CZ290484B6 - Sestavené částice rostlinného viru a způsob jejich výroby, očkovací látky, fragment cDNA, vektor a jejich RNA transkript - Google Patents
Sestavené částice rostlinného viru a způsob jejich výroby, očkovací látky, fragment cDNA, vektor a jejich RNA transkript Download PDFInfo
- Publication number
- CZ290484B6 CZ290484B6 CZ1996723A CZ72396A CZ290484B6 CZ 290484 B6 CZ290484 B6 CZ 290484B6 CZ 1996723 A CZ1996723 A CZ 1996723A CZ 72396 A CZ72396 A CZ 72396A CZ 290484 B6 CZ290484 B6 CZ 290484B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- virus
- plant virus
- plant
- sequence
- assembled
- Prior art date
Links
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 134
- 239000002245 particle Substances 0.000 title claims abstract description 77
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 title claims abstract description 27
- 239000012634 fragment Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title abstract description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 title description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 76
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 34
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 33
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 claims abstract description 28
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 17
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 claims abstract description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 6
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 6
- 244000037640 animal pathogen Species 0.000 claims abstract description 5
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 claims abstract description 4
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims abstract 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 113
- 241000723655 Cowpea mosaic virus Species 0.000 claims description 60
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 32
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 claims description 30
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 claims description 27
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 25
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 14
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 14
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 14
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 claims description 11
- 241000430519 Human rhinovirus sp. Species 0.000 claims description 9
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 9
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 9
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 6
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 claims description 4
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 claims description 4
- 108700012941 GNRH1 Proteins 0.000 claims description 3
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 claims description 3
- 241000701931 Canine parvovirus Species 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 241000723607 Comovirus Species 0.000 claims 2
- 239000011246 composite particle Substances 0.000 claims 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 125000003508 trans-4-hydroxy-L-proline group Chemical group 0.000 claims 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 abstract description 10
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 44
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 26
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 17
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 16
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 13
- 241000710122 Rhinovirus B14 Species 0.000 description 11
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 10
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 101800001690 Transmembrane protein gp41 Proteins 0.000 description 7
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 6
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 6
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- 101100135798 Caenorhabditis elegans pcp-1 gene Proteins 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 101100135809 Mus musculus Pcp2 gene Proteins 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 4
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 3
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 108020005089 Plant RNA Proteins 0.000 description 2
- 208000000474 Poliomyelitis Diseases 0.000 description 2
- 101800000874 Small capsid protein Proteins 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000010915 one-step procedure Methods 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108050009160 DNA polymerase 1 Proteins 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 241000702224 Enterobacteria phage M13 Species 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010020164 HIV infection CDC Group III Diseases 0.000 description 1
- 241000710124 Human rhinovirus A2 Species 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000709664 Picornaviridae Species 0.000 description 1
- 108010066124 Protein S Proteins 0.000 description 1
- 102000029301 Protein S Human genes 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 230000006819 RNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000010240 RT-PCR analysis Methods 0.000 description 1
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 1
- 102100023935 Transmembrane glycoprotein NMB Human genes 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000042314 Vigna unguiculata Species 0.000 description 1
- 235000010722 Vigna unguiculata Nutrition 0.000 description 1
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 108010030074 endodeoxyribonuclease MluI Proteins 0.000 description 1
- 238000009585 enzyme analysis Methods 0.000 description 1
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091007466 transmembrane glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
- C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8201—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation
- C12N15/8202—Methods for introducing genetic material into plant cells, e.g. DNA, RNA, stable or transient incorporation, tissue culture methods adapted for transformation by biological means, e.g. cell mediated or natural vector
- C12N15/8203—Virus mediated transformation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
- C12N2740/00011—Details
- C12N2740/10011—Retroviridae
- C12N2740/16011—Human Immunodeficiency Virus, HIV
- C12N2740/16111—Human Immunodeficiency Virus, HIV concerning HIV env
- C12N2740/16122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32111—Aphthovirus, e.g. footandmouth disease virus
- C12N2770/32122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
- C12N2770/00011—Details
- C12N2770/32011—Picornaviridae
- C12N2770/32711—Rhinovirus
- C12N2770/32722—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
Abstract
Sestaven stice rostlinn ho viru obsahuj c ciz peptid vlo en² do pl ov ho proteinu viru, p°i em tento ciz peptid je k dov n ciz sekvenc nukleov kyseliny vlo enou do genomu rostlinn ho viru, p°i em tato vlo en sekvence nukleov kyseliny neobsahuje dn p° m repetice sekvence lemuj c tuto vlo enou sekvenci nukleov kyseliny. Zp sob v²roby t chto stic, p°i n m se nukleov kyselina k duj c pl ov² protein rostlinn ho viru modifikuje zaveden m nukleotidov sekvence k duj c ciz peptid takov²m zp sobem, aby se zabr nilo vzniku p° m²ch repetic sekvence lemuj c ch zavedenou sekvenci, vzniklou modifikovanou virovou nukleovou kyselinou se infikuj rostliny, rostlinn tk , rostlinn bu ky nebo protoplasty a sklid se sestaven stice modifikovan ho viru. O kovac l tka pro ochranu proti hum nn m a ivo i n²m patogen m a virov o kovac l tka pro zv °ata, kter jako imunogenn slo ku obsahuje sestaven stice rostlinn ho viru uveden v² e. Fragment cDNA, Sst1, vektor obsahuj c tento fragment a RNA transkript tohoto fragmentu nebo vektoru.\
Description
Sestavené částice rostlinného viru a způsob jejich výroby, očkovací látky, fragment cDNA, vektor a jejich RNA transkript
Oblast techniky
Vynález se týká sestavených částic rostlinného viru a způsobu jejich výroby, očkovací látky pro ochranu proti humánním a živočišným patogenům, virová očkovací látky pro zvířata, fragmentem cDNA plášťového proteinu, vektor obsahujícího tento fragment ajejich RNA transkriptů.
V širším kontextu se vynález se týká použití virů jako nosičů (vektorů pro produkci nebo presentaci cizích peptidů. Zejména se vynález týká genetické manipulace virové nukleové kyseliny spočívající v zavedení sekvencí zcizí nukleové kyseliny, které se exprimují jako peptidy ve virové částici (virionu). Pod označením cizí, jak se ho používá v tomto popisu, ve spojitosti s peptidem nebo nukleovou kyselinou kódující tento peptid, se rozumí peptidy nebo sekvence nukleové kyseliny, které nejsou nativní vzhledem k rostlinnému viru použitému jako vektoru. Takové sekvence lze alternativně popsat jako exogenní nebo heterologické sekvence. Pod označením peptid se rozumějí malé peptidy a polypeptidy.
Dosavadní stav techniky
V patentové přihlášce WO 92/18 618 stejného přihlašovatele je popsáno použití rostlinných virů jako vektorových systému pro expresi cizích nukleotidových sekvencí, tj. nukleotidových sekvencí (RNA nebo DNA), které nejsou přítomny v rostlinných virech vyskytujících se v přírodě a které v důsledku toho kódují peptidy, které se normálně nevyskytují v žádném rostlinném viru, který se nalézá v přírodě. Vynález popsaný v citované přihlášce zahrnuje sestavené částice rostlinného viru obsahující cizí peptid. Rostlinné viry podle tohoto vynálezu přestavují proto modifikované formy nativních virů a účelněji jsou proto označovány názvem modifikované viry.
Cizí peptidy, které je možno zavést do rostlinných virů podle dřívější přihlášky stejného přihlašovatele WO 92/18 618, mohou být rozmanitých typů a jsou omezeny pouze tím, že povaha a velikost cizího peptidu a místo jeho lokalizace v nebo na virové částici nesmí interferovat s kapacitou sestavování modifikovaného viru při kultivaci in vitro nebo in vivo. V širokém smyslu je možno modifikované viry vytvářet zjakýchkoliv biologicky užitečných peptidů (obvykle polypeptidů), jejichž funkce vyžaduje specifickou konformaci pro dosažení aktivity. Toho se může dosáhnout spojením peptidu s větší molekulou, například za účelem zlepšení stability nebo modu presentace v konkrétním biologickém systému. Jako příklady takových peptidů je možno uvést peptidové hormony, enzymy, růstové faktory, antigeny protozoálního virového bakteriálního, fungálního nebo živočišného původu, protilátky, včetně antiidiotypických protilátek, imunoregulátory a cytokiny, například interferony a interleukiny; receptory, adhesiny a části prekurzorů kteréhokoliv zvýše uvedených typů peptidů. Peptid přednostně obsahuje více než 5 aminokyselin.
Z širokého spektra bioaktivních peptidových sekvencí presentovaných na rostlinném virovém vektoru podle vynálezu citovaného ve výše citované patentové přihlášce stejného přihlašovatele mají obzvláštní důležitost antigenní peptidy, které jsou základem očkovacích látek, zvláště pak virových očkovacích látek pro živočichy, včetně lidí. V kontextu našeho dřívějšího vynálezu se pod pojmem očkovací látky rozumějí látky používané jak k profylaktickým účelům (tj. k prevenci choroby), tak k terapeutickým účelům (tj. k léčbě choroby). Pro aplikace očkovacích látek zajišťuje náš dřívější vynález obzvláště atraktivní epitopový prezentační systém. Při takových aplikacích je složka antigenního peptidu vhodně umístěna na virové částici
- 1 CZ 290484 B6 tak, aby byla snadno rozpoznatelná imunitním systémem, tj. například tak, že je umístěna na exponované části plášťového proteinu viru. Náš dřívější vynález tedy zahrnuje sestavené částice modifikovaného rostlinného viru obsahující antigen odvozený z patogenu, například živočišného viru, přičemž tento patogen je zabudován v exponované poloze na povrchu plášťového proteinu rostlinného viru. Tento vynález se také týká použití takových sestavených částic modifikovaného rostlinného viru, jako imunogenní složky očkovací látky. Sestavené částice modifikovaného rostlinného viru prezentující antigenní peptidy vykazují též aplikace jako složka pro prezentaci antigenu při imunodiagnostickém stanovení, například za účelem detekce patogenů nebo chorob živočichů, včetně člověka.
Systém popsaný v naší dřívější přihlášce je vysoce všestranný, pokud se týče velikosti cizího peptidu, který je možno vložit do plášťového proteinu viru. Tak byly v průběhu našeho pokračujícího výzkumu úspěšně vloženy peptidy obsahující až 38 nebo více aminokyselin. Takto vzniklé modifikované viry vykazují však konkurenční nevýhodu vzhledem k nemodifikovaným virům (divokého typu) při propagaci v rostlinách, poněvadž se jedná o nepřirozené struktury. V důsledku toho jsme pozorovali tendenci ztrácet cizí peptid během propagace u některých modifikovaných virů, což vedlo ke snížení výtěžku těchto modifikovaných virů.
Při práci na tomto vynálezu byly identifikovány příčiny tohoto problému a byly stanoveny stupně, které je třeba provést, aby se tomuto jevu zabránilo.
Předně by se mělo při způsobu používaném pro modifikaci nukleové kyseliny rostlinného viru zaváděním nukleotidové sekvence kódující cizí peptid vyhnout přítomnosti přímých repetic sekvence lemujících vloženou nukleotidovou sekvenci. V kontextu tohoto vynálezu se za konstrukt obsahující přímou repetici sekvence rozumí takový konstrukt, v němž je na obou stranách vloženého nukleotidu přítomna stejná oligonukleotidová sekvence. Takové konstrukty mohou být geneticky nestálé, poněvadž může docházet k rekombinaci mezi repeticemi sekvence, což vede ke ztrátě sekvence kódující cizí peptid a k reverzi na sekvenci divokého typu. Za druhé, pokud se cizí oligonukleotidová sekvence vkládá do genomu rostlinného viru náhradou za část existující sekvence, může výsledný modifikovaný virový plášťový protein postrádat aminokyselinovou sekvenci, která je důležitá pro replikaci viru, enkapsidaci a šíření v rostlině. Tento defekt je možno snadno zjistit, a lze se mu vyhnout. Za třetí, heterologická sekvence by neměla být vkládána do místa, které není optimální.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou sestavené částice rostlinného viru obsahující cizí peptid vložený do plášťového proteinu viru, přičemž tento cizí peptid je kódován cizí sekvencí nukleové kyseliny vloženou do genomu rostlinného viru, přičemž tato vložená sekvence nukleové kyseliny neobsahuje žádné přímé repetice sekvence lemující tuto vloženou sekvenci nukleové kyseliny.
Předmětem vynálezu je také způsob výroby těchto částic, jehož podstata spočívá v tom, že se zavede nukleotidová sekvence kódující cizí peptid za účelem modifikace nukleové kyseliny kódující plášťový protein rostlinného viru takovým způsobem, aby se zabránilo vzniku přímých repetic sekvence lemujících zavedenou sekvenci, vzniklou modifikovanou virovou nukleovou kyselinou se infikují rostliny, rostlinná tkáň, rostlinné buňky nebo protoplasty a sklidí se sestavené částice modifikovaného viru.
Předmětem vynálezu je dále také očkovací látka pro ochranu proti humánním a živočišným patogenům a virová očkovací látka pro zvířata, která jako imunogenní složku obsahuje sestavené částice rostlinného viru uvedené výše.
- 2 CZ 290484 B6
Dále je předmětem vynálezu také fragment cDNA plášťového proteinu CPMV obsahujícím sekvenci DNA kódující cizí peptid v místě odpovídajícím exponovanému povrchu tohoto plášťového proteinu, přičemž tímto fragmentem je Sstl a také vektor obsahující tento fragment, jakož i jejich RNA transkripty.
V přednostním provedení se jako rostlinného viru používá viru mozaiky vigny (Vigna unguiculata) (CPMV) a cizí vložená nukleotidová sekvence se zavádí bezprostředně před prolinový zbytek v poloze 23 (Pro23) ve smyčce βΒ-pC malého kapsidového proteinu (VP23).
Vynález je možno aplikovat na jakýkoliv rostlinný virus tak, že se identifikuje část virového genomu, která kóduje exponovanou část plášťového proteinu. Pro tuto část genomu se vyberou dvě různá místa pro restrikční enzymy a nukleová kyselina se rozštěpí za použití příslušných restrikčních enzymů. Syntetizují se dvojice komplementárních oligonukleotidů kódující cizí peptid, který je žádoucí vložit do plášťového proteinu viru. Tyto oligonukleotidy obsahují konce, které jsou kompatibilní s místy rozštěpenými restrikčním enzymem, což umožňuje jejich vložení do rozštěpené nukleové kyseliny viru. Tento postup má za následek vložení nukleotidové sekvence kódující cizí peptid, při němž je možno se vyhnout přítomnosti přímých repetic sekvence lemujících vloženou nukleotidovou sekvenci. Přednostně se syntetizují komplementární oligonukleotidy, v nichž je sekvence kódující heterologické aminokyseliny lemována sekvencemi, které jsou specifické pro rostlinný virus, takže je cizí nukleová kyselina vložena jako přídavek k existující nukleové kyselině.
V přednostním provedení se prozkoumá trojrozměrná struktura rostlinného viru, za účelem identifikace částí plášťového proteinu, které jsou specificky exponovány na povrchu viru, a proto potenciálně představují optimální místa pro inserci. V dalším provedení se analyzuje aminokyselinová sekvence exponovaných částí plášťového proteinu na aminokyseliny, které rozbíjejí α-helikální struktury, poněvadž tyto aminokyseliny představují potenciální optimální místa pro inserci. Jako příklady vhodných aminokyselin je možno uvést prolin a hydroxyprolin. Obě tyto aminokyseliny při každém svém výskytu v polypeptidovém řetězci přerušují α-helix a vytvářejí tuhé kličky nebo záhyby ve struktuře.
Pro demonstraci tohoto systému byl zvolen virus mozaiky vigny (Vigna unguiculata) (CPMV). Trojrozměrná struktura CPMV byla identifikována při atomovém rozlišení, což umožňuje identifikaci míst vhodných pro modifikaci bez porušení struktury částice.
CPMV je bipartitní RNA virus a pro manipulaci genomu jakéhokoliv RNA viru, aby exprimoval cizí peptidy, je zapotřebí použít cDNA klonů RNA. Jsou k dispozici cDNA klony s úplnou délkou obou CPMV RNA molekul, které je možno manipulovat za účelem inserce oligonukleotidových sekvencí kódujících cizí peptid, cDNA klonů genomu rostlinných RNA virů je možno použít pro vytvoření in vitro transkriptů, které jsou infekční, když jsou inokulovány na rostliny. Infekčnost těchto transkriptů je však podstatně nižší než infekčnost přírodních virionových RNA, pravděpodobně v důsledku přítomnosti nevirových zbytků na koncích těchto transkriptů. Obtíže mohou být také způsobeny expozicí těchto trankriptů degradačním činidlům během inokulace. Proto se tyto transkripty obvykle stabilizují upravením jejich 5' konce čepičkou, ale tento postup je neúčinný, nákladný a zdlouhavý.
Podle vynálezu byly také zkonstruovány cDNA klony CPMV RNA M a B, kde cDNA klon M RNA obsahuje vloženou oligonukleotidovou sekvenci kódující cizí peptid využívající promotorovou sekvenci 35S z viru mozaiky květáku (CaMV) připojenou k 5' koncům virových cDNA, za účelem vytvoření infekčních transkriptů v rostlině. Tato technika překonává některé z problémů, s nimiž se střetává použití transkriptů vytvořených in vitro a je použitelná pro všechny rostlinné RNA viry.
- j CZ 290484 B6
Pro demonstraci široké aplikovatelnosti tohoto vy nálezu bylo použito antigenních peptidů ze čtyř různých živočišných virů, jednoho živočišného bakteriálního patogenu a savčího peptidového hormonu. Dva z těchto virů náleží do skupiny živočišných virů picornavirus, což jsou viry kulhavky aslintavky (FMDV) a humánního rhinoviru (HRV). Do této skupiny patří několik důležitých patogenů, zejména FMDV, poliomyelitis (polio) a hepatitis A. Třetím zvoleným virem je virus humánní imunitní deficience (HIV), který nevykazuje žádnou podobnost s žádným známým rostlinným virem a pro který nejsou v současné době dostupné žádné úspěšné očkovací látky. Bakteriálním patogenem je Staphylococcus aureus, kauzativní činidlo několika chorob živočichů, včetně mastitidy krav, Peptidovým hormonem je hormon uvolňující gonadotrophin u vepře.
Vynález je blíže objasněn pomocí následujících výkresů.
Přehled obrázků na výkresech
Na obr. 1 je znázorněna oblast CPMV M RNA kódující 40 aminoterminálních aminokyselin VP23. Čísla pod nukleotidovou sekvencí se vztahují k sekvenci M RNA a je označena poloha jedinečného místa Nhel. Aminokyseliny, které se podílejí na tvorbě řetězce βΒ a βθ VP23 jsou označeny nad aminokyselinovou sekvencí proteinu, která je znázorněna za použití standardního jednopísmenového kódu.
Na obr. 2 (A) je znázorněna sekvence oligonukleotidů použitých při konstrukci pFMDV spolu s aminokyselinovou sekvencí kódovanou vrchním (pozitivním) řetězcem, která odpovídá aminokyselinovým zbytkům 136 až 160 zVPI FMDV serotypu Oi; a (B) struktura VP23 po inserci FMDV-specifíckých oligonukleotidů. Oblast označená šipkami ukazuje rozsah vloženého epitopu FMDV. Místo Nhel, které nebylo restaurováno během klonování je označeno symbolem xNhel. Také je zde označeno diagnostické místo BglII, které je přítomno ve vložené sekvenci.
Na obr. 3 je znázorněn účinek inserce FMDV-specifíckých oligonukleotidů kódujících aminokyselinové zbytky 136 až 160 zVPI FMDV sérotypu Oi na strukturu VP23 v pMT7-FMDV-I. Aminokyseliny, které se podílejí na tvorbě řetězce βΒ a βθ VP23 jsou označeny nad aminokyselinovou sekvencí proteinu, která je znázorněna za použití standardního jednopísmenového kódu.
Na obr. 4 je znázorněna konstrukce substitučního vektoru místně orientovanou mutagenezí. Hvězdičkou je označen zbytek T, který je změněn na zbytek C místně orientovanou mutagenezí za vzniku nového místa AatlI.
Na obr. 5 (A) je znázorněna nukleotidová sekvence oligonukleotidů použitých při konstrukci pMT7-HIV spolu s aminokyselinovou sekvencí kódovanou vrchním (pozitivním) řetězcem, která odpovídá aminokyselinovým zbytkům 735 až 752 z gp41 HIVI; a (B) struktura VP23 po inserci HlV-specifických oligonukleotidů. Oblast označená šipkami ukazuje rozsah vloženého epitopu HIV. Také je zde označeno diagnostické místo Pvul, které je přítomno ve vložené sekvenci.
Na obr. 6 (A) je znázorněna nukleotidová sekvence oligonukleotidů použitých při konstrukci pMT7-HRV spolu s aminokyselinovou sekvencí kódovanou vrchním (pozitivním) řetězcem, která odpovídá aminokyselinovým zbytkům 85 až 99 zVPI HRV-14; a (B) sekvence VP23 po inserci HRV-specifických oligonukleotidů. Oblast označená šipkami ukazuje rozsah vloženého epitopu HRV. Také je zde označeno diagnostické místo Clal, které je přítomno ve vložené sekvenci.
-4CZ 290484 B6
Na obr. 7 je znázorněn účinek inserce FMDV-specifických oligonukleotidů (symboly vytištěné tučně) kódujících aminokyselinové zbytky 141 až 160 zVPl FMDV sérotypu Oi na sekvenci VP23 v pMT7-FMDV-II.
Na obr. 8 jsou znázorněny sekvence oligonukleotidů použitých pro konstrukci pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II a pMT7-HIV-III. Všechny použité oligonukleotidy jsou terminovány sekvencemi vyčištěnými tučně v horní části diagramu. Variabilní oblasti použité pro konstrukci pMT7-FMDV-V (FMDV-V), pMT7-HRV-II (HRV-II) a pMT7-HIV-III (HIV-ΠΙ) jsou znázorněny dále. Aminokyselinové sekvence kódované +-sense oligonukleotidy jsou označeny ío nad nukleotidovou sekvencí a mají tento význam: FMDV-V, aminokyseliny 141 až 160 zVPl FMDV sérotypu Ομ HRV-Π, aminokyseliny 85 až 98 zVPl HRV-14; HIV-ΠΙ, aminokyseliny 731 až 752 z gp41 HIV-I.
Na obr. 9 je dokumentována neutralizace HIV-I IIIB séry individuálních C57/BL6 myší, kterým byly podány dvě subkutánní injekce CPMV-HIV-I chiméry exprimující na povrchu aminokyseliny 731 až 752 gp41 (prázdné sloupce). Myším byla odebírána krev po dobu 14 dnů. Také jsou zde uvedeny střední hodnoty neutralizačního titru sérem paralelní skupiny myší inokulovaných divokým typem CPMV (plné sloupce). Všechny imunogeny byly formulovány za použití aluminy, jako pomocné látky.
Modifikace CPMV
Způsoby manipulace virového genomu za účelem zavedení vložených nukleotidových sekvencí do plášťového proteinu CPMV jsou popsány v WO 92/18618. cDNA klon o plné délce z CPMV 25 M RNA v transkripčním vektoru pPMI je dostupný (pPMM2902), stejně tak, jako cDNA klon o plné délce z CPMV B RNA (pBT7-123). Směs transkriptů z pPMM2902 a pBT7-123 vyvolává úplnou virovou infekci po elektroporaci do protoplastů vigny.
Pro inserci cizího peptidu byla zvolena smyčka βΒ-PC vVP23. Tato smyčka je jasně exponována na povrchu virové částice a počítačové modelování ukázalo, že ani velké smyčky vložené do tohoto místa nemají sklon k interferenci s interakcí mezi sousedními podjednotkami, které jsou zodpovědné za strukturu a stálost kapsidu. Tato smyčka obsahuje jedinečné místo Nhel v poloze 2708 M RNA specifické sekvence kde mohou být cizí sekvence vloženy (viz obr. 1).
Pro ilustraci použití modifikovaných rostlinných virů při výrobě očkovacích látek proti živočišným virům bylo použito hlavních antigenových míst picomaviru kulhavky a slintavky (FMDV), humánního rhinoviru (HRV) a lentiretroviru humánní imunitní deficience (HIV).
Návrh sestavení a konstrukce pFMDV, cDNA klonu o plné délce z CPMV M RNA s obsahem vložené DNA kódující segment smyčkového proteinu FMDV je popsán ve WO 92/18618. Oligonukleotidová sekvence kódující aminokyselinové zbytky 136 až 160 zVPl FMDV sérotypu Oi, kmene BFS 1860 se vloží do jedinečného místa Nhel pPMM2902, jako přídavek k existující nukleové kyselině. Použitý postup má za následek vytvoření přímé repetice sekvence lemující tuto vloženou nukleotidovou sekvenci (viz obr. 28). Vlastnosti transkriptů pFMDV jsou popsány v WO 92/18618. Infekce protoplastů vigny směsí pFMDV apBT7-123 transkriptů vede k multiplikaci a sestavení modifikovaných virových částic.
Pro výrobu modifikovaných rostlinných virů ve velkém měřítku je však zapotřebí zhotovit konstrukt, kterým lze přímo inokulovat celé rostliny a který se bude replikovat s následným sestavením virových částic jako v protoplastovém systému. Proto byl pPMM2902 modifikován tak, aby byla syntéza RNA poháněna účinnějším promotorem a modifikovaný plazmid byl
-5CZ 290484 B6 transkribován za podmínek, při nichž vznikají transkripty s čepičkou na 5' konci. Stupně modifikace pPMM2902 za účelem produkce pMT7-601 jsou podrobně popsány v WO 92/18618. Zjistilo se, že směs transkriptů pMT7-601 apBT7-123 upravených čepičkami je infekční vůči intaktním rostlinám vigny.
Návrh sestavení a konstrukce pMT7-FMDV-I z výchozího pMT7-601 a pFMDV je popsán ve WO 92/18618. Oligonukleotidová sekvence kódující aminokyselinové zbytky 136 až 160 zVPl FMDV sérotypu Oj, se vloží do jedinečného místa Nhel pMT7-601, jako přídavek k existující nukleové kyselině. Použitý postup má za následek vytvoření přímé repetice sekvence lemující tuto vloženou nukleotidovou sekvenci (viz obr. 3). Vlastnosti transkriptů pMT7-FMDVI jsou podrobně popsány v Usha et al., Virology (1993), 197, 366 až 374. Na inokulovaných listech rostlin inokulovaných směsí transkriptů pMT7-FMDV-I apBT7-123 se vyvinou léze, které jsou menší než léze pozorované na listech rostlin inokulovaných transkripty divokého typu. Imunosorpční elektronová mikroskopie na homogenátech listů z inokulovaných listů rostlin infikovaných pMT7-FMDV-I potvrdilo přítomnost virových částic podobných CPMV. Nebyl však podán žádný důkaz, že by docházelo k systemickému šíření chimérických virových částic na neinokulované listy.
Od té doby jsme byli schopni charakterizovat potomstvo pMT7-FMDV-I infekce analýzou RNA extrahované z listů inokulovaných pMT7-FMDV-I za použití řetězové reakce s reverzní transkriptázou a polymerázou (RT-PCR). Tato analýza ukázala přítomnost dvou produktů, z nichž hlavní odpovídá očekávanému produktu o délce asi 580 bp a menší má délku 500 bp. Posledně uvedený produkt migruje spolu s produktem syntetizovaným z RNA extrahované z rostliny infikované CPMV divokého typu. Když byly produkty PCR klonovány do bakteriofágu Ml3 a byla určována sekvence okolo místa vložení, bylo možno nalézt dva typy klonů: klony, které si zachovaly celou FMDV-specifickou sekvenci (většina) a klony, které obsahovaly sekvenci odpovídající přesně divokému typu CMPV (menšina). Tyto výsledky ukazují, že v listech inokulovaných transkriptem dochází zřejmě jednostupňovým postupem k reverzi na sekvenci divokého typu.
Když byla RNA extrahovaná z listu inokulovaného transkriptem pMT7-FMDV-I přenesena na neinfikované vigny, vyvinuly se na inokulovaných listech těchto rostlin symptomy tvořené směsí drobných lézí charakteristickou pro infekci pMT7-FMDV-I a větších lézí charakteristických pro CPMV divokého typu. Horní listy kromě toho jevily rozvoj symptomů mozaiky, které jsou charakteristické pro infekci CPMV divokého typu. Analýza RNA extrahované z inokulovaných listů těchto rostlin metodou RT-PCR opět poskytla dva produkty, ale v tomto případě hlavní produkt odpovídal produktu pocházejícímu zM RNA divokého typu. Analýza klonů pocházejících z dominantní směsi PCR produktů opět ukázala stejné dvě třídy sekvencí, jaké byly zjištěny dříve. V tomto případě však většina klonů představovala sekvenci divokého typu. Tyto výsledky ukazují, že pMT7-FMDV-I má nejen sklon ztrácet celou FMDV-specifickou sekvenci v jednostupňovém postupu, pravděpodobně v důsledku přítomnosti přímých repetic lemujících vloženou nukleotidovou sekvenci, nýbrž i dokumentují, že virové potomstvo divokého typu má významnou výhodu ve srovnání s chimérickým virem.
Aby se zabránilo vytvoření přímých repetic sekvence lemujících vloženou nukleotidovou sekvenci, vytvoří se v nukleotidové sekvenci oblasti CPMV genomu kódující VP23 druhé štěpící místo pro restrikční enzym. Jedinou tichou změnou báze (U na C) v poloze 2740 M RNA se vytvoří jedinečné místo AatlI na aminokyselině valinu 27 (poloha 2735 nukleotidové sekvence). To se provede místně orientovanou mutagenezí M13-JR-1 za použití metod popsaných v WO 92/18 618 (viz obr. 4). Vytvoření místa AatlI umožňuje odštěpit působením restrikčních enzymů Nhel a AatlI nukleotidovou sekvenci kódující 6 aminokyselin z nativní smyčky βΒ-pC v CPMV. Potom lze tuto sekvenci nahradit jakoukoliv sekvencí s Nhel a AatlI kompatibilními konci.
-6CZ 290484 B6
Konstrukce pMT7-FMDV-II, pMT7-HIV a pMT7-HRV
Pro nahrazení sekvence mezi místy Nhel a AatlI mutované sekvence M RNA se navrhnou tři různé sekvence. Ve všech třech případech nahrazují cizí sekvence sekvence divokého typu kódující šest aminokyselin. První sekvence substituovaná do VP23 se skládá z oligonukleotidů kódujících zbytky 735 až 752 transmembránového glykoproteinu gp41 viru humánní imunodeficience (H1V-1). Tato sekvence byla zvolena z toho důvodu, že syntetický peptid pro tuto oblast je rozpoznáván při stanovení na imunosorbentu spojeném s enzymem (ELISA) antiséry séropozitivních pacientů postižených AIDS aje schopna indukovat protilátky, které neutralizují paletu izolátů HIV-1. Druhá sekvence je tvořena nukleotidovou sekvencí kódující zbytky 85 až 99 zVPl humánního rhinoviru 14 (HRV14). V obou případech jsou oligonukleotidy navrženy tak, aby obsahovaly místa pro štěpení restrikčními enzymy umožňující screening. Sekvence oligonukleotidů a vliv substiticí na aminokyselinovou sekvenci VP23 jsou znázorněny na obr. 5 až 6. Metody použité pro konstrukci pMT7-HIV a pMT7-HRV jsou uvedeny v WO 92/18 618.
Třetí sekvence se skládá z nukleotidů kódujících zbytky 141 až 160 z VPI FMDV sérotypu O|. Účinek substituce na aminokyselinovou sekvenci VP23 je zřejmý z obr. 7. Metoda použitá pro konstrukci pMT7-FMDV-II je uvedena v publikaci Usha et al. z roku 1993, která byla citována výše.
Vlastnosti transkriptů pMT7-HIV jsou popsány ve WO 92/18 618 a vlastnosti pMT7-FMDV-II ve výše citované publikaci Usha et al. z roku 1993. Transkripty pMT7-HIV jsou schopny se po smíchání s transkripty pBT7-123 replikovat v protoplastech vigny výsledný modifikovaný plášťový protein se může uspořádat do podoby chimérických virových částic. Podobně se mohou transkripty pMT7-FMDV-II replikovat v protoplastech vigny, ale RNA potomků se akumuluje na podstatně nižší úrovni než v případě pMT7-FMDV-I nebo pMT7-601, které obsahují sekvenci VP23 divokého typu. Žádné virové částice nebylo možno detegovat v protoplastech infikovaných pMT7-FMDV-II. Schopnost transkriptů získaných z pMT7-FMDV-II multiplikovat se v celých rostlinách vigny byla také studována (Usha et al., výše uvedená publikace z roku 1993). Na inokulovaných rostlinách se nevyvinuly žádné symptomy a žádnou RNA potomstva nebylo možno detegovat ani v inokulovaných ani ve vrchních listech. Snížená infekčnost pMT7-FMDVII může být vysvětlena tím, že výsledné částice chimérického viru postrádají aminokyselinovou sekvenci přítomnou ve viru divokého typu a v chimérickém viru produkovaném při infekcích pMT7-FMDV-I, jež je důležitá pro replikaci viru a jeho šíření v rostlině.
Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II a pMT7-HIV-III
Malé léze fenotypu pMT7-FMDV-I a jeho konkurenční nevýhoda ve srovnání s CPMV divokého typu naznačují, že heterologická sekvence možná nebyla vložena v optimálním místě. Podrobný průzkum struktury 3-D CPMV ukazuje, že prolinový zbytek 23 (Pro23), který leží uprostřed smyčky βΒ-βΟ proteinu S je obzvláště exponován na povrchu viru a představuje potenciálně optimální místo pro jakékoliv inserce. Pro využití této skutečnosti a k tomu, aby se zabránilo zavedení repetic sekvencí, které by mohly usnadňovat reverzi, se syntetizuje dvojice
- 7 CZ 290484 B6 komplementárních oligonukleotidů, v nichž je sekvence kódující heterologické aminokyseliny lemována sekvencemi přítomnými v CPMV divokého typu tak, že je inserce provedena bezprostředně před Pro23. Tyto oligonukleotidy jsou terminovány Nhel a AatlI kompatibilními konci, což umožňuje jejich vložení mezi místa Nhel a AatlI buď pMT7-FMDV-II (Usha et al., 1993) nebo jeho derivátu pMT7-FMDV-II na místo původního FMDV-specifické vložené nukleotidové sekvence. Tato strategie nejen zajišťuje, že heterologické sekvence jsou vloženy v optimálním místě a že vložené nukleotidové sekvence nejsou lemovány přímými repeticemi, nýbrž i to, že se neztratí žádné CPMV-specifické sekvence. Posledně uvedená skutečnost se považuje za důležitou podmínku pro sestavování virových částic (Usha et al., 1993). Sekvence vložené tímto způsobem se skládají ze zbytků 141 až 160 VPI FMDV sérotypu O| (poněkud zkrácená verse epitopu v pMT7-FMDV-I), zbytků 85 až 98 z VPI HRV-14, které doplňují imunodominantní místo. Nlm-IA (Sherry et al., J. Virology (1986), 57, 246 až 257) a epitopu zahrnujícího zbytky 741 až 752 zgp41 zHIV-I, tj. tzv. Kennedyho epitopu [Kennedy et al., Science (1986) 231, 1556 až 1559]. Sekvence oligonukleotidů použitá při těchto konstrukcích je znázorněna na obr. 8. Výsledné konstrukty jsou označeny názvy pMT7-FMDV-V, pMT7-HRVII a pMT7-HIV-III.
Konstrukce a vlastnosti plazmidů pBT7-123, pMT7-FMDV-I a pMT7-FMDV-II byly nedávno popsány (Usha et al., 1993). Tyto konstrukty a jejich deriváty byly propagovány v Escherichia coli kmene JMB3. Oligonukleotidy byly syntetizovány v syntetizátoru Pharmacia Gene Assembler Plus. Sekvenční analýza byla prováděna dideoxymetodou za použití buď DNA polymerázy 1 z E. coli (Klenowův fragment), nebo Sequenase(R) verze 2,0.
Při konstrukci pMT7-FMDV-V se pMT7-FMDV-II úplně rozštěpí Nhel (tento restriční enzym štěpí v poloze 2708 sekvence M RNA) a částečně rozštěpí AatlI, který štěpí jednou v sekvenci MRNA (poloha 2735) a jednou v poloze pocházející zpUC plazmidů (poloha 2617 na mapě pUCI9). Dvojice komplementárních oligonukleotidů kódujících zbytky 141 až 159 z VPI FMDV sérotypu Oi lemovaná sekvencemi kódujícími zbytky 18 až 22 a 23 až 26 proteinu CPMV VP23 (viz obr. 8) se fosforyluje, teplotně hybridizuje a liguje do p-MT7-FMDV-II rozštěpeného Nhel/AatlI. Rekombinanty s požadovanou strukturou se identifikují mapováním restrikčním enzymem a analýzou sekvence.
Při konstrukci pMT7-HRV-H a pMT7-HIV-III se nejprve pMT7-FMDV-II částečně rozštěpí restrikčním enzymem AatlI a lineární molekuly o úplné délce se izolují po elektroforéze na agarosovém gelu. Na linearizovaný plazmid se působí DNA polymerázou I z E. coli (Klenowovým fragmentem), aby se odstranily 3' převisy zanechané AatlI, provede se recirkularizace a zpětná transformace do E. coli kmene JM83. Rekombinant, který je označen názvem pMT7-FMDV- AatlI, v němž bylo místo AatlI v části pUC plazmidů zničeno, ale v němž bylo zachováno místo AatlI v M RNA specifické části, se identifikuje analýzou restrikčním enzymem. Komplementární oligonukleotidy kódující zbytky 85 až 98 z VPI HRVI4 nebo zbytky 731 až 752 zgp41 HIV-I lemované příslušnými CPMV-specifickými sekvencemi se fosforylují, teplotně hybridizují a liguií do p-MT7-FMDV-AatII rozštěpeného Nhel/AatlI za vzniku pMT7HRV-II a pMT7-HIV-III.
Příklad 2
Schopnost pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II a pMT7-HIV-III replikace v celých rostlinách vigny
Když se RNA transkribuje z chimérických plazmidů ve směsi stranskripty zpBT7-123 a inokuluje rostlinám vigny, ve všech případech se na inokulovaných listech vyvinou chlorotické léze typické pro infekci CPMV divokého typu. Analýza hybridizací RNA ukazuje, že v těchto listech jsou přítomny M RNA specifické sekvence. Ve všech třech případech je možno infekci mechanicky přenést na další zdravé rostliny vigny. V případě pMT7-HRV-II a pMT7-HIV-III se
- 8 CZ 290484 B6 infekce rozšíří na vrchní listy většiny infikovaných rostlin za vzniku typické systemické mozaiky. Infekce indukovaná pMT7-FMDV-V zůstane však spojena výlučně s inokulovanými listy a nejsou pozorovány žádné systemické symptomy, ani není ve vrchních listech rostliny detegována žádná virově specifická RNA.
Když se z listů inokulovaných transkriptypMT7- FMDV-V extrahuje úplná RNA a analyzuje se metodou RT-PCRje pozorován pouze jediný pás, jehož velikost odpovídá produktu odvozenému z RNA a který si podržuje vloženou nukleotidovou sekvenci. Podobné výsledky se získají i po až 3 sériových pasážích. Pro potvrzení skutečnosti, že vložená nukleotidová sekvence zůstala io zachován, se produkty získané ze vzorků odebraných z rostlin po počáteční inokulaci a po provedení tří cyklů sériového pasážování klonují do bakteriofágu Ml3 a stanoví se nukleotidová sekvence reprezentativního počtu klonů. Všechny klony v obou případech obsahují sekvenci odpovídající virové RNA, v níž zůstává zachována intaktní vložená sekvence. Tyto výsledky ukazují, že s detegovatelnou četností nedochází k reverzi RNA z pMT7-FMDV-V. Analýza RNA 15 extrahované z purifikovaných částic pMT7-HRV-II a pMT7-HIV- III (viz dále) podporuje závěr, že tyto nové konstrukty jsou geneticky stabilní, vzhledem k tomu, že ani pod deseti sériích pasážování neexistuje žádný důkaz reverze.
Virové částice je možno připravit z listové tkáně infikované buď pMT7-HRV-II nebo pMT720 HIV-ΠΙ za použití standardního purifikačního protokolu pro CPMV (van Kammen and de Jager (1978). Cowpea mosaic virus; CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses, 197). Výtěžek činí 1,2 až 1,5 mg viru na gram čerstvé tkáně, což je podobná hodnota, jaká se získá s CPMV divokého typu. S tím kontrastuje zjištění, že za použití standardních postupů, ani řady jejich variant, nelze získat žádné částice z pMT7-FMDV-V. Tento neúspěch není zaviněn nepřítomností částic 25 v infikované tkáni, poněvadž při elektronové mikroskopii za použití imunosorbentu (ISEM) homogenované tkáně s použitím mřížek potažených anti-CPMV sérem je možno pozorovat velký počet takových částic.
Příklad 3
Imunologické vlastnosti částic chimérického viru získaných z pMT7-HRV-II a pMT7-HIV-III
Pro potvrzení, že purifikované částice pMT7-HRV-II vykazují antigenické vlastnosti vložené 35 sekvence, se vzorky purifikovaných virionů podrobí analýze Western blot za použití polyklonálního antiséra vypěstovaného proti HRV-14. Je možno detegovat produkt, který svou velikostí odpovídá modifikovanému proteinu VP23, což potvrzuje antigenicitu vložené sekvence. Není možno pozorovat žádnou reakci s antisérem, pokud se stejným způsobem analyzují vzorky CPMV divokého typu.
Když se vzorek denaturovaného viru zkouší elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu, jsou pozorovány pouze tři pásy. Největší polypeptid (L) odpovídá velkému virovému plášťovému proteinu (VP37) a migruje spolu s polypeptidem L z CPMV divokého typu. Střední pás (Ss) odpovídá malému virovému plášťovému proteinu (VP23), v němž sídlí HIV-1 specifický 45 epitop. Nejiychleji migrující pás (S1) představuje C-terminální sekvenci 192 aminokyselinových zbytků proteinu VP23. Analýza terminální sekvence ukazuje, že je odvozena z proteinu VP23 proteolytickým rozštěpením mezi dvěma C-terminálními aminokyselinovými zbytky vložené nukleotidové sekvence. Vložená nukleotidová sekvence je tedy umístěna v pásu Ss, ale nikoliv v pásu S' a jak lze předvídat, reaguje s gp41-specifickou protilátkou při zkoušce Western blot. 50 Předvídaný N-terminální produkt štěpení se skládá pouze z 43 zbytků a není ho možno oddělit na použitém gelovém systému. S virionem zůstávají spojeny oba elementy S. Jelikož určité množství proteinu S' je vždy přítomno v preparátech CPMV-HIV, bez ohledu na to, jak rychle byl virus purifikován. Je možné, že k tomuto štěpení dochází in planta.
-9CZ 290484 B6
Strategie navržená pro překonání omezení pMT7-FMDV-I se ukázala být úspěšnou, poněvadž všechny tři nové chiméry (pMT7-FMDV-V, pMT7-HRV-II a pMT7-HIV-III) poskytují na inokulovaných listech symptomy divokého typu a nejeví žádné známky reverze. Kromě toho, dvě chiméry rostou stejně dobře jako CPMV divokého typu a lze je snadno purifikovat. Skutečnost, že pMT7-FMDV-V poskytuje na inokulovaných listech léze divokého typu, ale nešíří se systemicky, ukazuje, že tyto částice chimérického viru jsou plně kompetentní pro pohyb z buňky do buňky, ale nejsou schopny transportu na dlouhou vzdálenost. Tento jev může být spojen s pozorováním, že se částice pMT7-FMDV-V zřejmě agregují do intracelulámích krystalických struktur, což činí purifikaci problematickou. Tyto znaky nejsou důsledkem délky heterologické sekvence, poněvadž pMT7-FMDV-V obsahuje vloženou nukleotidovou sekvenci střední délky (19 zbytků) mezi segmentem obsaženým v pMT7-HRV-II (14 zbytků) a segmentem obsaženým v pMT7-HIV-III (22 zbytků).
Příklad 4
Použití částic chimérického viru pMT7-HRV-Il pro vypěstování protilátek vůči HRV
Částice pMT7-HRV-II a CPMV divokého typu se purifikují způsobem popsaným v příkladu 2, injekčně podají králíkům a shromážděného antiséra se použije pro zkoušení Western blot denaturovaných virových částic HRV-14. Za použití tohoto antiséra vypěstovaného proti částicím pMT7-HRV-II je možno detegovat jediný pás odpovídající VP1 zHRV-14 i v tom případě, že se sérum zředí v poměru 1:16 000. Není pozorována žádná reakce s jinými plášťovými proteiny HRV-14 (VP2 a VP3). Také není pozorována žádná reakce sjakýmkoliv proteinem HRV-14, když se séra vypěstovaného proti CPMV divokého typu použije pro zkoušení těchto blotů. Schopnost virionů pMT7-HRV-Il vypěstovat protilátky, které rozeznávají VP1 z HRV-14, ukazuje, že epitopy přítomné na povrchu částic CPMV, jsou imunogenní.
Příklad 5
Použití částic chimérického viru pMT7-HIV-III pro vypěstování neutralizačních protilátek vůči HIV
Transkripty získané z pMT7-HIV-lII se smíchají stranskripty získanými z plazmidu pBT7-123 a inokulují na tři listy deset dní staré rostliny vigny. Pro získání vysokého výtěžku rekombinantních virových částic se vzorky tkáně listů vykazujících symptomy charakteristické pro infekci CPMV homogenizují v lOOmM pufru na bázi fosforečnanu sodného o pH 7,0, homogenát se krátce odstředí a supematantu se použije pro inokulaci zdravých rostlin vigny. Rostliny se sklidí 2 až 3 týdny po inokulaci a částice chimérického viru se purifikují způsobem popsaným v příkladu 2. Purifikovaný chimérický virus označený názvem CPMV-HIV-I se skladuje při 4 °C v lOmM pufru na bázi fosforečnanu sodného o pH 7,0 za přítomnosti 0,5 g/litr azidu sodného. Kvalita přípravku se monitoruje elektronovou mikroskopií a elektroforézou částí denaturovaného viru na 15 % gelech polyakrylamid/SDS/redukční složka. Proteiny se vizualizují obarvením gelu modrým barvivém coomassie briliant blue R250. Před injekčním podáním myším se virový přípravek dialyzuje proti fosfátem pufrovanému fyziologickému roztoku chloridu sodného a zkouškou Bio-Rad(R) se stanoví koncentrace proteinu.
Dospělé myši C57/BL6 se očkují ve stáří 8 týdnů. Virus (CPMV-HIV-I nebo CPMV) se smíchá s hydroxidem hlinitým, jako adjuvantem, v poměru 1:5. Vzniklá směs se míchá po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Myši (vždy 6 ve skupině) se očkují subkutánně na zadní straně krku v pěti místech za použití celkem 100 μΙ směsi viru aadjuvans s obsahem 100 μg viru. V požadovaných intervalech se zvířatům odebírá z ocasu krev a získané sérum se skladuje při
- 10 CZ 290484 B6
-20 °C. Před zkoušením se všechna séra 30 minut zahřívají na 56 °C, aby se neutralizovala protilátka.
Myším se podají 2 injekce CPMV-HIV-I nebo CPMV divokého typu v den 0 a 35 a po 14 dnech se jim odebere z ocasu krev. Individuální neutralizační titry vůči HIV-1 I1IB se potom stanoví takto: Zředěný vzorek tepelně ošetřeného séra se inkubuje s asi 2000 syncytium-tvomými jednotkami (sfu) na 1 ml viru 1 hodinu při 37 °C. V 96-jamkové misce pro tkáňové kultury, která byla předběžně ošetřena poly-L-lysinem, se vyrobí semikonfluentní monovrstva buněk C8166 (5 x 104 buněk/jamka). Médium se odstraní a k buňkám se přidá 50 μΐ inokula. Misky se jednu hodinu inkubují při 37 °C a potom se přidá čerstvé médium. V inkubaci se pokračuje 3 dny při 37 °C, potom se pod mikroskopem spočítají syncytia a pro každou jamku se vypočítá hodnota inhibice vyjádřená v procentech.
Jak ukazuje obr. 9, myši očkované CPMV-HIV-I vyprodukují neutralizační protilátku s 50 % neutralizačním titrem asi 1/1000 u 83% myší. Antisérum zředěné v poměru 1:100 poskytuje střední neutralizační titr 97 % při odpovědi 100 % myší. Odpověď je vysoce rovnoměrná. Obr. 9 také ukazuje, že i kontrolní skupina, které byl paralelně injekčně podán CPMV divokého typu, vykazuje neutralizační odpověď na HIV-1. Neutralizační titr je v tomto případě přibližně lOx nižší než za použití CPMV-HIV-I (50% neutralizační titr je asi 1/100). Evidentně se jedná o odpověď spočívající ve vytvoření nových protilátek, poněvadž za použití séra z neočkovaných sourozenců, nedochází k žádné významné neutralizaci ani při zředění 1:10.
Stabilita odpovědi spočívající ve vytvoření neutralizačních protilátek na chiméru CPMV-HIV, se zkoumá tak, že se po 48 hodinách od druhé injekce myším znovu odebere krev. Získaná antiséra nevykazují významný neutralizační titr při zředění 1:10, což ukazuje, že hladina neutralizačních protilátek poklesla více než lOOx. Ani neutralizační aktivita stimulovaná CPMV divokého typu není detegovatelná.
Stejným myším se 3 měsíce po druhé injekci podá třetí injekce stejného CPMV-HIV-I a po 14 dnech se jim odebere krev. Střední neutralizační titr je 54 % při zředění 1:100, přičemž nyní vykazují odpověď všechny myši. Při tomto zředění nedochází k žádné neutralizaci v případě séra myší přeočkovaných CPMV divokého typu. Dosáhne se tedy malého celkového zvýšení neutralizační aktivity. Stabilita odpovědi spočívající ve vytvoření neutralizačních protilátek vůči CPMV-HIV-I se zkouší pomocí antiséra získaného po 56 dnech. Titr poklesne, ale antisérum ze všech myší stále vykazuje významnou neutralizaci při zředění 1:10, jejíž střední hodnota je 58 %. Neutralizace antisérem z kontrolních myší inokulovaných CPMV divokého typu ztěží dosáhne prahové signifikantní hodnoty.
Neutralizace homologického HIV-1 kmene IIIB antisérem získaným po třetí injekci se porovnává s neutralizací HIV-1 kmenů RF a SF2. Při zředění, při němž je kmen IIIB neutralizován z 92 %, dochází k neutralizaci kmene RF z 78 % a kmene SF2 ze 66 %. Také antiséra vyrobená proti CPMV divokého typu neutralizují všechny tři kmeny, ale ve srovnání s kmenem IIIB tato antiséra neutralizují kmeny RF a SF2 méně než antisérum vypěstované proti CPMV-HIV-I.
Potvrdilo se, že neutralizační protilátky v antiséru produkovaném proti CPMV divokého typu jsou všechny specifické proti epitopům CPMV, přičemž žádný z nich nebyl vyroben proti peptidu gp41 z HIV-1, adsorpcí antiséra a purifikovaného CPMV divokého typu. Tři následné adsorpce za použití CPMV podstatně nesnížily neutralizační titr anti-CPMV-HIV-I séra vůči HIV-1, ale pětkrát snížily neutralizační titr anti-CPMV séra. Z toho lze učinit závěr, že většina neutralizačních protilátek produkovaných proti chiméře CPMV-HIV byla produkována proti HlV-specifickým epitopům, ale že CPMV stimuluje protilátky, které křížově reagují s neutralizačními epitopy HIV-1.
- 11 CZ 290484 B6
Příklad 6
Konstrukce cDNA klonů CPMV RNA M a B, kterých lze použít pro přímou inokulaci rostlin cDNA klony CPMV RNA M a B se zkonstruují v pUC18 tak, aby byly 5' konce virových RNA přímo připojeny k počátku transkripce promotoru CaMV 35S. Kromě toho se může klon RNA B (pCPl) linearizovat přesně u konce 3' virové sekvence štěpením restrikčním enzymem v jedinečném místě Mlul a podobně se může klon RNA M (pCP2) zpracovat pomocí EcoRI. Po štěpení těmito enzymy je tedy možno vytvořit transkripty, které neobsahují žádné virové sekvence ani u konce 5' ani u konce 3'.
Tyto klony se zkonstruují způsobem popsaným v Dessens et al., Joumal of Generál Virology (1993) 74, 889 až 892. Promotor CaMV 35S se klonuje mezi místo HindlII a Pstl v pUC18 a při tomto postupu se ztratí místo HindlII. Tato promotorová sekvence je lemována restrikčními místy SstlI a Stul, přičemž restrikční místo Stul umožňuje štěpení s tupým koncem, při němž je exponován počátek transkripce. Vytvoří se dvě cDNA pro RNA M a RNA B a jejich 5' poloviny se nezávisle klonují štěpením pomocí Sstl (RNA M) nebo BamHI (RNA B) a ligují do Stul/Sstl nebo StuI/BamHI- štěpeného vektoru CaMV 35S. 3' poloviny těchto RNA se klonují do těchto konstruktů za použití dříve zkonstruovaných klonů cDNA (pMT7-60l apBT7-123), které byly zkonstruovány tak, aby jejich 3' konce bylo možno přesně exponovat štěpením restrikčním enzymem. RNA M se klonuje na Pstl/EcoRI fragment a RNA B na BglII/EcoRI fragment.
Promotor CaMV 35S používá RNA polymeráz dependentních na DNA hostitelské rostliny a je vysoce aktivní. Infekci je proto možno vyvolat u hostitelské rostliny jednoduše tak, že se povrch primárních listů odírá za přítomnosti směsi linearizovaného pCPl apCP2. Polymeráza hostitele řídí trankripci virové RNA z promotoru CaMV 35S in vivo a v buňkách, v nichž je trankribován jak pCPl, tak pCP2, se vyvine infekce podobající se infekci CPMV divokého typu. Není tedy již zapotřebí stupeň transkripce RNA in vitro. To představuje významnou výhodu ve srovnání s dřívějším způsobem inokulace rostlin, a to jak pokud se týče jednoduchosti provedení, tak pokud se týče nákladů.
Aby bylo možno produkovat sestavené částice CPMV obsahující cizí peptid vložený bezprostředně před zbytek Pro23 ve smyčce βΒ-pC malého kapsidového proteinu, v nichž je odpovídající cizí nukleová kyselina vložena do genomu CPMV za nepřítomnosti přímých repetic sekvence lemujících vloženou nukleotidovou sekvenci, jakožto přídavek k existující nukleové kyselině, mutuje se klon cDNA pCP2 způsobem popsaným výše pro pMT7 za vzniku jedinečného místa AatlI v poloze 2735 sekvence RNA M. Získaný produkt se označí názvem pCP2-AatII.
Oligonukleotidovými sekvencemi kódujícími různé cizí peptidy (viz tabulka 1) se způsobem popsaným v příkladu 1 nahradí sekvence mezi místem Nhel aAatlI v pCP2-AatII. Varianty pCP2-AatII a pCP-1 se linearizují a inokulují na primární listy rostlin vigny. Ve všech případech se vyvinou infekce a z rostlin se získají stabilní částice chimérického viru exprimující příslušný cizí peptid.
- 12 CZ 290484 B6
Tabulka 1
Cizí peptidové sekvence exprimované jako částice chimérického viru produkované přímou inokulací rostlin klony cDNA
| Konstrukt | Délka (aminokyseliny) | Zdroj peptidu |
| HIV-1 | 22 | aminokyseliny 731-752 z gp41 z HIV-I kmene IIIB |
| HIV-3 | 6 | aminokyseliny 312-317 z gpl20 z HIV-I kmene IIIB (smyčka V3) |
| HIV-4 | 11 | aminokyseliny 140-150 z gpl 20 z HIV-I kmene IIIB (smyčka VI) |
| HIV-5 | 11 | aminokyseliny 117-127 zgpl20 z HIV-I kmene IIIB |
| FMDV-5 | 19 | aminokyseliny 141-159 z VP1 z FMDV kmene 0i (smyčka G-H) |
| FMDV-12 | 21 | sekvence peptidů z VP1 z FMDV kmene CS8 (smyčka G-H) |
| FMDV-13 | 23 | sekvence peptidů z VP1 z FMDV kmene A10 (smyčka G-H) |
| FMDV-14 | 10 | aminokyseliny 40-49 z VP1 z FMDV kmene 0] (smyčka B-C) |
| PARVO-1 | 17 | aminokyseliny 13-29 z VP2 psího parvoviru |
| PARVO-2 | 17 | opačně vložená sekvence PARVO-1 |
| PARVO-3 | 17 | varianta PARVO-1 s lemujícími sekvencemi |
| GNRH-1 | 10 | imunodominantní epitop z hormonu uvolňujícího gonadotrophin u vepře |
| MAST-1 | 30 | z proteinu vázajícího fibronektin ve Staphylococcus aureus |
| MAST-2 | 38 | delší verse MAST-1 |
| HRV-2 | 14 | aminokyseliny 85-98 z VP1 z HRV |
kmene 14
Claims (40)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Sestavené částice rostlinného viru obsahující cizí peptid vložený do plášťového proteinu viru, přičemž tento cizí peptid je kódován cizí sekvencí nukleové kyseliny vloženou do genomu rostlinného viru, přičemž tato vložená sekvence nukleové kyseliny neobsahuje žádné přímé repetice sekvence lemující tuto vloženou sekvenci nukleové kyseliny.
- 2. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 1, v nichž insert představuje přídavek k plášťovému proteinu.- 13 CZ 290484 B6
- 3. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 1 nebo 2, v nichž je cizím peptidem biologicky funkční peptid, jehož biologická aplikace je podmíněna nebo zvýšena presentací peptidu ve spojení s větší molekulou nebo částicí.
- 4. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 1 až 3, v nichž peptidem je antigen.
- 5. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 4, v nichž antigenem je virový antigen.
- 6. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 5. v nichž antigenem je virový antigen živočicha, včetně člověka.
- 7. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 6, v nichž je cizí peptid zaveden do exponovaného povrchu plášťového proteinu rostlinného viru.
- 8. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 7, v nichž je rostlinným virem RNA virus.
- 9. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 8, v nichž virový plášťový protein vykazuje strukturu β-barrelu.
- 10. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 9, v nichž je cizí peptid vložen do smyčky spojující listy β rostlinného viru.
- 11. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 10, v nichž je cizí peptid vložen vedle zbytku prolinu nebo hydroxyprolinu ve smyčce spojující listy β rostlinného viru.
- 12. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 11, v nichž je rostlinným virem comovirus.
- 13. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 12, v nichž je comovirem virus mozaiky vigny, CPMV.
- 14. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 9, 10, 11, 12 nebo 13, v nichž je cizí peptid vložen do smyčky βΒ-βϋ rostlinného viru.
- 15. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 14, v nichž je cizím peptidem antigen živočišného viru získaný z viru kulhavky a slintavky, FMDV.
- 16. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 14, v nichž je cizím peptidem antigen živočišného viru získaný z viru humánní imunodeficience, HIV.
- 17. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 14, v nichž je cizím peptidem antigen živočišného viru získaný z humánního rhinoviru. HRV.
- 18. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 14, v nichž je cizím peptidem antigen živočišného viru získaný z psího parvoviru.
- 19. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 14, v nichž je cizím peptidem antigen živočišného patogenu získaný ze Staphylococcus aureus.
- 20. Sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 14, v nichž je cizím peptidem antigen získaný z peptidového hormonu.- 14 CZ 290484 B6
- 21. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 20, v nichž je cizím peptidem antigen získaný z hormonu uvolňujícího gonadotrophin.
- 22. Virová očkovací látka pro ochranu proti humánním a živočišným patogenům, vyznačující se t í m , že jako imunogenní složku obsahuje sestavené částice rostlinného viru podle některého z nároků 4 až 21.
- 23. Virová očkovací látka pro zvířata, vy z n a č uj í c í se t í m , že jako imunogenní složku obsahuje virové částice podle nároku 6.
- 24. Způsob výroby částic rostlinného viru podle některého z nároků 1 až 21,vyznačující se tím, že se zavede nukleotidová sekvence kódující cizí peptid za účelem modifikace nukleové kyseliny kódující plášťový protein rostlinného viru takovým způsobem, aby se zabránilo vzniku přímých repetic sekvence lemujících zavedenou sekvenci, vzniklou modifikovanou virovou nukleovou kyselinou se infikují rostliny, rostlinná tkáň, rostlinné buňky nebo protoplasty a sklidí se sestavené částice modifikovaného viru.
- 25. Způsob podle nároku 24, vy z n ač u j í c í se t í m , že se zaváděná nukleotidová sekvence vloží do části nukleové kyseliny rostlinného viru, která kóduje exponovanou část plášťového proteinu.
- 26. Způsob podle nároku 24 pro aplikaci na RNA rostlinný virus, vy z n a č uj í c í se tím, že se zavede sekvence DNA kódující cizí peptid do cDNA odpovídající RNA rostlinného viru kódující exponovanou část plášťového proteinu, z takto modifikované cDNA se vytvoří transkript RNA, tímto transkriptem se inokulují rostliny, rostlinná tkáň, rostlinné buňky nebo protoplasty, je-li to zapotřebí spolu sjakoukoliv jinou RNA potřebnou pro multiplikaci a sestavení úplných virových částic v rostlinném materiálu a sklidí se sestavené částice modifikovaného viru.
- 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že se použije modifikovaná cDNA vyrobená zavedením DNA kódující cizí peptid do fragmentu DNA vyštěpeného z cDNA rostlinného viru a rekombinuje se modifikovaný fragment za účelem rekonstituce cDNA rostlinného viru v modifikované formě.
- 28. Způsob podle některého z nároků 24 až 27, v y z n a č u j í c í se t í m , že se cizí nukleotidová sekvence vkládá tak, že se v nukleové kyselině rostlinného viru zvolí dvě různá místa pro restrikční enzymy; nukleová kyselina rostlinného viru se odpovídajícími restrikčními enzymy rozštěpí a do rozštěpené nukleové kyseliny viru se vloží dvojice komplementárních oligonukleotidů kódujících cizí peptid s konci, které jsou kompatibilní s místy rozštěpení restrikčními enzymy.
- 29. Způsob podle nároku 28, vyznačující se tím, že v komplementárních oligonukleotidech je sekvence kódující cizí peptid lemována sekvencemi specifickými pro rostlinný virus, takže je cizí nukleotidová sekvence vložena jako přídavek k nukleové kyselině rostlinného viru.
- 30. Způsob podle nároku 26 nebo 27, vyznačující se tím, že se vyrobený modifikovaný virus nebo RNA z tohoto viru extrahovaná pasážuje v rostlinách za účelem produkce dalších množství modifikovaného viru.- 15 CZ 290484 B6
- 31. Způsob podle některého z nároků 24 až 29, v y z n a č u j í c í se tím, že cDNA obsahuje promotorovou sekvenci 35S z viru mozaiky květáku, která je připojena k 5' konci konstruktu.
- 32. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 1, kde plášťovým proteinem je plášťový protein CPMV.
- 33. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 32, kde plášťový protein CPMV je kódován fragmentem cDNA plášťového proteinu CPMV obsahujícím sekvenci DNA kódující cizí peptid v místě odpovídajícím exponovanému povrchu tohoto plášťového proteinu, přičemž toto místo nezahrnuje přímé repetice sekvence lemující vloženou DNA.
- 34. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 33, kde fragmentem cDNA plášťového proteinu CPMV je fragment Sstl.
- 35. Fragment sekvence cDNA plášťového proteinu CPMV kódující cizí peptid v místě odpovídajícím exponovanému povrchu plášťového proteinu, přičemž toto místo nezahrnuje přímé repetice sekvence lemující vloženou DNA.
- 36. Fragment podle nároku 35, kterým je fragment Sstl.
- 37. Vektor obsahující fragment podle nároku 35 nebo 36.
- 38. Sestavené částice rostlinného viru podle nároku 1, kde plášťovým proteinem je plášťový protein CPMV.
- 39. RNA transkript fragmentu nebo vektoru podle některého z nároků 35 až 37.
- 40. RNA transkript podle nároku 39, jehož 5' konec je upraven čepičkou.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB9414118A GB9414118D0 (en) | 1994-07-13 | 1994-07-13 | Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ72396A3 CZ72396A3 (en) | 1996-06-12 |
| CZ290484B6 true CZ290484B6 (cs) | 2002-08-14 |
Family
ID=10758254
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1996723A CZ290484B6 (cs) | 1994-07-13 | 1995-07-10 | Sestavené částice rostlinného viru a způsob jejich výroby, očkovací látky, fragment cDNA, vektor a jejich RNA transkript |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5958422A (cs) |
| EP (1) | EP0719336B1 (cs) |
| JP (1) | JP3681753B2 (cs) |
| KR (1) | KR100379803B1 (cs) |
| CN (1) | CN1211488C (cs) |
| AT (1) | ATE346934T1 (cs) |
| AU (1) | AU697867B2 (cs) |
| BR (1) | BR9506047A (cs) |
| CA (1) | CA2170412C (cs) |
| CZ (1) | CZ290484B6 (cs) |
| DE (1) | DE69535314T2 (cs) |
| GB (1) | GB9414118D0 (cs) |
| HU (1) | HU223078B1 (cs) |
| NZ (1) | NZ289170A (cs) |
| SK (1) | SK34296A3 (cs) |
| WO (1) | WO1996002649A1 (cs) |
Families Citing this family (44)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6660500B2 (en) | 1988-02-26 | 2003-12-09 | Large Scale Biology Corporation | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
| US7033835B1 (en) | 1988-02-26 | 2006-04-25 | Large Scale Biology Corporation | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
| US5977438A (en) * | 1988-02-26 | 1999-11-02 | Biosource Technologies, Inc. | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
| US6846968B1 (en) | 1988-02-26 | 2005-01-25 | Large Scale Biology Corporation | Production of lysosomal enzymes in plants by transient expression |
| GB9108386D0 (en) * | 1991-04-19 | 1991-06-05 | Agricultural Genetics Co | Modified plant viruses as vectors |
| US6034298A (en) * | 1991-08-26 | 2000-03-07 | Prodigene, Inc. | Vaccines expressed in plants |
| US5484719A (en) | 1991-08-26 | 1996-01-16 | Edible Vaccines, Inc. | Vaccines produced and administered through edible plants |
| US5612487A (en) * | 1991-08-26 | 1997-03-18 | Edible Vaccines, Inc. | Anti-viral vaccines expressed in plants |
| WO1997010347A1 (en) * | 1995-09-15 | 1997-03-20 | Howard John A | Expression cassettes and methods for delivery of animal vaccines |
| GB9712282D0 (en) * | 1997-06-12 | 1997-08-13 | Innes John Centre Innov Ltd | Epitope presentation system |
| US6759243B2 (en) | 1998-01-20 | 2004-07-06 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | High affinity TCR proteins and methods |
| GB9921337D0 (en) * | 1999-09-09 | 1999-11-10 | Axis Genetics Plc | Modified plant viruses |
| GB9924351D0 (en) * | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
| US7135282B1 (en) | 1999-10-14 | 2006-11-14 | The Dow Chemical Company | Viral particles with exogenous internal epitopes |
| AU2001269936A1 (en) * | 2000-06-20 | 2002-01-02 | Phycotransgenics, Llc | Transgenic algae for delivering antigens to an animal |
| US6932980B1 (en) * | 2001-01-18 | 2005-08-23 | Richard Sayre | Method of making microalgal-based animal foodstuff supplements, microalgal-supplemented animal foodstuffs and method of animal nutrition |
| WO2002059334A1 (en) * | 2001-01-24 | 2002-08-01 | Virogene Ltd. | Vectors capable of imparting herbicide resistance and viral cross protection and methods |
| JP4953570B2 (ja) * | 2002-07-05 | 2012-06-13 | フォリア バイオテック インコーポレイテッド | アジュバントウィルス粒子 |
| US8101189B2 (en) * | 2002-07-05 | 2012-01-24 | Folia Biotech Inc. | Vaccines and immunopotentiating compositions and methods for making and using them |
| WO2005086667A2 (en) * | 2004-02-27 | 2005-09-22 | The Dow Chemical Company | High efficiency peptide production in plant cells |
| US8715923B2 (en) * | 2004-07-30 | 2014-05-06 | The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Navy | Protein scaffolds and viral particles for detecting analytes |
| WO2006093967A2 (en) * | 2005-02-28 | 2006-09-08 | The Scripps Research Institute | Compositions and methods for targeting or imaging a tissue in a vertebrate subject |
| WO2007053188A2 (en) * | 2005-06-01 | 2007-05-10 | Dow Global Technologies, Inc. | Production of multivalent virus like particles |
| EP1909829A4 (en) * | 2005-07-19 | 2009-11-11 | Dow Global Technologies Inc | RECOMBINANT GRIP VACCINES |
| DK2069503T3 (da) * | 2006-11-15 | 2016-02-15 | Folia Biotech Inc | Papayamosaikvirus-baserede vacciner mod influenza |
| DE602007003944D1 (de) * | 2007-01-03 | 2010-02-04 | Academia Sinica | Rekombinante virale Proteine und Partikel |
| CA2615372A1 (en) | 2007-07-13 | 2009-01-13 | Marc-Andre D'aoust | Influenza virus-like particles (vlps) comprising hemagglutinin |
| EP2238253B1 (en) * | 2007-11-27 | 2012-09-12 | Medicago Inc. | Recombinant influenza virus-like particles (vlps) produced in transgenic plants expressing hemagglutinin |
| MX370690B (es) | 2008-07-18 | 2019-12-19 | Medicago Inc | Epitopo de inmunizacion de nuevo virus de la influenza. |
| CA2742288A1 (en) * | 2008-07-30 | 2010-02-04 | Folia Biotech Inc. | Multivalent vaccines based on papaya mosaic virus and uses thereof |
| US20100183523A1 (en) | 2009-01-22 | 2010-07-22 | Wagner Richard E | Dental composition and method |
| HRP20180706T1 (hr) | 2009-06-24 | 2018-06-01 | Medicago Inc. | Kimerna gripa nalik čestici koja sadrži hemaglutinin |
| PH12012500565B1 (en) | 2009-09-22 | 2018-01-12 | Medicago Inc | Method of preparing plant-derived proteins |
| EP2550362B1 (en) | 2010-03-25 | 2017-01-04 | Oregon Health&Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| CA2832109C (en) | 2011-06-10 | 2021-07-06 | Oregon Health & Science University | Cmv glycoproteins and recombinant vectors |
| EP2568289A3 (en) | 2011-09-12 | 2013-04-03 | International AIDS Vaccine Initiative | Immunoselection of recombinant vesicular stomatitis virus expressing hiv-1 proteins by broadly neutralizing antibodies |
| US9402894B2 (en) | 2011-10-27 | 2016-08-02 | International Aids Vaccine Initiative | Viral particles derived from an enveloped virus |
| EP2679596B1 (en) | 2012-06-27 | 2017-04-12 | International Aids Vaccine Initiative | HIV-1 env glycoprotein variant |
| EP2848937A1 (en) | 2013-09-05 | 2015-03-18 | International Aids Vaccine Initiative | Methods of identifying novel HIV-1 immunogens |
| US10058604B2 (en) | 2013-10-07 | 2018-08-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble HIV-1 envelope glycoprotein trimers |
| CA2936350C (en) | 2014-01-10 | 2023-01-31 | Medicago Inc. | Cpmv enhancer elements |
| EP3069730A3 (en) | 2015-03-20 | 2017-03-15 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| EP3072901A1 (en) | 2015-03-23 | 2016-09-28 | International Aids Vaccine Initiative | Soluble hiv-1 envelope glycoprotein trimers |
| US10617751B2 (en) | 2017-07-13 | 2020-04-14 | VisionTech International Limited | Edible vaccines expressed in yeast for preventing and treating infectious diseases in animals and humans |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8421282D0 (en) * | 1984-08-22 | 1984-09-26 | Connaught Lab | Multispecific antigenic proteins |
| EP1013771B1 (en) * | 1988-02-26 | 2004-10-06 | Large Scale Biology Corporation | Non-nuclear chromosomal transformation |
| WO1991013994A1 (en) * | 1990-03-13 | 1991-09-19 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Gene expression |
| JPH05506145A (ja) * | 1990-04-06 | 1993-09-16 | コモンウエルス・サイエンティフィック・アンド・インダストリアル・リサーチ・オーガニゼイション | 修飾ポチウイルス外被タンパク質に基づく自己ポリマー化発現系 |
| GB9108386D0 (en) * | 1991-04-19 | 1991-06-05 | Agricultural Genetics Co | Modified plant viruses as vectors |
| EP0596979B1 (en) * | 1991-08-01 | 2002-01-30 | Large Scale Biology Corporation | Recombinant plant viral nucleic acids |
| WO1995021248A1 (en) * | 1994-02-03 | 1995-08-10 | The Scripps Research Institute | Method for using tobacco mosaic virus to overproduce peptides and proteins |
-
1994
- 1994-07-13 GB GB9414118A patent/GB9414118D0/en active Pending
-
1995
- 1995-07-10 WO PCT/GB1995/001618 patent/WO1996002649A1/en not_active Ceased
- 1995-07-10 CN CNB951907956A patent/CN1211488C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-10 CA CA002170412A patent/CA2170412C/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-10 JP JP50478996A patent/JP3681753B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-10 BR BR9506047A patent/BR9506047A/pt not_active Application Discontinuation
- 1995-07-10 DE DE69535314T patent/DE69535314T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-10 AU AU28934/95A patent/AU697867B2/en not_active Ceased
- 1995-07-10 NZ NZ289170A patent/NZ289170A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-07-10 EP EP95924436A patent/EP0719336B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-07-10 AT AT95924436T patent/ATE346934T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-07-10 CZ CZ1996723A patent/CZ290484B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-10 US US08/612,858 patent/US5958422A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-10 SK SK342-96A patent/SK34296A3/sk unknown
- 1995-07-10 HU HU9600586A patent/HU223078B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-10 KR KR1019960701197A patent/KR100379803B1/ko not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| AU2893495A (en) | 1996-02-16 |
| HUT75088A (en) | 1997-04-28 |
| GB9414118D0 (en) | 1994-08-31 |
| AU697867B2 (en) | 1998-10-22 |
| JPH09504961A (ja) | 1997-05-20 |
| DE69535314D1 (de) | 2007-01-11 |
| BR9506047A (pt) | 1997-08-05 |
| EP0719336B1 (en) | 2006-11-29 |
| CA2170412C (en) | 2010-01-12 |
| CN1211488C (zh) | 2005-07-20 |
| HUP9600586D0 (en) | 1996-05-28 |
| EP0719336A1 (en) | 1996-07-03 |
| DE69535314T2 (de) | 2007-03-08 |
| US5958422A (en) | 1999-09-28 |
| CZ72396A3 (en) | 1996-06-12 |
| WO1996002649A1 (en) | 1996-02-01 |
| ATE346934T1 (de) | 2006-12-15 |
| KR100379803B1 (ko) | 2003-10-04 |
| SK34296A3 (en) | 1996-07-03 |
| JP3681753B2 (ja) | 2005-08-10 |
| CN1134174A (zh) | 1996-10-23 |
| NZ289170A (en) | 1997-11-24 |
| CA2170412A1 (en) | 1996-02-01 |
| HU223078B1 (hu) | 2004-03-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ290484B6 (cs) | Sestavené částice rostlinného viru a způsob jejich výroby, očkovací látky, fragment cDNA, vektor a jejich RNA transkript | |
| US6884623B1 (en) | Modified plant viruses as vectors of heterologous peptides | |
| Porta et al. | Development of cowpea mosaic virus as a high-yielding system for the presentation of foreign peptides | |
| McLAIN et al. | Human immunodeficiency virus type 1-neutralizing antibodies raised to a glycoprotein 41 peptide expressed on the surface of a plant virus | |
| EP1006782B1 (en) | Polypeptides fused with alfalfa mosaic virus or ilarvirus capsid | |
| EP0572433B1 (en) | Antigen-presenting capsid with fusion ms2-coat protein | |
| Fernández-Fernández et al. | Development of an antigen presentation system based on plum pox potyvirus | |
| WO2002000169A2 (en) | Production of vaccines using transgenic plants | |
| CN100415891C (zh) | 兔出血性疾病疫苗及抗原 | |
| WO1998056933A1 (en) | Polypeptide presentation system | |
| MXPA99011361A (en) | Dna sequences, molecules, vectors and vaccines for feline calicivirus disease and methods for producing and using same |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050710 |