CZ291013B6 - Modifikované polypeptidy vykazující zvýąenou imunogenitu - Google Patents
Modifikované polypeptidy vykazující zvýąenou imunogenitu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ291013B6 CZ291013B6 CZ19973378A CZ337897A CZ291013B6 CZ 291013 B6 CZ291013 B6 CZ 291013B6 CZ 19973378 A CZ19973378 A CZ 19973378A CZ 337897 A CZ337897 A CZ 337897A CZ 291013 B6 CZ291013 B6 CZ 291013B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- polypeptide
- recombinant
- vector
- csp
- antigen
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 73
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 62
- 230000028993 immune response Effects 0.000 title claims abstract description 12
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 title abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims abstract description 31
- 229930004094 glycosylphosphatidylinositol Natural products 0.000 claims abstract description 23
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 22
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 claims abstract description 15
- 244000045947 parasite Species 0.000 claims abstract description 12
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 14
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 12
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 claims description 8
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 7
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 4
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 claims description 3
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 3
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 2
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 claims 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 claims 1
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 11
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 11
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 7
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 101710117490 Circumsporozoite protein Proteins 0.000 description 4
- 241000168726 Dictyostelium discoideum Species 0.000 description 4
- 101000756636 Dictyostelium discoideum Major actin Proteins 0.000 description 4
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 101710197645 Actin-6 Proteins 0.000 description 3
- 108010049959 Discoidins Proteins 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 101150026451 csp gene Proteins 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 150000002632 lipids Chemical group 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 1-(3,5-dichloro-2,6-dihydroxy-4-methoxyphenyl)hexan-1-one Chemical compound CCCCCC(=O)C1=C(O)C(Cl)=C(OC)C(Cl)=C1O VUDQSRFCCHQIIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 101000942967 Homo sapiens Leukemia inhibitory factor Proteins 0.000 description 2
- 102100032352 Leukemia inhibitory factor Human genes 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 239000012130 whole-cell lysate Substances 0.000 description 2
- ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trimethyl-N-[3-(trifluoromethyl)phenyl]benzenesulfonamide Chemical compound CC1=CC(C)=CC(C)=C1S(=O)(=O)NC1=CC=CC(C(F)(F)F)=C1 ZIIUUSVHCHPIQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710197649 Actin-8 Proteins 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000255925 Diptera Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 206010034133 Pathogen resistance Diseases 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 102000015439 Phospholipases Human genes 0.000 description 1
- 108010064785 Phospholipases Proteins 0.000 description 1
- 108010065081 Phosphorylase b Proteins 0.000 description 1
- 101710112477 Phycobiliprotein ApcE Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000013452 biotechnological production Methods 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N furosemide Chemical compound C1=C(Cl)C(S(=O)(=O)N)=CC(C(O)=O)=C1NCC1=CC=CO1 ZZUFCTLCJUWOSV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000028996 humoral immune response Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000004344 prestalk cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 210000003079 salivary gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 125000000391 vinyl group Chemical group [H]C([*])=C([H])[H] 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Popisuje se rekombinantn polypeptid, vykazuj c zv² enou imunogenicitu a obsahuj c glykosylfosfatidylinositolovou strukturu. Polypeptidem je nap° klad antigen, jako je polypeptid parazita, zejm na polypeptid z Plasmodium falciparum, jako je protein cirkumsporozoit (CSP). D le se popisuje rekombinantn DNK vektor vhodn² pro expresi polypeptidu, zp soby vyvol n imunitn odpov di proti jednomu nebo v ce epitop polypeptidu a zp soby produkce modifikovan²ch polypeptidov²ch vakc n, kter obsahuj polypeptid.\
Description
N O
Modifikované polypeptidy vykazující zvýšenou imunogenitu
Oblast techniky
Vynález se týká modifikovaných polypeptidů vykazujících zvýšenou imunogenitu, zvláště polypeptidu, které se modifikovaly lipidovou strukturou. Vynález zvláště popisuje polypeptidy parazitů, které se modifikovaly lipidovou strukturou, a přesněji protein cirkumsporozoit Plastmodium falciparum. Vynález se dále týká způsobu vyvolání imunní odezvy proti modifikovaným polypeptidům, způsobu, vektoru a hostitele, které jsou vhodné pro produkci polypeptidů, a vakcín, jenž obsahují tyto polypeptidy.
Dosavadní stav techniky
Imunitní systém je komplex a není zcela pochopen. Způsob, kterým hostitelský imunitní systém rozeznává cizorodý imunogen, je vysvětlen pouze z části. U savců, jestliže se vystaví působení cizorodých proteinů, je imunitní odezva značně různorodá. Středem zájmu je proto libovolná metoda přípravy polypeptidů se zvýšenou imunogenitou. Tímto způsobem se dá překovat problém slabě imunogenních epitopů.
Jedním způsobem, jak zdokonalit vakcinaci pomocí rekombinantních proteinů, je produkce více epitopů z více jak jednoho proteinu, který pochází z jednoho nebo více infekčních agens. Tento přístup umožňuje získat levnější polyvalentní, účinnější vakcíny, které umožňují jednodušší a bezpečnější imunizační režim. Avšak takový přístup vyžaduje, že každý polypeptid se produkuje v dostatečném množství, specifický protokol pro čištění každého peptidu, který se používá k imunizaci, zabezpečení optimálního množství peptidu. Účelem imunizace je najít přístupy, kde se vyvolá silná imunitní odezva proti specifickým epitopům, zatímco imunigeny mají nízkou kvalitu nebo jsou ve směsi jiných polypeptidů, jak se může pozorovat v určitých situacích in vivo.
Nejčastěji se vyskytující kauzativní agens malárie je Plasmodium falciparum, který se nachází v různých formách ve hmyzích a lidských hostitelích. Při použití inaktivních forem parazitů jako vakcín určených pro savce se získaly slibné výsledky. Hlavní omezení však je skutečnost, že sporozitv není možné kultivovat a musí se izolovat ze slinných žláz komárů. Za účelem získat ochranu se vylučuje použití inaktivovaného parazita jako takového.
Z důvodu obejít tento problém se exprimovaly v heterologních rekombinantních systémech geny kódující specifické proteiny různých forem Plasmodia. Tyto proteiny se s omezeným úspěchem použily jako potenciální ochranný agens hostitele. V jiném případě se v imunizační studii využily peptidy, které odpovídají definovaným oblastem antigenů, což vykazuje jistá omezení v případě takových imunizací. Protein cirkumsporozoit (CSP) je jeden z antigenů, které jsou přítomny na povrchu sporozit Plasmodium falciparum, které se do organizmu dostávají hmyzím štípnutím. Tento protein se syntetizuje jako prekurzor polypeptidu, kteiý se skládá z odstranitelné signální sekvence N-konce, z velké centrální repetice, která je na obou stranách lemována oblastmi, zde označenými jako oblast I a oblast II, a která obsahuje sekvence, jež jsou u různých druhů Plasmodia konzervativní, a zhydrofóbní domény C-konce. Opakující se doména NANP se skládá z tandemové repetice klastru aminokyselin asparagin-alanin-asparagin-prolin ((ASN-ALA-ASN-PRO)n). Ukázalo se, že jde o účinný epitop CSP P. Falciparum, na který reagují B-buňky. Syntetické peptidy, obsahující takovou repetici, se používají s omezeným úspěchem jako podjednotky vakcíny v imunizační studii. Mapovaly se elementy odezvy T-buněk na CSP protein vně segmentů repetice. V každém experimentu se pro imunizaci použilo velké množství čištěných antigenů.
-1 CZ 291013 B6
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je poskytnout modifikované proteiny, jako jsou proteiny Plasmodium falciparum, které mohou vyvolat silnou imunitní odezvu i v případě, že antigeny parazity nejsou čištěny. Tento přístup je zajímavý z hlediska dalšího vývoje vakcín obsahujících celé buňky, které umožňují levnější ale účinnější imunizační režimy.
Zjistilo se, podle vynálezu, že antigen, k němuž se přidá glykosylfosfatidylinositolová kotva (GPI) vyvolá vyšší imunitní odezvu, než odpovídající antigen bez kotvy.
Vynález tedy poskytuje rekombinantní polypeptidy vykazující zvýšenou imunogenitu, obsahující glykosylfosfatidylinositolovou struktur, která slouží k vyvolání zvýšené imunitní odezvy ve srovnání s odpovídajícími polypeptidy bez kotvy. Polypeptidem může být antigen, přednost se dává antigenů parazita, jako je antigen Plasmodium falciparum podobný proteinu cirkumsporozoit Plasmodium falciparum (CSP) nebo jeho modifikovaná verze.
V popisu a v patentových nárocích používaný termín „nebo jeho modifikovaná verze“ znamená inkorporaci libovolného derivátu proteinu cirkumsporozoit, který vykazuje dostatečnou imunogenitu, aby došlo k vyvolání imunitní odezvy. Do toho termínu se zahrnují ne pouze celé proteiny, ale také fragmenty nebo jejich mutované verze.
Vynález se zde popisuje jako CSP protein Plasmodia falciparum. Avšak vynález není omezen pouze na tento antigen. Pro odborníka je jednoduché nahradit CSP jinými požadovatelnými antigeny, a tak získat výhodu vynálezu bez nutných experimentů.
Exprese CSP se dosáhlo v heterologních rekombinantních systémech (E. coli, kvasinky, virus Vaccinia, bakulovirus, Salmonella, Dystyostelium discoidem.). Zjistilo se, že druhy slizovky Distyostelium se mohou použít jako účinný eukaryotní expresní systém pro produkci rekombinantních proteinů. Ve srovnání sjinými expresivními systémy Distyostelium může produkovat zcela stabilní polypeptid CSP (Fasel, N., Begdadi-Rais, C., Bernard, M., Bom, C., Corradin, G., and Reymond, C.D., (1992) Gene 111, 157-163). Tento systém se pak používá za účelem získání silnější a déle trvající imunitní ochrany, protože nese každý epitop B a T buněk.
Slizovky Distyostelium je organizmus vhodný pro použití při biotechnologických výrobách. Je to volně žijící organizmus, jednoduše se kultivuje i udržuje. Kmeny rostou na vrstvě bakterií, kde čas zdvojení je 3 hodiny, v semisyntetickém médiu obsahující glukózu, pepton a kvasinkový extrakt, kde doba zdvojení je okolo 12 hodin nebo v bakteriálních suspenzích, kde dosahují vysoké hustoty (až 1010 buněk na litr).
Životní cyklus Distyostelium zahrnuje růstovou a vývojovou fázi. Vývojová fáze se spouští vyhladověním buněk a charakterizuje se agregací buněk, které se před tím vyskytovaly jednotlivě. Agregací vzniká vícebuněčný organizmus, který se pak diferencuje a produkuje se spory. V přítomnosti bakterií nebo v bohatém médiu spory vyklíčí, což vede k obnovení růstu. Během tohoto vývojového cyklu se produkuje difúzovatelné faktory. Nejméně jeden z nich (cAMP) tím, že se váže na svůj receptor vyvolává transkripci kazety specifických genů (Loomis, The Development Of Distyostelium discoideum, Acad. Press, 1982). Růstové vlastnosti a transformační kapacita Distyostelium discoideum umožňují expresi cizích proteinů, potom se buňky mohou levně kultivovat na bakteriích a exprese specifických proteinů se může kontrolovat vyhladověním v na živiny chudém médiu. Distyostelium discoideum je bezpečný, netoxický, nepatogenní volně žijící organizmus, který by se mohl uplatnit při vývoji celobuněčné vakcíny, avšak pro veterinární účely.
Dictyostelium discoideum se pak může použít za účelem produkce modifikovaných polypeptidů podle vynálezu. Buňky se transformují vhodným vektorem, kultivují se za podmínek, které umožňují expresi a izolaci polypeptidů. Vhodný vektor zahrnuje sekvenci DNK kódující
-2CZ 291013 B6 polypeptid, jehož DNK je spojena s přídavnou glykolipidovou kotevní sekvencí, která se nachází po směru jeho transkripce, a s vhodnou iniciační a terminační sekvencí. Sekvence DNK přednostně kóduje antigen parazita, jako je antigen Plasmodium falciparum, protein cirkumsporozoit P. Falciparum (CSP) nebo jeho modifikovanou verzi.
Rada povrchových buněčných proteinů v různých organizmech je zakotvena v membránové lipidové dvojvrstvě pomocí lykosylfosfatidylinositolové struktury (GPI). Tato komplexní struktura se syntetizuje jako prekurzor glykolipidu a v endoplazmatickém retikulu se přeměňuje na glykoproteiny. Přeměna přeformované kotvy GPI na určitý polypeptid je možná pouze, je-li příslušná signální sekvence (zde označovaná jako „přídavná glykolipidová kotevní sekvence) obsažena v oblasti C-konce cílového proteinu. Ukázalo se, že signální sekvence je zahrnuta do skupiny 10 až 12 zbytků umístěné proti směru transkripce hydrofobní sekvence C-konce. Dále se ukázalo, že v případě Distyostelium specifické proteiny jsou ukotveny pomocí GPI. Definovaly se determinanty sekvence C-konce pro jeden z těchto proteinů, jmenovitě kontaktní místo A (Noegel, A., Gerisch, G. Stadler, J. and Westphal, M. (1986) EMBO J. 5, 1473-1476). Poté, co se kotva GPI přemění na polypeptid, může se štěpit specifickou fosfolipázou (GPI-fosfolipáza C nebo D), což vede k modifikaci hydrofobní povahy proteinu a to se projeví odlišným dělením zvláště v detergentu, TX-114.
Podle vynálezu vektorová rekombinantní DNK obsahuje přídavnou glykolipidovou kotvicí sekvenci, která se odvodila od kontaktního místa a D. discoideum.
Vynález dále popisuje způsob produkce protilátek proti jednomu nebo více epitopů polypeptidu. Tato metoda zahrnuje imunizaci vhodného hostitele (například savce) za použití polypeptidu podle vynálezu a izolaci protilátek, které takto vznikají. Jako alternativní postup se může použít celé sérum. Pro imunizaci se upřednostňuje použití polypeptidu ve formě celobuněčného lyzátu hostitelských buněk exprimujících polypeptid.
Dále se vynález týká vakcíny pro imunizaci hostitele, kterým je savec. Vakcína obsahuje modifikovaný polypeptid podle vynálezu v množství, které je imunoprotektivní, spolu s vhodným excipientem. Imunoprotektivní množství znamená obsah polypeptidu obsaženého v například l-5xl07, zejména v 2xl07 hostitelských buněk transformovaných vektorem kódujícím polypeptid a přídavnou glykolipidovou kotvicí sekvenci.
Popis obrázků na výkresech
Na obrázku č. 1 jsou znázorněny expresivní vektory pro protein cirkumsporozoit (CSP).
Část A. Přesnější popis konstrukce těchto dvou vektorů se uvádí v textu. Protein CSP, kterému chybí prvních 18 aminokyselin, se fúzoval do rámce k vedoucímu peptidu UAG z P. falciparum za UAA je konstrukce vektoru pEDII-CS49. Vektor pERIV-CS je odvozený z pERII (v textu), který obsahuje Tn5 neoR gen mezi promotorem aktinu 15 a terminačními sekvencemi. GPI kotvicí doména proteinu CsA se umístila do rámce C. konce CSP (část B). Symboly „Diskoidin I“ a „ras“ označující sekvence podporující transkripci v buňkách Distyostelium. Šipky ukazují na počáteční místa transkripce. Čísla 1, II a III označují vysoce konzervativní domény proteinu CSP.
Část B. Ve vektoru pERIV-CS CSP hydrofobní doména se zaměnila za posledních 49 aminokyselin proteinu CsA. Během klonování se přidal další prolin (P) mezi sekvence CSP (podtrženo) a CsA.
Na obrázku č. 2 je znázorněna fosfolipidová modifikace CSP exprimovaného v buňkách Discoideum. Proteiny extrahované z přibližně 2x106 buněk se kultivovaly s jednou jednotkou (dráha 1) nebo s 5 jednotkami (dráha 5) enzymu GPI-PLD po dobu jedné hodiny. Pak se separovaly do TX-114 fáze (Bordier, shora uvedeno) a analyzovaly se imunoblotem. Stabilně
-3CZ 291013 B6 transformované buňky se lyžovaly a separovaly se SDS PAGE proteiny se dále přenesly na nitrocelulózovou membránu. CSP se identifikovalo imunodetekcí použitím (NANP)50 monoklonálních protilátek Sp3E9. Molekulová hmotnost proteinu CSP (62kDa) se odhadla použitím těchto standardů: fosforyláza b (97 kDa), BSA (66 kDa), ovalbumin vaječného bílku (42,7 kDa).
Význam symbolů: Aq: vodní fáze; Tx: TX-114 detergentová fáze; 0: vzorky, kde se neaplikoval enzym GPI-PLD.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1; Úvod
Následující příklad popisuje produkci CSP Plasmodium falciparum, který se modifikuje v Distyostelium discoideum přidáním glykolipidové kotvy a jeho použití při imunizaci. Polypeptid se exprimoval ve slizovce Distyostelium discoideum fůzí vedoucího polypeptidů a přidávané glykosylfosfatidylinositolové signální sekvence (GPI) získané z kontaktního místa A Distyostelium.
Myši se imunizovaly celobuněčným lyzátem kultury Distyostelia, kde se exprimuje GPI modifikovaný protein. Vznikají protilátky, které rozeznávají dvě různé oblasti polypeptidů. GPI modifikované polypeptidy se mohou exprimovat v buňkách Distyostelia. Jak polypeptidy v izolované formě, tak buňky obsahující polypeptidy se mohou použít při imunizaci, v diagnostických testech, v základních studiích nebo mají potenciál pro vakcinaci.
Příklad 2: Materiály a způsoby
V následujících experimentech se používá řada metod, které jsou pro odborníka v oblasti molekulární biologie, chemie proteinů a imunologie dobře známé a dostupné. Takové metody se nepopisují vždy do detailů.
Enzymy se získaly z komerčních zdrojů a používají se způsobem, který doporučuje výrobce.
Bakteriální média a způsobu klonování se popisují v publikaci Sambrook et al. (Molecular cloning: A Laboratory Manual, CSH press 1989).
Monoklonání protilátky a NANP50 se získaly od F. Sinaglia (Hoffman La Roche Aid, Basel).
Příklad 3: Konstrukce plazmidů obsahující CS
Vektor pEDII-CS 49
Expresivní vektor pEDI-CS se skládá z vektoru pVEII (Maniak and Nelle, (1990) Nucl. Acids, Res. 18, 5375), který obsahuje elementy důležité pro rozmnožování a udržování prokaryontního hostitele (počáteční místo replikace a gen rezistence a ampicilin), a zTn903, kteiý nese gen pro rezistenci na neomycin zajišťující u eukaryontních buněk rezistenci na geneticin (G418) za řízení transkripční jednotky aktinu 15 z Distyostelia. Přítomnost promotoru Discoidin 1 umožňuje vývojové řízení exprese sekvencí orientovaných po směru transkripce a sekvence aktinu 8 zajišťují správnou terminaci RNK.
Při konstrukci expresního vektoru pED-CS se HaelII/Rsal restrikČní fragment o velikosti 1 161 bp genu CS NF54 (Caspers, P., Genz, R., Matile, H., Pink, J. R., and Sinigaglia, F. (1989)
-4CZ 291013 B6
Mol. Biochem. Parisitoi. 35, 185-189) nejdříve začlenil do Asp718/BamHI restrikčního místa vektoru pVEII pomocí Klenow DNK polymerázy. Dále se na DNK syntetizéru, Applied Biosystem Model 380 B, syntetizovaly oba DNK řetězce sekvence kódující vedoucí peptid kontaktního místa A (CsA) a tři další aminokyseliny. Nukleotidová sekvence syntetického vedoucího peptidů je následující:
5-ATGTCTAGATTTTTAGTATTGATAATATTATATAATATTTTAAATAGTGCACATTCAG
CTCCAACCCAGGATCCATG- 3'
Sekvence se potvrdila sekvenováním replikovatelné formy M13mpl8, kam se do restrikčního místa Smál začlenil fragment z tupými konci.
Izoloval se Xbal/BamHI restrikční fragment obsahující CsA vedoucí peptid a začlenil se do Xbal/BamHI restrikčního místa ve vektoru za vzniku expresivního vektoru pEDII-CS. V expresivním vektoru pEDII-CS se přirozený terminační kodón UAG zaměnil za UAA terminační kodón. Tato záměna proběhla tak, že velká část oblasti kódující CSP se nahradila fragmentem DNK aplifikovaným za použití specifických oligonukleotidů:
5' amplimér (umístěný po směru transkripce sekvence vedoucího peptidů CsA, obsahuje BamHI restrikční místo):
5'-ACCCAGGATACCCTTATTCCAG- 3'
3' amplimér (odpovídající posledním kodónům genu CSP, ale obsahuje UAA terminační kodón a restrikční místo Sací):
5'-AAAGCCGAGCTCTTAATTAAGGAACAAGAAGGATAAT-3'
Tyto oligonukleotidy nesou specifická restrikční místa BamHI a Sací, která se také nacházejí ve vektoru pEDII-CS a použily se při náhradě segmentu genu CSP vektoru pEDII-CS. Při použití této strategie se získal expresivní vektor pEDII-CS49, který produkuje protein CSP sjeho původním C-terminálním polypeptidem.
Vektor pERIV-CS
Za účelem exprese GPI modifikované formy proteinu CSP se zkonstruoval plazmid pERIV-CS. Tento plazmid vznikl z pERIV, který sám vznikl z pERII. Jde o plazmid, který je kombinací fragmentu ras promotoru z Distyostelium, signálního peptidů CsA, terminační sekvence aktinu 6 a kazety neoR ve vektoru pGEM3. Za použití restrikčního enzymu EcoRV se z pDneo2 izolovala kazeta neoR, která zahrnuje promotor aktinu 15 z Distyostelium, bakteriální gen rezistance Tn903 a terminační sekvenci aktinu 15 z Distyostelium (Witke, W., Nellen, W., and Noegel, A. (1987). EMBO J. 6,4141=1148) a začlenila se do pGEM13 (Promega corp.). Fragment izolovaný z vektoru pERI-CS zahrnující ras promotor z Distyostelium-signální peptid CsA (Fasel et al., dříve uvedeno) se začlenil mezi restrikční místa BamHI a EcoRI. Terminační sekvence aktinu 6 zpDneo2 se nejdříve klonovala do HindlII místa plazmidu pGEM4 (Promega corp.), aby se získalo druhé restrikční místo a pak se znovu izolovala a začlenila se do BamHi restrikčního místa, které leží vedle signálního peptidů CsA. Konstrukce obsahující terminační sekvenci aktinu 6 ve správné orientaci se nazvala pERII. Tento plazmid se štěpil enzymy EcoRV/Xhol a fragment DNK získaný amplifikací oblasti obsahující přídavnou glykosylfosfatidylinositolovou kotevní sekvenci se začlenil za použití vhodných restrikčních míst. Dva oligonukleotidy používané při amplifikaci mají následující sekvenci:
-5CZ 291013 B6
5' amplimér (obsahující restrikční místo EcoRV)
5'-CCCGGTACCAGGCCTGATATCTCCAACTCCAACTGAAAC-3'
3' amplimér (obsahujíc restrikční místo Xhol) 5 5'-CGGCTCGAGTTAAATTAATAAAACAAAAGAAATG- 3'
Plazmid pERIV se štěpil enzymy Asp718/EcoRV a do tohoto plazmidu se včlenila alela CSP NF54. DNK proteinu CSP, která obsahuje gen CSP, ale nezahrnuje signálního peptidu N-konce a hydrofóbní segmenty C-konce kódujících CSP, se získala amplifikací za použití následujících amplimérů:
5' amplimér (obsahující restrikční místo Asp 718)
5CCCGGTACCATTATTCCAGGAATACCAGTGC- 3'
3' amplimér (obsahující restrikční místo HaelII, které se může spojit s reatrikčním místem EcoRV) 15 5-ATAGGCCACATTTTTCCATTTTACAAATTTTTTTTTC-3'
Amplifíkovaná DNK se po štěpení enzymy ASP 178 a HaelII začlenila mezi restrikční místa Asp718 a EcoRV plazmidu pERIV. Získaný plazmid se označil pERIV-CS.
Příklad 4: Kultivace buněk Distyostelia, transformace a exprese
Buňkv Distyostelia se kultivují vmíchané suspenzi v médiu HL-5 až dosáhnou hustoty 5x10° buněk/ml a nechají se vyhladovět v PDF (pufrovací ředící roztok) (Sussman, M. (1987) Methods in Cell Biology (Spudich, J. A., ed.) pp9-29, Acad. Press, lne., Orlando, FL). Různé 25 vektory se vnesly do buněk elektroporací a exprimující buňky se vybraly způsobem, který se popisuje v publikaci Nellen, W., and Firtel, R. A. (1985) Gene 39, 155-163; Howard, P.K., Ahem, K.G., and Firtel, A. (1988) Nucleic Acids Res. 16, 2613-1623).
Při expresy závislé na promotoru Discoidin I se buňky D. discoideum vyhladověly po dobu 30 4 hodin v míchané suspenzi (160 ot./min.) v PDF při hustotě buněk 5xl06 buněk/ml pokud není uvedeno jinak (Fasel et al., shora uvedeno).
V případě konstrukcí s ras promotorem se buňky vyhladověly po dobu 6 hodin v míchané suspenzi v-PDF při hustotě buněk okolo 5x106 buněk/ml a transkripce se vyvolala přidáním 35 2 00μΜ cAMP a lOnM DIF (faktor vyvolávající diferenciaci) (Morris, H.R., Taylor, G.W.,
Massento, M.S., Jermyn, K.A. Kay, R.R. (1987), Nátuře 328, 81-814) po dobu jedné hodiny pokud není uvedeno jinak (Louvion, J.F., Scholder, J. C., Pinaud, S., and Reymond, C.D. (1991) Nucleic Acid Res. 19,6133-6138).
Příklad 5: Analýza proteinu
Proteiny izolované z 2xl06 buněk (v komůrce o šířce 4 mm) se povařily a lx ředěném Laemmli pufru po dobu 5 min., separovaly se na 10% SDS-PAGE (Sambrook, J., Fritsch, E.F., and 45 Manioatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manual., 2nd Ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Proteiny se přenesly elektropřenosem na nitrocelulózu
-6CZ 291013 B6 (imunoblot). K filtru se přidalo padesát mikrogramů na mililitr anti-NANP monoklonálních protilátek (Sp3E9) (Boulanger, N., Matile, H., and Betschart, B. (1988) Acta. Tropica 45, 55-65) a vše se inkubovalo přes noc při teplotě místnosti. Pro detekci navázaných anti-NANP protilátek se použil protein A konjugovaný s alkalickou fosfatázou a chemoluminiscenční reakce (Amersham).
Příklad 6: GPI-fosfolipázový D-test
Testovala se citlivost CSP modifikovaného pomocí GPI na GPI-fosfolipázu D (GPI-PLD). Buňky s vektorem pERIV-CS se lyžovaly v roztoku 20 mM Tris/HCl pH 7,5, 0,lM CaCL2, 0,08 % TX-100 ve čtyřech cyklech zmrazení a rozmražení. K extraktu se přidalo jedna nebo pět jednotek enzymu GPI-PLD (Bohringer Manheim) a směs se inkubovala po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C. Pak se přidal detergent TX-114 v roztoku lxTBS obsahující lmM EDTA tak, aby konečná koncentrace byla 1% a separovala se vodní a detergentová fáze. Vzorky se rozdělily na 10% SDS polyakrylovém gelu a analyzovaly se imunoblotováním pomocí SP3E9 monoklonálních protilátek, jak se popisuje shora.
Příklad 7: ELISA
Sérum a monoklonální protilátky vytvořené proti N-konci (aminokyseliny 22 až 125), repetici NANP peptidu nebo C-terminálnímu (aminokyseliny 289 až 390) segmentu se testovaly ELISOLF. Vinylové destičky se potáhly různými peptidy, promyly se a blokovaly 1 % BSA v roztoku PBS. Monoklonální nebo sérové protilátky se sériově naředily v roztoku 1 % BSA/PBS, který obsahuje 0,05 % Tween 20. Ředěná séra se přidala do antigenem potažených komůrek a inkubovala se po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Destičky se promyly roztokem PBS obsahujícím 0,05 % Tween 20 a přidalo se vhodné ředění specifických anti-IgG navázaných na peroxidázu. Vše se inkubovalo po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Do každé komůrky se přidalo 100 μΐ roztoku peroxidázového substrátu a stanovila se A410. V případě myších sér se jako poslední bod titrační křivky pro ELISU stanovilo ředění séra, které vykazuje hodnotu absorbance 2 SD větší než je průměr kontrolních myší.
Příklad 8: Imunizace zvířat a analýza antisér
Balb/c myším se podkožní nebo intraperitoneální injekcí aplikovalo dvakrát 25 μΙ nebo jednou 50 μΐ sonikované směsi neúplného Freundova adjuvans a 2x107 buněk v poměru 1:1. Po 4 týdnech se aplikace injekce zopakovala se stejným materiálem. Po 10 dnech se shromáždila séra a analyzovala se ELISOU:
Příklad 9.: Dosažené výsledky
Exprimovai se CSP modifikovaný GPI a použil se při vývoji živé vakcíny nebo diagnostického testu. Hydrofóbní terminální segment CSP (posledních 23 aminokyselin) se nahradil posledními 49 aminokyselinami kontaktního místa A (CsA) polypeptidu obsahujícího GPI kotvicí doménu (Noegel et al., dříve uvedeno) (obrázek č. IA a B). Fúzní gen CSP/CsA se začlenil tak, aby jeho exprese byla řízena promotorem ras (Louvin et al., shora uvedeno, Fasel et al., shora uvedeno). Konstrukce se zavedla do buněk D. discoideum (pERIV-CS). Pro zjištění přítomnosti CSP na povrchu buněk s vektorem pERIV-CS (se použily anti-CSP protilátky (data nejsou publikovány). Promotor ras způsobil, že pouze 20 až 40 % indukovaných buněk vykázalo expresi. Byly to ty buňky, které se diferencují na prestalk cells (Reymond, C.D., Gomer, R.H., Mehdy, C., and Firtel, R.A. (1984) Cell 39, 141-148).
-7CZ 291013 B6
Fúzní protein CSP/CsA produkovaný kulturou Distyostelium discoideum má amfifilický charakter, což se očekává od proteinu modifikovaného GPI (Bordier, C. (1981) J. Biol. Chem. 256, 1604-1607, Conzelmann, A., Spiazzi, A., Hyman, R., and Bron, C. (1986) EMBO J. 5,3291-3296), protože přechází do detergentové fáze TX-114 (obrázek č. 2). Za účelem potvrzení výskytu GPI kotvy ve CSP/CsA fuzním proteinu se buňky lyžovaly ve třech cyklech mrazení a opětného rozmražení v 0,008 % TX-100. Buněčné lyzáty se trávily po dobu jedné hodiny s 1 nebo 5 jednotkami GPI-PLD. Odstranění lipidové části fúzního proteinu CSP/CsA pomocí 5-ti jednotek GPI-PLD změnilo jeho hydrofobní charakter a vyvolalo jeho přechod do vodní fáze (obrázek č.: 2), zatímco inkubace s jednou jednotkou enzymu měla omezený účinek. Tyto výsledky naznačují přítomnost GPI struktury v proteinu CSP exprimovaném v buňkách Distyostelia, což znamená, že Distyostelium discoideum může produkovat, zpracovat a modifikovat heterologní proteiny parazitů přidáním GPI kotvy.
Za účelem potvrzení schopnosti CSP modifikované GPI vyvolat imunitní odezvu se ošum Balb/c myší podkožně nebo intraperitoneálně imunizovalo s 2x107 celých buněk ve směsi s Freundovým neúplným adjuvans. Deset dní po druhé injekci se analyzovala humorální imunitní odpověď pomocí testu ELISA proti syntetickým peptidům z různých oblastí CSP (Tabulka 1). Stanovily se protilátky proti imunodominantní oblasti repetice NANP, proti C-terminální neopakující se oblasti (aminokyseliny 289-390), ale ne proti N-terminálnímu syntetickému peptidů s aminokyselinami 22 až 125. Je zajímavé, že přítomnost specifických protilátek a titry protilátek nejsou ovlivněny způsobem aplikace injekce (tabulka 1).
Tabulka 1: Test ELISA séra myší imunizovaných buňkami s vektorem pERIV-CS speptidy (NANP)5o, Ml (189-390).
| r~y rv Zvíře | (NANP)50 titr ELISA | Ml (289-390). titr ELISA |
| Búp? | 1/1 000 | 1/900 |
| G (sc) | 1/5 000 | 1/900 |
| R(ip) | 1/5 000 | 1/900 |
| Y(sc) | 1/1 000 | 1/300 |
| Y(ip) | 1/5 000 | 1/900 |
| W(ip) | 1/1 000 | 1/900 |
| kontrola0 | <1/10 | <1/10 |
a séra se získala 7 dní po aplikaci jedné injekce myším Balb/c imunizovaných 2x107 buněk b myši se imunizovaly buď podkožně (sc), nebo intraperitoneálně (ip) 0 kontrolní zvíře dostalo injekci samotného neúplného Freundova adjuvans
V kontrolním experimentu se myším aplikovala injekce buněk Distyostelium, které exprimují CSP syntetizovaný pomocí vektoru pEDII-CS49. V tomto případě má CSP původní peptidový segment C-konce a není modifikovaný GPI kotvou. Pomocí testu ELISA se nestanovily žádné protilátky proti různým segmentům CSP (tabulka 2).
Tabulka 2: Test ELISA séra myší imunizovaných buňkami s vektorem pEDII-CS49 s peptidy (NANP)S0, Μ1 (289-390) a M (22-125).
| Zvíře | (NANP)so titr ELISA | Ml (289-390) titr ELISA | M2 (22-125) titr ELISA |
| č. lb | <1/10 | <1/10 | <1/10 |
| č. 2 | <1/10 | <1/10 | <1/10 |
| č.3 | <1/10 | <1/10 | <1/10 |
| kontrola0 | <1/10 | <1/10 | <1/10 |
-8CZ 291013 B6 séra se získala 7 dní po aplikaci jedné injekce myším Balb/c imunizovaných 2xl07 buněk myši se imunizovaly buď podkožně (sc), nebo intraperitoneálně (ip) kontrolní zvíře dostalo injekci samotného neúplného Freundova adjuvans
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (18)
1. Rekombinantní polypeptid se zvýšenou imunogenitou, mající navíc glykosylfosfatidylinositolovou skupinu, která se v přírodním polypeptidů nenachází, polypeptid vyvolává vyšší imunitní odezvu, ve srovnání s odpovídajícím polypeptidem bez glykosylfosfatidylinositolové struktury.
2. Polypeptid podle nároku 1, kde polypeptid je antigen.
3. Polypeptid podle nároku 2, kde antigen je polypeptid parazita.
4. Polypeptid podle nároku 3, kde antigen parazita je polypeptid z Plasmodium falciparum.
5. Polypeptid podle nároku 4, kde antigen z Plasmodium falciparum je protein cirkumporozoit (CSP) nebo jeho modifikované verze.
6. Rekombinantní DNK vektor pro expresi polypeptidů podle libovolného z nároků 1 až 5 obsahující sekvenci DNK, která kóduje polypeptid, přičemž sekvence DNK je spojena s přídavnou glykolipidovou kotevní sekvencí umístěnou po směru transkripce této sekvence, s vhodnou iniciační a terminační sekvencí transkripce a popřípadě se sekvencí vedoucího peptidu.
7. Rekombinantní DNK vektor podle nároku 6, kde sekvence DNK kóduje antigen parazita.
8. Rekombinantní vektor podle nároku 7, kde antigen parazita je antien z Plasmodium falciparum.
9. Rekombinantní DNK vektor podle nároku 8, kde antigen z Plasmodium falciparum je protein cirkumsporozoit (CSP) nebo modifikované verze tohoto proteinu.
10. Rekombinantní DNK vektor podle libovolného z nároků 6 až 9, kde přídavná glykolipidová kotvící sekvence se získá z kontaktního místa A Disfostelium discoideum.
11. Rekomabinantní hostitelská buňka, v y z n a č u j í c í se t im , že obsahuje rekombinantní DNK vektor podle libovolného z nároků 6 až 10.
12. Rekombinantní hostitelská buňka podle nároku 11,vyznačující se tím, že hostitel je Distyostelidový hostitel.
13. Rekombinantní hostitelská buňka podle nároku 12, vyznačující se tím, že Dystyostelidový hostitel je druh Distyostelium, zvláště Distyostelium discoideum.
14. Způsob výroby modifikovaných polypeptidů podle nároků 1 až 5, vyznačující se tí m, že se vhodné hostitelské buňky transformují vhodným vektorem podle nároků 6 až 10, kultivují za podmínek, které umožňují expresi polypeptidů a popřípadě se polypeptid izoluje.
-9CZ 291013 B6
15. Vakcína, vy z n a č u j í c í se t í m , že obsahuje polypeptid podle libovolného z nároků 1 až 5 v imunoprotektivním množství spolu s vhodným ecipientem.
5
16. Vakcína podle nároku 15, vyznačující se tím, že imunoprotektivní množství znamená obsah proteinu přibližně v počtu 1 až 5x107, zejména v počtu 2x10' hostitelských buněk podle nároků 11 až 13, v jednotkové dávce.
17. Rekombinantní polypeptid podle nároků 1 až 5 pro použití k imunizaci.
o
18. Použití rekombinantního polypeptidů podle některého z nároků 1 až 5 pro výrobu vakcíny.
2 výkresy
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP95201066 | 1995-04-25 | ||
| US08/428,616 US6113917A (en) | 1995-04-25 | 1995-04-25 | Modified polypeptides for enhanced immunogenicity |
| NL1001348A NL1001348C2 (en) | 1995-04-25 | 1995-10-05 | Polypeptide comprising glycosyl-phosphatidyl:inositol structure |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ337897A3 CZ337897A3 (cs) | 1998-04-15 |
| CZ291013B6 true CZ291013B6 (cs) | 2002-11-13 |
Family
ID=26139248
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19973378A CZ291013B6 (cs) | 1995-04-25 | 1996-04-25 | Modifikované polypeptidy vykazující zvýąenou imunogenitu |
Country Status (15)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6113917A (cs) |
| EP (1) | EP0826050A1 (cs) |
| JP (1) | JPH11504215A (cs) |
| AU (1) | AU714808B2 (cs) |
| BR (1) | BR9604989A (cs) |
| CA (1) | CA2218987A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ291013B6 (cs) |
| HU (1) | HUP9802238A3 (cs) |
| IL (1) | IL118021A0 (cs) |
| NL (1) | NL1001348C2 (cs) |
| NO (1) | NO974924L (cs) |
| NZ (1) | NZ307195A (cs) |
| PL (1) | PL323078A1 (cs) |
| WO (1) | WO1996034105A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA963269B (cs) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2000504223A (ja) * | 1996-01-29 | 2000-04-11 | ジョージタウン・ユニヴァーシティ | Ｍｓａ１ペブチドの付加に基づいたマラリアワクチン |
| AUPP589398A0 (en) * | 1998-09-14 | 1998-10-08 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | Immunogenic compositions and uses thereof |
| AUPP675898A0 (en) * | 1998-10-27 | 1998-11-19 | Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research, The | A method of activating t cells and agents useful for same |
| KR20100039911A (ko) * | 2001-10-13 | 2010-04-16 | 아스테리온 리미티드 | 폴리펩타이드들을 포함하는 글리코실포스파티딜이노시톨 |
| US20030171260A1 (en) * | 2002-03-11 | 2003-09-11 | Nelson Deanna Jean | Compositions and methods utilizing hydroxamates to scavenge oxidant toxins |
| US8038986B2 (en) | 2002-07-26 | 2011-10-18 | The Walter And Eliza Hall Institute Of Medical Research | Immunogenic compositions and diagnostic and therapeutic uses thereof |
| US7625998B2 (en) | 2003-04-09 | 2009-12-01 | Asterion Limited | Cytokine polypeptides and antibodies containing a signal sequence for the attachment of glycosylphosphatidylinositol |
| US20080026008A1 (en) * | 2006-07-27 | 2008-01-31 | Clark Tibbs | Bacteriophage DNA vaccine vector |
| KR20240021211A (ko) * | 2021-06-10 | 2024-02-16 | 얀센 바이오테크 인코포레이티드 | Klk2-gpi 융합 단백질에 대한 핵산 코딩, 재조합 세포 및 이의 용도 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8905857D0 (en) * | 1989-03-14 | 1989-04-26 | Hoffmann La Roche | Plasmodium merozoite rhoptries antigen |
| NL9100869A (nl) * | 1991-05-17 | 1992-12-16 | Univ Lausanne | Dictyostelide expressievector en werkwijze voor het tot expressie brengen van een gewenst eiwit. |
| BR9400600A (pt) * | 1994-02-17 | 1995-10-24 | Finep Financiadora De Estudos | Processos para produção de uma protéina recombinante e/ou de glicosilfosfatidilinositol (GPI) em células de microorganismos eucariontes e para a obtenção de leveduras de S. cerevisae; célula de levedura sequência de nucleotídios; meio de cultura; medicamento ou vacina; e produto dos ditos processos |
-
1995
- 1995-04-25 US US08/428,616 patent/US6113917A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-10-05 NL NL1001348A patent/NL1001348C2/xx not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-04-23 IL IL11802196A patent/IL118021A0/xx unknown
- 1996-04-24 ZA ZA963269A patent/ZA963269B/xx unknown
- 1996-04-25 AU AU56481/96A patent/AU714808B2/en not_active Ceased
- 1996-04-25 BR BR9604989-8A patent/BR9604989A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-04-25 JP JP8532179A patent/JPH11504215A/ja not_active Ceased
- 1996-04-25 CZ CZ19973378A patent/CZ291013B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-04-25 EP EP96913528A patent/EP0826050A1/en not_active Withdrawn
- 1996-04-25 NZ NZ307195A patent/NZ307195A/xx unknown
- 1996-04-25 HU HU9802238A patent/HUP9802238A3/hu unknown
- 1996-04-25 WO PCT/EP1996/001744 patent/WO1996034105A1/en not_active Ceased
- 1996-04-25 CA CA002218987A patent/CA2218987A1/en not_active Abandoned
- 1996-04-25 PL PL96323078A patent/PL323078A1/xx unknown
-
1997
- 1997-10-24 NO NO974924A patent/NO974924L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA963269B (en) | 1996-10-25 |
| US6113917A (en) | 2000-09-05 |
| HUP9802238A3 (en) | 2000-03-28 |
| HUP9802238A2 (hu) | 1999-01-28 |
| AU714808B2 (en) | 2000-01-13 |
| IL118021A0 (en) | 1996-08-04 |
| CZ337897A3 (cs) | 1998-04-15 |
| AU5648196A (en) | 1996-11-18 |
| WO1996034105A1 (en) | 1996-10-31 |
| PL323078A1 (en) | 1998-03-02 |
| NO974924D0 (no) | 1997-10-24 |
| NZ307195A (en) | 1999-07-29 |
| NL1001348C2 (en) | 1996-10-28 |
| BR9604989A (pt) | 1999-11-30 |
| NO974924L (no) | 1997-12-19 |
| JPH11504215A (ja) | 1999-04-20 |
| EP0826050A1 (en) | 1998-03-04 |
| CA2218987A1 (en) | 1996-10-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gibson et al. | Structure and expression of the gene for Pv200, a major blood-stage surface antigen of Plasmodium vivax | |
| US20220409712A1 (en) | Biofusion proteins as anti-malaria vaccines | |
| JP3658690B2 (ja) | ウイルスの膜蛋白質の天然ドメインの獲得方法、特にｈｉｖに対するワクチンとしてのそれらの使用 | |
| US6958235B1 (en) | Recombinant protein containing a C-terminal fragment of plasmodium MSP-1 | |
| US7759461B2 (en) | Expression system for enhancing solubility and immunogeneicity of recombinant proteins | |
| CN1741815B (zh) | 疟疾疫苗 | |
| CZ291013B6 (cs) | Modifikované polypeptidy vykazující zvýąenou imunogenitu | |
| US11197920B2 (en) | Vaccines | |
| US20050095256A1 (en) | Recombinant process for preparing a complete malaria antigen gp190/MSP1 | |
| Mancilla et al. | Plasmodium vivax: dimorphic DNA sequences from the MSP-1 gene code for regions that are immunogenic in natural infections | |
| JP2000506381A (ja) | マラリア原虫ｍｓｐ―１のｃ末端断片を含む組換えタンパク質 | |
| US6846481B1 (en) | Recombinant expression of heterologous nucleic acids in protozoa | |
| EP0474891A1 (en) | Vectors for expression of malarial antigens on the surface of Salmonella vaccine strains | |
| WO2000046381A1 (en) | Recombinant expression of heterologous nucleic acids in protozoa | |
| EP1357128B1 (en) | The preparation and usage of plasmodium fusion antigen | |
| Matsumoto et al. | Stable expression and secretion of the B-cell epitope of rodent malaria from Mycobacterium bovis BCG and induction of long-lasting humoral response in mouse | |
| US6420523B1 (en) | Baculovirus produced plasmodium falciparum vaccine | |
| JPS63500637A (ja) | 組換えウイルス | |
| EP1888625B1 (en) | Malaria vaccines | |
| CN1187851A (zh) | 具有提高的免疫原性的修饰多肽 | |
| HK1014985A (en) | Modified polypeptides for enhanced immunogenicity | |
| Dumon-Seignovert | The oligomerization domain of C4-binding protein acts as an adjuvant: a fusion protein of MSP119 with the murine C4bp domain protects mice against malaria | |
| Ogun et al. | The oligomerization domain of C4-binding protein acts as an adjuvant: a fusion protein of MSP119 with the murine C4bp domain protects mice against malaria. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20050425 |