligována do DNA kódující konstantní oblast (C oblast) požadované protilátky, která je potom zabudována do expresního vektoru. Jinou možností je zabudovat DNA, kódující V oblast protilátky do expresního vektoru, který již obsahuje DNA, kódující C oblast protilátky.

Aby bylo možno produkovat protilátku, používanou v předkládaném vynálezu, protilátkový gen je zabudován způsobem, který je popsán níže, do expresního vektoru tak, aby byl exprimován pod kontrolou expresně regulační oblasti, např. zesilovače transkripce anebo promotoru. Následně může být expresní vektor transformován do hostitelské buňky a protilátka může být exprimována v ní.

1-3. Pozměněné protilátky

Podle předkládaného vynálezu může být za účelem snížení heterologní antigenicity proti člověku použita uměle pozměněná rekombinantní protilátka, jako je chimerní protilátka nebo pozměněná protilátka. Tyto pozměněné protilátky mohou být vytvořeny pomocí známých postupů.

Chimerní protilátku lze získat ligováním získané DNA, kódující V oblast protilátky do DNA, kódující C oblast lidské protilátky, která je pak vložena do expresního vektoru a vnesena do hostitele, vhodného pro produkci protilátek (viz European Patent Application EP 125023 a International Patent Application WO 96/02576). Za pomoci těchto známých metod lze získat chimerní protilátky, použitelné pro předkládaný vynález.

Např. E. coli, nesoucí plazmid, který obsahuje DNA kódující L řetězec V oblasti nebo H řetězec V oblasti chimerní protilátky anti-HM 1.24 protilátky byla uložena pro mezinárodní použití za podmínek Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gYl), dne 29. srpna 1996 organizací National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-5646 a FERM BP-5644 (viz Japanese Patent Application No. 9-271536).

Pozměněná protilátka, která je též označována pozměněná lidská protilátka byla vytvořena připojením oblasti, která určuje komplementaritu (CDR) v protilátce jiného savce než je člověk, např. myši, do CDR lidské protilátky. Obecné DNA rekombinanční technologie pro přípravu takových protilátek jsou rovněž známy (viz European Patent Application EP 125023 a International Patent Application WO 96/02576).

Podrobněji řečeno, DNA sekvence navržená tak, aby byla spojena CDR myší protilátky s podpůrnou oblastí (FR - framework region) lidské protilátky, je syntetizována pomocí metody PCR z několika oddělených oligonukleotidových úseků, které se vzájemné překrývají na svých koncích. Takto získaná DNA je spojena s DNA, kódující C oblast lidské protilátky a poté je vložena do expresního vektoru, jež je potom vnesen do hostitele (viz European Patent Application EP 239400 a International Patent Application WO 96/02576).

Podpůrné oblastí (FR - framework region) lidské protilátky, spojené pomocí oblastí, které určují komplementaritu (CDR) jsou vybrány tak, aby oblasti určující

9 9 9

99 • 9

999 999

9 • 9 99 komplementaritu vytvořily místo, které je schopno vázat požadovaný antigen. Pokud je potřeba, aminokyseliny v podpůrných oblastech variabilních částí protilátek mohou být zaměněny tak, že oblasti určující komplementaritu v pozměněných protilátkách vytvoří místo, které je schopno vázat požadovaný antigen (Sáto, K. a kol., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Například E. coli, nesoucí plazmid, který obsahuje DNA kódující verzi a (SEQ ID NO: 2) L řetězce V oblasti a E. coli, nesoucí plazmid, který obsahuje DNA kódující verzi r (SEQ ID NO: 3) H řetězce V oblasti pozměněné anti-HM 1.24 protilátky byly uloženy pro mezinárodní použití za podmínek Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gYl) dne 29. srpna 1996 organizací National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-5645 a FERM BP-5643 (viz Japanese Patent Application No. 9-271536), Dále E. coli, nesoucí plazmid, který obsahuje DNA kódující verzi s (SEQ ID NO: 4) H řetězce V oblasti pozměněné anti-HM 1.24 protilátky byla uložena pro mezinárodní použití za podmínek Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gYl) dne 29. srpna 1997 organizací National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, of

1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-6127 (viz Japanese Patent Application No. 9-271536).

Pro chimerní protilátku nebo pozměněnou protilátku je používána C oblast lidské protilátky, přičemž nejvýhodnější je použít jakožto konstantní oblast lidské protilátky Cy jako jsou Cy1, Cy2, Cy3 a Cy4. Z takto připravených protilátek mají protilátky, které obsahují Ογ1 a Cy3 silnou cytotoxickou aktivitu, tj. ADCC aktivitu a CDC aktivitu a tedy jsou s výhodou používány v předkládaném vynálezu.

Chimerní protilátky obsahují variabilní oblast protilátky odvozenou ze savčího druhu (nikoli však člověka) a C oblast odvozenou z lidské protilátky, zatímco u pozměněné protilátky jsou oblasti určující komplementaritu protilátky odvozené ze savčího druhu (nikoli však člověka) a podpůrné oblasti (FRs) spolu s C oblastí protilátky odvozené z lidské protilátky. V souhlase s tím, jejich antigenicita v lidském těle je redukována tak, že jsou použitelné jako aktivní složky léčebných činidel, připravených podle předkládaného vynálezu.

• * fl · ···

Výhodné provedení pozměněné protilátky, vhodné pro použití v rámci předkládaného vynálezu zahrnuje pozměněné protilátky anti-HM 1.24 (viz Japanese Patent Application No. 9-271536). Výhodné provedení L řetězce V oblasti pozměněné protilátky anti-HM 1.24 zahrnuje takové, které má aminokyselinovou sekvenci kódovánu nukleotidovou sekvencí, která je uvedena v SEQ ID NO: 2. Výhodné provedení H řetězce V oblasti pozměněné protilátky anti-HM 1.24 zahrnuje takové, které má aminokyselinovou sekvenci kódovánu sekvencí baží, která je uvedena v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ID NO: 4.

-4. Exprese a produkce

Protilátkové geny, zkonstruované tak, jak bylo výše popsáno, mohou být exprimovány a získány tak protilátky, to vše pomocí známých postupů. V případě savčích buněk může být exprese docílena za použití expresního vektoru, který obsahuje běžně užívaný užitečný promotor, protilátkový gen, který má být exprimován a DNA, v níž je operativně vázán signál poly-A ve směru 3' od tohoto genu (ve směru transkripce), nebo vektor, obsahující uvedenou DNA. Příkladem promotoru/zesilovače transkripce může být bezprostředně časný promotor/zesilovač cytomegaloviru.

Dále lze jako promotor/zesilovač pro expresi protilátky pro použití v předkládaném vynálezu, využít virové promotory/zesilovače jako jsou retrovirus, polyomavirus, adenovirus a opičí virus 40 (SV40), dále promotory/zesilovače odvozené ze savčích buněk, jako je např. lidský elongační faktor 1a (HEF1a).

Např. exprese může být snadno docílena pomocí metody Mulligan a kol., (Nátuře (1979) 277, 108), kdy je použit promotor/zesilovač z SV40, nebo metoda Mizushima a kol., (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322), kdy je použit promotor/zesilovač HEF1a.

V případě E. coli lze dosáhnout exprese operativním připojením běžně užívaného promotoru, signální sekvence pro sekreci protilátky a genu pro protilátku, jež má být exprimována, po čemž následuje vlastní exprese tohoto genu. Jako příklad promotoru lze zmínit lacz promotor a araB promotor. Metodu podle Ward a kol., (Nátuře (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) je možno uplatnit při použití promotoru lacz, zatímco metodu podle Better a kol., (Science (1988) 240, 1041-1043) je možno uplatnit při použití promotoru araB.

Jako signální sekvenci pro sekreci protilátky, když je produkována do periplazmatického prostoru E. coli, je možno použít signální sekvenci pelB (Lei, S. P. a • 0000 • 9

0 0 0 0 • 000 0 0 0 0· 0 0

0 0 0 ·

0 0 0 0 99 9 9 9 «0 9

9 9

000 000

0

00 kol., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Po oddělení protilátky, produkované do periplazmatického prostoru, je struktura protilátky před použitím vhodným způsobem upravena (viz např. WO 96/30394).

Jako počátek replikace je možno použít počátek replikace odvozený z SV40, polyomaviru, adenoviru, hovězího papillomaviru (BPV) a podobně. Navíc pro zmnožení počtu kopií genu v hostitelském buněčném systému, může expresní vektor obsahovat jakožto selektivní markér gen pro aminoglykozid transferázu (APH), gen pro thymidin kinázu, gen pro xanthin guaninfosforyl transferázu (Ecogpt) E. coli a podobně.

Pro produkci protilátek, používaných v předkládaném vynálezu, je možno použít jakýkoli produkční systém. Produkční systém pro přípravu protilátek zahrnuje in vitro a in vivo produkční systém. Jako in vitro produkční systém je možno zmínit produkční systém, který využívá eukaryotické buňky a produkční systém, který využívá prokaryotické buňky.

Pokud jsou používány eukaryotické buňky, jedná se o produkční systémy, které využívají živočišné buňky, rostlinné buňky či buňky hub. Známé živočišné buňky zahrnují (1) savčí buňky jako jsou buňky CHO, COS buňky, myelomové buňky, buňky z novorozených křečků (baby hamster celíš - BHK), HeLa buňky a Věro buňky, (2) buňky obojživelníků, jako je oocyty druhu Xenopus nebo (3) hmyzí buňky, jako jsou sf9, sf21 a Tn5. Mezi známé rostlinné buňky lze zahrnout např. ty, které jsou odvozené z rodu Nicotiana, přesněji buňky odvozené z Nicotiana tabacum. Jako známé buňky hub je možno uvést kvasinky, jako je rod Saccharomyces, přesněji Saccharomyces cereviceae, nebo vláknité houby, jako je rod Aspergillus, přesněji Aspergillus niger.

Pokud jsou používány prokaryotické buňky, jedná se o produkční systémy, které využívají bakteriální buňky. Jako známé bakteriální buňky je možno uvést Escherichia coli (E. coli) a Bacillus subtilis.

Tím, že je pomocí transformace gen požadované protilátky vnesen do těchto buněk a takto transformované buňky jsou kultivovány in vitro, je možno dosáhnout produkce protilátek. Kultivování je prováděno známými metodami. Např. jako kultivační média mohou být použity DMEM, MEM, RPM11640 a IMDM, jako sérový doplněk média je možno použít fetální telecí sérum (FCS). Dále mohou být protilátky produkovány in vivo tak, že buňky, do kterých byl vnesen gen pro protilátku, jsou implantovány do břišní dutiny živočicha.

• · • ·

Jako další in vivo produkční systémy je možno uvést ty, které využívají živočichy a ty, které využívají rostliny. Pokud jsou využíváni živočichové, jedná se o produkční systémy, které využívají savce a hmyz.

Ze savců mohou být využity kozy, vepři, ovce, myši a hovězí dobytek (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). Pokud se týká hmyzu, je možno využít bource morušového.

Pokud se týká rostlin, lze např. využít tabák.

Geny pro protilátku jsou vneseny do těchto živočichů nebo rostlin, protilátky jsou v těchto živočiších nebo rostlinách produkovány a z nich získávány. Např. gen pro protilátku je vnesen doprostřed genu, kódujícího protein, který je přirozeně produkován v mléku, jako např. kozí β kasein, tímto způsobem je vytvořen fúzní gen. Fragmenty DNA, které obsahují fúzní gen, do něhož byl vložen gen pro protilátku, jsou injikovány do kozích embryí a tato embrya jsou vložena do kozy. Požadovaná protilátka je získána z mléka, produkovaného transgenní kozou, která se narodila koze, jež obdržela toto embryo, nebo z mléka jeho potomka. Aby se zvýšilo množství mléka obsahujícího požadovanou protilátku a produkované transgenní kozou, pokud je to vhodné, lze transgenní koze podávat hormony. (Ebert, K. M. a kol., Bio/Technology (1994) 12, 699702).

Pokud je použit bourec morušový, pak bakulovirem, do něhož byl vložen gen pro požadovanou protilátku, je infikován bourec morušový a požadovanou protilátku je možno získat z tělní tekutiny bource morušového (Susumu, M. a kol., Nátuře (1985) 315, 592-594). Dále, pokud je použit tabák, gen pro požadovanou protilátku je vložen do expresního vektoru pro rostliny, např. do pMON 530 a poté je vektor vnesen do bakterie jako je Agrobacterium tumefaciens. Touto bakterií je dále infikován tabák, jako je Nicotiana tabacum, aby bylo možno získat požadovanou protilátku z tabákových listů (Julian, K. - C. Ma a kol., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Když je protilátka produkována in vitro či in vivo produkčními systémy, jak je popsáno výše, DNA kódující těžký řetězec (H řetězec) nebo lehký řetězec (L řetězec) protilátky může být vložena do expresních vektorů odděleně ale hostitelské buňky jsou jimi transformovány současně, nebo DNA kódující H řetězec a L řetězec mohou být spojeny v jednom expresním vektoru a hostitelské buňky jsou jím transformovány (viz International Patent Application WO 94/11523).

• ···· · tata ·· tata ♦ · · ·· » ta ♦ · · « • ta·· ··· · ·· · > ·· ·· ta· ······ • · ··· ·· ··· ··· ··· »· ·· «·

Protilátka, produkovaná výše popsaným způsobem, může být vázána k různým molekulám jako je polyetylenglykol (PEG) a použita jakožto modifikovaná protilátka. Výraz „protilátka“, jak je užíván zde, zahrnuje i tyto modifikované protilátky. Aby byla získána taková modifikovaná protilátka, získaná protilátka může být modifikována chemicky. Takové metody již byly v oboru zavedeny.

2. Oddělení a čištění protilátky.

2-1. Oddělení a čištění protilátky

Protilátky, které jsou produkovány a exprimovány výše uvedeným způsobem, mohou být odděleny zevnitř buňky, od buňky nebo z hostitele a poté vyčištěny do homogenního stavu. Oddělení a čištění protilátky pro použití v rámci tohoto vynálezu lze provést afinitní chromatografii. Jako sloupce, vhodné pro takovou afinitní chromatografii, je možno uvést sloupec s Proteinem A a sloupec s Proteinem G. Příklady nosičů, použité pro sloupec s Proteinem A, jsou Hyper A, POROS, Sepharosa

F. F. a podobně.

Popřípadě zde lze použít bez jakéhokoli omezení i ostatní metody pro oddělení a čištění, běžně užívané pro proteiny. Oddělení a čištění protilátky pro použití v rámci tohoto vynálezu lze provádět různým kombinováním i jiných vhodných chromatografických postupů, než je výše uvedená afinitní chromatografie, dále filtrace, ultrafiltrace, vysolování, dialýza a podobně. Chromatografie zahrnuje např. iontoménnou chromatografii, hydrofobní chromatografii, filtrace na gelu a podobně. Tyto chromatografické postupy mohou být provedeny na HPLC. Jinou možností je chromatografie na reverzní fázi.

2-2. Určení koncentrace protilátek

Koncentrace protilátek, získaných ve výše uvedeném bodě 2-1 může být určena měřením absorbance, nebo ELISA testem (enzyme-linked imunosorbent assay) a podobně. Když je tedy použito měření absorbance, je protilátka, pro použití v tomto vynálezu, nebo vzorek, protilátku obsahující, vhodně naředěn pomocí PBS(-), poté je při 280 nm měřena absorbance a následuje výpočet pomocí absorbčního koeficientu, který uvádí 1,35 OD při koncentraci 1 mg/ml. Když je pro měření koncentrace protilátek použita metoda ELISA, postup probíhá následovně. Sto μΙ kozího protilidského IgG (vyrobeno BIO SOURCE) zředěného na koncentraci 1 pg/ml v 0,1 M pufru kyselého uhličitanu sodného, pH 9,6, je nakapáno na 96-jamkovou destičku (vyrobeno NUNC) a je inkubováno přes noc při teplotě 4 °C, aby došlo k navázání protilátek.

) · ··« 9 · · 9 9 9 9 • * · 9999999999 > · 9 9 9 9 9 ··· ··· 9#· 9 9 99 99

I

Po blokování je přidáno 100 μΙ vhodně ředěné protilátky, připravené podle tohoto vynálezu, nebo vzorku, obsahujícího protilátky, nebo 100 μΙ lidského IgG o známé koncentraci (jako standard) a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti. Po promytí je přidáno 100 μΙ 5000-krát zředěné protilidské IgG protilátky, značené alkalickou fosfatázou (vyrobeno BIO SOURCE) a inkubováno 1 hodinu při teplotě místnosti. Po promytí je přidán roztok substrátu, inkubováno a následovalo měření absorbance při 405 nm na přístroji MICROPLATE READER Model 3550 (vyrobeno BioRad), na jehož základě byla spočtena koncentrace požadované protilátky.

3. FCM analýza

Reaktivita protilátky, vhodné pro použití v předkládaném vynálezu pro reakci s lymfatickými nádorovými buňkami, může být zjišťována metodou průtokové cytometrické analýzy (FCM - flow cytometry analysis). Je možno použít buď buňky z již ustavených buněčných linií, tak buňky čerstvě izolované. Z ustavených buněčných linií je možno použít jakožto T buněčnou linii např. RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), CCRFCEM (ATCC CCL-119) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, HPB-ALL (FCCH1018) odvozené z akutní lymfatické leukémie, HPB-MLT (FCCH1019) odvozené zT lymfomů, JM (FCCH1023) odvozené z akutní lymfatické leukémie, MOLT-4 (ATCC CRL-1582) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, Jurkat (FCCH1024) odvozené z akutní lymfatické leukémie, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, MT-1 (FCCH1043) odvozené z leukémie zralých T buněk, KT3 odvozené zLennertova lymfomů (Shimizu, S. a kol., Blood (1988) 71, 196-203) apod., jakožto B buněčnou linii např. buňky CESS, transformované EB virem (ATCC TIB-190), na EB virus pozitivní B buňky SKW 6.4 (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) odvozené zB lymfomů, CCRF-SB (ATCC CCL-120) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, B buňky RPMI 6410 (FCCH6047) odvozené z pacienta s akutní myelocytickou leukémií, Daudi (ATCC CCL-213) odvozené zBurkittova lymfomů, Jijoye (ATCC CCL-87) odvozené z Burkittova lymfomů, Ráji (ATCC CCL-86) odvozené z Burkittova lymfomů, a jakožto non-T, non-B buněčnou linii HL-60 (ATCC CCL-240) odvozené z akutní myelocytické leukémie, THP-1 (ATCC TIB-202) odvozené z akutní monocytické leukémie, U-937 (ATCC CRL-1593) odvozené z vazivového lymfomů, K-562 (ATCC CCL-243) odvozené z chronické myelocytické leukémie, a podobné.

« ··· «

··♦ * · > ·« ·· · ·

9 9 • · · 9

9 9 • 9 9 99 • · · • 9 9

999

99

999

Po promytí výše uvedených buněk vPBS(-) je knim přidáno 100 μΙ protilátek nebo kontrolních protilátek, zředěných na 25 gg/ml v pufru FACS (PBS(-) obsahující 2 % fetálního hovězího séra a 0,1 % azidu sodného) a inkubováno na ledu 30 minut. Po promytí pufrem FACS je přidáno 100 μΙ 25 pg/ml kozí protimyší protilátky značené FITC (GAM, vyrobeno Becton Dickinson) a inkubováno na ledu 30 minut. Po promytí pufrem FACS jsou buňky suspendovány v 600 μΙ nebo 1 ml pufru FACS a u každé buňky může být změřena intenzita fluorescence pomocí skenovacího přístroje (FACScan, vyrobeno Becton Dickinson).

Z naměřené hodnoty intenzity fluorescence u každé buňky, lze zjistit reaktivitu protilátky, používané v předkládaném vynálezu, s každou jednotlivou buňkou. Tedy z naměřené hodnoty intenzity fluorescence u každé buňky, lze zjistit zda antigen HM1.24 je exprimován na jednotlivých buňkách (buňka je pozitivní či negativní) a též stupeň této exprese. Přítomnost a intenzita exprese antigenů HM1.24 v buňkách lymfatického nádoru je popsána v příkladu 2.2. FCM analýza, uvedeném dále.

Nádorové buňky lymfatických nádorů, které mohou být léčebným cílem předkládaného vynálezu, exprimují antigen HM1.24. Přesněji řečeno, nádorové buňky lymfatických nádorů jsou přednostně ty, v nichž procento pozitivity na antigen HM1.24 není nižší než 5 %. Přesněji řečeno, nádorové buňky lymfatických nádorů jsou přednostně ty, v nichž procento pozitivity na antigen HM1.24 je 20 % nebo vyšší. Přesněji řečeno, nádorové buňky lymfatických nádorů jsou přednostně ty, v nichž procento pozitivity na antigen HM1.24 je 50 % nebo vyšší. Přesněji řečeno, nádorové buňky lymfatických nádorů jsou přednostně ty, v nichž procento pozitivity na antigen HM1.24 je 80 % nebo vyšší.

4. Cytotoxická aktivita

4-1. Měření CDC aktivity

Protilátka vhodná pro použití v předkládaném vynálezu je např. taková, která má CDC aktivitu jakožto cytotoxickou aktivitu.

CDC aktivita léčebného činidla proti lymfatickým nádorům, připraveného podle předkládaného vynálezu, může být měřena následujícím způsobem. Zaprvé jsou ve vhodném médiu, např. v médiu RPM11640, obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO-BRL), připraveny cílové buňky v koncentraci 4 χ 10⁵ buněk/ml. Jako cílové buňky lze použít CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL120.1), HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), M116 (ATCC CRL-1649) CCRF-

SB (ATCC CCL-120), K-562 (ATCC CCL-243) a podobně. Padesát μΙ těchto buněk je přidáno do 96-jamkové destičky (s rovným dnem) (vyrobeno FALCON) a destička je inkubována přes noc v CO₂ inkubátoru při 37 °C.

Poté je přidána protilátka, jejíž CDC aktivita je měřena, inkubace pokračuje 60 minut a poté je přidán vhodně ředěný komplement, např. Baby Rabitt Complement (vyrobeno CEDARLANE) a inkubován 2 hodiny. Do každé jamky je přidáno 10 μΙ Alamar Bule (vyrobeno BIO SOURCE), inkubováno 4 hodiny a poté je měřena intenzita fluorescence (excitační vlnová délka 530 nm, emisní vlnová délka 590 nm) za použití měřícího systému CytoFluor 2350 (vyrobeno MILLIPORE). Cytotoxickou aktivitu (%) je možno spočítat jako (A-C) / (B-C) x 100, kde A je intenzita fluorescence při inkubaci v přítomnosti protilátky, B je intenzita fluorescence při inkubaci samotného média bez protilátek a C je intenzita fluorescence v jamce bez buněk.

4-2. Měření ADCC aktivity

Protilátka vhodná pro použití v předkládaném vynálezu je např. taková, která má ADCC aktivitu jakožto cytotoxickou aktivitu.

ADCC aktivita léčebného činidla proti lymfatickým nádorům, připraveného podle předkládaného vynálezu, může být měřena následujícím způsobem. Zaprvé jsou centrifugační metodou z lidské periferní krve nebo kostního morku izolovány mononukleární buňky, které budou v testu použity jakožto efektorové buňky. Jako cílové buňky jsou CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), HPB-MLT (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), M116 (ATCC CRL-1649) CCRF-SB (ATCC CCL-120), K-562 (ATCC CCL-243) nebo podobné označeny ⁵¹Cr. Poté je ke značeným cílovým buňkám přidána protilátka, u které je měřena ADCC aktivita a inkubováno. K cílovým buňkám jsou pak ve vhodném poměru přidány buňky efektorové a pokračováno v inkubaci.

Po inkubaci je sebrán supernatant a měřena jeho aktivita pomocí měřiče γ záření, přičemž 1% NP-40 je možno použít pro změření maximální volné radioaktivity. Cytotoxickou aktivitu (%) je možno spočítat jako (A-C) / (B-C) x 100, kde A je radioaktivita (cpm) uvolněná v přítomnosti protilátky, B je radioaktivita (cpm) uvolněná pomocí NP-40 a C je radioaktivita (cpm) uvolněná samotným médiem bez protilátek.

4-3. Zesílení cytotoxické aktivity

Aby se projevila cytotoxická aktivita, jako je ADCC aktivita a CDC aktivita, je výhodné použít jakožto konstantní oblast (C oblast) protilátek u lidí Cy, zvláště Cy1 a e · • ·

¹⁸

Cy3. Dále je možno indukovat silnější ADCC aktivitu nebo CDC aktivitu přidáním, záměnou nebo modifikací části aminokyselin v C oblasti protilátky.

Jako příklad je možno zmínit konstrukci polymeru z IgG, napodobujícího IgM (IgM-like) pomocí substituce aminokyselin (Smith, R. I. F. & Morrison, S. L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), konstrukci polymeru z IgG, napodobujícího IgM (IgM-like) pomocí přidání aminokyselin (Smith, R. I. F. a kol., J. Immunology (1995) 154, 2226-2236), exprese tandemově vázaného genu, kódujícího L řetězec (Shuford, W. a kol., Science (1991) 252, 724-727), dimerizaci IgG pomocí substituce aminokyselin (Caron P. C. a kol., J. Exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., J. Immunology (1992) 148, 2918-2922), dimerizaci IgG pomocí chemické modifikace (Wolff, E. A. a kol., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565) a zavedení efektorové funkce pomocí změny aminokyseliny (aminokyselin) v kloubové oblasti protilátky (Norderhaug,

L. a kol., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384) a podobně. Tyto přístupy mohou být uskutečněny buď využitím místně-specifické mutageneze pomocí primeru, přidáním sekvence bází pomocí restrikčního štěpného místa, použitím chemického modifikujícího činidla, které vytváří kovalentní vazbu.

5. Potvrzení léčebných účinků

Účinky léčebného činidla, používaného v zde předloženém vynálezu pro lymfatické nádory, mohou být potvrzeny tím, že je zvířatům, kterým byly transplantovány lymfatické nádorové buňky podána protilátka, používaná v předloženém vynálezu, a je hodnocen její protinádorový účinek na tato zvířata.

Jako lymfatické nádorové buňky podávané zvířatům mohou být použity buď buňky z již ustavených buněčných linií, tak i buňky čerstvě izolované. Z ustavených buněčných linií je možno použít buňky CCRF-CEM (ATCC CCL-119), HPB-MLT (FCCH1019), MOLT-4 (ATCC CRL-1582), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) a podobné, jakožto T buněčné linie, a CESS (ATCC TIB-190), SKW 6.4 (ATCC TIB-215), CCRF-SB (ATCC CCL-120), RPMI 6410 (FCCH6047), EB-3 (ATCC CCL-85) a podobné, jakožto B buněčné linie.

U zvířat, která jsou transplantována, jsou imunologické funkce převážně redukovány, nebo zcela chybějí. Například lze použít nahé myši, myši SCID, béžové myší, nahé krysy a podobně. Protinádorové účinky, které mají být hodnoceny, mohou být potvrzeny měřením objemu a váhy nádoru nebo dobou přežívání zvířete či podobně.

Jak je uvedeno dále v příkladech, podání protilátky anti-HM1.24 má za následek potlačení zvětšování objemu nádoru a navíc prodloužení doby přežívání u myší s transplantovaným nádorem. Tyto skutečnosti ukazují, že protilátka anti-HM1.24 má protinádorový účinek na lymfatické nádory.

6. Způsob podání a farmaceutická příprava

Léčebná činidla pro lymfatické nádory, připravená podle předkládaného vynálezu, mohou být podávána buď systémově nebo místně, parenterální cestou, např. intravenózní injekcí jako je kapková infuze, intramuskulární injekcí, intraperitoneální injekcí a subkutánní injekcí. Způsob podání může být zvolen v závislosti na věku a stavu pacienta. Účinné dávkování je vybráno z oblasti 0,01 mg až 100 mg na kg tělesné váhy na jednu dávku. Popřípadě lze zvolit dávkování v oblasti 1 až 1000 mg, výhodněji 5 až 50 mg na pacienta.

Léčebná činidla pro lymfatické nádory, připravená podle předkládaného vynálezu, mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné nosiče nebo aditiva v závislosti na způsobu podávání. Příklady takových nosičů nebo aditiv jsou voda, farmaceuticky přijatelná organická rozpouštědla, kolagen, polyvinylalkohol, polyvinylpyrolidon, karboxyvinylový polymer, sodná sůl karboxymethylcelulózy, sodná sůl polyakrylové kyseliny, alginát sodný, ve vodě rozpustný dextran, karboxymethylový škrob, pektin, karboxymethylcelulóza, ethylcelulóza, xanthanová klovatina, arabská klovatina, kasein, agar, diglycerin, propylenglykol, polyethylenglykol, vazelína, parafin, stearylalkohol, kyselina stearová, lidský sérumalbumin (HSA), manitol, sorbitol, laktóza a farmaceuticky přijatelné povrchově aktivní látky a podobně. Použitá aditiva jsou vybrána mimo jiné zvýše uvedených látek nebo jejich kombinace v závislosti na dávkovači formě.

Nemoci léčené podle předloženého vynálezu, jsou lymfatické nádory (kromě myelomů), které mají na nádorových buňkách antigeny, ke kterým se váží protilátky, používané v předkládaném vynálezu. Specificky lze uvést akutní B lymfatickou leukémii (B-ALL), chronickou B lymfatickou leukémii (B-CLL), pre-B lymfom, Burkittův lymfom, folikulární lymfom, lymfom folikulárního obalu, difúzní lymfom, akutní T lymfatickou leukémii (T-ALL), chronickou T lymfatickou leukémii (T-CLL), leukémii zralých T buněk (ATL), non-ATL periferní T lymfom (PNTL) a podobně. Léčebná činidla, připravená podle předkládaného vynálezu, jsou užitečná jako léčebná činidla pro tyto lymfatické nádory.

• · • · > · · 9 » 9 9 9

9· 9 9 9 9

Popis obrázků

Obr. 1 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1 .24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 2 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována FCM nepřímou metodou za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 3 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 4 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 5 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 6 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího IgG2a.

Obr. 7 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 8 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 9 ukazuje histogram uvedené B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 10 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 11 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 12 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 13 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 14 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 15 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 16 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HMI .24 a kontrolního myšího lgG2a.

• · · · i

Obr. 17 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 18 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 19 ukazuje histogram uvedené T buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 20 ukazuje histogram uvedené non-T, non-B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 21 ukazuje histogram uvedené non-T, non-B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 22 ukazuje histogram uvedené non-T, non-B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 23 ukazuje histogram uvedené non-T, non-B buněčné linie, která byla analyzována nepřímou metodou FCM za použití protilátky anti-HM1.24 a kontrolního myšího lgG2a.

Obr. 24 je graf, ukazující, že protilátka anti-HM1.24 působí cytotoxicky na T buněčné nádorové linie CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 a HPB-MLT, přičemž účinek závisící na podané dávce.

Obr. 25 je graf, ukazující, že protilátka anti-HM1.24 působí cytotoxicky na B buněčné nádorové linie EB-3, MC116 a CCRF-SB, přičemž účinek závisící na podané dávce.

Obr. 26 je graf, ukazující, že zvětšování objemu nádoru u myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem je potlačeno ve skupině, které byly podávány protilátky ve srovnání se skupinou, které byl podáván kontrolní myší lgG2a.

Obr. 27 je graf, ukazující, že doba přežívání u myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem se prodloužila ve skupině, které byly podávány protilátky antiHM1.24 ve srovnání se skupinou, které byl podáván kontrolní myší lgG2a.

I

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález bude dále vysvětlen podrobněji na následujících příkladech. Zdůrazňujeme, že předkládaný vynález není žádným způsobem na tyto příklady omezen.

Příklad 1. Konstrukce protilátky anti-HM1.24.

1. Příprava myších ascitů, obsahujících protilátku anti-HM1.24

Hybridomy, produkující protilátku anti-HM 1.24, byly získány podle metody Goto, T. a kol., (Blood (1994) 84, 1922-1930).

Myším BALB/c (vypěstovány CLEA Japan), které 11 a 3 dny předem obdržely intraperitoneálně vždy 500 μΙ 2,6,10,14-tetramethylpentadekanu (vyrobeno Waco Pure Chemical Industries, Ltd.), bylo intraperitoneálně injikováno 5 x 10⁶ hybridomových buněk. Od 10. dne po injekci hybridomových buněk byly ascity, které se hromadily v břišní dutině myší, odebírány pomocí jehly Happycas č. 19 (vyrobeno Medikit), zavedené po delší dobu. Odebrané ascity byly dvakrát centrifugovány pří rychlosti 1000 a 3000 otáček za minutu na nízkoobrátkové centrifuze RLX-131 (vyrobeno Tomy Seiko), aby byly odstraněny hybridomy a kontaminanty, jako jsou krevní buňky a podobně.

2. Čištění protilátek anti-HM 1.24 z myších ascitů

Čištění protilátky anti-HM 1.24 z výše uvedených myších ascitů bylo provedeno následujícím způsobem. Po přidání stejného množství PBS(-) k myším ascitům, byla směs filtrována na filtru Mediaprep z dutých vláken (vyrobeno MILLIPORE) a poté afinitně čištěno pomocí zařízení ConSep LC1000 na vysokorychlostní čištění protilátek (vyrobeno MILLIPORE) a sloupce Hyper D Protein A (objem sloupce 20 ml, vyrobeno Nihon Gaisi) za použití PBS(-) jako absorbčního pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 4) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. Eluované frakce byly okamžitě upraveny na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCI pufru (pH 8,0), poté koncentrovány a současně byl zaměněn pufr za PBS(-) pomocí centrifugačního ultrafiltračního koncentrátoru Centriprep 10, dále sterilizovány filtrací na membránovém filtru MILLEXGV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 gm a tím získána čištěná protilátka anti-HM 1.24.

• ·

*	• ·· ·
• ·	•
•	• ··
•	•
•	•

3. Určení koncentrace protilátky

Koncentrace čištěné protilátky byla určena pomocí měření absorbance. Čištěná protilátka byla tedy zředěna v PBS(-), změřena absorbance při 280 nm a koncentrace vypočtena za předpokladu, že 1,35 OD odpovídá 1 mg/ml.

Příklad 2. Studium reaktivity protilátky anti-HM 1.24 s buňkami lymfatických nádorů

1. Čištění kontrolního myšího lgG2a

Kontrolní myší lgG2a byl čištěn následujícím způsobem. Komerčně dostupné lgG2a (KAPPA) (UPC 10) ascity (vyrobeno CAPPEL) byly rozpuštěny v čištěné vodě a PBS(-). Roztok byl filtrován na membránovém filtru Acrodisc (vyrobeno Gelman Sciences) s velikostí pórů 0,2 pm a ) a poté afinitně čištěno pomocí zařízení ConSep LC1000 na vysokorychlostní čištění protilátek (vyrobeno MILLIPORE) a sloupce Hyper D Protein A (objem sloupce 20 ml, vyrobeno Nihon Gaisi) za použití PBS(-) jako absorbčního pufru a 0,1 M pufru citrátu sodného (pH 4) jako elučního pufru podle přiloženého návodu. Eluované frakce byly okamžitě upraveny na pH 7,4 přidáním 1 M Tris-HCI pufru (pH 8,0), poté koncentrovány a současně byl zaměněn pufr za PBS(-) pomocí centrifugačního ultrafiltračního koncentrátoru Centriprep 10, dále sterilizovány filtrací na membránovém filtru MILLEX-GV (vyrobeno MILLIPORE) s velikostí pórů 0,22 pm a tím získán čištěný kontrolní myší lgG2a.

Určení koncentrace kontrolního myšího lgG2a byla provedena podle výše uvedeného bodu 3. Určení koncentrace protilátky.

2. FCM analýza

Reaktivita anti-HM 1.24 protilátky s buňkami lymfatického nádoru byla zkoumána průtokovou cytometrickou analýzou (FCM). Po promytí buněk T buněčné linie RPMI 8402 (ATCC CRL-1195), CCRF-CEM (ATCC CCL-119) odvozených z akutní lymfoblastické leukémie, HPB-ALL (FCCH1018) HPB-MLT (FCCH1019) odvozených zT lymfomu, JM (FCCH1023) odvozených z akutní lymfatické leukémie, MOLT-4 (ATCC CRL-1582) odvozených z akutní lymfoblastické leukémie, Jurkat (FCCH1024) odvozených z akutní lymfatické leukémie, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) odvozených z akutní lymfoblastické leukémie, MT-1 (FCCHG1043) odvozených z leukémie zralých T buněk a KT-3 odvozených z Lennertova lymfomu (Shimizu, S. a kol., Blood (1988) 71,196-203), jakožto B buněčné linie je možno použít EB virem transformovanou linii CESS (ATCC TIB-190), na EB virus pozitivní B buňky SKW 6.4 (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) odvozené z B lymfomu, CCRF-SB (ATCC • fl · • flfl ·· ·

CCL-120) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, B buňky RPMI 6410 (FCCH6047) odvozené z pacienta s akutní myelocytickou leukémií, Daudi (ATCC CCL213) odvozené zBurkittova lymfomu, Jijoye (ATCC CCL-87) odvozené zBurkittova lymfomu, Ráji (ATCC CCL-86) odvozené z Burkittova lymfomu, a jakožto non-T, non-B buněčnou linii HL-60 (ATCC CCL-240) odvozené z akutní myelocytické leukémie, THP1 (ATCC TIB-202) odvozené z akutní monocytické leukémie, U-937 (ATCC CRL-1593) odvozené z vazivového lymfomu a K-562 (ATCC CCL-243) odvozené z chronické myelocytické leukémie vPBS(-), je knim přidáno 100 μΙ protilátek nebo čištěného, zředěných na 25 gg/ml v pufru FACS (PBS(-) obsahující 2 % fetálního hovězího séra a 0,1 % azidu sodného) a inkubováno na ledu 30 minut.

Po promytí pufrem FACS je přidáno 100 μΙ 25 μg/ml kozí protimyší protilátky značené FITC (GAM) a inkubováno na ledu 30 minut. Po promytí pufrem FACS byly buňky suspendovány v 600 μΙ nebo 1 mi pufru FACS a u každé buněčné suspenze byla měřena intenzita fluorescence pomocí přístroje FACScan (vyrobeno Becton Dickinson). Výsledky uvedené na obrázcích 1 až 23 potvrzují, že všechny T buněčné linie a všechny B buněčné linie (vyjma Daudi a Ráji, které nereagují), reagovaly s anti-HM

1.24 protilátkou a silně exprimovaly antigen HM 1.24. Na druhé straně žádná non-T, non-B buněčná linie nereagovala s anti-HM 1.24 protilátkou a exprese antigenu HM

1.24 nebyla zjištěna v žádné z nich.

V histogramech uvedených na obrázcích 1 až 23 byly histogramové podmínky nastaveny tak, že negativní buňky tvoří 98 % a pozitivní buňky 2 % při barvení pomocí kontrolního myšího lgG2a. Podle těchto podmínek histogramů bylo spočítáno procento buněk pozitivních na antigen HM 1.24 v případě, že byla použita anti-HM 1.24 protilátka a výsledek je uveden v Tabulce 1. Podle procenta buněk pozitivních na antigen HM 1.24, byla síla exprese rozlišena do pěti stavů: -, +/-, +, ++ a +++. Bylo potvrzeno, že všechny T buněčné linie a B buněčné linie (vyjma Daudi a Ráji) silně exprimovaly antigen HM 1.24, podobně jak je uvedeno ve výsledcích na obrázcích 1 až 23. Též ve všech případech non-T, non-B buněčných linií bylo procento buněk pozitivních na antigen HM 1.24 nulové nebo menší než 5 %, což ukazuje, že exprese antigenu neprobíhá nebo je velmi malá.

·· ·0 * 0 0 · 0 ··· 000

Tabulka 1

Název buněk Úroveň exprese

B buněčně linie	CESS	+++	94,5
	SKW 6.4	+++	92,8
	MC116	++	65,0
	CCRF-SB	+++	98,4
	RPMI 6410	+++	94,5
	EB-3	+++	88,3
	Jijoye	+++	92,3
	Daudi	-	2,8
	Ráji	-	2,0
T buněčné linie	RPMI 8402	+++	94,0
	CCRF-CEM	+++	97,8
	HPB-ALL	++	63,8
	HPB-MLT	+++	94,6
	JM	+++	99,6
	MOLT-4	+++	84,1
	Jurkat	++	70,9
	CCRF-HSB-2	+++	100,0
	MT-1	+++	95,9
	KT-3	+++	96,0
non-T, non-B	HL-60	-	2,9
buněčné linie	THP-1	-	1,5
	U-297	-	1,1
	K-562		3. 9 - .
<5%; +/-,5-20%;	+, 20-50%; ++,	50-80%;	+++, >80%

Příklad 3. Určování CDC aktivity

CDC aktivita anti-HM 1.24 protilátky proti buňkám lymfatického nádoru byla určována následujícím způsobem.

♦ ΦΦΦ • φ φ* φφ > φ φ φ ► φ φ φ φφφ φφφ φφ

1. Příprava cílových buněk

Jako cílové buňky byly připraveny CCRF-CEM (ATCC CCL-119) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, HPB-MLT (FCCH1019) odvozené zT lymfomu, EB-3 (ATCC CCL-85) odvozené zBurkittova lymfomu, MC116 (ATCC CRL-1649) odvozené zB lymfomu, CCRF-SB (ATCC CCL-120) odvozené z akutní lymfoblastické leukémie a K562 (ATCC CCL-243) odvozené z akutní myelocytické leukémie v koncentraci 4 χ 10⁵buněk/ml v médiu RPMI1640, obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO-BRL). Padesát μΙ suspenze každých těchto buněk bylo přidáno do 96-jamkové destičky (s rovným dnem) (vyrobeno FALCON) a inkubováno v 5% CO₂ v inkubátoru s vysokou vlhkostí vzduchu (vyrobeno TABAI) přes noc při 37 °C.

2. Příprava anti-HM 1.24 protilátky

Čištěná anti-HM 1.24 protilátka získaná ve výše uvedeném příkladu 1 byla připravena v koncentraci 0, 0,2, 2 a 20 gg/ml v médiu RPMI1640, obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO-BRL) a 50 μΙ těchto protilátek bylo přidáno do 96-jamkové destičky (s rovným dnem), připravené ve výše uvedeném odstavci 1. Po inkubaci destičky v 5% CO₂ v inkubátoru s vysokou vlhkostí vzduchu (vyrobeno TABAI) při 37 °C po dobu 60 minut, byla centrifugována v nízkoobrátkové centrifuze 05PR-22 (vyrobeno Hitachi) při 1000 otáček za minutu po dobu 5 minut a poté bylo 50 μΙ supernatantu odstraněno.

3. Příprava komplementu

Baby Rabbit Complement (vyrobeno CEDARLANE) byl rozpuštěn v čištěné vodě po 1 ml na lahvičku, která byla dále naředěna v 5 ml média RPMI1640 (vyrobeno GIBCO-BRL), které neobsahovalo fetální telecí sérum (FCS). Padesát μΙ tohoto roztoku bylo rozpínáno do 96-jamkové destičky (s rovným dnem), připravené ve výše uvedeném odstavci 2 a inkubováno v 5% CO₂ v inkubátoru s vysokou vlhkostí vzduchu (vyrobeno TABAI) při 37 °C po dobu 2 hodin.

4. Určení CDC aktivity

Po skončení inkubace bylo ke každé jamce 96-jamkové destičky (s rovným dnem) přidáno 10 μΙ Alamar Bule (vyrobeno BIO SOURCE), připravené ve výše uvedeném odstavci 3 a bylo inkubováno v 5% CO₂ v inkubátoru s vysokou vlhkostí vzduchu (vyrobeno TABAI) při 37 °C po dobu 4 hodin. U každé jamky byla pak měřena intenzita fluorescence (excitační vlnová délka 530 nm, emisní vlnová délka 590 nm) za • ·*·· použití měřícího systému CytoFluor 2350 (vyrobeno MILLIPORE). Cytotoxickou aktivitu (%) je možno spočítat jako (A-C) / (B-C) x 100, kde A je intenzita fluorescence při inkubaci v přítomnosti protilátky, B je intenzita fluorescence při inkubaci samotného média bez protilátek a C je intenzita fluorescence v jamce bez buněk.

Výsledky ukázaly, jak je uvedeno v obrázcích 24 a 25, že buňky K562, které nereagují při FCM analýze s anti-HM 1.24 protilátkou, nevykazují žádnou cytotoxickou aktivitu ani po přidání anti-HM 1.24 protilátky, zatímco CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MC116 a CCRF-SB, které reagují s anti-HM 1.24 protilátkou, vykazují cytotoxickou aktivitu, jejíž rozsah je závislý na koncentraci anti-HM 1.24 protilátky. To jasně prokazuje, že anti-HM 1.24 protilátka projevuje CDC aktivitu proti lymfatickým nádorům, které mají na povrchu svých buněk antigenní protein, ke kterému se anti-HM

1.24 protilátka specificky váže.

Příklad 4. Protinádorové účinky anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem

1. Příprava protilátky pro podání

1-1. Příprava anti-HM 1.24 protilátky

Čištěná anti-HM 1.24 protilátka, získaná ve výše uvedeném příkladu 1, byla

1- 2. Příprava kontrolního myšího lgG2a

Čištěná protilátka, získaná ve výše uvedeném příkladu 2, byla připravena v koncentraci 1 mg/ml v PBS(-) sterilizovaném filtrací a byla použita v následujících pokusech.

2. Protinádorové účinky anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem

2- 1. Příprava myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem

Myši s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem byly připraveny následujícím způsobem. Buňky CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1), odvozené z akutní lymfoblastické leukémie, které byly pěstovány in vivo na myších SCID (CLEA Japan) byly naředěny na koncentraci 1 x 10⁸ buněk/ml v médiu RPMI1640, obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO-BRL). Takto připravené buněčné suspenze byly Subkutánné podány do břicha myší SCID (samci, 6 týdnů staří), z nichž každému bylo předchozí den intraperitoneálně podáno 100 μΙ anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

φ · ·φ φ φ φ · ·· φ ·· · φ • ··· φ φ · • φ φ · φ φ φ « φφφ β « φ φ « « φφφ φ · φφ φφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ • Φ φφ

2-2. Podávání protilátek

Sedmý den po transplantaci nádoru byl kaliperem měřen průměr nádoru v místě, kde byly transplantovány buňky CCRF-HSB-2. Po spočtení objemu nádoru byla zvířata seskupena tak, že průměrný objem nádoru byl v každé skupině téměř stejný (8 zvířat ve skupině, 3 skupiny). Od téhož dne bylo každé skupině intraperitoneálně podáváno 100 μΙ anti-HM 1.24 protilátky v koncentracích 1 mg/ml nebo 200 pg/ml, nebo 1 mg/ml kontrolního myšího lgG2a, které byly připraveny, jak je uvedeno ve výše uvedeném odstavci 1. Protilátky byly podávány 2x v týdnu, celkově 19x, vždy podobným způsobem. Během této doby byl 2x týdně měřen kaliperem průměr nádoru a spočítán jeho objem.

2-3. Hodnocení protinádorového účinku anti-HM 1.24 protilátky u myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem

Protinádorový účinek anti-HM 1.24 protilátky byl hodnocen podle změn v objemu nádoru a délce doby přežívání u myší. Výsledkem bylo to, jak je ukázáno na obrázku 26, že zvyšování objemu nádoru bylo potlačeno ve skupině, které byla podávána antiHM 1.24 protilátka, ve srovnání se skupinou, které byl podáván kontrolní myší lgG2a. Také jak je ukázáno na obrázku 27, bylo pozorováno prodloužení doby přežívání ve skupině, které byla podávána anti-HM 1.24 protilátka, ve srovnání se skupinou, které byl podáván kontrolní myší lgG2a. Tyto skutečnosti ukazují, že anti-HM 1.24 protilátka má protinádorový účinek u myší s transplantovaným lidským lymfatickým nádorem.

Referenční příklad 1. Příprava hybridomů, které produkují myší anti-HM 1.24 monoklonální protilátku

Hybridomy produkující myší anti-HM 1.24 protilátku byly připraveny podle metody Goto, T. a kol., Blood (1994) 84, 1992-1930).

Buněčná linie plazmatických buněk KPC-32 (1 x 10⁷), odvozená z kostního morku pacienta s mnohočetným lidským myelomem (Goto, T. a kol., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400), byla každých šest týdnů dvakrát injekčně vpravena do břišní dutiny myší BALB/c (vyrobeno Charles River).

Tři dny před usmrcením zvířat jim bylo do sleziny injekčně podáno 1,5 x 10⁶buněk KPC-32, aby se dále zvětšila schopnost produkovat protilátky (Goto, T. a kol., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Po usmrcení zvířat jim byla odebrána slezina a s odebraným orgánem byla provedena buněčná fúze s myelomovými buňkami SP2/0 podle metody Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465).

• ···· ·· ta • ··· • ta · • · ta· · • · • · ·* ·» • «· · • · · · ··· ··· • · ♦· a·

Pomocí testu ELISA, využívajícího buňky KPC-32 (Posner, M. R. a kol., J. Immunol. Methods (1982) 48, 23), byl supernatant hybridomových kultur testován na přítomnost protilátek. 5 x 10⁴ buněk KPC-32 bylo suspendováno v 50 ml PBS a poté rozděleno do 96-jamkové destičky (dno tvaru „U“, Corning, vyrobeno Iwaki), která byla poté vysušena na vzduchu při teplotě 37 °C přes noc. Po blokování pomocí PBS, obsahujícího 1 % hovězího sérumalbuminu (BSA), byl přidán supernatant hybridomových kultur a inkubováno při 4 °C po dobu 2 hodin. Potom byla provedena reakce 1 hodinu při 4 °C s kozí protilátkou proti myšímu IgG (vyrobeno ZYMED), která byla značena peroxidázou. Po promytí byl přidán roztok o-fenylenendiaminu (vyrobeno Sumimoto Bakelite) a reakce probíhala při teplotě místnosti 30 minut.

Reakce byla zastavena přidáním 2 N kyseliny sírové a absorbance byla měřena při 492 nm na odečítacím zařízení pro destičky ELISA reader (vyrobeno Bio-Rad). Aby byl odstraněn hybridom, který vytváří protilátky proti lidskému imunoglobulinu, supernatant pozitivního hybridomu byl předem absorbován s lidským sérem a reaktivita s jinými buněčnými liniemi byla zjišťována ELISA testem. Byly vybrány pozitivní hybridomy a jejich reaktivita s různými buněčnými liniemi byla zjišťována průtokovou cytometrií. Poslední vybraný hybridomový klon byl dvakrát klonován a injekčne vpraven do břišní dutiny myší BALB/c léčených přistáném, a z nich byly získány ascity.

Monoklonální protilátky z myších ascitů byly čištěny srážením síranem amonným a soupravou Protein A affinitt chromatography kit (Ampure PA, vyrobeno Amersham). Čištěné protilátky byly značeny FITC pomocí soupravy Quick Tag FITC biding kit (vyrobeno Boehringer Mannheim).

Výsledkem bylo, že monoklonální protilátky, produkované 30 hybridomovými klony, reagovaly s buňkami KPC-32 a RPMI 8226.

Po klonování byla zkoumána reaktivita supernatantu těchto hybridomů s jinými buněčnými liniemi nebo mononukleárními buňkami periferní krve.

Tři z těchto klonů produkovaly monoklonální protilátky, jež specificky reagovaly s plazmatickými buňkami. Z těchto tří klonů byl vybrán klon, který byl nejužitečnější pro průtokovou cytometrickou analýzu a měl CDC aktivitu vůči RPMI 8226, a byl označen jako HM1.24. Podtřída monoklonální protilátky produkované tímto hybridomem, byla určena testem ELISA za použití králičích antimyších protilátek, specifických pro jednotlivé podtřídy (vyrobeno Zymed). Anti-HM 1.24 protilátka byla podtřídy lgG2a k. HYbridom HN1.24, který produkuje anti-HM 1.24 protilátky byl uložen pro mezinárodní • · použití podle ustanovení Budapešťské smlouvy jako FERM BP-5233 14. září 1995 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan.

Referenční příklad 2. Příprava pozměněné anti-HM 1.24 protilátky

Pozměněná anti-HM 1.24 protilátka byla získána následujícím způsobem.

Z hybridomu HM1.24, připraveného v referenčním příkladu 1, byla běžným postupem připravena celková RNA. Podle ní byla syntetizována cDNA, kódující

V oblast myší protilátky, amplifikována polymerázovou řetězovou reakcí (PCR) a metodou 5'- RACE. Byl získán fragment DNA, který obsahuje gen, kódující myší

V oblast, ten byl ligován do klonovacího vektoru pUC a poté vnesen do kompetentních buněk E. coli a získány tak transformanty E. coli. Výše uvedený plazmid byl z transformantů získán. Nukleotidová sekvence cDNA kódující oblasti v plazmidu byla zjištěna běžným postupem a pro každou V oblast byla určena oblast určující komplementaritu (CDR).

Aby bylo možno zkonstruovat vektor exprimující chimerní anti-HM 1.24 protilátku, cDNA kódující V oblast každého L řetězce a H řetězce myší anti-HM 1.24 protilátky byla vložena do vektoru HEF. Dále, aby byla zkonstruována pozměněná antiHM 1.24 protilátka, V oblast CDR myší anti-HM 1.24 protilátky byla připojena k lidské protilátce. L řetězec lidské protilátky REI byl použit jako L řetězec lidské protilátky, FR 1 až 3 lidské protilátky HG3 byly použity jako podpůrné oblasti (FRs) 1 až 3 H řetězce lidské protilátky a FR4 lidské protilátky JH6 byl použit pro FR4. Některé aminokyseliny v FR V oblasti H řetězce byly zaměněny tak, že CDR takto pozměněné protilátky může vytvářet vhodné místo pro vazbu antigenů.

Aby bylo možno exprimovat geny pro L řetězec a H řetězec a tak zkonstruovat pozměněnou anti-HM 1.24 protilátku v savčí buňce, každý gen byl zvlášť vnesen do vektoru HEF, čímž byly vytvořeny vektory exprimující buď L řetězec nebo H řetězec pozměněné anti-HM 1.24 protilátky.

Současným vnesením těchto dvou exprimujících vektorů do CHO buněk byla vytvořena buněčná linie, která produkuje pozměněnou anti-HM 1.24 protilátku. Vazebná aktivita k antigenů a vazebně inhibiční aktivita pozměněné anti-HM 1.24 protilátky, získané pěstováním této buněčné linie, pro lidskou amnionovou buněčnou linii WISH byla zjišťována testem ELISA za použití buněk. Výsledky ukázaly, že pozměněná anti-HM 1.24 protilátka má stejnou vazebnou aktivitu k antigenů jako • « · · • ·· chimerní protilátka a při použití biotinylované myší anti-HM 1.24 protilátky byla rovněž zjištěna stejná vazebně inhibiční aktivita, jako u chimerní protilátky nebo myší protilátky.

Mimochodem, E. coli nesoucí plazmid, který obsahuje DNA, kódující V oblast L řetězce chimerní protilátky a E, coli nesoucí plazmid, který obsahuje DNA, kódující V oblast H řetězce chimerní protilátky byly uloženy pro mezinárodní použití podle ustanovení Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1) 29. srpna 1996 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-5646 a FERM BP5644. Dále E. coli nesoucí plazmid, který obsahuje DNA, kódující verzi a (SEQ ID NO:

2) V oblasti L řetězce a E. coli nesoucí plazmid, který obsahuje DNA, kódující verzi r (SEQ ID NO: 3) V oblasti H řetězce pozměněné anti-HM 1.24 protilátky byly uloženy pro mezinárodní použití podle ustanovení Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gK) a Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gYl) 29. srpna 1996 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-5645 a FERM BP-5643. Dále E. coli nesoucí plazmid, který obsahuje DNA, kódující verzi s (SEQ ID NO: 4) V oblasti L řetězce pozměněné anti-HM

1.24 protilátky byla uložena pro mezinárodní použití podle ustanovení Budapešťské smlouvy jako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1) 29. září 1997 v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japan, jako FERM BP-6127.

Referenční příklad 3. Klonování cDNA kódující protein antigenu HM1.24 cDNA kódující protein antigenu HM1.24, který je specificky rozpoznáván anti-HM

1.24 protilátkou byl klonován.

1. Konstrukce cDNA knihovny

1) Příprava celkové RNA

Z buněčné linie KPMM2, pocházející z lidského mnohočetného myelomu, byla získána celková RNA pomocí metody Chirgwin a kol., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). Tedy 2 x 10⁸ buněk KPMM2 bylo kompletně homogenizováno v 20 ml 4 M guanidin izothiokyanátu (vyrobeno Nacalai Tesque Inc.). Homogenát byl navrstven na 5,3 M chlorid česný v centrifugační zkumavce, která byla poté centrifugována v rotoru • · · · • ·

Backman SW40 při 31 000 otáček/min při 20 °C po dobu 24 hodin, aby došlo k vysrážení RNA. Sraženina RNA byla promyta 70% etanolem a rozpuštěna v 300 μ110 mM Tris-HCl (pH 7,4), který obsahoval 1 mM EDTA a 0,5 % SDS. Byla přidána pronáza (vyrobeno Boehringer) do koncentrace 0,5 mg/ml a provedena inkubace 30 minut při 37 °C. Směs byla extrahována směsí fenolu s chloroformem a RNA byla sražena etanolem. Sraženina RNA byla pak rozpuštěna v 200 μ110 mM Tris-HCl (pH 7,4), který obsahujícího 1 mM EDTA.

2) Příprava poly(A)+RNA

Poly(A)+RNA byla čištěna za použití 500 pg materiálu celkové RNA, připravené jak bylo popsáno výše, pomocí soupravy Fast Track 2.0 mRNA Isolation kit (vyrobeno Invitrogen) podle návodu přiloženého k soupravě.

3) Konstrukce knihovny cDNA

Dvouřetězcová cDNA byla syntetizována a jako materiál bylo použito 10 pg výše uvedené poly(A)+RNA pomocí soupravy pro syntézu cDNA TimeSaver cDNA Synthesis Kit (vyrobeno Pharmacia) podle návodu přiloženého k soupravě, dále ligována k EcoRI adaptéru, obsaženému v soupravě za pomoci soupravy Directional Cloning Toolbox (vyrobeno Pharmacia) podle návodu přiloženého k soupravě. Kinázování a štěpení EcoRI adaptéru restrikčním enzymem Notl byly provedeny podle návodu přiloženého k soupravě. Dále byla dvouřetězcová cDNA s připojeným adaptérem, která má velikost 500 párů bází nebo více, oddělena a čištěna za použití 1,5% nízkotajícího agarózového gelu (vyrobeno Sigma) a bylo získáno 40 μΙ dvouřetězcové cDNA s připojeným adaptérem.

Takto konstruovaná dvouřetězcová cDNA s připojeným adaptérem byla ligována pomocí T4 ligázy (vyrobeno GIBCO-BRL) do vektoru pCOS1 (Japanese Patent Application 8-255196), který byl předtím opracován restrikčními enzymy EcoRI a Notl a alkalickou fosfatázou (vyrobeno Takara Shuzo) a tak byla konstruována cDNA knihovna. Konstruovaná cDNA knihovna byla vnesena do E. coli kmene DH5a (vyrobeno GIBCO-BRL) a následně byl ustanovena jako nezávislý klon, který má celkovou velikost 2,5 χ 10⁶.

2. Klonování přímou expresní metodou

1) Transfekce buněk COS-7

Přibližně 5 χ 10⁵ klonů výše uvedené transdukované E. coli bylo pěstováno v médiu 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring • · • · · · · · · · · · · ···»»····»·

44 44 44 444444 • · · · 4 · ·

444 444 444 ·4 44 44 ³³

Harbor Laboratory Press (1989)), obsahujícím 50 pg/ml ampicilinu, aby došlo kamplifikaci cDNA, pak byly zpracovány alkalickou metodou (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook a kol., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)), aby byla získána plazmidová DNA zE. coli. Takto získaná plazmidová DNA byla elektroporační metodou vpravena do buněk COS-7 pomocí zařízení Gene Pulser (vyrobeno Bio-Rad).

Deset pg čištěné plazmidové DNA bylo přidáno do 0,8 ml roztoku buněk COS-7, v němž byly buňky suspendovány v PBS na koncentraci 1 x 10⁷ buněk/ml a směs byla podrobena pulsům o napětí 1500 V a kapacitě 25 pFD. Po 10 minutové zotavovací periodě při teplotě místnosti, byly elektroporézované buňky pěstovány v kultivačním médiu DMEM (vyrobeno GIBCO-BRL), obsahujícím 10 % fetálního hovězího séra (vyrobeno GIBCO-BRL) při 37 °C a v 5% CO₂ po dobu 3 dní.

2) Příprava adsorbční plotny

Adsorbční plotna pokrytá myší anti-HM 1.24 protilátkou byla připravena metodou podle B. Seed a kol., (Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84, 3365-3369 (1987)). Myší anti-HM

1.24 protilátka byla přidána do 50 mM Tris-HCI, pH 9,5 v koncentraci 10 pg/ml. Tři ml takto připraveného roztoku protilátek bylo přidáno na plotnu pro tkáňovou kultivaci o průměru 60 mm a inkubovány při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Poté byla plotna třikrát promyta roztokem 0,15 M NaCl a byl přidán PBS, obsahující 5 % fetálního hovězí séra, 1 mM EDTA, 0,02% NaN₃. Po blokování byla takto připravená plotna použita pro následující klonování.

3) Klonování cDNA knihovny

Buňky COS-7 transfekované tak, jak bylo popsáno výše, byly rozptýleny v PBS, obsahujícím 5 mM EDTA. Po jednom promytí PBS, obsahujícím 5 % fetálního hovězího séra byly buňky suspendovány v PBS, obsahujícím 5 % fetálního hovězího séra a 0,02% NaN₃ na koncentraci 1 x 10⁶ buněk/ml. Suspenze byla pak přidána k adsorbční plotně, připravené jak bylo popsáno výše, a inkubováno při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Po trojím opatrném promytí s PBS obsahujícím 5 % fetálního hovězího séra a 0,02% NaN₃, byla plazmidová DNA izolována z buněk vázaných k adsorbční plotně, za použití roztoku obsahujícího 0,6% SDS a 10 mM EDTA.

Získaná plazmidová DNA byla transdukována do buněk Escherichia coli DH5a.

Po amplifikaci plazmidové DNA, jak je výše uvedeno, byla DNA izolována alkalickou metodou. Získaná plazmidová DNA byla transfekována elektroporační metodou do • · φ φ buněk COS-7 a plazmidová DNA izolována z adsorbovaných buněk, jak je popsáno výše. Podobný postup byl opakován ještě jednou a získaná plazmidová DNA byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a Notl. Na závěr byla potvrzena koncentrace inzertu o velikosti 0,9 kbp. Dále byly buňky E. coli, transdukované částí získané plazmidové DNA byly naočkovány na plotny s agarem 2-YT, obsahujícím ampicilin o koncentraci 50 gg/ml. Po kultivaci přes noc byla z jedné kolonie izolována DNA. Ta byla štěpena restrikčními enzymy EcoRI a Notl a získán klon p3.19, nesoucí inzert 0,9 kbp.

Sekvence bází tohoto klonu byla určena pomocí sekvenační soupravy PRISM, Dye Terminátor Cycle Sequencing Kit (vyrobeno Perkin Eimer) podle návodu, přiloženého k soupravě a DNA sekvenátoru ABI 373A (vyrobeno Perkin Eimer). Jeho nukleotidová sekvence a odpovídající sekvence aminokyselin jsou ukázány v SEQ ID NO: 1.

Průmyslová využitelnost

Výsledky FCM analýzy ukázaly, že anti-HM 1.24 protilátka silně reaguje s většinou buněk, odvozených z lidských lymfatických nádorů, což naznačuje, že v mnoha lymfatických nádorech je silně exprimován polypeptid obsahující epitop, rozpoznávaný anti-HM 1.24 protilátkou. Dále u myší s transplantovaným lidským nádorem, který reaguje s anti-HM 1.24 protilátkou, podání anti-HM 1.24 protilátky má za následek potlačení zvětšování objemu nádoru a navíc prodloužení doby přežití zvířete. Tyto skutečnosti ukazují, že anti-HM 1.24 protilátka nebo protilátky rozpoznávající polypeptid, který obsahuje epitop rozpoznávaný anti-HM 1.24 protilátkou, mají cytotoxickou aktivitu pro mnoho lymfatických nádorů. To naznačuje, že protilátka může být užitečná pro léčení pacientů s lymfatickými nádory.

• * • φ • φ • · · · φ • 49

Seznam organizmů, uložených podle Smlouvy o patentové spolupráci, Pravidlo 13-2 a název ukládajícího institutu

Název: the National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of

Industrial Science and Technology, MITI

Adresa: Higashi 1-chome, Tsukuba City, Ibalaki pref., Japan

Mikroorganizmus (1)

Jméno: Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19)

Přístupové č.: FERM BP-4434 Datum uložení: 5. října 1993

Mikroorganizmus (2)

Jméno: hybridom HM1.24 Přístupové č.: FERM BP-5233 Datum uložení: 14. září 1995

Mikroorganizmus (3)

Jméno: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1)

Přístupové č.: FERM BP-5643 Datum uložení: 29. srpna 1996

Mikroorganizmus (4)

Jméno: Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1)

Přístupové č.: FERM BP-5644 Datum uložení: 29. srpna 1996

Mikroorganizmus (5)

Jméno: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AHM-gK)

Přístupové č.: FERM BP-5645 Datum uložení: 29. srpna 1996

Mikroorganizmus (6)

Jméno: Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gK)

Přístupové č.: FERM BP-5646 • · · · • ··

Datum uložení: 29. srpna 1996

Mikroorganizmus (7)

Jméno: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM-gy1) Přístupové č.: FERM BP-6127 Datum uložení: 29. září 1997 • · · · • ·· • · ·· ♦· • · · • · ♦ ·· · ·· · • · • 9 ·»

SEZNAM SEKVENCÍ <110> CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA <120> Léčebné činidlo pro lymfatické nádory <130> E908 <140> PCT/JP98/00568 <141> 1998-02-12 <150> JP 9-41410 <151> 1997-02-02 <160> 8 <210> 1 <211> 1013 <212> DNA <213> Homosapiens <223> Nukleotidová sekvence kódující HM 1.24 antigen <400> 1 gaattcggca cgagggatct gg atg gca tet act tcg tat gac tat tgc 49

Met

Ala

Ser

Thr

Ser 5

Tyr

Asp

Tyr

Cys

aga

gtg

CCC

atg

gaa

gac

ggg

gat

aag

ege

tgt

aag

ctt

ctg

ggg

97

Arg

Val

Pro

Met

Glu

Asp

Gly

Asp

Lys

Arg

Cys

Lys

Leu

Gly

10

15

20

25

ata

gga

att

ctg

gtg

ctc

ctg

atc

gtg

att

ctg

ggg

gtg

CCC

ttg

145

Ile

Gly

Ile

Leu

Val

Leu

Ile

Val

Ile

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

30

35

40

att

atc

ttc

acc

atc

aag

gcc

aac

age

gag

gcc

tgc

cgg

gac

ggc

ctt

193

Ile

Phe

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Glu

Ala

cys

Arg

Asp

Gly

Leu

45

50

55

cgg

gca

gtg

atg

gag

tgt

ege

aat

gtc

acc

cat

ctc

ctg

caa

gag

241

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Cys

Arg

Asn

Val

Thr

His

Leu

Gin

Glu

60

65

70

ctg

acc

gag

gcc

cag

aag

ggc

ttt

cag

gat

gtg

gag

gcc

cag

gcc

289

Leu

Thr

Glu

Ala

Gin

Lys

Gly

Phe

Gin

Asp

Val

Glu

Ala

Gin

Ala

75

80

85

• a a · · a a a · ·

acc	tgc aac	cac act gtg	atg gcc	cta	atg gct tcc ctg gat gca gag	337
Thr	Cys Asn	His Thr Val	Met Ala	Leu	Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu
90		95			100 105
aag	gcc caa	gga caa aag	aaa gtg	gag	gag ctt gag gga gag atc act	385
Lys	Ala Gin	Gly Gin Lys	Lys Val	Glu	Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr
	110	115	120
aca	tta aac	cat aag ctt	cag gac	gcg	tet gca gag gtg gag ega ctg	433
Thr	Leu Asn	His Lys Leu	Gin Asp	Ala	Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu
	125		130		135
aga	aga gaa	aac cag gtc	tta agc	gtg	aga atc gcg gac aag aag tac	481
Arg	Arg Glu	Asn Gin Val	Leu Ser	Val	Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr
	140		145		150
tac	ccc agc	tcc cag gac	tcc agc	tcc	gct gcg gcg ccc cag ctg ctg	529
Tyr	Pro Ser	Ser Gin Asp	Ser Ser	Ser	Ala Ala Ala Pro Gin Leu Leu
	155		160		165
att	gtg ctg	ctg ggc ctc	agc gct	ctg	ctg cag tga gatcccagga	575
Ile	Val Leu	Leu Gly Leu	Ser Ala	Leu	Leu Gin
170		175			180

agctggcaca tcttggaagg tccgtcctgc tcggcttttc gcttgaacat tcccttgatc 635 tcatcagttc tgagcgggtc atggggcaac acggttagcg gggagagcac ggggtagccg 695 gagaagggcc tctggagcag gtctggaggg gccatggggc agtcctgggt ctggggacac 755 agtcgggttg acccagggct gtctccctcc agagcctccc tccggacaat gagtcccccc 815 tcttgtctcc caccctgaga ttgggcatgg ggtgcggtgt ggggggcatg tgctgcctgt 875 tgttatgggt tttttttgcg gggggggttg cttttttctg gggtctttga gctccaaaaa 935 aataaacact tcctttgagg gagagcacac cttaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 995 aaaattcggg cggccgcc 1013 <210> 2 <211> 379 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221>

<222>

<223> Nukleotidová sekvence DNA kódující L řetězec V oblasti verze a pozměněné anti-HM 1.24 protilátky <400> 2

atg

gga

tgg

agc

tgt

atc

ctc

tcc

ttg

gta

gca

aca

gct

aca

ggt

48

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

gtc

cac

tcc

gac

atc

cag

atg

acc

cag

agc

cca

agc

ctg

agc

gcc

96

Val

His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

-1

1

5

10

agc

gtg

ggt

gac

aga

gtg

acc

atc

acc

tgt

aag

gct

agt

cag

gat

gtg

144

Ser

Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

15

20

25

aat

act

gct

gta

gcc

tgg

tac

cag

aag

cca

gga

aag

gct

cca

aag

192

Asn

Thr

Ala

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

* · · · · · · · · • ·· · · · · · · ·

ctg

atc

tac

tcg

gca

tcc

aac

cgg

tac

act

ggt

gtg

cca

agc

aga

240

Leu

Ile

Tyr

Ser

Ala

Ser

Asn Arg

Tyr

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

ttc

agc

ggt

agc

ggt

agc

ggt

acc

gac

ttc

acc

ttc

acc

atc

agc

288

Phe

Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

65

70

75

ctc

cag

cca

gag

gac

atc

gct

acc

tac

tgc

cag

caa

cat

tat

agt

336

Leu

Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

His

Tyr

Ser

80

85

90

act

cca

ttc

acg

ttc

ggc

caa

ggg

acc

aag

gtg

gaa

atc

aaa

c

379

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

100 105 <210> 3 <211> 418 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221>

<222>

<223> Nukleotidová sekvence DNA kódující H řetězec V oblasti verze r pozměněné anti-HM 1.24 protilátky <400> 3

atg gac	tgg acc tgg	agg	gtc	ttc	ttc ttg	ctg gct gta gct	cca	ggt	48
Met Asp	Trp Thr Trp	Arg	Val	Phe	Phe Leu	Leu Ala Val Ala	Pro	Gly
	-15				-10		-5
gct cac	tcc cag gtg	cag	ctg	gtg	cag tet	ggg gct gag gtg	aag	aag	96
Ala His	Ser Gin Val	Gin	Leu	Val	Gin Ser	Gly Ala Glu Val	Lys	Lys
-1	1			5		10
cct ggg	gcc tca gtg	aag	gtt	tcc	tgc aag	gca tet gga tac	acc	ttc	144
Pro Gly	Ala Ser Val	Lys	Val	Ser	Cys Lys	Ala Ser Gly Tyr	Thr	Phe
15			20			25
act ccc	tac tgg atg	cag	tgg	gtg	ega cag	gcc cct gga caa	ggg	ctt	192
Thr Pro	Tyr Trp Met	Gin	Trp	Val	Arg Gin	Ala Pro Gly Gin	Giy	Leu
30		35				40		45
gag tgg	atg gga tet	att	ttt	cct	gga gat	ggt gat act agg	tac	agt	240
Glu Trp	Met Gly Ser	Ile	Phe	Pro	Gly Asp	Gly Asp Thr Arg	Tyr	Ser
	50			55	60
cag aag	ttc aag ggc	aga	gtc	acc	atg acc	gca gac aag tcc	acg	agc	288
Gin Lys	Phe Lys Gly	Arg	Val	Thr	Met Thr	Ala Asp Lys Ser	Thr	Ser
65		70		75
aca gcc	tac atg gag	ctg	agc	agc	ctg aga	tet gag gac acg	gcc	gtg	336
Thr Ala	Tyr Met Glu	Leu	Ser	Ser	Leu Arg	Ser Glu Asp Thr	Ala	Val
80			85		90
tat tac	tgt gcg aga	gga	tta	ega	ega ggg	ggg tac tac ttt	gac	tac	384
Tyr Tyr	Cys Ala Arg	Gly	Leu	Arg	Arg Gly	Gly Tyr Tyr Phe	Asp	Tyr

100 tgg ggg caa ggg acc acg gtc acc gtc Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val 110 115

105 tcc tca g Ser Ser

120

418

• MO	0 · 0	00	00
0 0	0	« 0	0 0	0 0	0 0
0	• 00	•	0 0	• »	0 1
•	0 0	0	0 0	• 0 0 0	0 0 1
0	0	0	0 0	0	•
0 0 0		0 0 0	0 »	0 0	0 «

<210> 4 <211> 418 <212> DNA <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221>

<222>

<223> Nukleotidová sekvence DNA kódující H řetězec V oblasti verze s anti-HM 1.24 protilátky <400> 4

atg	gac	tgg acc	tgg agg	gtc	ttc	ttc ttg ctg gct gta gct cca	ggt	48
Met	Asp	Trp Thr	Trp Arg	Val	Phe	Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro	Gly
		-15			-10 -5
gct	cac	tcc cag	gtg cag	ctg	gtg	cag tet ggg gct gag gtg aag	aag	96
Ala	His	Ser Gin	Val Gin	Leu	Val	Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys	Lys
	-1	1			5	10
cct	ggg	gcc tca	gtg aag	gtt	tcc	tgc aag gca tet gga tac acc	ttc	144
Pro	Gly	Ala Ser	Val Lys	Val	Ser	Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr	Phe
	15			20		25
act	CCC	tac tgg	atg cag	tgg	gtg	ega cag gcc cct gga caa ggg	ctt	192
Thr	Pro	Tyr Trp	Met Gin	Trp	Val	Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly	Leu
30			35			40	45
gag	tgg	atg gga	tet att	ttt	cct	gga gat ggt gat act agg tac	agt	240
Glu	Trp	Met Gly	Ser Ile	Phe	Pro	Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr	Ser
		50			55 60
cag	aag	ttc aag	ggc aga	gtc	acc	atc acc gca gac aag tcc acg	age	288
Gin	Lys	Phe Lys	Gly Arg	Val	Thr	Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr	Ser
	65		70	75
a ca	gcc	tac atg	gag ctg	age	age	ctg aga tet gag gac acg gcc	gtg	336
Thr	Ala	Tyr Met	Glu Leu	Ser	Ser	Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala	Val
	80			85	90
tat	tac	tgt gcg	aga gga	tta	ega	ega ggg ggg tac tac ttt gac	tac	384
Tyr	Tyr	Cys Ala	Arg Gly	Leu	Arg	Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp	Tyr
	95			100		105
tgg	ggg	caa ggg	acc acg	gtc	acc	gtc tcc tca g		418
Trp	Gly	Gin Gly	Thr Thr	Val	Thr	Val Ser Ser
110			115			120

<210> 5 <211> 180 <212> PRT <213> Homosapiens <223> Aminokyselinová sekvence HM 1.24 antigenů <400> 5

Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys ·♦»· ··· • 9 99 » 9 9 9 > 9 9 9

999 999

9

9 99

Arg

Val

Pro

Met

Glu

Asp

Gly

Asp

Lys

Arg

Cys

Lys

Leu

Gly

10

15

20

25

Ile

Gly

Ile

Leu

Val

Leu

Ile

Val

Ile

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

30

35

40

Ile

Phe

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Glu

Ala

Cys

Arg

Asp

Gly

Leu

45

50

55

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Cys

Arg

Asn

Val

Thr

His

Leu

Gin

Glu

60

65

70

Leu

Thr

Glu

Ala

Gin

Lys

Gly

Phe

Gin

Asp

Val

Glu

Ala

Gin

Ala

75

80

85

Thr

Cys

Asn

His

Thr

Val

Met

Ala

Leu

Met

Ala

Ser

Leu

Asp

Ala

Glu

90

95

105

Lys

Ala

Gin

Gly

Gin

Lys

LysVal Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr

110

115

120

Thr

Leu

Asn

His

Lys

Leu

Gin

Asp

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

Glu

Arg

Leu

125

130

135

Arg

Glu

Asn

Gin

Val

Leu

Ser

Val

Arg

Ile

Ala

Asp

Lys

Tyr

140

145

150

Tyr

Pro

Ser

Gin

Asp

Ser

Ala

Pro

Gin

Leu

155

160

165

Ile

Val

Leu

Gly

Leu

Ser

Ala

Leu

Gin

<210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<221>

<222>

<223>

126

PRT

Uměle připravená sekvence

Aminokyselinová sekvence L řetězce V oblasti verze a pozměněné anti-HM 1.24 protilátky

<400>

6

Met Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Thr

Gly

-15

-10

-5

Val His

Ser

Asp

Ile

Gin

Met

Thr

Gin

Ser

Pro

Ser

Leu

Ser

Ala

-1

1

5

10

Ser Val

Gly

Asp

Arg

Val

Thr

Ile

Thr

Cys

Lys

Ala

Ser

Gin

Asp

Val

15

20

25

Asn Thr

Ala

Val

Ala

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lys

Ala

Pro

Lys

30

35

40

45

Leu Leu

Ile

Tyr

Ser

Ala

Ser

Asn

Arg

Tyr

Thr

Gly

Val

Pro

Ser

Arg

50

55

60

Phe Ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Gly

Thr

Asp

Phe

Thr

Phe

Thr

Ile

Ser

65

70

75

Leu Gin

Pro

Glu

Asp

Ile

Ala

Thr

Tyr

Cys

Gin

His

Tyr

Ser

80

85

90

Thr Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lys

Val

Glu

Ile

Lys

95

100

105

999· * ·· 99 99 • ·· · · 9999 *99 999 9999 • · · · 9 · 999 999 • 9 9 9 9 9 <210> 7 <211> 139 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221>

<222>

<223> Aminokyselinová sekvence H řetězce V oblasti verze r pozměněné anti-HM 1.24 protilátky <400> 7

Met Asp Trp Thr Trp

Arg Val

Phe

Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro

Gly

-15

-10

-5

Ala

His

Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

-1

1

5

10

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

Thr

Pro

Tyr

Trp

Met

Gin

Trp

Val

Arg

Gin

Ala

Pro

Gly

Gin

Gly

Leu

30

35

40

45

Glu

Trp

Met

Gly

Ser

Ile

Phe

Pro

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

50

55

60

Gin

Lys

Phe

Lys

Gly

Arg

Val

Thr

Met

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

65

70

75

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

95

100

105

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110 115 120 <210> 8 <211> 139 <212> PRT <213> Uměle připravená sekvence <220>

<221>

<222>

<223> Aminokyselinová sekvence H řetězce V oblasti verze s pozměněné anti-HM 1.24 protilátky <400> 8

Met

Asp Trp

Thr

Trp

Arg

Val

Phe

Leu

Ala

Val

Ala

Pro

Gly

-15

-10

-5

Ala

His Ser

Gin

Val

Gin

Leu

Val

Gin

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

-1 1

5

10

Pro

Gly Ala

Ser

Val

Lys

Val

Ser

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

• · ·♦ · ···

Thr Pro Tyr	Trp Met Gin Trp Val Arg	Gin Ala Pro Gly	Gin Gly	Leu
30	35	40		45
Glu Trp Met	Gly Ser Ile Phe Pro Gly	Asp Gly Asp Thr	Arg Tyr	Ser
	50	55	60
Gin Lys Phe	Lys Gly Arg Val Thr Ile	Thr Ala Asp Lys	Ser Thr	Ser
65	70	75
Thr Ala Tyr	Met Glu Leu Ser Ser Leu	Arg Ser Glu Asp	Thr Ala	Val
80	85	90
Tyr Tyr Cys	Ala Arg Gly Leu Arg Arg	Gly Gly Tyr Tyr	Phe Asp	Tyr
95	100	105
Trp Gly Gin	Gly Thr Thr Val Thr Val	Ser Ser
100	115	120

·**· · ·· BB ·· • »······· • ·· · 9 · BB·· ·· ·· ·· ··· ··· • · · Β B «

999 BBB ·· BB »·

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Léčebné činidlo pro lymfatické nádory (kromě myelomů) vyznačující se t í m, že obsahuje jako aktivní složku protilátku, která se specificky váže na protein, který má aminokyselinovou sekvenci jak je ukázáno v SEQ ID NO: 1 a která má cytotoxickou aktivitu.
2. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.1, vyznačující se tím, že lymfatický nádor je nádor T buněk.
3. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.1, vyznačující se tím, že lymfatický nádor je nádor B buněk (kromě myelomů).
4. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.1, vyznačující se tím, že protilátka je monoklonální protilátka.
5. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.1, v y z n a č u j í c í se t í m, že cytotoxická aktivita je ADCC aktivita.
6. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.1, vyznačující se tím, že cytotoxická aktivita je CDC aktivita.
7. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.4, vyznačující se tím, že protilátka má konstantní oblast Cy lidské protilátky.
8. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.7, vyznačující se tím, že konstantní oblast lidské protilátky Cy je Cy1 nebo Cy3.
9. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.4, vyznačující se tím, že protilátka je anti-HM 1.24 protilátka.
10. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.4, vyznačující se tím, že protilátka je chimerní protilátka nebo pozměněná protilátka.

9 99· · 9 9 99 99

9 9999 «999

999 999 9999

99 9 9 9· 999 999

9 9 9 9 9 9

999 999 99 99 99
11. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.9, vyznačující se tím, že protilátka je chimerní anti-HM 1.24 protilátka.
12. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.9, vyznačující se tím, že protilátka je pozměněná anti-HM 1.24 protilátka.
13. Léčebné činidlo podle patentového nároku č.9, vyznačující se tím, že protilátka se specificky váže k epitopu, rozpoznávanému anti-HM 1.24 protilátkou.
14. Protilátka, vyznačující se tím, že se specificky váže k proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci ukázanou v SEQ ID NO: 1 a která má cytotoxickou aktivitu.
15. Protilátka podle patentového nároku č.13, v y z n a č u j í c í se t í m, že cytotoxické aktivita je ADCC aktivita.
16. Protilátka podle patentového nároku č.13, vyznačující se tím, že cytotoxické aktivita je CDC aktivita.

Obr. 1

Naměřená radioaktivita

B-1 • ··#· * ·* ·· 49

94 9 44 4 4 4 4 9 4

4 441 4 4 4 9 4 4 1

4 44 1 4 4 4 494 949

4 4 9 4 4 9 4

449 494 944 41 94 99

Obr. 2

B-2

Naměřená radioaktivita