CZ291598A3 - Způsob ošetření lidských nádorů genovou terapií a odpovídající rekombinantní viry - Google Patents

Způsob ošetření lidských nádorů genovou terapií a odpovídající rekombinantní viry Download PDF

Info

Publication number
CZ291598A3
CZ291598A3 CZ982915A CZ291598A CZ291598A3 CZ 291598 A3 CZ291598 A3 CZ 291598A3 CZ 982915 A CZ982915 A CZ 982915A CZ 291598 A CZ291598 A CZ 291598A CZ 291598 A3 CZ291598 A3 CZ 291598A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
mage
cells
defective recombinant
nucleic acid
adenovirus
Prior art date
Application number
CZ982915A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ295967B6 (cs
Inventor
Falleur Boon
Marie-Thérese Duffour
Hedi Haddada
Christophe Lurquin
Michel Perricaudet
Catherine Uyttenhoveghesquiere
Guy Warnier
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Ludwig Institute For Cancer Research
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S. A., Ludwig Institute For Cancer Research filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Publication of CZ291598A3 publication Critical patent/CZ291598A3/cs
Publication of CZ295967B6 publication Critical patent/CZ295967B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4748—Tumour specific antigens; Tumour rejection antigen precursors [TRAP], e.g. MAGE
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2799/00—Uses of viruses
    • C12N2799/02—Uses of viruses as vector
    • C12N2799/021—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid
    • C12N2799/022—Uses of viruses as vector for the expression of a heterologous nucleic acid where the vector is derived from an adenovirus

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Způsob ošetření lidských nádorů genovou terapií a odpovídající rekombinantní viry
Oblast techniky
Předložený vynález se týká metody léčení lidských nádorů genovou terapií. Týká se zejména defektních rekombinantních virů nesoucích sekvenci kódující specifický antigen lidských nádorů a jejich použití pro preventivní nebo kurativní léčení lidských nádorů, stejně jako pro vytvoření specifických CTL in vitro nebo ex vivo. Týká se také farmaceutických kompozic těchto virů zejména v injektovatelné formě.
Dosavadní stav techniky
Genová terapie spočívá v opravě snížení schopnosti nebo anomálie vložením genetické informace do buňky nebo do postiženého orgánu. Tato informace může být vložena, buď in vitro do buněčného extraktu orgánu a potom reinjektována do organizmu, nebo in vivo přímo do postižené tkáně. Co se týče molekul s vysokou molekulovou hmotností a s negativním nábojem, DNA obtížně spontáně přechází přes fosfolipidovou buněčnou menbránu. Používají se tedy různé vektory, aby umožnily přenos genu: používají se jednak virové vektory, jednak chemické vektory nebo/a biochemické, přírodní nebo syntetické. Chemické vektory nebo/a biochemické vektory jsou například kationty (fosforečnan vápenatý, DEAE-dextran, ...), které působí vytvořením sraženiny s DNA, která může být fagocitována buňkami. Může se také jednat o lipozomy do kterých je DNA zahrnuta, a která fúzuje s plazmidovou membránou. Syntetické vektory pro přenos genů jsou všeobecně lipidy nebo kationické polymery, které vytvářejí komplax s DNA a tvoří s ní částice nesoucí na povrchu pozitivní náboj.
• 9 ··* * « ··· 9 • 9 ·>
Tyto částice jsou schopné interagovat s negativním nábojem buněčné membrány a potom jsou schopné projít buněčnou membránou. Jako příklad se mohou uvést vektory dioktadekylamidoglycylspermin (DOGS, Transfectam™) nebo N-[1-(2,3-dioleyloxy)propyl]-Ν,N,N-trimethylamonium chlorid (DOTMA, Lipofectin TM). Byly také vyvinuty chimérní proteiny: jsou tvořeny polykationickou částí, která kondenzuje DNA, vázanou k ligandu, který se fixuje na membránovém receptoru a odnáší komplex do buněk endocytosou. Je teoreticky možné zacílit tkáň nebo určitou buněčnou populaci ke zvýšení biodisponibility přenášeného genu in vivo (viz Behr, 1993, Cotten et Wagner, 1993). Mezi potencionelně použitelnými viry jako vektory pro přenos genů se mohou uvést zejména retroviry (RSV, HMS, MMS, atd.) virus HSV, adeno associated virusch a adenoviry. Tyto viry byly použity pro infikování různých buněčných typů.
Byly vyvinuty přístupy genové terapie pro léčení různých typů patalogií, včetně poruch nervového systému, kardiovaskulární nemocí nebo rakovin. Co se týče zejména oblasti rakovin, byly navrženy různé přístupy ve vedlejších oborech. Studie popisují použití lymfocytů ex vivo kultivací v přítomnosti 2-interleukinu nebo transfekci s genem 2-interleukinu. Přijaté imunoterapeutické studie byly také založeny na purifikovaných monocytes makrofágů, které byly aktivovány ex vivo interferonem pro zvýšení jejich tumorocidní schopnosti, potom reinjektovány pacientu (Anderssen et al., Cancer Res. 50 (1990) 7450). Byla také popsána možnost použití geneticky modifikovaných makrofágů (W095/06120). Další série přístupů je založena na přenosu toxických genů schopných způsobit přímo nebo nepřímo smrt rakovinových buněk. Tento typ přístupu byl popsán například s genem thymidin-kinasy přenesené in vivo buď adenovirovým vektorem (PCT/FR94/01284, PCT/FR94/01285) nebo štěpováním buněk produkujících retrovirální vektor (Caruso et al., PNAS 90 (1993) 7024). Další použité geny jsou například gen ··· * 999 9
9 9 9 9 ·· <
cytosindeaminasy.
Podstata vynálezu
Předložený vynález se vztahuje k nové metodě léčení rakovin. Tato metoda je zaměřena na léčení lidských nádorů, zejména melanomů. Metoda podle vynálezu je založena na přenosu a expresi in vivo specifických antigenů lidských nádorů jako jsou melanomy schopné vyvolat (i) imunitní ochranu proti vzniku tohoto typu rakoviny a (ii) šíření populace specifických cytotoxických buněk T (CTL) představujících tyto antigeny a také destrukci imunitním systémem odpovídajících nádorových buněk.
Imunitní systém má, mezi jinými funkcemi, schopnost zajistit ochranu proti virovým infekcím. Tato schopnost je zajištěna cytotoxickými lymfocyty T (CTL). CTL mají dvě význačné charakteristiky: jsou vysoce specifické a vysoce účinné. Ničí infikované buňky po určení virového antigenů na Antigen, o který se jedná, se projevuje ve spojeného s molekulou histokompatibilního komplexu třídy I (CMH-I). V oblasti tumorů bylo pozorováno, zpočátku u myší, že maligní buňky tvoří komplexy peptidových molekul CMH-I schopných vyvolat, jako v rámci antivirové odpovědi, imunitní odpověď řízenou CTL. Tyto peptidy pocházejí zejména z proteinů kódovaných mutovanými geny nebo selektivně aktivovanými geny v nádorových buňkách. Tyto proteiny jsou označené specifickými antigeny nádorů. Na lidských nádorech byly charakterizovány různé antigeny rozpoznané CTL.
jejich povrchu, formě peptidu
Předložený vynález se týká nové metody léčení lidských nádorů. Vyplývá zejmén z upřesnění vektorů virového původu schopných přenést a exprimovat in vivo specifické antigeny lidských nádorů nebo melanomů. Je založen zejména na myších •
444
4
4
4·*
444 4
4 » »
4 4 >4 44 modelech, které ukazují, že defektní rekombinantní adenoviry jsou schopné vyvolat imunizaci proti tomuto typu antigenu umožňujících získat in vivo lymfocytovou odpověď proti těmto antigenům, zejména nádorovým buňkám je nesoucích. Tato metoda podle vynálezu umožňuje tedy přenosem těchto genů působit na vývoj lidských nádorů účinným způsobem, tím že zastaví jejich vývoj, může vést k odstranění.
První předmět vynálezu tedy spočívá v rekombinantním defektním adenovirú obsahujícím vložený ve svém genomu, nukleovou kyselinu kódující protein nebo specifický peptid nádoru, zejména celek nebo část specifického antigenu nebo melanomu.
Jedná se především o antigen lidského melanomu. Jedná se zejména o fragment specifického antigenu lidského melanomu odpovídajícího části vyjádřené CTL ve spojení s molekulami CMH-I. Specifické antigeny lidských nádorů byly již popsány (Thierry Boon et al., US5,342,774; US5,405,940; WO92/20356; WO94/23031; WO94/21126). Tyto antigeny označené výrazem MÁGE, jsou selektivně exprimovány v nádorových buňkách, zejména v lidských nádorech. Byly popsány různé lidské geny MÁGE, zejména MAGE-1, MAGE-2, MAGE-3, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, MAGE-7, MAGE-8, MAGE-9, MAGE-10, MAGE-11, MAGE-12. Jako reprezentativní příklad myších homologických genů se mohou uvést geny S-MAGE-1 a S-MAGE-2. Co se týče zejména genů BAGE, GAGE a RAGE, jsou to zástupci jiné podobné rodiny genů.
Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu, předložený vynález se týká defektního rekombinantního adenovirú, který obsahuje, vložený ve svém genomu, nukleovou kyselinu kódující protein nebo peptid odvozený od proteinu vybraného mezi proteiny Mage-1, Mage-3, Bage, Gage a Rage. Tyto antigeny jsou vlastně nejvíce selektivní v tom smyslu, že nebyly detekovány na žádné nenádorové somatické buňce. Byla popsána sekvence antigenu mage-1 a odpovídajícího genu (Van der Bruggen et al., Science 254 (1991) 1644). Byla také ··♦ popsána sekvence cDNA, která kóduje Mage-1 a Mage-3 (například Gaugler et al., J. Exp. Med. 179 (1994) 921).
Jak je již naznačeno, upřednostňovaný způsob provedení vynálezu je reprezentován defektním rekombinantním adenovirem, který obsahuje, zahrnutý ve svém genomu, nukleovou kyselinu kódující peptid proteinu Mage-1, Mage-3, Bage nebo Gage obsahující část vyjádřenou CTL ve spojení s molekulami CMH-I. Geny Máge, Bage a Gage kódují proteiny značné velikoti. Tyto proteiny jsou degradovány enzymovou digescí v buňce, která vede k degeneraci peptidů. Jsou to peptidy, které jsou tedy umístěny na povrchu buněk, a které jsou rozpoznány CTL ve spojení s molekulami CMH-I (viz obrázem 2) . Vynález se týká zejména rekombinantních adenovirů, které obsahují nukleovou kyselinu kódující peptid proteinu Mage-1, Mage-3, Bage nebo Gage obsahující část vyjádřenou CTL.
Podle specifického způsobu provedení vynálezu předložený vynález se týká rekombinantních adenovirů obsahujících, zahrnutou ve svém genomu, sekvenci SEQ ID n°l. Tato sekvence obsahuje sekvenci kódující nonapeptid (27pb) Mage-1, který je vyjádřen molekulou HLA.A1 cytotoxických lymfocytů T. Jedná se o sekvenci obsaženou mezi rezidui 55 až 82 sekvence SEQ ID n°l.
Podle jiného specifického způsobu provedení vynálezu se předložený vynález týká rekombinantních adenovirů obsahujících, zahrnutou ve svém genomu sekvenci SEQ ID n°2. Tato sekvence obsahuje sekvenci kódující nonapeptid (27pb) Mage-3, který je vyjádřen molekulou HLA.A1 cytotoxických lymfocytů T.
Podle jiného způsobu provedení vynálezu předložený vynález se týká rekombinantních adenovirů obsahujících, zahrnutou ve svém genomu, nukleovou kyselinu, která kóduje antigenní peptid genu PIA mastocytomu p815 myší DBA/2 (SEQ ID • · · · · ·· • · · · · ···· · η°3:
Jak je již naznačeno adenoviry podle vynálezu umožňují přenos a účinnou expresi těchto antigenních peptidů in vivo. Umožňují také výrazně stimulovat in vivo vznik specifických cytotoxických lymfocytů T těchto antigenů, který selektivně ničí každou buňku, která má na svém povrchu tento antigen.
Viry podle vynálezu jsou tedy použitelné pro přípravu farmaceutické kompozice určené pro léčení rakovin, jejichž buňky mají antigen Máge na svém povrchu. Pro přípravu takovýchto kompozic, nádorové buňky (zejména melanomy) pacienta jsou přednostně odebrány a analyzovány pro (i) určení exprese genu Máge například RT-PCR a (ii) případně typizování tohoto antigenů Máge. Adenovirus, který obsahuje nukleovou kyselinu kódující celek nebo část odpovídajícího antigenů je konstruován a použit pro podávání.
Viry podle vynálezu mohou být také použity in vitro (nebo ex vivo), pro vytvoření populace specifických cytotoxických buněk T určitého nádorového antigenů. Proto populace buněk je infikovaná virem podle vynálezu, potom uvedena do kontaktu s prekurzorem buněk CTL. Specifické buňky antigenů mohou být tedy selekovány in vitro, amplifikovány, potom použity například jako medikamenty pro specifickou destrukci odpovídajících nádorů. Buněčná populace infikovaná virem podle vynálezu obsahuje výhodně buňky, které obsahují antigeny (APC). Může se jednat zejména o makrofágy (W095/06120) nebo buňky B.
V adenovirech podle vynálezu, vložená nukleová kyselina může být fragment komplementátní DNA (cDNA), genomické DNA (gDNA) nebo hybridní konstrukce složená například z cDNA, do které je vložen jeden nebo více intronů. Může se také jednat o syntetické nebo semisyntetické sekvence. Jak je již naznačeno jedná se o nukleovou kyselinu, která kóduje každý protein nebo peptid odvozující protein vybraný mezi Mage-1,
Mage-3, Bage a Gage. Ve smyslu předloženého vynálezu, exprese peptidu odvozujícího tento protein naznačuje, že nukleová kyselina může kódovat fragment proteinu, a že tento fragment může být vhodný pro vytvoření CTL. Fragment podle vynálezu nese tedy alespoň antigenní determinant rozpoznaný specifickou CTL. Tyto fragmenty mohou být získány všemi odborníky známými technikami zejména genetickou modifikací nebo/a chemickou modifikací nebo/a enzymovou modifikací nebo také klonováním expresí, umožňující selekci variant v závislosti na jejich biologické aktivitě. Genetické modifikace začleňují suprese, delece, mutace atd.
Vložená nukleová kyselina je především cDNA nebo gDNA.
Vložená nukleová kyselina obsahuje také sekvence umožňující expresi v infikovaných buňkách antígenu nebo fragmentu antígenu. Může se jednat o sekvence, které jsou přirozeně odpovědné za expresi výše uvedeného antígenu, když tyto sekvence schopné fungovat v infikované buňce. Může se také jednat o sekvence různého původu, označené heterologní sekvence (odpovědné za expresi jiných proteinů, nebo stejných syntetických). Může se jednat zejména o promotory eukaryontních nebo virových genů nebo odvzených sekvencí stimulujících nebo potlačujících transkripci genu specificky nebo nespecificky, induktivně nebo neinduktivně. Například se může jednat o sekvence promotorů pocházejících z genomu buňky, která se požaduje infikovat, nebo z genomu viru a zejména se může jednat o promotory genů E1A, MLP adenoviru, promotor CMV, LTR-RSV, SRcc, atd. Mezi eukaryontními promotory se mohou uvést promotory ubikvitinové (HPRT, vimentin, α-actin, tubulin atd.) promotory středních filament (desmin, neurovlákna, keratin, GFAP, atd.) promotory terapeutických genů (typ MDR, CFTR, faktor VIII atd.) specifické tkáňové promotory (pyruvátkinasa, villin, promotor střevního proteinu vázání mastných kyselin, promotor actinu α buněk hladkého svalstva, specifické promotory pro játra, Apo AI, Apo AII,
• · · · • · • · • ·
• • • • · · • · • ·
• • · » fc fcfcfcfc • fcfc • •
• • • • · • • fc
• · · • fcfc • · • · • · • ·
lidský Albumin atd.) nebo také promotory odpovídající na stimuly (receptory steroidních hormonů, receptor kyseliny retinové atd.). Mimo jiné tyto sekvence exprese mohou být modifikovány adicí aktivačních sekvencí, regulačních sekvencí atd. Když vložená nukleová kyselina neobsahuje sekvence exprese může být vložena do genomu defektního viru po směru této sekvence.
Viry podle vynálezu jsou defektní, tudíž nejsou schopné se autonomě replikovat v cílové buňce. Genom defektních virů použitých v rámci předloženého vynálezu je tedy zbaven alespoň sekvence nezbytné pro replikaci výše uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď vyloučeny (úplně nebo zčásti) nebo zbaveny funkčnosti substitucí jinými sekvencemi, zejména vloženým genem. Defektní virus nicméně zachovává sekvence genomu, které jsou nezbytné pro enkapsidaci virových částic.
Viry podle vynálezu mohou být získány od různých adenovirových serotypů. Existují různé adenovirové serotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud různí. Mezi těmito serotypy se přednostně používá v rámci předloženého vynálezu lidský adenovirus typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirus zvířecího původu (viz přihláška WO94/26914). Mezi adenoviry zvířecího původu použitelných v rámci předloženého vynálezu se mohou uvést adenoviry psího, hovězího, myšího původu (například Mávl, Beard et al., Virology 75 (1990) 81), ovčího, prasečího, ptačího nebo také opičího původu (například SAV) . Adenovirus zvířecího původu je přednostně adenovirus psí, přednostně adenovirus CAV2 (souche manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)). V rámci předloženého vynálezu se přednostně používá adenovirus lidského původu nebo původu psího nebo jejich směs.
Defektní adenovirus podle vynálezu obsahuje ITR, sekvenci umožňující enkapsidaci a nukleovou kyselinu zájmu. V genomu adenoviru podle vynálezu je alespoň oblast El nefunkční. Požadovaný virový gen může být zbaven funkčnosti všemi odborníky známými technikami, zejména úplnou supresí, substitucí, částečnou deleci nebo adicí jedné nebo více basí v požadovaném genu nebo požadovaných genech. Tyto modifikace mohou být získány in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu například prostřednictvím technik genové terapie nebo také působením mutagenních činidel. Mohou být modifikovány také jiné oblasti zejména oblast E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Podle upřednostňovaného způsobu provedení vynálezu adenovirus podle vynálezu obsahuje deleci v oblastech El a E4. Podle jiného upřednostňovaného způsobu provedení adenovirus obsahuje deleci v oblasti El na úrovni, ve které jsou vloženy oblast E4 a nukleová kyselina (viz FR94 13355). Delece v oblasti El zasahuje výhodně nukleotidy 454 až 3328 (Fragment PvuII-BglII) nebo 382 až 3446 (fragment HinfII-Sau3A). Delece v oblasti E4 výhodně obsahuje alespoň fáze ORF3 a ORF6.
Nukleová kyselina zájmu může být vložena do různých oblastí genomu adenoviru. Genom adenoviru je složen z lineární dvouvláknové DNA velikosti 36 kb. Obsahuje zejména sekvenci obrácené repetice (ITR) na každém konci, sekvenci enkapsidace (Psi), rané geny a pozdní geny (viz obrázek 1) . Zásadní ranné geny jsou obsaženy v oblastech El, E2, E3 a E4. Mezi nimi geny obsažené v oblasti El jsou nezbytné pro virovou propagaci. Hlavní pozdní geny jsou obsaženy v oblastech Ll až L5. Genom adenoviru Ad5 byl zcela sekvenován a je dostupný na základě dat (viz zejména Genebank M73260). Právě tak části genomů, ba dokonce celek genomu adenovirů (Ad2, Ad7, Adl2 atd.) byl také sekvenován. Nukleová kyselina zájmu je přednostně vložena do nepodstatné oblasti k produkci defektních rekombinantních virů. Je přednostně vložena na úrovni oblasti El, která je defektní ve viru a doplněna produkovanou linií, na úrovni oblasti E3, která není podstatná pro produkci rekombinantních virů (její inaktivace nemusí být transkomplementární) nebo také v oblasti E4. V • · • ·
I tomto posledním případě je nezbytné doplnit funkce E4 během produkce, buď společnou transfekci s plazmidem nebo pomocným virem nebo prostřednictvím přijatelné linie. Je jasné, že mohou být použita i jiná místa. Přístup k nukleové sekvenci genomu umožňuje odborníkovi identifikovat oblasti umožňující vložit nukleovou kyselinu zájmu.
Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny všemi odborníky známými technikami (Levrero et al., Gene 101 (1991) 195, EP 185 573, Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Adenoviry jsou produkovány transfekci DNA rekombinantního viru v odpovídající buněčné kapsidační linii. Může se jednat o jednoduchou transfekci, když se může připravit konstrukce nesoucí společně genom rekombinantního viru nebo, jako je to v nejčastějším případě společnou transfekci více fragmentů DNA nesoucích různé části rekombinantního virového genomu. V tom případě proces zahrnuje jednu nebo více etap obecné rekombinace mezi různými konstrukcemi v buněčné enkapsidační linii pro vytvoření DNA rekombinantního viru. Různými způsoby mohou být připraveny různé fragmenty použité pro produkci viru. Nejvšeobecněji používaná technika spočívá v izolaci virové DNA a potom modifikaci in vitro klasickými metodami molekulární biologie (digesce, ligace atd.). Získané konstrukce jsou potom purifikovány a použity pro transfekci enkapsidační linie. Jiné techniky spočívají v použití plazmidu nesoucího část genomu rekombinantního viru, který je společně transfektován s virem nesoucím chybějící část genomu. Jiné možnosti spočívají v použití prokaryontních plazmidů pro přípravu virových DNA použitelných pro transfekci (viz Bett et al., PNAS 91 (1994) 8802, FR95 01632).
Použitá buněčná linie musí přednostně (i) být transformovatelná výše uvedenými elementy a (ii) obsahovat sekvence schopné doplnit část genomu defektního adenoviru přednostně ve formě integrované pro vyhnutí se nebezpečí ·· · · • · • · <
rekombinace. Jako příklad linie se může uvést ledvinová linie lidského embrya 293 (Graham et al., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), která obsahuje, začleněnou ve svém genomu levou část genomu adenovirů Ad5 (12%) nebo linie schopné doplnit funkce El a E4 tak, jak je popsáno zejména v přihláškách vynálezů n°WO94/26914 a WO95/02697.
Adenoviry, které jsou rozmnoženy, jsou získány a purifikovány podle klasických technik molekulární biologie, jak je naznačeno v příkladech.
Předložený vynález se týká také každé farmaceutické kompozice obsahující jeden nebo více defektních rekombinantních adenovirů tak, jak je popsáno. Farmaceutické kompozice podle vynálezu mohou být formulovány z pohledu podávání a to orálně, parenterálně, intranasálně, intravenózně, intramuskulárně, podkožně, transdermikálně...
Předložený vynález kompozice obsahující rekombinantním adenovirem se týká každé farmaceutické buňky infikované defektním tak, jak je popsáno. Kompozice podle vynálezu výhodně obsahuje buňky poskytující antigen (APC) infikované defektním rekombinantním adenovirem tak, jak je již popsáno. Jako příklad se mohou uvést makrofágy nebo lymfocyty B. Vynález se také týká kompozice obsahující cytotoxické buňky T (CTL) specifické nádorovému antigenu, připravené kultivací buněčných prekurzorů v přítomnosti buněk poskytujících antigeny (APC) infikované defektními rekombinantními adenoviry tak jak je popsáno.
Farmaceutická kompozice podle vynálezu obsahuje vhodné farmaceutické vehikulum pro injektovatelnou formu. Může se jednat zejména o roztoky solí (dihydrogenfosforečnan sodný, hydrogenfosforečnan sodný, chlorid sodný, draselný, vápenatý nebo hořečnatý atd. nebo směs těchto solí), sterilní, izotonické nebo kompozice suché zejména lyofilizované, které po přídavku, podle případu, sterilované vody nebo • ·
• · ·· ·· ·· • · * · · · · • · · · · ·· • · · · ♦ ·· · · · • · · · · fyziologického séra umožňují injektovateinou formu kompozice.
Dávka viru použitá pro injekci může být přizpůsobena různým parametrům zejména způsobu použitého podávání, patologii, genu určeného k exprimování nebo také délce léčení. Všeobecně rekombinantní adenoviry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek, která obsahuje mezi lO4 a 1014 pfu, přednostně 106 až 1O10 pfu. Termín pfu (plaque forming units) odpovídá infekční schopnosti virového roztoku a je určena infekcí určité buněčné kultury a následném měřením po 15 dnech počtu plaků infikovaných buněk. Techniky určení velikosti pfu virového roztoku jsou dobře popsány v odborné literatuře.
Adenoviry podle vynálezu mohou být použity pro léčení nebo prevenci rakovin zahrnujíce zejména lidské nádory (pro antigeny Mage-1 až Mage-12, Gage a Bage a Rage) sarkomy (pro antigeny Mage-1).
Následující obrázky a příklady blíže ilustrují vynález, aniž by však v jakémkoliv směru omezovaly jeho rozsah.
Legenda k obrázkům a tabulkám
Obrázek 1: Genetické uspořádání adenoviru Ad5
Obrázek 2: Exprese a opracování antigenů máge
Obrázek 3: Konstrukce plazmidů pAd. SRoc-MAGE
Obrázek 4: Protokol č.l imunizace myši DBA/2 ad-PlA nebo kontrolou
Obrázek 5: Protokol č.2 imunizace myši DBA/2 ad-PlA nebo kontrolou
Tabulka 1: Prokázání specifické lýzy CTL infikovaných buněk Ad-Mage podle vynálezu
Tabulka 2: Prokázání schopnosti buněk infikovaných
I · · · ©· ·· • » · » » * ·· » · · ··· * ···· <
© · · · « I ·· ♦· · * · *
Ad-Mage podle vynálezu stimulovat produkci TNE klonem CTL
Tabulka 3: Prokázání imunizace myši DBA/2 injekcí podle protokolu č.l, Ad-PIA (Tabulka 3A) nebo adenovirové kontroly, Ad-pGal (Tabulka 3B)
Tabulka 4: Prokázání imunizace myši DBA/2 injekcí podle protokolu č.2, Ad-PIA (Tabulka 4A) nebo adenovirové kontroly, Ad-pGal (Tabulka 4B) » « 4 ·· · · • ·
Všeobecné techniky klonování, molekulární biologie
Klasické metody molekulární biologie takové jako jsou odstřeďování plazmidové DNA v gradientu chloridu cesnatého/ethidiumbromidu, digesce restrikčními enzymy, elektroforéza na gelu, transformace v E. coli, sráženi nukleových kyselin atd. jsou popsány v odborné literatuře (Maniatis et al., 1989).
Enzymy byly dodány firmou New-England Biolabs (Beverly,
MA) .
Pro ligaci byly fragmenty DNA rozděleny na základě velikosti na 0,8 - 1,5% agarosových gelech, purifikovány GeneClean (BIO101, LaJolla CA) a inkubovány přes noc při teplotě 14°C v pufru 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM MgCl,, 10 mM DTT, 2 mM ATP v přítomnosti DNA-ligasy fágu T4.
Byla také provedena amplifikace PCR (Polymerase Chain Reaction) podle Maniatis et al., 1989 s následujícími specifikacemi:
-koncentrace v MgCl2 8 mM
-teplota denaturace 95°C, teplota hybridace 55°C, teplota elongace 72°C. Tento cyklus byl 25x opakován v PE9600 Thermacycler (Perkin Elmer, Norwalk CO).
Oligonukleotidy chráněné v β skupinou kianoethylovou byly syntetizovány za použití fosforamidové chemie (Sinha et al., 1984, Giles 1985) automatickým syntetizátorem DNA Applied Biosystem model 394 (Applied Biosystem, Foster City CA) podle doporučení dodavatele.
Sekvenování bylo provedeno na dvouvláknové matrici metodou terminace řetězce za použití fluorescenčních nástrojů. Byla použita souprava pro sekvenování Taq Dye Primer Kit od Applied Biosystem (applied Biosystem, Foster City CA) podle doporučení výrobce.
• * • ♦ · · · · · · • · · © © · · · • · © ··©· ···© © • © · © · · ·© ·» ·» ·9
Příklad 1: Konstrukce defektního rekombinantního adenoviru, který kóduje fragment antigenu PIA
Tento příklad popisuje konstrukci defektního rekombinantního adenoviru podle vynálezu, který kóduje fragment antigenu PIA. Adenovirus nese sekvenci SEQ ID n°3. Konstruovaný adenovirus je adenovirus serotypu 5, který má deleci v oblastech El a E3, nukleovou kyselinu zájmu, která je vložena do oblasti El na úrovni delece.
Nukleová kyselina vložena na úrovni oblasti El obsahuje zejména:
-promotor SRa. Promotor SRa obsahuje raný počátek replikace SV40 a část LTR HTLV1 (odpovídající oblasti R a části U5), následuje spojení 16S SV40 (Takebe et al., Mol.
Cell. Biol. 8 (1988) 466) .
-minigen PIA 44pb (SEQ ID N°3)
-polyadenylační místo viru SV40
Tato nukleová kyselina byla extrahována z plazmidu pcD-SRa-PlA, odpovídajícího plazmidu pcD-SRa, ve kterém byl minigen PIA klonován v místě EcoRl. Získaný inzert byl pak klonován v plazmidu pAd.RSV-pGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. Invest. 90 (1992) 626) místo fragmentu obsahujícího LTR RSV a gen LacZ.
Takto získaný plazmid pAd-SRa-PlA byl potom použit pro tvorbu rekombinantního adenoviru. Proto byly buňky linie 293 společně transfektovány 5 pg plazmidu pAd-SRa-PlA a 5 μρ DNA adenovirového mutantu dl 324 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvořené rekombinantní adenoviry byly selekovány purifikací na plaku. Po izolaci byl rekombinantní adenovirus amplifikován v buněčné linii 293, to vedlo ke kultivačnímu supernatantu, který obsahuje nepurifikovaný rekombinantní » φ φ · φφ φφ φ φ φ * φ φφφ φφφφ φ φ φ φ φφ φφ adenovirus, který má okolo 1O10 pfu/ml.
Virové částice se potom purifikují odstřeďováním v gradientu chloridu cesnatého podle známých technik (viz zejména Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Analýza virové DNA digescí pomocí restrikčních enzymů EcoRI ukazuje na přítomnost inzertu v genomu. Adenoviry mohou být uchovávány při -80°C v 10% glycerolu.
Příklad 2: Konstrukce defektního rekombinantního adenoviru, který kóduje fragment antigenu Mage-1
Tento příklad popisuje konstrukci defektního rekombinantního adenoviru podle vynálezu, který kóduje fragment antigenu Mage-1. Adenovirus nese sekvenci SEQ ID n°l, kódující fragment nesoucí antigenový nonapeptid Mage-1. Konstruovaný adenovirus je adenovirus serotypu 5, který má deleci v oblastech El a E3, nukleovou kyselinu zájmu, která je vložena do oblasti El na úrovni delece.
Nukleová kyselina vložena na úrovni oblasti El obsahuje zejména:
-promotor SRa. Promotor SRa obsahuje raný počátek replikace SV40 a část LTR HTLV1 (odpovídající oblasti R a části U5) následuje spojení 16S SV40 (Takebe et al., Mol.
Cell. Biol. 8 (1988) 466).
-minigen MAGE-1 116 pb (SEQ ID N°l). Tento fragment byl získán PCR od úplného genu Mage-1. Obsahuje ATG v poloze 15, terminační kodon v poloze 121 a část exonu 3 genu Mage-1.
Obsahuje sekvenci odpovídající nonapeptidu (27 pb), který je vyjádřen molekulou HLA.Al cytotoxických lymfocytů T (Obrázek 2) .
-polyadenilační místo viru SV40
• · * fc fcfcfc ♦ · fcfc fcfc ♦ fcfc · fc fcfcfc fc fcfcfcfc fc fcfc · ♦ fc ··
Tato nukleová kyselina byla extrahována z plazmidu pcD-SRcc-Mage-1, odpovídajícího plazmidu pcD-SRa, ve kterém byl minigen Mage-1 klonován v místě EcoRI. Získaný inzert byl pak klonován v plazmidu pAd.RSV-pGal (Stratford-Perricaudet et al., J. Clin. ínvest. 90 (1992) 626) místo fragmentu obsahujícího LTR RSV a gen LacZ (Obrázek 3).
Takto získaný plazmid pAd-SRct-MAGE-1 byl potom použit pro tvorbu rekombinantního adenoviru. Proto byly buňky linie 293 společně transfektovány plazmidem pAd-SRa-MAGE-1 a DNA adenovirý mutant dl 324 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvořené rekombinantní adenoviry byly selekovány purifikací na plaku. Po izolaci rekombinantní adenovirus byl amplifikován v buněčné linii 293, to vedlo ke kultivačnímu supernatantu, který obsahuje nepurifikovaný rekombinantní adenovirus, který má okolo IO10 pfu/ml.
Virové částice se potom purifikují odstřeďováním v gradientu chloridu cesnatého podle známých technik (viz zejména Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Analýza virové DNA digescí pomocí restrikčních enzymů EcoRI ukazuje na přítomnost inzertu v genomu. Adenoviry mohou být uchovávány při -80°C v 10% glycerolu.
Příklad 3: Konstrukce defektního rekombinantního adenoviru, který kóduje fragment antigenu Mage-3
Tento příklad popisuje konstrukci defektního rekombinantního adenoviru podle vynálezu, který kóduje fragment antigenu Mage-3. Adenovirus nese sekvenci SEQ ID n°2, kódující fragment nesoucí antigenový nonapeptid Mage-3. Konstruovaný adenovirus je adenovirus serotypů 5, který má deleci v oblastech El a E3, nukleovou kyselinu zájmu, která je vložena do oblasti El na úrovni delece.
Nukleová kyselina vložena na úrovni oblasti El obsahuje φ φ • φ φφ · φ · ·
Φ Φ φ Φ · Φ ι φφφ φ φ φφ φ φφφφ φφφφ 4 φ φ φφ φφ φφ zejména:
-promotor SRa. Promotor SRa obsahuje raný počátek replikace SV40 a část LTR HTLV1 (odpovídající oblasti R a části U5) následuje spojení 16S SV40 (Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8 (1988) 466).
-minigen MAGE-3 44 pb (SEQ ID N°2). Tento fragment byl získán PCR od úplného genu Mage-3. Obsahuje ATG v poloze 12, terminační kodon v poloze 44 a sekvenci odpovídající nonapeptidu (27 pb), který je vyjádřen molekulou HLA.A1 cytotoxických lymfocytů T (Obrázek 2).
-polyadenilační místo viru SV40
Tato nukleová kyselina byla extrahována z plazmidu pcD-SRa-Mage-3, odpovídajícího plazmidu pcD-SRa, ve kterém byl minigen Mage-3 klonován v místě EcoRI. Získaný inzert byl pak klonován v plazmidu pAd.RSV-3G místo fragmentu obsahujícího LTR RSV a gen LacZ (Obrázek 3).
Takto získaný plazmid pAd-SRa-MAGE-3 byl potom použit pro tvorbu rekombinantního adenovirů. Proto byly buňky linie 293 společně transfektovány plazmidem pAd-SRa-MAGE-3 a DNA adenovirový mutant dl 324 v přítomnosti fosforečnanu vápenatého. Vytvořené rekombinantní adenoviry byly selekovány purifikací na plaku. Po izolaci rekombinantní adenovirus byl amplifikován v buněčné linii 293 to vedlo ke kultivačnímu supernatantu, který obsahuje nepurifikovaný rekombinantní adenovirus, který má okolo 1O10 pfu/ml.
Virové částice se potom purifikují odstřeďováním v gradientu chloridu cesnatého podle známých technik (viz zejména Graham et al., Virology 52 (1973) 456). Analýza virové DNA digescí pomocí restrikčních enzymů EcoRI ukazuje na přítomnost inzertu v genomu. Adenoviry mohou být uchovávány při -80°C v 20% glycerolu.
Příklad 4: Funkční charakteristika adenovirů podle vynálezu
• · · · • 9 • 9 • 9 9
9 • • • * · 9 9 9«
• • • · 9 9 9 9 ♦ • 9 9 9 •
• • • 9 9 • 9 9
9 9 9 ♦ · 9 ·· 99 9· • 9
Tento příklad ukazuje, že viry podle vynálezu jsou schopné indukovat expresi genu zájmu, který kóduje protein, jehož degradace vede k expresi antigenního peptidů na povrchu cílové buňky.
Exprese minigenu MAGE-1 a přítomnost peptidů byly prokázány na buňkách infikovaných Ad-Mage (4.1.), určením specifické lysy (4.2.) a stimulace produkce TNF (4.3.).
4.1. Buněčné linie
Buněčné linie byly infikovány následujícím způsobem:
-C1R.A1: linie lymfocytů B transformovaná EBV (Storkus, W.J., Howell, D. N., Salter, R. D., Dawson, J. R., Cresswell, P: NK susceptibility varies inversely with target cell class I HLA antigen expression. J. Immunol. 138: 1675 - 1659, 1987) a transfektována genem HLA.A1 klonovaným v plazmidů pHEBO.
-Gerl III β EF': Buňky lidského melanomu HLA.A1 imunoselekované pro ztrátu antigenů MAGE-1 (označené Gerlach E v Tabulkách 1 a 2).
Tyto dvě linie exprimují tedy molekulu HLA.A1, ale neexprimují antigen MAGE-1.
4.2. Určení specifické lýzy
Tento příklad ukazuje existenci specifické lýzy buněk specifickým klonem CTL antigenů (test uvolňování radioaktivního chrómu). Proto buňky zmíněné v 4,1. byly infikovány adenovirem Ad-Mage-1 (příklad 2) nebo kontrolním adenovirem (Ad-PGal) při několikanásobné infekci 500 pfu/buňka. Infikované buňky byly označeny chromém 51 potom inkubovány během 4 hodin, v poměru 1000 buněk/jamka, se ·· ·· ·* 99
9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 99 • ···· ·· · · ·
9 9 9 9
99 99 99 specifickým CTL (klon 82:30) v různých poměrech účinné buňky/cílové buňky (E/T). Byla stanovena procenta lysy.
Získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1. Jasně ukazují, že buňky infikované virem podle vynálezu vyjadřují citlivost k lýze specifickým CTL jasně lepší než buňky infikované kontrolním adenovirem. Tyto buňky jasně ukazují také zvýšenou citlivost vzhledem k buňkám přímo transfektovanými antigenem Mage-1, tím ukazuje terapeutickou účinnost vektorů vynálezu.
Tyto výsledky jasně ukazují, že viry podle vynálezu jsou schopné dodat buňkám velkou citlivost k lýze specifickým CTL.
4.3. Stimulace produkce TNF
V tomto příkladě byla určena schopnost buněk Gerl III β EF stimulovat produkci TNF stejným klonem CTL. Proto byly buňky Gerl III β E'F' infikovány adenovirem Ad-Mage-1 (příklad 2) nebo kontrolním adenovirem (Ad-^Gal) při několikanásobné infekci 50 až 100 pfu/buňka, potom inkubovány s klonem CTL. Po 24 hodinách bylo měřeno množství TNE přítomné v suupernatantu stanovením jejich cytotoxicity na linii citlivé k TNF (linie WEHI-164-13). Životaschopnost buněk byla měřena kolorimetrickým testem (MTT). Výsledky jsou vyjádřeny v optické denzitě v množství TNF (pg/ml). Tento test nebyl prováděn na buňkách CIR.Al, protože přirozeně vylučují TNF. Kontrolní buňky Gerlach E+ jsou melanomové buňky melanomů exprimující Mage-1 a HLA-A1.
Tyto získané výsledky jsou uvedeny v Tabulce 2. Jasně ukazují, že buňky infikované virem podle vynálezu indukují produkci TNF CTL, to jasně potvrzuje biologické a terapeutické vlastnosti virů podle vynálezu.
Příklad 5: Aktivita in vivo virů PIA vynálezu
0
0
0 0 0 000 • ·0·
0000 »
0 0
00
Příklad 4 ukázal, že in vitro nebo ex vivo, buňky infikované adenovirem podle vynálezu jsou dobře rozpoznány v testu TNF a lyžovány v testu uvolňování radioaktivního chrómu specifickou CTL.
Tento příklad nyní ukazuje, že in vivo, adenoviry podle vynálezu jsou schopné vytvořit specifickou odpověď CTL. Tento příklad ukazuje, že dvě injekce 109 virových partikulí (pfu) do myší DBA/2 v týdenním intervalu vytvářejí u části z nich silnou specifickou odpověď CTL.
Byly provedeny dvě pokusné série. Postup obou sérií je uveden na Obrázku 4 a 5. V první pokusné sérii (viz Obrázek 4) byly virové částice podávány jedné polovině v peritoneální kavitě a druhé polovině byly podávány pod kůži (ve čtyřech místech). V druhé pokusné sérii (viz Obrázek 5) virové částice byly podávány podkožně injekcemi, intraperitoneálně, intranasálně a intratracheálně. Tyto dvě série pokusů byly provedeny podle následujícího postupu. Myši byly usmrceny 15 dní po druhé sérii injekcí adenovirů. Splenocyty těchto myší byly zkontaktovány s antigenem P815A prostřednictvím buněk L1210A1 (syngenická leukémie transfektovaná s genem PXA mastocytomu P815) ozářené v osmidenní periodě. Jako příklad této kultivace se může uvést směs tumor-lymfocyty (MLTC), lymfocyty řízené proti antigenu P815A, které byly proliferovány a diferencovány ve vražedných lymfocytech T. Tyto jsou uvedeny v kontakt s buňkami značenými radioaktivním chromém. Jedná se o buňky P511, varianta azaguaninu, který je rezistentní k myšímu mastocytomu P815, který nese antigen A a PI.204, varianta stejného mastocytomu, který ztratil antigen A. Tento poslední bude pro kontrolu negativní. Aby se vyloučila každá možnost nespecifické reakce, byly cílové buňky označené radioaktivním chromém uvedeny v přítomnost s syngenickými buňkami (L1210), které nesou na svém povrchu antigen stimulační buňky v MLTC, kromě antigenu A P815.
··
I · · · » * 00
000 · 0 • < 0 ··
Získané výsledky v první pokusné sérii, vyjádřené v procentech specifické lýzy, jsou uvedeny v Tabulkách 3A a 3B.
Získané výsledky v druhé pokusné sérii, vyjádřené v procentech specifické lýzy, jsou uvedeny v Tabulkách 4A a 4B.
V obou případech uvedené výsledky ukazují, myš od myši, úrovně lýzy v poměrných průměrných hodnotách výkonných/cílových (E/T). CTL byly získány z jakéhokoliv místa injektace adenoviru (Tabulka 4A a 4B). Výsledky jasně ukazují, že adenoviry podle vynálezu jsou schopné vytvořit in vivo imunitu proti buňkám, které nesou nádorový antigen.
·· ·· > · ·· ··· · 1 • · <
·« ··
Λ υ
ro
P
Φ c ω .S
I
Cd c
(Ο >
ro
o a cn o\° o\o
34 •H ca ° o o o O CM θ cn cn t—I O O
ΨΊ t—I o t—I
Ό a
υ ro '>1 ro >
01 (O
LO LO CO
LO LO CM
H £ £ Φ c o .5 v
Cd o o LO CM CO (O co
O\o o
CZ τ—I O
C (0 >
O i—I
4-> I Jd Φ ro o Φ a ro a (0 OT £ (0
P
4-)
LO
O LO co CO CM t—I σι o
CM
LO
Q\° co '>Ί
ro ro r0
34 I—I 3 Λ Od i—1 o > O 34 H a co.
rr) Ψ4 Ό
H c <
-r4
t—1 I
(k ra > Φ a
r~4 o LJ •H r0 £
Ψ4 3 •H <
ro cm to r-t <\j σ> i-i
LO LO LO co om οοο
LO 0\° cn cn
O\O
O co xř cm (O
-šT co
LO o\<= lo cn i—I tp
Cd
O o (O r—( ro
P
3
ro o
i—1 ε P '£l 34
on ϊ—1 rO P >Φ
*. o 3 Ό 3
o o P O 3
o r~4 Φ a ε 43
3 o\O
co
pfu/c 500 500 500 500 v-f c
'(0
-P c
o a
m ε 0 ε
H 4-1 <0 ε
O a
m • ·
A*A
A* AA ·· ·· • « · * A A A
AAA · · ·· • AAA A AAA A « • A AAA • A AA AA AA
P
O GI i—I G a O + G G
G tc-l 2 2 G G σ σι a a
LQ O II
II ID r~ CTi a
G σ· a
o
II co cn a
G σ
a ’Ο’
II co
LT) a
G σ
a
Ol lQ
LQ a
G σ
a o
II <D co
P
G a
o o
O o <—1 *» 00 i-1
O) t—1 o O o o o G Φ
Ol 1 P
CO Φ a a a a a a
a σ 2 2 2 2 2 2 o\o
P G G G G G G O
2 G
1 , η σ σ σ σ σ σ
H i—1 r i a a a a a a >N
a r > o o o O O O P
P t 11 II II II II II
< I Ol LQ LQ co Ol O
•xT CO g i—! Ol o CO
o O o O o G
X *► *» P
:—1 :—1 τ—i i—i ϊ—1 t-H
<o a
r !
G
P
G
P a
>P
P
G
P
G a
o
LQ o
LQ
P σ
ca ρ
σ ca i Φ i—I p) P
Φ 2
Φ Φ φ
φ
σ σ • σ • σ σ
P P Ό P Ό P Ρ •
2 2 2 f=íj 2 Ό 2 G
*—' — xí>t < >—' <
__„ c „_ c ,__ ,__ '2
+ + Γ0 + (Ό + p + P
r-i τ—1 > rH > i—1 P t—i P
< < O 0 > o > 0
< < •H < Ή < a < a
G G G G G G •H
G G C G Č G G G G
— —· •rd --' H —' C P
Ή •H
1 1 1 1
a a a a a
P
G a
o
LQ
P o\o
O
LQ >N
P
O g
G υ
P r—|
P
Φ o
G O P I—I p φ
G υ P i—I P Φ
G U P i—I P Φ o
G u P i—I P Φ o
G υ P I—i ρ
φ o
£
P •H
Ό
Φ £
o σ
οι co a
G
G
O
G υ P P 1-1 o P i 1 G υ '2 a Ρ >Φ
f—i G P
P 4—> o P
Φ o Íg o a £ o\° G
··· · • · ·· 4 m
co co co
O «· ·· • * · · • · · · • t ·<· ·· ·· » a ··
Tabulka 3A: Injektované myši rekombinantním adenovirem PIA o (—i OJ l-1 t-q +
o
T~J OJ ,—I
Lf)
Lf) O rLf)
CO o
Lf)
Lf) co o
CN
CN
O 'XT
Lf)
CN co co rH
Γ co co o co
CO co o o co rr•^r
CO
CN co co
ΟΊ
LO co i—I co
Lf) co rrCN
CN
CN
Lf) 'Φ c Φ Ό cn oj + i—j O ,-1 i—i OJ ϊ—I i-q 'Φ c
Φ
Ό
4-1 cn +
o t—I CN t—I i-q
-ςρ
O
OJ <—H íX
Lf) cn o
co
CO Lf) o o o
Lf)
CN
CN
CN rd O o
CN co o o
oooo
CO CO ΟΛ rd r- m cn co xr co o o r*·* o
Γ- CN 1
MTD/CW . 5A94
O O O CN O
CO co
CN co ^r co co
CN
Lf)
ŠT co
CN r-4
CO <—I CN >O >0) a
CO Lf) CN CN r ro o r- co co <Jů Γ m co co co > co
Lf)
CN
CN
CO Lf) CO LO
Lf)
CN
CN
CO
CN
CO CO
Lf) CO CN O CO r-i
CO CN CO rH
O
Lf)
CN
CO CO CO CN
O) CO
O CO Lf) CO Lf) rN t-H O CO CN r** cn
CN >O >ω
B co >o >tf) >1 a
XJ xn >1 a
• · • ·
I · « ··· · c
'(fl >
o >υ λ:
o
G i
CQ rc ro r—) (0
H o
r—I OJ rH
G +
<
o t—4
Ol t-1
G o
i—I CM rH
G
Ό r—I o
υ +
o r—I OJ i—l
G o
rH OJ t—I
G
Ό
I—i O u + o
rH
CM rH
G
-3o
Ol =—i
Oj
LQ cn
LQ
OJ co o
-=31 σ>
lQ
Oj co
CQ
OJ σι o\° vr i-j
-ef OJ
O O\o cn co r~ i—I
O o\° -=31 (—) LQ Ol sO cAP 00 O Γ- r-i o
oOJ
Ol
O o\o
CO o\o cn
LQ '(fl
4-1 c
o
G cn
X (fl £
£ £
-H 4-1
X (0 £
c o
G cn • · ·· ·· ·· · ·
9 9 9 9 9 9 9 9 9
9 99 99999 9999 • · · A A · · • AA AAA AA AA AA AA
Tabulka 4A:
E/T P511 P1.204 P511 + st. L1210 50X1 P511 + st. L1210 50X1
podkožně myš č. 1 490 9 2 0 1
163 5 3 ' 0 0
54 3 1 0 0
18 3 0 0 0
8 2 1 0 0
2 0 0 0 0
myš č.2 50 5 0 0 0
27 3 0 0 0
9 5 0 3 1
3 6 0 0 8
1 4 0 1 0
0, 3 2 0 0 0
ntraperi- toneálně
myš č. 1 258 51 9 48 0
85 43 10 37 0
28 43 8 27 0
9 38 3 12 1
3 18 2 8 0
1 7 0 1 0
myš č.2 295 9 4 9 2
88 8 6 2 0
33 7 4 2 0
11 3 2 1 0
4 1 2 0 0
1 0 0 0 1
myš č.3 400 68 12 76 0
133 77 12 82 0
44 88 14 73 0
15 14 7 66 0
6 10 6 30 0
P1.204 P511 + st.
L1210 50X1
E/T
P511 myš č intratracheálně myš č myš č myš č myš č
• 9 9 9 • 9 9 9 ·
9 9 9 9
999 9 ··· 9 · • 9 9 9 •9 ·· ··
P511 + st. L1210 50X1
3 10 1 14 0
185 8 2 3 0
5 3 0 . 3 0
57 10 2 3 0
8 4 1 2 0
2 3 0 0 0
0,8 2 0 2 0
440 67 11 50 3
247 78 13 52 2
49 64 6 49 0
18 34 8 23 0
6 31 7 9 0
2 14 0 2 0
410 6 7 3 2
137 6 7 3 1
45 6 4 0 1
15 5 2 2 0
9 1 3 0 0
2 1 2 0 2
344 8 2 3 1
115 4 0 2 0
38 8 0 1 0
13 8 0 0 0
4 4 1 0 0
1 1 0 0 0
265 80 9 52 0
85 46 8 47 0
28 42 7 21 0
9 33 3 9 0
3 17 2 2 0
9
9
9 9 9 9
9 9
9 9 9
E/T P511
1 5
myš č. 5 230 2
77 4
25 2
8 2
3 1
1 1
myš č. 6 210 13
70 10
23 6
3 1
3 2
1 2
intrana-
sálně
myš č. 1 430 58
160 52
53 84
18 84
6 51
2 52
myš č. 2 205 4
69 4
83 1
8 5
2 3
0,8 2
myš č. 3 250 1
83 0
28 . 1
9 1
3 1
P1.204 P511 + st. L1210 50X1 P511 + st L1210 50X1
2 1 0
0 1 0
0 . 3 0
0 0 0
0 0 0
1 0 0
2 0 0
2 11 0
0 7 0
0 2 1
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 52 6
0 58 1
4 65 0
2 52 0
2 33 0
0 20 0
0 0 2
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
myš č.
4 4 4 4 4 4
4444 4444 ·
4 4 4 4 • <9 44 44 44 • · 44 4 4 myš č.
E/T P511 P1.204 P511 + st. L1210 50X1 P511 + st L1210 50X1
1 1 0 0 0
280 2 0 1 0
87 8 1 . 0 0
29 1 0 0 0
10 2 0 1 0
3 0 0 0 0
1 1 1 0 0
240 3 0 0 2
80 1 0 0 0
27 . 1 0 0 1
9 1 1 0 0
3 1 0 0 0
1 1 1 1 0
125 0 0 0 0
λ n 4 Z. 0 0 0 0
14 0 0 0 0
5 1 0 0 0
2 0 0 0 1
0, 6 0 0 0 0
• · φ 4 4444 4444 • 4 44 4 4444 4444 4
4 44 4 444
444 444 44 4 4 44 44
Tabulka 4B:
E/T P511 P1.204 P511 + st. L1210 50X1 Pl .204 st. 50X1 + L1210
podkožně myš č.l 300 0 0 0 0
100 0 '0 0 0
33 0 0 0 0
11 0 0 0 0
4 0 0 0 1
1 0 0 0 0
myš č.2 230 4 3 0 1
77 1 1 0 0
25 1 4 0 0
8 0 0 0 0
3 0 0 0 0
1 0 0 0 0
itraperi- toneálně myš č. 1 220 1 2 1 0
73 0 0 0 1
24 1 1 1 2
8 0 0 0 0
3 0 0 0 1
1 0 0 0 0
myš č.2 410 9 1 0 3
137 1 1 0 2
45 0 0 0 0
15 0 1 0 0
5 0 1 0 0
2 0 0 0 0
intratra- cheálně myš č. 1 310 0 0 0 0
103 0 0 0 0
34 0 0 0 0
·» ·· • · · • · · ·· · · · • · · ·· ·· • · ·» ·· • · · · · · · · • · · · · · • © * · · · · · • · · · · ·· · ··· ·* *·
E/T myš č. 2 270
P511 P1.204 P511 L1210
0 0
0 0
0 0
2 1
1 0
0 0
0 0
1 0
1 0
l·- st. P1.204 +
50X1 st. 50X1 L1210
0 0
0 0
0 0
0 1
0 0
0 0
0 0
0 0
0 0
intranasálně myš č. 1 400 myš č. 2 230
25 spont. max.
0 0
1 0
0 0
0 0
3 0
2 0
0 0
0 0
1 0
106 127
1 041 971
spont/ 10% 13% 13% max
0 0
0 1
0 0
0 0
0 1
0 0
0 0
0 0
0 0
122 110
957 988
12%
• »
• · · · ·· · · • · · «· ··
Seznam sekvencí (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 1:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 126 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dvě (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 1:
TTGAATTCGC CGCCATGGAG TCCTTGCAGC TGGTCTTTGG CATTGACGTG 50 AAGGAAGCAG ACCCCACCGG CCACTCCTAT GTCCTTGTCA CCTGCCTAGG 100 TCTCTCCTAT GATGGCTAGA ATTCTT 126 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 2:
(i) charakteristika sekvence:
(A) délka: 44 párů basí (B) typ: nukleotid (C) počet vláken: dvě (D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 2:
AATTCGCCGC CATGGAAGTG GACCCCATCG GCCACTTGTA CTAG 4 4 (1)Informace pro sekvenci SEQ ID NO: 3:
fl ·· 00 00 *· fl 0 «0 0 · 0 0 0 00 0
0 0000 00 00 fl · 00 0 000 0 0000 0
0 ·· 0 000
0*0 ··· 00 00 00 00
35
charakteristika sekvence:
(A) délka: 44 párů basí
(B) typ: nukleotid
(C) počet vláken: dvě
(D) konfigurace: lineární:
(ii) typ molekuly: cDNA (ix) popis sekvence SEQ ID NO: 3:
AATTCGCCGC CATGCTGCCT TATCTAGGGT GGCTGGTCTT CTAG

Claims (19)

1. Defektní rekombinantní adenovirus obsahující, zahrnutou ve svém genomu, nukleovou kyselinu kódující protein nebo specifický peptid nádoru, schopný indukovat imunitní ochranu a destrukci odpovídajících nádorových buněk imunitním systémem.
2. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 1 vyznačený tím, že obsahuje nukleovou kyselinu kódující protein nebo specifický peptid lidského nádoru.
3. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 1 nebo 2 vyznačený tím, že nukleová kyselina vložená do genomu kóduje celek nebo část specifického antigenu melanomu.
4. Defektní rekombinantní adenovirus podle nároku 3 vyznačený tím, že se jedná o nukleovou kyselinu kódující fragment specifického antigenu lidského melanomu, který obsahuje část vyjádřenou CTL ve spojení s molekulami CMJ-I.
5. Defektní rekombinantní adenovirus podle jednoho z předchozích nároků vyznačený tím, že nukleová kyselina kóduje protein nebo peptid, z něho odvozený, vybraný mezi proteiny Mage-1, Mage-3, Bage, Rage a Gage.
6. Defektní rekombinantní adenovirus obsahující, zahrnutou ve svém genomu, nukleovou kyselinu, která kóduje
99 99
99 99
9 9 9 9
9 9 999 9
99 99
9 999
99 9 9 9
9 9 9
99 99 peptid proteinu Mage-1 nebo Mage-3 obsahující část vyjádřenou CTL.
7. Defektní rekombinantní adenovirus obsahující, vloženou ve svém genomu, sekvenci SEQ ID n°l.
8. Defektní rekombinantní adenovirus obsahující, vloženou ve svém genomu, sekvenci obsaženou mezi rezidui 55 až 82 sekvence SEQ ID n’l.
9. Defektní rekombinantní adenovirus obsahující, vloženou ve svém genomu, sekvenci SEQ ID n°2.
10. Adenovirus podle jednoho z předchozích nároků vyznačený tím, že je vybrán mezi lidskými serotypy Ad2 a Ad5.
11. Adenovirus podle jednoho z nároků 1 až 9 vyznačený tím, že je vybrán mezi psími serotypy.
12. Adenovirus podle jednoho z předchozích nároků v yznačený tím, že obsahuje deleci v oblasti El.
13. Adenovirus podle nároku 11 vyznačený tím, že obsahuje mimo jiné deleci v oblasti El.
14. Adenovirus podle jednoho z předchozích nároků v yznačený tím, že nukleová kyselina je vložena do • 9
99 99 99 99
9 9 9 9 9 9 9
9 9 9 9 9 99
9 9999 99 99 9
9 9 9 9 9
99 99 99 99 oblasti El nebo E3 nebo E4.
15. Farmaceutická kompozice obsahující alespoň adenovirus podle jednoho z předchozích nároků.
16. Použití adenoviru podle jednoho z předchozích nároků 1 až 14 pro produkci in vitro nebo ex vivo specifických cytotoxických lymfocytů lidských nádorů.
17. Kompozice obsahující buňky infikované defektním rekombinantním adenovirem podle jednoho z předchozích nároků 1 až 14.
18. Kompozice podle nároku 17 vyznačená tím, že obsahuje buňky nesoucí antigen (APC) infikované defektním rekombinantním adenovirem podle jednoho z předchozích nároků 1 až 14.
19. Postup přípravy specifických cytotoxických buněk T nádorového antigenů obsahující uvedení do kontaktu prekurzor buněk CTL s populací buněk infikovaných virem podle jednoho z nároků 1 až 14.
CZ19982915A 1996-03-14 1997-03-12 Defektní rekombinantní virus nesoucí gen pro nádorově specifický antigen a farmaceutické přípravky obsahující takový virus CZ295967B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9603207A FR2746110B1 (fr) 1996-03-14 1996-03-14 Methode de traitement par therapie genique des tumeurs humaines et virus recombinants correspondants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ291598A3 true CZ291598A3 (cs) 1998-12-16
CZ295967B6 CZ295967B6 (cs) 2005-12-14

Family

ID=9490181

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ19982915A CZ295967B6 (cs) 1996-03-14 1997-03-12 Defektní rekombinantní virus nesoucí gen pro nádorově specifický antigen a farmaceutické přípravky obsahující takový virus

Country Status (19)

Country Link
US (1) US20030082150A1 (cs)
EP (1) EP0889969B1 (cs)
JP (1) JP2000507229A (cs)
KR (1) KR19990087718A (cs)
CN (1) CN1218512A (cs)
AT (1) ATE309382T1 (cs)
AU (1) AU732288B2 (cs)
BR (1) BR9707994A (cs)
CA (1) CA2248612A1 (cs)
CZ (1) CZ295967B6 (cs)
DE (1) DE69734574T2 (cs)
DK (1) DK0889969T3 (cs)
ES (1) ES2252779T3 (cs)
FR (1) FR2746110B1 (cs)
HU (1) HUP9902150A3 (cs)
IL (1) IL126152A0 (cs)
NO (1) NO984052D0 (cs)
SK (1) SK124698A3 (cs)
WO (1) WO1997034009A1 (cs)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU4668797A (en) * 1996-10-07 1998-05-05 Ludwig Institute For Cancer Research Replication-defective adenoviruses for cancer immunotherapy
AU1013601A (en) 1999-10-22 2001-05-08 Aventis Pasteur Limited Method of inducing and/or enhancing an immune response to tumor antigens
ATE346925T1 (de) * 2000-05-10 2006-12-15 Sanofi Pasteur Ltd Durch mage minigene kodierte immunogene polypeptide und ihre verwendungen
JP5089847B2 (ja) * 2001-03-27 2012-12-05 ニューヨーク・ユニバーシティ アルファウイルスに基づく高親和性ラミニン受容体標的化ベクターを用いた腫瘍の治療
ATE369895T1 (de) 2002-04-09 2007-09-15 Sanofi Pasteur Ltd Modifizierte cea nucleinsäure und expressionsvektoren
EP1497412A4 (en) * 2002-04-30 2006-11-22 Avior Therapeutics Inc ADENOVIRUS VECTORS USED IN IMMUNOTHERAPY
CN1327000C (zh) * 2002-09-06 2007-07-18 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 靶向黑色素瘤的可复制性腺病毒穿梭载体及腺病毒
AU2003278036B2 (en) * 2002-10-22 2009-12-10 Aventis Pasteur Limited Anti-cancer vaccines and high-dose cytokines as adjuvants
US8562970B2 (en) * 2003-10-08 2013-10-22 Sanofi Pasteur Limited Modified CEA/B7 vector
SG11201507393TA (en) 2013-03-14 2015-10-29 Salk Inst For Biological Studi Oncolytic adenovirus compositions
PL3198009T3 (pl) 2014-09-24 2022-01-24 Salk Institute For Biological Studies Onkolityczne wirusy nowotworowe i sposoby zastosowania
JP7015551B2 (ja) 2016-02-23 2022-02-15 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ ウイルス動態への影響を最小限にするための治療用アデノウイルスにおける外因性遺伝子発現
JP7054527B2 (ja) 2016-02-23 2022-04-14 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ アデノウイルスの複製動態を測定するための高スループットアッセイ
WO2018111767A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Salk Institute For Biological Studies Tumor-targeting synthetic adenoviruses and uses thereof
JP7430395B2 (ja) 2018-04-09 2024-02-13 ソーク インスティテュート フォー バイオロジカル スタディーズ 複製特質が増強された腫瘍溶解性アデノウイルス組成物

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5342774A (en) * 1991-05-23 1994-08-30 Ludwig Institute For Cancer Research Nucleotide sequence encoding the tumor rejection antigen precursor, MAGE-1
US6235525B1 (en) * 1991-05-23 2001-05-22 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid molecules coding for tumor rejection antigen precursor MAGE-3 and uses thereof
US5620886A (en) * 1993-03-18 1997-04-15 Ludwig Institute For Cancer Research Isolated nucleic acid sequence coding for a tumor rejection antigen precursor processed to at least one tumor rejection antigen presented by HLA-A2
CN1115414C (zh) * 1993-07-13 2003-07-23 罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司 用于基因治疗的病毒载体

Also Published As

Publication number Publication date
CN1218512A (zh) 1999-06-02
SK124698A3 (en) 1999-05-07
DE69734574T2 (de) 2006-07-13
BR9707994A (pt) 1999-07-27
JP2000507229A (ja) 2000-06-13
NO984052L (no) 1998-09-03
KR19990087718A (ko) 1999-12-27
HUP9902150A3 (en) 2000-12-28
AU2164197A (en) 1997-10-01
CZ295967B6 (cs) 2005-12-14
ES2252779T3 (es) 2006-05-16
CA2248612A1 (fr) 1997-09-18
EP0889969B1 (fr) 2005-11-09
IL126152A0 (en) 1999-05-09
ATE309382T1 (de) 2005-11-15
AU732288B2 (en) 2001-04-12
NO984052D0 (no) 1998-09-03
EP0889969A1 (fr) 1999-01-13
FR2746110B1 (fr) 1998-04-17
DE69734574D1 (de) 2005-12-15
WO1997034009A1 (fr) 1997-09-18
FR2746110A1 (fr) 1997-09-19
HUP9902150A2 (hu) 1999-11-29
US20030082150A1 (en) 2003-05-01
DK0889969T3 (da) 2006-03-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP7554119B2 (ja) 共有抗原
JP3759738B2 (ja) 免疫原性ペプチド
JP5640237B2 (ja) 癌関連抗原をコードする単離された核酸分子、その抗原そのものおよびその使用
JP2022174123A (ja) マイクロｒｎａ認識エレメントを含むｃｍｖベクター
CZ295967B6 (cs) Defektní rekombinantní virus nesoucí gen pro nádorově specifický antigen a farmaceutické přípravky obsahující takový virus
KR20190064624A (ko) 주요 조직적합성 복합체 분자에 의해 제한된 t 세포를 유발하는 사이토메갈로바이러스 벡터
JP2003512829A (ja) 改変型ｇｐ１００およびその使用
JP5148116B2 (ja) 癌胎児性抗原融合タンパク質及びその使用
JP3816959B2 (ja) 肝細胞癌の予防および処置
US20070104685A1 (en) Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and uses thereof
WO2006023598A2 (en) Prostate-specific antigen-derived mhc class ii-restricted peptides and their use in vaccines to treat or prevent prostate cancer
MXPA98007290A (en) Recombinant adenoviral vectors for the genuine therapy of the huma tumors
CN101001869B (zh) 癌胚抗原融合物和其用途
EP1658370A1 (en) Synthetic gene encoding rhesus monkey carcinoembryonic antigen and uses thereof
WO2024192085A1 (en) Recombinant oncolytic adenovirus for cancer therapy
WO2000060068A1 (fr) Sequences de bases d&#39;expression genique utilisees a des fins therapeutiques et medicaments utilises en therapie genique
ZA200508013B (en) Synthetic gene encoding human carcinoembryonic antigen and use thereof
HK1260171A1 (en) Cmv vectors comprising microrna recognition elements
MXPA06009202A (en) Carcinoembryonic antigen fusions proteins and uses thereof
WO2004015098A2 (en) Rhesus epithelial cell adhesion molecule, nucleic acid encoding the same, and uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic