CZ291496B6

CZ291496B6 - Protismyslný oligonukleotid a terapeutický prostředek s jeho obsahem

Info

Publication number: CZ291496B6
Application number: CZ19951688A
Authority: CZ
Inventors: Soudhir Colote; Eduardo Pirotzky
Original assignee: Société De Conseils De Recherches Et D´Application
Priority date: 1994-06-29
Filing date: 1995-06-27
Publication date: 2003-03-12
Also published as: SE9502259D0; AU689887B2; FR2721930B1; BR9503015A; IE950477A1; FI953170L; GB9513246D0; MA23595A1; NZ272398A; ZA955288B; OA10221A; SK83895A3; HU9501913D0; SE9502259L; CZ168895A3; AU2329995A; EP0692535A1; CN1124142A; HUT72133A; PL309384A1

Abstract

Protismysln² oligonukleotid selektivn hybridizovateln² s genem nebo transkrip n mi produkty pro podjednotky z isoprenylprotein transfer z je u ite n² t m, e inhibuje bun nou proliferaci, a oligonukleotid sest v ze SEQ ID . 1 a SEQ ID . 36 nebo modifikovan²ch SEQ ID . 1 a SEQ ID . 36, p°i em modifikace hlavn ho °et zce spo vaj v modifikaci nukleotidov²ch b z , modifikaci skupin vytv °ej c ch vazbu a/nebo modifikaci polohy 5' a/nebo 3'. Je tak pops n terapeutick² prost°edek, kter² jako · innou l tku obsahuje alespo jeden v²Üe uveden² oligonukleotid. Tento oligonukleotid je vhodn² pro oÜet°ov n nebo terapii lidsk ho nebo zv °ec ho t la, ve kter m je bun n proliferace abnorm ln a/nebo nekontrolovan .\

Description

Protismyslný oligonukleotid a terapeutický prostředek s jeho obsahem

Oblast techniky

Vynález se týká protismyslného oligonukleotidů selektivně hybridizovatelného genem nebo transkripčními produkty pro podjednotky z izopropenylprotein transferáz a terapeutického prostředku, který jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden takový oligonukleotid. Tento oligonukleotid je vhodný pro ošetřování nebo terapii lidského nebo zvířecího těla, ve kterém je buněčná proliferace abnormální a/nebo nekontrolovaná.

Dosavadní stav techniky

Jakýkoli žijící organismus, ať je jednobuněčný nebo vícebuněčný, je charakterizován svou schopností rozmnožovat se, jevem vyžadujícím replikaci z dědičných materiálů (DNA a podobně) a rovněž distribuci replikované DNA mezi dvě „dceřinné“ buňky. Existuje vysoký počet velmi různorodých molekul smitogenními aktivitami, které působí způsobem „specifickým pro buňku“. „Signální“ molekuly nebo růstové faktory jsou polypeptidového typu, které ve velmi nízkém množství a po interakci s cílovými buňkami, mohou vyvolat kaskádu událostí, které ukončí v replikaci DNA a mitóze.

Růstové faktory nepůsobí přímo na buněčný cyklus, ale interakcí a aktivací řady transmembránových receptorů umístěných na plazmové membráně cílových buněk. Tento mechanismus spouští řetězovou reakci v buňkách, která vede k mitóze. Tyto aktivované intracelulámí. případy se mohou měnit od jednoho buněčného typu k druhému pro stejný receptor.

Jedním z prvních stupňů vázání růstového faktoru ke svému receptoru je aktivace proteinu kinázy a fosfory láce proteinů. Jedním z proteinů vytvářejících tuto signální převádějící (transdukující) vazbu je protein ras, 21-kDa protein modifikovaný prenylačním mechanismem. Jako prenylace se označuje post-translační modifikace, která zahrnuje kovalentní vázání izopropenylových seskupení k cysteinu z řady proteinů. Tak izopropenylace se může přenášet z famesylových seskupení nebo geranylgeranylových seskupení na cílové proteiny. Tato modifikace dovoluje určitým proteinům, aby se samy vázaly na akční straně membrány. Jedním z důsledků inhibice této prenylace je zabránění transdukci mimobuněčných signálů na jádra, a proto buněčné proliferaci.

Nyní jsou charakterizovány tři typy enzymů, které katalyzují tuto modifikaci: famesyl-protein transferáza, geranylgeranyl-protein transferáza typu 1 a geranylgeranyl-protein transferáza typu 2. Všechny enzymy vykazují shodné sekvence, která jsou umístěny na C-konci proteinů.

Jedním z důsledku blokování syntézy těchto enzymů je blokace hlavních signálních přenosových cest, která vede k proliferaci buněk.

Většina klasických aktivních složek se účastní interakce s proteiny, translačním produktem genetické informace, a inhibuje jejich funkce. Tento vynález je zaměřen na moderní terapeutický přístup, na protismyslnou (antisense) strategii. Tento přístup je určen pro selektivní modulaci exprese genu selektivním spojením nukleotidového řetězce (oligonukleotidů) s komplementární sekvencí na mediátorová (messenger) nebo pre-mediátorová (premessenger) RNA nebo DNA, a proto inhibuje syntézu odpovídajícího proteinu. Použité molekuly podléhají interakci přímo na genetické informační kaskádě.

Oligonukleotidy komplementární k transkripčním produktům se označují a/nebo nazývají protismyslnými „antisense“ oligonukleotidy. Oligonukleotidy, které mají stejné sekvence jako transkripční produkty se označují jako „sense“ oligonukleotidy. Původně byly tyto sloučeniny

-1 CZ 291496 B6 racionálně určeny k inhibici tvorby genových produktů odstraněním odpovídající „sense“ RNA cestou RNAzy H zprostředkovanou mechanizmem hydrolýzy. Brzo vyšlo na povrch, že mechanizmus účinku těchto protismyslných oligonukleotidů není tak jednoduchý. Tyto oligonukleotidy by mohly interagovat s rozdílným počtem buněčných cílů, které nejsou nukleovými kyselinami. Tyto oligonukleotidy by také podléhaly interakci s genem, za vzniku trojnásobně dvoušroubovicové struktury a inhibovaly by tvorbu transkripčních produktů. Oligonukleotidy by podléhaly interakci s intron-exonovými spojeními pre-mediátorové RNA a tak byly na překážku správnému střihu transkripčního produktu. Oligonukleotidy by mohly hybridizovat s mRNA v cytoplazmě za tvorby duplexu RNA-DNA, který se rychle degraduje enzymem RNAzou H nebo tím, že zabrání ribozomovému komplexu v posunu po mRNA a tedy blokádou translace. Oligonukleotidy, zvláště modifikované oligonukleotidy by podléhaly interakci s řadou buněčných složek, jako jsou proteiny. Tyto interakce by byly sekvenčně specifické (například transkripční faktory) nebo by byly nesekvenčně specifické (například růstové faktory). Tak oligonukleotidy (SEQ ID č. 1-36) by přivodily zastavení proliferace přes libovolný z výše uvedených mechanizmů nebo jejich kombinací.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je protismyslný oligonukleotid selektivně hybridizovatelný s genem nebo transkripčními produkty pro podjednotky z izopropenylprotein transferáz užitečný tím, že inhibuje buněčnou proliferaci, kde oligonukleotid sestává ze SEQ ID č. 1 až SEQ ID č. 36 nebo modifikovaných SEQ ID č. 1 až SEQ ID č. 36, přičemž modifikace hlavního řetězce spočívají v modifikaci nukleotidových bází, modifikaci skupin vytvářejících vazbu a/nebo modifikaci polohy 5' a/nebo 3'.

Předmětem tohoto vynálezu je také terapeutický prostředek, jehož podstata spočívá vtom, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden oligonukleotid podle tohoto vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředidlem a/nebo nosnou látkou, které jsou vhodné pro zvolený způsob podávání.

Předmětem tohoto vynálezu konečně je oligonukleotid selektivně hybridizovatelný s genem nebo transkripčními produkty pro podjednotky z izopropenylprotein transferáz podle tohoto vynálezu pro ošetřování nebo terapii lidského nebo zvířecího těla, ve kterém je buněčná proliferace abnormální a/nebo nekontrolovaná.

Dále se popisuje tento vynález podrobněji a v širších souvislostech.

Tento vynález je zaměřen zvláště na použití protismyslných oligonukleotidů k blokování syntézy enzymů, jak je uvedeno výše. Je navrženo jejich použití jako antiproliferačních prostředků při kardiovaskulárních chorobách, v oblasti rakoviny, dermatologie, určitých virových infekcí a jiných patologických stavů, které zahrnují proliferaci buněk.

Při protismyslné metodologii se mohou používat protismyslné oligonukleotidy nebo protismyslná RNA. Protismyslná oligonukleotidová metodologie protismyslné RNA. V tomto posledním případě se DNA segment genu zavádí do vektorové DNA o obrácené orientaci k normálnímu smyslu a tak během transkripce tohoto vektoru se jeden ze řetězců DNA replikuje v RNA. Inzerce reverzního fragmentu genu vede kin šitu syntéze RNA, která je komplementární k normální mRNA syntetizované samotnou buňkou. Tato RNA, označovaná jako prostismyslná RNA, může hybridizovat s normálně exprimovanou mRNA a tak inhibovat translaci cílového proteinu. Takovou metodu použil Prendergast a kol. (Cell Growth and Differenciation 4, 707-713 /září 1993/), k ohodnocení úlohy famesyl-protein transferázy. cDNA pro podjednotku této famesyl-protein transferázy byla klonována a čištěna, přičemž cílového buňky pomocí genového inženýrství vedly k expresi protismyslných molekul RNA.

-2CZ 291496 B6

Přístup přes protismyslnou RNA je zvláště vhodný jako mechanistický prostředek k objasnění úlohy proteinu v buňce a eventuálně jako terapeutického prostředku, za použití protokolů vyspělé genové terapie, zatímco protismyslné oligonukleotidy jsou mnohem přitažlivější jako farmaceutické prostředky a jsou podkládané úředními orgány za klasické chemické entity. Kromě toho se oligonukleotidy mohou snadno syntetizovat ve velkém podle metod klasické chemie, zatímco protismyslné molekuly RNA se produkují v biologickém systému a vyskytuje se mnoho překážek pro jejich výrobu v průmyslovém měřítku.

Způsob dávkování famesyl-protein transferáz se dá zjistit v evropském patentovém spisu č. 456 180 a zvláště tímto způsobem lze měřit aktivitu potenciálního inhibitoru famesyl-protein transferáz. V žádném případě však taková metoda neumožňuje definovat strukturu nového potenciálního inhibitoru famesyl-protein transferáz, ani tento patentový spis nepopisuje nějakou molekulu, která by byla příbuzná tomuto vynálezu.

Vynález se týká oligonukleotidů (protismyslných nebo „sense“), které selektivně hybridizují s genem nebo transkripčními produkty pod podjednotky izoprenyl-protein transferáz a výhodně pro podjednotky a a/nebo β izopropenylprotein transferáz. Oligonukleotid může obsahovat od 2 do 50 jednotek a výhodně od 8 do 35 jednotek. Obzvláště výhodně oligonukleotid obsahuje od 10 do 25 jednotek. Oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se mohou syntetizovat některým ze známých chemických způsobů syntézy oligonukleotidů. Oligonukleotidy se nejvýhodněji vyrábějí za použití některého z průmyslově dostupných automatizovaných syntetizátorů nukleových kyselin. Jedním ze způsobů syntézy oligonukleotidů je β-kyanethylfosforamidátová metoda, kterou popsal S. L. Beaucage a kol. (Tet. Let. 22,1859-1862 /1981/).

Vynález také skýtá deriváty takových oligonukleotidů, to znamená oligonukleotidy, ve kterých kostra je modifikována na celé délce oligonukleotidů nebo v jedné nebo obou z poloh 5' a 3'. Ve skutečnosti oligonukleotidy jsou citlivé k enzymům, nukleázám, které je hydrolyzují na nukleotidy. Oligonukleotidy se stávají rezistentní k nukleázám modifikaci například chemické povahy svého cukru nebo intemukleotidovými vazbami fosfát-cukr. Tak fosfodiesterový řetězec může být nahrazen například fosforthioátovým, fosfordithioátovým, methylfosfonátovým, fosforamidátovým, fosforethyltriesterovým, butylamidátovým, piperazidátovým nebo morfolidátovým řetězcem. Jiné typy modifikací se mohou provádět po celé délce oligonukleotidů nebo v polohách 5' a/nebo 3' oligonukleotidů k dosažení větší rezistence oligonukleotidů v biologickém prostředí. Také fosfátové vazby mezi nukleotidy se mohou nahradit amidovými vazbami (peptidové nukleové kyseliny). Také transmembránový průchod oligonukleotidů může být podporován k dosažení pozdější větší hydrofobnosti. To se může dosáhnout například připojením hydrofobních substituentů, jako cholesterového nebo aromatického seskupení nebo polymeru. Modifikované báze by mohly být zavedeny částečně nebo po celé délce oligonukleotidů. Také konformačně modifikované nukleotidy (například oligonukleotidy s α-anomerovou konformací) rezistentní knukleáze nebo se zvýšenými hybridizačními nebo intracelulámími absorpčními vlastnostmi by se mohly zavést částečně nebo po celé délce oligonukleotidů. Výraz „derivát“ zahrnuje nukleotid modifikovaný jedním ze způsobů popsaných výše nebo některým jiným způsobem, který je dobře znám odborníkovi v oboru.

Výhodné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu jsou oligonukleotidy se sekvencemi SEQ ID č. 1 až SEQ ID č. 36. Jejich komplementární sekvence neboli smyslné oligonukleotidy podle tohoto vynálezu se také mohou používat.

Tento vynález dále poskytuje oligonukleotidy, které zahrnují alespoň část jedné ze sekvencí vybraných ze SEQ ID č. 1 až SEQ ID č. 36.

Vynález dále zahrnuje farmaceutické prostředky, které obsahují jako účinnou látku alespoň jeden protismyslný oligonukleotid podle tohoto vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředidlem a/nebo nosnou látkou vhodnou pro zvolený způsob podání.

-3CZ 291496 B6

Využitelnost

Farmaceutické prostředky se mohou podávat topickým, systémovým nebo lokálním ošetřením a mohou mít formu kapaliny pro injekce, lipozomu, prostředku s protrahovaným účinkem, gelu, masti pro lokální použití nebo jinou přijatelnou formu pro zvolený způsob podávání. Konečně vynález skýtá použití prostředku podle tohoto vynálezu při způsobu ošetřování nebo terapii lidského nebo zvířecího těla, při kterém je proliferace buněk abnormální a/nebo nekontrolovaná.

Příklady provedení vynálezu

Dále uvedené příklady ilustrují tento vynález.

Příklad 1

Účinek protismyslné sekvence na proliferaci hladkého svalstva u krysy

Buňky hladkého svalstva z aorty samčích kiys kmene Wistar se izolují enzymatickým štěpením (kolagenáza a elastáza) a kultivují se v přítomnosti prostředí DMEM, 10 % fetálního telecího séra (FCS), 2 mmol glutaminu, 50jedn./ml penicilinu a 50 pg/ml streptomycinu. Buňky hladkého svalstva se používají mezi 3. a 7. pasáží v deskách se 24 jamkami.

Po 3 dnech kultivace se buňky izolují v séru po 72 hodin. Buňky se potom stimulují (nebo nestimulují) 1% sérem nebo 5 ng/ml bFGF (základní fibroblastový růstový faktor) nebo zpracují současně s látkami podle tohoto vynálezu v koncentraci 10^-5 mol nebo bez nich během 24 hodin. Čtyři hodiny před koncem inkubace se buňky označí tritiovaným thymidinem (s aktivitou 3,7.10—4 s^jnT¹). Inkorporace se zastaví přidáním 5% TCA po 10 minut a buňky se potom zpracují do homogenního stavu s 500 μΐ 5-normálního roztoku hydroxidu sodného. Alikvóty o objemu 400 μΐ se odeberou a rozdělí do scintilačních nádob, které obsahují 400 μΐ 0,5normální kyseliny chlorovodíkové a 10 ml Instagelu.

Aktivity oligonukleotidů se stanovují měřením proliferace buněk a vyjadřují v procentech. Získané výsledky j sou uvedeny v následuj ící tabulce.

% proliferace

	buňky nestimulované	bFGF
Kontrolní stanovení	100	100
SEQ ID č. 1	38	37
SEQ ID č. 2	35	40
SEQ ID č. 3	75	90
SEQ ID č. 4	114	100
SEQ ID č. 5	24	13
SEQ ID č. 6	49	70
SEQ ID č. 7	40	40
SEQ ID č. 8	119	70
SEQ ID č. 21	88	100
SEQ ID č. 22	89	86
SEQ ID č. 23	58	59
SEQ ID č. 30	121	225
SEQ ID č. 31	103	111
SEQ ID č. 32	111	204
SEQ ID č. 33	9	2
SEQ ID č. 34	10	2
SEQ ID č. 35	13	2
SEQ ID č. 36	12	2

-4CZ 291496 B6

Příklad 2

Studie dávka/odpověď - účinek protismyslné sekvence na proliferaci hladkého svalstva u krysy

Experimentální pracovní postup je identický jako je popsán v příkladu 1. Buňky se zpracují se sloučeninami podle tohoto vynálezu v koncentracích 10⁹mol, 10^_8mol, 10~⁷mol, lO^mol a 10^-5 mol.

% proliferace

Koncentrace	0	10 ⁹ mol	10 ⁸ mol	10’⁷mol	IO^-6 mol	10’⁵mol
SEQ ID č. 1	100	99	108	107	64	25
SEQ ID č. 2	100	86	81	90	50	14
SEQ ID č. 5	100	95	80	100	66	20
SEQ ID č. 6	100	87	69	84	48	20
SEQ ID č. 7	100	102	98	96	59	28

Příklad 3

Velikost účinku na biologickou aktivitu protismyslných oligonukleotidů in vitro

Experimentální pracovní postup je identický jako je popsán v příkladu 1. Buňky se zpracují se sloučeninami podle tohoto vynálezu.

% inhibice

	Koncentrace (pmol)	buňky nestimulované	bFGF
Kontrolní stanovení	-*	0	0
SEQ ID č. 5	10	76	87
SEQ ID č. 30	10	-21	-125
SEQ ID č. 31	10	-3	-11
SEQ ID č. 32	10	-11	-104
SEQ ID č. 2	1	33	4
SEQ ID č. 33	1	87	85
SEQ ID č. 34	1	83	89
SEQ ID č. 35	1	81	89
SEQ ID č. 36	1	85	89

²⁰

Příklad 4

Antiproliferační studie protismyslných oligonukleotidů in vivo na modelu angioplastiky (krysa 25 nebo králík)

Samčí normotensivní krysy kmene Wistar nebo samčí normotensivní králíci kmene NewZealand se anestetizují a naříznou, aby se odkryla arteria iliaca. Artérie se očistí od obklopující spojovací tkáně a zavede se kanyla pomocí French Fogarty Catheter. Balónek se nafoukne 30 vzduchem k rozšíření artérie a pohybuje se jím třikrát nahoru a dolů, k vyvolání deendothelializujícího poškození.

Oligonukleotid rozpuštěný v 25% pluronovém gelu se aplikuje bezprostředně na okolí vystavené oblasti artérie. Otevřené rány se uzavřou a zvířata se usmrtí po 21 dni. Provede se histomorfo35 metrická analýza části deendothelializované artérie a změří se intimální a mediální oblasti.

-5CZ 291496 B6

Procento proliferace se stanoví jako poměr intimální oblasti k součtu intimální a mediální oblasti.

Tabulka 1

	Model angioplastiky na králíkovi
Koncentrace (pg)	% proliferace
Kontrolní stanovení		33,6 ± 8,8
Placebo (pluronový gel F127)		31,7 ±5,9
SEQ ID č. 2	200
+	+	16,5 ± 4,8
SEQ ID č. 5	200

Tabulka 2

Model angioplastiky na kryse Koncentrace (pg)% proliferace

Kontrolní stanovení		46,71 ±4,35
Placebo (pluronový gel F127)		45,20 ±3,99
SEQ ID č. 2	200	28,63 ±4,51
SEQ ID č. 2 („sense“)	200	26,92 ± 3,40
SEQ ID č. 5	200	34,99 ±3,06
SEQ ID č. 2 („sense“)	200	38,37 ±2,54

Jak je obvyklé v celém popisu, výraz „SEQ ID sense“ označuje komplementární oligonukleotidovou sekvenci k oligonukleotidové sekvence SEQ ID.

Příklad 5

a) In vitro účinek sense a protismyslných oligonukleotidů pro famesyl-transferázu v buňkách kiysího gliomu C6

Buňky se naočkují na hustotu 5000 buněk na misku a inkubují v prostředí doplněném 5 % koňského séra a 2,5 % fetálního telecího séra. O 24 hodiny později se prostředí nahradí jedním prostým sérem s lipofektinem a rozdílnými oligonukleotidy v koncentraci 5 mmol na prováděnou transfekci. Po 5 hodinách inkubace se prostředí nahradí normálním prostředím, které obsahuje 5 % koňského séra a 2,5 % fetálního telecího séra. V inkubaci se potom pokračuje po dobu 72 hodin za teploty 37 °C. Proliferace buněk se hodnotí spočítáním buněk po tiypsinizaci monovrstvy za použití počítače Coulter Counter model ZM.

	Den 1	Den 2
Kontrolní stanovení SEQ ID č. 5 SEQ ID č. 5 („sense“) SEQ ID č. 2 SEQ ID č. 2 („sense“)	267 000 ± 9900 138 000 ±4500 288 500 ± 43 700 220 000 ± 12 600 157 300 ±11 400	2 080 000 ± 28 700 1 090 000 ± 10 400 2 040 000 ± 25 200 1 990 000 ± 17 500 1 150 000 ±57 500

-6CZ 291496 B6

b) Časový průběh účinku protismyslného oligonukleotidu na α-podjednotkou famesyltransferázy

Buňky se zpracují jak je uvedeno výše a spočítání buněk se provede, na souběžných vzorcích kontrolní misky a misky ošetřené oligonukleotidy ve dnech 3, 7 a 14. Hodnota p je menší než 0,05 % ve všech 3 dnech probíhajícího experimentu.

Den	Kontrolní stanovení (Počet buněk)	SEQ ID č. 5 (5 pmol) (Počet buněk)
0	5000	5000
3	950 000	350 000
7	2 100 000	600 000
14	3 750 000	1 350 000

Příklad 6

Antiproliferační studie na glioblastomu u krysy

a) Účinek ex vivo protismyslných oligonukleotidů na tumorigenicitu gliomových buněk C6

Buňky se ošetří jak je popsáno výše. Za 24 hodin po transfekci s 5 gmol oligonukleotidů apodjednotky pro famesyl-transferázu se neošetřené a ošetřené buňky intracerebrálně naočkují samčím krysám kmene Sprague-Dawley, starým 7 až 8 týdnů, o hmotnosti přibližně 180 až 200 g. Zvířata se anestetizují i.p. injekcí 1,5 mg/kg tělesné hmotnosti xylazinem a potom i.p. injekcí 5 mg/kg ketaminů, po 10 minutách. l,5xl0⁵ buněk ve 3 ml fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem, kde buňky byly předtím získány trypsinizací, se stereotakticky injikují do levého vasálního ganglia 3 mm od středové čáry a do hloubky 5 mm za použití Hamiltonovy mikroinjekční stříkačky o objemu 10 μΐ. Dříve se pozorovalo na krysách, které byly usmrceny po řadě dnů následujících po implantaci nádoru, že střední doba přežití krysy činila 24 dnů. Histologická analýza mozků získaných od všech přežívajících zvířat ukazuje, že implantace nádoru je úspěšná ze 100 %. 2 hodiny před usmrcením všech zvířat se injekčně zavede 40 mg BrdU. Zvířata se usmrcují dekapitací. Mozky se vyjmou ze všech zvířat a fixují proplachováním 70% ethanolem po dobu 2 dnů za teploty 4 °C. Nádor se stanovuje pomocí biparametrické DNA (BrdU) cytofluorimetrické analýzy obou mozkových hemisfér.

____________________________________________________značkovací index BrdU__________ Kontrolní stanovení 4,7 ±1,9

SEQ ID č. 2 (5 gmol) 2,3 ± 0,7

SEQ ID č. 5 (1 μιηοΐ)2,4 ± 0,5

b) In vivo účinek oligonukleotidů na tumorigenicitu gliomových buněk C6 in vivo

Neošetřené gliomové buňky C6 se zachytí z kultury pěstované po dobu 48 hodin na Petriho miskách a stereotakticky se injikují do levé hemisféry mozku krysy, jak je popsáno výše. Bezprostředně po injekci buněk se do hřbetní oblasti umístí Alzetovo čerpadlo, které obsahuje buď expicient nebo „sense“ nebo protismyslný oligonukleotid (v dostatečném množství pro dodání oligonukleotidu v koncentraci 5 μτηοΐ za den). Dodávají se rozdílné prostředky do buněk v místě injekce, pomocí trubičky o průměru 0,5 mm. Všechny statistické analýzy se provádějí za použití post-hoc Dunkanova testu.

Kontrolní stanovení

SEQ ID č. 5 („sense“)

SEQ ID č. 5 značkovací index BrdU

8,02 ± 0,24

6,82 ± 0,26

4,94 ± 0,3

Přehled sekvencí (2) Informace pro SEQ ID č. 1 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 1

AGAAGCCATGAT (2) Informace pro SEQ ID č. 2 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2

GGACGTGACT GT (2) Informace pro SEQ ID č. 3 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano

-8CZ 291496 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3

AAGGAGTAGC AG (2) Informace pro SEQ ID č. 4 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4

CAGGCAGTAG CA (2) Informace pro SEQ ID č. 5 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5

CCCGTCGTCC AT (2) Informace pro SEQ ID č. 6 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID Č. 6

CTGTCCCTGTAC

-9CZ 291496 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 7 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 7

ACTTCTCTCT CC (2) Informace pro SEQ ID č. 8 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 8

ACTTGGTCCT AA (2) Informace pro SEQ ID č. 9 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 9

GCCATCATTC TG (2) Informace pro SEQ ID č. 10 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid

-10CZ 291496 B6 (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 10

GATCTGGACC AC (2) Informace pro SEQ ID č. 11 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 11

CTCAATAGCA TC (2) Informace pro SEQ ID č. 12 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 12

GTTTTTGGGC TG (2) Informace pro SEQ ID č. 13 (i) Charakteristiky sekvence:

-11 CZ 291496 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 13

TCTCACATCC TC (2) Informace pro SEQ ID č. 14 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 14

TTGTAAGAAC TG (2) Informace pro SEQ ID č. 15 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 15

GAAGTGCTTC TC (2) Informace pro SEQ ID č. 16 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 16

GCCTCTTTTC AG

-12CZ 291496 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 17 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 17

GGCATCTGTCAG (2) Informace pro SEQ ID č. 18 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 18

CGGCTGGCAT CC (2) Informace pro SEQ ID č. 19 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 19

GAACTGACAC AC (2) Informace pro SEQ ID č. 20 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid

-13CZ 291496 B6 (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 20

ACGATCACAT CA (2) Informace pro SEQ ID č. 21 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 21

ATCAACATGC AG (2) Informace pro SEQ ID č. 22 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 22

CTGCATATCG AC (2) Informace pro SEQ ID č. 23 (i) Charakteristiky sekvence:

-14CZ 291496 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 23

CAGTGCACCA GC (2) Informace pro SEQ ED č. 24 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 24

CTGCAGCCTC GG (2) Informace pro SEQ ID č. 25 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 25

ACTCTCTGGA CC (2) Informace pro SEQ ID č. 26 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 26

CAAGAATCCT CG

-15CZ 291496 B6 (2) Informace pro SEQ ID č. 27 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 27

ACATCTGCTC TG (2) Informace pro SEQ ID č. 28 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 28

TCTGTACTCG TC (2) Informace pro SEQ ID č. 29 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 12 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 29

CTACAGTACA GC (2) Informace pro SEQ ID č. 30 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 párů bází (B) Typ: nukleotid

-16CZ 291496 B6 (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 30

CCCGTCGTCC ATAGG (2) Informace pro SEQ ID č. 31 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ED č. 31

CCCGTCGTCC ATAGGGGA (2) Informace pro SEQ ID č. 32 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 32

CCCGTCGTCC ATAGGGGACGC (2) Informace pro SEQ ID č. 33 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 15 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano

- 17CZ 291496 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 33

GGACGTGACT GTTTC (2) Informace pro SEQ ID č. 34 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 18 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ED č. 34

GGACGTGACT GTTTCCAC (2) Informace pro SEQ ID č. 35 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 35

GGACGTGACT GTTTCCACTG A (2) Informace pro SEQ ID č. 36 (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Typ: nukleotid (C) Šroubovice: jednoduchá (D) Topologie: lineární (iv) Protismyslnost: ano (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 36

GGACGTGACT GTTTCCACTG AGTC

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Protismyslný oligonukleotid selektivně hybridizovatelný s genem nebo transkripčními produkty pro podjednotky z izoprenylprotein transferáz užitečný tím, že inhibuje buněčnou proliferaci, kde oligonukleotid sestává ze SEQ ID č. 1 až SEQ ID č. 36 nebo modifikovaných SEQ ID č. 1 až SEQ ID č. 36, přičemž modifikace hlavního řetězce spočívají v modifikaci nukleotidových bází, modifikaci skupin vytvářejících vazbu a/nebo modifikaci polohy 5' a/nebo 3'.
2. Oligonukleotid podle nároku 1, který má modifikovaný hlavní řetězec.
3. Oligonukleotid podle nároku 2, kde alespoň jedna z nukleotidových bází je modifikována.
4. Oligonukleotid podle nároku 3, kde modifikovaná nukleotidová báze má alfa-anomemí konformaci.
5. Oligonukleotid podle nároku 2, kde alespoň jedna ze skupin vytvářejících vazbu je modifikována.
6. Oligonukleotid podle nároku 2, kde buď jedna nebo obě polohy 5' a 3' jsou modifikovány.
7. Oligonukleotid podle nároku 6, kde buď jedna nebo obě polohy 5' a 3' jsou modifikovány substitucí hydrofobní nebo chránící skupiny.
8. Terapeutický prostředek, vyznačující se tím, že jako účinnou látku obsahuje alespoň jeden oligonukleotid podle některého z předcházejících nároků, ve směsi s farmaceuticky přijatelným ředidlem a/nebo nosnou látkou, které jsou vhodné pro zvolený způsob podávání.
9. Oligonukleotid selektivně hybridizovatelný genem nebo transkripčními produkty pro podjednotky z izoprenyl-protein transferáz podle kteréhokoli z nároků 1 až 7 pro ošetřování nebo terapii lidského nebo zvířecího těla, ve kterém je buněčná proliferace abnormální a/nebo nekontrolovaná.