CZ287295A3 - Antibodies against p-selectin, method of detecting p-selectin, preparation processes of medicaments, pharmaceutical preparations, nucleic acids, cell lines and their use - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se obecně týká nových imunoglobulinů, reagujících s funkčními epitopy na povrchovém buněčném receptorů Pselektinu. Tato přihláška se také obecně týká diagnostických a terapeutických metod použití těchto protilátek.

Dosavadní stav techniky

Schopnost vzájemné adhese buněk hraje kritickou roli při vývoji, normální fyziologii a chorobných procesech, jako jsou záněty. Tato schopnost je zprostředkována adhesními molekulami, obecně glykoproteiny, exprimovanými na buněčných membránách. Často se adhesní molekula na jednom typu buňky váže k jiné adhesní molekule, exprimované na odlišném typu buňky, a tak vytváří dvojici receptor-protireceptor. Tři významné skupiny adhesních molekul tvoří integriny, selektiny a členové nadskupiny imunoglobulinů (Ig) (viz Springer, Nátuře 346:425 (1990); Osborn, Cell 62:3 (1990); Hyneš, Cell 69:11 (1992), kteréžto odkazy jsou zde ve své úplnosti pro všechny účely zahrnuty formou odkazu). Tyto molekuly jsou zvlášť nepostradatelné pro interakci leukocytů a destiček se sebou navzájem a s extracelulární matricí a vaskulárním endothelem.

P-Selektin, známý také jako CD6 2, granulární membránový protein 140 (GMP-140)/granulární externí membrána závislá na aktivaci destiček (PADGEM)/LECCAM-3, je specializovaný povrchový receptor na vaskulárních endotheliálních buňkách a destičkách, který se účastní rozpoznávání různých obíhajících buněk. P-Selektin je povrchový glykoprotein s lektinu podobnou doménou, oblastí, která je homologní k epidennálnímu růstovému faktoru, a oblastí homologní k proteinům regulujícím komplement (viz McEver, Blood Cells 16:73-83 (1990)). Struktura P-selektinu je podobná jako u dvou jiných povrchových receptorů vaskulárních buněk, endotheliální leukocytové adhesní molekuly (ELAM-1) a receptorů směrujícího lymfocyty (LHR). Název selektin byl pro tuto obecnou skupinu receptorů navržen kvůli jejich doméně podobné lektinu a selektivnímu charakteru jejich adhesních funkcí.

P-Selektin je na povrchu destiček a endotheliálních buněk přítomen jako odpověď na různé stimuly, kde zprostředkovává interakce destička-leukocyt a endothelleukocyt. Naproti tomu je ELAM-1 exprimován pouze, na endotheliálních buňkách a LHR je exprimován na různých leukocytech v endotheliálních žilkách periferních lymfatických uzlin. Exprese P-selektinu je indukovatelná a k expresi nedochází na neaktivovaných endotheliálních buňkách nebo destičkách. Exprese P-selektinu nevyžaduje opětnou syntézu, poněvadž je skladován v sekrečních granulách (nebo Weibel-Paladových tělíscích) jak v destičkách, tak v endotheliálních buňkách. Během několika minut po aktivaci buněk obou typů thrombinem, histaminem nebo forbolovými estery nebo jinými humorálními faktory je tedy P-selektin rychle redistribuován k povrchu buňky, kde je přístupný pro vazbu na jiné buňky.

Byl zaznamenán velký počet myších protilátek proti Pselektinu (viz například patent US 4,783.330, patentová přihláška WO 91/06632, patentová přihláška PCT/FR90/00565, McEver ad., J. Biol. Chem. 259:9799-9804 (1984); Gang a d., Nátuře 343:757-760; Parmentier a d., Blood 77:1734-1739 (1991)). Další protilátka proti P-selektinu byla popsána v přednáškách na Scripps Institute, La Jolla, California, a na kolokviu v Keystonu 16.1.1992. Některé z těchto protilátek, které blokují P-selektinem zprostředkovanou adhesi, jsou závislé na Ca²⁺.

Experimenty in vitro s použitím protilátek proti Pselektinu poskytly omezené pochopení ligandové specificity tohoto receptorů. Bylo uvedeno, že P-selektin váže neutrofily, monocyty a určité karcinomové buňky (Bevilacqua a d., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84:9238-9242 (1987); Geng a d., Nátuře 343:757-760 (1990); Larsen a d., Cell 63:467-474 (1990), a Polley a d. Bylo rovněž uvedeno, že P-selektin rozpoznává Le^x jako vysoce afinitní iigand (Larsen a d., Cell 63:467-474 (1990)). Následné experimenty však ukázaly, že SLe^x obsahující oligosacharid je ve skutečnosti účinnějším inhibitorem P-selektinem zprostředkované adhese než Le^x (Polley a d., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:6224-6228 (1991)).

Z účasti P-selektinu v intracelulární adhesi in vitro lze soudit, že P-selektin se muže, podobně jako jiné adhesní molekuly, účastnit buněčných interakcí, které přispívají k zánětlivým onemocněním in vivo. Dosud však nebylo osvětleno, v kterých konkrétních zánětlivých onemocněních by P-selektin mohl hrát významnou roli. Podobně je nejasná epitopová specificita prostředků, účinných při likvidaci konkrétních Pselektinem zprostředkovaných zánětlivých onemocnění. Ze známých protilátek k P-selektinu se některé na P-selektin vážou, ale neblokují P-selektinem zprosředkované intercelulární interakce. Jiné známé protilátky mají schopnost blokovat P-selektinem zprostředkovanou intercululární vazbu pouze v přítomnosti vysokých koncentracích Ca²⁺, kterážto podmínka nemusí být in vivo vždy splněna. Absence vysokých koncentrací Ca²·*· in vivo způsobuje neúčinnost těchto protilátek jako terapeutických prostředků. Navíc všechny dosud vyrobené protilátky k P-selektinu jsou myšího původu, a mohu tedy v klinickém použití vyvolat lidskou-antimyší protilátkovou odpověd (HAMA).

Na základě výše uvedených skutečností je zřejmé, že existuje potřeba nových prostředků, cílených proti Pselektinu, které mají příslušnou epitopovou specificitu pro likvidaci intercelulárních interakcí, vedoucích k zánětlivým onemocněním in vivo. Ideálně takové prostředky nebudou vyvolávat při ošetřování lidí odpověď HAMA. Tuto a další potřeby plní tento vynález.

Podstata vynálezu

V jednom aspektu jsou předmětem vynálezu blokující protilátky, které se specificky vážou na P-selektin. Příkladem je protilátka označená mu MAb PBI.3 (produkovaná buněčnou linií, která má přírůstkové číslo ATCC HB11041) . Další protilátky konkurenčně inhibují vazbu mu MAb PBI.3 na P-selektin, měřeno testem kompetitivní inhibice. Výhodné protilátky se vážou na P-selektin v nepřítomnosti Ca²⁺. Protilátky podle vynálezu zahrnují fragmenty, jako je Pab, Fab' F(ab')2' Fabc a Fv, stejně jako intaktní protilátky.

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu farmaceutické přípravky. Farmaceutické přípravky zahrnují výše popsanou blokující protilátku proti P-selektinu a farmaceuticky přijatelný nosič.

Vynález rovněž poskytuje terapeutické metody k léčbě onemocnění imunitního systému. Tyto metody zahrnují podávání terapeuticky účinné dávky výše popsaného farmaceutického přípravku pacientovi, trpícímu takovýmto onemocněním.

Příklady onemocnění, léčitelných podle vynálezu, jsou akutní poškození plic a ischemické reperfusní poškození.

Některé protilátky podle vynálezu jsou humanizované imunoglobu1iny. Humanizované imunoglobu1iny zahrnují humanizovaný těžký řetězec a humanizovaný lehký řetězec. Humanizovaný lehký řetězec zahrnuje tři oblasti determinující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), mající sekvence aminokyselin z odpovídajících oblastí determinujících komplementaritu lehkého řetězce myšího imunoglobulinu PB1.3 a úsek základní struktury variabilní oblasti ze sekvence základní struktury variabilní oblasti lidského lehkého řetězce *. Humanizovaný těžký řetězec zahrnuje tři oblasti determinující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), mající sekvence aminokyselin z odpovídajících oblastí determinujících komplementaritu těžkého řetězce myšího imunoglobulinu PB1.3 a úsek základní struktury variabilní oblasti ze sekvence základní struktury variabilní oblasti lidského těžkého řetězce. Humanizované imunoglobuliny se specificky vážou na P-selektin, přičemž vazebná afinita má spodní hranici asi 10⁷ M'¹ a horní hranici asi pětinásobku vazebné aktivity myšího imunoglobulinu PB1.3.

V mnoha humanizovaných imunoglobulínech je sekvence úseku základní struktury variabilní oblasti lehkého lidského řetězce * substituována v alespoň jedné poloze, vybrané z první skupiny tvořené L21, L46, L6 0 a L7 0 aminokyselinou přítomnou v ekvivalentní poloze sekvence úseku základní struktury variabilní oblasti lehkého řetězce myšího imunoglobulinu PB1.3. Podobně je sekvence úseku základní struktury variabilní oblasti těžkého lidského řetězce substituována v alespoň jedné poloze, vybrané z druhé skupiny tvořené Hl, H2, H71 a H73 aminokyselinou přítomnou v ekvivalentní poloze sekvence úseku základní struktury variabilní oblasti těžkého řetězce myšího PB1.3. V některých humanizovaných imunoglobulinech je úsekem základní struktury variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce sekvence úseku základní struktury variabilní oblasti těžkého řetězce 21/28'CL. V některých humanizovaných imunoglobulinech je úsekem základní struktury variabilní oblasti humanizovaného lehkého řetězce sekvence úseku základní struktury variabilní oblasti lehkého řetězce DEN. Příklady aminokyselinových sekvencí variabilní oblasti maturovaného lehkého řetězce jsou znázorněny na obr. 14 až 17. Příklady aminokyselinových sekvencí variabilní oblasti maturovaného těžkého řetězce jsou znázorněny na obr. 11 až 13. Výhodný humanizovaný imunoglobulin zahrnuje variabilní oblast maturovaného lehkého řetězce, znázorněnou na obr. 17, a variabilní oblast maturovaného těžkého řetězce, znázorněnou na obr. 12.

Vynález poskytuje intaktní humanizované imunoglobuliny a fragmenty humanizovaných imunoglobulinů, jako je Fab, Fab¹ F(ab')2, Fabc a Pv. Některé humanizované imunoglobuliny dále zahrnují konstantní oblast, která může nebo nemusí mít efektorovou funkci.

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu nukleové kyseliny, kódující humanizované imunoglobuliny. Některé nukleové kyseliny kódují těžké a jiné lehké řetězce.

Předmětem vynálezu jsou rovněž počítače, programované tak, aby zobrazovaly trojrozměrné znázornění výše popsaných imunoglobulinů na monitoru nebo tiskárně.

Předmětem vynálezu jsou dále farmaceutické přípravky, zahrnující výše popsané humanizované imunoglobuliny a farmaceuticky přijatelný nosič..

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu způsoby detekce P-selektinu s použitím výše popsaných humanizovaných imunoglobulinů. Humanizovaný . imunoglobulin se aplikuje pacientovi nebo na jeho tkáňový vzorek. Detekují se komplexy,

Ί vznikající specifickou vazbou mezi imunoglobulinem a Pselektinem, přítomným v cílovém vzorku, které indikují přítomnost P-selektinu.

Předmětem vynálezu jsou rovněž způsoby léčení pacienta trpícího onemocněním imunitního systému s použitím humanizovaných imunoglobulinú. Tyto způsoby zahrnují podávání terapeuticky účinné dávky výše popsaného farmaceutického přípravku pacientovi. Onemocnění, na něž je tato léčba použitelná, zahrnují akutní poškození plic a ischemické reperfusní poškození. Přípravky jsou použitelné například k léčbě pacientu trpících epidermální, myokardiální, renální, cerebrální, splenickou, hepatickou, spinální, splanchnickou, pulmonární ischemií a ischemií celého těla nebo jeho částí.

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu stabilní buněčné linie produkující humanizované imunoglobuliny. Stabilní buněčné linie zahrnují dva segmenty nukleových kyselin. Jeden segment nukleové kyseliny kóduje těžký řetězec výše uvedeného humanizovaného imunoglobulinu a je operativně vázán k promotoru k umožnění exprese těžkého řetězce. Druhý segment nukleové kyseliny kóduje lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu a je operativně vázán k druhému promotoru k umožnění exprese lehkého řetězce. Výhodné buněčné linie produkují asi 30 ^g humanizovaného imunoglobulinu/10⁶ buněk/den.

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu fragmenty Pselektinu. Tyto fragmenty mají až 100 aminokyselin, které zahrnují alespoň pět navzájem sousedících aminokyselin ze segmentu mezi polohami 448 a 467 sekvence aminokyselin, znázorněné na obr. 34. Ve výhodných fragmentech těchto až 100 aminokyselin zahrnuje celý souvislý segment aminokyselin mezi polohami 448 a 467.

Přehled obrázku na výkresech

Obr. 1 znázorňuje údaje, z nichž vyplývá, že protizánětlivé imunoglobuliny podle vynálezu inhibují vazbu thrombinem aktivovaných destiček na neutrofily.

Obr. 2A a 2B ukazují, že protizánětlivé imunoglobuliny podle vynálezu účinně zabraňují poškození plic vyvolanému infusí faktoru kobřího jedu (CVF), měřeno prostřednictvím permeability (obr. 2A), resp. hemorrhagie (obr. 2B).

Obr. 3A až 3H ukazují, že obsah exprese P-selektinu v plicích živočichů je doregulováván v odpovědi na infusi kobřího jedu, visualizované barvením mu MAb PB1.3 křenovou peroxidasou; panely (a) až (d) zobrazují expresi P-selektinu v plicních žilkách v různých dobách po infusi CVF; (a) doba 0, (b) 5 min, (c) 10 min a (d) 15 min (obr. 3A až 3D) . Obr. 3E až 3H jsou světelné a propustnostní fotografie z elektronového mikroskopu v případě akutního poškození plic, vyvolaného CVF u krys, ošetřených 200 pg neblokující protilátky (mu MAb PNB1.6) (rámce a, c) nebo blokující protilátky (mu MAb PB1.3) proti P-selektinu (rámce b, d). U zvířat ošetřených PNB1.6 bylo vaskulární poškození indikováno intenzivní intraalveolární hemorrhagií (rámec a) , spojovanou s intravaskulárními agregáty nebo neutrofily (rámec c, šipky) v ostrém protikladu s endotheliálními buňkami. Naproti tomu u zvířat ošetřených mu MAb PB1.3 k intraalveolární hemorrhagii nedošlo (rámec b) a intravaskulární neutrofily vykázaly málo kontaktů s endothelem (rámec d, šipky) . Rámce a a b: sekce zalité v plastu barvené toluidinovou modří, X160, rámce c a d: barveno uranylacetátem, citrátem olovnatým, X2250.

Obr. 4 znázorňuje vazbu monoklonální protilátky mu MAb

PB1.3 na P-selektin: účinek chelatačních dvojvazných kationtů s EDTA. Prázdné symboly v grafu (spodní čára) znázorňují vazbu v přítomnosti Ca²⁺ a Mg^{2 +} a plné symboly (horní čára) vazbu v přítomnosti EDTA. Protilátka byla ředěna při 1,6 mg/ml jak uvedeno.

Obr. 5 znázorňuje vliv peptidů CQNRYTDLVAIQNKNE na vazbu mu MAb PBI.3 k P-selektinu. Plné symboly odpovídají přítomnosti 0,35 mg/ml peptidů, prázdné symboly absenci peptidů. Uvedené ředění se provádělo z roztoku s 1,6 mg/ml mu MAb PBI.3.

Obr. 6A, 6B a 6C osvětlují schopnost monoklonálních protilátek blokovat vazbu na P-selektin. Blokující protilátky byly přítomny v množství 50 pg/ml. Uvedené ředění biotinylovaných protilátek se provádělo z 1,6 mg/ml mu MAb PBI.3, 0,87 mg/ml mu MAb PNB1.6 a 0,59 mg/ml mu MAb 84/26.

Obr. 7 ukazuje, že rozsah agregace destiček, vyvolané thrombinem, je ekvivalentní za kontrolních podmínek v nepřítomnosti protilátky i v přítomnosti zvyšujících se koncentrací (1-100 /ig/ml) čištěné protilátky mu MAb PBI.3.

Obr. 8 ukazuje, že rozsah myokardiální ischemie, vyjádřený jako procento rizikové oblasti, je významně nižší u zvířat ošetřených blokující protilátkou proti P-selektinu (mu MAb PBI.3) než u zvířat ošetřených neblokující protilátkou k P-selektinu. Rovněž schopnost relaxace kroužků z koronárních tepen v odpověd na acetylcholin je významně větší u zvířat ošetřených mu MAb PBI.3 v porovnání s mu MAb PNB1.6. Že je možno tyto jevy přisoudit snížení myokardiální infiltrace leukocytů, ukazuje snížený počet PMN v myokardiální tkáni ze zvířat ošetřených mu MAb PBI.3 v porovnání s PNB1.6.

Obr. 9 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidů a variabilní oblasti těžkého řetězce PBI.3.

Obr. 10 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidů a variabilní oblasti lehkého řetězce PBI.3.

Obr. 11 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti těžkého řetězce A CY1748.

Obr. 12 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti těžkého řetězce B CY1748.

Obr. 13 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti těžkého řetězce C CY1748.

Obr. 14 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti lehkého řetězce A CY1748.

Obr. 15 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti lehkého řetězce B CY1748.

Obr. 16 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti lehkého řetězce C CY1748.

Obr. 17 znázorňuje sekvenci a translaci signálního peptidu a variabilní oblasti lehkého řetězce D CY1748.

Obr. 18 znázorňuje fyzikální mapu neo-plasmidu exprimujícího lidský těžký řetězec (konstantní oblast y-1).

Obr. 19 znázorňuje fyzikální mapu neo-plasmidu exprimujícího lidský lehký řetězec (konstantní oblast κ) .

Obr .	20 znázorňuje	vazebné kř ivky	chimérické	PB1.3	a
přetvořené	verze CY1748 k	rsP-selektinu.
Obr .	21 znázorňuje	vazebné křivky	chimérické	PB1.3	a
přetvořené	verze CY1748 k	rsP-selektinu.
Obr .	22 znázorňuje	vazebné kř ivky	chimér ické	PB1.3	a
přetvořené	verze CY1748 k	rsP-selektinu.
Obr .	23 znázorňuje fyzikální	mapu dhfr	-plasmidu

exprimujícího lidský těžký řetězec (konstantní oblast y-1).

Obr. 24 znázorňuje fyzikální mapu dhfr-plasmidu exprimujícího lidský těžký řetězec (konstantní oblast y-4).

Obr. 25 znázorňuje inhibici vazby biotinylované PB1.3 na rsP-selektin působením PB1.3 a CY1748 RH^/RL^-IgGl.

Obr. 26 znázorňuje inhibici vazby biotinylované PB1.3 na rsP-selektin působením PB1.3 a CY17 48 RHg/RLp-IgG4.

Obr. 27 ukazuje, že protilátka PB1.3 snižuje bobtnání králičího ucha, spojené s ischemií a reperfusí.

Obr. 28 ukazuje, že protilátka PB1.3 brání vývinu nekrózy po ischemii a reperfusí králičího ucha.

Obr. 29 ukazuje, že protilátka PB1.3 inhibuje interakce leukocyt-endotheliální buňka, vyvolané degranulačním prostředkem žírných buněk sloučeninou 48/80.

Obr. 30 znázorňuje navrhované svinovací schéma domén Pselektinu.

Obr. 31 představuje schematické znázornění delečních mutantú P-selektinu, použitých k mapování epitopu, který PB1.3 rozpoznává.

Obr. 32 znázorňuje vazbu PB1.3 a králičích polyklonálních protilátek na deleční mutanty P-selektinu.

Obr. 33 znázorňuje vazbu PB1.3 a P6H6 na P-selektin a na P-selektin Á5CRP, což je deleční mutant P-selektinu, kterému chybí pátý CRP.

Obr. 34 znázorňuje sekvence syntetických peptidů, odvozených od aminokyselinové sekvence 5. CRP lidského Pselektinu a reaktivitu PB1.3 vůči těmto imobilizovaným peptidům. Aminokyseliny jsou číslovány v souladu s konvencí Johnstona a d., Cell 56:1033-1044 (1989) pro plnou délku polypeptidu P-selektinu.

Zkratky pro dvacet přirozeně se vyskytujících aminokyselin se řídí konvenčním použitím (Immu.no logy - A Synthesis (2. vyd., ed. E.S. Golub & D.R. Gren, Sinauer Associates, Sunderland, MA, 1991)). Stereoisomery (například D-aminokyseliny) dvaceti konvenčních aminokyselin, nepřírodní aminokyseliny, jako jsou a,a-disubstituované aminokyseliny,

N-alkylaminokyseliny, mléčná kyselina a další nekonvenční aminokyseliny mohou rovnéž být vhodnými složkami polypeptidú podle vynálezu. Příklady nekonvenčních aminokyselin zahrnují

4-hydroxyprolin, y-karboxyglutamát, ε-Ν, N, N-tr imethyllysin, z -N-acetyllysin, O-fosfoserin, N-acetylserin, Nformylmethionin, 3-methylhistidin, 5-hydroxylysin, ω-Νmethylarginin a další podobné aminokyseliny a iminokyseliny (například 4-hydroxyprolin) . Aminokyseliny mohou být kromě toho modifikovány glykosylací*, fosforylací apod.

Peptidy jsou zde v souladu se standardním používáním a konvencí uváděny tak, že směr doleva je směr k aminoterminálnímu konci a směr doprava je směr ke karboxyterminálnímu konci. Podobně, není-li uvedeno jinak, levý konec jednořetězcových polynukleotidových sekvencí je 5'-konec; na levý směr dvouřetězcových polynukleotidových sekvencí se odkazuje jako na 5'-směr. Na směr adice nascentních transkriptů RNA 5' k 3' se odkazuje jako na směr transkripce; oblasti sekvencí v řetězci DNA, mající stejnou sekvenci jako RNA, které jsou 5' k 5'-konci transkriptů RNA, se označují jako sekvence proti směru exprese; oblasti sekvencí v řetězci DNA, mající stejnou sekvenci jako RNA, které jsou 3' k 3'-konci transkriptů RNA, se označují jako sekvence po směru exprese.

Výraz polynukleotidová sekvence se vztahuje na jednořetězcový nebo dvouřetězcový polymer deoxyribonukleot idových nebo ribonukleot idových bází, čtený od 5'-konce k 3'-konci. Zahrnuje autoreplikující plasmidy, infekční polymery DNA nebo RNA a nefunkční DNA nebo RNA.

K popisu sekvenčních vztahů mezi dvěma nebo více polynukleotidy se používají tyto termíny: referenční sekvence, srovnávací okno, sekvenční identita, procento sekvenční identity a podstatná identita. Referenční sekvence je definovaná sekvence, používaná jako základ pro srovnávání sekvencí; referenční sekvence může být podjednotkou větší sekvence, například jako segment plné délky cDNA nebo sekvence genu uvedené v seznamu sekvencí, například jako je polynukleotidová sekvence na obr. 9 až 17, nebo může zahrnovat kompletní sekvenci DNA nebo genu. Obecně má referenční sekvence délku alespoň 20 nukleotidů, obvykle alespoň 25 nukleotidů a často alespoň 50 nukleotidů. Protože v případě dvou polynukleotidů může každý (1) zahrnovat sekvenci (tj. část kompletní polynukleotidová sekvence), která je mezi oběma polynukleotidy podobná a (2) může dále zahrnovat sekvenci, která se mezi oběma polynukleotidy liší, provádějí se srovnání sekvence mezi dvěma (nebo více) polynukleotidy nejčastěji porovnáním sekvencí obou nukleotidů přes srovnávací okno, aby bylo možno identifikovat a porovnat místní oblasti sekvenční podobnosti. Zde používaný termín srovnávací okno se vztahuje na konceptuální segment alespoň 20 sousedících nukleotidových poloh, kde polynukleotidová sekvence může být srovnávána s referenční sekvencí o alespoň 20 sousedících nukleotidech a kde část polynukleotidová sekvence ve srovnávacím okně může zahrnovat adice nebo delece (tj. mezery) v rozsahu 20 % nebo méně vůči referenční sekvenci (která neobsahuje adice nebo delece) pro optimální přiřazení obou sekvencí. Optimální přiřazení sekvencí pro přiřazení srovnávacího okna je možno provést pomocí algoritmu lokální homologie podle Smithe & Watermana, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981), algoritmu porovnávaní homologie podle Needlemana & Wunsche, J. Mol. Biol. 48:443 (1970), metodou hledání podobnosti podle Pearsona & Lipmana, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 85:2444 (1988) (kteréžto materiály jsou zde pro všechny účely zahrnuty ve svém celku formou odkazu, pomocí komputerizovaných aplikací těchto algoritmů (GAP, BESTFIT, FASTA a TFASTA v Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) nebo inspekcí, načež se vybere nejlepší shoda (tj. vedoucí k nejvyššímu procentu podobnosti sekvencí ve srovnávacím okně), získaná různými metodami. Výraz sekvenční identita znamená, že dvě polynukleotidové sekvence jsou ve srovnávacím okně identické (tj. nukleotid po nukleotidu). Procento sekvenční identity se vypočte ze srovnání dvou optimálně přiřazených sekvencí pomocí srovnávacího okna, přičemž se stanoví počet poloh, v nichž se v obou sekvencích vyskytuje identická nukleová báze (například A, T, C G, U nebo I) , čímž se získá počet souhlasících poloh, který se pak vydělí celkovým počtem poloh ve srovnávacím okně (tj. velikostí okna) a výsledek se násobí 100 a poskytne procento identity sekvencí. Výraz podstatná identita, jak je zde používán, označuje charakteristiku polynukleotidové sekvence, kdy polynukleotid zahrnuje sekvenci, která má sekvenční identitu alespoň 85 %, přednostně alespoň 90 až 95 %, obvykleji alespoň 99 % v porovnání s referenční sekvencí ve srovnávacím okně o alespoň 20 polohách nukleotidů, obvykle o alespoň 25 až 50 nukleotidech, přičemž procento sekvenční identity se vypočte z porovnání referenční sekvence s polynukleotidovou sekvencí, která může zahrnovat delece nebo adice, které celkově činí 20 % nebo méně referenční sekvence ve srovnávacím okně. Referenční sekvence může být podúsek větší sekvence, například sekvence znázorněné na obr. 10 až 17.

Ve vztahu k polypeptidům výraz sekvenční identita znamená, že peptidy sdílejí v odpovídajících polohách identické aminokyseliny. Výraz sekvenční podobnost znamená, že peptidy mají v odpovídajících polohách identické nebo podobné aminokyseliny (tj. konzervativní substituce). Výraz podstatná identita znamená, že dvě peptidové sekvence, jsou-li optimálně přiřazeny, například pomocí programu GAP nebo BESTFIT s použitím implicitních hmotností mezer, sdílejí alespoň 80 % sekvenční identity, přednostně alespoň 90 % sekvenční identity, zvláště alespoň 95 % sekvenční identity nebo více (například 99 % sekvenční identity). Přednostně se polohy zbytků, které nejsou identické, liší konzervativními substitucemi aminokyselin. Výraz podstatná podobnost znamená, že dvě peptidové sekvence sdílejí odpovídající procento sekvenční podobnosti.

Výraz v podstatě čistý znamená, že cílová entita je převládající přítomnou entitou (tj. na molární bázi je hojnější než kterákoli jiná jednotlivá entita ve směsi), a podstatně přečištěná frakce je směs, v níž cílová entita činí alespoň asi 50 % (na molární bázi) všech přítomných makromolekulárních druhů. V podstatě čistá sloučenina obvykle tvoří více než asi 80 až 90 % všech makromolekulárních druhů přítomných ve směsi. Přednostně se cílová entita čistí do podstatné homogenity (běžnými detekčními metodami ve směsi nelze detekovat kontaminující entity), kdy je směs tvořena v podstatě jediným makromolekulárním druhem.

Pro účely klasifikace substituce aminokyseliny jako konzervativní nebo nekonzervativní se aminokyseliny dělí takto: skupina I (hydrofobní postranní řetězec) : norleucin, met, ala, val, leu, ile, skupina II (neutrální hydrofilní postranní řetězec): cys, ser, thr, skupina III (kyselý postranní řetězec): asp, glu, skupina IV (bazický postranní řetězec) : asn, gin, his, lys, arg, skupina V (zbytky ovlivňující orientaci řetězce): gly, pro, skupina VI (aromatický postranní řetězec): trp, tyr, phe. Konzervativní substituce jsou záměny aminokyselin ze stejné skupiny. Nekonzervativní substituce tvoří záměny člena jedné z těchto tříd za člena jiné třídy.

Aminokyseliny z variabilních oblastí maturovaných těžkých a lehkých řetězců imunoglobulinů se označují Hx, resp. Lxx, kde x je číslo označující polohu aminokyseliny podle schématu Kabata a d., Sequences of Proteine of Immunological Interest (National Institutes of Health,

Bethesda, MD (1987) a (1991); dále označováno jako Kabat a d., zahrnuto ve zvérn ceJku formou odkazu pro všechny účely). Kabat a d. uvádí mnohé aminokyselinové sekvence pro protilátky z každé podtřídy a nejčastěji se vyskytující aminokyselinu pro polohu každého zbytku v této podtřídě. Používá metodu označování každé aminokyseliny v uvedené sekvenci číslem zbytku, která se stala v oboru standardní. Schéma Kabata ad. je možno rozšířit na další protilátky, nezahrnuté v kompendiu, tak, že se daná protilátka přiřadí k protilátce v Kabatovi ad. s kosensuálními sekvencemi. Použitím číslovacího systému podle Kabata ad. je možno snadno identifikovat aminokyseliny v ekvivalentních polohách v různých protilátkách. Například aminokyselina v poloze L50 lidské protilátky zaujímá ekvivalentní polohu jako aminokyselina v poloze L50 myší protilátky.

Výrazy imunoglobulin, protilátka nebo peptidická protilátka se vztahují na intaktní protilátku nebo na její vazebný fragment, který s intaktní protilátkou soutěží při specifické vazbě na P-selektin.

Podstatná inhibice znamená inhibici alespoň asi 50 %, přednostně asi 60 až asi 80 %, a nejčastěji vyšší než asi 85 % nebo více (měřeno v kompetitivním biotestu in vitro).

Chimérické protilátky jsou protilátky, jejichž lehký a těžký řetězec byl konstruován, nejčastěji genetickým inženýrstvím, z imunoglobulínových genových segmentů, náležejících k různým druhům. Například je možno spojit variabilní (V) segmenty genů z myší monoklonální protilátky s lidskými konstantními (C) segmenty, jako jsou a . Typická terapeutická chimérická protilátka je tedy hybridní protein, tvořený oblastí V čili na antigen se vážící doménou z myší protilátky a C čili efektorovou doménou z lidské protilátky, i když je možno použít i jiných druhů savců.

Vynález poskytuje přípravky a způsoby pro inhibici nemocí a stavu imunitního systému, zprostředkovaných Pselektinem. Konkrétné vynález poskytuje imunoglobuliny, které mají schopnost inhibovat P-selektinem zprostředkovanou adhesi buněk in vivo.

I, Charakteristika imunoglobulinu

A, Obecně

Je známo, že základní strukturní jednotka protilátky zahrnuje tetramer. Každý tetramer je složen ze dvou identických dvojic polypeptidových řetězců, přičemž každá dvojice obsahuje jeden lehký (asi 25 kDa) a jeden těžký (asi 50 až 7 0 kDa) řetězec. Aminoterminální část každého řetězce zahrnuje variabilní oblast s asi 100 až 110 nebo více aminokyselinami, primárně odpovědnou za rozpoznání antigenů. Karboxyterminální část každého řetězce definuje konstantní oblast, primárně odpovědnou za efektorovou funkci.

Lehké řetězce se klasifikují jako bud kappa κ nebo lambda λ. Těžké řetězce se klasifikují jako gamma y, mí μ, alfa ot, delta δ nebo epsilon ε a definují isotyp protilátky jako IgG, IgM, IgA, IgD, resp. IgE. Uvnitř lehkého a těžkého řetězce jsou variabilní a konstantní oblasti spojeny oblastí J s asi 12 nebo více aminokyselinami, přičemž těžký řetězec dále zahrnuje oblast D s asi 10 nebo více aminokyselinami. Obecně viz Fundamental Inununology (ed. Paul, W. 2. vyd., Raven Press, N.Y., 1989), kap. 7 (zde zahrnuto jako celek formou odkazu pro všechny účely).

Variabilní oblasti každé dvojice lehkého a těžkého řetězce tvoří vazebné místo protilátky. Všechny řetězce vykazují stejnou obecnou strukturu s relativně Zachovalými úseky základní struktury (framework regions, FR) , spojenými třemi hypervarlabilními oblastmi, nazývanými rovněž oblasti určující komplementaritu (complementarity determining regions, CDR). CDR z obou řetězců každé dvojice jsou navzájem přiřazeny pomocí úseků základní struktury, což umožňuje vazbu na specifický epitop. Zbytky CDR a FR se zobrazují podle standardní definice sekvencí podle Kabata a d. Alternativní strukturní definice byla navržena Chothiou ad., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987); Nátuře 342:878-883 1989) a J. Mol. Biol. 196:651-663 (1989) (dále zde kolektivně uváděno jako Chothia a d. a zahrnuto jako celek formou odkazu pro všechny účely).

B, Vazebná speoificita a afinita

Imunoglobuliny (nebo protilátky) podle vynálezu selektivně vážou funkční epitop na P-selektinu, spojovaný s odpovědí na poranění a zánět tkáně. Vazba protilátek na funkční epitop na P-selektinu obvykle účinně inhibuje adhesi leukocytú k aktivovaným destičkám a/nebo k aktivovanému vaskulárnímu endothelu in vivo. Protilátky vykazující tuto vlastnost se označují jako blokující protilátky. Přednostní blokující protilátky zhoršují adhesi leukocytú k aktivovanému vaskulárnímu endothelu, a tak zamezují nebo inhibují zánětlivé nebo thrombotické stavy.

Mnohé blokující protilátky podle vynálezu soutěží při specifické vazbě na P-selektin s příkladnou protilátkou, označenou mu MAb PB1.3. Hybridom, produkující protilátku mu MAb PB1.3, byl podle Budapešťské smlouvy uložen u American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, pod přírůstkovým číslem HB11041. Produkce této monoklonální protilátky je popsána v příkladu 1. Další blokující protilátky podle vynálezu soutěží s druhou příkladnou protilátkou, označenou 84/26.

Kompetitivní navazování se sleduje testem, při němž zkoumaný imunoglobulin inhibuje specifickou vazbu referenční protilátky (například mu MAb PB1.3) na antigenní determinantu na molekule P-selektinu. Jsou známy různé typy testů kompetitivní vazby, například přímá nebo nepřímá radioimunoanalýza v pevné fázi (RIA), přímá nebo nepřímá enzymová imunoanalýza v pevné fázi (EIA), sendvičová kompetitivní analýza (viz Stáhli a d., Methods in Enzymology 9:242-253 (1983)), přímá EIA biotin-avidin v pevné fázi (viz Kirkland a d., J. Immunol. 137:3614-3619 (1966)), přímá značená analýza v pevné fázi, přímá značená sendvičová analýza v pevné fázi (viz Harlow a Lané, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1988)), přímá značená RIA v pevné fázi se značením 1-125 (viz Morel a d., Molec. Immunol. 25(1):7-15 (1988)), přímá EIA biotin-avidin v pevné fázi (Cheung a d., Virology 176:546-552 (1990)) a přímá značená RIA (Moldenhauer a d., Scand. J. Immunol. 32:77-82 (1990)). V popsaných testech se typicky používá čištěný Pselektin nebo buňky nesoucí P-selektin vázané na pevný povrch, neznačený testovaný imunoglobulin a značený referenční imunoglobulin. Kompetitivní inhibice se měří stanovením množství značeného materiálu, navázaného na pevný povrch v přítomnosti testovaného imunoglobulinu. Testovaný imunoglobulin je obvykle přítomen v přebytku. Příklad vhodného testu kompetitivní vazby je uveden v příkladu 8. Protilátky, identifikované kompetitivním testem (konkurenční protilátky), zahrnují protilátky vážící se na stejný epitop jako referenční protilátka a protilátky vážící se na přilehlý epitop dostatečně blízký k epitopu, vázanému referenční protilátkou, aby mohlo dojít ke sterické zábraně. Je-li konkurenční protilátka přítomna v přebytku, obvykle inhibuje specifickou vazbu referenční protilátky na P-selektin o alespoň 10, 25, 50 nebo 75 %.

Epitop vázaný mu MAb PB1.3 byl mapován k epitopu mezi aminokyselinami 448 a 467 lidského P-selektinu, viz obr. 34 a Johnson a d., Cell 56:1033-1044 (1989); zahrnulo zde jako celek formou odkazu pro všechny případy. Epitop se objevuje v páté doméně CRP P-selektinu, viz obr. 30. Protilátky, které soutěží s mu MAb PB1.3, se obvykle vážou na segment aminokyselin mezi polohami 448 a 467 nebo na jiný segment uvnitř páté domény CRP.

Vazebná specificita mnoha blokujících protilátek podle vynálezu je dále definována jejich schopností vázat Pselektin v úplné nebo podstatné nepřítomnosti Ca²⁺ (například v přítomnosti 25 mM EDTA (chelatační prostředek pro vápník) a nepřítomnosti Ca²⁺ v testu in vitro) . Protilátky, vyžadující pro blokování aktivity kofaktor Ca²⁺, nemusejí být účinné za podmínek in vivo, je-li očekávána fluktuace hladiny Ca²⁺.

Protilátky, které soutěží s protilátkou mu MAb PB1.3, jsou dále charakterizovány zjištěním, že jejich schopnost specificky se vázat na P-selektin, není inhibována fragmentem P-selektinu se sekvencí aminokyselin CQNRYTDLVAIQNKNE. Molární přebytek tohoto fragmentu obvykle inbihuje specifickou vazbu takových protilátek o méně než 5 %. Mu MAb PB1.3 a konkurenční protilátky jsou takto odlišeny od popsaných myších protilátek označených Gl, G2 a G3 (Geng a d., The Journal of Biological Chemistry 266:22313-22318 (1981)), jejichž vazba na P-selektin je výše uvedeným peptidem částečně nebo zcela blokována.

Některé protilátky podle vynálezu jsou dále charakterizovány schopností selektivně inhibovat některé Pselektinem zprostředkované odpovědi a ostatní ponechat nezhoršené. Například některé protilátky jsou schopny blokovat specifickou vazbu neutrofilů na aktivované endotheliální buňky in vivo bez inhibice agregace destiček. Takového protilátky jsou zvlášt vhodné k léčbě zánětlivých poruch bez zhoršení schopnosti pacienta iniciovat odpověď na stavy (například poranění), kde je agregace destiček žádoucí.

Protilátky podle vynálezu obvykle vykazují specifickou vazebnou afinitu k P-selektinu alespoň ΙΟ⁷, 10^θ, 10⁹ nebo

10¹⁰ M¹. Horní hranice vazebné afinity protilátek proti Pselektinu je obvykle v rozmezí asi troj-, pěti- nebo desetinásobku této hodnoty pro mu MAb PB1.3. Spodní hranice vazebné afinity je rovněž v rozmezí asi troj-, pěti- nebo desetinásobku této hodnoty pro mu MAb PB1.3. Výraz asi v tomto kontextu zahrnuje malý stupeň experimentální chyby, která může typicky nastat při měření vazebné afinity.

II, Výroba imunoglobulinu

A, Protilátky jiné než lidské

Výroba jiných než lidských monoklonálních protilátek, například myších, lagomorfa, koňských, je známa a je možno ji provádět například imunizací zvířete přípravkem obsahujícím buňky nesoucí P-selektin (například thrombinem aktivované destičky), izolované molekuly P-selektinu nebo jejich fragmenty, jako jsou extracelulární domény. Buňky produkující protilátku, získané z imunizovaných zvířat, se usmrtí a podrobí screeningu nebo nejprve podrobí screeningu na produkci protilátky, která se váže na P-selektin, a pak usmrtí, viz výše Harlow w Lané. Alternativně je možno produkovat populace v podstatě monospecifických protilátek chromatografickým čištěním polyklonálních sér.

B, Lidské ptbti látky , ,pi<?t i ...Β.-sělektinu

V jiném aspektu jsou předmětem vynálezu lidské protilátky proti P-selektinu. Některé lidské protilátky se vybírají pomocí testu kompetitivní vazby nebo jiným způsobem tak, aby měly stejnou epitopovou specificitu jako konkrétní myší protilátka, například mu MAb PB1.3. Takové protilátky jsou zvlášt náchylné ke sdílení užitečných terapeutických vlastností, demonstrovaných pro mu MAb PB1.3. Lidské protilátky proti P-selektinu je možno vyrábět tak, že se knihovna DNA z lidských B buněk podrobí screeningu podle obecného protokolu, navrženého Husem a d., Science 246:12751281 (1989). Vyberou se protilátky, vážící se na P-selektin nebo jeho fragment. Sekvence kódující tyto protilátky (nebo vazebné fragmenty) se pak klonují a amplifikují. Účinnost

Huseova protokolu je možno zvýšit v kombinaci s technologií zobrazování fágů, viz například Dower a d., WO 91/17271, a McCafferty ad., WO 92/01047 (kteréžto dokumenty jsou zde jako celky zahrnuty formou odkazu pro všechny účely). Při těchto postupech se vyrobí knihovny fágú, v nichž členové vykazují na vnějších površích různé protilátky. Protilátky se obvykle zobrazují jako fragmenty Fv nebo Fab. Fágy, zobrazující protilátky s požadovanou specificitou, se vyberou afinitním obohacením na polypeptid P-selektinu nebo jeho fragment.

Při obměně postupu zobrazování fágů je možno vyrábět lidské protilátky, mající vazebnou specificitu zvolené myší protilátky, viz Winter, WO 92/20791. Při tomto postupu se jako výchozí materiál použije variabilní oblast bud těžkého nebo lehkého řetězce zvolené myší protilátky (například mu MAb PBI.3). Jestliže se jako výchozí materiál zvolí například variabilní oblast lehkého řetězce, konstruuje se knihovna fágů, jejíž členové zobrazují stejnou variabilní oblast lehkého řetězce (tj. myšího výchozího materiálu) a odlišnou variabilní oblast těžkého řetězce. Variabilní oblasti těžkého řetězce se získají z knihovny přeskupených variabilních oblastí lidského těžkého řetězce. Vybere se fág, vykazující silnou specifickou vazbu na P-selektin (například alespoň 10θ a přednostně alespoň 10⁹ M'¹). Variabilní oblast lidského těžkého řetězce z tohoto fága pak slouží jako výchozí materiál pro konstrukci další fágové knihovny. V této knihovně každý fág zobrazuje tutéž variabilní oblast těžkého řetězce (tj. oblast identifikovanou z první zobrazovací knihovny) a odlišnou variabilní oblast lehkého řetězce. Variabilní oblasti lehkého řetězce se získají z knihovny přeskupených variabilních oblastí lidského lehkého řetězce. Opět se vyberou fágy, vykazující silnou specifickou vazbu na L-selektin. Tyto fágy vykazují variabilní oblasti kompletně lidských anti-P-selektinových protilátek. Tyto protilátky mají obvykle stejnou nebo podobnou epitopovou speciíicitu jako výchozí myší materiál (například mu MAb PB1.3).

C, Humanizované protilátky

Vynález poskytuje humanizované imunoglobuliny, mající úsek základní struktury variabilní oblasti v podstatě z lidského imunoglobulinu (nazývaného akceptorový imunoglobulin) a oblasti určující komplementaritu v podstatě z myšího imunoglobulinu s označením mu MAb PB1.3 (nazývaného donorový imunoglobulin). Konstantní oblasti, jsou-li přítomny, jsou rovněž v podstatě z lidského imunoglobulinu. Humanizované protilátky podle vynálezu nabízejí několik výhod oproti myší donorové protilátce, které již byly prokázány na zvířecích modelech:

1) Lidský imunitní systém by neměl rozpoznávat úsek základní struktury nebo konstantní oblast humanizované protilátky jako cizí, a tudíž by odpověd protilátek proti injekci takové protilátky měla být menší než proti zcela cizí myší protilátce nebo částečně cizí chimérické protilátce.

2) Protože efektorová část humanizované protilátky je lidská, může lépe interagovat s s ostatními částmi lidského imunitního systému.

3) Bylo popsáno, že injekčně vpravené myší protilátky mají v lidském oběhu poločas mnohem kratší než je poločas normálních lidských protilátek (Shaw a d., J. Immunol. 138:4534-4538 (1987)). Injekčně vpravené humanizované protilátky mají poločas v podstatě ekvivalentní přirozeně se vyskytujícím lidským protilátkám, což umožňuje menší a méně časté dávky.

(1) Klonování a sekvenování variabilních oblasti mu MAb

EBl ,,3„

Klonování a sekvenování cDNA, kódující variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce protilátky mu MAb PB1.3, je popsáno v příkladu 10 a sekvence nukleotidů a předpokládané sekvence aminokyselin jsou uvedeny na obr. 11 a 12. Tabulky 1 a 2 ilustrují rozdělení kódující sekvence aminokyselin do úseků základní struktury a domén určujících komplementaritu. Od N-terminálního k C-terminálnímu konci obsahují lehký i těžký řetězec domény FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 a FR4. Přidělení aminokyselin do jednotlivých domén je v souladu s konvencí o číslování podle Kabata ad., viz výše.

Í2I... .Výběr.....li.dskýgh..pr.Qfcilátek k získání zbytků základní struktury

Substituce myších CDR do základní struktury lidské variabilní oblasti bude mít velmi pravděpodobně za následek uchování jejich správné prostorové orientace, jestliže základní struktura lidské variabilní oblasti přijme stejnou nebo podobnou konformaci, jakou má myší základní variabilní struktura, z níž CDR pochází. Toto se dosahuje tak, že se lidské variabilní oblasti získávají z lidských protilátek, jejichž sekvence základní struktury vykazují vysoký stupeň sekvenční identity se strukturou myších variabilních oblastí, od nichž byly CDR odvozeny. Úseky struktury variabilních oblastí těžkého a lehkého řetězce mohou být odvozeny od stejných nebo podobných sekvencí lidských protilátek. Sekvence lidských protilátek mohou být sekvence přirozeně se vyskytujících lidských protilátek nebo může jít o souhlasné sekvence několika lidských protilátek, viz Kettleborough a d., Protein Engineering 4:773 (1991), Kolbinger a d., Protein Engineering 6:971 (1993).

Vhodné sekvence lidských protilátek se identifikují komputerovým porovnáním sekvencí aminokyselin myších variabilních oblastí se sekvencemi známých lidských protilátek. Porovnání se provádí odděleně pro těžký a lehký řetězec, ale princip je pro oba podobný. Tímto porovnáním se zjišťuje, že lehký řetězec mu MAb PB1.3 vykazuje největší sekvenční identitu s lidskými lehkými řetězci subtypu κ-l a že těžký řetězec mu PB1.3 vykazuje největší sekvenční identitu s lidskými těžkými řetězci subtypu 1, definovaného Rabatem a d., viz výše. Úseky základní struktury lehkého a těžkého lidského řetězce se tedy obvykle odvozují od lidských protilátek těchto subtypu nebo ze souhlasných sekvencí takovýchto subtypů. Přednostní variabilní oblasti lidského těžkého a lehkého řetězce, vykazující největší sekvenční identitu s odpovídajícími oblastmi z mu MAb PB1.3, jsou z protilátek 21/28'CL, resp. DEN.

(3) Počítačové modelování

Nepřirozené umístění myších oblastí CDR vedle základní struktury lidské variabilní oblasti muže mít za následek nepřirozená konformační omezení, která, pokud se neopraví substitucí určitých aminokyselinových zbytků, vedou ke ztrátě vazebné afinity. Výběr aminokyselinových zbytků pro substituci je částečně určován počítačovým modelováním. Počítačové hardware a software k vytvoření trojrozměrných obrazů imunoglobulínových molekul je široce dostupné. Molekulové modely se obecně vytvářejí na základě vyřešených struktur iraunglobulinových řetězců a jejich domén. Řetězce, které se mají modelovat, se porovnávají z hlediska podobnosti aminokyselinové sekvence s řetězci nebo doménami vyřešených trojrozměrných struktur a řetězce nebo domény vykazující největší sekvenční podobnost se volí jako výchozí body pro konstrukci molekulárního modelu, například v případě lehkého řetězce mu MAb PB1.3 byl výchozím bodem pro modelování lidský lehký řetězec DEN. Vyřešené výchozí struktury se modifikují tak, aby umožnily rozdíly mezi skutečnými aminokyselinami v modelovaných řetězcích nebo doménách imunoglobulinu a aminokyselinami ve výchozí struktuře. Modifikované struktury se pak sestaví do složeného imunoglobulinu. Nakonec se model dočištuje z hlediska minimalizace energie a ověření, zda všechny atomy jsou navzájem ve správných vzdálenostech a zda délky vazeb a úhly jsou v chemicky přijatelných mezích. Takovýto model pak může sloužit jako výchozí bod pro předpověď trojrozměrné struktury protilátky obsahující oblasti určující komplementaritu mu MAb PB1.3, substituované do lidských základních struktur. Je možno konstruovat další modely, reprezentující strukturu při zavedení dále popsaných dalších substitucí aminokyselin.

(4) Substituce aminokyselinových zbytku

Jak výše uvedeno, humanizované protilátky podle vynálezu zahrnují základní strukturu variabilních oblastí v podstatě z lidského imunoglobulinu a oblasti určující komplementaritu v podstatě z myšího imunoglobulinu s označením mu MAb PB1.3. Po identifikaci oblastí určujících komplementaritu mu MAb PB1.3 a příslušných lidských akceptorových imunoglobulinů je dalším krokem určení, zda a které zbytky z těchto komponent mají být pro optimalizaci vlastností získané protilátky. Substituce lidských aminokyselinových zbytků myšími by obecně měla být minimalizována, protože zavedení myších zbytků zvyšuje riziko, že protilátka vyvolá u člověka

Aminokyseliny pro substituci se volí na možného vlivu na konformaci CDR a/nebo vazbu k antigenů. Vyšetřování těchto možných vlivů se provádí modelováním, zkoumáním charakteristik aminokyselin v jednotlivých polohách nebo empirickým pozorováním účinku substituce nebo mutagenese jednotlivých aminokyselin.

substituovány humanizované odpověď HAMA. základě jejich

Pokud se aminokyselina liší mezi základní strukturou variabilní oblasti mu MAb PB1.3 a ekvivalentní lidskou základní strukturou variabilní oblasti, měla by být aminokyselina lidské základní struktury substituovány ekvivalentní myší aminokyselinou obvykle tehdy, je-li možno odůvodněně předpokládat, že tato aminokyselina:

(1) nekovalentně váže antigen přímo (například aminokyseliny v polohách Hl, H2 a L60 mu MAb PB1.3), (2) sousedí s oblastí CDR, je částí oblasti CDR podle alternativní definice, navržené výše citovaným Chothiou a d., nebo jinak interaguje s oblastí CDR (například je ve vzdálenosti do asi 3 angstróm od oblasti CDR) (například H7 3 mu MAb PB1.3, tabulky 1 a3), nebo (3) participuje na rozhraní Vl-V_h.

Dalšími kandidáty substituce jsou aminokyseliny akceptorové lidské základní struktury, které jsou pro lidský imunoglobulin v této poloze neobvyklé. Tyto aminokyseliny mohou být substituovány aminokyselinami z ekvivalentních poloh typičtějších lidských imunoglobulinů. Alternativně mohou být aminokyseliny z ekvivalentních poloh mu MAb PB1.3 zavedeny do lidských oblastí základní struktury, jsou-li takové aminokyseliny typické pro lidský imunoglobulin v ekvivalentních polohách.

Obecně je substituce všech nebo většiny aminokyselin, splňujících uvedená kriteria, žádoucí. V některých případech však panuje určitá nejednoznačnost v tom, zda konkrétní aminokyselina tato kriteria splňuje, a vytvoří se alternativní variantní imunoglobu1iny, z nichž jeden tuto konkrétní substituci má a druhý ne. Jako příklad uvedená humanizovaná protilátka, označovaná jako přetvořený MAb PB1.3 (HgLg), překvapivě obsahuje pouze jednu substituci zbytků základní struktury variabilní oblasti lidského těžkého řetězce a pouze dvě substituce zbytků základní struktury variabilní oblasti lidského lehkého řetězce, a přesto vykazuje v podstatě podobnou (v rozsahu faktoru dvě) vazebnou aktivitu jako myší nebo chimérická protilátka s intaktními myšími variabilními oblastmi, fúzovanými k lidské konstantní oblasti (s označením chi MAb PB1.3).

Některé humanizované protilátky podle vynálezu obsahují substituci zbytku základní struktury lidského lehkého řetězce odpovídajícím zbytkem mu MAb PB1.3 v alespoň 1, 2 nebo 3 a někdy 4 z těchto poloh: L21, L46, L60 a L70 (viz tabulky 2 a

4) . Některé humanizované protilátky obvykle obsahují substituci zbytku základní struktury lidského těžkého řetězce v alespoň 1, 2 nebo 3 a někdy 4 z těchto poloh: Hl, H2 a H71 a H73 (viz tabulky 1 a 3). Mnohé humanizované protilátky obsahují substituce základní struktury variabilní oblasti jak lehkého, tak těžkého řetězce. Přednostní protilátky obsahují substituci zbytku základní struktury lidského těžkého řetězce alespoň v poloze H71 a substituce zbytků základní struktury lidského lehkého řetězce alespoň v polohách 21 a 46.

Oblasti CDR v humanizovaných protilátkách jsou obvykle v podstatě identické a častěji identické s odpovídajícími oblastmi CDR v protilátce mu MAb PB1.3. I když to obvykle není žádoucí, je někdy možné provést jednu nebo více konzervativních substitucí aminokyselin ve zbytcích CDR bez zjistitelného ovlivnění vazebné afinity výsledného humanizovaného imunoglobulinu. V některých případech může substituce oblastí CDR vést ke zvýšené vazebné afinitě.

Kromě výše uvedených konkrétních substitucí aminokyselin jsou oblasti základní struktury humanizovaných imunoglobulinů obvykle v podstatě identické a často identické s oblastmi základní struktury lidských protilátek, z nichž byly odvozeny. Mnohé z aminokyselin v oblasti základní struktury ovšem mají malý nebo nemají žádný přímý příspěvek ke specificitě nebo afinitě protilátky. Je tedy možno tolerovat mnohé jednotlivé konzervativní substituce zbytků základní struktury bez pozorovatelné změny specificity nebo afinity výsledného humanizovaného imunoglobulinu. Obecně jsou však tyto substituce nežádoucí.

Přednostní inserčních (5) Produkce variabilních oblasti

Poté, co byly definovány a vybrány komponenty oblastí CDR a základní struktury humanizovaných imunoglobulinů, jsou k dispozici různé metody výroby takovýchto imunoglobulinů. V důsledku degenerace kódu je každá aminokyselinová sekvence imunoglobulinů kódována několika různými sekvencemi nukleových kyselin. Požadované sekvence nukleových kyselin je možno vyrobit novou syntézou DNA v pevné fázi nebo mutagenesí PCR dříve připravené varianty požadovaného nukleotidu.

metodou přípravy substitučních, delečních a variant DNA cílového polypeptidu je oligonukleotidově zprostředkovaná mutagenese, viz Adelman a d., DNA 2:183 (1983). Stručně je ji možno popsat tak, že DNA cílového polypeptidu se pozmění hybridizací oligonukleotidu, kódujícího požadovanou mutaci, k templátu jednořetězcové DNA. Po hybridizací ee použije DNA polymerasa k syntéze celého druhého komplementárního řetězce templátu, který zahrnuje oligonukleotidový primer a kóduje zvolenou alteraci DNA cílového polypeptidu.

(6.) Výkéi .-kgns.k3.n

Variabilní segmenty humanizovaných protilátek, vyrobené výše popsaným způsobem, se v typickém případě napojí k alespoň části konstantní oblasti imunoglobulinů (Fc), typicky lidského imunoglobulinů. Sekvence DNA lidské konstantní oblasti je možno izolovat známými postupy z různých lidských buněk, ale přednostně z usmrcených B-buněk (viz výše Kabat a d. a WO 87/02671; oba tyto dokumenty jsou zde ve svém celku zahrnuty formou odkazu pro všechny účely). Protilátka pak obvykle bude obsahovat konstantní oblasti lehkého i těžkého řetězce. Konstantní oblast těžkého řetězce obvykle obsahuje oblasti CH1, pantovou oblast, CH2, CH3 a CH4.

Humanizované protilátky zahrnují protilátky mající všechny typy konstantních oblastí včetně IgM, IgG, IgD, IgA a

IgE a kteréhokoli isotypu včetně IgGl, IgG2, IgG3 a IgG4. Požaduje-li se, aby humanizovaná protilátka vykazovala cytotoxickou aktivitu, jedná se v případě konstantní domény obvykle o konstantní doménu fixující komplement a typicky o třídu IgG^. Pokud cytotoxická aktivita není žádoucí, může být konstantní doména třídy IgG4. Humanizovaná protilátka může obsahovat sekvence z více než jedné třídy nebo isotypu.

(7) Expresní systémy

Nukleové kyseliny, kódující variabilní oblasti humanizovaného lehkého a těžkého řetězce, popřípadě spojené s konstantními oblastmi, se vkládají do expresních vektorů. Lehký a těžký řetězec může být klonován ve stejném nebo odlišném expresním vektoru. Segmenty DNA, kódující řetězce imunoglobulinu, jsou operativně navázány ke kontrolním sekvencím v expresních vektorech, které zajišťují expresi imunoglobulínových polypeptidů. Tyto kontrolní sekvence zahrnují signální sekvenci, promotor, zesilovač transkripce a terminační sekvenci transkripce. Expresní vektory jsou typicky replikovatelné v hostitelských organismech bud jako epizoray nebo jako integrální část chromozomální DNA hostitele. Expresní vektory běžně obsahují selekční markéry, například tetracyklin nebo neomycin, aby bylo možno detekovat tyto buňky transformované požadovanými sekvencemi DNA (viz například patent US 4,7 04.362) .

Jedním z prokaryotických hostitelů, zvlášť vhodných pro klonování polynukleotidů podle vynálezu, je E. coli. Další použitelní mikrobiální hostitelé zahrnují bacily, jako je Bacillus subtilis, a další enterobakterie, jako je Salmonella, Serratia, a různé druhy Pseudomonas. V těchto prokaryotických hostitelích je rovněž možno produkovat expresní vektory, které budou typicky obsahovat kontrolní sekvence kompatibilní s hostitelskou buňkou (například počátek replikace). Kromě toho bude přítomen velký počet různých známých promotorů, jako je laktózový promotorový systém, tryptofanový (trp) promotorový systém, β-laktamasový promotorový systém nebo promotorový systém z fága λ. Promotory typicky budou kontrolovat expresi, popřípadě s operátorovu sekvencí, a budou mít sekvence ribosomových vazebných míst apod. pro iniciaci a dokončení transkripce a translace.

K expresi je možno použít i jiných mikrobu, například kvasinek. Přednostním hostitelem je Saccharomyces podle potřeby s vhodnými vektory majícími expresní kontrolní sekvence, jako promotory včetně 3 -fosfoglyceratkinasy nebo jiných glykolytických enzymů, a počátek replikace, terminační sekvence apod.

Kromě mikroorganismů je možno k expresi a produkci polypeptidů podle vynálezu použít buněčnou kulturu savčí tkáně (viz Winnacker, From Genes to Clones (VCH Publishers, N.Y., N.Y., 1987)). V současnosti jsou preferovány eukaryotické buňky, poněvadž bylo vyvinuto velké množství vhodných hostitelských buněčných linií, schopných sekrece intaktního imunoglobulinu. Přednostní hostitelské buňky pro expresi nukleových kyselin, kódujících imunoglobuliny podle vynálezu, zahrnují: linii CVI opičí ledviny transformovanou SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), linii lidské embryonální ledviny (293) (Graham ad., J. Gen. Virol. 36:59 (1977)), ledvinné buňky křeččího mláděte (BHK, ATCC CCL 10), DHFR ovariální buňky čínského křečka (CHO, Urlaub a Chasin, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 77:4216 (1980)), myší Sertoliho buňky (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)), opičí ledvinné buňky (CVI ATCC CCL 7 0) . ledvinné buňky african green monkey (VERO-76, ATCC CRL 1587), buňky lidského cervikálního karcinomu (HELA, ATCC CCL 2), psí ledvinné buňky (MDCK, ATCC CCL 34), jaterní buňky buffalo rat (BRL 3A, ATCC CRL 1442), lidské plicní buňky (W138, ATCC CCL 75), lidské jaterní buňky (Hep G2, HB 8065), myší tumor mléčné žlázy (MMT 060562, ATCC

CCL 51) a buňky TRI (Mather a d., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-46 (1982)), buňky baculoviru.

j iné buněčné fosforečnanem Sambrook a d.,

Vektory, obsahující příslušné polynukleotidové sekvence (například sekvence kódující těžký a lehký řetězec a expresní kontrolní sekvence), mohou být do hostitelské buňky přeneseny známými metodami, které se liší v závislosti na typu buněčného hostitele. Například pro prokaryotické buňky se běžně používá transfekce chloridem vápenatým, zatímco pro hostitele je možno použít zpracování vápenatým nebo elektroporaci (obecně viz Molecular Cloning: A Labora tory Manual (Cold

Spring Harbor Press, 2. vyd., 1989; zahrnuto zde jako celek formou odkazu pro všechny účely). Pokud se těžký a lehký řetězec klonují na oddělených expresních vektorech, pak se vektory kotransfikují k získání exprese a sestavení Po zavedení rekombinaění DNA se buněčných linií exprimujících imunoglobulínové produkty. Preferují se buněčné linie schopné stabilní exprese (tj. nesnížená hladina exprese po padesáti pasážích buněčné linie).

intaktních imunoglobulinů. provede buněčná selekce

Jakmile jsou expriraovány, mohou být celé protilátky, jejich dimery, jednotlivé lehké a těžké řetězce nebo jiné formy imunoglobulinů podle vynálezu čištěny standardními známými metodami, zahrnujícími srážení síranem amonným, afinitní kolony, sloupcovou chromatografií, gelovou elektroforézu apod. (obecně viz Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag, N.Y., 1982). Pro farmaceutické použití jsou preferovány v podstatě čisté imunoglobuliny o homogenitě alespoň asi 90 až 95 % a zvláště preferovány o homogenitě 98 až 99 % nebo více.

Výše popsané techniky iekombinnce mohou být použity také pro expresi nativních sekvencí, kódujících lidské nebo myší protilátky. Tento přístup je zvlášt výhodný pro expresi lidských protilátek, které se izolují jako nestabilní buněčné linie.

imunoglobu1inů. Například získán z molekuly IgG

III, Fragmenty protilátek

V jiném provedení jsou předmětem vynálezu výše uvedené fragmenty intaktních protilátek. Tyto fragmenty typicky soutěží s intaktní protilátkou, z níž byly odvozeny, o specifickou vazbu na P-selektin a vážou se s afinitou alespoň ΙΟ⁷, ΙΟ⁸* 10⁹ nebo 10¹⁰ M'¹. Fragmenty protilátek zahrnují

Fab, Fab' F(ab*)2* Fabc ^a Fv oddělených těžkých a lehkých řetězců. Fragmenty je možno získat enzymatickou nebo chemickou separací intaktních fragment F(ab')2 může být proteolytickou digescí s pepsinem při pH 3,0 až 3,5 pomocí standardních metod, jaké jsou například popsány v Harlow a Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Pubs., N.Y. (1988). Fragmenty Fab je možno získat z fragmentů F(ab’)2 omezenou redukcí nebo z celých protilátek digescí s papainem v přítomnosti redukčních činidel (víz tamtéž). Fragmenty je možno vyrobit rovněž technikami rekombinace DNA. Segmenty nukleových kyselin, kódující zvolené fragmenty, se získají digescí plné délky kódujících sekvencí restrikčními enzymy nebo novou syntézou. Fragmenty se často exprimují ve formě fúzních proteinů s fágovým pláštěm. Tento způsob exprese je výhodný pro zostření afinity protilátek, popsané v oddílu IV.

IV... Pr cti látky se zcstžencu. afinitan

V mnohých výše popsaných imunoglobulinech je možno provádět nekritické substituce, adice nebo delece aminokyselin jak ve variabilních, tak v konstantních oblastech beze ztráty vazebné specificity nebo efektorových funkcí nebo netolerovatelného snížení vazebné afinity (tj. pod 10⁷ M'¹). Imunoglobu1iny, v nichž byly provedeny takovéto změny, obvykle vykazují podstatnou sekvenční identitu s referenčním imunoglobulinem, z něhož byly odvozeny. V některých případech je možno selekcí získat mutovaný imunoglobulin se stejnou specificitou a zvýšenou afinitou ve srovnání s referenčním imunoglobulinem, z něhož byl odvozen. Technologie zobrazování fágů nabízí účinné techniky selekce takových imunoglobulinů, viz například Dower a d., WO 91/17271, McCafferty ad., WO 92/01047, a Huse, WO 92/06204. SL-Hybt i dn í pí ftfciláfcky

Vynález poskytuje rovněž hybridní protilátky, které sdílejí specificitu blokujících protilátek proti P-selektinu, ale jsou schopny se specificky vázat také na druhou jednotku. V těchto hybridních protilátkách je obvykle jedna dvojice těžkého a lehkého řetězce z anti-P-selektinové protilátky a druhá dvojice z protilátky působící proti jinému epitopu. Z toho vyplývá multifunkční valence, tj. schopnost vázat se na alespoň dva různé epitopy současně, přičemž alespoň jedním epitopem je epitop, k němuž se váže protilátka blokující Pselektin. Takovéto hybridy je možno vytvářet fúzí hybridomu, produkujících odpovídající jednotlivé protilátky, nebo rekombinačníroi technikami.

Imunoglobu1iny je rovněž možno fúzovat k funkčním oblastem z jiných genů (například enzymů) a získávat tak fúzní proteiny (například imunotoxiny) s novými vlastnostmi. VI, Nukleové kyseliny

Intaktní protilátky a fragmenty protilátek, popsané výše, se často získávají expresí nukleových kyselin. Všechny nukleové kyseliny, kódující kteroukoli protilátku nebo protilátku popsanou v této přihlášce, jsou výslovně zahrnuty ve vynálezu. Modifikace nukleových kyselin je možno snadno provádět různými známými metodami, jako je místně řízená mutagenese (viz Gillman a Smith, Gene 8:81-97 (1979), a

Roberts a d., Nátuře 328:731-734 (1987)). Mnohé z nukleových kyselin podle vynálezu vykazují podstatnou sekvenční identitu s nukleovými kyselinami kódujícími těžký a lehký řetězec mu MAb PB1.3 nebo jeho humanizované deriváty, uvedené zde jako příklady.

VII, .Počítače

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu počítače, programované tak, aby zobrazovaly trojrozměrné obrazy protilátek na monitoru nebo tiskárně. Vhodná je například pracovní stanice Silicon Graphics IRIS 4D, pracující pod operačním systémem UNIX, s použitím molekulární modelovací sady QUANTA (Polygen Corp. USA). Počítače jsou vhodné ke znázornění modelů variant humanizovaných protilátek. Protilátky podle vynálezu obecně již poskytují uspokojivou vazebnou afinitu. Je však pravděpodobné, že dalšími obměnami určitých aminokyselinových zbytků je možno identifikovat protilátky s ještě silnější vazebnou afinitou. Pomocí trojrozměrného obrazu je možno identifikovat i mnoho nekritických aminokyselin, které mohou být předmětem konzervativních substitucí bez pozorovatelného ovlivnění vazebné afinity protilátky.

VIII, Produkce protilátek ve velkém měřítku

Pro produkci protilátek ve velkém měřítku se produkují stabilní buňky, obsahující v chromozomech vícečetné kopie genů, kódujících těžké a lehké řetězce imunoglobulinů. Vícečetné kopie se získají amplifikací izolovaných oblastí buněčné chromozomální DNA. Amplifikace se provádí pomocí selekčního prostředku, například methotrexátu (MTX), který inaktivuje buněčný enzym (například DHFR), který je nezbytný za určitých růstových podmínek. Amplifikací, tj. akumulací vícečetných kopií genu DHFR, se dosáhne produkce většího množství DHFR jako odpovědi na větší množství MTX. Amplifikační postup se aplikuje bez ohledu na přítomnost endogenní DHFR přídavkem ještě většího množství MTX k médiu. Amplifikace požadovaných genů (zde genů kódujících těžký a lehký řetězec imunoglobulinu) se dosáhne připojením každého genu ke kopii genu DHFR na stejném nebo odděleném plasmidů nebo plasmidech a kotransfekcí plasmidů nebo plasmidů. Amplifikací genu DHFR v odpověď na MTX dochází ke střídavému zvýšení počtu kopií požadovaných imunoglobulinových genů. Zvýšení počtu kopií požadovaných genů má za následek vyšší expresi požadovaného heterologního proteinu. Preferovány jsou stabilní buněčné linie, exprimující asi 10 až 100, 20 až 50 nebo asi 30 /tg humanizovaného imunoglobul inu na 10⁶ buněk za den.

IX.... Fr agmenty- P - se lekt inu

V dalším aspektu jsou předmětem vynálezu fragmenty Pselektinu. Fragmenty zahrnují aminokyseliny z páté regulační doména C3b-C4b P-selektinu (pátá CRP) . Fragmenty obsahují epitop vázaný protilátkou mu MAb PB1.3 a/nebo proximální epitopy vázané konkurenčními protilátkami. Fragmenty obvykle obsahují celkem až 5, 10, 20, 25, 50, 75, 100 nebo 200 aminokyselin. Většina fragmentů obsahuje některé nebo všechny aminokyseliny mezi polohami 448 a 467 sekvence lidského Pselektinu, znázorněné na obr. 34. Tyto aminokyseliny definují epitop, specificky vázaný protilátkou mu MAb PB1.3. V mnoha fragmentech je alespoň pět souvislých aminokyselin z oblasti mezi polohami 448 a 467 sekvence aminokyselin znázorněné na obr. 34. Jiné fragmenty obsahují celý souvislý segment aminokyselin mezi polohami 448 a 467. Některé fragmenty jsou tvořeny v podstatě tímto souvislým segmentem aminokyselin. V těchto fragmentech nejsou přítomny žádné jiné aminokyseliny, které přispívají k vazebné specificitě nebo afinitě fragmentu. Často nejsou přítomny Žádné jiné jakkoli popsatelné aminokyseliny.

Polypeptidové fragmenty podle vynálezu mají různá použití. Fragmenty jsou použitelné jako imunogeny pro tvorbu protilátek, které soutěží při specifické vazbě na P-selektin s mu MAb PB1.3. Použití definovaných fragmentů jako imunogenů snižuje rozsah screeningu nutného k izolaci protilátky s požadovanou specificitou. Polypeptidové fragmenty jsou použitelné rovněž při určitých dále popsaných diagnostických a terapeutických metodách. Některé fragmenty soutěží s celými molekulami P-selektinu při vazbě na aktivované neutrofily. Tyto fragmenty jsou tedy použitelné k boji s nemocemi a stavy imunitního systému, zprostředkovanými interakcemi P-selektinu s jeho ligandy na aktivovaných neutrofilech. Tyto fragmenty jsou rovněž použitelné k monitorování přítomnosti aktivovaných neutrofilů vazbou na ligandy pro P-selektin, přítomné na povrchu těchto buněk. Malá velikost fragmentů je činí zvlášt vhodnými pro účinné uvolňování po podání in vivo. Výlučně lidský původ fragmentů snižuje riziko vedlejších účinků, které by mohly nastat v případě některých prostředků. X, Terapeutické a diagnostické metody

Terapeutické metody používají protilátky (celé a vazebné fragmenty) a fragmenty P-selektinu, diskutované výše, jako terapeutické prostředky pro léčbu různých onemocnění. Terapeutické prostředky jsou vhodné pro profylaktické a terapeutické ošetření různých onemocnění a poruch imunitního systému. Tato onemocnění a poruchy zahrnují odhojení štěpu, reakci hostitele na štěp, autoimunitní onemocnění, jako je diabetes mellitus se závislostí na insulinu, roztroušená skleróza, stiff man syndrome, reumatická arthritis, myastenia gravis a lupus erythematosuB, a zánětlivé poruchy. Prostředky jsou vhodné rovněž pro prevenci metastáze tumorů inhibici adhese cirkulujících rakovinných buněk, jako jsou karcinomy kolonu a melanomy. Některé terapeutické prostředky fungují tak, že blokují nebo jinak antagonizují interakci molekuly P-selektinu s jejím ligandem. Jiné terapeutické prostředky fungují tak, že usmrcují buňky nesoucí polypeptid, proti němuž je prostředek směrován.

Terapeutické prostředky jsou zvlášť vhodné pro ošetřování zánětlivých a thrornbotických stavů včetně postischemického leukocyty zprostředkovaného poškození tkáně (reperfusní poškození) vznikajícího při traumatickém šoku, mrtvice, infarktu myokardu, akutního odmítnutí transplantace, omrzlin, compartment syndrome, a patofyziologických stavů spojených s kardio-pulmonárním bypassem, akutním poškozením plic zprostředkovaným leukocyty (například syndrom respirační nouze u dospělých), septickým šokem, sepsí spojenou s ránou po virové infekci, například virem herpes simplex, IGEzprostředkovanými alergickými reakcemi, jako je akutní fáze astmatické choroby, a chronických zánětlivých stavů včetně reumatické arthritidy, atopické dermatitidy a psoriasy.

Ischemie/reperfusní poškození je zánětlivý stav, ke kterému dochází při návratu průtoku krve do orgánů trpících obstrukcí přívodu způsobující ischeraii (zamezení přívodu kyslíku). Nedojde-li k rychlé úlevě reperfusí, způsobuje ischemie odumření okolních buněk a nakonec celého orgánu nebo smrt pacienta. Hromadící se důkazy však ukazují na to, že reperfuse samotná může působit zhoubně na okolní tkáň. Má se za to, že nepříznivé účinky reperfuse alespoň částečně vyplývají ze zánětlivé odpovědi, zprostředkované aktivovanými neutrofily v obnoveném krevním řečišti. Někteří pacienti mají ischemii celého těla, zatímco u jiných pacientů je ischemie omezena na konkrétní části nebo orgány těla. Pacient může například trpět epidermální, myokardiální, renální, cerebrální, splenickou, hepatickou, spinální, splanchnickou, pulmonární ischemii, částečnou tělesnou nebo celkovou tělesnou ischemii. Terapeutické prostředky podle vynálezu fungují tak, že antagonizují interakci takovýchto lymfocytů s P-selektinem.

Jednou z hlavních komponent akutních alergických stavů včetně astmatu je degranulace žírných buněk po expozici subjektů antigenům, na něž jsou specificky sensitivní.

Důsledky degranulace žírných buněk zahrnují bronchokonstriktorovou odpověd a také zánět1řvou odpověd, charakterizovanou zčásti akumulací leukocytú. Histamin, který je spolu s jinými mediátory zánětů obsažen v žírných buňkách, může vyvolávat expresi P-selektinu na vaskulárních endotheliálních buňkách, což ukazuje, že degranulace žírných buněk může vést také k expresi P-selektinu a následné akumulaci leukocytú. Protože degranulace žírných buněk je klíčovým elementem patogenese alergických stavů, může být podávání protilátek proti P-selektinu použitelné při léčbě lidských alergických stavů.

Způsoby jsou zvlášt vhodné pro lidské pacienty, ale mohou být aplikovány i na veterinární subjekty. Terapeutické metody se obvykle aplikují na orgány, přítomné v živém subjektu. Některé metody, jako je reperfusní terapie ischemie, jsou použitelné rovněž na oddělené orgány, jestliže tyto orgány čekají na transplantaci příjemci. Terapeutické metody mohou být prováděny i ex vivo.

Terapeutické prostředky a přípravky, cílené proti Pselektinu, mohou být rovněž používány v kombinaci s prostředky, cílenými proti jiným molekulám, zejména humanizovaným nebo lidským protilátkám reagujícím s odlišnými adhesními molekulami. Mezi vhodné imunoglobuliny patří imunoglobuliny specifické pro CDlla, CDllb, CD18, E-selektin, L-selektin a ICAM-1. Imunoglobuliny by se měly vázat na epitopy těchto adhesních molekul, aby inhibovaly vazbu leukocytú, zejména neutrofilů, na endotheliální buňky. Jinými vhodnými protilátkami pro použití v kombinační terapii jsou protilátky specifické pro lymfokiny, jako je IL-1, IL-2 a IFN-y a jejich receptory. Tyto protilátky slouží k blokování aktivace endotheliálních buněk, a tak brání jejich interakci s neutrofily v zánětlivé odpovědi.

Blokující protilátky proti P-selektinu a farmaceutické přípravky podle vynálezu jsou zvlášt vhodné pro parenterální podávání, tj . subkutánní, intramuskulární nebo intravenózní aplikaci. S ohledem na probíhající vývoj různých nových přístupů uvolňování léčiv jsou farmaceutické přípravky podle vynálezu vhodné rovněž pro aplikaci těmito novými metodami, viz Langer, Science 249:1527-1533 (1990).

Blokující protilátky proti P-selektinu mohou být přímo nebo nepřímo kombinovány s chemoterapeutickým prostředkem. Kombinace, která může být získána obecně známými prostředky, by neměla podstatně inhibovat schopnost imunoglobulinu vázat se na receptor ani podstatně snižovat aktivitu chemoterapeutického prostředku. Pro cílené použití je možno kombinovat různá chemoterapeutika. Například protizánětlivé prostředky, které mohou být kombinovány, zahrnují imunomodulátory, antagonisty faktoru aktivace destiček (PAF), inhibitory cyklooxygenasy, inhibitory lipoxygenasy a antagonisty leukotrienů. Některé přednostní jednotky zahrnují cyklosporin A, indomethacin, naproxen, FK-506, mykofenolovou kyselinu apod. Podobně jsou při léčbě reperfušního poškození vhodné antioxidanty, například superoxiddismutasa. Obdobně je možno pro cílenou aplikaci použít protirakovinné prostředky, jako je daunomycin, doxorubicin, vinblastin, bleomycin apod.

Cílení na P-selektin může být rovněž prováděno pomocí amfipatů čili molekul s dvojím charakterem (polárnínepolární), které existují ve vodném roztoku jako agregáty. Amfipaty zahrnují nepolární lipidy, polární lipidy, mono- a diglyceridy, sulfatidy, lysolecithin, fosfolipidy, saponin, žlučové kyseliny a soli. Tyto molekuly mohou existovat jako emulze a pěny, micely, nerozpustné monovrstvy, tekuté krystaly, fosfolipidové disperze a lamelární vrstvy. Všechny se zde obecně označují jako liposomy. V těchto přípravcích je léčivo, které má být uvolňováno, obsaženo ve formě části liposomu, v němž je zabudován imunoglobulin proti P41 selektinu. V tomto provedení nemusí imunoglobulin vázat funkční epitop na molekule P-selektinu, dokud imunoglobulin účinně zaciluje liposom k molekulám P-selektinu. Jsou-li liposomy přivedeny do blízkosti napadených buněk, uvolňují zvolené terapeutické přípravky.

Pro přípravu liposomů jsou k dispozici různé metody, popsané například v Szoka a d., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), patentech US 4,235.871, 4,501.728 a 4,837.028, které jsou zde zahrnuty formou odkazu. Cílení liposomů s použitím různých zacilovacích prostředků (například ligandů, receptorů a monoklonálních protilátek) je známo, viz například patenty US 4,957.773 a 4,603.044, které jsou zde zahrnuty formou odkazu. Je možno použít standardních metod k napojení zacilovacích prostředků k liposomům. Liposomy cílené protilátkami mohou být například konstruovány s použitím liposomů, které zahrnují protein A (viz Renneisen ad., J. Biol. Chem. 265:16337-16342 (1991) a Leonetti a d., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 87:2448-2451 (1980).

Farmaceutické přípravky pro parenterální aplikaci obvykle obsahují roztok terapeutického prostředku (například protilátky proti P-selektinu (intaktní nebo vazebný fragment nebo fragment P-selektinu)) nebo koktejl několika takových prostředků, rozpuštěných v přijatelném nosiči, přednostně vodném. Je možno použít různé vodné nosiče, například vodu, pufrovanou vodu, 0,4% salinický roztok, 0,3% glycin apod. Tyto roztoky jsou sterilní a obecně prosté částic. Tyto přípravky mohou být sterilizovány běžnými známými sterilizačními technikami. Přípravky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné látky, nutné k aproximaci fyziologických podmínek, jako jsou prostředky pro úpravu pH a pufry, prostředky pro úpravu tonicity apod., například acetát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, laktát sodný atd. Koncentrace protilátky v těchto formulacích se může velmi lišit, tj. například od méně než asi 0,5 %, obvykle od nebo alespoň asi 0,1 % do až 1,5 nebo 2,0 % Hm. a primárně se volí na základě objemu, viskozity tekutiny atd. v souladu s konkrétním zvoleným způsobem podávání. Současné metody přípravy parenterálně aplikovaných přípravků jsou odborníkům známy nebo zřejmé a podrobně jsou pospány například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. vyd., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1985), kterýžto dokument je zde zahrnut formou odkazu.

Protilátky podle vynálezu mohou být pro skladování lyofilizovány a před použitím rekonstituovány ve vhodném nosiči. Tato technika se ukázala jako účinná u běžných imunog1obulinů a je možno použít známých metod lyofilizace a rekonstituce. Lyofilizace a rekonstituce může vést k různému stupni ztráty aktivity protilátky (například u běžných imunoglobu1inů mají protilátky IgM tendenci k větší ztrátě aktivity než protilátky IgG) a může nastat nutnost kompenzace adjustací používané hladiny.

Přípravky obsahující protilátky podle vynálezu nebo jejich koktejl mohou být podávány při profylaktickém a/nebo terapeutickém ošetření. V terapeutické aplikaci se přípravky pacientovi podávají v množství dostatečném k vyléčení nebo alespoň částečnému zastavení infekce a jejích komplikací. Množství umožňující toho dosáhnout se definuje jako terapeuticky účinná dávka. Účinné množství v tomto případě bude záviset na vážnosti onemocnění a obecném stavu vlastního imunitního systému pacienta, ale obvykle se pohybuje od asi 0,05 do asi 5, přednostně mezi asi 0,2 a a si 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti.

Látky podle vynálezu jsou obecně použitelné při vážných chorobných stavech, tzn. v situacích ohrožujících nebo potenciálně ohrožujících život. V takových případech je s ohledem na minimalizaci vnějších látek a nižší pravděpodobnost odmítání cizích látek (například HAMA), dosahovanou lidskými nebo humanizovanými formami protilátek podle vynálezu, možné a může být ošetřujícím lékařem pocitováno jako žádoucí podávat tyto protilátky v podstatném přebytku.

V profylaktické aplikaci se přípravky obsahující protilátky podle vynálezu nebo jejich koktejl podávají pacientovi, který ještě není ve stavu choroby, ke zvýšení jeho odolnosti. Takové množství se definuje jako profylakticky účinná dávka. V tomto případě přesné množství opět závisí na zdravotním stavu pacienta a obecné hladině imunity, ale obecně je ve výše uvedených mezích.

Jednorázová nebo vícenásobná aplikace přípravků může být prováděna na základě stanovení velikosti dávky a schématu ošetřujícím lékařem. V každém případě by farmaceutické formulace měly poskytovat množství imunoglobulinu podle vynálezu, dostatečné k účinnému ošetření pacienta.

Protilátky podle vynálezu (celé a jejich vazebné fragmenty) a fragmenty P-selektinu mohou být rovněž používány pro diagnostické účely. Množství dostatečné pro tyto účely se definuje jako diagnosticky účinná dávka. Přesné množství při diagnostickém použití bude záviset na zdravotním stavu pacienta, způsobu aplikace apod. Protilátky mohou být bud značené nebo neznačené. Neznačené protilátky mohou být používány v kombinaci s dalšími značenými protilátkami (druhé protilátky), které s protilátkou reagují, jako jsou protilátky specifické pro konkrétní konstantní oblast imunoglobulinu. Alternativně mohou být protilátky značeny přímo. Mohou být používány různé druhy značení, jako jsou radionuklidy, fluorescery, enzymy, enzymové substráty, enzymové kofaktory, enzymové inhibitory, ligandy (zejména hapteny).

Protilátky (celé a vazebné fragmenty) jsou použitelné k detekci přítomnosti buněk nesoucích receptor P-selektinu.

Přítomnost těchto buněk diagnostikuje zánětlivý stav nebo onemocnění a může signalizovat nutnost zahájení výše popsané terapeutické metody. Diagnózu je možno provést po odebrání vzorku pacientovi. Pak se stanoví množství exprimovaného receptoru P-selektinu v jednotlivých buňkách vzorku, například imunohistochemickým barvením fixovaných buněk nebo westernovým přenosem buněčného extraktu s protilátkou podle vynálezu. Fragmenty P-selektinu jsou použitelné k monitorování přítomnosti aktivovaných neutrofilů, která může indikovat nežádoucí imunitní odpověd.

Diagnózu je možno provádět rovněž podáváním značené protilátky in vivo (přednostně humanizované nebo lidské protilátky) a detekcí zobrazováním in vivo. Koncentrace podávaného MAb by měla dostačovat k tomu, aby vazba na buňky, obsahující cílový antigen, byla detekovatelná oproti signálu pozadí. Diagnostické činidlo může být značeno radioisotopem pro zobrazování kamerou nebo paramagnetickým radioisotopem pro zobrazování magnetickou resonancí nebo elektronovou spinovou resonancí.

Změna (typicky zvýšení) hladiny proteinu P-selektinu v buněčném vzorku nebo v zobrazení jedince, která je mimo rozsah klinicky stanovených normálních hladin, může indikovat přítomnost nežádoucí zánětlivé reakce u jedince, od něhož byl vzorek získán, a/nebo predispozici jedince k vývinu (nebo rozvíjení) takové reakce P-selektin může být použit rovněž jako rozlišovací markér k identifikaci a typizaci buněk určitých rodin a počátků vývoje. Tato typově specifická detekce může být použita k histopatologické diagnóze nežádoucích imunitních odpovědí.

Pro použití s protilátkami podle vynálezu je rovněž možno dodávat soupravy. Mohou obsahovat přípravek na bázi protilátky podle vynálezu, obvykle v lyofilizované formě v obalu, bud samotný nebo v kombinaci s dalšími protilátkami, specifickými pro požadovaný buněčný typ. Protilátky, které mohou být ve formě konjugátu se značící látkou nebo s toxinem nebo nekonjugované, jsou v soupravě zahrnuty s pufry, jako je Tris, fosfátový, karbonátový atd., stabilizátory, biocidy, inertními proteiny, například sérovým albuminem apod. a návodem k použití. Obecně jsou tyto látky přítomny v množství méně než asi 5 % hm., vztaženo na množství účinné protilátky, a obvykle jsou přítomny v celkovém množství alespoň asi 0,001 % hm., vztaženo na koncentraci protilátky. Často je žádoucí přítomnost inertního nastavovadla nebo vehikula ke zředění účinných složek, které může být přítomno v množství asi 1 až 99 % hm. z celkového přípravku. Pokud se v testu používá druhá protilátka schopná vázat se na protilátku k Pselektinu, je druhá protilátka obvykle v oddělené lahvičce. Druhá látka je typicky konjugována se značící látkou a formulována výše popsaným způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Vynález je osvětlen, avšak nikoli omezen, pomocí příkladů provedení.

Příklad 1

Příprava činidel

Tento příklad popisuje přípravu nebo izolaci činidel, použitých k imunizaci v příkladech 2 a 3 a k analýze ELISA v příkladu 4.

A. Prošlé destičky

Destičkový preparát, který byl přečištěn z prošlých destiček, získaných z krevní banky v San Diegu. Byla použita modifikace metody, popsané v Moore ad., J. Cell. Biol.

112:491-499 (1991), která je zde zahrnuta formou odkazu. Stručně řečeno spočívá v tom, že se 25 jednotek prošle plasmy, bohaté na destičky, podrobí dvakrát po 10 min odstředění při 1200 min'1 (300 g) k odstranění kontaminujících nedestičkových krevních buněk. Přečištěný destičkový preparát byl pak třikrát promyt pufrem obsahujícím 0,1 M NaCl, 20 mM Tris a 5 mM benzamidinu. Dále obsahoval 3,8 % citrátu sodného. Hodnota pH byla pomocí ÍM HCl upravena na 7,5. Přečištěné destičky byly skladovány při 7 0 °C a před injekcí promyty jednou v PBS.

B. Čištěný P-selektin

Frakcionace destiček: Promyté prošlé destičky byly frakcionovány v podstatě podle Moorea a d., 1991, viz výše; 25 jednotek destiček bylo upraveno na 100 μΜ. v leupeptinu a 1 mM v 4 -(2-aminoethyl)-benzensulfonylfluoridu (AEBSF), třikrát zmraženo a roztaveno v suchém ledu/methanolu a homogenizováno deseti rázy homogenizéru Dounce. Suspenze pak byla centrifugována 60 min při 35000 minpři 4 °C v odstředivce Beckman Ti 70 rotor. Získaný supernatant byl výchozím materiálem pro čištění rozpustného P-selektinu. Peleta byla resuspendována v 1 mM MnCl₂, 1 mM CaCl2, 5 mM benzamidin-HCl, 0,lM NaCl, 20 mM Tris, 2% Triton X-100, pH 7,5, homogenizována lOkrát homogenizérem Dounce a inkubována 1 h při 4 °C. Suspenze pak byla centriřugována 1 h při 4 ®C a 35000 min¹· v zařízení Beckman Ti 7 0 rotor. Supernatant byl výchozím materiálem pro izolaci membránově vázaného Pselektinu.

Izolace_P-S.elekt.lnu_s_frakcionovaných destiček:

Rozpustný a membránově vázaný P-selektin pak byly odděleně čištěny některými něho všpmi ·ζ dálp nvpfipnyrh pontupú. Pro izolaci membránově vázané formy P-selektinu byl ve všech pufrech zahrnut neiontový detergent Rennex 30 (Accurate Chemical and Scientific Corp.) v koncentraci 0,1 %.

Všechny pufry také obsahovaly 1 mM CaCla a 1 mM MnCl2. Frakce, obsahující P-selektin, byly detekovány westernovým přenosem s monoklonální protilátkou PNB1.6.

Chromatografie čočkového lektinu: Super natant rozpustného P-selektinu nebo detergentový extrakt membránově vázaného P-selektinu z 25 jednotek destiček byl vnesen na sloupec (1,5 x 5,5 cm) lektinu z Lens culinaris (čočkový lektin), navázaného na Sepharose 4B (Sigma Chemical Co., L-0511). Sloupec byl pak promyt 150 ml 20 mM Tris, O,1M NaCl, pH 7,5. Navázané glykoproteiny byly ze sloupce vymývány 10 x alikvoty po 3 ml 20 mM Tris, 0,5M NaCl, 0,5M ot-methyl-Dmannopyranosid, pH 7,5. Frakce, obsahující P-selektin, byly v zařízení Amicon Centriprep 30 zkoncentrovány na 1,5 až 2 ml.

Gelová filtrační chromatografie: Koncentrované frakce z chromatografie Čočkového lektinu byly nastříknuty do HPLC kolony Toso Haas G3000 SW (21,5 mm x 30 cm), ekvilibrováné 20 mM Tris, 0,lM NaCl, pH 7,5. Kolona byla eluována stejným pufrem s průtokem 0,75 ml/min, byly jímány frakce (1,5 ml) a analyzovány westernovým přenosem. Frakce obsahující Pselektin byly spojeny a zkoncentrovány v zařízení Amicon Centriprep 30 na 1,5 až 2 ml, načež byl několikrát vyměněn pufr za 20 mM Tris, pH 7,5.

Heparin-agarózová chromatografie: Vzorek ve 20 mM Tris, pH 7,5, byl nanesen na 1 ml sloupce heparin-agarózy, sloupec byl promyt stejným pufrem a eluován 20 mM Tris, 1,5M NaCl, pH 7,5.

Aniontová _ výměnná chromatografie: Frakce byly dialyzovány do 20 mM Tris, pH 7,5 a nastříknuty do kolony Toso Haas DEAE-5PW (7,5 mm x 7,5 cm), která byla ekvilibrována 20 mM Tris, pH 7,5, a eluována solným gradientem do ÍM NaCl. Frakce obsahující P-selektin byly spojeny a zkoncentrovány na zařízení Amicon Centriprep-30 a skladovány při -80 ’C.

Kationtová výměnná chromatografie: Vzorky byly dialyzovány do 10 mM fosfát, pH 7, a nestříknuty na porézní kolonu CM/P, která byla ekvilibrována ve stejném pufru a eluována solným gradientem do IM NaCl.

C. Izolace a aktivace čerstvých lidských destiček

Všechny chemikálie, používané během postupu izolace destiček, byly získány od Sigma Chemical Company, St. Louis, MO.

1. Lidskému dobrovolnému dárci bylo odebráno 42 ml krve do injekční stříkačky obsahující 7 ml antikoagulantu ACD (kyselý citrát-dextróza).

Příprava antiaoakulantu ACD dextróza 2,0 g citrát sodný 2,49 g kyselina citrónová 1,25 g destilovaná voda do 100 ml

2. Jehla byla oddálena a krev byla přenesena do dvou sterilních zkumavek po 50 ml.

3. Zkumavky byly centrifugovány v odstředivce IECC-6000, opatřené hlavou 921 (poloměr 17,2 cm) při 800 min'¹ (přibližně 90 g) po dobu 15 min při teplotě místnosti s přerušením.

4. Supernatant byl odebrán plastovou pipetou. Supernatant byl odebírán co nejblíže vrstvě buněk.

5.	Supernatant	byl centrifugován 6	min	při	1200	min 1
(přibl.	300 g).
6 .	Byl odebrán	supernatant.
7. Supernatant (přibližně 1200 g).	byl centrifugován 10 Destičky se objevily	min při 2000 jako buněčná	min 1 zátka

na dně zkumavky. Supernatant byl kanalizován.

8. Destičky byly promývány tímto způsobem: bylo přidáno 2 ml pufru lyrode-Hepes pH 6,5, obsahujícího prostaglandin E-l (PGEp v konečné koncentraci 100 nM, a destičky byly opatrně resuspendovány. Bylo přidáno dalších 10 ml stejného pufru a vzorek byl 10 min centrifugován při 3000 min'¹.

Příprava pufru Tvrode-Hepes
NaCl	8,0 g
KCl	0/2 g
NaH2PO4<H2O	0,057	9
MgCl2. 6H2O	0,184	g
NaHCO3	0,1 g
dextróza	1/ 0 g
HEPES	2,383	g
destilovaná	voda do 1 1
IN NaOH pro	úpravu pH na	6,

9. 8. krok byl ještě jednou opakován a pak byly destičky promyty jednou tímtéž pufrem bez PGEi·

10. Destičky byly spočteny na přístroji Coulter Counter a zředěny na 2.10⁸/ml.

11. pH suspenze destiček bylo upraveno na 7,2 a bylo stanoveno množství thrombinu (lidský thrombin - Sigma), nutné k maximální aktivaci. Existuje určitá variace donorů, ale optimální aktivace se obvykle dosáhne v rozmezí 0,25 až 0,5 jednotek/ml. Maximální aktivace, tj. maximální thrombinem vyvolaná agregace se zdá odpovídat maximální expresi Pselektinu.

12. K destičkovému preparátu bylo přidáno požadované množství thrombinu a směs byla ponechána 20 min při teplotě místnosti bez míchání k zamezení agregace.

Příklad 2

Příprava blokující protilátky proti P-selektinu

Tento příklad popisuje přípravu mu MAb PB1.3, tj . monoklonální protilátky k P-selektinu, která inhibuje vazbu thrombinem aktivovaných destiček na neutrofily.

Jako zdroj buněk produkujících protilátku byl použit jeden myší samec RBF/DnJ, získaný od Jackson Laboratories, a byl imunizován podle následujícího schématu (všechny injekce byly prováděny intraperitoneálně):

1. Měsíc 1	- 200	μΐ	shluknutých	prošlých	destiček
obsahujících přibližně 6	. 104 5 * * * 9	destiček.
2. Měsíc 2	- 250	μΐ	shluknutých	prošlých	destiček
(8.109 destiček).
3. Měsíc 4	- 250		shluknutých	prošlých	destiček

(8.10⁹ destiček).

4. Měsíc 5 - rozpustná frakce P-selektinu, izolovaná na čočkovém lektinu.

5. Měsíc 6 - rozpustný P-selektin, čištěný čočkovým lektinem, gelovou filtrací, heparin-agarózou a iontově výměnnou chromatografií.

Podrobnosti ohledně přípravy všech činidel, použitých pro imunizaci, jsou uvedeny v příkladu 1.

A. Myelomová fúzní buněčná linie

FOX-NY, myší myelomová buněčná linie, deficitní na adenosinfosforibosyltransferasu (APRT) a hypoxanthinfosforibosyltransferasu (HPRT), byla získána z American Type Culture Collection (CRL 1732) a udržována v RPMI 1640 s obsahem 10 % fetálního hovězího séra (Hyclone) a 1 % L-glutaminu.

B. Postup fúze buněk

Po čtyřech dnech po konečné injekci byla vyjmuta slezina a bylo získáno 1,2.10⁸ splenocytu. Ty byly podrobeny fúzi s myelomovými buňkami FOX-NY s použitím PEG 1500(BMB) podle tohoto protokolu: Izolované splenocyty byly dvakrát promyty v kultivačním médiu, prostém séra. Splenocyty a myelomové buňky byly kombinovány v poměru 1:4,8 (myelomové buňky ke splenocytům). Peleta kombinovaných buněk byla promyta dvakrát médiem prostým séra a pak odsáváním sušena k suchu. Pak byla peleta buněk mírným poklepem resuspendována a zahřívána 1 min na vodní lázni při 37 ^eC. Peleta byla distribuována podél stěn a dna 50 ml konické odstředivkové zkumavky. Během 60 s byl za míchání k udržení tenké vrstvy buněk přidán 1 ml PEG 1500 (50 % w/v v 7 5mM HEPES, lot BMB 14702800), předem zahřátého na 37 *C. Během 6 0 s byl pomalu přidán 1 ml média prostého séra. Další 1 ml byl přidán mírně rychleji. Bylo přidáno dalších 8 rol média a zkumavka byla ponechána nerušeně stát 8 min a pak byla 5 min centrifugována při 300 g. Konečná peleta byla resuspendována v RPMI 1640 s obsahem 10 % fetálního hovězího séra (Hyclone), 1 % L-glutaminu, 1 % pyruvátu sodného a lxAAT (Sigma). Buňky byly naočkovány na 10 96jamkových mikrotitračních ploten s plochým dnem (COSTAR). Nebyly použity žádné doplňkové buňky.

Příklad 3

Příprava ..nebl.Qkuji.c.I pr-Q-fcilátky prsti P-selektinu

Tento příklad popisuje přípravu monoklonální protilátky mu MAb PNB1.6 proti P-selektinu, která neinhibuje vazbu thrombinem aktivovaných destiček na neutrofily.

Jako zdroj buněk, produkujících protilátku, byl použit jeden myší samec RBF/DnJ, získaný od Jackson Laboratories, a byl imunizován podle následujícího schématu (všechny injekce byly prováděny intraperitoneálně):

1. Měsíc 1 - 100 μΐ thrombinem aktivovaných čerstvě izolovaných destiček (přibližně 3.10⁹ destiček).

2. Měsíc 2 - 200 μΐ thrombinem aktivovaných čerstvých destiček (6.10⁹ destiček).

3. Měsíc 4 - 100 μΐ thrombinem aktivovaných čerstvých destiček (8310⁹ destiček).

Po čtyřech dnech po konečné injekci byla odebrána slezina a získány splenocyty. Byly podrobeny fúzi s myelomovými buňkami FOX-NY s použitím PEG 1500 (Sigma), obecně jak je popsáno v Oi a d., Immunoglobulin-Producing

Hybrid Cell Lines v Selected Methods in Cellular Inununology, ed. Mishell a Shiigi, str. 351-372, 1980, kterýžto dokument je zde zahrnut formou odkazu.

Příklad 4

Screening na protilátku

Tento příklad popisuje screening supernatantových médií z fúzovaných buněk, produkovaných v příkladech 2 a 3. Supernatanty z příkladu 2 byly testovány analýzou ELISA proti (a) thrombinem aktivovaným destičkám, (b), čištěnému Pselektinu a (c) rekombinačnímu P-selektinu. Supernatanty z příkladu 2 byly testovány analýzou ELISA proti thrombinem aktivovaným destičkám. Všechny tyto testy jsou dále popsány, příprava činidel, použitých v jednotlivých testech, je popsána v příkladu 1.

A. Thrombinem aktivované destičky

1. 96jamková plotna s plochým dnem COSTAR byla potažena

0,1 % želatiny (2% želatina - Sigma) přídavkem 100 μΐ/jamku a inkubací po dobu 15 min při 37 °C.

2. Želatina byla odstraněna a do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ thrombinem aktivovaných destiček (10⁸/ml).

3. Plotna byla inkubována 15 min při 37 ^eC.

4. Plotna byla odstředována 2 min při 800 min'¹.

5. Nenavázané destičky byly odstraněny a plotna byla promytá 2x PBS.

6. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ PBS s obsahem 1 % BSA a plotna byla ponechána stát při teplotě místnosti po dobu 60 min.

7. Do každé jamky bylo přidáno 100 jbtl supernatantu. Plotna byla na 60 min při teplotě místnosti umístěna na třepačku.

8. Plotna byla promytá 4x PBS.

9. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ peroxidasového konjugátu kozího anti-myšího IgG zředěného 1/1000 v PBS s obsahem 1 % BSA. Plotna byla ponechána 30 min při teplotě místnosti.

10. Plotna byla promytá 7x PBS.

11. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ substrátového systému ABTS (Kirkegaard and Pexry Laboratories, lne.).

12. Plotna byla vyvíjena při teplotě místnosti po dobu až 30 min.

13. Na přístroji Titertek Multiskan MCC/340 bylo provedeno měření OD při 414 nm.

B. Čištěný P-selektin

1. Rozpustný nebo membránově vázaný P-selektin, izolovaný chromatografií na čočkovém lektinu, gelovou filtrací a kolonami DEAE, byl zředěn (1:50 až 1:1000) v DPBS (Dulbeccův fosfátem pufrovaný salinický roztok je fosfátem pufrovaný salinický roztok (PBS) s obsahem CaCl₂ (1 mM) a

MgSO₄ (0,5 mM) ) a na noc zakryt při 4 ^eC na 96jamkových mikrotitračních plotnách Falcon.

2. Plotny pak byly lh nebo déle blokovány DPBS + 1 %

BSA.

3. Do jamek pak byly přidány testované supernatanty a podrobeny inkubaci při teplotě místnosti po dobu 30 až 60 min.

4. Plotny byly promyty DPBS a pak byl do jamek přidán konjugát křenové peroxidasy a ovčího anti-myšího IgG a plotny byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti.

5. Plotny pak byly promyty DPBS a vyvíjeny se substrátovým systémem TMB Microwell (Kirkegaard and Perry Laboratories, lne.).

C. Rekombinační P-selektin

1. 96 jamkové plotny s plochým dnem byly přes noc povlečeny při 4 °C 100 μΐ P-selektinu, který byl vypuštěn do média, prostého séra, fondu 293 buněčných klonů, transfikovaných rekombinačním genem P-selektinu. Tento supernatant obsahoval alespoň 8 ng/ml P-selektinu a byl na plotny COSTAR nanášen bud neředěný nebo zředěný médiem 1:8.

2. Plotna byla promyta jednou Dulbeccovým PBS (DPBS) a blokována po dobu 30 min při teplotě místnosti 200 μΐ DPBS s obsahem 1 % BSA.

3. Plotna pak byla zpracována pro analýzu ELISA podle stupňů 7 až 13 v části A.

D. Isotypizační analýza mAB k P-selektinu

Isotypová analýza mu MAb PB1.3 a PNB1.6 ukázala, že obě monoklonální protilátky patří k podtřídě myšího imunoglobulinu IgGl. Isotypizace byla provedena s použitím záchytové metody soupravy Mouše-Hybridoma-Subtyping Kit

Boehringer Mannheim.

Příklad 5

Pět ěks.e _.e_- sel eis. Linu

Tento příklad popisuje detekci P-selektinu westernovým přenosem. Vzorky obsahující P-selektin byly smíseny se stejným objemem vzorkového pufru SDS-PAGE (neredukující), zahřátý na 100 °C, podrobeny gradientu 8-16 % gelu Novex a elektroforeticky přeneseny na nitrocelulózu. Nitrocelulózová membrána pak byla blokována alespoň 1 h ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) + 1 % hovězího sérového albuminu (BSA). Membrána pak byla inkubována 1 h nebo déle při teplotě místnosti s každým supernatantem buněčné kultury z hybridomů exprimujících příslušnou monoklonální protilátku nebo čištěnou protilátku (5 pg/ml) v PBS + 1 % BSA. Pak byla membrána několikrát promyta se zředěním 1:1000 konjugátem křenové peroxidasy a ovčího anti-myšího IgG (Sigma A-6782) v PBS + 1 % BSA. Poté byla membrána promyta a pásy byly visualizovány tetramethylbenzidinem/membránovým zesilovačem (Kirkegaard and Perry Laboratories, lne.) .

Pro supernatanty tkáňových kultur z mu MAb PB1.3 a PNB1.6 byl detekován protein s molekulovou hmotností 140 kD. Ten se objevoval v přípravcích solubilizovaných destičkových membrán i v čištěném P-selektinu.

Příklad 6

Inhibice akutního zánětlivého poškození in vivo blokující protilátkou proti P-selektinu

Tento příklad poskytuje data demonstrující schopnost blokující protilátky proti P-selektinu podle vynálezu léčit akutní poškození plic. V tomto příkladu bylo systemické aktivace komplementu dosaženo vaskulární infusí faktoru kobřího jedu (CVF) do krys. Poškození se v tomto modelu vyvíjelo rychle a je známo, že je závislé na toxických kyslíkových produktech, generujících se z neutrofilů.

Při těchto studiích byly použity dvě monoklonální protilátky, popsané v příkladech 2 a 3. Pro tuto studii je zvlášt významné, že blokující protilátka proti P-selektinu mu MAb PB1.3 inhibuje také adhesi thrombinem aktivovaných myších destiček k lidským neutrofilům (obr. 1). Z těchto údajů vyplývá, že mu MAb PB1.3 pravděpodobně rozpoznává konzervovaný funkční P-selektinový epitop a že blokující protilátka proti P-selektinu by mohla být použitelná při léčbě dalších zánětlivých poškození.

Při experimentech in vivo bylo 20 jednotek CVF/kg tělesné hmotnosti vpraveno intravenózní infusí do 300 g samců krys Long-Evans. Tím byla vyvolána rychlá intrapulmonární, intravaskulární sekvestrace krevních neutrofilů a z toho vyplývající poškození intersticiárních kapilárních endotheliálních buněk v místech fyzického kontaktu endotheliálních buněk a neutrofilů. Pokud byly použity mu MAb PB1.3 a PNB1.6, byly vpraveny intravenózní infusí v uvedených množstvích spolu s CVF v celkovém objemu 0,5 ml. Negativní kontrolní zvířata dostávala intravenózní infusi fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS). Ve všech případech obsahoval infusní materiál také stopová množství (¹²⁵I)hovězího sérového albuminu a homologní (⁵¹Cr)-červené krvinky (RBC). Parametry plicního poškození byly zjiŠtovány po 30 min zavedenými technikami, viz Mulligan ad., J. Clin. Invest. 88 : 1396 (1991) .

Výsledky těchto experimentu jsou uvedeny na obr. 2A a

2B. Souběžná infuse 200 (tg PNB1.6 (neblokující protilátka proti P-selektinu) s CVF nevyvolala žádné snížení poškození plic v porovnání s hodnotami neošetřených CVF pozitivních kontrol. Zvířata, dostávající CVF PNB1.6 v PBS tedy sloužila jako referenční pozitivní kontrola. Když bylo infusí vpraveno 100 pg protilátky mu MAb PB1.3 s CVF, byla permeabilita snížena o 19,2 % (p = 0,002) a hemorrhagie byla snížena o 37,5 % (p = 0,001 (data neznázorněna). Když bylo přidáno 200 pg mu MAb PB1.3, byla permeabilita snížena o 50,8 % (ρ < 0,001) (obr. 2A) a hemorrhagie o 70,0 % (p < 0,001), resp. 70,1% (p < 0,001) (obr . 2B) .

Plíce ze společných skupin zvířat byly homogenizovány, sonifikovány a byla měřena myeloperoxidasová aktivita (MPO) za účelem získání odhadu obsahu neutrofilů v plíci. MPO byla stanovena rozkladem H2O2 v přítomnosti o-dianisidinu podle standardních metod, Warren ad., J. Clin. Invest. 84:1873 (1989). Jak je znázorněno na obr. 3A, při ošetření 100, 200 nebo 400 pg mu MAb PB1.3 se obsah MPO snížil pod hodnoty u referenční (neošetřené) pozitivní kontrolní skupiny o 26 % (p = 0,024), 41 % (p < 0,001), resp. 50 % (p < 0,001). U zvířat, jimž bylo injekčně vpraveno 200 pg PNB1.6 nedošlo ke-snížení obsahu MPO (obr. 3A), což je konsistentní s neschopností této protilátky chránit před poškozením plic vyvolaným CVF. Ochranné účinky blokující protilátky mu MAb PB1.3 tedy korelují s její schopností interferovat s akumulací neutrofilů v plicní tkáni. Transmisním elektronovým mikroskopickým zkoumáním sektorů plic bylo potvrzeno, že ošetření mu MAb PB1.3 vedlo ke snížené akumulaci neutrofilů v pulmonárních intersticiálních kapilárách, snížené adhesi neutrofilů k endotheliálním buňkám a sníženému množství důkazů poškozených endotheliálních buněk (obr. 3B).

Za účelem zkoumání plicní exprese P-selektinu po intravenózní injekci CVF byl další skupině infusně vpraven CVF a zvířata byla usmrcena po 0, 5, 10, 15, 20 a 60 min.

Plíce byly nafouknuty O.C.T., rychle zmrazený a získané sekce byly zkoumány přítomnosti P-selektinu imunohistochemickými metodami s použitím mu MAb PB1.3. V čase 0 bylo zjištěno málo detekovatelné radioaktivity v pulmonární vaskulatuře, zatímco po 5 min bylo barvení zcela evidentní a po 15 a 20 min po infusi vzrostlo. Schéma barvení zahrnovalo pulmonární venuly a septální oblasti ve schématu konsistentním s barvením intersticiálních kapilár. Po 60 min barvení z velké části zmizelo (údaje neznázornšny). I když je P-selektin pravděpodobně přítomen v intracelulárních skladovací granulách před infusi CVF, je zřejmé, že mobilizace Pselektinu k povrchu endothelu dramaticky zvýšila jeho reaktivitu s protilátkou mu MAb PB1.3.

Příklad 7

Test konkurenční vazby

Způsoby izolace destiček z lidské krve, aktivace izolovaných destiček thrombinem a izolace PMN (neutrofilů) jsou popsány -výše v příkladu 1.

INKUBACE THROMBINEM AKTIVOVANÝCH DESTIČEK S MONOKLONÁLNÍMI PROTILÁTKAMI PROTI P-SELEKTINU

a) Do každé z 24 Eppendorfových zkumavek (1,5 ml) se duplicitně vloží 20 μΐ thrombinem aktivovaných destiček 2.10⁸/ml).

b) K 8 těmto zkumavkám se přidá 20 μΐ frakce IgG čištěné z PNB1.6 v koncentraci 10 pg/ml v pufru Tyrode-Hepes, pH 7,2, obsahujícím 1 mM CaCl2· Ke druhé řadě 8 zkumavek se přidá 20 pl stejného přípravku IgG o koncentraci 1 pg/ml. Ke třetí řadě 8 zkumavek se přidá 20 pl samotného pufru.

c) Zkumavky se zamíchají a ponechají se stát 20 min při teplotě místnosti.

d) Ke každé řadě 8 zkumavek se přidá 20 pl frakce IgG čištěné z mu MAb PB1.3 v koncentraci pohybující se od 10 p g/ml do 0,03 pg/ml.

e) Zkumavky se zamíchají a ponechají stát 20 min při teplotě místnosti.

f) Přidá se 20 /il neutrofilú v koncentraci 3.10⁶/ml.

g) Zkumavky se zamíchají a ponechají stát 20 min při teplotě místnosti.

h) Adhese se hodnotí mikroskopicky tímto způsobem: V každém vzorku se napočítá 100 neutrofilú. Buňka se označí jako pozitivní, jestliže navázala 2 nebo více destiček, a jako negativní, jestliže navázala méně než 2 destičky. Vypočte se procento pozitivních buněk.

Jak je znázorněno na obr. 1, předběžné ošetření thrombinem aktivovaných destiček mu MAb PNB1.6 neovlivnilo schopnost mu MAb PB1.3 blokovat jejich P-selektinem zprostředkovanou adhesi k neutrofilům.

Příklad 8

Charakterizace vazby blokujících protilátek proti P-s^lekt..inu

I. a) Čištění monoklonálních_piptilát.e.k: Monoklonální protilátky PNB1.6 a 84/26 byly izolovány ze supernatantů tkáňových kultur pasáží kolonou protein G Sepharose 4 Fast Flow (Pharmacia). Kolona byla důkladně promyta fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) a navázaná protilátka byla eluována 0,lM glycin-HCI, pH 2,7, do zkumavek, obsahujících 0,2 až 0,5 objemu 1M Tris, pH 8,8. Postup použitý k izolaci mu MAb PB1.3 byl identický s výjimkou toho, že protilátka, navázaná na protein G, byla eluována 0,lM acetát-HCl, pH 2,5, do zkumavek obsahujících 0,3 objemy 2M Tris, pH 10. Frakce obsahující protilátku byly spojeny a dialyzovány proti několika změnám PBS při 4 ^eC.

b) Příprava afinitní kolony mu MAb PB1.3: Pro použití při čeištění P-selektinu byl mu MAb PB1.3 navázán na tresyl60 aktivovanou agarózu podle instrukcí výrobce (Schleicher a Schuell).

c) Čištění P-selektinu: k promytým prošlým lidským destičkám, připraveným výše popsaným způsobem, byla přidána 1/100 objemu 5mg/ml leupeptinu a 1/100 objemu 35mg/ml AEBSF (Calbiochem) . Po rozmíchání byly destičky třikrát zmrazený a roztaveny bud v lázni suchý led/methanol nebo v kapalném dusíku, homogenizovány deseti běhy homogenizéru Dounce a centrifugovány 1 h v zařízení Beckman 7 0TI rotor při 35000 min'¹ a při 4 °C. peleta byla resuspendována v Dulbeccově fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (DPBS, Whittaker Bioproducts, který obsahuje přibližně 0,9 μΜ Ca²⁺ a 0,5 mM Mg^{2 +} ) a upravena na koncentraci 5 mM v benzamidinu-HCl, 100 μ M v leupeptinu a 2 % Tritonu X-100. Suspenze byla resuspendována a homogenizována 10 rázy homogenizéru Dounce. Po 1 h inkubace při 4 °C byl roztok opět centrifugován v zařízení Beckman 70TI rotor po dobu 1 h při 35000 min¹ a 4 °

C. Supernatant byl pasážován kolonou mu MAb PBI.3 -agarózy, která byla ekvilibrována DPBS + 0,05 % Rennex 30 (Accurate Chemical and Scientific Corp.). Kolona byla důkladně promyta DPBS + 0,05 % Rennex 30 a navázaný P-selektin byl eluován 0,1 M triethylamin-HCl, 0,05 % Rennex 30, pH 11,5, do zkumavek obsahujících 0,01 objemu IM fosfátu, pH 6,8. Frakce obsahující P-selektin byly spojeny, dialyzovány proti DPBS + 0,05 % Rennex 30, zkoncentrovány s použitím bud rotační odparky Centricon 30 nebo Centriprep 30 (Amicon), alikvotovány a skladovány při -80 °C.

d) Příprava peptidu CONRYTDLVAIONKNE_(.Cys_; Gin.- Asrt - Arg ~

Tvr-Thr-Asp-Leu-Val-Ala-Ile-Gln-Asn-Lys-Asn-Glu-NHo): Peptid byl syntetizován na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems (Foster City, CA) 430A s použitím Fmoc chráněných aminokyselin a 2-(lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3tetramethyuroniumhexafluorofosfátových (HBATU) esterů pro aktivaci aminokyselin. Každá aminokyselina byla rutinně kondenzována dvakrát. Fmoc chráněné aminokyseliny a hydroxybenzotriazol byly zakoupeny u Applied Biosystems. Všechna rozpouštědla byla zakoupena u Burdick and Jackson. HBTU byl zakoupen u Richelieu Biotechnologies (St, Hyacinthe, Canada). Piperidin a trifluoroctová kyselina, acetanhydrid, thioanisol, fenol a ethandithiol byly zakoupeny u Sigma Chemical Corporation.

Fmoc-amidová pryskyřice (Bachem Bioscience) byla nasazena do reakční nádoby pro syntézu peptidů a promyta jednou N-methylpyrrolidonem (NMP). Postupně byly provedeny tyto operace:

1. Byla odstraněna Fmoc chránící skupina působením 25% piperidinu v NMP.

2. Pryskyřice byla promyta 5krát NMP.

3. Do reakční nádoby byla přidána směs obsahující liteře .butylester N-a-Fmoc-L-glutamové kyseliny, diisopropylethylamin. HBTU a NMP a ponechána reagovat 30 min za vířivého míchání.

4. Rozpouštědlo bylo vypuštěno a pryskyřice byla promyta třikrát NMP.

5. Stupně (3) a (4) byly opakovány ještě dvakrát.

6. Pryskyřice byla promyta ještě čtyřikrát NMP.

Stupně 1 až 6 byly opakovány pro každou aminokyselinu peptidů. Po konečném kondenzačním cyklu byl peptid navázaný na pryskyřici odblokován reakcí s 25% piperidinem v NMP, promyt 7krát v NMP a dvakrát dichlormethanem. Pryskyřice byla sušena 24 h ve vakuu, peptid byl z pryskyřice odštěpen působením trifluoroctové kyseliny obsahující 2,5 % ethandiolu, 5 % thioanisolu, 7,5 % fenolu a 5 % vody.

Polystyrénová pryskyřice byla od roztoku trifluoroctová kyseliny oddělena filtrací. Trifluoroctová kyselina byla odpařena ve vakuu. Surový peptid byl triturován s diethyletherem a rozpuštěn ve vodě. Voda byla odstraněna lyofilizaci. Peptid pak byl čištěn HPLC s reverzními fázemi na sloupci Cg (VYDAC) s použitím gradientu acetonitrilu, vody, vždy s obsahem 0,1 % TFA jako modifikátoru.

e) Biotinvlace monoklonálních protilátek: Protilátky byly dialyzovány proti 0,1 m bikarbonátu sodnému, pH 8,5. Byl přidán biotin NHS-LC (Pierce) do 0,3 mg/ml. Po 2 h při teplotě místnosti byly protilátky dialyzovány proti několika změnám PBS.

f) Povlékání mikrotitračních ploten pro ELISA: 96jamkové mikrotitrační plotny (Falcon Microtest III) byly přes noc povlečeny při 4 °C 50 μΐ/jamku 2 μΐ/ml afinitně čištěného Pselektinu v DPBS.

g) Westernový přenos: mu MAb PBI.3, PNB1.6 i 84/26 se vážou na jediný pás 140 kD, jsou-li destičky rozpuštěny v běžném pufru SDS-PAGE (neredukovaný) , podrobeny SDS-PAGE a přeneseny na nitrocelulózu (údaje neznázorněny). Zjistili jsme rovněž, že mu MAb PBI.3 a PNB1.6 při westernovém přenosu již nerozpoznávají P-selektin, jestliže byly vzorky redukovány β-merkaptoethanolem.

II. Účinek chelatačních dvojvazných kationtu na vazbu monoklonálních protilátek_na_P:ssl.ektin: Dvě mikrotitrační plotny byly výše uvedeným způsobem povlečeny afinitně čištěným P-selektinem. Plotna 1 byla blokována 200 μΐ/jamku PBS + 1 % BSA, zatímco plotna 2 byla blokována 200 μΐ/jamku DPBS + 1 % BSA (DPBS obsahuje Ca ²⁺ a Mg^{2 +} ) . Po 1 h byly plotny promyty (v případě plotny 1 vždy PBS, u plotny 2 DPBS) . Do jamek na plotně 1 bylo přidáno 25 μΐ 25mM EDTA v PBS + 1 % BSA a na plotnu 2 bylo přidáno 2 5 μΐ DPBS + 1 % BSA. Po 1 h bylo do jamek na obou plotnách přidáno 25 jttl ředění příslušné protilátky. Ředění pro plotnu 1 se provádělo v PBS + 1 % BSA, pro plotnu 2 v DPBS + 1 % BSA. Po 1 h byly plotny promyty a bylo přidáno 50 μΐ konjugátu ovčího anti63 myšího IgG a křenové peroxidasy ve zředění 1:1000 (ředění pro plotnu 1 se provádělo v PBS + 1 % BSA, pro plotnu 2 v DPBS + 1 % BSA) . Po 1 h byly plotny promyty a bylo přidáno 50 jtil peroxidasového substrátu TMB (3,3,5',5*-tetramethylbenzidin, Kirkegaard and Perry Laboratories, lne.). Poté, co se vyvinula příslušná úroveň zbarvení, byla reakce se substrátem zastavena přídavkem 25 μΐ ÍM kyseliny fosforečné a byla odečtena absorbance při 450 nm.

Obr. 4 znázorňuje vazbu anti-P-selektinových monoklonálních protilátek na P-selektin v pufru DPBS, který obsahuje Ca²⁺ a Mg²⁺, a v PBS + 25 mM EDTA, což je chelatační prostředek dvojmocných kovových kationtů. Koncentrace dvojmocných kationtů přítomných v DPBS je více než dostatečná k podpoře adhese neutrofilů k P-selektinu (Geng a d., 1991), zatímco chelátor EDTA v koncentraci 25 mM je více než dostatečný pro blokování adhese neutrofilů k P-selektinu. Vazba všech monoklonálních protilátek k P-selektinu je málo ovlivněna přítomností EDTA, což ukazuje, že přítomnost Ca²⁺ není nutná ke vzniku vazby. Mu MAb FBI.3 je blokující protilátka, tzn. je schopná blokovat vazbu neutrofilů k Pselektinu, například na aktivovaných destičkách. PNB1.6 je neblokující protilátka. Schopnost 84/26 blokovat vazbu neutrofilů k P-selektinu nebyla dosud plně charakterizována. Naproti tomu z anti-P-selektinových monoklonálních protilátek, popsaných Gengem ad., je pouze neblokující protilátka S12 schopna vázat se v nepřítomnosti Ca²⁺.

III. Účinek peptidu CONRYTDLVAIONKNE na vazbu mu MAb PB1.3 na

P-selektin: Mikrotitrační plotna byla výše popsaným způsobem povlečena afinitně čištěným P-selektinem, blokována 200 μ 1/jamku DPBS + 1 % BSA po dobu lha promyta. Ředění mu MAb PB1.3 v DPBS + 1 % BSA byla smíchána bud s 0,35 mg/ml CQNRYTDLVAIQNKNE v PBS nebo s PBS samotným jako kontrola. Po 1 h bylo 50 μΐ každého ředění protilátky přidáno k mikrotitrační plotně a inkubováno 1 h. Plotna byla promyta

DPBS a bylo přidáno ředění 1:1000 konjugátu ovčího antimyší ho IgG s křenovou peroxidasou v DPBS + 1 % BSA. Po 1 h byla plotna píomyta, byl přidán substrát TMB a po zastavení vývinu zbarvení byly plotny odečteny výše uvedeným způsobem.

Obr. 5 ukazuje, že peptid CQNRYTDLVAIQNKNE, homologní ke zbytkům 19 až 34 lektinové oblasti P-selektinu, nemá žádný vliv na vazbu mu MAb PB1.3 na P-selektin, je-li peptid přítomen v koncentraci 0,35 mg/ml. Tím se tato konkrétní monoklonální protilátka odlišuje od monoklonálních protilátek Gl, G2 a G3, jejichž vazba na p-selektin je částečně nebo úplně blokována tímto peptidem.

IV. Schopnost Pytel mu MAb PB1.3, PNB1.6 a 84/26 blokovat navzájem vazbu na P-selektin: Mikrotitrační plotny, povlečené afinitně čištěným P-selektinem výše popsaným způsobem, byly po dobu 1 h blokovány DPBS + 1 % BSA a pr omyty. Do příslušných jamek bylo přidáno 25 μΐ 50/tg/ml roztoku mu MAb PB1.3, PNB1.6 nebo 84/26 v DPBS + 1 % BSA a inkubováno po dobu 1 h. Pak bylo přidáno 25 μΐ zředění (v DPBS + 1 % BSA) biotinylované protilátky. Plotna pak byla inkubována 1 h na plotnové třepačce. Po promytí bylo přidáno 50 μΐ ředění 1:1000 streptavidinového konjugátu s křenovou peroxidasou a inkubováno po dobu 1 h. Po promytí DPBS byla plotna vyvíjena výše uvedeným způsobem se substrátem TMB.

Obr. 6 znázorňuje schopnost mu MAb PB1.3, PNB1.6 a 84/24 interferovat mezi sebou navzájem při vazbě na P-selektin. Obr. 6A ukazuje, že pouze mu MAb PNB1.6 je schopna blokovat vazbu biotinylované mu MAb PNB1.6 na P-selektin, což demonstruje, že mu MAb PB1.3 a 84/26 musejí rozpoznávat odlišné epitopy od mu MAb PNB1.6. Podobně na obr. 6B je mu MAb PB1.3, ale ne mu MAb PNB1.6 nebo 84/26, schopna blokovat vazbu biotinylované PB1.3 na selektin, což demonstruje, že ostatní dvě protilátky musejí rozpoznávat odlišné epitopy. Podle obr. 6C jsou mu MAb 84/26 i PB1.3, avšak nikoli mu MAb

PNB1.6, schopny blokovat vazbu biotinylované mu MAb 84/26 na P-selektin.

v. B.lQkující protilátky proti_p-selektinu_ne.lnh.ih.uii thrombinem indukovanou agregaci lidských destiček:

Tento příklad demonstruje, že protilátky proti Pselektinu mu MAb PB1.3 a PNB1.6 neinhibují thrombinem indukovanou agregaci destiček. Čerstvé lidské destičky byly izolovány výše popsaným způsobem a suspendovány v pufru Tyrode-Hepes, pH 7,2, v koncentraci 2.10⁸/ml.

Agregometrie byla provedena v agregometru Lumi (ChronoLog Corp.). Za účelem měření bylo 0,45 ml suspenze destiček vloženo do standardní silikonované kyvety. K tomu bylo přidáno 10 μΐ protilátky nebo vehikula jako kontrola. Po 5 min při 37 °C bylo přidáno 0,1 jednotky thrombinu (Human, Sigma) a byla zaznamenána agregace.

Když byla agregace měřena za podmínek kontroly v nepřítomnosti protilátky, byla získána agregační odpověd 71 jednotek. Ekvivalentní rozsah agregace byl získán v přítomnosti 10 μΐ neředěných supernatantů kultur z buněk produkujících protilátku mu MAb PB1.3 (obr. 7). K suspenzi destiček byly přidávány různé koncentrace mu MAb PB1.3 (1 až

100 /ig/ml) . Při žádné koncentraci mu MAb PB1.3 nebyla agregace destiček odlišná od odpovědi stanovené v nepřítomnosti protilátky (obr. 7).

Příklad 9

Ochranné účinky blokující protilátky proti P-selektinu mu MAb £Β1^-ϊπ vivo při kočičí mvokardiálni ischeroii a reperfusi

Model poškození myokardiální ischemií a reperfusi u kočky byl proveden metodami podle Tsao a d., (Circulation

82:1402-1412 (1990)). Model lze stručně popsat tak, že kočičí samci (2,5 až 3,5 kg) byli anestetizováni pentobarbitalem sodným (30 mg/kg, i.v.). Do řezu střední čárou byla vložena intratracheální trubice a všechna zvířata dostávala přerušovanou ventilaci pozitivního tlaku pomocí malého zvířecího respirátoru Harvard. Do externí jugulární žíly byl vložen polyethylenový katetr a pravá femorální žíla byla kanylována a připojena k tlakovému snímači Statham P23Ac k měření arteriálního krevního tlaku. Byla provedena thorakotomie po střední čáře, otevřeno perikardium a odhaleno srdce. Kolem levé přední sestupné tepny byl 10 až 12 mm od jejího počátku opatrně umístěn šev hedvábím 2-0. Po 30 min stabilizace byla iniciována nekardiální ischemie úplným podvázáním tepny; po 1,5 h ischemie následovaly 4,5 h reperfuse. 10 min před zahájením reperfuse byly intravenózně v dávce 1 mg/kg podány blokující (mu MAb PB1.3) a neblokující (mu MAb PNB1.6) protilátky proti P-selektinu.

Ischemické myokardium bylo určeno jako ta část tkáně, která se nebarví tetrazoliovou nitromodří; bylo vyjádřeno jako procento ohrožené oblasti. Ohrožená oblast byla stanovena reokluzí levé sestupné tepny po skončení reperfuse a vstříknutí Evansova modrého barviva do levého atria. Ohrožená oblast byla tedy stanovena negativním barvením.

Endotheliálně závislá relaxace kroužků z koronárních tepen byla stanovena měřením acetylcholinem indukované relaxace kroužků, předem kontrahovaných mimetikem thromboxanu A2 U 46619. Údaje jsou uvedeny jako procento relaxace.

Akumulace neutrofilů v myokardiu byla měřena jako myeloperoxidasová aktivita polytronem homogenizované myokardiální tkáně.

Výsledky těchto experimentů jsou znázorněny na obr. 8. U koček ošetřených neblokující protilátkou proti P-selektinu mu

MAb PNB1.6 činil rozsah myokardiální ischemie 33 i 5 % ohrožené oblasti. Naproti tomu rozsah ischemie u zvířat ošetřených PB1.3 byl významně (P < 0,01) nižší; 15 ± 3 % ohrožené oblasti. Endotheliálně závislá relaxace na acetylcholin byla také významně zachována v ischemickýchreperfundovaných koronárních arteriích odebraných kočkám, ošetřeným mu MAb PBI.3, oproti mu MAb PNB1.6 (67 ± 6 oproti 11+3%, P < 0,01). Že jsou tyto jevy přisouditelné snížení myokardiální infiltrace leukocytů, se zdá -vyplývat z významného (P < 0,1) snížení počtu PMN v myokardiální tkáni ze zvířat ošetřených mu MAb PB1.3 (64 ± 7 PMN/mm²) oproti zvířatům ošetřeným mu MAb PNB1.6 (136 i 12 PMN/mm²).

Příklad 10

Produkce humanizovaných protilátek proti P-selektinu

A, Klonování a sekvenování variabilních oblasti mu MAb PBI,3

Izolace mu MAb PBI.3 je popsána v příkladu 2. Totální RNA byla izolována z hybridomových buněk produkujících mu MAb PBI.3. Jednotlivé cDNA, kódující variabilní oblasti těžkého a lehkého řetězce mu MAb PBI.3, byly amplifikovány řetězovou reakcí s polymerasou (PCR). Celá myší variabilní oblast byla amplifikována pomocí směsi degenerátových primerů, které hybridizovaly uvnitř vedoucí sekvence, a jediného primerů, který hybridizoval k myší konstantní oblasti blízko spojky VC; viz Jones & Bendig, Bio/Technology 9:88-89 (1991) a

Bio/Technology 9:579 (1991). PCR fragmenty byly klonovány a sekvenovány. Nukleotidové sekvence a odpovídající aminokyselinové sekvence pro variabilní oblasti těžkého, resp. lehkého řetězce mu MAb PBI.3 jsou uvedeny na obr. 9, resp. 10.

B, Modelování struktury variabilních oblasti mu. .MAb.. PB.1^.3.

Byl zkonstruován model oblastí Vl a mu MAb PBI. 3.

Model byl vypracován na pracovní stanici Silicon Graphics

IRIS 4D, pracující pod operačním systémem UNIX, s použitím molekulární modelovací sady QUANTA (Polygen Corp., USA).

Aminokyselinové sekvence variabilních oblastí mu MAb PB1.3 byly porovnány se sekvencemi variabilních oblastí strukturně vyřešeného imunoglobulinů, viz tabulky 1 a 2.

C, Návrh přetvořených variabilních oblastí mu MAb PB1.3

Byly vybrány lidské variabilní oblasti, které měly úseky základní struktury nejpodobnější těm, jaké se nalézají ve variabilních oblastech mu MAb PB1.3. Variabilní oblast lehkého řetězce lidské mAB DEN a variabilní oblast těžkého řetězce lidské mAB 21/28'CL byly zvoleny jako základní struktury k napojení na odpovídající oblasti určující komplementaritu (CDR) mu MAb PB1.3. Lidské úseky základní struktury byly modifikovány metodologií popsanou v Monoclonal Antibodies, 2: Applications in Clinical Oncology (ed. A. Epenetos. Chapman & Halí, 1992, kterýžto dokument je zde zahrnut formou odkazu; viz zejména tam obsaženou práci Bending ad., The Humanization of Mouše Monoclonal Antibodies by CDR-Grafting: Examples with Anti-Viral and Anti - Tumor Cell Antibodies, která je zde zahrnuta formou odkazu). Přiřazení aminokyselin variabilních oblastí, vedoucí k návrhu přetvořených variabilních oblastí humanizované PB1.3, je uvedeno v tabulkách 1 a 2.

Byly modelovány tři verze variabilní oblasti těžkého řetězce a byly označeny CY1748RH_A, CY1748RH_B a CY1748RH_C. Nukleotidové sekvence a odpovídající aminokyselinové sekvence těchto variabilních oblastí a signálních peptidů jsou uvedeny na obr. 11, 12, resp. 13. V případě CY1748RH_B byly dva první myší zbytky, zachované v CY1748RH_A (glutamová kyselina a alanin), změněny zpět na původní lidské aminokyseliny (glutamin a valin), nacházející se v donoru lidském FR1. V případě CY1748RHc z počítačového modelování vyplývalo, že myší lysin v poloze 73 by mohl tvořit solný můstek se zbytkem 55 (asparagová kyselina) v CDR2. Pokud by tomu tak bylo, pak by byl lysin důležitý pro stabilizaci smyčky H2. Lidský threoninový zbytek v této poloze by byl neschopen takový solný můstek vytvořit. Tudíž verze CY1748RHq substituuje myší lysin v poloze CY1748RH^. Verze CY1748RHg obsahuje nejvyšší počet lidských aminokyselinových zbytků. Shrnutí aminokyselinových rozdílů mezi těmito třemi verzemi těžkého řetězce je uvedeno v tabulce 3.

Byly modelovány čtyři verze variabilní oblasti lehkého řetězce a byly označeny CY1748RL^, CY1748RLb, CY1748RLq a CY1748RLp. Nukleotidové sekvence a odpovídající aminokyselinové sekvence těchto variabilních oblastí a signálních peptidů jsou uvedeny na obr. 14, 15, 16, resp. 17. Z počítačového modelování vyplývalo, že myší glutamová kyselina v poloze 60 by mohla být důležitá při vazbě Pselektinu. Tento zbytek byl začleněn ve verzi CY17 48LR/_!l, ale ve verzi CY1748LRg byl nahrazen původním serinem z lidské základní struktury. Myší asparagová kyselina by mohla mít nábojovou interakci se zbytkem 24 ve smyčce 1 (Ll) , a tudíž je CY1748LRc identický s CY1748LRa s výjimkou náhrady myšího zbytku asparagové kyseliny v poloze 70 za glutamovou kyselinu z lidské základní struktury. CY1748LRp zahrnuje obě tyto náhrady aminokyselin a ze všech čtyř verzí obsahuje největší počet lidských aminokyselinových zbytků. Shrnutí aminokyselinových rozdílů mezi těmito čtyřmi verzemi lehkého řetězce je uvedeno v tabulce 4.

D, Subklonování cDNA, kódujících variabilní oblasti těžkého ..a lehkého řetězce, do expresních vektorů

1) Konstrukce expresních vektorů

a).......pHCMV-17 4 8 RL - KR - neo

Expresní vektor obsahuje zesilovač transkripce a promotor lidského cytomegaloviru (HCMV) k provedení transkripce lehkého řetězce rekombinačního imunoglobulinu, kódující sekvence bakteriálního genu neo, které působí jako dominantní volitelný markér během stabilní transformace, a

SV40 jako počátek replikace k dosažení vysokých úrovní dočasné exprese v buňkách cos. Za účelem konstrukce vektoru byl fragment HindlII-SacII z vektoru pUC8, obsahující fragment Pstl-m z HCMV (Boshart a d., Cell 41:521-530 (1985)), konvertován pomocí příslušných adaptorových oligonukleotidů na fragment EcoRI-HindlII. Při trojcestné ligaci byl l,2kb fragment EcoRI-HindlII, obsahující zesilovač transkripce-promotor HCMV. ligován k 5,05kb fragmentu z pSV2neo (Southern a Berg, J. Mol. App. Gener. 1:327341 (1982)) a 0,5kb fragmentu HindlII-BamHI, obsahujícímu lehkou variabilní oblast Vj^lys κ (Foote a Winter, J. Mol. Biol. 224:487-499 (1982)). Místo HindlII v pSV2neo bylo předtím odstraněno vyplněním Klenowovou polymerasou za vzniku vektoru označeného pHCMV-VLlys-neo.

Fragment 2,6 kb EcoRI genomové lidské κ oblasti byl klonován (Rabbitts a d., Curr. Top. Microbiol. Immunol. 113:166-171 (1984)) a subklonován do pUC vektoru pUCKR17 (Mengle-Gaw, EMBO J. 6:1959-1965 (1987)). Místa BamHI byla přidána k oběma koncům fragmentu pomocí adaptérů EcoRI-BamHI. Tento fragment pak byl vložen do místa BamHI v pHCMV-VLlysK^-neo v příslušné orientaci k vytvoření pHCMV-V£lys-K_p-neo. K usnadnění inserce přetvořených lidských variabilních oblastí bylo místo BamHI na 3'-straně lidské κ konstantní oblasti odstraněno vyplněním Klenowovou polymerasou. Ve vzniklém vektoru, označeném pHCMV-1748RL-KR-neo, je fragment HindlII-BamHI, obsahující V^ys, snadno nahrazen VL přetvořené protilátky.

b) pHCMV-174.9 :ýl.C-nsQ

Konstrukce tohoto vektoru byla zahájena stejnou trojcestnou ligací, jaká je popsána výše pro tvorbu pHCMVVLlys-neo, avšak s insercí 0,7kb fragmentu HindlII-BamHI, obsahujícího těžkou variabilní oblast V^lys (Verhoeyen a d., Science 239:1534-1536 (1988), Foote a Winter, viz výše) místo

0,5kb fragmentu HindiII-BamHI, obsahujícího lehký řetězec Vj^Lys K. Do místa BamHI byla vložena cDNA, kódující lidskou y 1 konstantní oblast, za vzniku vektoru označeného pHCMVV^ys-neo. cDNA, kódující lidskou yl konstantní oblast, byla klonována z lidské buněčné linie, vylučující lidskou yl protilátku, amplifikací PCR. Na každém konci cDNA byla vytvořena místa BamHI a na 5-konec sekvence cDNA bylo zavedeno akceptorové místo sestřihu a 65bp intronová sekvence. Fragment BamHI (1176 bp) obsahující lidskou yl cDNA plus akceptorové místo sestřihu a intronovou sekvenci pak byl klonován do expresního vektoru. Jako v případě expresního vektoru lehkého řetězce bylo místo BamHI na 3'-konci lidské y 1 konstantní oblasti odstraněno vyplněním Klenowovou polymerasou. U tohoto vektoru, označeného pHCMV-1748-ylC-neo, je fragment HindlII-BamHI, obsahující nežádoucí Vjjlys, snadno nahrazen V_H přetvořené protilátky.

2J_Inserce sekvencí kódujících imunoglobulin cDNA, kódující variabilní oblast těžkého řetězce mu MAb PB1.3 a tří humanizovaných verzí, byly standardními technikami vloženy do expresního vektoru HCMV-ylC-neo za vzniku expresních piasmidů HCMV-1747CH-ylC-neo, HCMV-1748RH_AylC-neo, HCMV-1748RH_B-ylC-neo a HCMV-1748RH_c-ylC-neo. Nukleotidová sekvence cDNA konstantní oblasti lidského IgG a sekvence odpovídajícího proteinu je uvedena v Ellison a d., Nuc. Acids Res. 10:4071-4079 (1982). cDNA, kódující variabilní oblast lehkého řetězce CY1747(PB1.3) a čtyř humanizovaných verzí, byly vloženy do expresního vektoru HCMV-KR-neo za vzniku piasmidů HCMV-1747CL-KR-neo, HCMV1748RL_A-KR-neo atd. Nukleotidová sekvence genu lidské κ konstantní oblasti a sekvence odpovídajícího proteinu je uvedena v Hieter a d., Cell 22:197-207 (1980; zahrnuto zde formou odkazu pro všechny účely). Schematické mapy expresních vektorů těžkého a lehkého řetězce jsou uvedeny na obr. 18 a

19. Současnou expresí vhodných kombinací těžkého a lehkého řetězce je možno exprimovat několik protilátek. Například současnou expresí HCMV-1748RH_A-ylC-neo a HCMV-1748RL_A-KR-neo vzniká přetvořená MAb PB1.3 (H_A/L_A). Současnou expresí HCMV1747CH-ylC-neo a HCMV-1747CL-KR-neo vzniká chi MAb PB1.3 (tj . chimérická protilátka zahrnující myší variabilní domény a lidské konstantní domény).

E, Elektroporace buněk COS

Konstrukce DNA byly testovány v buňkách COS na dočasnou expresi chi MAb PB1.3 a různé přetvořené verze protilátek MAb PB1.3. DNA byla do buněk zavedena elektroporaci pomocí zařízení Gene Pulser (Biorad). Buňky COS byly trypsinizovány a promyty jednou fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS) . DNA (po 10 pg plasmidů těžkého řetězce a plasmidů příslušného lehkého řetězce) a 0,8 ml alikvotu 1.10⁷ buněk/ml v PBS bylo vloženo do sterilní kyvety Gene Pulser (Biorad, mezera 0,4 cm). Byl vytvořen puls o 1900 V a kapacitanci 25 μ

F. Po 10 min zotavení při teplotě místnosti byly elektroporováné buňky přidány k 20 ml média DMEM (GIBCO/BRL), obsahujícího 10 % fetálního hovězího séra. Po 48 h inkubace bylo médium shromážděno, centrifugováno k odstranění buněčných zlomků a skladováno krátkodobě za sterilních podmínek při 4 °C.

Příklad 11

Analýza humanizovaných protilátek

Média z transfikovaných buněk COS byla analyzována pomocí ELISA za účelem kvantifikace hladin produkované lidské protilátky a analýzy schopnosti vázat se na rekombinační rozpustný P-selektin (rsP-selektin). Mikrotitrační plotny Immulon (Dynatech, #011-010-3355) byly povlečeny 100 μΐ/jamku roztoku kozího anti- lidského IgG (celá molekula, Sigma #11886) na konečnou koncentraci 12,5 pg/ml nebo roztokem rsPTi selektinu (1,2 mg/ml), zředěném Dulbeccovým fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (DPBS). Plotny byly povlečeny přes noc při 4 °C nebo po dobu 2 h při 37 °C. Pak byly plotny promyty třikrát DPBS. Poté byly plotny 1 h nebo déle při teplotě místnosti blokovány 400 μΙ/jamku DPBS + 1 % hovězího sérového albuminu (BSA, Sigma, #A-7 888) . Pak byly plotny promyty třikrát DPBS.

K plotnám byly přidány postupně ředěné monoklonální protilátky v DPBS + 1 % BSA (100 (tl/jamku) a plotny byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti. Pak byly plotny promyty třikrát DPBS. K plotnám bylo přidáno 100 (tl/jamku druhé protilátky (peroxidasový konjugát kozího anti- lidského IgG, Sigma #A-8867), zředěné 1:1000 v DPBS + 1 % BSA a plotny byly inkubovány 1 h při teplotě místnosti. Pak byly plotny promyty třikrát DPBS. K plotnám bylo přidáno 100 μΐ/jamku tetramethylbenzidinperoxidasového substrátu/H2C>2 (TMB,

Kirkegaard and Perry Laboratories #50-76-00), byla ponechána příslušná doba pro vývoj zbarvení (obvykle 3 až 15 min) a reakce byla zastavena přídavkem 100 μΐ/jarnku 1M kyseliny fosforečné. Plotny byly odečítány při 450 nm v zařízení Titertek Multiskan MCC/340.

Koncentrace protilátek, produkovaných ve všech supernatantech buněk COS, byla stanovena porovnáním výsledků ELISA pro IgG s lidskou protilátkou IgGl (lehký řetězec κ, Sigma #1-3889) o známé koncentraci.

Vazba P-selektinu byla vynesena jako optická hustota proti koncentraci IgG. Vazebné křivky chi PB1.3 a různých přetvořených verzí přetvořených MAb PB1.3 jsou uvedeny na obr. 20, 21 a 22. Účelem bylo vybrat humanizovanou protilátku, vykazující v podstatě nerozlišitelné vazebné charakteristiky od chi MAb PB1.3. Pokud by takové charakteristiky vykazovalo více humanizovaných protilátek, byla by preferována ta z nich, která obsahuje nejvíce lidských aminokyselinových zbytků (nebo nejméně myších aminokyselin), poněvadž u této verze je nejméně pravděpodobná indukce odpovědi HAMA v klinickém použití. Všechny čtyři přetvořené lehké řetězce, exprimované současně s těžkým řetězcem CY1748RH^, generovaly protilátky, které se vázaly na P-selektin i na chi MAb PB1.3. Z nich byla pro další experimenty vybrána variabilní oblast lehkého řetězce CY1748LRp, protože obsahuje nejvíce lidských aminokyselinových zbytků. Variabilní oblasti těžkého řetězce CY1748RH^ a CY17 48RHg, pokud byly exprimovány současně s variabilními oblastmi lehkého řetězce CY1748RL^ a CY1748RL_B, rovněž generovaly protilátky, které se vázaly na rsP-selektin ve stejném rozsahu jako chi MAb PB1.3 (obr. 22). Z těchto těžkých řetězců je preferován CY1748RHg, protože obsahuje nejvíce lidských aminokyselinových zbytků. Preferovaná humanizovaná protilátka je tedy tvořena z lehkého řetězce D a těžkého řetězce B a označuje se jako přetvořená MAb PB1.3 (H_b/L_d).

Příklad 12

Stabilní exprese přetvořené MAb PBI.3 (H_fi/Lp) v buňkách CHO

Δ._Zavedení_humanizovaných imunoglobulínových řetězců do buněk CHO

1) Konstrukce vektorů

a) pHCMV-1748RH-VlC-dhfr

Tento vektor je identický s pHCMV-1748RH-ylC-neo, popsaným v příkladu 11, s tou výjimkou, že gen neo je nahrazen dihydrofolátreduktasovým (dhfr) genem, navázaným na defektní sekvenci SV40 promotor - zesilovač transkripce. K odstranění sekvence zesilovače z časného promotoru SV40 byla piasmidová DNA pSV2-dhfr (Subramani a d., Mol. Cell. Biol. 1:854-864 (1981)) digerována s Sphl a PvuII, vyplněna

Klenowovou polymerasou a autoligována za vzniku pSV2-dhfr-ΔΕ. Fragment '3,7 kb EcoRI, obsahující promotor HCMV, variabilní oblast těžkého řetězce Vjjlys a genomový klon DNA lidské yl konstantní oblasti, byl pomocí EcoRI vyříznut z plasmidu pHCMV-V^lys-yl-neo. Tento fragment byl ligován k EcoRIdigerovanému pSV2-dhfr-ÁE k vytvoření pHCMV-V^lys-yl-dhfr. Genomický klon konstantní oblasti yl byl nahrazen fragmentem BamHI obsahujícím klon cDNA lidské konstantní oblasti yl popsáno v příkladu 11. Místo BamHI na 3'-konci lidské konstantní oblasti yl pak bylo odstraněno vyplněním Klenowovou polymerasou jako v příkladu 11. Výsledný vektor byl označen pHCMV-17 4 RH-yC-dhfr. Fragment HindlII-BamHI tohoto vektoru, obsahující nežádoucí V^lys, je snadno nahrazen V^ přetvořené protilátky.

fc>). pHgMV,-,1.7..43.RH:.y4. :,dhf I.

Tento vektor je identický s výše popsaným pHCMV-1748RH-y lC-dhfr až na náhradu klonu cDNA lidské konstantní oblasti yl genomickým klonem lidské konstantní oblasti y4. Za účelem konstrukce tohoto vektoru byl '7,0 fragment HindlII DNA, obsahující genomický klon lidské konstantní oblasti y4 (Bruggeman a d., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)) subklonován do místa HindlII pUC19 k vytvoření plasmidu s názvem 428D. Protože lidský fragment y4 již měl v blízkosti 3'-konce místo BamHI, byl subklon vložen do pUC19 v orientaci, která toto místo vzdálila od místa BamHI v polylinkeru pUC19. Lidský fragment y4 7,0 kb byl z 428D vyříznut pomocí BamHI a ligován do pHCMV - V_H lys-neo za vzniku plasmidu pHCMV-V^lys-y4-neo.

Konečný plasmid byl konstruován trojcestnou ligací 5,4kb fragmentu BamHI-HindlII, obsahujícího zesilovač-promotor HCMV a sekvenci plasmidu pSV2-dhfr-ΔΕ, 0,5kb fragmentu HindlIIBamHI, obsahujícího VH přetvořené lidské protilátky 1748, a

7,0 kb fragmentu BamHI-BamHI, obsahujícího genomický klon lidské konstantní oblasti γ4 .

2J_Inserce sekvencí kódujících imunoglobulin cDNA, kódující variabilní oblast těžkého řetězce 1748RH^, byla klonována do expresního vektoru HCMV-lC-dhfr za vzniku HCMV-1748RH^-lC-dhfr. cDNA, kódující 1748RHg, byla klonována do expresního vektoru HCMV-lC-dhfr, resp. HCMV-4Cdhfr, za vzniku plasmidu HCMV-1748RHg-lC-dhfr a HCMV-1748RHg4C-dhfr. Nukleotidovou sekvenci genu konstantní oblasti lidského IgG4 a odpovídající sekvenci aminokyselin uvádí Ellison a d., DNA 1:11-18 (1981). Vektor HCMV-lC-dhfr exprimuje protilátku isotypu IgGl a vektor HCMV-y4C-dhfr protilátku isotypu IgG4, je-li každý z nich exprimován současně s vektorem lehkého řetězce a. Schematické mapy dhf r expresních vektorů jsou uvedeny na obr. 23, resp. 24.

dhfr-Deficitní CHO buňky byly kultivovány v aMEM (+ nukleosidy, GIBCO/BRL) a 10% fetálním hovězím séru. Plasmidová DNA byla do buněk zavedena elektroporací pomocí zařízení Gene Pulser. CHO buňky byly trypsinizovány a jednou promyty fosfátem pufrovaným salinickým roztokem (PBS). Do sterilní kyvety Gene Pulser (mezera 0,4 cm) byla vložena DNA (po 10 ^g plasmidu těžkého řetězce a plasmidu příslušného lehkého řetězce) a 0,8ml alikvot 1.10⁷ buněk/ml v PBS. Byl generován puls o 19 00 V a kapacitanci 25 (iF. Po 10 min zotavení při teplotě místnosti byly elektroporované buňky přidány ke 20 ml aMEM (+ nukleosidy)/10% FBS. Po 24 až 48 h inkubace byly buňky trypsinizovány a naočkovány do misek 100 mm v aMEM (- nukleosidy)/10% dialyzované FBS (za účelem výběru pro expresi plasmidu obsahujícího dhfr), doplněné 500 /tg/ml G418 (GIBCO/BRL, za účelem výběru pro expresi plasmidu obsahujícího neo) . Média byla měněna každé 3 až 4 dny až do výskytu kolonií. Jednotlivé klony byly izolovány pomocí klonovacích válců, expandovány a analyzovány na produkci IgG pomocí ELISA.

Do dhfr-deficitních CHO buněk byly zavedeny tři sady DNA: 1) HCMV-1748RH_A-ylC-dhfr a HCMV-1748RL_A-KR-neo exprimující přetvořenou MAb PB1.3 (H_A/L_A), isotyp IgGl, 2) HCMV-17 48RHg-ylC-dhfr a HCMV-1748RLg-KR-neo exprimující přetvořenou MAb PB1.3 (Hg/L_D), isotyp IgGl, a HCMV-1748RHg-γ 4C-dhfr a HCMV-1748RLp-KR-neo exprimující přetvořenou MAb PB1.3 (Hg/Lp), isotyp IgG4.

Buňky CHO byly expandovány a nasazeny do lOkomorového (celkový povrch 6000 cm²) kultivátoru Nunc cell factories. Médium bylo sklizeno po 7 2 h a pasážováno přes sloupec protein A-Sepharose v koloně Fast Flow (Pharmacia). Kolona byla promytá a při pH 4,5 byl eluován hovězí IgG. Humanizované protilátky byly eluovány při pH 3,5, dialyzovány v PBS nebo 2 0 mM acetátu, 0,15 M NaCl, pH 5,5. Koncentrace protilátek byla stanovena spektrofotometricky a potvrzena metodou ELISA pro lidský IgG. (Jako kontrola pro mu MAb PB1.3 (Hg/Lg), isotyp IgG4, byla použita lidská protilátka IgG4 (x, Sigma #1-4639). Čistota byla potvrzena pomocí SDS-PAGE.

B, Test konkurenční vazby

Pomocí kompetitivního testu ELISA byly stanoveny relativní vazebné afinity různých verzí přetvořených MAb PB1.3 k P-selektinu. Test měří koncentraci neznačené protilátky, která inhibuje z 50 % vazbu značené mu MAb PBI.3 na P-selektin.

ml čištěné MAb PBI.3 (1 mg/ml) byly rozmíchány s 100,8 (ti NHS-LC-biotin (1 mg/ml, Pierce) a byla provedena inkubace přes noc při 4 °C. 2,lml vzorek byl vnesen na sloupec NAP 25 (vylučovací kolona, Pharmacia). Kolona byla eluována podíly po 0,3 ml PBS. Každá frakce byla odečítána při 280 nm. Frakce s nejvyšší optickou hustotou při 280 nm byly spojeny. Biotinylovaná MAb PBI.3 byla titrována proti rsP-selektinu, aby bylo možno zvolit příslušnou koncentraci pro použití při testu konkurenční vazby.

96jamková plotna (Microtest III, Falcon #3912) byla povlečena 50 /tl/jamku rsP-selektinu (zředěn na 2 /tg/ml v DPBS) přes noc při 4 °C nebo 90 min při 37 °C. Plotna byla převráceny a zbylá tekutina sklepána.

Povlečená plotna s další prázdnou plotnou byly 1 h při teplotě místnosti blokovány 200 /tl/jamku DPBS + l % hovězího sérového albuminu (BSA, Sigma #A-7888). Prázdná plotna byla převrácena a zbylá blokující tekutina byla sklepána. Plotna povlečená rsP-selektinem byla blokována dále během doby ředění protilátek. K prázdné plotně byla přidána řada postupně ředěných vzorků protilátek (v DPBS + 1 % BSA) v množství 50 /tl/jamku. Počáteční koncentrace protilátek činily 100 /tg/ml. K vzorkům protilátek na prázdné plotně byla v množství 50 /il/jamku přidána biotinylovaná PB1.3 (zředěná na 0,3 /tg/ml v DPBS + 1 % BSA) a promíchána opakovaným pipetováním. Plotna povlečená rsP-selektinem byla promyta třikrát DPBS. Směs vzorků protilátek a biotinylované PB1.3 byla po 50 /il/jamku napipetována na plotnu povlečenou rsPselektinem a ponechána inkubovat 1 h při teplotě místnosti. Pak byla plotna promyta třikrát DPBS.

Na plotnu byl přidán konjugát křenové peroxidasy a streptavidinu (Pierce #21124), zředěný 1:2000 v DPBS + 1 % BSA, v množství 50 /tl/jamku a ponechán inkubovat 1 h při teplotě místnosti. Plotna pak byla promyta třikrát DPBS.

Pak bylo k plotnám přidáno 50 /tl/jamku tetramethylbenzidinperoxidasového substrátu/H₂O₂ (TMB, Kirkegaard and Perry Laboratories #50-76-00), byla ponechána příslušná doba k vývoji zbarvení (obvykle 3 až 15 min) a reakce byla zastavena přídavkem 50 /tl (jamku 1M kyseliny fosforečné. Plotny byly odečítány při 450 nm na zařízení Titertek Multiskan MCC/340.

Zdánlivá vazebná afinita se vyjadřuje jako koncentrace protilátky, která se váže na P-selektin při polovině maximální optická hustoty při 450 nm. Poměr koncentrací při polovině maximální vazby vzorku protilátky ke kontrole (neznačená PBI.3) poskytuje odhad relativní vazebné afinity testované protilátky k P-selektinu.

Výsledky dvou typických experimentů konkurenční vazby jsou uvedeny na obr. 25 a 26. V prvním experimentu je k inhibici vazby značené PBI.3 na 50 % maxima nutné dvojnásobné množství přetvořené MAb PBI.3 (H^L^) , isotyp IgGl (2,0 jttg/ml) oproti PBI.3 (1,0 /tg/ml) . Tato humanizovaná protilátka tedy váže rsP-selektin z 50 % tak dobře, jako PBI.3. Podobně v druhém experimentu se PBI.3/(HgLp) (isotyp IgG4) váže na rsPselektin z 50 % tak dobře jako PBI.3.

Příklad 13

Zvýšeni produkce protilátek v buňkách CHO amplifikací dhfr

Buňky CHO byly naočkovány do baněk a ponechány dosáhnout konfluence před výměnou média (8 ml pro baňku T-25 cm² nebo 20 ml pro baňku T-7 5 cm²) . Po inkubaci po dobu 48 až 7 2 h bylo médium sklizeno a testováno pomocí ELISA na produkci IgG. Buňky byly trypsinizovány a spočteny. Produktivita protilátky byla vyjádřena jako množství protilátky v /tg, vyloučené jedním milionem buněk za 24 h.

Tři až šest nejproduktivnějších klonů bylo amplifikováno odděleně a zbylých sedm nej lepších klonů bylo spojeno a amplifikováno. Buňky byly naočkovány v hustotě 1.10⁵ buněk/100 mm misku v selekčním médiu. Pro první cyklus amplifikace byly buňky naočkovány ve třech sadách misek obsahujících aMEM (- nukleosidy)/10% dialyzované FBS doplněné 500 /tg/ml G418 a bud 10, 20 nebo 50 nM methotrexátu (Sigma # A-6770) . Kultury byly živeny každé čtyři dny. Po 10 až 14 dnech byly klonovacími válci izolovány jednotlivé kolonie, expandovány a testovány pomocí ELISA na produkci IgG. Další cyklus amplifikace byl proveden na jednotlivých klonech nebo poolech klonů při koncentracích methotrexátu 5 až lOkrát vyšších než počáteční koncentrace methotrexátu.

Tabulka 3 poskytuje souhrn produkce protilátek pro buňky CHO exprimující tři humanizované verze PBI.3. Jeden amplifikovaný klon exprimující přetvořenou MAb PBI.3 (HgLp) (isotyp lyG4) vznikl z poolu klonů, které exprlinovaly méně než 0,2 /ig/10⁶ buněk/den, amplif ikovaných na 2,0 jiig/lO⁶ buněk/den v prvním cyklu, a dosáhl 33,0 /jg/10⁶ buněk/den po třetím cyklu. Tento klon byl vybrán pro kultivaci při produkci přetvořené MAb PBI.3 ve velkém měřítku.

Příklad 14

Pokus v bioreaktoru

160 g mikroperliček, povlečených kolagenem (150 až 200 μ m, JRH Bioscience #60142-100), bylo 30 min hydratováno v 800 ml sterilní vody a voda byla dekantována. Perličky byly resuspendovány v 800 ml vody a 30 min au tok láv ovány. Po ochlazení na teplotu místnosti byly perličky promyty dvakrát sterilním oMEM (- nukleosidy) prostým séra a resuspendovány v 1 1 kompletního média aMEM (- nukleosidy)/5 % dialyzovaného FBS.

Buněčná linie CHO-48B4, která exprimuje přetvořenou MAb / PBI.3 (HgLp) (isotyp IgG4) v množství 33,0 /ig/10⁶ buněk/den, byla expandována do 36 T-225 cm² v aMEM (- nukleosidy)/10 % dialyzovaného FBS/500 nM methotrexátu. Když buňky dosáhly konfluence, byly trypsinizovány a resuspendovány v 2 1 kompletního média (bez methotrexátu) v konečné koncentraci

5,0 až 8,0.10⁴ buněk/ml.

1 perliček, 2 1 suspenze buněk a 2 1 čerstvého kompletního média byly asepticky přidány do 101 autoklávové nádoby bioreaktoru Próteus 2000 (Wheaton). Horní prostor byl kontinuálně proplachován vzduchem a 5 % CC>2 . Za účelem přilnutí buněk k mikroperličkám bylo míchání suspenze buněk a mikroperliček v přístroji Próteus naprogramováno na 70 min'¹ po dobu 1 min a 0 min'po dobu 59 min. Po celkem 48 cyklech bylo 5 1 média přidáno do bioreaktoru, který byl naprogramován tak, aby udržoval teplotu suspenze 37 “C, pH 7,0, rozpuštěný kyslík na hodnotě 30 % vzduchu a který byl kontinuálně míchán rychlostí 50 min¹.

Po 3 dnech byl bioreaktor naprogramován pro výměnu kompletního média v množství 5 1/den pomocí gravitačního filtru, připevněného ke sklízecímu výstupu (aby mikroperličky zůstaly v reaktoru). Sklizené médium bylo do zpracování uchováváno při 4 °C. Bioreaktor běžel 5 až 7 dní, dokud nahromaděné buněčné zlomky nezakalily sklízené médium (v důsledku poruchy aerace).

Sklizené médium bylo vyčiřeno průchodem filtrem Millipak-60 0,45 μια (Millipore). 20 1 přefiltrovaného supernatantu bylo přiváděno v množství 0,55 1/h na sloupec (2,5 x 12 cm) protein A-Sepharose (Fast Flow, Pharmacia). Poté, co sloupcem prošel všechen supernatant, byl sloupec promyt 1,5 1 PBS (BioWhittaker, #17-516Y). Sloupec byl předběžně eluován 8x 40 ml 0,2M acetátu sodného, pH 4,5 a pak eluován 8 x 40 ml 0,2M glycinu, 0,5M NaCl, pH 3,5, vždy do zkumavek obsahujících 10 ml 2M Tris-HCl, pH 8,0. Samostatná frakce s nejvyšší absorbancí při 280 nm byla dialyzována do 2 0mM acetátu, 0,15M NaCl, pH 5,5 a skladována při 4 °C.

Po dobu 5 až 7 dní bylo sklízeno 200 mg protilátky za den. Výtěžek čištění byl přibližně 50 %. Jeden cyklus reaktoru tedy poskytuje 500 až 700 mg čištěné protilátky.

Příklad 15

Účinek mu MAb PB1.3 na poškození tkáně vyvolané ischemií a reoerfusí po replantaci králičího ucha

Králíci (New Zealand White) byli anestetizováni kombinací ketaminu a xylazinu s následující infiltrací lidocainu do báze ucha. Levé ucho bylo částečně amputováno, přičemž byla centrální tepna, žíla a chrupavkový můstek ponechány intaktní. Všechny nervy byly rozděleny, aby bylo ucho totálně anestetické. Pak bylo ucho znovu připevněno a na arterii byla umístěna mikrovaskulární svorka k vyvolání úplné ischemie. Králíci byli drženi 6 h v místnosti, udržované na teplotě 23,5 °C, pak byla mikrovaskulární svorka odstraněna, by mohlo ucho reperfundovat. Ošetření bylo provedeno těsně před reper fusí bud mu MAb PB1.3 (2 mg/kg) nebo salinickým roztokem nebo isotypově souhlasnou (IgGl) myší monoklonální protilátkou označenou PNB1.6 (2 mg/kg) . Po dobu 7 dní byl denně měřen objem ucha vytlačením vody ke kvantifikaci tkáňového edemu. 7. den byla stanovena nekrosa jako procento celkového povrchu.

U kontrolních zvířat, jimž byl po reperfusi ucha podáván bud salinický roztok nebo PNB1.6, bylo stanoveno významné zvýšení objemu ucha (obr. 27). Protože nebyly zaznamenány rozdíly mezi těmito dvěma kontrolními skupinami, byly jejich výsledky spojeny. Zvětšení edemu bylo pozorováno i u zvířat ošetřených MAb PB1.3, avšak magnituda tohoto zvětšení v měřených časových bodech byla významně menší než u kontrolní skupiny. Rozsah nekrosy, měřený 7. den, byl u zvířat ošetřených mu MAb PB1.3 také významně snížen v porovnání s kontrolními zvířaty.

Ischemie s následující reperfusí replantovaného králičího ucha tedy vyvolává edematózní odpověd, zpočátku následovanou intenzivní nekrosou tkáně. Tyto dva projevy poškození tkáně jsou podstatně a významně sníženy u zvířat, předem ošetřených protilátkou proti P-selektinu mu MAb PBI.3.

Příklad 16

Účinek mu MAb PBI.3 na vaskulární průchodnost po ischemii a reperfusi psího kosterního svalu

Tento experiment používá model ischemie a reperfuse na izolovaném psím štíhlém svalu. Jedním aspektem reperfušního poškození je jev zvaný no-reflow, při němž je po reperfusi nepřítomen nebo silně redukován tok krve mikrooběhem předtím ischemické tkáně.

Byl použit dříve popsaný preparát psího štíhlého svalu (Carden a d., Circ. Res. 66:1436-1444 (1990)). Stručně řečeno dospělí nečistokrevní psi byli anestetizováni pentobarbitalem sodným. Kůže ležící nad štíhlým svalem byla rozdělena a sval byl uvolněn z pojivové tkáně tupým oddělením. Uzavírací nerv byl přeříznut. Proximální kaudální tepna i žíla byly kanylovány a všechny ostatní cévy podvázány. Kanyla femorální tepny byla připojena na perfusní čerpadlo s konstantním průtokem a výtok z femorální žíly byl odveden do reperfusního zásobníku. Tepenný a žilní tlak byl sledován na postranních větvích a průtok krve byl nastaven tak, aby perfusní tlak byl udržován na 100 mm Hg. Vaskulární izolace byla považována za úplnou, jestliže arteriální perfusní tlak po vypnutí perfusního čerpadla klesl na méně než 20 mm Hg.

Mikrovaskulární průchodnost byla po skončení experimentu zjištována per fusí izolovaného štíhlého svalu kontrastním médiem (tuš). Komputerizované videozobrazení bylo použito ke kvantifikaci počtu mikrocév obsahujících tuš (průměr < 10 /im) na svalové vlákno v histologických řezech získaných z izolovaných psích štíhlých svalů, podrobených kontinuální per fusi po dobu 4,5 h, ischemii po dobu 4 h a pak po dobu 0,5 h reperfusi nebo ischemické reperfusi v přítomnosti protilátky proti P-selektinu mu MAb PB1.3 v koncentraci 40 μ g/ml v perfusátu.

Provedením ischemie a refperfuse se snížil počet průchodných mikrocév na 36 í 3 % hodnoty stanovené pro kontrolní zvířata. Jestliže byla v perfusátu zahrnuta mu MAb PB1.3, činil počet průchodných mikrocév po ischemii a reperfusi 119 ± 18 % kontroly.

Protilátka proti P-selektinu mu MAb PB1.3 tedy kompletně zabraňovala vývoji jevu no-reflow v ischemickém a reperfundovaném psím štíhlém svalu, stanoveno počtem průchodných mikrocév.

Příklad 17

Účinek mu MAb PB1.3 na interakce leukocvtú a endotheliálních buněk vyvolané degranulací žírnvch buněk tkáně I. Metody

a) Intravitální mikroskopie

Samci krys Wistar (200 až 250 g) byli získáni u Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, a před chirurgickým procesem byli po dobu 12 až 24 h podrobeni hladovění. Chirurgická intramuskulární injekcí levé jugulární žíly byl spontánního dýchání byla anestesie byla vyvolána ketamin/rompun/acepromazinu. Do umístěn katetr a k usnadnění provedena tracheotomie. Bylo oholeno a omyto břicho a podél střední čáry do peritoneální dutiny byl opatrně, aby nedošlo ke krvácení, proveden řez dlouhý 3/4 . Krysa byla položena na stojan mikroskopu, speciálně upravený pro intravitální mikroskopii. Byla vyjmuta dobře vaskularizovaná zadní klička ilea a mesenterium bylo přetaženo přes pozorovací podstavec, vyhřívaný na 37 °C. Během celého experimentu bylo mesenterium super fundováno zahřívaným bikarbonátem pufrovaným salinickým roztokem (37 °C, pH 7,4) v množství 2 ml/min. Kromě toho byly na ileum a na oblasti mesenteria kolem pozorované plochy vloženy malé kousky Saran-Wrap (předem máčené v alkoholu a propláchnuté v salinickém roztoku), aby byly udrženy vlhké. Intravitálním mikroskopem (Mikron Instruments, San Diego), vybaveným okuláry lOx a objektivem 20x (ponořený ve vodě, numerický otvor 0,4) bylo pozorováno mikrocirkulační řečiště. Videozáznam mikroskopického obrazu byl umožněn videosystémem vysokého rozlišení, tvořeným videokamerou (Hitachi color CCD), nasazenou na mikroskop, časovačem videa (American Video Equipment), VCR (Sony SVO-9500MD) a monitorem (Sony Trinitron). V každém mesenteriálním preparátu byly vybrány tři postkapilární venulární segmenty o délce přibližně 180 μπι pro opakované měření podle těchto kriterií: (1) skutečná postkapilární venula, zásobovaná krví z konfluentních kapilár, průměr 15 až 30 /zm, (2) čilý průtok krve, takže není možno rozeznat jednotlivé červené krvinky, (3) určité bazální hromadění leukocytú (v kterémkoli okamžiku přítomno ve vaskulárním segmentu méně než 8 leukocytú), avšak žádná pevná adhese leukocytú. Pevná adhese leukocytu se definuje tak, že leukocyt zůstane nepohyblivý u stěny cévy více než 30 s.

b) Experimentální postup

2é a 25 min po dokončení chirurgického procesu byly pořízeny jednominutové videozáznamy bazální interakce leukocytú ve vybraných venulách. Všechna ošetření byla provedena intravenózně před druhým bazálním záznamem. 30 min po chirurgickém úkonu byla zahájena infuse sloučeniny 48/80 (Sigma, katalog #C4257) do superfusního pufru a trvala do konce experimentu. Tím se dosáhlo konečné koncentrace 10 μ g/ml v mesenteriu a účelem bylo vyvolat degranulaci žírných buněk. Venuly byly podrobeny záznamu opět po 20 a 30 min po zahájení aplikace 48/80. Rozsah interakcí leukocytyendotheliální buňky byl stanoven po skončení experimentu analýzou videozáznamů na páscích. Počet jasně viditelných Ieukocytů (tj . buněk interagujících se stěnou cévy) byl stanoven ze záběrů zastavených přesně v čase 0, 15, 30, 45 a 60 s zaznamenané sekvence a byl vypočten průměr z těchto pěti hodnot. Počet Ieukocytů tedy zahrnoval jak volně se pohybující, tak pevně adherované buňky.

c) Statistika

Každá experimentální skupina obsahovala 5 až 6 zvířat se 2 až 3 venulami z každého zvířete. Je uvedena střední hodnota a její standardní odchylka. Významné rozdíly mezi skupinami byly testovány variační analýzou s následujícím testem HSD podle Tukey-Kramera. Rozdíly u jednotlivých venul před ošetřením a po něm byly studovány zdvojenými t-testy. Všechny testy byly prováděny s použitím software JMP na Mackintosh Ilsi a významnost byla uznána při p < 0,05.

ii. výgledky

Topická aplikace sloučeniny 48/80 na krysí mesenterium vedla k viditelné degranulaci více než 90 % žírných buněk, která proběhla do 3 min po aplikaci. V důsledku toho bylo pozorováno zvýšení hromadění a adhese Ieukocytů. Nebyl pozorován významný rozdíl v akumulaci Ieukocytů mezi časovými body 20 min a 30 min po aplikaci 48/80, a proto byla ve statistické analýze použita střední hodnota z těchto dvou měření. Variabilita od venuly k venule v tomto modelu byla značně vysoká, přičemž bazální interakce se pohybovala od přítomnosti 0 do 4,8 Ieukocytů v jednotlivých venulách a interakce vyvolaná žírnými buňkami se pohybovala od 2,8 do 25,6 Ieukocytů ve skupině ošetřené PBS (koeficient variability CV = 37 %) . Průměry pro zvíře vykazovaly mnohem nižší variabilitu (CV = 16 %) ; každá jednotlivá venula proto byla pro statistické účely považována za samostatnou experimentální jednotku.

Jak je patrné z obr. 29, intravenózní ošetření mu MAb PB1.3 vyvolalo inhibici žírnými buňkami vyvolané intravaskulární akumulace leukocytú o 90 % oproti kontrolní skupině ošetřované formulací s pufrem. Nereaktivní protilátka P6H6 neměla v tomto modelu žádný účinek.

Podávání protilátky proti P-selektinu mu MAb PB1.3 krysám tedy zcela brání interakci leukocytú s vaskulárním endothelem a jejich následné migraci do tkání, indukované aplikací degranulačního prostředku pro žírné buňky 48/80.

Příklad 18

Mapování epitopu mu MAb PB1.3 P-selektin je integrální membránový glykoprotein, destiček a je P-selektin Maturovaná zahrnuj ícími tandemových Protein, Klonování nacházející se v endotheliálních buněk, rychle redistribuován molekula je protein lektinovou oblast, sekrečních granulách

Po buněčné aktivaci do plasmové membrány s různými doménami, oblast EGF, devět konvenčních repetic (CRP) C3b-C4b Regulátory transmembránovou oblast a cytoplasmatickou doménu a popis P-selektinu viz Johnston a d., Cell 56:1033-1044 (1989, zde zahrnuto jako celek formou odkazu pro všechny účely). Obr. 30 znázorňuje navržené schéma svinování domén Pselektinu.

Deleční analýzy P-selektinu

Za účelem mapování epitopu, specificky vázaného mu MAb PB1.3, byla provedena konstrukce mutantú rekombinačního Pselektinu vypuštěním posloupných domén CRP (obr. 31) . Tato místně specifická mutagenese byla provedena amplifikací PCR s použitím primerů specifických pro každou doménu CRP (tabulka 6). Templátem, použitým pro PCR-mutagenesi, byl pUC DNA klon P-selektinu, který byl zkrácen a mutován v poloze 2354 sekvence DNA (polohy v sekvenci jsou v souladu s publikovanou sekvencí P-selektinu podle Johnstona a d., viz výše). Tento templátový plasmid pGÁl,T, který byl původně derivován mutagenesí in vitro, postrádá transmembránovou doménu a cytoplasmový karboxyterminální konec P-selektinu a místo toho kóduje 11 karboxyterminálních aminokyselinových zbytků SV40 velkého T antigenů. Tento SV40-derivovaný C-terminál je rozpoznáván monoklonální protilátkou KT-3 (viz MacArthur a d., Journal of Virology 52:483-491 (1984)). Po amplifikaci PCR byly deleční molekuly DNA čištěny, ligovány, transformovány do bakterií, klonovány a sekvenovány dále popsaným způsobem. DNA s příslušným napojením CRP k sekvenci tag T-antigenů byly subklonovány do expresního vektoru pcDNAl (Invitrogen) a transfikovány do buněk COS.

Mutagenese PCR byla provedena na plasmidu pGMPÁl,T. Po fosforylaci na 5'-konci byly do jednotlivých reakcí PCR přidávány primery v tabulce 6 v množství 1 μΜ spolu s primerem sekvence T-antigenu lys-1. Metoda PCR byla prováděna v zařízení Perkin Elmer-Cetus po dobu 30 cyklů po 50 s při 95 °C, 1 min při 50 °C a 4 min při 7 3 °C s použitím polymerasy

Pfu (Stratagene) podle podmínek doporučených výrobcem. Po přečištění elektroforézou na agarózovém gelu a eluci pomocí Qiaex (Qiagen Corp.) byly mutované pUC DNA ligovány a transformovány do buněk InvFOi E. coli (Invitrogen). Klonované DNA, nesoucí požadovanou mutaci, byly identifikovány sekvenční analýzou DNA a fragmenty Sall-Hpal, obsahující gen mutovaného P-selektinu, byly klonovány do míst Xhol a Xbal expresního vektoru pcDNAl (Invitrogen). Klony transformovány do kmene MC1061 E. coli a čištěné plasmidové DNA byly použity pro pcDNA byly (Invitrogen) transfekci do COS.

Metoda transfekce DEAE-dextran

Tato metoda je popsána v Kriegler, M., Gene Transfer and Express ion: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company (1990). Buňky COS byly naočkovány v množství 1.10⁶ buněk/100 mm misku v DMEM (Biowhittaker) , 10 % fetálního hovězího séra (FBS) . V den 2 byla piasmidová DNA vysrážená ethanolem a resuspendována v koncentraci 20 pg/ml ve sterilním TE (10 mM Tris, pH 8,0, 1 mM EDTA) . 150 μΐ DNA bylo smí seno s 300 μΐ sterilního TBS (salinický roztok pufrovaný Tris, 140 mM NaCl, 5 mM KC1, 1,4 mM Na₂HPO₄, 25 mM Tris-báze, pH 7,5, 1,0 mM

CaCl₂ a 0,5 mM MgCl₂) a s 300 μΐ sterilního DEAE-dextranu (Sigma, #D-9885, 1 mg/ml v TBS). Růstové médium bylo odsáto a buněčné monovrstvy byly promyty jednou PBS a jednou TBS. K monovrstvě bylo přidáno 750 μΐ směsi DNA/DEAE-dextran/TBS. Miska byla inkubována při teplotě místnosti uvnitř digestoře s laminárním prouděním a každou 1 h s ní bylo 5 min kýváno. Po 1 h byl roztok DNA odsát a buňky byly promyty jednou TBS a pak jednou PBS. Pak byly buňky inkubovány v kompletním médiu, doplněném 100 μΜ chlorochinu (Sigma, #C-6628) při 37 ^eC, 5 % CO₂. Po 4 h bylo médium nahrazeno kompletním médiem a buňky byly inkubovány při 37 °C a 5 % CO₂. Po 48 h post -transfekce bylo buňkám dodáno růstové médium DMEM neobsahující sérum. Po dalších 24 h bylo médium sklizeno, buněčné zlomky byly odstraněny odstředěním při 1500 min'¹ po dobu 5 min ve stolní klinické odstředivce.

Záchvtová ELISA pro analýzu vyloučených mutačních proteinů P-selektinu

96jamková plotna Costar byla přes noc při 4 °C povlečena protilátkou KT-3 (produkovanou v ascites a čištěnou na Protein G-Sepharose, Pharmacia) o koncentraci 40 /ig/ml v množství 100 μΐ/jamku. Plotna byla promyta 3x DPBS, blokována 1 h při teplotě místnosti 250 μΐ/jamku DBPS + 1 % BSA. Pak byla plotna promyta 3x DPBS a inkubována 2 h při teplotě místnosti se supernatanty buněk COS v množství 100 μΐ/jamku. Po promytí plotny 3x DPBS byl navázaný P-selektin detekován přídavkem bud 100 μΐ/jamku (a) 1 ng/ml králičího anti-Pselektinového polyklonálního Ig nebo (b) biotinylované mu MAb PB1.3 nebo (c) biotinylované P6H6, ředěné 1 h při teplotě místnosti v DPBS/l % BSA. Po promytí plotny 3x DPBS byla detekována králičí protilátka s použitím 100 μΐ/jamku ředění 1:1000 HRP-konjugované kozí anti-králičí protilátky (Biorad), blokované 30 min při teplotě místnosti tkáňovým kultivačním médiem z buněčné linie KT-3 (10%) . Biotinylované protilátky byly detekovány s použitím 100 μΙ/jamku ředění 1:1000 HRPstreptavidinu (Pierce) po dobu 30 min při teplotě místnosti. Navázaná HRP byla inkubována s TMB a reakce ukončena IM kyselinou fosforečnou. Obr. 32 znázorňuje signál menší než pozadí ze supernatantů simulované transfikovaných buněk COS. Sloupec simulace je supernatant z buněk transfikovaných formou P-selektinu o plné délce, které chybí tag SV40 Tantigenu, a není proto detekována při této metodě záchytové ELISA pomocí KT-3. Na ose X jsou uvedeny počty CRP, exprimovaných cDNA různých mutantú P-selektinu, od všech 9 CRP ve sloupci 2 k jednomu CRP ve sloupci 10. Výsledky ukazují, že přestože je možno mutanty P-selektinu, jimž chybí 5 karboxyterminálních CRP, detekovat polyklonálním králičím Ig, nereagují tyto molekuly s PB1.3. Z toho by vyplývalo, že vazebné místo pro PB1.3 leží uvnitř oblasti páté repetice CRP.

Za účelem potvrzení výsledků z mapování epitopu byla deleční analýza rozšířena na deleci pouze páté oblasti CRP s ponecháním karboxyterminálních sekvencí P-selektinu intaktních (viz obr. 30). K odstranění oblasti P-selektinu, kódující aminokyseliny 407 až 468 (tabulka 6) byly navrženy amplimery PCR stejným způsobem jako výše. Supernatanty buněk byly analyzovány přímo ELISA s protilátkami mu MAb PB1.3 a P6H6 (obr. 33). Přestože se mu MAb PB1.3 váže na intaktní P91 selektin, neváže se na deleční molekulu. P6H6 se váže na obě molekuly ekvivalentně.

Analýzy syntetických peptidů

Epitop mu MAb PBI.3 byl dále charakterizován syntetizováním peptidů překlenujících oblast 62 aminokyselin pátého CRP P-selektinu (obr. 34) a screeningem vazby mu MAb PBI.3 pomocí ELISA. Pátá oblast CRP sahá od aminokyseliny 407 do 468 podle nomenklatury podle Johnstona a d. Peptidické sekvence jsou 968.01, aminokys. 408-426; 968.02, aminokys. 418-436; 968.04, aminokys. 408-433; 968.05, oxidovaná verze 968.04; 968.06, aminokys. 428-447, a 968.08, aminokys. 448467. Každý peptid byl rozpuštěn na 2 mg/ml v dimethylsulfoxidu (DMSO) a povlečen na 96jamkovou mikrotitrační plotnu neředěním 1 pg do 100 μί PBS a sušen přes noc při 37 °C. Povlečené jamky byly promyty PBS a blokovány 30 min při teplotě místnosti 250 μΐ/jaraku roztoku PBS/1 % BSA. Pak byly jamky promyty PBS a inkubovány při teplotě místnosti se 100 μΐ/jarnku PBI.3, zředěné na 1 /ig/ml v PBS/l % BSA. Navázaná mu MAb PBI. 3 byla detekována HRPkonjugovanou kozí anti-myší protilátkou a substrátem TMB, jak popsáno výše. Na obr. 34 je uvedeno porovnání reaktivity PBI.3 s peptidy. Karboxyterminální peptid č. 968.08 silně reagoval s PBI.3. Epitop rozpoznávaný PBI.3 je tedy mapován mezi aminokyselinami 448 až 467 v páté CRP lidského Pselektinu.

Vynález byl pro jasnost a srozumitelnost popsán v těchto příkladech a ve výše uvedeném popisu poněkud podrobněji. Je však zřejmé, že v rozsahu připojených patentových nároků je možno provádět určité změny a modifikace. Všechny výše citované publikace a patentové přihlášky jsou zde vždy jako celek zahrnuty formou odkazu pro všechny účely v takovém rozsahu, jako by byly jednotlivě celé uvedeny.

TABULKA 1

PŘIŘAZENÍ SEKVENCÍ AMINOKYSELIN VEDOUCÍ K NÁVRHU VARIABILNÍ OBLASTI TĚŽKÉHO ŘETĚZCE PŘETVOŘENÉ LIDSKÉ PB1.3

KabaC č. FR či myší myší lidská lidská RHV^A pozn. CDR 17 47 II A I_21/28'Cl 1747

1	1	FR1	E	E	Q	PCA	E	klonování k Hl,
2	2	1 1	A	V	V	V	Δ	možná role při vazbě antigenu neobvyklá aminokys
3	3	1 t	Q	Q	Q	Q	Q	klonování do Hl, možná role při vazbě antigenu
4	4	1 1	L	L	L	L	L
5	5	1 1	Q	Q	V	V	V
6	6	1 1	Q	Q	Q	Q	Q
7	7	1 1	s	S	s	S	s
8	8	1 1	G	G	G	G	G
9	9	1 »	P	P	A	A	A
10	10	1 1	E	E	E	E	E
11	11	í 1	L	L	V	V	V
12	12	1 1	V	V	K	K	K
13	13	1 1	E	K	K	K	K
14	14	1 1	P	P	P	P	P
15	15	í 1	G	G	G	G	G
16	16	1 J	A	A	A	A	A
17	17	1 1	S	S	S	S	S
18	18	1 1	V	V	V	V	V
19	19	1 t	K	K	K	K	K
20	20	1 1	V	I	V	v	V
21	21	1 1	S	s	S	s	s
22	22	1 1	C	c	C	c	c
23	23	1 1	K	K	K	K	K
24	24	1 1	A	A	A	A	A
25	25	1 1	S	S	s	s	S
26	26	1 1	G	G	G	G	G*
27	27	1 1	Y	Y	Y	Y	Y*
28	28	1 1	T	T	T	T	T*
29	29	» «	P	P	P	P	P*
30	30	FR1	T	T	T	T	T*
31	31	CDRl	N	D	S	S	N*
32	32	ί 1	Y	Y	Y	Y	Y*
33	33	1 1	V	Y	A	A	V
34	34	1 r	M	M	I	M	M*
35	35	1 1	H	N	s	H	H
35A 35B 36	36	1 i CDRl FR2	W	W	w	W	W
37	37	1 i	V	V	v	V	V
38	38	t 1	K	K	R	R	R
39	39	1 t	Q	β	Q	Q	Q
40	40	1 1	K	s	A	A	A
41	41	1 »	P	P	P	P	P
42	42	1 1	G	G	G	G	G
43	43	1 1	Q	K	Q	Q	Q

44	44	G	s	G	R	R
45	45			L	L	L	L	L
46	46			E	E	E	E	E
47	47			W	W	W	W	W
48	48			I	I	M	M	M
49	49	FR2	G	G	G	G	G
50	50	CDR2	F	D	W	W	F
51	51			I	I	I	I	I
52	52			N	N	N	N	N
52A	53			P	P	P	A	P*
52B				-	-	Y	-	-
52C				-	-	-	-	-
53	54			S	G	G	G	s*
54	55			N	N	N	N	N*
55	56			D	G	G	G	D*
56	57			G	G	D	N	G
57	58			P	T	T	T	P
58	59			K	S	N	K	K
59	60			Y	Y	Y	T	Y
60	61			N	N	A	S	N
61	62			E	Q	Q	Q	E
62	63			R	K	K	K	R
63	64			F	F	F	F	F
64	65			K	K	Q	Q	K
65	66	CDR2	N	G	G	G	N
66	67	FR3	K	K	R	R	R
67	68			A	A	V	V	V
68	69			T	T	T	T	T
69	70			L	L	I	I	I
70	71			T	T	T	T	T
71	72			S	V	A	R	s*
72	73			D	D	D	D	D
73	74			K	K	T	T	T
74	75			s	S	S	s	S
75	76			s	s	T	A	A
76	77			s	s	s	S	S
77	78			T	T	T	T	T
78	79			A	A	A	A	A
79	80			Y	Y	Y	Y	Y
80	81			M	M	M	M	M
81	82			E	C	E	E	E
82	83			L	L	L	L	L
82A	84			S	S	S	S	S
82B	85			S	S	S	S	S
82C	86			L	L	L	L	L
83	87			T	T	R	R	R
84	88			s	S	S	S	S
85	89			E	E	E	E	E
86	90			V	D	D	D	D
87	91			S	S	T	T	T
88	92			A	A	A	A	A
89	93			V	V	V	V	V
90	94			Y	Y	Y	Y	Y
91	95			P	Y	Y	Y	Y

kanonická struktura H2, může podporovat H2

92	96	ί C	c	c	c	c
93	97	1	A	A	A	A	A
94	98	FR3	R	R	R	R	R
95	99 CDR3	A	G	A	G	A
96	100		R	X	P	-	R
97	101		P	Y	G	-	P
98	102		G	Y	Y	-	G
99	103		F	s	G	G	F
100	104		D	s	S	-	D
100A			-	s	G	-	-
100B			-	Y	G	-	-
100C			-	M	G	-	-
100D			-	X	C	-	-
100E			-	A	Y	-	-
100F			-	X	R	Y	-
100G			-	X	G	Y	-
100H			-	Y	D	G	-
1001	105		W	Y	Y	S	W
100J	106		Y	A	-	G	Y
100K	107		F	F	F	S	F
101	108		D	D	D	N	D
102	109 CDR3	V	Y	Y	Y	V
103	110 FR4	W	W	W	W	W
104	111		G	G	G	G	0
105	112		A	Q	Q	0	Q
106	113		G	G	G	G	G
107	114		T	T	T	T	T
108	115		T	T	L	L	L
109	116		v	V	V	V	V
110	117		T	T	T	T	T
111	118		v	v	V	V	V
112	119		s	s	s	S	s
113	120 FR4	s	s	s	S	s

TABULKA 2

PŘIŘAZENÍ SEKVENCÍ AMINOKYSELIN VEDOUCÍ K NÁVRHU VARIABILNÍ OBLASTI LEHKÉHO ŘETĚZCE PŘETVOŘENÉ LIDSKÉ PB1.3

Kabat č.

1

2

3

4

5

6

7

8

FR či myší myší CDR 1747 «-V

FR1 D D ! I I

V Q

Μ M

T T

Q Q ' s s

Q P lidská lidská RHV_L JC2_DEN_1242

D D D

III*

Q Q Q

Μ Μ M τ T T

Q Q Q

S S S

P P P pozn.

9	9	K	s	S	S	S
10	10			F	s	S	T	T
11	11			M	L	L	L	L
12	12			S	S	s	S	S
13	13			T	A	A	A	A
14	14			s	S	S	S	S
15	15			v	L	V	V	V
16	16			G	G	G	G	G
17	17			D	D	D	D	D
18	18			R	R	R	R	R
19	19			V	V	V	V	V
20	20			S	T	T	T	T
21	21			V	I	I	I	V
22	22			T	T	T	T	T
23	23	FR1	c	C	c	c	C
24	24	CDR1	K	R	R	R	K
25	25			A	A	A	T	A*
26	26			S	S	S	S	S*
27	27			Q	Q	Q	Q	Q*
27A	28			N	D	S	S	N
27B				-	-	L	-	-
27 C				-	-	V	-	-
27D				-	-	-	-	-
27 E				-	-	-	-	-
27 F				-	-	-	-	-
28	29			V	D	s	I	V*
29	30			A	I	I	A	A*
30	31			T	S	s	R	T*
31	32			N	N	N/S	W	N*
32	33			V	Y	Y	L	V*
33	34			V	L	L	A	V*
34		CDR1	-	N	A	-	-
35	35	FR2	W	W	W	W	W
36	36			Y	Y	Y	Y	Y
37	37			Q	Q	Q	β	Q
38	38			Q	Q	Q	Q	Q
39	39			R	K	K	K	K
40	40			P	P	P	P	P
41	41			G	G	G	G	G
42	42			Q	Q	K	E	E
43	43			s	s	A	A	A
44	44			P	P	P	P	P
45	45			K	K	K	K	K
46	46			A	L	L	L	A

podporujcí LI.1 může přerušit zónu může podporovat L2.

L může změnit orientaci L2

47	47	i 1	L	L	L	L	L
48	48	1 J	I	I	I	I	I*
49	49	FR2	Y	Y	Y	Y	Y
50	50	CDR 2	T	Y	A	G	T*
51	51	1 i	A	A	A	A	A*

52	52	S	S	S
53	53			Y	R	S
54	54			R	L	L
55	55			F	H	E
56	56	CDR2	S	S	S
57	57	FR3	G	G	G
58	58			V	V	V
59	59			P	P	P
60	60			E	S	S
61	61			R	R	R
62	62			F	F	F
63	63			S	S	S
64	64			G	G	G
65	65			S	S	S
66	66			G	G	G
67	67			S	S	S
68	68			G	G	G
69	69			T	T	T
70	70			D	D	D

71	71	1 1	F	Y	F
72	72	1 i	T	S	T
73	73	1 1	L	L	L
74	74	1 1	T	T	T
75	75	1 1	I	I	I
76	76	t 1	T	s	s
77	77	1 t	N	N	s
78	78	1 1	V	L	L
79	79	t t	Q	E	Q
80	80	1 1	S	Q	P
81	81	1 1	E	E	E
82	82	I 1	D	D	D
83	83	1 1	L	I	F
84	84	1 1	A	A	A
85	85	1 1	D	T	T
86	86	1 t	Y	Y	Y
87	87	1 í	F	F	Y
88	88	FR3	C	C	C
89	89	CDR3	Q	Q	Q
90	90	1 1	Q	0	Q
91	91	t 1	Y	G	Y
92	92	1 1	N	N	N
93	93	» í	N	T	S
94	94	í 1	Y	L	I.
95 95A 95B 95C 9 5D 95E	95	1 1 1 1 1 1 1 1 » 1 1 i	P	P	P E

s s*

N Y

L R

E F

S S

G G

Y V

P P

S £ blízký zb$tu 54 v L2, na povrchu a může vázat Ag

R R

F F

S S

G G*

S S

G G

S S

G G

T T

E 2 může mít nábojovou interakci se zbytkem 24 v Ll

F F*

T T

L L

T T

I I

S S

S S

L L

Q Q

S S

D D

D D

F F

A A

T T

Y Y

Y Y

C C

Q Q

Q Q*

Y Y*

D N*

S N*

F Y<

P P*

95F				-	-	I	-	-
96	96			Y	R	w	Y	Y*
97	97	CDR 3	T	T	T	T	T
98	98	FR4	F	F	F	F	F
99	99			G	G	G	G	G
100	100			G	G	Q	Q	Q
101	101			G	G	G	G	G
102	102			T	T	T	T	T
103	103			K	K	K	K	K
104	104			V	L	V	L	L
105	105			E	E	E	E	E
106	106			I	T	I	I	I
106A				-	-	-	-	-
107	107	FR4	Q	K	K	K	K

TABULKA 3

ROZDÍLY V SEKVENCÍCH AMINOKYSELIN VE VARIABILNÍCH OBLASTECH TĚŽKÉHO ŘETĚZCE PRO TŘI PŘETVOŘENÉ VERZE PB1.3

KONSTRUKJ'	1	AMINOKYSELINA
2	73
1748RHA	GLU	ALA	THR
1748RHg	GLN	VAL	THR
1748RHC	GLU	ALA	LYS

TABULKA 4

ROZDÍLY V SEKVENCÍCH AMINOKYSELIN VE VARIABILNÍCH OBLASTECH LEHKÉHO ŘETĚZCE PRO ČTYŘI PŘETVOŘENÉ VERZE PB1.3

KONSTRUKT	AMINOKYSELINA
60	70
1748RLA	GLU	ASP
1748RLg	SER	ASP
1748RLC	GLU	GLU
1748RLg	SER	GLU

TABULKA 5

PRODUKTIVITA PROTILÁTEK AMPLIFIKOVANÝCH BUNĚČNÝCH LINIÍ CHO PRODUKUJÍCÍCH TŘI RŮZNÉ VERZE HUMANIZOVANÉ PB1.3 (CY1748) (jttg/10⁶ buněk/den) prbUlátka_nemplif i kovaná 1, běh 2, běh 3, běh

1748A-lgGl	0,36	2,1	8,2	29,6
	0,36	2,1	13,7	21,8
	0,36	0,90	9,9	19,7
1748B-IgGl	0,10	1,6	23,9
	0,24	1,5	21,1
	< 0,2	7,3	18,6
	0,10	1,6	17,8
1748B-IgG4	< 0,3	< 2,0	(33,0)
	< 0,3	< 2,0	26,9
	0,75	2,6	23,2
	< 0,3	3,0	20,8
	0,80	6,5	20,8
	< 0,3	< 2,0	19,4
	0,78	2,5	18,6
	0,78	8,8	17,8

TABULKA 6

SEKVENCE DNA AMPLIMERŮ PCR POUŽITÝCH KE GENEROVÁNÍ CRP DELEČNÍCH MUTANTÚ LIDSKÉHO P-SELEKTINU

3'-amplimer PCR předpokládaná sekvence pro odstranění čísla CRP_aminokyselin mutanta

9	5	-TTTCACAGCTCTGCATGC- 3'	CRP . . .CRAVK	TIQEA	TAg LK. .
8-9	5	-TGCTATGCCTTTGCAGGT-3'	...CKGIA	TIQEA	LK. .
7-8	5	-CTTGATGGCTTCACACAT- 3'	...CEAIK	TIQEA	LK. .
6-9	5	-GGGAATGGCTTGGCATTC- 3’	...CQAIP	TIQEA	LK. .
5-9	5	-CTGCAAAGCTTGACAGAC- 31	...CQALQ	TIQEA	LK. .
4-9	5'	-CGAAATAGCCTCACAGGT- 3'	...CEAIS	TIQEA	LK. .
3-9	5 1	-CTGCACAGCTTTACACAC- 3'	...CKAVQ	TIQEA	LK. .
2-9	5 '	-CTGGGCAGCTAAACACTG- 3'	...CLAAQ	TIQEA	LK. .
5 ' -	amplimer, lys-1 51 -AAACCTCCCACACCCCCT-31

K vypuštění 5'-amplimer 3'-amplimer pouze CRP#5 byly použity tyto dva amplimery: 5¹ -TGCACACCTTTGCTAAGC- 3'

5¹ -CTGCAAAGCTTGACAGAC- 3'

100

PAT

ENTOVÉ

Claims (61)

1. NÁROKY

   1. Blokující protilátka proti P-selektinu, která konkurenčně inhibuje vazbu protilátky, vylučované buněčnou linií s přírůstkovým číslem ATCC HB11041, na P-selektin, měřeno testem kompetitivní inhibice.
2. 2. Blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1, která inhibuje vazbu neutrofilů na P-selektin v nepřítomnosti Ca²⁺.
3. 3. Blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1, která inhibuje vazbu neutrofilů na P-selektin v přítomnosti peptidů CQNRYTDLVAIQNKNE.
4. 4. Blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1, kterou je imunoglobulin IgG.
5. 5. Blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1, kterou je myší protilátka.
6. 6. Blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1, která je produkována buněčnou linií s přírůstkovým číslem ATCC HB11041.
7. 7. Blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1, kterou je fragment Fab, Fab' F(ab’)2/ Fabc nebo Fv.
8. 8. Způsob detekce P-selektinu in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   aplikaci protilátky podle nároku 1 na tkáňový vzorek z pacienta a detekci komplexů vytvořených specifickou vazbou mezi protilátkou a P-selektinem přítomným v cílovém vzorku.

   101
9. 9. Způsob přípravy léčiva pro léčení onemocnění imunitního systému, vyznačující se tím, že se blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
10. 10.

    blokující

    Způsob podle nároku 9, vyznačující protilátkou proti P-selektinu je IgGi· se tím, že
11. 11.

    blokuj ící

    Způsob podle nároku 9, vyznačující protilátka proti P-selektinu je myší.

    se tím, že
12. 12. Způsob podle nároku 9, vyznačující se blokující protilátka proti P-selektinu je produkována linií s přírůstkovým číslem ATCC HB11041.

    tím, že buněčnou
13. 13. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že onemocnění je důsledkem akutního poškození plic.
14. 14. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že onemocnění je poškození ischemií-reperfusí.
15. 15. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že blokující protilátka proti P-selektinu se podává intravenózně.
16. 16. Způsob přípravy léčiva pro léčení stavu imunitního systému, vyznačující se tím, že se blokující protilátka proti P-selektinu podle nároku 1 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
17. 17. Způsob přípravy léčiva pro inhibici adhese leukocytu k endotheliální buňce nebo destičce, vyznačující se tím, že se protilátka podle nároku 1 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
18. 18. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje farmaceuticky přijatelný nosič a blokující protilátku proti P-selektinu podle nároku 1.

    102.
19. 19. Farmaceutický přípravek podle nároku 18, vyznačující se tím, že blokující protilátka proti P-selektinu je vylučována buněčnou linií s přírůstkovým číslem ATCC HB11041.
20. 20. Farmaceutický přípravek podle nároku 19, vyznačující se tím, že protilátka je myší.
21. 21. Kompozice, vyznačující se tím, že zahrnuje buněčnou linii s přírůstkovým číslem ATCC HB11041.
22. 22. Humanizovaný imunoglobulin zahrnující humanizovaný těžký řetězec a humanizovaný lehký řetězec, přičemž (1) humanizovaný lehký řetězec zahrnuje tři oblasti určující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), mající aminokyselinové sekvence z odpovídajících oblastí určujících komplementaritu lehkého řetězce myšího imunoglobulinu PBI.3, a základní strukturu variabilní oblasti ze sekvence základní struktury variabilní oblasti lidského lehkého řetězce κ a (2) humanizovaný těžký řetězec zahrnuje tři oblasti určující komplementaritu (CDR1, CDR2 a CDR3), mající aminokyselinové sekvence z odpovídajících oblastí určujících komplementaritu těžkého řetězce myšího imunoglobulinu PBI.3, a základní strukturu variabilní oblasti ze sekvence základní struktury variabilní oblasti lidského těžkého řetězce, a přičemž se tento humanizovaný imunoglobulin specificky váže na P-selektin s vazebnou afinitou, jejíž dolní mez činí asi 10⁷ M^-1 a jejíž horní mez činí asi pětinásobek vazebné afinity myšího imunoglobulinu PBI.3.
23. 23. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, přičemž sekvence základní struktury variabilní oblasti lidského lehkého řetězce κ je v alespoň jedné poloze vybrané z první skupiny zahrnující L21, L46, L60 a L70 substituována aminokyselinou přítomnou v ekvivalentní poloze sekvence základní struktury variabilní oblasti lehkého řetězce myšího imunoglobulinu PB1.3 a ιο3 sekvence základní struktury variabilní oblasti lidského těžkého řetězce je v alespoň jedné poloze vybrané z druhé skupiny zahrnující Hl, H2, H71 a H73 substituována aminokyselinou přítomnou v ekvivalentní poloze sekvence základní struktury variabilní oblasti těžkého řetězce myšího PB1.3.
24. 24. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 23, kde základní strukturou variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce je sekvence základní struktury variabilní oblasti těžkého řetězce 21/28’CL.
25. 25. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 24, kde základní strukturou variabilní oblasti humanizovaného lehkého řetězce je sekvence základní struktury variabilní oblasti lehkého řetězce DEN.
26. 26. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 25, kde základní struktura variabilní oblasti humanizovaného lehkého řetězce je v alespoň dvou polohách substituována z první skupiny.
27. 27. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 26, kde základní struktura variabilní oblasti humanizovaného těžkého řetězce je v alespoň dvou polohách substituována z druhé skupiny.
28. 28. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný lehký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného lehkého řetězce 1748RLA, znázorněnou na obr. 14 (SEQ. ID. No ).
29. 29. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný lehký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného lehkého řetězce 1748RLB, znázorněnou na obr. 15 (SEQ. ID. No ).

    104·
30. 30. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný lehký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného lehkého řetězce 1748RLC, znázorněnou na obr. 16 (SEQ. ID. No ).
31. 31. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný lehký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného lehkého řetězce 1748RLD, znázorněnou na obr. 17 (SEQ. ID. No ).
32. 32. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný těžký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného těžkého řetězce 1748RHA, znázorněnou na obr. 11 (SEQ. ID. No ).
33. 33. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný těžký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti těžkého řetězce 1748RHB, znázorněnou na obr. 12 (SEQ. ID. No ).
34. 34. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kde humanizovaný těžký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného těžkého řetězce 1748RHC, znázorněnou na obr. 13 (SEQ. ID. No ).
35. 35. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 31, kde humanizovaný těžký řetězec zahrnuje sekvenci aminokyselin variabilní oblasti maturovaného těžkého řetězce 1748RHB, znázorněnou na obr. 12 (SEQ. ID. No ).
36. 36. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22, kterým je fragment Fab, Fab', F(ab')2< Fabc nebo Fv.
37. 37. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 35, dále zahrnující doménu konstantní oblasti.
38. 38. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 37, kde doména konstantní oblasti má efektorovou funkci.

    105
39. 39. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 35, kde doméně konstantní oblasti chybí efektorová funkce.
40. 40. Humanizovaný imunoglobulin podle nároku 38, kde efektorová funkce je schopna fixace komplementu nebo protilátkově závislé buněčné toxicity.
41. 41. Nukleová kyselina kódující těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 22.
42. 42. Nukleová kyselina kódující lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 22.
43. 43. Počítač, vyznačující se tím, že je programován pro trojrozměrné zobrazování humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 22 na monitoru nebo tiskárně.
44. 44. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje humanizovanou protilátku podle nároku 35 a farmaceuticky přijatelný nosič.
45. 45. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že zahrnuje humanizovanou protilátku podle nároku 22 a farmaceuticky přijatelný nosič.
46. 46. Farmaceutický přípravek podle nároku 45, vyznačující se tím, že humanizovaným imunoglobulinem je fragment Fab.
47. 47. Způsob detekce P-selektinu in vitro, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    aplikaci humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 35 na tkáňový vzorek z pacienta a detekci komplexů vytvořených specifickou vazbou mezi imunoglobulinem a P-selektinem přítomným v cílovém vzorku.
48. 48. Způsob přípravy léčiva pro inhibici adhese leukocytu k endotheliální buňce nebo destičce, vyznačující se tím, že se

    10ή humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
49. 49. Způsob přípravy léčiva pro léčení pacienta s onemocněním imunitního systému, vyznačující se tím, že se humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
50. 50. Způsob podle nároku onemocnění je důsledkem akutního

    49, vyznačující poškození plic.

    se tím, že
51. 51. Způsob podle onemocněním je poškození nároku 49, vyznačující ischemií-reperfusí.

    se tím, že
52. 52. Způsob podle nároku 51, vyznačující se tím, že onemocněním je epidermální, myokardiální, renální, cerebrální, splenická, hepatická, spinální, splanchnická, pulmonální, částečná tělesná nebo celková tělesná ischemie.
53. 53. Způsob přípravy léčiva pro léčení pacienta s chorobným stavem imunitního systému, vyznačující se tím, že se humanizovaný imunoglobulin podle nároku 22 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
54. 54. Stabilní buněčná linie zahrnující:

    segment nukleové kyseliny kódující těžký řetězec humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 35, přičemž je tento segment operativně vázán k promotoru k umožnění exprese těžkého řetězce, druhý segment nukleové kyseliny kódující lehký řetězec humanizovaného imunoglobulinu podle nároku 35, přičemž je tento druhý segment operativně vázán k druhému promotoru k umožnění exprese lehkého řetězce, přičemž tato stabilní buněčná linie je schopna produkovat humanizovaný imunoglobulin podle nároku 35.

    107
55. 55. Buněčná linie podle nároku 54, která je schopna produkovat asi 30 μg humanizovaného imunoglobulinu/10^ buněk/den.
56. 56. Buněčná linie podle nároku 55 s označením CHO-48B4, uložená jako ATCC CRL 11596.
57. 57. Čištěný polypeptid P-selektin s až 100 aminokyselinami, přičemž těchto až 100 aminokyselin zahrnuje pět po sobě jdoucích aminokyselin z úseku mezi polohami 448 až 467 sekvence aminokyselin, znázorněné na obr. 34 (SEQ. ID. No.

    ) .
58. 58. Čištěný polypeptid podle nároku 57, kde až 100 aminokyselin zahrnuje souvislý segment aminokyselin mezi polohami 448 až 467 sekvence aminokyselin, znázorněné na obr. 34 (SEQ. ID. No. ).
59. 59. Čištěný polypeptid podle nároku 58, tvořený v podstatě souvislým segmentem aminokyselin mezi polohami 448 až 467 sekvence aminokyselin, znázorněné na obr. 34 (SEQ. ID. No. ).
60. 60. Způsob přípravy léčiva pro detekci P-selektinu ve tkáňovém vzorku z pacienta, vyznačující se tím, že se protilátka podle nároku 1 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.
61. 61. Způsob přípravy léčiva pro detekci P-selektinu ve tkáňovém vzorku z pacienta, vyznačující se tím, že se humanizovaný imunoglobulin podle nároku 35 smísí s farmaceuticky přijatelným nosičem.

    ο

    1/31 < —,

    Vs ι /l··;

    λ ·>

    ο to, cn