CZ288882B6 - Polynukleotid, antimediátorový polynukleotid, polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotidem, vektor obsahující uvedený polynukleotid, farmaceutická kompozice obsahující uvedený polynukleotid nebo antimediátorový polynukleotid nebo polypeptid nebo vektor a jejich použití pro přípravu farmaceutické kompozice - Google Patents
Polynukleotid, antimediátorový polynukleotid, polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotidem, vektor obsahující uvedený polynukleotid, farmaceutická kompozice obsahující uvedený polynukleotid nebo antimediátorový polynukleotid nebo polypeptid nebo vektor a jejich použití pro přípravu farmaceutické kompozice Download PDFInfo
- Publication number
- CZ288882B6 CZ288882B6 CZ1996758A CZ75896A CZ288882B6 CZ 288882 B6 CZ288882 B6 CZ 288882B6 CZ 1996758 A CZ1996758 A CZ 1996758A CZ 75896 A CZ75896 A CZ 75896A CZ 288882 B6 CZ288882 B6 CZ 288882B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polynucleotide
- vector
- grb3
- pharmaceutical composition
- polypeptide
- Prior art date
Links
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 title claims abstract description 46
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 title claims abstract description 46
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 title claims abstract description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 29
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 16
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 14
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims abstract description 11
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 101150098203 grb2 gene Proteins 0.000 claims description 36
- 101100015729 Drosophila melanogaster drk gene Proteins 0.000 claims description 30
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 claims description 21
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 16
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 claims description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 5
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 claims description 5
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 claims description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 4
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 claims description 3
- 241001068295 Replication defective viruses Species 0.000 claims description 2
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 45
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 23
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 22
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 21
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 11
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 11
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 10
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 10
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 102000014400 SH2 domains Human genes 0.000 description 8
- 108050003452 SH2 domains Proteins 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 7
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 6
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 108010035563 Chloramphenicol O-acetyltransferase Proteins 0.000 description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 5
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 5
- 108700042226 ras Genes Proteins 0.000 description 5
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010014186 ras Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 5
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102000000395 SH3 domains Human genes 0.000 description 4
- 108050008861 SH3 domains Proteins 0.000 description 4
- 101000820462 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Suppressor protein STM1 Proteins 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 4
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 3
- 101710088675 Proline-rich peptide Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 3
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 3
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 3
- 108091005990 tyrosine-phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 3
- OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N (2s)-2,5-bis(3-aminopropylamino)-n-[2-(dioctadecylamino)acetyl]pentanamide Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCCN(CC(=O)NC(=O)[C@H](CCCNCCCN)NCCCN)CCCCCCCCCCCCCCCCCC OPCHFPHZPIURNA-MFERNQICSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701533 Escherichia virus T4 Species 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 2
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 2
- 208000037357 HIV infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N Leu-Asn-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N KKXDHFKZWKLYGB-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 description 2
- 108010059447 Son of Sevenless Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000005588 Son of Sevenless Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 2
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 2
- 208000033519 human immunodeficiency virus infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 208000037803 restenosis Diseases 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N Ala-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WXERCAHAIKMTKX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O HXNNRBHASOSVPG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N Ala-Gly-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN BLIMFWGRQKRCGT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N Ala-Leu-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VHVVPYOJIIQCKS-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 1
- 101100404726 Arabidopsis thaliana NHX7 gene Proteins 0.000 description 1
- KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N Arg-Asp-Gly Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O KMSHNDWHPWXPEC-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N Arg-Asp-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JSHVMZANPXCDTL-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N Arg-Pro-Pro Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 YCYXHLZRUSJITQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N Arg-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)O LRPZJPMQGKGHSG-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N Asn-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)CN=C(N)N XHFXZQHTLJVZBN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N Asn-Gly-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLVIPTLKNSAYRJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- IPAQILGYEQFCFO-NYVOZVTQSA-N Asn-Trp-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CNC4=CC=CC=C43)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N IPAQILGYEQFCFO-NYVOZVTQSA-N 0.000 description 1
- LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N Asn-Trp-Tyr Chemical compound C1=CC=C2C(=C1)C(=CN2)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N LGCVSPFCFXWUEY-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N Asn-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 FYRVDDJMNISIKJ-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- KHGPWGKPYHPOIK-QWRGUYRKSA-N Asp-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O KHGPWGKPYHPOIK-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UMHUHHJMEXNSIV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZQFZEBRNAMXXJV-KKUMJFAQSA-N Asp-Tyr-His Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O ZQFZEBRNAMXXJV-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000004366 CD4-positive T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 206010008748 Chorea Diseases 0.000 description 1
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 1
- 108020004394 Complementary RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- SBDVXRYCOIEYNV-YUMQZZPRSA-N Cys-His-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N SBDVXRYCOIEYNV-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 101900234631 Escherichia coli DNA polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N Glu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OBIHEDRRSMRKLU-ACZMJKKPSA-N Glu-Cys-Asp Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OBIHEDRRSMRKLU-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N Glu-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPLNJYHNAJVLRT-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- RMWAOBGCZZSJHE-UMNHJUIQSA-N Glu-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N RMWAOBGCZZSJHE-UMNHJUIQSA-N 0.000 description 1
- AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N Gly-Asn-Asp Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)N AIJAPFVDBFYNKN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Asp-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RPLLQZBOVIVGMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- FXLVSYVJDPCIHH-STQMWFEESA-N Gly-Phe-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O FXLVSYVJDPCIHH-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N Gly-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN)O MYXNLWDWWOTERK-BHNWBGBOSA-N 0.000 description 1
- ZFDKSLBEWYCOCS-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Lys Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)C1=CC=CC=C1 ZFDKSLBEWYCOCS-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101001077604 Homo sapiens Insulin receptor substrate 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N Ile-Leu-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N TVYWVSJGSHQWMT-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N Ile-Phe-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N Ile-Phe-Leu Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100025087 Insulin receptor substrate 1 Human genes 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N L-Phenylalanyl-L-lysin Natural products NCCCCC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FADYJNXDPBKVCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108700005090 Lethal Genes Proteins 0.000 description 1
- DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N Leu-Pro-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 DPURXCQCHSQPAN-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- KNKHAVVBVXKOGX-JXUBOQSCSA-N Lys-Ala-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KNKHAVVBVXKOGX-JXUBOQSCSA-N 0.000 description 1
- PXHCFKXNSBJSTQ-KKUMJFAQSA-N Lys-Asn-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)O PXHCFKXNSBJSTQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- ITWQLSZTLBKWJM-YUMQZZPRSA-N Lys-Gly-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN ITWQLSZTLBKWJM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZMYHJISLFYTQGK-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZMYHJISLFYTQGK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N Met-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN IMTUWVJPCQPJEE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100425552 Mus musculus Tle2 gene Proteins 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N N-formyl-L-phenylalanine Chemical compound O=CN[C@H](C(=O)O)CC1=CC=CC=C1 NSTPXGARCQOSAU-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N Nalpha-L-Leucyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 BQVUABVGYYSDCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710149086 Nuclease S1 Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 description 1
- CDNPIRSCAFMMBE-SRVKXCTJSA-N Phe-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CDNPIRSCAFMMBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HWMGTNOVUDIKRE-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N Phe-Lys-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 DMEYUTSDVRCWRS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N Pro-Arg-Pro Chemical compound N([C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C(=O)[C@@H]1CCCN1 ICTZKEXYDDZZFP-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010001267 Protein Subunits Proteins 0.000 description 1
- 102000002067 Protein Subunits Human genes 0.000 description 1
- 101150040459 RAS gene Proteins 0.000 description 1
- 108700022176 SOS1 Proteins 0.000 description 1
- 102000057028 SOS1 Human genes 0.000 description 1
- 101100197320 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) RPL35A gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N Ser-Arg-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O FCRMLGJMPXCAHD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101150100839 Sos1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108700025695 Suppressor Genes Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UBDDORVPVLEECX-FJXKBIBVSA-N Thr-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O UBDDORVPVLEECX-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 1
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 208000024770 Thyroid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102100022563 Tubulin polymerization-promoting protein Human genes 0.000 description 1
- WPVGRKLNHJJCEN-BZSNNMDCSA-N Tyr-Asp-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 WPVGRKLNHJJCEN-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- SCZJKZLFSSPJDP-ACRUOGEOSA-N Tyr-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SCZJKZLFSSPJDP-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 108010029539 arginyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 125000004057 biotinyl group Chemical group [H]N1C(=O)N([H])[C@]2([H])[C@@]([H])(SC([H])([H])[C@]12[H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 208000012601 choreatic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 1
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000994 depressogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 210000002308 embryonic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 description 1
- 101150089730 gly-10 gene Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000006882 induction of apoptosis Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 239000000138 intercalating agent Substances 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 201000005296 lung carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940099607 manganese chloride Drugs 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000403 monosodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 230000006740 morphological transformation Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005105 peripheral blood lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000031539 regulation of cell division Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 201000002510 thyroid cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 108010015385 valyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
- A61P31/18—Antivirals for RNA viruses for HIV
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4705—Regulators; Modulating activity stimulating, promoting or activating activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Virology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Oncology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
eÜen je zalo eno na nalezen nov ho genu ozna en ho jako Grb3-3 a t²k se polynukleotidu, kter² obsahuje cel² gen Grb3-3 nebo jeho st, odpov daj c ho antimedi torov ho polynukleotidu, polypeptidu k dovan ho uveden²m polynukleotidem, vektoru obsahuj c ho uveden² polynukleotid, farmaceutick kompozice obsahuj c uveden² polynukleotid nebo uveden² antimedi torov² polynukleotid nebo uveden² polypeptid nebo uveden² vektor a jejich pou it pro p° pravu farmaceutick kompozice, ur en pro l en rakoviny a AIDS.\
Description
Oblast techniky
Vynález je založen na nalezení nového genu Grb3-3 a týká se takto polynukleotidu, který obsahuje celý gen Grb3-3 nebo jeho část, odpovídajícího antimediátorového polynukleotidu, polypeptidu kódovaného uvedeným polynukleotidem, vektoru obsahujícího uvedený polynukleotid, farmaceutické kompozice obsahující uvedený polynukleotid nebo uvedený antimediátorový polynukleotid nebo uvedený polypeptid nebo uvedený vektor, a jejich použití pro přípravu uvedené farmaceutické kompozice.
Dosavadní stav techniky
Při regulaci buněčného dělení se uplatňují různé geny, které se nazývají onkogeny a supresorové geny. Z těchto genů lze uvést geny ras a jejich produkty obecně označované jako proteiny p21, které hrají klíčovou roli při regulaci buněčné proliferace u všech eukaryotických organismů, ve kterých byly zkoumány. Zejména bylo prokázáno, že některé specifické modifikace těchto proteinů ztrácí normální regulační schopnost a stávají se onkogenními. Takto má velký počet lidských nádorů souvislost s výskytem modifikovaných genů ras. Stejně tak může nadměrná exprese těchto proteinů vést k poruchám v buněčné proliferaci. Pochopení přesné úlohy těchto proteinů p21 v buňkách, mechanismu jejich funkce a jejich charakteristik tedy představují základní kameny pro pochopení kancerogeneze a pro stanovení farmaceutického přístupu k léčení rakoviny.
V rámci ras-dependentní signální dráhy byly identifikovány různé vektory. Mezi těmito faktory figuruje gen Grb2, který kóduje protein s 23-25 kDa mající strukturu SH3-SH2-SH3 (Lowenstein a kol., Cell 70 (1992) 431; Matuoka a kol., PNAS 89 (1992) 9015). Zdá se, že produkt genu Grb2 vstupuje v interakci s tyrosin-fosorylovanými proteiny svou doménou SH2 a s výměnným faktorem GDP třídy SOS dvou doménou SH3 (Egan a kol., Nátuře 363 (1993)45). Tento produkt by byl takto jednou ze složek transformační aktivity produktu genu ras. Vynález je výsledkem prokázání, klonování a charakterizace izoformy genu Gsb2, označované jako Grb3-3 a mající deleci v doméně SH2. Tento gen je exprimován v dospělých tkáních: odpovídající RNAm je přítomna v jediném řetězci o délce 1,5 kb, a je translací konvertován na protein s 19 kDa. Vzhledem kjeho deleci v doméně SH2 není již produkt genu schopen interakce s tyrosin-fosforylovanými proteiny (fosforylovaný receptor EGF), i když si zachovává schopnost interakce s doménami bohatými na prolin proteinů SOS. Z důvodu uvedené delece je produkt genu Grb3-3 takto schopen opozice vůči buněčným účinkům produktu genu Grb2. Přenos tohoto genu in vivo nebo jeho variant, včetně antimediátorových sekvencí tudíž umožňuje interferenci s proliferačními nebo diferenciačními procesy nebo/a s procesy buněčné smrti.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je polynukleotid kódující polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ idč. 1.
Předmětem vynálezu je rovněž výše uvedený polynukleotid obsahující nukleotid 37 až 564 sekvence SEQ ID č. 1.
Předmětem vynálezu je rovněž antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého výše uvedeného polynukleotidu nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expresi Grb2.
Předmětem vynálezu je rovněž antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého výše uvedeného polynukleotidu nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expresi Grb3-3.
Předmětem vynálezu je rovněž polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 1.
Předmětem vynálezu je rovněž vektor obsahující výše uvedený polynukleotid.
Výhodně je uvedeným vektorem virový vektor. Výhodně se uvede virový vektor vektorem odvozeným od adenovirů, retrovirů, přidružených adenovirů, viru herpes, cytomegaloviru nebo viru kravských neštovic. Výhodně je uvedeným virem replikačně defektní vir.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, jejíž podstata spočívá vtom, že obsahuje výše uvedený polynukleotid nebo výše uvedený vektor nebo výše uvedený antimediátorový polynukleotid nebo výše uvedený polypeptid.
Předmětem vynálezu je konečně použití výše uvedeného polynukleotidu nebo výše uvedeného antimediátorového polynukleotidu nebo výše uvedeného vektoru nebo výše uvedeného polypeptidu pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakoviny a použití výše uvedeného antimediátorového polynukleotidu schopného inhibovat expresi Grb3-3 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení AIDS.
Polynukleotid odvozený od sekvence SEQ ID č. 1 je schopen inhibovat alespoň částečně expresi proteinu Grb2 nebo Grg3-3. Vynález se zejména týká antimediátorových sekvencí, jejichž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat přepis buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány v cílové buňce na komplementární RNA buněčných mRNA Grb2nebo Grb3-3 a blokovat takto jejich translaci na protein technikou popsanou v evropském patentu EP 140 308. Takové sekvence mohou být tvořeny celou nukleovou sekvencí SEQ ID č. 1, přepsanou v inverzní orientaci, nebo její částí.
Jak již bylo uvedeno výše, je Grb2 alespoň bifunkčním proteinem vázajícím se svou doménou SH2 ke specifickým sekvencím fosforylovaným na tyrosinu a svými dvěma doménami SH3 k výměnným faktorům skupiny SOS. Grb3-3, který ji ztratil svou schopnost vázat se na proteiny fosforylované na tyrosinu, může tedy výlučně tvořit komplex s proteiny SOS. Grb3-3 může tedy oponovat tvorbě komplexu Grb2-SOS receptory autofosforylovaných růstových faktorů nebo přidruženými proteiny rovněž fosforylovanými na tyrosinu, jakými jsou SHC nebo IRS1. Grb3-3, který je schopný blokovat tuto tvorbu, je způsobilý blokovat mitogenní cesty a způsobit buněčnou smrt. Přihlašovatel skutečně prokázal, že protein Grb3-3 je exprimován v průběhu některých fyziologických procesů, jakým je například maturace brzlíku u krysy. Přihlašovatel rovněž prokázal, že Grb3-3 je schopen přivodit buněčnou smrt apoptózou různých buněčných typů. Tyto naprosto výhodné vlastnosti mohly být prokázány i) injekcí rekombinantního proteinu do fibroblastů 3T3 a ii) přenosem sekvence kódující Grb3-3 v buňkách 3T3 (příklad 4). Grb3-3 je tedy schopen indukovat buněčnou smrt životných buněk, jakými jsou imortalizované, rakovinové nebo embryonální buňky. Jak je to prokázáno v příkladech, je Grb2 schopen opanovat účinkům Grb3-3.
Výzkum exprese Grb3 provedený v průběhu infekce lymfocytních buněk virem HIV umožnil prokázat, že masivní virální produkce pozorovaná 7 dní po infekci je korelovaná nadměrnou expresí RNAm Grb3-3 infikovanými buňkami (příklad 5). Tento experiment rovněž prokázal, že eliminace nebo opozice buněčných účinků Grb3-3 může rovněž umožnit zachování naživu infikovaných buněk, a to infikovaných zejména virem HIV, a takto umožnit lymfocytům T4
-2CZ 288882 B6 pokračovat v jejich úloze při imunitní ochraně. V tomto ohledu se vynález rovněž týká použití sloučenin schopných eliminovat nebo redukovat alespoň částečně buněčné účinky Grb3-3 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení AIDS. Zejména použitými sloučeninami mohou být:
- genetické antimediátorové sekvence, jaké jsou definovány výše,
- specifické oligonukleotidy Grb3-3, nemodifikované nebo modifikované za účelem lepší stability nebo biologické dostupnosti (fosforothioáty, interkalační činidla, atd.). Výhodně se může jednat o oligonukleotidy pokrývající kódující sekvenci lokalizovanou mezi N-terminální doménou SH3 a reziduální doménou SH2,
- libovolná sekvence, jejíž přenos do infikovaných buněk indukuje nadměrnou expresi Grb2.
Nukleové sekvence podle vynálezu mohou být použity jako takové, například pro injekci člověka nebo zvířeti za účelem indukování ochrany proti rakovině nebo za účelem léčení rakoviny. Tyto sekvence mohou být zejména injikovány ve formě samotné DNA technikou popsanou v přihlášce WO 90/11092. Tyto sekvence mohou být rovněž podány ve formě komplexu, například komplexu s DEAE-dextranem (Pagano a kol.. J. Virol. 1(1967) 891), s jádrovými proteiny (Kaneda a kol., Science 243 (1989) 375), s lipidy (Felgner a kol., PNAS 84 (1987)7413), ve formě liposomů (Fraley a kol., J. Biol. Chem. 255 (1980) 10431), atd.
Výhodně tvoří nukleové sekvence podle vynálezu součást vektoru. Použití takového vektoru ve skutečnosti umožňuje zlepšit podání nukleové kyseliny do buněk, které mají být léčeny, a rovněž zlepšit její stabilitu v uvedených buňkách, což umožňuj dosáhnout trvalého terapeutického účinku. Kromě toho je možné zavést do jednoho a téhož vektoru několik sekvencí nukleové kyseliny, což rovněž zvyšuje účinnost léčení.
Použitý vektor může být rozličného původu, pokud je schopen transformovat živočišné buňky, výhodně lidské nádorové buňky. V rámci výhodného provedení způsobu podle vynálezu se používá virový vektor, který může být zvolen z množiny zahrnující adenoviry, retroviry, přidružené adenoviry (AAV), vir herpes, cytomegalovir (CMV), vir kravských neštovic, atd. Vektory odvozené od adenovirů, retrovirů nebo přidružených adenovirů s inkorporovanými sekvencemi heterologních nukleových kyselin byly popsané v četné odborné literatuře /Akli a kol., Nátuře Genetics 3 (1993) 224; Stratford-Perricaudet a kol., Human Gene Therapy 1 (1990) 241; EP 185 573, Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; Le Gal Ia Salle a kol., Science 259 (1993) 988; Roemer a Friedmann, Eur. J. Biochem 208 (1992) 211; Dobson a kol., Neuron 5 (1990) 353; Chiocca a kol., New Biol. 2(1990) 739; Miyanohara a kol., New Biol. 4 (1992) 238; WO 91/1808/.
Vynález se rovněž týká libovolného rekombinantního viru, který obsahuje ve svém genomu vloženou výše definovanou nukleovou sekvenci.
Výhodně je rekombinantním virem podle vynálezu defektní vir. Výraz „defektní vir“ zde označuje vir, který je schopen replikace v cílové buňce. Obecně je genom defektního viru použitého v rámci vynálezu zbaven alespoň sekvencí, které jsou nezbytné pro replikaci uvedeného viru v cílové buňce. Tyto oblasti mohou být buď eliminovány (zcela nebo částečně), nebo mohou být učiněny nefunkčními, nebo mohou být nahrazeny jinými sekvencemi a zejména nukleovou kyselinou podle vynálezu. Výhodně si defektní vir nicméně zachovává sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.
Je obzvláště výhodné použít nukleové sekvence podle vynálezu ve formě přidružené k defektnímu adenovirů, přidruženému adenovirů (AAV) nebo rekombinantnímu retrovirů.
Pokud jde o adenoviry, existují různé sérotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud mění, přičemž tyto sérotypy nejsou pro člověka patogenní a zejména nejsou patogenní pro subjekt s nedeprimovanou imunitní odezvou. Tyto viry se ostatně neintegrují do genomu
-3CZ 288882 B6 buněk, které infikují, a mohou inkorporovat důležité fragmenty exogenní DNA. Z těchto rozličných sérotypů se přednostně v rámci vynálezu používají adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5). V případě adenovirů Ad 5 jsou oblastmi nezbytnými pro replikaci oblasti El A aElB.
Defektní rekombinantní viry podle vynálezu mohou být připraveny homologní rekombinací mezi defektním virem a plazmidem nesoucím mimo jiné výše definovanou nukleotidovou sekvenci (Levrero a kol., Gene 101 (1991) 195; Graham, EMBO J. 3(12) (1984)2917). Ktéto homologní rekombinací dojde po kotranfekci uvedených virů a plazmidů v příslušné buněčné řadě. Použitá buněčná řada výhodně musí být transformovatelná uvedenými prvky a musí obsahovat sekvence schopné komplementovat část genomu defektního viru, výhodně v integrované formě, aby se zabránilo rizikům rekombinace. Jako příklad použitelné buněčné řady pro přípravu defektních rekombinantních adenovirů lze uvést buněčnou řadu 293 z ledviny lidského zárodku (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje integrované ve svém genomu levou část genomu adenoviru Ad5 (12 %). Jako příklad buněčné řady použitelné pro přípravu defektních rekombinantních retrovirů lze uvést buněčnou řadu CRIP (Danos et Mulligan, PNAS 85 (1988) 6460).
Multiplikované viry se potom izolují a přečistí klasickými technikami molekulární biologie.
Předmětem vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice obsahující alespoň jeden rekombinantní vir nebo nukleotidovou sekvenci, které byly definovány výše.
Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány do vhodné galenické formy pro topické, perorální, parenterální, intranasální, intravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulámí a jiné podání.
Výhodně tyto farmaceutické kompozice obsahují farmaceuticky přijatelné nosiče pro injikovatelnou formulaci, případě aplikovanou přímo do léčeného nádoru. Zejména se může jedna o solné roztoky (hydrogenfosforečnan sodný, dihydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý, atd. nebo směsi těchto solí) ve sterilním izotonickém stavu nebo o suché, zejména lyofylizované kompozice, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku umožňují vytvoření injikovatelných roztoků.
Dávky nukleových kyselin (sekvence nebo vektor) použité pro podání mohou být závislé na různých faktorech mezi které zejména patří způsob podání, léčený patologický stav, nukleová kyselina, která má být exprimována, nebo také požadovaná doba léčení. Obecně pokud jde o rekombinantní viry podle vynálezu, jsou tyto viry formulovány a podávány ve formě dávek obsahujících mezi 104 a 1014 pfu/ml, výhodně mezi 106 a 1010 pfu/ml. Výraz pfu („plaque forming unit“) odpovídá infekční potenci virového roztoku a je stanoven infekcí příslušné buněčné kultury a určením, obvykle po 48 hodinách, počtu kolonií infikovaných buněk. Technika stanovení hodnoty pfu daného virového roztoku je velmi dobře dokumentována v literatuře.
Uvedené kompozice mohou být použity v humánní medicíně pro léčení nebo/a prevence rakovin. Produkty podle vynálezu jsou zejména schopné modulovat aktivitu proteinů ras, umožňují intervenci do procesů rozvoje rakovin a zejména mohou inhibovat aktivitu onkogenů, jejíchž transformační aktivita je zprostředkována funkční interakcí p21-GAP. Ve skutečnosti bylo zjištěno, že četné rakoviny jsou v souvislosti s přítomností onkogenních proteinů ras. Z těchto rakovin zahrnujících nejčastěji mutantní geny ras lze zejména uvést adenokarcinomy pankreasu, z nichž 90 % má mutantní onkogen Ki-ras na dvanáctém kodonu (Almoguare a kol., Cell 53 (1988)549), adenokarcinomy tračníku a rakoviny štítné žlázy (50 %) nebo karcinomy plic a myeloidní leukomie (30%, Bos, J.L. Cancer Res. 49 (1989)4682). Obecněji mohou být kompozice podle vynálezu použity pro léčení všech typů patologických stavů, u kterých je pozorována abnormální buněčná proliferace indukcí apoptózy, jakož i všech patologických stavů
-4CZ 288882 B6 charakterizovaných buněčných smrtí následkem apoptózy (AIS, Hustingotova chorea, Parkinsonova nemoc) pomocí sloučenin blokujících účinky Grb3-3 (zejména antimediátorové).
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétnějších příkladů jeho provedení za použití odkazů na připojené výkresy.
Stručný popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje schematické zobrazení strukturních domén Grb2 a Grb3-3, obr. 2 znázorňuje studium vazby Grb3-3 k receptoru pro EGF (obr. 2a) a k peptidům bohatým na prolin (obr. 2b), obr. 3 znázorňuje účinek Grb3-3 na aktivitu typu trans za použití ras PRE odvozeného od enhanceru polyomaviru, obr. 4 znázorňuje demonstraci buněčné smrti indukované působením Grb3-3 na fibrolastech 3T3 a obr. 5 znázorňuje demonstraci exprese Grb3-3 v buňkách infikovaných virem HIV.
Obecné techniky molekulární biologie
Klasicky používané techniky molekulární biologie, jakými jsou preparativní extrakce plazmidové DNA, odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu česného, elektroforéza na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, purifikace fragmentů DNA elektroelucí, extrakce proteinů fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, srážení DNA v solném prostředí ethanolem nebo izopropanolem, transformace v Escherichia coli atd. jsou velmi dobře známé a hojně popsané v příslušné odborné literatuře /Maniatis T. a kol., „Molecular Cloning, a Laboratory Manual“, Cold Spring Harbor Laboratory, Colg Spring Harbor, N.Y. 1982; Ausubel F.M. a kol. (edit.), „Current Protocol in Molecular Biology“, John Wiley and Sons, New York, 1987/.
Plazmidy typu pBR322, pUC a fágy řady M13 jsou komerčně dostupné (Bethesda Research Laboratories).
Za účelem ligací mohou být fragmenty DNA separovány podle velikosti elektroforézou na agarosovém nebo akrylamidovém gelu, extrahovány fenolem nebo směsí fenolu a chloroformu, sráženy ethanolem a potom inkubovány v přítomnosti DNA-ligázy fágu T4 (Biolabs) podle doporučení dodavatele.
Naplnění proeminentních konců 5' může být provedeno Klenowovým fragmentem DNA polymerázy I Escherichia coli (Biolabs) podle pokynů dodavatele. Destrukce proeminentních konců 3' se provádí v přítomnosti DNA polymerázy fágu T4 (Biolabs) použité podle doporučení výrobce. Destrukce proeminentních konců 5' se provádí šetrným působením nukleázy Sl.
Řízená mutageneze in vitro syntetickými oligodeoxynukleotidy může být provedena metodou vyvinutou Taylorem a kol. /Nucleic Acids Res. 13 (1985) 8749-8764/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
Enzymatická amplifikace fragmentů DNA technikou, nazvanou PCR /Polymerase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. a kol., Science 230 (1985) 1350-1354; Mullis K.B. a Fallona F.A., Meth. Enzym. 155 (1987) 335-350/, může být provedena za použity DNA-termálního cykleru („DNA thermal cycler“) (Perkin Elmer Cetus) podle pokynů výrobce.
-5CZ 288882 B6
Ověření nukleotidových sekvencí může být provedeno metodou vyvinutou Sangerem a kol. /Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74 (1977) 5463-5467/ za použití soupravy distribuované firmou Amersham.
V následující části popisu bude vynález blíže objasněn pomocí konkrétních příkladů jeho provedení, které mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně definován formulací patentových nároků.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Izolace genu Grb3-3
Gen Grb3-3 byl izolován tříděním lidské banky DNA pomocí sondy odvozené od sekvence genu Grb2.
Pomocí sondy odvozené od sekvence genu Grb2 bylo vytříděno 500 000 rekombinantních fágů Lambda gtl 1 nesoucích fragmenty DNA původem z banky lidské placenty (Clontech). Použitá sonda odpovídá osmi prvním aminokyselinám proteinu Grb2 a zahrnuje následující sekvenci:
ATGGAACCATCGCCAAATATGAC (SEQ ID č. 2).
Takto bylo identifikováno deset pozitivních klonů. Inzert těchto deseti klonů byl izolován ve formě fragmentů EcoRI, klonován vplazmidu M13mpl8 a sekvenován. Z těchto deseti klonů jich devět neslo inzerty identické se sekvencí Grb2. Pouze jediný z těchto klonů nesl inzert, jehož velikost byla menší než velikost genu Grb2 z důvodů delece v doméně SH2 (obr. 1). Analýza zbývající sekvence prokázala dokonalou identitu s odpovídajícími oblastmi Grb2, včetně nekódujících oblastí 5' a 3'. Fáze otevřené četby tohoto klonu kóduje protein se 177 aminokyselinami (SEQ Id č. 1), obsahující dvě domény SH3 ohraničující neúplnou doménu SH2 (obr. 1). Vypouštěné (delece) aminokyseliny v doméně SH2 (zbytky 60 až 100 proteinu Grb2) odpovídají zbytkům implikovaným ve vazbě Grb2 kpeptidům obsahujícím fosforylované tyrosiny.
Příklad 2
Aktivita vazby proteinu Grb3-3
Jak již bylo uvedeno výše, je Grb2 mediátor interakce mezi receptory fosforylovaných růstových faktorů a faktory SOS. Tento příklad demonstruje skutečnost, že protein Grb3-3 je neschopen interakce s fosforylovaným EGF (s fosforylovaným růstovým faktorem), ale že si i nadále zachovává svoji schopnost interakce s peptidem bohatým na prolin odvozeným ze sekvence lidského faktoru SOS1.
Kapacita vazby Grb3-3 byla studpvána za použití biotinylových fúzních proteinů k glutathionS-transferáze (GST). Tento typ fúze umožňuje rychlou a účinnou purifikaci rekombinantních produktů. Za tím účelem byly sekvence podle vynálezu exprimovány v kmeni Escherichia coli TG1 ve formě fúzních proteinů s GST podle techniky popsané Smithem a Jonoson-em /Gene 67(1988)31/. Stručně specifikováno, byly geny Gsb2 a Grb3-3 nejdříve modifikovány zavedením na obou stranách kodonů start a stop místa BamHI. Za tím účelem byly otevřené fáze četby těchto genů amplifíkovány technikou PCR za použití následujících oligonukleotidů:
-6CZ 288882 B6
Oligonukleotid I (5') (SEW ID č. 3):
GAATTCGGATTCATGGAAGCCATCGCCAAATATGACTTC oligonukleotid II (3') (SEQ ID č. 4):
Podtržená část uvedených oligeonukleotidů odpovídá vytvořenému místu BamHI následovanému nebo předcházenému kodony start a stop.
Takto amplifikované geny se potom klonují ve formě fragmentů BamHI ve vektoru pGEX 2T (Pharmacia) linearizovaném stejným enzymem v 3' a ve fázi cDNA kódující GST. Takto získané vektory se potom použijí pro transformaci kmene Escherichia coli TG1. Takto transformované buňky se potom předkultivují přes noc při teplotě 37 °C, zředí 1:10 v prostředí LB, smísí s IPTG pro indukci exprese (2 hodiny, 25 °C) a potom kultivují po dobu 21 hodin při teplotě 25 °C. Tyto buňky se potom podrobí lyži a produkované fúzní proteiny se přečistí na základě jejich afinity na sloupci produktu agarosa-GSH. Za tím účelem se bakteriální lyzát inkubuje v přítomnosti gelu (připraven a uveden do rovnovážného stavu s pufrem lyže) po dobu 15 minut při teplotě 4 °C. Po 3 hodinách promývání tamponem Tris-HCl (pH 7,4) se proteiny eluují v přítomnosti pufru Tris-HCl (pH 7,7) obsahujícího přebytek GST. Supematant se oddělí a odstředí.
Stejná metodika se použije pro přípravu mutantu Grb2, ve kterém je glycin 203 nahrazen argininem (Grb2G203R), a mutantu Grb3-3, ve kterém je glycin 162 nahrazen argininem (Grb33T162R). Mutant Grb2G203R byl popsán jako mutant, který nevykazuje účinnost při testu reiniciace syntézy DNA (Lowenstein a kol.). Mutant Grg3-3G162R nese stejnou mutaci ve stejné poloze a měl by tedy být rovněž neúčinný.
Tyto mutanty byly připraveny mutagenezí technikou PCR na genech Grb2 a Grb3-3 za použití v 5' oligonukleotidu I popsaného výše a v 3' následujícího oligonukleotidu III, ve kterém je mutovaný kodon podtržen:
oligonukleotid III (3')(SEQ ID č. 5):
GACGTTCCGGTTCACGGGGGTGACATAATTGCGGGGAAACATGCGGGTC.
Takto amplifikované fragmenty se potom eluují, reamplifikují technikou PCR pomocí oligonukleotidů I a II a potom klonují ve vektoru pGEX 2T. Potom se výše uvedenými postupy připravují odpovídající mutanty.
Fúzní proteiny s GST (GST-Grb2, GST-Grb3-3, GST-Grb3-3G162R a GST) se potom biotinylují klasickými známými technikami (viz obecné techniky molekulární biologie a Mayer a kol., PNAS 88 (1991)627) a použijí jako sondy pro stanovení vazby kreceptoru pro imobilizovaný fosforylovaný EGF (2.1) a potom k peptidu odvozenému od hSOSl (2.2)..
1) Vazba k receptoru pro fosforylovaný EGF
Metodika:
Receptor pro EGF byl purifíkován z buněk A431 imobilizací na WGA-sepharose provedenou technikou popsanou Duchesnem a kol. (Science 259 (1993)525). 2 pg tohoto receptoru se nejdříve stimulují 1 μΜ EGF po dobu 10 minut při teplotě 22 °C a potom inkubují v přítomnosti nebo nepřítomnosti chladného ATP (10 μΜ), a v přítomnosti 2,5 mM chloridu manganatého v pufru HNTG (20 mM Hepes, 150 mM NaCl, 0,1 % Triton, 10% glycerol, pH=7,5) při teplotě 4 °C po dobu 2 minut. Fosforylace receptoru se potom ukončí přidáním degradačního pufru. Vzorky se potom nanesou na 4-20% gel SDS-PAGE a potom převedou na polyvinyl
-7CZ 288882 B6 idendifluoridové membrány (PVDF). Získané bloty se potom inkubují v přítomnosti různých biotinylovaných fúzí GST (2 pg/ml) a potom vyvolají pomocí streptavidinu kopulovitého s alkalickou fosfatázou (Promega). Receptory RGf byly rovněž podrobeny imunoglotu v přítomnosti anti-fosfotyrosinových protilátek (anti-PY) za účelem ověření toho, že receptory byly skutečně fosforylovány.
Výsledky:
Získané výsledky jsou zobrazeny na obr. 2. Tyto výsledky ukazují pode očekávání, že protein Grb2 vstupuje do interakce s receptorem EGF pouze v případě, kdy je tento receptor fosforylován. Tyto výsledky dále ukazují, že protein Grb3-3 se neváže k receptoru EGF a to bez ohledu na jeho stupeň fosforylace.
2) Vazba k peptidu odvozenému od hSOS 1
Metodika:
Byly syntetizovány následující dva peptidy bohaté na prolin:
- peptid hOSl: GTPEVPVPPPVPPRRRPESA: tento peptid odpovídá zbytkům 1143 až 1162 proteinu hSOSl (li a kol., Nátuře 363 (1993)83), odpovědného za interakci mezi Grb2 ahSOSl (SEQ ID č. 6), peptid 3BP1: PPPLPPLV: tento peptid je odvozen od derivátu proteinu 3BP1, o kterém je známo, že váže účinně doménu SH3 Abl a Src (Cicchetti a kol., Science 257 (1992)803) (SEQ ID č. 7).
Každý z těchto peptidů byl imobilizován na nitrocelulózové membráně. Tyto membrány byly potom inkubovány v blokačním pufru (Tris 20 mM pH=7,6, 150 mM NaCl, 0,1 % Tween, 3 % bovinní albumin). Membrány se potom inkubují přes noc při teplotě 4 °C v přítomnosti různých biotinylovaných fúzí GST (4 pg/ml) a potom vyvolají pomocí streptavidinu kopulovaného s alkalickou fosfatázou (Promega).
Výsledky:
Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Tyto výsledky ukazují, že Grb3-3 je stejně jako Grb2 schopen vázat peptid hSOSl. Tyto výsledky dále ukazují, že tato interakce je specifická, neboť nebyla pozorována žádná vazba speptidem 3BP1. Jinak výsledky rovněž ukazují, že mutant Grb3-3G162R již není schopen vázat peptid hSOSl, což potvrzuje důležitost tohoto zbytku a funkční úlohu uvedené interakce.
Příklad 3
Aktivita proteinu Grg3-3
Tento příklad demontruje, že vzdor deleci v doméně SH2 má protein Grb3-3 funkční účinek.
Aktivita proteinu Grb3-3 byla studována stanovením jeho schopnosti kooperovat s ras v rámci aktivity typu trans promotoru majícího prvky odezvy vůči ras (RRE) a řídícího expresi reportážního genu.
Použitá metodika byla popsána například Schweighoffem a kol., v Science 256 (1992) 825. Stručně specifikováno je použitým promotorem syntetický promotor tvořený murinním promotorem genu thymidin-kinázy a 4 repetitivních prvků PEAÍ odvozených od polyomního
-8CZ 288882 B6 enhanceru (Wasylyk a kol., EMBO J. 7(1988)2475): promotor Py-TK. Tento protomor řídí expresi reportážního genu, v případě bakteriálního genu chloramfenikolacetyltransferázy (CAT): vektor Py-TK-CAT. Testované vektory exprese genů byly konstruovány inzercí uvedených genů ve formě fragmentů BamHI do místa BglII plazmidu pSV2. Toto místo umožňuje vložit geny pod kontrolu raného promotoru SV40.
Buňky ER22 se 40% konfluencí byly transfekovány za použití 0,5 pg vektoru Py-TK-CAT samotného (Py) nebo v přítomnosti expresního vektoru nesoucího pod kontrolou raného promotoru SV40 gen: Grb2, 2 pg, Grb3-3, 2 pg, Grb2(G203R) 2 pg, Grb3-3(G162R) 2 pg nebo Grb3-3, 2 pg + Grb2, 2 pg. V každém případě je celkové množství DNA nastaveno na 5 pg expresním vektorem bez inzertu. Transfekce byla provedena v přítomnosti liposperminu (Transfectam, IBF-Sepracor). Buňky byly udržovány po dobu 48 hodin v prostředí DMEM suplementovaném 0,5 % fetálního telecího séra. Aktivita CAT (transaktivace RRE) byla potom stanovena způsobem popsaným Wasylykem a kol. (PNAS 85 (1988)7952).
Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Tyto výsledky jasně ukazují, že exprese proteinu Grb3-3 oponuje účinkům aktivace receptoru pro růstový faktor. Tyto výsledky rovněž ukazují, že Grb2 v přebytku oponuje účinkům Grb3-3 v odezvu na růstový faktor.
Příklad 4
Grb3-3 indukuje buněčnou apoptózu
Tento příklad demonstruje přímou implikaci Grb3-3 v buněčné apoptóze. Tato vlastnost nabízí obzvláště výhodná použití v rámci léčení patologických stavů vyplývajících z buněčné proliferace (rakoviny, restenóza, atd.).
Indukce buněčné apoptózy účinkem Grb3-3 byla demonstrována i) injekcí rekombinantního proteinu do fíbroblastů 3T3 a ii) přenosem sekvence kódující Grb3-3 do buněk 3T3.
i) Injekce rekombinantního proteinu
Rekombinantní protein Grb3-3 byl připraven ve formě fúzovaného proteinu s GST podle metodiky popsané v příkladu 2. Fúzovaný protein byl potom zpracován trombinem (0,25%, Sigma) za účelem oddělení části GST a potom purifikován iontoměničovou chromatografií na sloupci monoQ. Frakce obsahující rekombinantní protein se potom zahustí pomocí mikrokoncentrátoru Microsep (Filtron) ve 20 mM fosfátovém pufru (pH 7) obsahujícím 100 mM chloridu sodného. Takto získaný purifikovaný protein byl infikován (1 až 3 mg/ml) do kultury buněk 3TS pomocí automatického mikroinjektoru Eppendorf. Tyto buňky se potom inkubují při teplotě 34 °C a v pravidelných intervalech fotografují za účelem sledování morfologických transformací. Získané výsledky ukazují, že 5 hodin po injekci Grb3-3 je většina buněk mrtvých, zatímco injekce Grb2 nebo mutantu Grb3-3(G162R) není žádný účinek na životnost buněk.
ii) Přenos sekvence kódující rekombinantní protein
Byl konstruován plazmid obsahující sekvenci SEQ ID č. 1 kódující protein Grb3-3 pod kontrolou raného promotoru viru SV40.
Fibroblasty 3T3 se 40% konfluencí byly transfekovány v přítomnosti liposperminu (Transfectam, IBF-Sepracor) pomocí 0,5 nebo 2 pg tohoto expresního plazmidu. 48 hodin po transfekci bylo 50 % buněk suspendováno v prostředí, zatímco zbývající buňky lnoucí ke stěně měly velmi významné morfologické změny (obr. 4). Analýza provedená elektroforézou na agarosovém gelu ukázala, že tyto buňky měly charakteristickou oligo-nukleosomální strukturu fragmentace DNA mrtvých buněk (obr. 4). Naopak buňky transfekované za stejných podmínek expresním
-9CZ 288882 B6 plasmidem Grb2, Grb3-3 (G162R) nebo Grb2 (G203R) si zachovaly normální morfologii, jsou stále živé a nemají žádnou fragmentaci DNA. Jak je to patrné z obr. 4, umožňuje ko-exprese Grb2 opozici vůči účinkům Grb3-3.
Tyto výsledky ukazují tedy jednoznačně, že Grb3-3 je smrtícím genem schopným indukovat buněčnou apoptózu. Jak již to bylo uvedeno výše, nabízí tato vlastnost obzvláště výhodné aplikace v rámci léčení patologických stavů rezultujících z buněčné proliferace, jakými jsou zejména rakoviny, restenóza, atd..
Příklad 5
Demonstrování exprese Grb3-3 v lymfocytech infikovaných virem HIV
Tento příklad ukazuje, že v průběhu infekčního cyklu lymfocytů T virem HIV je podíl RNAm Grb2 a Grb3-3 modifikován a že v okamžiku masivní virové tvorby a buněčné smrti je nadměrně exprimován mediátor Grb3-3.
Lymfocyty periferní krve byly infikovány virem HIV-1 ve dvou zředěních (1/10 a 1/100) po dobu 1, 4 nebo 7 dnů. RNAm buněk byly potom analyzovány reverzní technikou PCR pomocí specifických oligonukleotidů Grb2 a Grb3-3 za účelem stanovení relativního podílu mediátorů Grg2 a Grb3-3. Použitými specifickými oligonukleotidy Grb3-3 jsou následující oligonukleotidy:
oligonukleotid IV (3'):
ATCGTTTCCAAACGGATGTGGTTT (SEQ ID č. 8) oligonukleotid V (5'):
ATAGAAATGAAACCACATCCGTTT (SEQ ID č. 9).
Získané výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Tyto výsledky ukazují jednoznačně, že 7 dní po infekci virem HIV dochází k nadměrné expresi mRNA Grb3-3. Jak je to patrné ze stanovení proteinu p24 a inverzní transkriptázy viru, odpovídá 7 dnů rovněž periodě, ve které je pozorována masivní virová produkce.
-10CZ 288882 B6
Seznam sekvencí
SEQ ID č. 1:
i) charakteristiky sekvence:
A) délka: 933 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) počet řetězců: dvojitý io D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA iii) Hypotetický: ne iii) antimediátorový: ne vi) původ:
A) organismus: Homo sapiens ix) Dodatečné charakteristiky:
A) jméno/klíč: CDS
B) umístění: 37..567
C) další informace: produkce = „Grg3-3“ ix) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:
-11CZ 288882 B6
GAATTCGGGG CTGCTGAGCA CTGAGCAGGG CTCAGA ATG GAA GCC ATC GCC AAA 54
| Met 1 | Glu | Ala | Ile | Ala 5 | Lys | |||||||||||
| TAT | GAC | TTC | AAA | GCT | ACT | GCA | GAC GAC | GAC | CTG | AGC | TTC | AAA | AGG | GGG | 102 | |
| Tyr | Asp | Phe | Lys | Ala | Thr | Ala | Asp Asp Asp | Leu | Ser | Phe | Lys | Arg | Gly | |||
| 10 | 15 | 20 | ||||||||||||||
| GAC | ATC | CTC | AAG | GTT | TTG | AAC | GAA | GAA | TGT | GAT | CAG | AAC | TGG | TAC | AAG | 150 |
| Asp | Ile | Leu | Lys | Val | Leu | Asn | Glu | Glu | Cys | Asp | Gin | Asn | Trp | Tyr | Lys | |
| 25 | 30 | 35 | ||||||||||||||
| GCA | GAG | CTT | AAT | GGA | AAA | GAC | GGC | TTC | ATT | CCC | AAG | AAC | TAC | ATA | GAA | 198 |
| Ala | Glu | Leu | Asn | Gly | Lys | Asp | Gly | Phe | Ile | Pro | Lys | Asn | Tyr | Ile | Glu | |
| 40 | 45 | 50 | ||||||||||||||
| ATG | AAA | CCA | CAT | CCG | TTT | GGA | AAC | GAT | GTG | CAG | CAC | TTC | AAG | GTG | CTC | 246 |
| Met | Lys | Pro | His | Pro | Phe | Gly | Asn | Asp | Val | Gin | His | Phe | Lys | Val | Leu | |
| 55 | 60 | 65 | 70 | |||||||||||||
| CGA | GAT | GGA | GCC | GGG | AAG | TAC | TTC | CTC | TGG | GTG | GTG | AAG | TTC | AAT | TCT | 294 |
| Arg | Asp | Gly | Ala | Gly Lys | Tyr | Phe | Leu | Trp | Val | Val | Lys | Phe | Asn | Ser | ||
| 75 | 80 | 85 | ||||||||||||||
| TTG | AAT | GAG | CTG | GTG | GAT | TAT | CAC | AGA | TCT | ACA | TCT | GTC | TCC | AGA | AAC | 342 |
| Leu | Asn | Glu | Leu | Val | Asp | Tyr | His | Arg | Ser | Thr | Ser | Val | Ser | Arg | Asn | |
| 90 | 95 | 100 | ||||||||||||||
| CAG | CAG | ATA | TTC | CTG | CGG | GAC | ATA | GAA | CAG | GTG | CCA | CAG | CAG | CCG | ACA | 390 |
| Gin | Gin | Ile | Phe | Leu | Arg | Asp | Ile | Glu | Gin | Val | Pro | Gin | Gin | Pro | Thr | |
| 105 | 110 | 115 | ||||||||||||||
| TAC | GTC | CAG | GCC | CTC | TTT | GAC | TTT | GAT | CCC | CAG | GAG | GAT | GGA | GAG | CTG | 438 |
| Tyr | Val | Gin | Ala | Leu | Phe | Asp | Phe | Asp | Pro | Gin | Glu | Asp Gly | G1U | Leu | ||
| 120 | 125 | 130 | ||||||||||||||
| GGC | TTC | CGC | CGG | GGA | GAT | TTT | ATC | CAT | GTC | ATG | GAT | AAC | TCA | GAC | CCC | 486 |
| Gly | Phe | Arg | Arg Gly Asp | Phe | Ile | His | Val | Met | Asp | Asn | Ser | Asp | Pro | |||
| 135 | 140 | 145 | 150 | |||||||||||||
| AAC | TGG | TGG | AAA | GGA | GCT | TGC | CAC | GGG | CAG | ACC | GGC | ATG | TTT | CCC | CGC | 534 |
| Asn | Trp | Trp | Lys | Gly | Ala | Cys | His | Gly | Gin | Thr | Gly | Met | Phe | Pro | Arg | |
| 155 | 160 | 165 | ||||||||||||||
| AAT | TAT | GTC | ACC | CCC | GTG | AAC | CGG | AAC | GTC | TAAGAGTCAA GAAGCAATTA | 584 | |||||
| Asn | Tyr | Val | Thr | Pro | Val | Asn | Arg | Asn | Val | |||||||
| 170 | 175 |
TTTAAAGAAA
GTGAAAAATG
TAAAACACAT
ACAAAAGAAT
TAAACCCACA
AGCTGCCTCT
644
GACAGCAGCC
TGTGAGGGAG
TGCAGAACAC
CTGCCGGGTC
ACCCTGTGAC
CCTCTCACTT
704
TGGTTGGAAC
TTTAGGGGGT
GGGAGGGGGC
GTTGGATTTA
AAAATGCCAA
AACTTACCTA
764
TAAATTAAGA
AGAGTTTTTA
TTACAAATTT
TCACTGCTGC
TCCTCTTTCC
CCTCCTTTGT
824
CTTTTTTTTC TTCCTTTTTT
CTCTTCTGTC CATCAGTGCA TGACGTTTAA GGCCACGTAT
884
AGTCCTAGCT GACGCCAATA AAAAACAAGA AACCAAAAAA CCCGAATTC
933
-12CZ 288882 Β6
SEQ ID č. 2:
i) Charakteristiky sekvence
A) délka: 24 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) počet řetězců: jednoduchý
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:
A) organismus: oligonukleotid xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:
ATGGAAGCCA TCGCCAAATA TGAC 24
SEQ ID č. 3:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 39 párů bází
B) typ: kyselina nukleová
C) počet řetězců: jednoduchý
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:
A) organismus: oligonukleotid I xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:
GAATTCGGAT CCATGGAAGC CATCGCCAAA TATGACTTG 39
SEQ ID č. 4:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 39 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) počet řetězců: jednoduchý
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:
A) organismus: oligonukleotid II xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:
GAATTCGGAT CCTTAGACGT TCCGGTTCAC GGGGGTGAC 39
-13CZ 288882 B6
SEQ ID č. 5:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 49 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) počet řetězců: jednoduchý
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:
A) organismus: oligonukleotid III xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:
GACGTTCCGG TTCACGGGGG TGACATAATT GCGGGGAAAC ATGCGGGTC 49
SEQ ID č. 6:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 20 aminokyseliny
B) aminokyselina
C) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: protein vi) Původ:
A) organismus: peptid hSOSl (zbytky 1142 až 1162) xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 6:
Gly Thr Pro Glu Val Pro Val Pro Pro Pro Val Pro Pro Arg Arg Arg Pro Glu Ser Ala 1 5 10 15 20
SEQ ID č. 7:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 8 aminokyselin
B) typ: aminokyselina
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: protein vi) původ:
A) organismus: peptid 3BP1 xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 7:
Pro Pro Pro Leu Pro Pro Leu Val
5
-14CZ 288882 B6
SEQ ID č. 8:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 24 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) počet řetězců: jednoduchý
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:
A) organismus: oligonukleotid IV xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 8:
ATCGTTTCCA AATGGATGTG GTTT
SEQ ID č. 9:
i) Charakteristiky sekvence:
A) délka: 24 párů bází
B) typ: nukleová kyselina
C) počet řetězců: jednoduchý
D) konfigurace: lineární ii) Typ molekuly: cDNA vi) Původ:
A) organismus: oligonukleotid V xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 9:
Claims (12)
- PATENTOVÉNÁROKY1. Polynukleotid kódující polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č. 1.
- 2. Polynuikleotid podle nároku 1 obsahující nukleotid 37-564 sekvence SEQ ID č. 1.
- 3. Antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého polynukleotidu podle nároku 1 nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expesi Grb2.
- 4. Antimediátorový polynukleotid, který je komplementárním řetězcem celého polynukleotidu podle nároku 1 nebo jeho části, přičemž uvedený antimediátorový polynukleotid je schopný inhibovat expresi Grb3-3.
- 5. Polypeptid mající aminokyselinovou sekvenci SEG ID č. 1.-15CZ 288882 B6
- 6. Vektor obsahující polynukleotid podle nároku 1 nebo 2.
- 7. Vektor podle nároku 6, který je virovým vektorem.
- 8. Vektor podle nároku 7, který je vektorem odvozen od adenovirů, retrovirů, přidružených adenovirů, viru herpes, cytomegaloviru nebo viru kravských neštovic.
- 9. Vektor podle nároku 7 nebo 8, který je replikačně defektním virem.
- 10. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje polynukleotid podle nároku 1 nebo 2 nebo vektor podle nároků 6 až 9 nebo antimediátorový polynukleotid podle nároku 3 nebo polypeptid podle nároku 5.
- 11. Použití polynukleotidu podle nároku 1 nebo 2 nebo vektoru podle nároků 6 až 9 nebo antimediátorového polynukleotidu podle nároku 3 nebo polypeptidů podle nároku 5 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakoviny.
- 12. Použití antimediátorového polynukleotidu podle nároku 4 pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení AIDS.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9310971A FR2710074B1 (fr) | 1993-09-15 | 1993-09-15 | Gène GRB3-3, ses variants et leurs utilisations. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ75896A3 CZ75896A3 (en) | 1996-06-12 |
| CZ288882B6 true CZ288882B6 (cs) | 2001-09-12 |
Family
ID=9450882
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1996758A CZ288882B6 (cs) | 1993-09-15 | 1994-05-09 | Polynukleotid, antimediátorový polynukleotid, polypeptid kódovaný uvedeným polynukleotidem, vektor obsahující uvedený polynukleotid, farmaceutická kompozice obsahující uvedený polynukleotid nebo antimediátorový polynukleotid nebo polypeptid nebo vektor a jejich použití pro přípravu farmaceutické kompozice |
Country Status (27)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5831048A (cs) |
| EP (1) | EP0719328B1 (cs) |
| JP (1) | JP3794697B2 (cs) |
| KR (1) | KR100330477B1 (cs) |
| CN (1) | CN1098930C (cs) |
| AT (1) | ATE196926T1 (cs) |
| AU (1) | AU698819B2 (cs) |
| BR (1) | BR9407693A (cs) |
| CA (1) | CA2169938A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ288882B6 (cs) |
| DE (1) | DE69426121T2 (cs) |
| DK (1) | DK0719328T3 (cs) |
| ES (1) | ES2152313T3 (cs) |
| FI (1) | FI120499B (cs) |
| FR (1) | FR2710074B1 (cs) |
| GR (1) | GR3034600T3 (cs) |
| HU (1) | HU221516B (cs) |
| IL (2) | IL110942A (cs) |
| NO (1) | NO319144B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ266162A (cs) |
| PL (1) | PL178402B1 (cs) |
| PT (1) | PT719328E (cs) |
| RU (1) | RU2159815C2 (cs) |
| SK (1) | SK281123B6 (cs) |
| UA (1) | UA46715C2 (cs) |
| WO (1) | WO1995007981A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA947059B (cs) |
Families Citing this family (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2732348B1 (fr) * | 1995-03-31 | 1997-04-30 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Systeme d'expression conditionnel |
| US6423824B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-07-23 | Biogen, Inc. | CAIP-like gene family |
| US5837844A (en) * | 1995-06-07 | 1998-11-17 | Biogen, Inc. | CAIP-like gene family |
| US6171800B1 (en) | 1995-06-07 | 2001-01-09 | Biogen, Inc. | Method of making and binding CAIP polypeptides |
| US5855911A (en) * | 1995-08-29 | 1999-01-05 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Liposomal phosphodiester, phosphorothioate, and P-ethoxy oligonucleotides |
| AU6342696A (en) * | 1996-06-27 | 1998-01-14 | Biogen, Inc. | The caip-like gene family |
| US7309692B1 (en) * | 1996-07-08 | 2007-12-18 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of chronic myelogenous leukemic cell growth by liposomal-antisense oligodeoxy-nucleotides targeting to GRB2 or CRK1 |
| US6977244B2 (en) | 1996-10-04 | 2005-12-20 | Board Of Regents, The University Of Texas Systems | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
| US7704962B1 (en) | 1997-10-03 | 2010-04-27 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Small oligonucleotides with anti-tumor activity |
| US7285288B1 (en) | 1997-10-03 | 2007-10-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides |
| EP0998945A1 (en) * | 1998-09-30 | 2000-05-10 | Transgene S.A. | Use of magnesium (Mg2+) for the enhancement of gene delivery in gene therapy |
| KR20080023768A (ko) | 2000-03-30 | 2008-03-14 | 화이트헤드 인스티튜트 포 바이오메디칼 리서치 | Ｒｎａ 간섭의 ｒｎａ 서열 특이적인 매개체 |
| CN100523215C (zh) | 2000-12-01 | 2009-08-05 | 马普科技促进协会 | 介导rna干涉的小rna分子 |
| CA2471967A1 (en) * | 2002-01-03 | 2003-07-31 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Wt1 antisense oligos for the inhibition of breast cancer |
| CN121476598A (zh) * | 2025-11-03 | 2026-02-06 | 昆明理工大学 | Grb2基因表达抑制剂在制备增强肿瘤细胞药物敏感性制剂中的应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IE920151A1 (en) * | 1991-01-18 | 1992-07-29 | Univ New York | A novel expression-cloning method for identifying target¹proteins for receptor tyrosine kinases and novel human grb¹proteins |
| AU5136093A (en) * | 1992-09-25 | 1994-04-26 | Warner-Lambert Company | Peptide antagonists of sh2 binding and therapeutic uses thereof |
-
1993
- 1993-09-15 FR FR9310971A patent/FR2710074B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-05-09 RU RU96107888/13A patent/RU2159815C2/ru active
- 1994-05-09 CN CN94193814A patent/CN1098930C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-09 SK SK345-96A patent/SK281123B6/sk not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 PL PL94313445A patent/PL178402B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 CZ CZ1996758A patent/CZ288882B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 AU AU67247/94A patent/AU698819B2/en not_active Ceased
- 1994-05-09 HU HU9600668A patent/HU221516B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 BR BR9407693A patent/BR9407693A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-05-09 UA UA96030994A patent/UA46715C2/uk unknown
- 1994-05-09 CA CA002169938A patent/CA2169938A1/fr not_active Abandoned
- 1994-05-09 WO PCT/FR1994/000542 patent/WO1995007981A1/fr not_active Ceased
- 1994-05-09 US US08/612,857 patent/US5831048A/en not_active Ceased
- 1994-05-09 ES ES94915598T patent/ES2152313T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 PT PT94915598T patent/PT719328E/pt unknown
- 1994-05-09 EP EP94915598A patent/EP0719328B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-09 KR KR1019960701323A patent/KR100330477B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-09 AT AT94915598T patent/ATE196926T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-05-09 DK DK94915598T patent/DK0719328T3/da active
- 1994-05-09 JP JP50901595A patent/JP3794697B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-09 DE DE69426121T patent/DE69426121T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-09 US US09/641,640 patent/USRE37952E1/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-05-09 NZ NZ266162A patent/NZ266162A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-12 IL IL11094294A patent/IL110942A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-12 IL IL126756A patent/IL126756A/en not_active IP Right Cessation
- 1994-09-13 ZA ZA947059A patent/ZA947059B/xx unknown
-
1996
- 1996-03-08 NO NO19960965A patent/NO319144B1/no not_active IP Right Cessation
- 1996-03-14 FI FI961202A patent/FI120499B/fi active IP Right Grant
-
2000
- 2000-10-12 GR GR20000401514T patent/GR3034600T3/el not_active IP Right Cessation
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Schneider et al. | Regulation of CAK kinase activity by p53 | |
| USRE37952E1 (en) | Grb3-3 cDNA and polypeptides | |
| US6368829B1 (en) | Smad2 phosphorylation and interaction with Smad4 | |
| KR102566745B1 (ko) | 암의 예방 또는 치료를 위한 Runx3 변이 단백질 | |
| EP0846761A1 (en) | A novel transcription factor expressed in cycling cells, nucleic acid molecules encoding said transcription factor and its promoter region and uses thereof | |
| AU722973B2 (en) | Grb3-3 gene, variants and uses thereof | |
| EP1003859A1 (en) | Use of transcription factor brn-3a | |
| US8088892B2 (en) | Inhibitors of proteins from the Rho-GEF family | |
| US6818744B1 (en) | p53 regulatory protein called RB18A and uses thereof | |
| Xu et al. | Molecular cloning and characterization of FX3, a novel zinc-finger protein. | |
| US20060160732A1 (en) | Compositions and methods for inhibiting cell senescence and hyperproliferative disorders | |
| KR20040056105A (ko) | 인간 원암유전자 ｈｌｃ-8 및 이에 의해 코드되는 단백질 | |
| NO315895B1 (no) | Farmasöytisk preparat for kontroll av cellesyklusutvikling, fremstilling avdette for regulering av cellesyklusutvikling i en celle sommangler et funksjonelt retinoblastomtumorsuppressorprotein, samt fremgangsmåte forkontroll av cellesyklusutv |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20100509 |