CZ291754B6 - Proteinový chimerní receptor, terapeutická buňka, DNA kódující chimerní receptor a vektor - Google Patents

Abstract

Je pops na metoda sm rov n bun n odpov di u savc exprimov n m chimern ch receptor v bu ce savc , kter zp sobuj , e bu ky specificky rozpozn vaj a ni infek n agens, bu ku infikovanou infek n m agens, n dorovou nebo rakovinnou bu ku nebo autoimunitn generovanou bu ku. Proteinov² chimern receptor sest v z (a) intracelul rn sti, kter je schopna specificky rozpozn vat a v zat c lovou bu ku nebo c lov infek n agens a (b) z extracelul rn sti protein- tyrosin kin zy, kter je schopna signalizovat terapeutick bu ce, aby likvidovala c lovou bu ku v zanou receptorem nebo c lov infek n agens v zan receptorem. Tak jsou pops ny bu ky, kter exprimuj chimern receptory a DNA k duj c chimern receptory.\

Description

Oblast techniky

Vynález se týká proteinového chimemího receptorů vázaného k membráně terapeutické buňky, dále terapeutické buňky, která exprimuje proteinový chimerní receptor, dále je popsána DNA kódující chimerní receptor a vektor zahrnující chimerní receptor kódovaný s uvedenou DNA.

Vynález se týká funkce protein-tyrosin kinázy chimerasy, která je schopna přesměrování funkce imunitního systému. Konkrétněji se týká regulace lymfocytů, makrofágů, přirozených zabiječských buněk nebo granulocytů expresí chimeras v uvedených buňkách, které způsobují, že tyto buňky reagují na cíle rozpoznané chimarasami. Vynález se také týká funkčních protein-tyrosin kinázy chimerasy, která je schopná směrovat terapeutické buňky, aby rozeznaly a zničily buňky infikované specifickým infekčním agens, samotné infekční agens, nádorové buňky nebo buňky vzniklé auto imunitou. Konkrétněji vynález popisuje přípravu protein-tyrodin kinázy schopné směrovat cytotoxické Tlymfocyty ke specifickému rozeznání a lýzi buněk, které produkují HTV obalové proteiny. Vynález popisuje dále terapii chorob jako je AIDS (Syndrom získané imunidificience), které je způsobeno virem HIV.

Dosavadní stav techniky

Rozeznání antigenu T buňkou prostřednictvím receptorů T buněk je základem řady imunologických jevů. T buňky určují tzv. terapeutická buňkami zprostředkovanou imunitu. To zahrnuje zničení cizích tkání nebo infikovaných buněk buňkami imunitního systému. Existují různé druhy T buněk, včetně „pomocných“ buněk a suppressorových buněk, které tlumí imunitní odpověď, a cytotoxických (nebo „zabij ečských“) buněk, které mohou abnormální buňky přímo zabíjet.

T buňka, která rozezná a naváže specifický antigen na povrchu jiné buňky se aktivuje; může se pak zmnožit, a pokud je to cytotoxická buňka, může navázanou buňku zabít.

Autoimunitní choroba je charakterizována produkcí buď protilátek, které reagují s hostitelskou tkání, nebo s imunitními efektorovými T buňkami, které jsou autoreaktivní. V některých případech autoprotilátky mohou vznikat při normální odpovědi T- a B-buněk aktivovaných cizími látkami nebo organismy, které obsahují antigeny křížově reaktivní s podobnými sloučeninami tělesných tkání. Příkladem klinicky relevantních autoprotilátek jsou protilátky proti acetylcholinovým receptorům při myasthenii gravis; a anti-DNA, anti-erythrocytové protilátky a protilátky proti krevním destičkám při systematické lupus erythematosus.

HIV a imunopathogenese

V roce 1984 bylo objeveno, že HTV je etiologickým agens AIDS. Od té doby byla definice AIDS mnohokrát revidována vzhledem k tomu, jako kritéria mohou být zahrnuta do diagnózy. Avšak přes změny v diagnostických parametrech hlavním jednoduchým příznakem AIDS je infekce HIV a následný rozvoj persistentních konstitučních symptomů a AIDS definovaných chorob jako jsou sekundární infekce, neoplasmosa a neurologické choroby. Harrisonů Principles of Intemal Medicine, 12. vyd., McGraw Hill (1991).

HIV je lidský retrovirus ze skupiny lentivirů. Čtyři popsané lidské retroviry patří do dvou různých skupin: lidské T lymfotropní (nebo leukemické) retroviry, HTLV-1 a HTLV-2, a lidské imunodeficitní viry, HTV-1 a HIV-2. První skupina jsou transformující viry, zatímco druhá skupina jsou cytopatické viry.

-1 CZ 291754 B6

HTV-1 byl objeven jako obvyklá příčina AIDS ve světě. Homologická sekvence mezi HIV-2 a HIV-1 je asi 40%, HTV-2 je více příbuzná s některými členy skupiny opičích imunodefícientních virů (SIV). Viz Curran, J. a kol., Science, 329: 1 357-1 359 (1985); Weiss, R. a kol., Nátuře, 324: 572-575 (1986).

HIV má běžně retrovirální geny (env, gag, a pol) stejně jako šest speciální genů, které zahrnují replikační a další biologické aktivity virů. Jak byl řečeno dříve, obvyklým znakem AIDS je hluboká imunosuprese, převážně buňkami zprostředkované imunity. Imunosuprese vede k různým oportunním chorobám, konkrétně různým infekcím a neoplasmose.

Hlavní příčinou porušení imunity při AIDS bylo definováno jako kvalitní a kvantitativní nedostatek podskupiny lymfocytů indukovaných thymem (T), skupiny T4. Tato podskupina je definována fenotypicky přítomností CD4 povrchových molekul, které jsou buněčnými receptory pro HIV. Dalgleish a kol., Nátuře. 312: 763 (1984). I když buňky T4 jsou hlavním buněčným typem infikovaným HIV, v podstatě jakákoliv lidská buňka která je schopná tvořit molekuly CD4 receptorů na svém povrchu je schopná vázat HTV a být jimi infikována.

Obvykle u CD4⁺T buněk je popisována role pomocných buněk/induktorů, jejich funkce spočívá v poskytnutí aktivačního signálu B buňkám, nebo indukování T lymfocytů, které mají odpovídající CD8 znak, čímž vznikají cytotoxické/supresorové buňky. Reinhenz a Schlossman, Cell. 19: 821-827 (1980); Goldstein a kol., Immunol. Rev.. 68: 5-42, (1982).

HTV se váže specificky a s vysokou afinitou, přes řetězec aminokyselin na virovém obalu (gpl20), na část oblasti VI na molekule CD4, lokalizované blízko N-konce. Po navázání virus fúzuje s buněčnou membránou a proniká dovnitř. Když pronikne dovnitř, použije enzym reverzní transkriptasu k přepisu jeho genomové RNA do DNA, která je integrována do buněčné DNA, kde potom přežívá jako „provirus“.

Provirus může zůstávat latentní nebo je aktivován, dochází k transkripci mRNA a genomové RNA, které vede k syntéze proteinu, novému vytvoření virionua vypučení viru z povrchu buňky. I když přesný mechanismus, kterým virus způsobuje smrt buňky, nebyl dosud objasněn, je zřejmé, že hlavním mechanismem je masivní pučení z buněčného povrchu, které vede k rozvrácení plasmatické membrány a výsledné osmotické nerovnováze.

Během průběhu infekce hostitelský organismus produkuje protilátky proti proteinům viru, včetně hlavních obalových glykoproteinů gpl20 a gp41. Přes tuto humorální imunitu choroba pokračuje a ústí do letální imunosuprese, která je charakterizována mnohonásobnými oportunními infekcemi, parasitémií, demencí a smrtí. Neúspěch hostitelských antivirových protilátek zabránit rozvoji choroby představuje jeden z nejobtížnějších aspektů infekce, a naznačuje neúspěch při aplikaci očkování založeného na konvenčním přístupu.

Dva faktory hrají roli v účinnosti humorální odpovědi na virus imunodeficience. Za prvé, stejně jako ostatní RNA viry (a konkrétněji jako retroviry), viry imunodeficience vykazují vysokou úroveň mutace jako odpovědi na hostitelskou imunitní kontrolu. Za druhé samotné obalové glykoproteiny jsou silně glykosylované molekuly a představují málo epitopů vhodných pro vazbu protilátek s vysokou afinitou. Slabě antigenní cíle, které představují virové obaly, poskytují hostiteli malou příležitost pro omezení virové infekce specifických protilátek.

Buňky infikované virem HTV produkují na svém povrchu gpl20 glykoprotein. Gpl20 zprostředkovává spojení mezi CD₄+ buňkami reakcí podobnou jako když virus vstupuje do neinfikovaných buněk, což vede ke vzniku vícejademých obřích buněk s krátkou životností. Vznik syncytia závisí na přímé interakci gpl20 obalové glykoproteinů sCD4 proteinem. Dalgleish a kol., viz výše; Klatzman, D. a kol, Nátuře, 312: 763 (1984); McDougal, J. S. a kol.,

-2CZ 291754 B6

Science, 231: 382 (1986); Sodroski, J. a kol., Nátuře, 322: 470 (1986); Lifton, J. D. a kol, Nátuře, 323: 725 (1986), Sodroski, J. a kol., Nátuře, 321: 412 (1986).

Je zřejmé, že vazba CD4-gpl20 je odpovědná za virovou infekci buněk nesoucích CD4 antigen a mezi gpl20 a CD4 je tvořen specifický komplex. McDougal a kol., viz výše. Ostatní výzkumy ukázaly, že linie buněk, které jsou neinfikovatelné pro HIV, byly přeměněny na infikovatelné řady buněk následující expresí lidského CD4 cDNA genu. Maddon a kol., Cell, 46: 333-348 (1986).

Byly navrženy terapeutické programy založené na rozpustném CD4 jako pasivním agens, které zasahuje do virové absorpce a syncytiem zprostředkované buněčné infekce, které byly úspěšné demonstrovány in vitro množstvím skupin (Deen a kol., Nátuře, 3321: 82-84(1988); Fisher a kol., Nátuře. 331: 76-78(1988), Hussey a kol., Nátuře, 331: 78-81 (1988); Smith a kol., Science. 238: 1 704-1 707 (1987); Traunecker a kol., Nátuře. 331: 84-86 (1988); a následně byly objeveny CD4 imunoglobulinové fuzní proteiny s prodlouženým poločasem rozpadu a mírnou biologickou aktivitou (Capon a kol., Nátuře. 337: 525-531 (1989); Traunecker a kol. Nátuře, 339, 68-70 (1989); Bym a kol., Nátuře 344, 667-670 (1990); Zettlmeissl a kol. DNA Cell Biol. 9: 347-353 (1990). Ačkoliv CD4 imunotoxinové konjugáty nebo spojovací proteiny vykazují silnou cytotoxicitu pro infikované buňky in vitro (Chaudhary a kol., Nátuře, 335: 369-372 (1988); Till a kol., Science, 242, 1 116-1 168 (1988)), je vzhledem k latenci syndromu imunodeficience nepravděpodobné, že by při eliminaci virového napadení organicsmu byla účinná jakákoliv jednorázová terapie, a antigenicita cizích spojovacích proteinů je pravděpodobně limitem jejich přijatelnosti při léčení vyžadujícím opakované dávky. Zkoušky s opicemi s použitím STV ukázaly, že rozpustný CD4, pokud je podán zvířatům bez výrazné CD4 cytopenie, může snižovat titr SIV a zlepšit in vitro měření myeloidního potenciálu (Watanabe a kol., Nátuře, 337: 267-270(1989)). Avšak po přerušení léčení bylo pozorováno okamžité opětovné zhoršení, předpokládá se, že jako prevence progresivního oslabení imunitního systému bude nutné celoživotní podávání.

Povrchový buněčný receptor-spoj ovací protein-tyrosin dinasy

Počáteční impuls pro spuštění buněčných efektorových procesů v imunitním systému je často buněčné rozpoznání seskupených ligandů. Mezi receptory, o nichž je známo, že přenášejí aktivační signály na seskupení patří antigenní receptory B a T buněk (DeFranco, 1992, Eur. J. Biochem. 210: 381-388, Weiss, 1991, Annu. Rev. Genet. 25:487-510), členové receptorové skupiny IgG a IgE Fc (Fanger a kol., 1989, Immunol. Today 10: 92-99; Ravetch a Kmet, 1991, Annu. Rev. Immunol. 9: 457-492) a množství přídavných receptorů, včetně CD2, CD4, CD8 aCD28 na T buňkách (Yokoyama a Shevach, 1989, Year immunol. 4: 110-146, CD 19, CD20, CD21 a CD40 na B buňkách (Clark a Ledbetter, 1989, Adv. Cancer Res. 52: 81-149), a CD44, CD45 a CD58 na monocytech (Webb a kol., 1990, Science 249: 1 295-1 297). Navíc velké množství fosfolipidových proteinů podporuje buněčnou aktivaci v závislosti na antigenních receptorech 1989, Immunol. Ser. 45: 411-416; Kroczek a kol., 1986, Nátuře 322: 181-184; Yeh a kol., 1987, J. Immunol. 138: 91-97; Yokoyama a Shevach, 1989, Year immunol. 4: 110-146).

V tomto případě není jasné, jak jednoduchý fyzikální děj, agregace, má za následek tak významný fyziologický signál.Spřažení buněčných efektorových procesů zprostředkovaných antigenními receptory T a B buněk, a různými formami Rc receptorů,. může být imitováno křížovou vazbou chimemích proteinů nesoucích intracelulámí domény individuálních řetězců receptorovýcgh komplexů (Irving a Weiss, 1991, Cell 64: 891-901; Kolaunus a kol., 1992, EMBO J. 11: 4 861-4 868; Letoumeur a Klusner, 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 8 905-8 909; Letoumeur a Klausner, 1992, Science255: 79-82; Romeo a Seed, 1991, Cell 64: 1 037-1 046; Wegener a kol., 1992, Cell 68: 83-95). Bylo objeveno, že minimálně účinné spouštěcí prvky vyžadují fylogeneti<?kou ochranu (Reth, 1989, Nátuře 338: 383-384) peptidové sekvence obsahující dva tyrosinové zbytky separované 10 nebo 11 zbytky a vložené v hydrofilním, obvykle kyselém okolí (Romeo a kol., 1992, Cell 68: 889-897; Irving a kol.,

-3 CZ 291754 B6

1993, J. Exp. Med. 177,1 093-1 103). Seskupení receptorů nesoucích tyto prvky iniciuje aktivaci kaskády, pro kterou se jeví nezbytná aktivita proteinu tyrosin kinázy (PTK); PTK inhibitory blokují jak časné procesy aktivace B a T buněk jako je mobilizace kalcia, tak pokračování uvolňování cytokinu a buněčnou proliferaci (June a kol., 1990, J. Immunol. 164: 715-722; Mustelin a kol., 1990, Science 247: 1 584-1 587; Stanley a kol., 1990, J. Immunol. 145: 2 189-2 298). Ačkoliv důsledky pozdních procesů aktivace receptorů se liší podle typu buňky, časné procesy jsou výrazně podobné mezi buňkami z různých hematopoetických linií. Například byl pozorován vzestup PTK aktivity po křížové vazbě antigenního receptorů B buňky. (Gold a kol., 1990, Nátuře 345: 810-813; Campbell a Sefton, 1990, EMBO J. 9: 2 125-2 131), antigenního receptorů T buňky (June, C. H., a kol., 1990, Proč. Nati. Acad. sci. USA 87: 7 722-7 726; June, C. H., a kol., 1990, J. Immunol. 144: 1 591-1 599) a vysokoafinitního IgE receptorů (Eiseman a Bolen, 1992, Nátuře 355: 78-80; Li a kol., 1992, Mol. Cell. biol. 12: 3 176-3 182), všechny mají mezi svými cíli časné fosforylace γ isoformu fosfatidylinositolspecifícké fosfolipasy C (Carter a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Aci. USA 88: 2 745-2 749; Li a kol., 1992, Mol. Cell Biol., 12:3 176-3 182; Park a kol., 1991, J. Biol. Chem. 266: 24 237-24 240; Park a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci USA 88: 5 453-5 456; Secrist a kol.,

1991, J. Biol. Chem. 266: 12 135-12 139; Weiss a kol., 1991, Annu. Rev. Genet. 25: 487-510), která je přímo aktivována tyrosinovou soforylací (Nishibe a kol., 1990, Science 250: 1 253-1 256).

Aktivity PTK spjaté s receptory buněčného povrchu spadají do dvou skupin: první patří do skupiny příbuzné Src proto-onkogen kinázám a druhé jsou příbuzné Syk kináze. V první skupině, Fyn kináza je spojena s receptory T buněk (Gassmann a kol., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 283-286; Samelson a kol., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 4 358^1362) u Lyn, Fyn, Blk a Lek kináz bylo zjištěno, že jsou spojeny s IgM receptorem B buněk (Burkhardt a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7 410-7 414; Campbell a Sefton, 1992, Mol. Cell. Biol. 12:2 315-2 321; Yamanashi a kol., 1991, Science251: 192-194), a u Lyn a Yes kináz bylo zjištěno, že jsou spojeny s vysoce afinitním IgE receptorem (Eiseman a Bolen, 1992, Nátuře 355: 78-80; Hutchcroft a kol., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 107-9 111; Hutchcroft, J. E., a kol., 1992, J. biol. Chem. 267: 8 613-8 619). Mechanismus pozorovaného spojení nebyl studován detailně, ale předběžné údaje předpokládaly, že intracelulámí domény komplexních řetězců receptorů jsou fyzikálně spojeny s Src skupinou kináz (Clark a kol., 1992, Science 258: 123-126; Timson a Gauen a kol., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5 438-5 446). Dosud není jasné, jestli tato spojení jsou přímá nebo nepřímá.

Až do dnešního dne nejzávaznější důkaz důležitosti Src kináz v aktivaci buňky plynul ze studie Fyn a Lek kináz v T buňkách. Přílišná exprese Fyn u transgenních myší vede antigenně přecitlivělému fenotypu u výsledných buněk, zatímco přílišná exprese katalyticky inaktivní formy blokuje receptory T buňky zprostředkované proliferaci (Cooke a kol., 1991, Cell 65: 281-291). Thymové T buňky izolované z mutovaných myší postrádající Fyn kinázovou aktivitu vykazují hluboký nedostatek ve schopnosti zahájit proliferativní odpověď jako odpověď na léčení kombinací forbolesteru a buď anti-CD3 protilátky, nebo Concanavalinu A (Appleby a kol., 1992, Cell 70: 751-763; Stein a kol., 1992, Cell 70: 741-750). Slezinné buňky izolované z těchto myší ukázaly menší než kritické ale významné snížení buněčné aktivační odpovědi (Appleby a kol.,

1992, Cell 70: 751-763; Stein a kol., 1992, Cell 70: 741-750). VT buňkách je Lek kináza spojena nepřímo s TCR přes CD4 a CD8 koreceptory Rudd a kol., 1988, Proč. Nati. Adac. Sci. USA 85: 5 190-5 194; Shaw a kol., 1989, Cell 59: 627-636; Turner a kol., 1990, Cell 60: 755-765; Veillette a kol., 1988, Cell 55: 301-308). Přílišná exprese Led v buněčné linii, která antigenně odpovídá, potenciuje citlivost receptorů podobným způsobem jako Fyn (Abraham a Veillette, 1990, Mol. Cell. Biol. 10: 5 197-5 206; Davidson a kol., 1992, J. Exp. Med. 175: 1 483-1 492; Luo a Sefton, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 4 724-4 732). U hybridomového modelu CD4-ďependentní myší T buňky bylo dosaženo rekonstituce antigenně specifické pomahačské funkce pouze s CD4 molekulami, které jsou schopné interakce s Lek (Glaichenhaus a kol., 1991, Cell 64:511-520).

-4CZ 291754 B6

Ovšem nej silnější důkaz přímé účasti Lek kinázy vantigenní receptorově zprostředkované signalizace vychází ze studií mutantních buněčných linií, které postrádají Lek. Byly studovány dvě takovéto linie, jedna je odvozena z Jurkatské linie lidských T buněk leukémie (Goldsmith aWeiss, 1987, Proč. Nat. Ačad. Sci. USA 84: 6 879-6 883; Straus a Wiess, 1992, Cell 70: 585-593) a druhá z cytotoxického buněčného klonu CTLL-2 (Kamitz a kol., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 4 521-4 530). Obě Lck-negativní mutantní linie mají defektní TCR zprostředkovanou signalizaci, a komplementací obou mutantních linií transfekcí s Lek expresním plazmidem je navrácena citlivost kTCR křížovému podmětu (Kamitz a kol., 1992, Mol., Cell. Biol. 12: 4 521-4 530; Straus a Weiss, 1992, Cell 70: 585-593).

Nedávno bylo objeveno, že členové skupiny tyrosinových kináz, původně representované blízce příbuznými nebo identickými kinázami Syk (Taniguchi a kol., 1991, J. Biol. Chem. 266: 15 790-15 796) a PTK 72 (Zioncheck a kol., 1986, J. Biol. Chem. 261:15 637-15 643; Zioncheck a kol., 1988, J. Biol. Chem. 263:19 195-19 202), jsou spojeny s buněčnými povrchovými receptory. Ačkoliv nebylo definitivně dokázáno, že PTK 72 a Syk jsou identické, mají společnou tkáňovou distribuci (thymus a slezina), molekulovou hmotnost a labilitu k proteolýze. Bylo objeveno, že PTK 72 je spojen s IgM receptorem B bunňky (Hutchcroft a kol., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 107-9 111; Hutchcroft, J. E., a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8 613-8 619) a že je fosforylován přes křížovou vazbu receptorů s anti-IgM (Hutchcroft a kol., 1991, J. Biol. Chem. 266:14 846-14 849). Po křížové vazbě povrchově IgM byla demonstrována průvodní aktivace enzymu, měřená autofosforylací a fosfoiylací exogenních proteinových fragmentů (Hutchcroft a kol., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 107-9 111; Hutchcrfot, J. E., a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8 613-8 619). Také bylo objeveno, že PTK 72 je spojena s vysokoafinitním IgE receptorem v linii krysích basofilních leukemických buněk (Hutchcrfot a kol., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 107-9 111; Hutchcroft. J. E., a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8 613-8 619).

Ukázalo se, že druhý člen skupiny Syk, ZAP-70, spojuje PTK s zeta řetězcem receptorů T buňky a následuje křížová vazba receptorů (Chán a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 9 166—9 170).

Ačkoliv exprese ZAP-70, Fyn nebo Lek v COS buňkách vede k mírnému vzrůstu celkového buněčného tyrosin-fosfátu, koexprese ZAP-70 a buď Lek, nebo Fyn vede k dramatickému zvýšení v systému tyrosinové fosforylace (Chán a kol., 1992, Cell 71: 649-662). Pokud je také přítomen CD8-zeta chimemí řetězec, chiméra začne fosfoiylovat a ZAP-70 je s ní spojen (CHan a kol., 1992, Cell 71: 949-662). V tomto případě není jasné, zda ZAP-70 aktivuje skupinu Src kináz a/nebo naopak, ani proč koexprese kináz v COS buňkách může vést k jasné konstitutivní aktivaci. Proto aktivní spojení ZAP-70 s křížovou vazbou TCR svědčí o roli PTK v šíření receptorově odpovědi.

Na rozdíl od skupiny Src kináz, Syk a ZAP-70 nesou dvě SH2 domény a žádné N-koncové myristoylační místo (Taniguchi a kol., J. Biol. Chem. 266: 15 790-15 796; Chán a kol., Cell 71: 949-662). Přirozený předpoklad pro mechanismus spojení kináza-receptor je takový, že dvě SH2 domény váží dva tyrosiny spouštěcího mechanismu antigenního receptorů, jakmile jsou fosforylovány. Ovšem toto stále zůstává spíše hypotézou.

Podstata vynálezu

Tento vynález popisuje proteinový chimemí receptor výrazný k membráně terapeutické buňky, který sestává z (a) intracelulámí části protein-tyrosin kinázy, která je schopna signalizovat terapeutické buňce, aby likvidovala cílovou buňku vázanou receptorem nebo cílové infekční agens vázané receptorem, a (b) extracelulámí části, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, přičemž tato terapeutická buňka je schopna specifického rozpoznávaní a likvidace cílové buňky nebo cílového infekčního agens.

-5CZ 291754 B6

Proteinový chimemí receptor podle vynálezu zahrnuje protein-tyrosin kinázu ze skupiny Syk kináz a s výhodou se jedná o syk protein-tyrosin kinázu.

Intracelulámí část (a) proteinového chimemího receptoru podle vynálezu zahrnuje lidské Syk aminokyseliny 336-628 nebo vepřové Syk aminokyseliny 338-630.

Extracelulámí část proteinového chimemího receptoru zahrnuje HIV část CD-4 vázající obal a dále zahrnuje ligand-vázající část receptoru - vázající část ligandu, antigen - vázající část protilátky nebo jejich funkční derivát.

Dále vynález popisuje terapeutickou buňku, která exprimuje proteinový chimemí receptor vázaný k membráně, který sestává z (a) intracelulámí části protein-tyrosin kinázy, která je schopna signalizovat terapeutické buňce, aby likvidovala cílovou buňku vázanou receptorem, nebo cílové infekční agens vázané receptorem a (b) extracelulámí části, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, přičemž tato terapeutická buňka je schopna specifického rozpoznávání a likvidace cílové buňky nebo cílového infekčního agens a rovněž terapeutickou buňku, která exprimuje druhý proteinový chimemí receptor vázaný k membráně, přičemž tento druhý chimemí receptor sestává z (a) intracelulámí části druhé protein-tyrosin kinázy, která je schopna signalizovat terapeutické buňce, aby likvidovala cílovou buňku vázanou receptorem nebo cílové infekční agens vázané receptorem a (b) extracelulámí části, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, přičemž tato terapeutická buňka je schopna specifického rozpoznávání a likvidace cílové buňky nebo cílového infekčního agens.

V terapeutické buče podle vynálezu je protein-tyrosin kináza ze skupiny Syk kináz s výhodou se jedná o Syk protein-tyrosin kinázu.

Intracelulámí část terapeutické buňky podle vynálezu zahrnuje lidské Syk aminokyseliny 336-628 nebo vepřové Syk aminokyseliny 338-630.

V terapeutické buňce podle vynálezu je jedna z protein-tyrosin kináz ze skupiny Syk kináz a jiná protein-tyrosin kináza je ze skupiny Src kináz, přičemž jedna z protein-tyrosin kináz je ZAP-70 a jiná protein-tyrosin kináza je Fyn a nebo se v případě jiné protein-tyrosin kinázy může jednat o Lek. ZAP-70 část terapeutické buňky podle vynálezu zahrnuje lidský ZAP-70 Tyr 369.

S výhodou je terapeutická buňka podle vynálezu vybrána ze skupiny sestávající Z. (a) T lymfocytů; (b) cytotoxických T lymfocytů; (c) buněk přirozených zabíječů; (d) neutrofilů; (e) granulocytů; (f) makrofágů; (g) mastocytů; (h) buněk HeLa a (i) embryonálních kmenových buněk (ES).

Cílovým infekčním agens pro terapeutickou buňku je virus selhání imunity.

Extracelulámí část terapeutické buňky zahrnuje HIV část CD-4 vázající obal a dále ligand - vázající část receptoru, receptor - vázající část ligandu, antigen - vázající část protilátky nebo jejich funkční derivát.

Dále je terapeutická buňky podle vynálezu charakterizována tím, že má vazebnou část MHC- nezávislou.

Dále je předmětem předloženého vynálezu DNA kódující chimemí receptor popsaný výše a vektor, který zahrnuje chimemí receptor kódovaný DNA.

Předkládaný vynález ukazuje proveditelnost vytvoření chimér mezi intracelulámí doménou protein-tyrosin kinázové molekuly a extracelulámí doménou, které je schopná splnit rozpoznání

-6CZ 291754 B6 cíle. Konkrétně shlukování chimér nesoucích Syk nebo ZAP-70 kinázové sekvence spouští mobilizaci kalcia. Agregace pouze Syk chiméry nebo koagreagace chimér nesoucích Fyn nebo Lek a ZAP-70 kináz postačují k iniciaci cytolytické efektorové funkce. Tato efektorová funkce usnadňuje specifické rozpoznání a zničení nežádoucích cílových buněk, například patogenů, patogeny infikovaných buněk, nádorových buněk nebo autoimunitních buněk.

Podle tohoto vynálezu může být připraven jakýkoliv počet použitelných chimemích molekul, např. struktura chimér, skládající se z intracelulámí části protein-tyrosin kinázy napojené na extracelulámí část vhodné konstrukce protilátkové molekuly, která umožňuje cílení rozpoznávacího potenciálu buněk imunitního systému tak, že je specificky přesměrován na antigen rozpoznaný extracelulámí protilátkovou částí. Tak s protilátkovou částí schopnou rozpoznat některé determinanty na povrchu patogenů by buňky imunitního systému vybavené chimerasami odpovídaly na přítomnost patogenů s efektorovým programem vhodným podle jejich linie, tj. pomahačské T lymfocyty by odpovídaly cytotoxickou aktivitou proti cíli a B lymfocyty by byly aktivovány k produkci protilátky. Makrofágy a granulocyty by prováděly své efektorové programy, včetně uvolnění cytokinů, fagocytosy a generování reaktivního kyslíku. Takto spolu s protilátkovou částí schopnou rozpoznání nádorových buněk, by byla odpověď imunitního systému na nádor vhodně zvýšena. Spolu s protilátkou schopnou rozpoznání imunitních buněk, které mají nežádoucí reaktivitu s vlastními determenantami, autoreaktivní buňky mohou být selektivně cíleny pro destrukci.

Ačkoliv tyto příklady jsou zaměřeny na použití protilátkových chimér jako vhodný prostředek, vynález není omezen rámcem protilátkových chimér, a použití specifických neprotilátkových extracelulámích domén může jistě mít významné výhody. Například s extracelulámí částí, která je receptorem pro viry, bakterie nebo parazity, budou buňky vybavené těmito chimermi specifickými cílovými buňkami, vykazujícími virální, bakteriální nebo parasitické determenanty. Výhoda tohoto přístupu oproti použití protilátek je v tom, že přirozený receptor pro patogeny by mohl mít mimořádně vysokou selektivitu nebo afinitu pro patogeny, což umožňuje dosáhnout vyššího stupně přesnosti výsledné imunitní odezvy. Podobně, aby se z imunitního systému odstranily buňky, které nevhodně reagují s vlastním antigenem, postačuje připojení antigenu (buď jako inaktivního proteinu, v případě terapií deplece B buněk, nebo jako MHC komplex v případě terapií deplece T buněk) k intracelulámím protein-tyrosin kinázovým řetězcům, a tak dojde k ovlivnění specifického cílení buněk, které nevhodně reagují na své determinanty.

Další použití chimér je v kontrole buněčných populací in vivo, která následuje po předchozích genetickoinženýrských manipulacích. Např. bylo navrženo využití lymfocytů, které se infiltrují do nádoru, nebo zabij ečských buněk k cytotoxickým účelům v nádoru. Předkládaný vynález poskytuje běžné prostředky, kterými se reguluje počet a aktivita takových lymfocytů a buněk, aniž by se vyjímaly z těla pacienta pro amplifikaci in vitro. Protože intracelulámí domény chimemích receptorů mediují proliferativní odpovědi buněk, koordinace extracelulámích domén různými agregačními stimuly, které jsou specifické pro extracelulámí domény (např. protilátka specifická pro extracelulámí doménu) povedou k proliferaci buněk nesoucích chiméry.

Ačkoliv konkrétní provedení předkládaného vynálezu zahrnuje chiméry Syk nebo Syk a Src skupin protein-tyrosin kináz, lze pro popsané účely použít jakoukoliv tyrosinovou kinázu, která má podobnou funkci jako tyto molekuly. Charakteristické vlastnosti žádoucích spouštěcích imunitních molekul zahrnují schopnost autonomní exprese, schopnost být připojen (přímo nebo nepřímo přes transmembránovou doménu) tak, že vzniká chiméra je přítomna na povrchu terapeutické buňky a schopnost iniciovat buněčné efektorové programy po agregaci, která následuje po setkání s cílovým ligandem.

V současnosti nejběžnější metodou dopravy chimér do buněk imunitního systému je některá forma genetická terapie. Nicméně rekonstituce buněk imunitního systému s chimemími receptory směsí buněk s vhodně solubilizovanými čištěnými chimemími proteiny by také měla vést k vzniku buněčné populace, schopné odpovědi na cíle rozpoznané extracelulámími doménami

-7CZ 291754 B6 chimér. Podobný způsob byl např. použit pro dodání intaktního HIV receptorů, CD4, do erytrocytů pro terapeutické účely. V tomto případě nebyla buněčná populace schopná samoobnovy.

Předkládaný vynález se týká funkčně zjednodušených protein—tyrosin chimér, které jsou schopné přesměrovat funkci imunitního systému. Konkrétněji se týká regulace lymfocytů, makrofágů, zabíječských buněk nebo granulocytů expresí chimeras v uvedených buňkách, které způsobí, že buňky odpovídají na cíle rozeznané chimerasami. vynález se také týká způsobu směrování buněčné odpovědi na infekční agens, nádorové buňky nebo autoimunitně generované buňky. Způsob směrování buněčné odpovědi u savců zahrnuje podávání účinného množství terapeutických buněk, které jsou schopné rozeznat a zničit zmíněné infekční agens, nádorové, rakovinné nebo autoimunitně generované buňky.

V dalším provedení zahrnuje způsob směrování buněčné odpovědi na infekční agens podávání terapeutických buněk, které jsou schopné rozeznat a zničit infekční agens, přičemž toto agens je konkrétní virus, bakterie, protozoa nebo houba. Ještě konkrétněji je tento způsob směrován proti agens, jako jsou HIV a Pneumocystis carinii.

Pro léčení infekce HTV se pacientovi podává účinné množství T lymfocytů exprimujících chimemí receptory; lymfocyty jsou schopné specificky rozeznávat a lýzovat buňky infikované HIV stejně jako cirkulující virus.

V jednom provedení se podle předkládaného vynálezu poskytuje způsob směrování buněčné odpovědi na buňky infikované HIV, který zahrnuje podávání účinného množství cytotoxických T-lymfocytů, které jsou schopné specificky rozeznávat a lýzovat buňky infikované HIV.

Další provedení poskytuje chimemí receptorové proteiny, které směrují cytotoxické T-lymfocyty tak, že rozeznávají a lýzují buňky infikované HIV. Další provedení předkládaného vynálezu zahrnuje hostitelské buňky transformované vektorem, který obsahuje chimemí receptory.

Tyto a další neomezující provedení předkládaného vynálezu budou osobě vzdělané vdané problematice jasné z následujícího podrobného popisu vynálezu.

V následujícím podrobném popisu jsou reference na různé metodologie, které jsou známy osobám vzdělaným v molekulární biologii a imunologii. Publikace a další materiály, které obsahují takovéto známé metodologie jsou zde zahrnuty ve svém celku jako reference.

Standardní referenční práce, které obsahují obecné principy technologie rekombinantní DNA zahrnují Watson, J. D. a kol. Molecular biology of the Gene, Vol I a Π, the Benjamin/Cummings Publishing Company, lne., Vydavatel, Menlo Park, CA (1987); Damell, J. E. a kol., Molecular Cell Biology, Scientific Američan Books, lne., vydavatel, Nwe York, N. Y. (1986); Lewin, B. M., Genes Π, John Wiley & Sons, vydavatelé, New York, N. Y. (1985); Old, R. W., a kol., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering. 2. vydání, University of Califomia Press, vydavatel, Berkeley, CA (1981); Maniatis, T., a kol., Molecular Cloning : A Laboratorv Manual. 2. vydání, Cold Spring Harbor Laboratory, vydavatel, cold Spring Harbor, NY (1989); a Current Protocols in Molecular biology, Ausubel a kol., Wiley Press, New York, NY (1989).

Definice „Klonování“ znamená použití in vitro rekombinantních technik v ložení jednotlivého genu nebo jiné DNA sekvence do vektorové molekuly. Aby bylo klonování žádaného genu úspěšné, je třeba použít metody přípravy DNA fragmentů pro napojení fragmentů na vektorové molekuly, pro uvedení složené DNA molekuly do hostitelské buňky, kde se může replikovat, a pro sekvenci klonu, který má cílový gen mezi příjmovými hostitelskými buňkami.

-8CZ 291754 B6 „cDNA“ znamená komplementární DNA nebo kopii DNA vzniklou podle RNA vzoru působením RNA-dependentní DNA polymerasy (reversní transkriptasy). „cDNA klon“ tedy znamená duplexní DNA sekvenci komplementární k RNA molekule, která nás zajímá; nese ji klonovací vektor.

„cDNA knihovna“ znamená soubor rekombinantních DNA molekul obsahujících cDNA inserty, který obsahuje DNA kopie mRNA, které jsou exprimovány buňkou v době, kdy se tvoří cDNA knihovna. Takováto cDNA knihovna může být připravena metodami, které jsou osobám obeznámeným s touto problematikou dobře známy, jak je popsáno například v Maniatis a kol., Molecular Cloning: A Laboratory manual, viz výše. Obecně je RNA nejprve izolována z buněk organismu, jehož z jehož genomu požadujeme klonovat jednotlivý gen. Preferované pro účely předkládaného vynálezu jsou savčí, konkrétněji lidské, buněčné linie lymfocytů. Konkrétně preferovaný vektor pro tento účel je virový kmen WR.

„Vektor“ znamená DNA molekulu, odvozenou např. z plazmidu, bakteriofágu nebo savčího nebo hmyzího viru, do které mohou být vloženy fragmenty DNA nebo může být klonována. Vektor bude obsahovat jedno nebo více specifických restrikčních míst a může být schopen autonomní replikace v definovaném organismu hostitele nebo nositele, takže klonovaná sekvence je reprodukovatelná. Tedy „DNA expresivním vektorem“ je míněn jakýkoliv autonomní element schopný směrovaní syntézy rekombinantního peptidu. Takovéto DNA expresní vektory zahrnují bakteriální plazmidy a fágy a savčí a hmyzí plazmidy a viry.

„Skutečně čistá“ znamená sloučeninu, např. protein, polypeptid nebo protilátku, která je vyčištěná od sloučenin, které ji přirozeně doprovází. Obecně sloučenina je skutečně čistá pokud nejméně 60 %, výhodněji 75 % a nejvýhodněji 90 % celkové hmoty vzorku je požadovaná sloučenina. Čistota může být měřena jakoukoliv vhodnou metodou, např. klonovanou chromatografií, elektroforézou na polyakrylamidovém gemu nebo HPLC analýzou. V případě nukleových kyselin je „skutečně čistou“ míněna aminokyselinová sekvence, segment nebo fragment, který přímo nesousedí (tj. není kovalentně spojen) s oběma kódovanými sekvencemi, s kterými přímo sousedí (tj. jeden na 5' konci a jeden na 3' konci) v přirozeně se vyskytujícím genomu organismu, z kterého je DNA vynálezu odvozena.

„Funkční derivát“ znamená „fragment“, „variantu“, „analog“ nebo „chemický derivát“ molekuly. „Fragment“ molekuly je jakákoliv cDNA sekvence předkládaného vynálezu, znamená jakoukoliv nukleotidovou podskupinu molekul. „Varianta“ takovéto molekuly znamená, že má vztah k přirozeně se vyskytující molekule substančně podobné buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. „Analog“ molekuly znamená vztah k nepřírodní molekule látkově podobné buď celé molekule, nebo jejímu fragmentu. To, že molekula je „substančně podobná“ jiné molekule, znamená, že sekvence aminokyselin v obou molekulách je substančně stejná. Substančně podobné aminokyselinové molekuly budou vykazovat podobnou biologickou aktivitu. Ovšem za předpokladu, že dvě molekuly vykazují podobnou aktivitu, jsou považovány za varianty, protože tento termín je zde používán i když jedna z molekul obsahuje více nebo méně aminokyselinových zbytků, které nejsou v té druhé, nebo když sekvence aminokyselinových zbytků není identická. Jak se zde používá, molekula je nazývána „chemickým derivátem“ jiné molekuly, když obsahuje další chemické skupiny, které normálně nejsou součástí molekuly. Tyto skupiny mohou mít vliv na rozpustnost molekuly, absorpci, biologický poločas apod. Skupiny mohou snižovat toxicitu molekuly, eliminovat nebo zeslabovat nežádoucí vedlejší účinky molekuly, atd. Skupiny schopné zprostředkovat tyto účinky jsou uvedeny, např. v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Mack Publishing Co., Easton, Penn. (1980).

Podobně „funkční derivát“ receptorového chimemího genu v předkládaném vynálezu znamená, že zahrnuje „fragmenty“, „varianty“ nebo „analogy“ genu, které mohou být „látkově podobné“ v nukleotidové sekvenci, a které kódují molekulu vykazující podobnou aktivitu jako protein-tyrosin kinázová chiméra.

-9CZ 291754 B6

Termín protein-tyrosin kinázový chimemí protein tak, jak je použit v předkládaném vynálezu znamená, že zahrnuje jakýkoliv funkční derivát, fragmenty, varianty, analogy nebo chemické deriváty, které mohou být substančně podobné „divokému typu“ chiméry a které vykazují 5 podobnou aktivitu (tj. nejvýhodněji 90 %, výhodněji 70 %, výhodně 40 % nebo nejméně 10 % aktivity chimemího receptoru divokého typu. Aktivitu funkčního derivátu chimemího receptoru zahrnuje specifické vazby (s jejich extracelulámí částí) k zacílení činidla nebo buňky a výsledná destrukce (provedená jeho intracelulámí částí) činidla nebo buňky; tato aktivita může být testována např. s použitím jakýchkoliv zde popsaných stanovení.

DNA sekvence kódující chiméru v předkládaném vynálezu nebo její funkční deriváty, může být rekombinována s vektorem DNA s použitím konvenčních technik, včetně ztupení nebo roztřepení konců pro ligaci, digesce restrikčními enzymy za získání vhodných konců, doplnění kohesivních konců podle potřeby, reakce s alkalickou fosfatasou k odstranění nežádoucích vazeb a ligace 15 vhodnými ligasami. Techniky pro takovéto manipulace jsou uvedeny vManiatis, T., a kol., viz výše, a jsou v dané oblasti velmi dobře známy.

Molekula z nukleových kyselin, jako je DNA, je nazývána jako „schopná exprese“ polypeptidů, pokud obsahuje nukleotidové sekvence, které obsahují transkripční a translační regulační 20 informaci a takovéto sekvence jsou „operabilně spojeny“ s nukleotidovou sekvencí, která kóduje polypeptid. Operabilní spojení je spojení, kdy regulační DNA sekvence určená k expresi tímto spojením povolují genovou expresi. Přesná povaha regulačních oblastí potřebných pro expresi genu se u různých organismů liší, ale obecně zahrnuje promotorovou oblast, která u prokaryot obsahuje jak promotor (kteiý řídí iniciaci transkripce RNA), tak DNA sekvence, které 25 transkribované do RNA budou signalizovat iniciaci proteinové syntézy. Tyto oblasti budou normálně obsahovat 5-nekódující sekvence týkající se iniciace transkripce a translace, jako je TATA box, capping sekvence, CAAT sekvence apod.

Pokud je třeba, nekódující oblast 3' pro genovou sekvenci kódující protein můžeme získat výše 30 popsanými metodami. Tato oblast může být zachována pro svoje transkripční terminační regulační sekvence, jako je terminace a polyadenylace. zachováním 3'- oblasti, která přirozeně sousedí s DNA sekvencí kódující protein, můžeme zajistit transkripční terminační signály. Když transkripční terminační signály nejsou dostatečně funkční při expresi v hostitelské buňce, potom může být substituována 3' oblast funkční v hostitelské buňce.

Dvě DNA sekvence (jako je sekvence promotorové oblasti a sekvence kódující protein-tyrosin kinázovou chiméru) se označují jako operabilně spojené pokud povaha spojení mezi dvěma DNA sekvencemi (1) nevede k zavedení mutace, která vznikne posunutím rámce, (2) neinterferuje se schopností sekvence promotorové oblasti směrovat transkripci genové sekvence chimemího 40 receptoru nebo (3) neinterferuje se schopností genové sekvence chimemího receptoru být transkribována sekvencí promotorové oblasti. Promotorová oblast by byla operabilně navázána na DNA sekvenci, pokud by promotor byl schopen proteinu jsou nutné transkripční a translační signály rozpoznané vhodným hostitelem.

Předkládaný vynález zahrnuje expresi protein-tyrosin kinázového chimemího proteinu (nebo jeho funkčních derivátů) jak v prokaryotických, tak v eukaiyotických buňkách, avšak je preferována eukaryotická exprese (a zejména lidských lymfocytů).

Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny kteroukoliv z mnoha metod. 50 Například buňky produkující receptorové chimemí proteiny nebo jejich funkční deriváty mohou být podávány zvířatům, aby indukovaly produkci séra, obsahujícího polyklonální protilátky, které jsou schopné vázat chiméru.

V preferované metodě, protilátky podle předkládaného vynálezu jsou monoklonální protilátky. 55 Tyto monoklonální protilátky mohou být připraveny s použitím hybridomové technologie

-10CZ 291754 B6 (Kohler a kol., Nátuře 256: 495 (1975); Kohler a kol., Eur. J. Immunol.. 6: 511 (1976); Kohler a kol., Eur. J. Immunol. 6: 292(1976); Hammerling a kol., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas. Elsevier, N. Y. str. 563-684 (1981)). Obecně tyto procedúry zahrnují imunizaci zvířete chimemím antigenem. Splenocyty těchto zvířat jsou extrahovány a fúzovány s vhodnými myeloidními buněčnými liniemi. Může být použita jakákoliv vhodná myeloidní linie v souladu s předkládaným vynálezem, po fůzi jsou výsledné hybridomové buňky selektivně ošetřeny v HAT médiu a poté klonovány limitní dilucí, jak je popsáno v Wands, J. R., a kol., Gastroenterologv 80: 225-232f (1981). U hybridomových buněk získaných touto selekcí je potom provedeno stanovení, aby byly identifikovány klony, které produkují protilátky schopné vázat chiméru.

Protilátky podle předkládaného vynálezu také mohou být polyklonální, nebo, výhodněji, oblastně specifické polyklonální protilátky.

Protilátky proti chiméře podle předkládaného vynálezu mohou být použity k monitorování množství chimemích receptorů (nebo buněk nesoucích chimemí receptory) u pacienta. Takovéto protilátky jsou vhodné pro použití při standardních imunodiagnostických stanoveních, které jsou v dané oblasti dobře známy, včetně imunometrických nebo „sendvičových“ stanovení, jako je předsunuté sendvičové stanovení, reversní sendvičové stanovení a simultánní sendvičové stanovení, protilátky lze použít v jakýchkoliv kombinacích, jak může osoba zběhlé vdané problematice určit, bez nevhodných experimentů, které by ovlivnily imunostanovení přijatelné specifity, citlivosti a přesnosti.

Standardní referenční práce uvedené dále obsahují obecné principy imunologie: Roitt, I., Essential Immunologv. 6. vyd., blackwell Scientific Publications, vydavatel, Oxford (1988); Kimball, J. W. Introduction to Immunology, 2. vydání, Macmillan Publishing Co., vydavatel, New York (1986); Roitt, I., a kol., Immunology. Gower Medical Publishing Ltd., vydavatel, London, (1985); Campbell, A., „Monoclonal Antibody Technology“, burdon, R., a kol., editoři, Laboratorv techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Elsevier, vydavatel, Amsterdam (1984); Klein, J., Immunology: the Science of Self-Nonself Discrimination, John Wiley & Sons, vydavatel, New York (1982); a Kennett, R. a kol., editoři, Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension In Biological Analyses, Plenům Press, vydavatel, New York (1980).

Termín „detekce“ zahrnuje stanovení přítomnosti nebo nepřítomnosti látky nebo kvantifikace množství látky. Termín tedy vztahuje k použitým materiálům, prostředkům a způsobům přípravy v předkládaném vynálezu jako kvalitativní a kvantitativní stanovení.

Isolace dalších hybridomy produkovaných monoklonálních protilátek stejné specificity, jak je zde popsáno, mohou být provedeny technikami anti-idiotypického screeningu (Potocmjak, a kol., Acience 215: 1 637 (1982)). Stručně, anti-idiotypická protilátka je protilátka, která rozpozná jedinečné determinanty přítomné v protilátce produkované klonem, který nás zajímá. Anti-idiotypická protilátka je připravována imunizací zvířete stejné linie použitým jako zdroj monoklonální protilátky s monoklonální protilátkou, která nás zajímá. Imunizované zvíře rozpozná a odpoví na idiotypické determinanty imunizující protilátky produkcí protilátky k těmto idiotypickým determinantám (anti-idiotypická protilátka).

Při replikaci mohou být hybridní buňky kultivovány jak in vitro, tak in vivo. Vysoká produkce in vivo tuto metodu kultivace v současné době upřednostňuje. Stručně buňky individuálních hybridních linií jsou intraperitoneálně injektovány do prověřených kvalitních BALB/c myší k produkci ascitické tekutiny obsahující vysoké koncentrace požadovaných monoklonálních protilátek. Monoklonální protilátky isotypu IgM nebo IgG mohou být purifikovány ze supematantu kultury s použitím kolonových chromatografických metod, které jsou v této oblasti velmi dobře známy.

-11 CZ 291754 B6

Protilátky podle předkládaného vynálezu jsou vhodné zejména pro použití při imunostanoveních, kde mohou být utilizovány v kapalné fázi nebo navázány na pevný nosič. Protilátky v těchto stanoveních jsou opatřeny různými detekovatelnými značeními.

V této oblasti je známo mnoho různých značení. Příklady značení, které mohou být použity v předkládaném vynálezu, zahrnují enzymy, radioisotopy, fluorescenční sloučeniny, chemiluminiscenční sloučeniny, bioluminiscenční sloučeniny a cheláty kovů (tyto příklady však nejsou limitující). Pro osoby zběhlé v dané problematice budou známé i další vhodné způsoby značení vazby protilátek, nebo budou schopny tyto způsoby zjistit s použitím běžných experimentálních technik. Vazba těchto značek na protilátku může být provedena s použitím standardních technik běžně známých osobám, které jsou zběhlé v dané problematice.

Jeden ze způsobů, kterým mohou být značeny protilátky podle předkládaného vynálezu, aby byly detekovatelné, je vazba protilátky na enzym. Tento enzym, pokud je později přidán jeho substrát, bude reagovat se substrátem za produkce chemické skupiny, která bude moci být detekována např. spektrofotometricky nebo fluorometricky. Příklady enzymů, které mohou být použity jako detekovatelné značení protilátek zahrnují malátdehydrogenasu, stafylokokovou nukleasu, delta-V-steroid isomerasu, kvasinkovou alkoholdehydrogenasu, alfa-glycerofosfátdehydrogenasu, triosafosfátisomerasu, biotinavidiperoxidasu, křenovou peroxidasu, alkalickou fosfatasu, asparaginasu, glukózaoxidasu, β-galaktosidasu, ribonukleasu, ureasu, katalasu, glukóza-VI-fosfátdehydrogenasu, glukoamylasu a acetylcholinesterasu.

U protilátek v tomto vynálezu také mohou být jako detekovatelné značení použity radioaktivními isotopy, které mohou být potom stanoveny takovými metodami, jako je gama čítač nebo scintilační čítač. Isotopy, které mohou být zejména použitelné pro účely předkládaného vynálezu jsou ³H, ¹²⁵I, ³²P, ³⁵S, ¹⁴C, ⁵¹Cr, ³⁶C1,⁵⁷Co, ⁵⁹Fe a ⁷⁵Se.

U protilátek v tomto vynálezu také může být jako detekovatelné značení použita vazba s fluorescenční sloučeninou. Pokud je protilátka značená fluorescenčně vystavena záření vhodné vlnové délky, může být potom její přítomnost detekována barevnou fluorescencí. Mezi nejběžněji používané fluorescenční značící sloučeniny patří fluorescein, isothiokyanát, thodamin, fycoerythrin, fycocyanin, allofycocyanin, o-ftaldehyd a fluoreskamin.

U protilátek v tomto vynálezu fluorescenci emitující kovy, jako je ¹²⁵Eu, nebo další ze skupiny lanthanoidů. Tyto kovy mohou být navázány na protilátkovou molekulu s použitím chelačních skupin kovů, jako je diethylenteriaminpentaoctová kyselina (CTPA) nebo ethylendiamintetraoctová kyselina (EDTA).

U protilátek v tomto vynálezu také může být jako detekovatelné značení použito navázání chemiluminiscenčních sloučenin. Přítomnost chemiluminiscenčně značené protilátky je pak stanovena detekcí přítomnosti luminiscence, která vzniká chemickou reakcí. Příklady zvláště vhodných chemiluminiscenčních značících sloučenin jsou luminal, isoluminol, theromatický akridiniumester, imidazol, akridiniové soli, oxalátester a dioxetan.

Stejně tak mohou být použity ke značení protilátek podle předkládaného vynálezu i bioluminiscenční sloučeniny. Bioluminiscence je typ chemiluminiscence, která se nachází v biologických systémech, v kterých katalytické proteiny zvyšují efektivitu chemiluminiscenční reakce. Přítomnost bioluminiscenční protilátky je stanovena detekcí přítomnosti luminiscence. Důležité bioluminiscenční sloučeniny pro účely značení zahrnují luciferin, aequorin luciferasy.

Protilátky a látkově purifikovaný antigen v předkládaném vynálezu jsou ideálně vhodné pro přípravu kitu. Takovýto kit bude obsahovat nosič, aby byl rozčleněn na uzavřené prostory s jednou nebo více nádobkami, jako jsou kyvety, tuby apod., každá takováto nádobka bude obsahovat oddělené součásti stanovení, které budou ke stanovení třeba.

- 12CZ 291754 B6

Typů stanovení, které mohou být připraveny ve formě kitu, je mnoho, a zahrnují např. kompetitivní a akompetitivní stanovení, typickými příklady stanovení, které mohou utilizovat protilátky z tohoto vynálezu jsou radioimunostanovení (RIA), enzymoimunostanovení (EIA), enzyme-linked imunosorbční stanovení (ELISA), a imunometrické nebo sendvičová stanovení.

Termíny „imunometrické stanovení“ nebo „sendvičové stanovení“ znamená, že zahrnuje simultánní sendvičové stanovení, předsunuté (forward) sendvičové stanovení a reversní sendvičové stanovení. Tyto pojmy jsou velmi dobře známy osobám, které jsou zběhlé v dané problematice. Tyto osoby mohou také posoudit, že protilátky podle předkládaného vynálezu budou použitelné v dalších variantách a formách stanovení, které jsou nyní známé nebo které mohou být vyvinuty v budoucnosti. Ty také spadají do rámce předkládaného vynálezu.

Preferovaným způsobem pro provedení stanovení je důležité, že v inkubačním médiu jsou přítomny určité „blokátory“. „Blokátory“ jsou přidávány, aby bylo zajištěno, že nespecifické proteiny, proteasy nebo lidské protilátky proti myším imunoglobulinům přítomné v experimentálním vzorku nebudou křížově reagovat nebo ničit protilátky na pevné fázi nebo radioznačící indikátorovou protilátku za vzniku falešně pozitivních nebo falešně negativních výsledků. Výběr přidávaných „blokátorů“ tedy zvyšuje specifitu stanovení popsaných v tomto vynálezu.

Bylo zjištěno, že množství nonrelevantních (tj. nespecifických) protilátek stejné třídy nebo podtřídy (isotypu), jako jsou ty, které jsou použité ve stanovení (tj. IgG_b IgG_2a, IgM, atd.), mohou být použity jako „blokátory“. Koncentrace „blokátorů“ (normálně 1-100 μg/μl) je důležitá, aby při získání vhodné sensitivity ještě inhibovaly jakékoliv nežádoucí vzájemné interference křížově reagujících proteinů v lidském séru. Pufrační systém obsahující „blokátory“ musí být optimalizován, preferované pufiy jsou ty, které jsou založené na slabých organických kyselinách, jako je imidazol, HEPPS, MOPS, TES, ADA, ACES, HEPES, PIPES, TRIS apod., ve fyziologickém rozsahu pH. Méně preferovanými pufiy jsou anorganické pufiy jako je fosfátová, borátový a karbonátový. Nakonec do pufru, který obsahuje „blokátory“, mohou být přidány vhodné inhibitory proteas (normálně 0,01 až 10 pg/μΐ).

Používá se mnoho pevných imunoadsorbentů, které mohou být použity i v předkládaném vynálezu. Dobře známé imunoadsorbenty zahrnují sklo, polystyren, polypropylen, dextran, nylon a další materiály, ve formě trubiček, korálků a mikrotitračních destiček, které jsou z nich vyrobeny, nebo které jsou těmito materiály pokryty apod. Imobilizované protilátky mohou být na pevný imunoadsorbent navázány buď kovalentně, nebo fyzikálně technikami, jako je kovalentní vazba přes amidovou nebo esterovou vazbu, nebo absorpcí. Osoby zběhlé v dané problematice znají mnoho dalších vhodných pevných imunoadsorbentů a metod imobilizace protilátek, nebo budou schopni toto zjistit s použitím běžných experimentálních metod.

Značení pro dianostiku in vivo, in vitro nebo in šitu, jako jsou radionuklidy, mohou být na protilátky podle předkládaného vynálezu navázány jak přímo, tak s použitím zprostředkujících funkčních skupin, často používanou zprostředkující skupinou pro vazbu radioisotopů, které existují jako kationty kovů, na protilátky je diethylenetriaminpentaoctová kyselina (DTPA). Typickými příklady kationtů kovů, které jsou vázány tímto způsobem: ^99mTc, ¹²³I, ^1UIN, ¹³¹I, ⁹⁷Ru, ⁶⁷Cu, ⁶⁷Ga a ⁶⁸Ga. Protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také pro diagnostické účely značeny neradioaktivními isotopy. Prvky, které jsou zejména používány pro tyto účely jsou ¹⁵⁷Gd, ⁵⁵Mn, ¹⁶²Dy, ^S2Cr a ⁵⁶Fe.

Antigen podle předkládaného vynálezu může být izolován v látkově čisté formě použitím protilátek podle předkládaného vynálezu. Provedení předkládaného vynálezu zahrnuje k látkově čisté protein-tyrosinové kinázové chiméře uvedený antigen charakterizovaný tím, že je rozpoznán a navázán na protilátky podle předkládaného vynálezu. V jiném provedení předkládaný vynález zahrnuje způsob isolace nebo purifikace chimemího receptorového antigenu

-13CZ 291754 B6 vznikem komplexu uvedeného antigenu s jednou nebo více protilátkami směrovanými proti receptorové chiméře.

Látkově čisté chimemí antigeny v předkládaném vynálezu mohou být naopak použity k detekci nebo měření protilátky k chiméře ve vzorku, jako je sérum nebo moč. Jiné provedení vynálezu zahrnuje metodu detekce přítomnosti nebo množství protilátky k protein-tyrosin kinázovému antigenu ve vzorku, zahrnuje kontakt vzorku obsahujícího protilátku kchimemímu natigenu a detekovatelným značením receptorové chiméry, a detekci uvedeného značení. Bude oceněno, že mohou být použity i imunoreaktivní frakce a imunoreaktivní analogy chiméry. Termín „imunoreaktivní frakce“ zahrnuje jakoukoliv část chimemího antigenu, který vykazuje ekvivalentní imunitní odpověď k protilátce směrované proti receptoru chiméry. Termín „imunoreaktivní analogy“ zahrnuje protein, který se liší od receptorového chimemího proteinu jednou nebo více aminokyselinami, ale který vykazuje ekvivalentní imunitní odpověď na protilátku z tohoto vynálezu.

Termín „specificky rozpoznají a vážou“ znamená, že protilátky rozpoznají a vážou chimemí receptorový polypeptid, ale látkově nerozpoznávají a nevážou další neodpovídající molekuly ve vzorku, tj. v biologickém vzorku.

Termín „autoimunitně generované buňky“ znamená buňky produkující protilátky, které reagují s hostitelskou tkání nebo imunoefektorové T buňky, které jsou autoreaktivní; tyto buňky zahrnují protilátky proti acetylcholinovým receptorů, (vedoucím např. kmyasthenii gravis) nebo anti-DNA, anti-erytrocytové a anti-destičkové protilátky (vedoucí např. k lupus erythematosus).

„Terapeutická buňka“ znamená buňku, která je transformována chimérou podle tohoto vynálezu tak, že je schopná rozpoznávání a zničení specifického infekčního agens, buňky infikované specifickým agens, nádorové nebo rakovinné buňky nebo autoimunitně generované buňky; preferované j ako terapeutické buňky j sou buňky hematopoetického systému.

„Cílové infekční agens“ znamená jakékoliv infekční agens (tj. viry, bakterie, protozoa nebo houby), které může být rozpoznáno terapeutickými buňkami, které nesou chimemí receptory. Termín „cílová buňka“ znamená jakoukoliv hostitelskou buňku, která může být rozpoznána terapeutickou buňkou, která nese chimemí receptor; cílové buňky zahrnují, bez omezení, hostitelské buňky, které jsou infikovány viry, bakteriemi, protozoi nebo houbami, stejně jako nádorové, rakovinné nebo autoimunitně generované buňky.

„Extracelulámí“ znamená, že nejméně část molekuly je umístěna na buněčném povrchu. „Intracelulámí“ znamená, že nejméně část molekuly je umístěna vcytoplasmě terapeutické buňky. „Transmembránová“ znamená, že nejméně část molekuly se táhne napříč plasmatickou membránou. Termíny „extracelulámí část“, „intracelulámí část“ a „transmembránová část“, jak jsou zde použity, mohou zahrnovat postranní aminokyselinové sekvence, které zasahují do sousedících buněčných kompartmentů. „Oligomerizování“ znamená shlukování s jinými proteiny za vzniku dimémerů, trimérů, tetramérů nebo dalších vyšších forem oligomerů. takovéto oligomery mohou být homooligomery nebo heterooligomery. „Oligomerizovaná část“ je ta oblast molekuly, kteiý řídí vznik komplexu (tj. oligomerů).

„Cytolytický“ znamená schopnost destruovat buňku (např. buňky infikované patogenem, nádorové nebo rakovinné buňky nebo autoimunitně generované buňky) nebo schopnost destruovat infekční agens (např. virus).

„Imunodeficientní virus“ znamená retrovirus, který, v divoké formě, je schopen infikovat T4 buňky primárního hostitele a vykazuje virální morfogenesi a morfologické charakteristiky podskupiny lentivirů. Termín zahrnuje, bez omezení, všechny varianty HIV a SIV, včetně HIV-1, HTV-2, SIVmac, SIVagm, SIVmnd, SIVsmm, SIVman, SlVmand a SIVcpz.

-14CZ 291754 B6 „MHC-independentní“ znamená, že buněčná cytolytická odpověď nevyžaduje přítomnost MHC třídy Π antigenu na povrchu cílové buňky.

„Funkční cytolytický signál-indukující derivát“ znamená funkční derivát (jak je definován výše), kteiý je schopen směrovat nejméně 10 %, výhodně 40 %, výhodněji 70 % a nejvýhodněji 90 % biologické aktivity divokého typu molekuly. Jak je zde uvedeno, „funkční cytolytický signálindukující derivát“ může působit přímo signálem terapeutické buňky na destrukci receptorově navázaného činidla nebo buňky (např. v případě intracelulámí části chimemího receptorů), nebo může působit nepřímo zahájením oligomerizace s cytolytickými signál-indukujícími proteiny terapeutických buněk (např. v případě transmembránové domény). Účinnost takovýchto derivátů může být testována např. s použitím zde popsaných in vitro stanovení.

„Funkční HTV obalově-vazebné deriváty“ znamenají funkční deriváty (jak jsou definovány výše), které jsou schopné vázat jakýkoliv HTV obalový protein. Funkční deriváty mohou být identifikovány s použitým zde popsaných in vitro stanovení.

Terapeutické podávání

Transformované buňky v předkládaném vynálezu mohou být použity pro terapii mnoha chorob. Současně metody podávání takovýchto transformovaných buněk zahrnují adoptivní imunoterapii nebo buněčnou transferovou terapii. Tyto metody dovolují navrácení transformovaných buněk imunitního systému do krevního oběhu. Rosenberg, S. A., Scientific Američan, 62, (květen 1990); Rosenberg a kol., The New England Joumal of Medicine. 323(9): 570 (1990).

Farmaceutické prostředky z tohoto vynálezu mohou být podávány jakémukoliv zvířeti, u kterého můžeme posoudit prospěšný vliv prostředků z tohoto vynálezu. V první řadě mezi těmito zvířaty jsou lidé, ale vynález není tímto omezen.

Přehled obrázků na výkresech

Vynález bude blíže osvětlen pomocí výkresů, na kterých obr. 1A je schematický diagram, který ukazuje organizaci receptor-kinázových fuzních proteinů podle tohoto vynálezu. Obr. 1B ukazuje výsledky cytometrické produkce pro CD16/7/zeta, CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk a CD16/7/ZAP-70 produkovaných rekombinantními vakciniemi vJurkatských buňkách. Obr. 1C ukazuje stanovení in vitro kinázové aktivity imuniprecipitované CD16/7/zeta (negativní kontrola), CD16/7/Lck, CD16/7/Fyn(T), CD16/7/Syk a CD16/7/ZAP-70; složka s nižší molekulovou hmotností, která se objevuje v imunoprecipitátu Fyn chiméry již musí být identifikována.

Obr. 2 ukazuje cytosolickou kalciovou odpověď spuštěnou křížovou vazbou kinázových chimeras s TCR-negativních Jurkatských buňkách. Je ukázána relativní koncentrace extracelulámího kalcia positivní populace (měřeno poměrem Indo-1 fialové k modré fluorescenci). Kurkat buňky infikované rekombinanty kravských neštovic produkující různé fúzní proteiny byly vystaveny působení anti-CD16 mAb 3G8 a potom pfykoerythrinem konjugované kozí F(ab')₂ protilátky k myšímu IgG v čase 0. Chimerasy založené na TRC zeta řetězci a FcRHB2 sloužily jako positivní a negatvní kontrola, respektive.

Obr. 3 ukazuje předčasné spouštění kalciové odpovědi v TCR positivních buňkách produkujících Syk kinázovou chiméru. Infekce a analýza byly provedeny, jak je popsáno výše pro Obr. 2. Látkový poměr buněk produkujících Syk chiméru ukazuje vysoký poměr fialové k modré fluorescenci před přidáním primární protilátky.

Obr. 4A a 4B ukazují anti-hybridomové zabiječské stanovení.

- 15CZ 291754 B6

Obr. 4A ukazuje poměr ⁵¹Cr-chromanu uvolněného z hybridomových cílových buněk, ukázaný jako funkce poměru efektorových buněk (CTL produkující kinázové chiméry) k cílovým buňkám; buňky produkující receptorové chiméry nesoucí intracelulámí domény TCR zeta řetězce a FcRIIB2 sloužily jako positivní a negativní kontroly, respektive. Obr. 4B. Ukazuje specificitu zabíjení (bez náhodného zabíjení). BW5147 buňky (mající nedostatek povrchových anti-CD16 protilátek) byly naplněny ⁵¹Cr-chromanem a byly vystaveny působení CTL produkujících kinázových chimér za stejných podmínek jako paralelní vzorek chromanem naplněných 3G8 buněk (produkujících anti-CD16 protilátku). Nedetekovatelné uvolnění chromanu bylo pozorováno z BW5147 buněk.

Obr. 5A, 5B a 5C ukazuje, že koexprese ZAP-70 a Fyn nebo Lek umožňuje indukci cytolýzy a redukuje reakční čas kalciové odpovědi. CTL byly koinfektovány rekombinantními vakciniemi produkujícími iniciované chiméry a analyzovány pro cytolytický potenciál nebo mobilizaci kalcia. Účinnost chimér lze touto analýzou špatně odhadnout, protože frakce buněk produkující obě chiméry nebyly nezávisle měřeny (frakce buněk produkujících nejméně jednu chiméru byla použita k normalizaci aktivity). Obr. 5A ukazuje cytolytické stanovení s použitím CTL produkujících páry CD16/7/kinázových chimér. Obr. 5B ukazuje kalciovou odpověď TCR negativních buněk produkujících páry CD16/7/kinázových chimeras. Obr. 5C ukazuje cytolytické stanovení CTL koprodukujících CD4/CD7/Fyn chiméru a CD16/CD7/ZAP-70 chiméru. CD16/7/zeta chiméra slouží jako positivní kontrola, zatímco CD16/7/FcRIIB2 chiméra slouží jako negativní kontrola.

Obr. 6A a 6B ukazují, že chiméry nesoucí kinázové delece nebo bodové mutace jsou neúčinné v kalciové mobilizaci a přesměrování cytolýzy. varianty kinázových negativních fuzních proteinů byly konstruovány delecí (v případě Syk) nebo bodovou mutací (v případě ZAP-70) a testovány na kalciovou odpověď a cytolýzu. Obr. 6A ukazuje kalciovou odpověď v TCR negativních buňkách. Obr. 6B ukazuje přesměrování stanovení přesměrování cytolýzy.

Obr. 7A, 7B a 7C ukazuje, že chiméry založené na lidské Syk jsou v podstatě rovnomocné s chimérami založenými na vepřovém Syk. Obr. 7A je sekvence lidské Syk a srovnání s vepřovou SYK; prvních 11a posledních 7 zbytků je určeno primárními sekvencemi. Obr. 7B ukazuje analýzu mobilizace kalcia TCR negativních buněk koprodukujících lidskou Syk chiméru. Obr. 7C ukazuje stanovení přesměrování cytolýzy CTL produkující lidskou Syk chiméru.

Obr. 8 ukazuje změny ve způsobu tyrosinové fosforylace, která následuje po křížové vazbě chimemích kináz. Jurkatské buňky negativní na T buněčné antigenní receptory produkující uvedené chiméry nebo párychimer reagovaly s anti-CD16 a kozí proti-myší IgG sekundární protilátkou a poté byly lyžovány, frakcionovány na polyakrylamidovém gelu, přesunuty na nitrocelulózu a testovány s anti-fosforysinovou protilátkou. Pásy označené '+' představují extrakty z buněk podrobených křížové vazbě, zatímco pásy označené byly lyžovány přímo bez předchozí reakce se sekundární protilátkou. Kontrolní pásy byly vytvořeny podobnou úpravou TCR-negativních buněk produkujícími CD16/7 fuzní protein, které neobsahovaly intracelulámí doménu. Pro srovnání, účinky anti-CD3 úpravy TCR-positivních Jurkartských buněk (s nebo bez infekce divokého typu vakcinií) jsou ukázány vpravo. Významné pásy přibližné hodnoty 100 kD na levé straně tohoto panelu odpovídají očekávaným molekulovým hmotnostem kinázových chimér.

Obr. 9 ukazuje tyrosinovou fosforylaci fosfolipasy C-γΙ následovanou agregací chimér. PLC-γΙ byl imunoprecipitován z buněk vystavených křížové vazbě protilátky a imunoprecipitáty byly frakcionovány na gelech, přeneseny do nitrocelulózy a testovány anti-fosfotyrosinovou protilátkou. Substanční vzestup u fosforylovaného PLC-γΙ ukázala následující agregace Syk chimér, zatímco omezená, ale snadno detekovatelný vzrůst následuje po koagregaci Fyn a ZP-70 chimér.

-16CZ 291754 B6

Obr. 10A a 10B ukazuje kinázová stanovení in vitro. Buňky produkující chimérické kinázy byly vystaveny protilátkou zprostředkované chimemí křížové vazbě, potom byly kinázy imunoprecipitovány a imunoprecipitáty vyhodnoceny fosforylací endogenního substrátu. Obr. 10A ukazuje srovnání aktivity imunoprecipitovaných kinázových chimér po inkubační době deset minut s použitím imunoprecipitátů isolovaných z křížově vázaných (+) nebo křížově nevázaných (-) buněk. Obr. 10B ukazuje časový průběh asimilace fosfátového značení s endogenním substrátem Syk kinázových chimérou, s (+) a bez (-) křížové vazby.

Příklady provedení vynálezu

Aktivace T buněk seskupenými tyrosin kinázami

Nyní následuje popis jednotlivých provedení vynálezu. V tomto popisu je demonstrováno, že nenreceptorové kinázy jsou aktivovány jednoduchými seskupovacími způsoby. Byly vytvořeny umělé receptorové kinázy, jejichž intracelulámí domény se skládají z kompletních sekvencí Src nebo Syk kinázových skupin a byly studovány důsledky agregace pomocí externího podmětu křížové vazby. Mezi aktivitou kinázových skupin Syk a Src se objevil jasný rozdíl: křížová vazba Src nevede ke zřetelné buněčné aktivaci, zatímco křížová vazba Syk vede k objevení volných intracelulámích kalciových iontů a, v případě Syk, cytolytického potenciálu. Nedostatek ZAP-70 chimér v indukci distálními receptory zprostředkovaných programů může být překonán koseskupením ZAP-70 chiméry buď sRyn, nebo Lee kinázovými chimérami. Nyní popsané příklady slouží pro ilustraci, nejsou omezením vynálezu.

Konstrukce protein-tyrosin kinázových chimér a demonstrace účinnosti

Genové fuze kódujících proteinů podobných buněčných povrchových receptorových kináz byly konstruovány připojením DNA fragmentů kódujících extracelulámí doménu CD 16 molekuly k krátkému mezisegmentu kódujícímu juxtamembránové a transmembránové domény CD7 připojené naopak ke kompletně kódující sekvence lidské Lek (Koga a kol., 1986, Eur. J. Immunol. 16: 1 643-1 646), myší Fyn (T) (Cooke a Perlmutter, 1989, New. Biol. 1: 66-74), vepřovou Syk (Taniguchi a kol., 1991, J. biol. Chem. 166: 15 790-15 796) a lidskou ZAP-70 (Chán a kol., 1992, Cell 71: 649-662) tyrosinové kinázy (obr. 1A). Výsledné tripartitní genové fuze byly zavedeny do rekombinantů virů vakcinií homologickou rekombinací a selekcí pro koexpresi E. coli gpt genového produktu. Infekce buněk rekombinanty vedla k tomu, že buněčný povrch byl chopen exprese všech čtyř kinázových chimér (Obr. IB). Imunoprecipitace výsledných proteinových chimér s anti-CD16 protilátkami ukázala přítomnost molekulových druhů očekávaných hmotností, které byly aktivní při in vitro fosforylačním stanovením (Obr. 1C).

Nejprve jsme stanovili, zda by křížová vazba fuzních proteinů poskytla akumulaci volného intracelulámího kalcia podobným způsobem, který se objevuje při fúzi proteinů založených na antigenních receptorových intracelulámích doménách T buněk. Proto jsme infikovaly různé buňky rekombinantními vakciniemi a měřili relativní koncentraci cytoplasmatického kalcia po křížové vazbě intracelulámích domén s protilátkami. Bylo provedeno měření spektrofluorimetrické (velké populace) a průtoková cytometrie (jednotlivé buňky), buňky byly plněny barvivém Indo-1 (Grynkiewicz a kol., 1985, J. Immunol. 137: 952-961). Analýzy průtokovou cytometrií byly provedeny na základě dat získaných u buněk, jejichž buněčná povrchová produkce CD 16, stanovená intenzitou fycoerythrinové fluorescence, spadala do relativně úzkého, předem definovaného rozmezí. Ačkoliv uvnitř tohoto rozmezí byly pozorovány menšinové variace ve střední intenzitě fluorescence (způsobené diferencemi v rozložení distribuce chimér produkovaných buňkami), tato metoda nám dovoluje rozlišit odpovědi buněk nesoucích přibližně stejné množství receptoru. Obr. 2 ukazuje analýzu údajů shromážděných z buněk mutační varianty Jurkatských T buněk lidské leukemické linie s chybějícím T buněčným antigenním receptorem (Weiss a Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160: 1 284-1 299). V těchto buňkách ani Lek ani

- 17CZ 291754 B6

Fyn chiméry nemají kapacitu mobilizovat kalcium po křížové vazbě. V některých experimentech shlukování Lek fuzního proteinu vedlo k mírnému zvýšení klidové koncentrace kalcia, vzhledem k negativní kontrole, fuznímu proteinu založenému na nízké afinitě IgG receptorové FcRHB2 intracelulámí doméně (kolanus a kol., 1992, EMBO J. 11: 4 861-4 868). Agregace fuzních proteinů založená na ZAP-70 a Syk byla vysoce účinná při ovlivnění vzniku volných cytoplasmatických kalciových ionů, přibližně tak účinná, jako agregace podobných chimér nesoucích intracelulámí doménu T buněčného receptorového zeta řetězce. U ZAP-70Í Syk kinázových chimér bylo zjištěno nepatrné zpoždění zahájení kalciové odpovědi, v poměru k době zahájení kalciové mobilizace zeta chimérou. V buňkách T buněčné receptorové pozitivních (Obr. 3) byla vyhodnocení změny u chimér částečně znemožněna vysokou klidovou koncentrací volného kalciového ionu, svědčí o základním spuštění kalciového regulačního aparátu.

Zavedení chimér do cytolytické linie T buněčné linie nám dovoluje vyhodnotit potenciál fuzních proteinů přijmout efektorovou funkci. V tomto stanovení byly jako cílové buňky použity anti-CD16 hybridomové buňky, které produkují buněčnou povrchovou IgG protilátku proti DC16 (Fleit a kol., 1982, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 79: 3 275-3 279; Shen a kol., 1989, Mol. Immunol. 26: 959-969). Hybridomové buňky byly značeny inkorporováním ^5ICr-chromanu a kosedimentovány s efektorovými buňkami, připravenými infekcí linie lidských allospecifických cytotoxických T lymfocytů (CTL) rekombinanty vakcinií produkujícími CD16/CD7 kinázové fuzní proteiny. Produkce chimemích receptorových kináz dovoluje infikovaným CTL buňkám vázat se na cílové buňky, a pokud jsou toho schopné, tak je lýzovat, tento proces je měřen uvolněním inkorporovaného ⁵¹Cr. Relativní schopnost takto vybavených CTL je stanovena srovnáním poměru efektorových k cílovým buňkám potřebných k dosažení daného poměru uvolnění ⁵¹Cr. Obr. 4A ukazuje, že CTL produkující chimemí receptory obsahující Src skupinu kináz Lek nebo Fyn (T), nebo Syk skupinu kináz ZAP-70, nejsou schopné zprostředkovat cytolýzu proti anti-CD16 hybridomových cílům. CTL produkující kinázovou chiméru založenou na produktech Syk proteinů byly v podstatě tak účinné jako CTL produkující chiméru složenou z CD 16 fúzovaných stejným způsobem do intracelulámí domény zeta řetězce T buněčného receptoru. Cytolytická aktivita směrovaná CD16/CD7/kinázovými chimérami nemůže být vysvětlována nespecifickým uvolněním cytotoxických granulí, protože kosedimentace irelevantních chromanem značených cílů s kinázou vybavených CTL nevede k detekovatelnému uvolnění značeného chromanu (Obr. 4B).

Rozdíl mezi aktivitami Syk a ZAP-70 při cytolytickém stanovení byl neočekávané vzhledem k podobným aktivitám dvou chimér ve stanovení kalciové odpovědi. Vzhledem k důkazu, že koprodukce nechimerických ZAP-70 a Src-skupiny kináz vede k aktivaci COS buněk (Chán a kol., 1992, Cell 71: 649-662), zabývali jsme se vyhodnocením relativního potenciálu párů kinázových chimér ovlivňovat cytolýzu. CTL efektory byly koeinfektovány rekombinanty virů vakcinií kódujícími ZAP-70 a Lek chiméry, ZAP-70 a Fyn (T) chiméry, nebo Lek a Fyn (T) chiméry. Obr. 5A ukazuje, že koexpresní ZAP-70 a Fyn (T) chimér nebo ZAP-70 a LCK chimér vybavené CTL s aktivitou v podstatě stejně silnou, jako CTL produkující samotné CD16/CD7/Syk kinázové chiméry, aktivita je také stejně silná jako ta, která byla naměřena u CD16/CD7/zeta chimér. Koexprese Lek a Fyn (T) chimér neumožňuje signifikantní přesměrování cytolytického potenciálu proti anti-CD16 cílovým buňkám (Obr. 5A). Vyhodnocení kalciového mobilizačního potenciálu buněk koinfektovaných párem kinázových fuzních proteinů ukazuje, že koexprese kinázových chimér skupin ZAP-70 a Src zvýšilo rychlost, kterou bylo kalcium mobilizováno jako odpověď na receptorovou křížovou vazbu a že koexprese Lek a Fyn (T) chimér nevede k signafikantní akumulaci volného intracelulámího kalcia (Obr. 5B). Pro další výzkum úlohy Fyn chiméry při aktivaci odpovědi indukované koagregací jsme připravili Fyn chiméru skládající se z extracelulámích a transmembránových domén CD4 fúzovaných do Fyn podobným způsobem jaké u CD 16 chimér. Obr. 5C ukazuje, že účinnosti chiméry v tomto stanovení směrování cytolýzy je deset krát nižší, než u srovnatelné CD16 chiméry, za předpokladu, že pro aktivaci je důležité fyzické spojení chimemích kináz. Nicméně cytolytická aktivita buněk produkujících dvě chiméry je signifikantně větší než by bylo pozorováno pro buňky produkující samotnou ZAP-70 chiméru. Kvůli relativně vysoké kinázové

-18CZ 291754 B6 produkci v tomto systému nemůže být vyloučeno, že residuální aktivita nevyjadřuje spontánní náhodné spojení CD4/Fyn chiméry s CD16/ZAP-70.

Abychom zjistili, jestli aktivaci, pozorovanou při stanovení kalciové odpovědi i při stanovení cytolýzy, můžeme přisuzovat odpovídající kinázové aktivitě a ne pasivnímu spojení kináz s existujícími signálními transdukčními prvky, jejichž nepřímá agregace poté iniciuje aktivaci odpovědi, vytvořili jsme kinázové negativní varianty Syk a lidských ZAP-70 receptorových chimér. Obr. 6 ukazuje, že receptorové chiméry mají nedostatek buď substančně všech kinázových domén (v případě Syk), nebo nesou bodové mutace, které ruší fosfotransferasovou aktivitu (v případě ZAP-70), chyběla jim in vitro kinázová aktivita a nebyly schopné zprostředkovat mobilizaci kalcia jako následek křížové vazby, nebo zprostředkovat receptory přesměrovanou cytolýzu.

Protože interakce vepřové Syk s lidským buněčným aparátem nemohla být identická's interakcí lidské Syk, konstruovali jsme také podobné proteinové chiméry založené na lidské Syk, po izolaci lidských Syk sekvencí pomocí PCR s promery odpovídajícím amino a karboxy konci vepřové proteinové sekvence. Obr. 7A ukazuje, že vepřová a lidská Syk jsou nápadně podobné proteiny, o čemž svědčí analýza PCR produktů odpovídající částem kináz a sekundárním SH2 doménám (Chán a kol., 1992, Cell 71: 649-662). V souladu stím se lidské Syk chimemí receptorové proteiny při stanovení kalciové odpovědi a cytolytickém stanovení chovaly v podstatě stejně jako vepřové (Obr. 7B a 7C).

Aby bylo zjištěno, zda agregace chimemích tyrosin kináz vede k signifikantní změně v množství fosfotyrosinových proteinů, buňky negativní na T buněčné receptory byly infikovány rekombiannty vakcinií kódujícími chimérické kinázy. Extracelulámí domény chimér byly křížově vázány s protilátkami a celkové buněčné lysáty aktivovaných buněk byly frakcionovány elektroforézou, přeneseny do membrán a analyzovány protilátkou rozpoznávající fosfotyrosin. Lyzáty byly připraveny rozrušením buněk neionogenními detergenty v přítomnosti vanadičnanu s nebo bez EDTA, nebo lyžováním v přítomnosti dodecylsulfátu sodného a následnou sonitabní (ultrazvukovými vibracemi), aby byla rozstříhána uvolněná DNA. Typ fosfotyrosinových proteinů byl v každém případě různý a lyzáty připravené s vanadičnanem ale bez EDTA vykazovaly navíc typy nepřítomné v lyzátech připravených pouze v SDS, předpokládáme, že EDTA může inhibovat postlytickou funkci tyrosin kináz stejně jako fosfatas. Bylo zjištěno, že přímá lýze v SDS vede k více reprodukovatelným typům proteinové tyrosin fosforylace než lýze neionogenními detergenty v přítomnosti EDTA a vanadičnanu. Obr. 8 ukazuje, že agregace chimér nesoucích Syk, ZAP-70, nebo Fyn plus ZAP-70 má za následek objevení se nebo zvýšení fosforylace několika proteinových typů komigrujících s proteiny, které vykazují zvýšení fosforylace jako následek antigenní receptorové křížové vazby. Konkrétně, typ pásů vyvolaný Syk chimemím shlukováním je velmi podobný typu vyvolanému anti-CD3 protilátkou v buňkách positivních na T buněčné receptory (Obr. 8). Mezi nimi je přibližně 150 kD protein vyvolaný agregací Syk chiméry, ale také vyvolaný koagregací Fyn a ZAP-70 chimér. V předchozích experimentech s těmito fosfoproteiny bylo pozorováno, že komigrují spolu s fosfolipasou C-γ (údaje nejsou uvedeny).

Abychom objasnili účinky kinázových chimér shlukujících se přímo na PCL-γ, křížově jsme navázali chiméry, precipitovali PCL-γ se směsí monoklonálních protilátek a analyzovali jsme výsledné imunoprecipitáty na přítomnost fosfotyrosilových proteinů.OBr. 9 ukazuje, že shlukování Syk vede k významnému zvýšení obsahu tyrosin fosfátu PLC-γ, zatímco křížová vazba Fyn plus ZAP-70 chimér vede k méně dramatickému ale snadno detekovatelnému zvýšení u tyrosin fosfátu. Buňky produkující samotnou Fyn chiméru vykazují mírnou bazální fosforylaci PLC-γ, která není zvýšená po receptorové agregaci (Obr. 9). Zda jsou stejné tyrosinové zbytky fosforylovány Syk, Fyn nebo ZAP-70 plus Fyn není nyní známo. Protože buňky produkující Fyn chiméru nevykazují ani klidovou ani indukovanou kalciovou mobilizaci, může fosfotyrosinový

-19CZ 291754 B6 signál, pozorovaný u těchto buněk, reprezentovat utilizaci jiných míst na PLC-γ než těch, které zprostředkovávají fosfolipasovou aktivaci.

V předcházejícím pokusu objasnit změny ve fosfotyrosinových typech jsme určovali aktivitu různých kináz následně po shlukování in vitro autofosforylačním stanovení. Chiméry byly agregovány, imunoprecipitovány a byla vyjádřena jejich schopnost inkorporovat fosfátovou značku do proteinových typů přítomných v precipitátu. Obr. 10A ukazuje, že za těchto podmínek nebyl zjištěn žádný vzrůst kinázové aktivity po křížové vazbě, když bylo kinázové stanovení prováděno 10 minut. Ačkoliv inkorporace značícího fosfátu pokračovala zvýšením po 30 minutách stanovení, je nejasné, jaké faktory limitují aktivitu; v pozorované kinetice může být rozhodující rychlost disociace imunitních komplexů, která dovoluje kináze se rozptýlit, aby mohla ulitizovat substrát, při pokusu kontrolovat tento efekt a také maximalizovat sensitivitu stanovení jsme také vyhodnocovali kinázovou aktivitu s a bez předcházející křížové vazby po velmi krátkou dobu průběhu od 5 do 30 sekund; nicméně zde také nebyl nevýznamný vzrůst kinázové aktivity (Obr. 10B). Ačkoliv nyní nemůžeme vyloučit možnost, že vzrůst aktivity by mohl být pozorován s vhodným substrátem, agregací indukovaný vzrůst Syk chimerové aktivity také nebyl pozorován, pokud byl pro měření kinázové aktivity použit exogenní peptidový substrát (Y 19 K substituce cdc 2 zbytků 6-20).

Pravděpodobný mechanismus

Mechanismus, kterým jednoduchý fyzický podmět, receptorová agregace, vede k přenosu charakteristického chemického signálu do buněk imunitního systému zůstává neznámý.

V dřívějších studiích bylo zjištěno, že Src-skupina kináz se může spojovat s mnoha důležitými agregací aktivovanými receptory imunitních systému, a že křížová vazba těchto receptorů často vede ke zvýšení kinázové aktivity. Před nedávném bylo objeveno, že příbuzné Syk a ZAP-70 kinázy se spojují stabilně (v případě Syk) nebo dočasně (v případě ZAP-70) s antigenními receptory B a T buňky respektive, a nejméně v případě Syk bylo zjištěno, že receptorová křížová vazba vede k zvýšení kinázové aktivity.

V této práci bylo ukázáno, že agregace Syk skupiny kináz, ale nikoliv Src skupiny kináz Lek nebo Fyn, vede ke kalciové odpovědi v buňkách, které postrádají T buněčné receptory. Odpověď se objevuje ne jako následek nepřímého spojení s jiným receptorem T buňky nebo signálními transdukčními komponentami, protože kinázové negativní mutanti neindukují kalciovou odpověď. Agregace chimér obsahujících Syk kinázu je dostačující k poskytnutí indukce specifické cytolýzy, zatímco indukce podobné cytolýzy ZAP-70 chiméry vyžaduje další účast Src skupiny kináz. Nyní je nejasné, které ze Syk skupiny kináz hraje důležitější úlohu v aktivaci T buňky: jak ZAP-70 tak Syk jsou produkovány v T buňkách, včetně buněčných linií použitých v této studii, nejméně jedna odpovědná lidská T buněčná linie obsahuje Syk ale ne ZAP-70, jak bylo zjištěno specifickými PCR amplifikačními produkty. Druh zvýšené proteinové tyrosinové fosfory láce, který je pozorován následně po shlukování Syk chiméry je velmi podobný tomu druhu, kterýje pozorován po křížové vazbě antigenního receptorů T buňky.

Jeden jednoduchý model aktivace buněk imunitního systému nereceptorovými tyrosin kinázami vyvolává receptorové spojená kináza, jejíž agregace vede k aktivaci buď fyzikálním spojením (např. vznikem aktivních kinázových dimérů), nebo vzájemným enzymatickým působením (např. křížovou fosforylací); aktivovaný enzym potom působí na klíčové intracelulámí substráty nutné pro kalciovou mobilizaci a inositolfosfátové syntézy. Podporu pro tuto část událostí můžeme nalézt ve studiích, které publikují zvýšení aktivity receptorvě spojené kinázy následně po receptorové křížové vazbě (např. Bolen a kol., 1991, Adv. Cancer Res. 57: 103-149; Burkhardt a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 7 410-7 414; Eiseman a Bolen, 1992, Nátuře 355: 78-80; Hutchcroft a kol., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 107-9 111/J. Biol. Chem. 267: 8 613-8 619; Tsygankov a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 18 259-18 262; Wong a kol., 1992, Oncogene 7: 2 407-2 415). Avšak publikované změny v kinázové aktivitě jsou v mnoha případech mírné, a kontrastují s dramatickými změnami u typů fosfotyrosylových proteinů

-20CZ 291754 B6 pozorovaných in vivo. Protože je obtížné jednoznačně vyloučit aktivaci slabým allosterickými interakcemi s použitím in vitro kinázových stanovení, v tomto bodě nemůžeme učinit definitivní rozhodnutí ohledně relativní důležitosti kinázové aktivace iniciací signální transdukcí. Ale zde uvedené údaje předpokládají, že agregací indukované rozdělení enzymu substrátu může být významným faktorem při směrování existující aktivity k vhodnému fysiologickému cíli.

Agregace chimér založených na Syk skupině kináz vedla ke kalciové odpovědi, která byla mírně opožděná, ale rozsahem podobná odpovědi pozorované po agregaci zeta receptorových chimér v buňkách postrádajících endogenní T buněčný receptor. S výraznějším zpožděním se volné kalciové iony objevily po křížové vazbě ZAP-70 chiméry, a toto zpoždění by mohlo být v podstatě odstraněno křížovou vazbou ZAP-70 a Fyn chimér. V současnosti je vysvětlení pozorovaného prodlení nejasné. Protože křížová vazba urychluje mobilizaci kalcia, je snaha vysvětlovat prodlení relativní neúčinnosti ZAP-70 na agregací zprostředkovanou autoaktivaci. Ovšem stejně důležité mohou být i jiné faktory, a vazba ZAP a Syk kináz na buněčný povrch může být ve skutečnosti překážkou aktivace ve srovnání s normálním procesem; například pokud za normálních okolností jsou kinázy Syk skupiny dočasně transportovány do shluknutých receptorů, aktivovány a poté uvolněny difúzí ke svým substrátům, trvalá vazba kinázových domén na plasmatickou membránu může být omezující tím, že brání přístupu k substrátu a/nebo omezuje šíření signálu v důsledku neschopnosti chimemích receptorů fungovat jako druh katalytického centra pro aktivaci kinázy.

Druhým charakteristickým rysem kalciové odpovědi bylo zjištění, že buňky pozitivní na T buněčné receptory produkující chiméry založené na lidské nebo vepřové Syk vykazují vyšší základní koncentraci volného kalciového iontu, předpokládáme, že kalciové odpověď byla spuštěna spontánně. Podobný jev nebyl pozorován u receptorově negativních buněk. Tento výsledek je v rozporu s obecnou pozorovanou tendencí, podle které mutanty lidských T buněčných nádorových linií, negativní na T buněčné receptory, jsou obvykle vysoce citlivé na exogenně zavedené spouštěcí molekuly. K objasnění zřejmé potřeby T buněčných receptorů v spontánním aktivačním procesu navrhujeme dvě možná a související vysvětlení, první je, že chimemí Syk kináza může podstatně působit na intracelulámí domény T buněčného receptorů za vzniku fosfotyrosinových cílů pro SH2 domény receptorové chiméry, a toto vede k intracelulámí agregaci prostřednictvím multivalentního můstku T buněčného receptorů, která naopak zahajuje kinázovou aktivaci. Jiná možnost je, že buněčná linie, negativní na T buněčné receptory, může mít nižší hladiny membránově spojené kinázy potřebné k aktivaci Syk, buď protože globální regulační okruh vede ke snížené de novo syntéze hypotetické kinázy, nebo protože absence antigenních receptorů má za následek disregulovanou intracelulámí signalizaci.

Bylo publikováno, že v B buňkách je Syk kináza dočasně spojena s intracelulámími prvky IgM antigenního receptorů (Hutchcrofit a kol., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89: 9 107-9 111; Hutchcroft a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 8 613-8 619). Přesný mechanismus spojení je nejasný, ale jedna možnost je, že fosfotyrosin není nutný pro interakci Syk SH2 domén s tyrosinovými spouštěcími prvky přítomnými v cytoplasmatické doméně mb-1 a B 29 receptorových řetězců. Dílčí precedens pro tento předpoklad je zpráva, že genový produkt BCR oblasti zlomového shluku Philadelphského chromosomu se váže na různé SH2 domény způsobem nezávislým na fosfotyrosinu (Pendergast a kol., 1991, Cell 66: 161-171; Muller a kol., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5 087-5 093). V tomto případě ale pravděpodobně vyjde najevo, že fosfoserinové a/nebo fosfothreoninové zbytky mají kritickou úlohu v interakci. A nebo Syk se mohou spojovat s intercelulámími prvky IgM receptorů přes jedinečnou oblast umístěnou mezi Syk SH2 prvky a katalytickou doménou. Třetí možnost je, že k shromáždění funkčně důležitých hladin Syk na vnitřní část plasmatické membrány je třena pouze velmi malé množství tyrosinem fosforylovaného peptidu, a tato nízká hladina tyrosinového fosfátu může tedy uniknout detekci.

Ačkoliv v B buňkách nebyla potřeba Src skupiny kináz pro aktivaci definitivně určena, ukázala somatická genetika a genetika organismů, že v T buňkách dvě kinázy, Lek a Fyn (T), hrají důležité role (Appleby a kol., 1992, Cell 70: 751-763; Kamitz a kol., 1992, Mol. Cell. Biol.

-21CZ 291754 B6

12: 4 521-4 530; Stem a kol., 1992, Cell 70: 741-750; Straus a Weiss, 1992, Cell 70: 585-593). V současnosti nemůžeme přesvědčivě prokázat, jestli působení těchto kináz normálně předchází nebo následuje po působení Syk skupiny kináz. Jedna hypotéza objasňující působení ZAP-70 v T buněčné aktivaci předpokládá receptorově spojenou Src skupinu kináz, jejichž agregace dovoluje přechodnou fosforylaci receptorových řetězců a opět vede k spojení ZAP-70 a následné buněčné aktivaci. Počáteční fosforylace receptorových řetězců předpokládaná v tomto modelu musí být odlišena od stabilní fosforylace zeta, pozorované po delším čase po receptorově křížové vazbě.

U myších T buněk malé procento komplexů T buněčných receptorů obsahuje zeta-příbuzné molekuly nazývané eta (Baniyash a kol., 1988, J. Biol. Chem. 263: 9 874-9 878), které představují alternativní spojovanou formu (Clayton a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 5 202-5 206). Eta se liší od zety na karboxylovém konci, a nemá nejdistálnější z šesti tyrosinů, které nalézáme v myší zetě (Jin a kol., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 3 319-3 323). Ačkoliv fosforylace zeta řetězce myších TCR zeta-zeta isoforem může být snadno detekována po protilátkově zprostředkované receptorově křížové vazbě, za stejných podmínek není TCR eta řetězec detekovatelně fosforylován (Bauer a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3 842-3 846). Bylo zjištěno, že stabilní fosforylace zeta řetězce vyžaduje dva velmi blízké zeta řetězce, zatímco TCR isoformy nesoucí zeta-eta heterodiméry nejsou fosforylovány po receptorově křížové vazbě (Bauer a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 3 842-3 846). Fosforylace zety tedy, jak bylo pozorováno 30 minut po protilátkou zprostředkované receptorově agregaci, nekoreluje s aktivací. V separátní studii zkoumání časového průběhu akumulace fosfotyrosinových fosfoproteinů po TCR agregaci ukázalo, že nejdříve pozorovatelné druhy jsou dva proteiny o velikosti 135 a 100 kD, jejich fosforylace je nejprve detekovatelná v pěti a patnácti sekundách po křížové vazbě, respektive, a polovina jejich maximální fosforylace v obou případech přibližně ve 30 sekundách, a předchází poloviční maximální mobilizaci kalcia a vznik inositol fosfátu (June a kol., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7 722-7 726; June a kol., 1990, J. Immunol. 144:1 591-1 599). naproti tomu rychlost fosforylace zeta je podstatě nižší, vede k polovině maximální substituce při přibližně třech až pěti minutách po stimulaci, byla pozorována dlouho po akumulaci kalcia a uvolnění inositol fosfátů (June a kol., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7 722-7 726; June a kol., 1990, J. Immunol. 144: 1 591-1 599).

Tedy pokud je správný dvoustupňový model, tyrosinová fosforylace nutná k transportu ZAP-70 k vnitřní části plasmatické membrány musí být lychlejší, pravděpodobně přechodná, případ byl pozorován ve výše uvedených studiích. Nedávno se objevil předpoklad, že tyrosinová fosforylace s přiměřeně rychlým (asi patnáct sekund) začátkem může být detekována na zeta i CD3 epsilon řetězcích po receptorově Iďížové vazbě (Wange a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 11 685-11 688), a že lze zjistit, že 70 kD protein nesoucí tyrosinový fosfát je spojen s zeta i epsilon řetězci. Není stále jasné, zdaje stabilní spojení s fosforylovanými receptorovými řetězci bezpodmínečně nutné pro úspěšnou T buněčnou aktivaci.

Jako obecné tvrzení, zde publikované výsledky svědčí o tom, že Syk skupina kináz působí více přímo na efektorový aparát T buněk než Src skupina kináz. Více důkazů svědčí o tom, že Src skupina kináz se může spojovat s množstvím molekul buněčného povrchu, které nepatří do antigen/Fc receptorově skupiny, včetně CD2 (Bell a kol., 1992, Mol. Cell. Biol. 12: 5 548-5 554), CD3 (Sugie a kol., 1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88: 9 132-9 135), CD36 (Huang a kol., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5 467-5 473), IL-2 receptorový beta řetězec (Hatakeyama a kol., 1991, Science 252: 1 523-1 528) a různé fosfatidylinositolové upevněné proteiny (Stefanova a kol., 1991, Science 254: 1 016-1 019; Thomas a Samelson, 1992, J. Biol. Chem. 267: 12 317-12 322), u některých z nich je známo, že pro zahájení aktivace T buněk vyžadují další přítomnost antigenního receptorů. Jednoduché vysvětlení tohoto posledního požadavku může být takové, že cílové prvky na antigenním receptorů mají roli substrátů pro Src skupinu kináz, umožňující následné spojení Syk skupiny kináz, následované asi nějakým modifikačním dějem zahajujícím jejich aktivaci. Uvedené těžkosti objasnění příčinného řetězce fosforylace a aktivace mohou být také způsobeny tím, že spouštěcí prvky mají pouze přechodnou

-22CZ 291754 B6 roli, vystupují jako druh katalytického centra pro shromáždění, aktivaci a uvolnění efektorových kináz.

Src skupina kináz je všeobecně distribuována mezi nonhematopaetickými liniemi, dřívější studie používající Fyn negativní myši ukázaly úlohu Fyn při zachování dlouhodobé potenciace, způsob usnadnění synaptické transmise, o které předpokládáme, že je základem počáteční konsolidace asociaticní paměti. (Grant a kol., 1992, Science 258: 1 903-1 910).

Experimentální metody

Konstrukce chimeras. Všechny kódující oblasti lidské Lek (Koga a kol., 1986, Eur, J. Immunol. 16: 1 643-1 646), myší Fyn (T) (Cooke a Permutter, 1989, New. Biol. 1: 66-74), vepřové Syk (taniguchi a kol., 1991, J. Biol. Chem. 166: 15 790-15 796) a lidské ZAP-70 (Chán a kol., 1992, Cell 71: 649-662) kináz byly připojeny k intracelulámí doméně chimemího transmembránového proteinu skládajícího se z CD16 extracelulámí domény napojené na krátký 'stopkový' segment a transmebránovou doménu CD7. CD7 intracelulámí doména byla zkrácena na stop transferové sekvenci přidáním Mlu místa. Různé kinázy byly upraveny Mlu místem v příslušném čtecím rámci, aby došlo k expresi tripartitního fuzního proteinu. Prasečí Syk sekvence byla získána reverzní transkripcí a PCR totální prasečí lymfocytové RNA použitím primerů nesoucích vhodná restrikční místa. ZAP-70 sekvence byly podobně získány pomocí PCR z lidské T buněčné cDNA knihovny. Některé izoláty byly sekvenovány v paralele a nezmutované kódující sekvence byly pro každou kinázu odvozeny restrikční fřagmentovou záměnou. Výsledné kódující sekvence byly vloženy do expresního vektoru viru vakcinií ve směru od CD16/CD7 sekvencí. Lidský Syk byl izolován z knihovny cDNA přirozených buněčných zabij ečů a z Daudi buněčné knihovny z použitím primerů odpovídajícím koncům vepřové sekvence. Následující primer nesl sekvenci atg gca gac agt gcc aac cac ttg ccc ttc ttc t a reversní primer nesl sekvenci ege ggg gcg gcc get tta att cac cac gtac gta gta gta. Po úvodní amplifíkaci se objevila přítomnost pásů očekávané velikosti a reamplifikace (10 cyklů) byla provedena s použitím prodlouženého primem na 5' konci nesoucího sekvenci ege ggg acg cgt acc atg gca gac agt gcc aac, který umožňuje vazbu fragmentu na Mlu I-cut vektor.

Analýza mobilizace kalcia. Průtoková cytometrická a odměmá spektrofotometrická analýza byla provedena u buněk produkujících rekombinantní kinázy s použitím kalciově sensitivního fluoroforu Indo-1, jak je popsáno dříve (Romeo a Seed, 1991, Cell 64: 1 037-1 046; Romeo a kol., 1992, Cell 68: 889-897). Stručně, buňky zJurkartské mutantní sublinie JRT 3.T 3.5 (Weiss a Stobo, 1984, J. Exp. Med. 160: 1 284-1 299) byly infikovány rekombinanty viru vakcinií po dobu jedné hodiny v IMDM bez séra při násobnosti infekce deset a inkubovány tři až devět hodin v IMDM, 10% FBS. Buňky byly odstředěny centrifugám' a resuspendovány v hustotě 3xl0⁶/ml v kompletním médiu obsahujícím lmM Indo-1 acetomethoxyester (Grynkiewicz a kol., 1985, J. Biol. Chem. 260: 3 440-3 450) (Molekular Porbes, Eugene, OR) a inkubovány při 37 °C po dobu 45 minut. Indo-1 naplněné buňky byly peletovány a resuspendovány v hustotě 1 x 107ml v IDM bez séra a uchovány v temnu při laboratorní teplotě. Buňky byly analyzovány na volné kalciové ionty simultánním měřením emise fialové a modré fluorescence průtokovou cytometrií (Rabinovitch a kol., 1986, J. Immunol. 137: 952-961). K iniciaci kalciového toku byly přidány do suspense buněk buď nekonjugované 3G8 (anti-CD16) monoklonální protilátky (při 1 pg/ml) a následovně 10 pg/ml fycoeiythrin (PE)-konjugovaný Fab 02 kozí anti-myší IgG v čase 0, nebo byla přidána PE-konjugovaná anti-CD4 protilátka (Leu-3a, Bacton Dickinson), a následně nekonjugovaná sekundární protilátka.

Histogramy poměru fialové/modré emise byly shromážděny u PE pozitivních (infikovaných) buněčných populací, které obvykle reprezentovaly 48 až 80 % buněk. Poměr fialové/modré emise před přidáním protilátky byl použit k stanovení normalizovaného počátečního poměru a stanovení odpovídaj ících j ednotek.

-23 CZ 291754 B6

Lymfocytové cytolytické stanovení. A CD8⁺CD4“HLAB44 restriktované cytolytické linie (WH3) byly ošetřeny v IHDM, 10% lidském séru s 100 U/ml IL-2 a byly periodicky stimulovány s ozářenými (3000 rad) mononukleámími buňkami majícími HLAB44 haplotyp. Buňky byly pěstovány nejméně lOdní po stimulaci před jejich použitím ve stanovení cytotoxicity. Buňky byly infikovány rekombinanty vakcinií s násobností infekce nejméně deset po dobu 1 hodiny v médiu bez séra, pak následovala inkubace v kompletním médiu 3 hodiny. Buňky byly odstředěny centrifugací a resuspendovány s hustotou lxl0⁷/ml. 10 μΐ bylo přidáno do každé jamky mikrotitrační destičky s dnem ve tvaru U, která obsahovala 100 μΐ/misku kompletního média. Buňky byly ředěny v sériích v dvojnásobných krocích. Dvě jamky pro každý vzorek neobsahovaly lymfocyty, abychom získali pro měření spontánní uvolnění chrómu a totální absorpci chrómu. Aliquot 10⁶ 3G8 10-2 cílových buněk (Shen a kol., 1989, Mol. Immunol. 26: 959-969) byl centrifugován a Tesuspendován v 50 μΐ sterilních ⁵¹Cr chromanu sodném (lm Ci/ml, DuPont) po dobu jedné hodiny při 37 °C při občasném míchání, poté třikrát promyt PBS. Do každé jamky bylo přidáno 100 μΐ značených buněk resuspendovaných v médiu při 10⁵/ml. Mikrotitrační destička byla odstředěna při 750xg 1 minutu a inkubována 4 hodiny při 37 °C. Na konci inkubační doby byly buňky v každé jamce resuspendovány jemným pipetováním, vzorek odebrán pro stanovení celkových inkorporovaných jednotek a mikrotitrační destička byla odstředěna při 750xg 1 minutu. Byly odebrány 100 μΐ aliquoty supematantu a odečteny na scintilačním čítači gama paprsků. Poměr efektoru k cíli byl korigován a procenta infikovaných efektorových buněk (obvykle > 70%).

Tvorba mutant kinázových chimér. Vepřový Syk kinázový negativní spojený proteinový variant byl vytvořen štěpením chimeiy pomocí Stul a Notl (který leží právě 3' ke karboxylovému konci), vyplněním v místě Notl a ligací konců. Vzniklá sekvence spojuje před ukončením prvních 298 zbytků vepřového Syk k 4 extra zbytkům (GPRL). Bodová mutace (K369G) v ATP vazebném místě ZAP-70 byla vytvořena vložením duplexového oligonukleotidového fragmentu mezi Balí a Earl místa umístěná mezi nukleotidovými zbytky 1319 a 1345 vrchního řetězce sekvence popsané Chánem a kol. (1992, Cell 71: 649-662). Výsledná sekvence kóduje glycin v pozici 369 místo lysinu.

Imunosrážení a kinázový test, přibližně 2 χ 10⁶ Hela S3 buněk bylo infikováno po dobu jedné hodiny v DME médiu bez séra s rekombinanty vekcinií při násobnosti infekce přinejmenším deset. 5 hodin po infekci byly buňky sebrány, dvakrát promyty roztokem soli pufrovaným fosfátem a lyžovány v 1% Triton X-l00, 0,15MNaCl, 0,02 M HEPES pH7,3, 5mMEDTA, 5 mM NaF, 0,2 m MNaVO₃, 10 mg/ml leu peptin, 10 mg/ml protinin a 1 mM PMSF. Po 10 min inkubace na ledu byla jádra oddělena centrifugací a CD 16 spojené proteiny byly imunosráženy protilátkou BMA209/2 a protein-A sefarosou. Pryskyřice plná spojeného proteinu byla 3 krát promyta lyzovacím pufrem a nakonec promyta 20 mM Hepes pH 7,3. Ke každému vzorku bylo přidáno 10 ml kinázového pufru (20 mM Hepes pH 7,3, 10 mM MgCl₂, 10 mM MnCl₂), který obsahoval 10 mCi [g-³²P]ATP (>3000 Ci/mmol). Reakce byla ponechána inkubovat za laboratorní teploty po dobu 10 min a ukončena přidáním 20 ml 2X vzorkového pufru (4% SDS, 100 mM Tris pH 6,8, 20% glycerol a 10% b-merkaptoethanol). Pak byly vzorky po dobu 3 min vařeny a alikvotní podíly byly naneseny na 4 až 15% gradientový gel. Kinázové testy s rozpustným peptidovým substrátem, který odpovídá pozicím 6 až 20 cdc 2, ve které je tyr 20 nahrazen lys, byly provedeny podle doporučení výrobce (UBI).

Imunoblotační analýza protein tyrosinové fosforylace. TCR negativní 3.5 buňky byly infikovány rekombinantní virovou zásobní kulturou (násobnost infekce přinejmenším deset) po dobu jedné hodiny. Buňky byly následně inkubovány při 37 °C po dobu 8 až 12 h, centrifugovány, promyty a resuspendovány vlscově médiu bez séra při 10⁷ buněk na ml. Alikvotní podíly byly inkubovány s anti-CD16 mAb (3G8, Medarex nebo BMA209/2, Behringwerke) při 1 mg protilátky 2-3 χ 10⁶ buněk. Stimulované vzorky byly dále inkubovány 3-5 násobným přebytkem protilátky afinitní čistění anti-myší IgG 1 (Southem Biotechnology) po dobu 5 min. Buňky byly dále zpracovány podle Secrist, J. P., Bums, L. A., Kamitz, L., Koretzky, G. A. a Abraham, R. T.

-24CZ 291754 B6 (J. Biol. Chem. 268, 5 886-5 893, 1993) s mírnými úpravami. Inkubace byla ukončena přidáním SDS na konečnou koncentraci 1 % a vzorky byly vařeny po dobu tří minut. DNA byla přerušena ultrazvukem po dobu 1 min použitím Heat Systems Ultrasonics, lne., byl přidán 2x vzorkový pufr a alikvoty, které odpovídají 10⁵ až 2,5 x 10³ buněk byly odděleny na polyakryamidových gelech a proteiny byly přeneseny polosuchou elektroblokací (Hoefer) do nitrocelulosy (Schleicher a Schuel BA45). Filtry byly blokovány po dobu jedné hodiny v roztoku soli pufrovaném Tris s 0,05% Tween-20 (TBST) obsahujícím 1,5% kuřecí ovalbumin (Sigma), promyty v TBST a přeneseny do roztoku obsahujícího anti-fosfotyrosinovou protilátkou 4G1O (UBI) při zředění 1:10000 a inkubovány při 22 °C po dobu 1 až 2 h. Po promytí TBST, byly filtry inkubovány v TBST a konjugátu anti-myší křenové peroxidasy při zředění 1:5000 po dobu 1 h. Pásy fosforylovaných proteinů byly detekovány chemiluminiscencí (ECL, Amersham). Čas expozice se měnil mezi 2 s až 5 min.

Konstrukce lidských IgGl: protein-tyrosin kinázových chimér

Mohou být produkovány chimemí molekuly, které zahrnují extracelulámí doménu protilátkové molekuly specifické pro cílovou buňku a intracelulámí doménu protein tyrosin kinázy (např. kinázy popsané v předkládaném vynálezu). Aby se vyrobila takové molekula, jsou připraveny sekvence těžkého řetězce lidského IgGl připojením sekvencí Ch3 domény k cDNA fragmentu odvozenému od 3' konce transmembránové formy protilátkové mRNA. Fragment 3' konce je získán polymerasovou řetězcovou reakcí pomocí tosilové cDNA knihovny jako substrátu a oligonukleotidů následujících sekvencí:

CGC GGG GTG ACC GTG CCC TCC AGC AGC TTG GGC a

CGC GGG GAT CCG TCG TCC AGA GCC CGT CCA GCT CCC CGT CCT GGG CCT CA, které odpovídají 5' a 3' koncům žádaných DNA fragmentů. 5' oligomer je komplementární k místu vC_Hl doméně lidského IgGl a 3' oligomer je komplementární k místu 5' sekvencí kódujících doménu přemosťující membránu, produkt PCR je digerován BstXI a BamHI a ligován mezi BstXI a BamHI místa semisyntetického genu IgGl protilátky, kteiý obsahuje proměnné a konstantní oblasti. Po inserci BstXI do fragmentu BamHI, jsou zesílené části konstruktu umístěny až k Smál místu C_H3 pomocí restrikční výměny fragmentu tak, že z PCR reakce je odvozena pouze část mezi Smál místem a 3' oligomerem.

Aby se vytvořil lidský IgGl chimemí receptor, gen těžkého řetězce, který končí v BamHI místě, je připojen ke kinázové intracelulámí doméně standardními technikami. Množství exprese chimemích receptorů lze stanovit proudovou cytometrií. Zvýšení exprese může být způsobeno koexpresí plazmidů s cDNA kódující lehký řetězec protilátky.

Aby se vytvořila jednoduchá transkripční jednotka, která by umožnila jak lehkého tak těžkého řetězce z jediného promotoru, je ze sekvencí kódujících těžký a lehký řetězec a 5' nepřepisované části mRNA kódující 78 kD glukózou regulovaný protein, jinak známý jako grp78 nebo BiP, vytvořen plazmid kódující bicistronní mRNA. grp78 sekvence jsou získány PCR lidské genomové DNA pomocí primerů, které mají následující sekvence:

CGC GGG CGG CCG CGA CGC CGG CCA AGA CAG CAC a

CGC GTT GAC GAG GAG CCA GTT GGG CAG CAG CAG na 5' a 3' koncích. Polymerasová řetězcová reakce byla provedena s těmito oligomery v přítomnosti 10% dimethylsulfoxidu. Fragment získaný PCR je digerován sNotl a HincII a vložen mezi Notl a Hpal místa protisměrně od sekvencí kódujících lidský IgG. Sekvence kódující lidský IgG kapa lehčí řetězec cDNA jsou pak vloženy protisměrně od grp78 leaderu, pomocí HincII místa a dalšího místa ve vektoru. Expresní plazmid vzniklý těmito manipulacemi

-25CZ 291754 B6 sestává ze semisyntetického genu těžkého řetězce, následovaného sekvencemi grp78 leaderu, následovaného sekvencemi kapa lehkého řetězce cDNA, následovaného polyadenylačními signály odvozenými od SV40 DNA fragmentu. Již jsme demonstrovali, že transfekce COS buněk s tímto expresním plazmidem poskytla značně lepší expresi determinantů těžkého řetězce ve srovnání s transfekcí plazmidu kódujícího pouze determinanty těžšího řetězce.

Aby se vytvořil bicistronní gen, který obsahuje těžký řetězec /receptorovou chiméru a lehký řetězec, sekvence těžkého řetězce ve směru řetězce lze nahradit jakýmkoliv genem chimemího těžkého řetězce/ receptoru popsaným v předkládaném vynálezu.

Po konstrukci mohou být IgG -tyrosin kinázové chiméry klonovány do expresních vektorů, vkládány do hostitelských buněk a testovány jakýmikoliv testy popsanými v tomto dokumentu (např. testem mobilizace vápníku nebo cytolytickým testem).

Konstrukce CD4-tyrosin kinázových chimér

Mohou být produkovány chimemí molekuly, které zahrnují extracelulámí doménu CD4 molekuly a intracelulámí doménu protein tyrosin kinázy (např. kinázy popsané v předkládaném vynálezu). Aby se vyrobila taková molekula, je izolována (například tak, jak je popsáno výše) tyrosin kinázu kódující sekvence (například, cDNA). Tato sekvence je pak připojena standardními technikami k extracelulámí doméně vyrobené formy CD4, která obsahuje BamHI místo právě proti membránou přemostěné doméně (Aruffo a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 8 573-8 577 (1987b); Zettlmeissl a kol., DNA Cell Biol.. 9 347-9 353 (1990)). Aby vznikl tento spojená protein, BamHI místo může být umístěno do sekvence na vhodném místě (opět, standardními technikami). Genová spojení jsou vkládána do vakciniového virového expresního plazmidu (jak je popsáno v předkládaném vynálezu) a vkládána do genomu vakciniového kmenu WR homologní rekombinací a selekcí na růst v kyselině mykofenolové (Falkner a kol.-, J. Virol.. 62: 1 849-1 854 (1988); Boyle a kol., Gene, 65: 123-128 (1988)). Proudová cytometrická analýza je použita k testování exprese pomocí vakciniových rekombinantů CD4-tyrosin kinázové spojených proteinů na buněčném povrchu. Imunosrážení buněk infikovaných vakciniových rekombinantů se používá k ověření výsledků (jak je popsáno výše).

Účinnost CD4 chimér může být testována jakýmkoliv testem mobilizace vápníku nebo cytolytickým testem, které jsou popsány v tomto dokumentu. V jednom konkrétním příkladu, je vytvořen model cíl: efektor systém založený na CD4 rozpoznání HIV obalového gpl20/gp41 komplexu. HeLa buňky jsou infikovány rekombinantním vakciniovým virem, který exprimuje gpl20/gp41 (Chakrabarti a kol., Nátuře, 320: 535-537 (1986); Earl a kol., J. Virol., 64: 2 4482 451 (1990)), a označení ⁵¹Cr. Označené buňky jsou inkubovány s buňkami z lidské allospecifické (CD8⁺, CD4 ) cytotoxické T lymfocytové linie, která byla infikována vakciniovými rekombinanty, které exprimují CD4 tyrosin kinázovou chiméru, a otestovány na specifickou lyži.

Pro kontrolu možnosti, že vakciniová infekce může podporovat artefaktní rozpoznávání pomocí CTL, byly provedeny podobné cytolytické experimenty s cílovými buňkami infikovanými vakciniovými rekombinanty exprimujícími fosfatidylinositol spojenou formou CD 16 (CD16pi) a označenými ^5,Cr a sCTL infikovanými kontrolními rekombinanty exprimujícími CD16 chiméry.

V dalším příkladu jsou přitažlivé buňky, pro expresi CD4 - tyrosin kinázových chimér, neutrofilní granulocyty, které mají velmi krátkou dobu života (= 4 h) v oběhu a jsou silně cytolytické. Infekce neutrofílů HIV pravděpodobně nevede k uvolnění viru a hojnost výskytu těchto buněk (nejvíce převládající z leukocytů) by měla způsobit obranu hostitele. Další přitažlivost možností pro hostitelské buňky jsou maturované T buňky, populace v současnosti přístupná retrovirálním úpravám (Rosenberg, S. A. Sci. Am.. 262: 62-69 (1990)). S pomocí rekombinantní IL-2, T buněčné populace mohou být relativně snadno expandovány v kultuře

-26CZ 291754 B6 a expandované populace mají po reinfusi omezenou životnost (Rosenberg a kol., N, Engl. J. Med.. 323: 570-578 (1990).

Za vhodných podmínek může rozpoznání HIV buňkami exprimujícími CD4 chiméry vést kmitogennímu stimulu, který způsobí, že populace buněk dynamicky odpovídá na virovou infekci. Ačkoliv jsme se zde soustředili na chování spojených proteinů v cytolytických T lymfocytech, exprese chimér v pomocných lymfocytech může být HIV - mobilizovaným zdrojem cytokinů, které působí jako protiváha kolapsu pomocných buněk, který vede k AIDS. Současné práce, které popisují několik schémat pro úpravu odolnosti vůči infekci v jiných momentech než je penetrace viru (Friedman a kol., Nátuře, 335: 452-454 (1988); Green a kol., Cell, 58: 215-223 (1989); Malim a kol., Cell, 58: 205-214 (1989); Trono a kol., Cell, 59: 113-120 (1989); Bouconore a kol., Nátuře, 345: 625-628 (1990)), navrhují, aby buňky, které nesou CD4 chiméry byly navrženy tak, aby překazily produkci viru expresí vhodných agens, které mají intracelulámí místo působení.

Schopnost přenášet signály k T lymfocytům pomocí autonomních chimér také poskytuje možnost regulace retrovirálně upravených lymfocytů in vivo. Zesíťovací stimul, vyvolaný například specifickými IgM protilátkami upravenými tak, že jsou odstraněny komplement - vazebné domény, umožní zvýšení takových lymfocytů in sítu, zatímco působení podobných specifických IgG protilátek (například rozpoznávajících aminokyselinové změny vpravené do chimemího řetězce) může vést k selektivní depleci upravené populace. Již dříve jsme stanovili, že anti - CD4 IgM protilátky nevyžadují další zesíťování, aby mobilizovaly vápník vJurkatových buňkách exprimujících CD4: dzéta chiméry. Schopnost regulovat populace buněk bez další pomoci opakování extrakorpolámí amplifikace může podstatně přesáhnout rozsah a účinnost současného použití navržených geneticky upravených T buněk.

Další provedení

Aby se vytvořily další chiméry, které obsahují protein kinázové intracelulámí sekvence, cDNA nebo genomické sekvence kódující extracelulámí doménu receptorů lze vybavit restrikčním místem vloženým v místě, které právě předchází vybrané extracelulámí doméně. Fragment extracelulámí domény ukončený v restrikčním místě lze připojit k protein kinázovým sekvencím. Typické extracelulámí domény lze odvodit od receptorů, které rozpoznávají doplněk, cukry, virální proteiny, baktérie, protozoální nebo metazoální parazity nebo proteiny, které jsou jimi indukovány. Podobně, ligandy nebo receptory exprimované patogeny nebo nádorovými buňkami lze připojit k protein kinázovým sekvencím, aby se řídily imunitní odpovědi proti buňkám, které nesou receptory, které rozeznávají tyto ligandy.

Aby se identifikovala minimální protein kinázová sekvence nezbytná pro cytolýzu, lze pomocí standardních technik připravit sérii delečních mutantů, ve kterých je postupně odstraňováno stále více z kinázové extracelulámí domény. Tito deleční mutanti se testují na účinnost jakýmkoliv testem popsaným v předkládaném vynálezu. Použitelné intracelulámí domény pro Syk protein kinázu zahrnují, například, amino kyseliny 336-628 vepřové Syk sekvence a aminokyseliny 338— 630 lidské Syk sekvence.

Ačkoliv byl vynález popsán ve spojení s jeho konkrétními provedeními, je jasné, že je možné provést další modifikace a tato přihláška je zamýšlena tak, že pokrývá různé variace, použití nebo adaptace předkládaného vynálezu a zahrnuje taková provedení předkládaného vynálezu, která na základě problematiky, do které předkládaný vynález spadá, lze provést s využitím esenciálních vlastností, které byly popsány výše, a spadají do rámce následujících patentových nároků.

-27CZ 291754 B6

Seznam sekvencí (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: Briad Sedd

Charles Romeo Waldemar Kolanus (ii) Název vynálezu: Přesměrování funkční imunity chimemími receptory (iii) Počet sekvence: 8 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresář: Frish & Richardson (B) Ulice: 225 Fraknklin Street (C) Město: Boston (D) Stát: Massachusetts (E) Země: U.S.A.

(F) Kód: 02110-2804 (v) Forma určená pro počítač:

(A) Typ média: 3,5” disketa, 1,44 Mb (B) Počítač: IBM PS/2 Model 50Z nebo 55SX (C) Operační systém: MS-DOS (Verze 5.0) (D) Software: WordPerfect (Verze 5.1) (vi) Současná data přihlášky:

(A) Číslo přihlášky: 08/093,210 (B) Datum podání: 16. 7. 1993 (C) Klasifikace:

(vii) Informace o právním zástupci:

(A) Jméno: Paul T. Clark (B) Registrační číslo: 30,162 (C) Refenční číslo: 00786/195001 (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: (617)542-5070 (B) Fax: (617)542-8906 (C) Telex: 200154 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

-28CZ 291754 B6 (A) Délka: 33 (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 1:

CGCGGGGTGA CCGTGCCCTC CAGCAGCTTG GGC 33 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo: 2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 50 (B) Typ. nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 2:

CGCGGGGATC CGTCGTCCAG AGCCCGTCCA GCTCCCCGTC CTGGGCCTCA 50 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo: 3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 33 (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 3:

CGCGGGCGGC CGCGACGCCG GCCAAGACAG CAC 33 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo: 4:

(i) Charakteristiky sekvence (A) Délka: 33 (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 4:

CGCGTTGACG AGCAGCCAGT TGGGCAGCAG CAG 33 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo: 5:

(i) Charakteristiky sekvence

-29CZ 291754 B6 (A) Délka: 630 (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitost: N/A (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 5:

Met

Ala

ABp

Ser

Ala

Asn

Hle

Leu

Pro

Phe

Phe

Phe

Gly

His

Zle

Thr

1

5

10

15

Arg

Clu

Glu

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu

Val

Gin

Gly

Gly

Met

Ser

Asp

Gly

20

25

30

Lau

Tyr

Leu

Leu

Arg

Gin

Sér

Arg

Asn

Tyr

Leu

Cly

Cly

Phe

Ala

Leu

35

40

45

Ser

vál

Ala

His

Gly

Arg

Lye

Ala

His

Asn

Tyr

Thr

Xle

Clu

Arg

Glu

50

55

60

Leu

Asn

Gly

Thr

Tyr

Alá

Ile

Ala

Gly

Cly

Arg

Thr

His

Ala

Ser

Pro

65

70

75

80

Ala

Asp

Leu

cyt

Asn

Tyr

His

Ser

Gin

Clu

Ser

AŠp

Gly

Leu

Val

Cys

85

90

95

Leu

Leu

Lya

Lya

Pro

Phe

Asn

Arg

Pro

Gin

Gly

val

Gin

Pro

Lya

Thr

100

105

110

Cly

Pro

Phe

Glu

Asp

Leu

Lye

Glu

Asn

Leu

Zle

Arg

Glu

Tyr

Val

Lys

115

120

125

Gin

Thr

Met

Aan

Leu

Gin

Gly

Gin

Ala

Leu

Glu

Gin

Ala

Zle

Zle

Ser

130

135

140

Gin

Lye

Pro

Gin

Leu

Glu

Lye

Leu

Zle

Ala

Thr

Thr

Ala

His

Glu

Lys

145

150

155

160

Met

Pro

írp

Phe

His

Gly

Lye

Zle

Ser

Arg

G1U

Zle.

ser

Thr

Gin

Xla

165

170

175

Val

Leu

Xle

Gly

Ser

Lye

Thr

Asn

Gly

Lye

Phe

Leu

Zle

Arg

Xla

Arg

180

185

190

*’P

Asn

Aan

Gly

Ser

Tyr

Ala

Leu

Čys

Leu

Leu

Hit

Zle

Gly

Lys

Val

195

200

205

Leu

His

Tyr

Arg

Zle

Asp

Lye

Atp

Lye

Thr

Gly

i-ý·

Leu

Ser

Zle

Pro

210

215

220

Glu

Gly

Lya

Lys

Phe

Asp

thr

Leu

Trp

Gin

Leu

Val

Glu

HiS

Tyr

Ser

225

230

23S

240

Tyr

Lya

Ala

Aep

Gly

Leu

Leu

Arg

Val

Leu

Thr

Val

Pro

cys

Cln

Lys

245

250

255

tle

Gly

Thr

Gin

Gly

Xcn

Val

Asn

Phe

cly

Gly

Arg

PrO

cln

Leu

Phe

260

265

270

-30CZ 291754 B6

Cly

Ser

Hle

Pro

Ala

Thr

His

Ser

Ala

Gly

Gly

Zle

Zle

Ser

Arg

Zle

275

280

285

Lye

Ser

Tyr

Ser

Phe

Pro

Lys

Pro

Gly

His

Arg

Lys

Ser

Ser

Pro

Ala

290

295

300

Gin

Gly

Asn

Arg

Gin

Glu

Ser

Thr

Val

Ser

Phe

Asn

Phe

Tyr

Glu

Pro

305

310

315

320

Clu

Leu

Ala

Pro

His

Ala

Ala

Asp

Lys

Gly

Pro

Gin

Arg

Zle

Ala

Leu

325

Val

330

335

Pro

Met

Asp

Thr

Glu

Tyr

Glu

Ser

Pro

Tyr

Ala

Asp

Pro

Glu

Glu

11·

340

345

350

Arg

Pro

Lye

Glu

Val

Tyr

Leu

Asp

Arg

Ly«

Leu

Leu

Thr

Leu

Glu

355

360

365

Aap

Lys

Glu

Leu

cly

ser

Gly

Asn

Phe

Gly

Thr

Val

Lys

Lys

Gly

Tyr

Tyr

370

375

380

Gin

Met

Lye

Lys

Val

val

Lys

Thr

Val

Ala

Val

Lys

Zle'

‘Leu

Lys

385

Glu

Ala

390

395

400

Asn

Asn

Aap

Přó

Ala

Leu

Lys

Asp

Glu

Leu

Leu

Ala

Glu

Ala

405

410

415

Asn

Val

Met

Gin

Gin

Leu

Asp

Aert

Pro

Tyr

Ile

Val

Arg

Met

Ile

Cly

420

425

430

Zle

Cys

Glu

Ala

Glu

Ser

Trp

Met

Leu

Vál

Met

Glu

Met

Ala

Glu

Leu

435

440

445

Gly

Pro

Leú

Aen

Lys

Tyr

Leu

Gin

Gin

Asn

Arg

His

val

Lys

Leu

Lys

450

455

460

Asn

Ile

Zle

Glu

Leu

Vál

His

Gin

Val

Ser

Met

Gly

Met

Lys

Tyr

Leu

465

470

475

480

Clu

Glu

Ser

Aen

Phé

Val

His

Arg

Asp

Leu

Ala

Ala

Arg

Aan

Val

Leu

485

490

495

Leu

Val

Thr

Gin

His

Tyr

Ala

Lys

Zle

Ser

Α·Ρ

Phe

Gly

Leu

Ser

Lys

500

505

510

Alt

Leu

Arg

Ala

Asp

Glu

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Ala

Gin

Thr

His

Gly

Lys

515

520

525

Trp

Éro

Val

Lye

Trp

Tyr

Ala

Pro

Glu

Cys

Zle

Asn

Tyr

Tyr

Lys

Phe

530

535

540

Ser

Ser

Lye

Ser

Asp

Vál

His

Ser

Phe

Gly

val

I^U

Met

Aen

Glu

Ala

545

550

555

560

Phe

Ser

Tyr

Gly

cm

Lys

Phe

Tyr

Arg

Gly

Met

Lys

Gly

Ser

Glu

Val

565

570

575

Zle

Ala

Met

Leu

Glu

Lys

Gly

Glu

Arg

Met

Gly

Cys

Pro

Ala

Gin

Oys

550

585

590

Pro

Arg

Glu

Met

Tyr

Asp

Leu

Met

Asn

Leu

Cys

Trp

Thr

Tyr

Asp

Val

595

600

605

Glu

Asn

Arg

Pro

Gly

Phe

Ala

Ala

Vál

Glu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Tyr

610

615

620

Tyr Tyr Asp Val Val λιη

625 630 (2) Informace o sekvenci identifikační číslo: 6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 628 (B) Typ: aminokyselinová (C) Vláknitost: N/A (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 6:

-31 CZ 291754 B6

Mět Ala Asp Ser Ala Asn His T 0
Arg Clu Clu Ala 20 Leu Tyr Leu Leu	a Glu Aap Arg Gin	Tyt Ser
Ser	1 vai 50	**9 Ala Tyr	ASp	Arg	Lys 55
Leu 65	Aan	Gly Thr	Tyr	Ala 70	Zle
Ala	Glu	Leu Cya	Bia 85	Tyr	Hia
Leu	Leu	Lya Aan 100	Pro	Phe	Asn
Cly	Pro	Phe Olu 115	Aap	Leu	Lys
Gin	Thr 130	His Aan	Leu	Gin	Gly 135
Gin 145	Lya	Pro Gin	Leu	Glu 150	Lys
Met	Pro	Trp Phe	Hia 165	Gly	Lys
Val	Leu	Tle Gly 180	Ser	Lya	Zle
Asp	Met	Gly Ser 195	Tyr	Ala	Leu
Met	Tyr Arg Zle Asp 210	Lya	Aap 215
Cly 225	Lya	Aan Phe	Asp	Thr 230	Leu
Lya	Ser	Aap Gly	Leu 245	Leu	Arg
cly	Giy	Gin Thr 260	Gly	Aan	Asp
Hle	Ser	Ala Thr 275	Trp	Ser	Ala
Tyr	Sér 290	Phe Pro	Lya	Pro	Cly 295
Aan 305	Árg	Pro Glu	Ser	Leu 310	Val
Gly	Phe	Trp Ala	Asn 325	Glu	Arg
Aap	Thr	Glu val 340	Val	Glu	Ser
Pro	Lya	Glu Val 355	Tyr	Léu	Aap
Glu	Leu 370	Gly Ser	Gly	Aan	PHe 375
Met 385	Lye	Lya Val	Val	Lya Thr 390
Ala	Aan	Aap Pro	Ala 405	Leu	Lys
Met	Gin	Gin Leu 420	Aap	Aan	Pro
Glu	Ala	Ser Ser 435	Trp' Met	Leu
Leu	Aen 450	Lya Tyr	Le.u Gin	Gin 455
Zle 465	G1U	Leu Val	His	Gin 470	val
Cya	Aen	pro Val	His 485	Arg	Aap
thr	Gin	His Tyr 500	Ala	Lys	Zle
Arg	Ala	Aap Glu 515	Aan	Tyr	Tyr
Val	Lya 530	Trp Tyt	Ala	Pro	Glu 535
Lya 545	Ser	Aap Val	Aan	Ser 550	Phe

Pro Phe	Phe Phe Gly Gin	Zle Thr
Val 25	10					15
Gin Gly Gly	Met	Sér 30	ABp	Gly
Asn	Tyr	Leu	Gly	Gly 45 Zle	Phe	Ala	Leu
His	His	Tyr	Thr 60	G1U	Arg	Glu
Cly	Gly	Arg 75	Thr	His	Gly	Ser	Pro 80
Gin	Glu 90	Leu	Asp Gly	Leu	Val ůe	cya
Pro 105	Pro	Gly	Val	Gin	Pro 110	73 Lys	Thr
Aan	Léu	Zle	Arg	Glu 1 *)C	Tyr	Val	Lye
Ala	Leu	Glu	Gin 140	Ala	Zle	Zla	Ser
Zle	Ala	Thr 155	Thr	Ala	His	Glu	Lys 160
Ser	Arg 170	Asp	Glu	ser	Clu	Gin 175	Zla
Gly 185	Lye	Phe	Leu	Zle	Arg 190	Ala	Arg
Leu	Leu	His	Zle	Gly Lya 205	Val	Léu
Thr	Gly Lys	Leu 220	Ser	Ila	Pro	Gly
Gin,	Léu	Val 235	Glu	Lys	Tyr	Ser	Tyr 240
Leu	Tht 250	val	Pro	Cya	Gin	Lys 2S5	Zle
Phe 265	Arg	Pro	Gin	Leu	Phe 270	Ser	Ala
Gly	Zle	Zle	Sér	Arg 285	Zle	Ly·	Ser
Arg	Lya	Ala	Set 300	Ser	Pro	Gin	Gly
Tyr	Aan	Phe 315	Tyr	G1U	Ser	Asp	*^g 320
Ala	Gin 330	Arg	Glu	Ala	Leu	Pro 335	Met
Tyr 345	Ala	Asp	Pro	Glu	Glu 350	Zla	Arg
Lys	Leu	Leu	Thr	Leu 365	Clu	λ·Ρ	Lye
Thr	val	Lys	Lys 380	Cly Tyr Tyr	Gin
Ala	val	Lys 395	Zle	Leu	Lys	haň	Glu 400
Glu	Leu 410	Leu	Ala	Glu	Ala	Aan 415	Val
Zlé 425	Val	Arg	Met	Zle	Gly 430	Zle	Cys
Met	Glu	Met	Ala	Glu 445	Leu	Cly	Pro
Arg	His	Val	Lys 460	Asp Lys	Asn	Zle
Met	Gly	Met 475	Lya	Tyr	Leu	Glu	Clu 480
Ala	Ala Arg 490	Asn	Val	Leu	Leu 495	Val
Aap 505	Phe	Gly	Leu	Sér	Lya 510	Ala	Leu
Ala	Gin	Thr	His	Gly 525	Lys	Trp	Pro
Zle	Asn	Tyr	Tyr 540	Ly*	Phe	Ser	Ser
Val	Leu	Met 555	Trp	Glu	Ala	Phe	Ser 560

-32CZ 291754 B6

Tyr

Cly

Gin

Lya

Phe

Tyr

Arg

Cly

Met

Lye

cly

ser

Clu

Val

ser

Ala

565

570

575

Kať

Leu

Clu

ty*

Gly

Glu

Arg

Met

Cly

Cye

Phe

Phe

Cly

Cy«

Phe

Arg

sao

585

590

Clu

Met

Tyr

Clu

Leu

A«n

Thr

Leu

Cya

Asn

Thr

Tyr

Asp

Val

Clu

Asn

595

600

605

Arg

Pro

Cly

Phe

Val

Ala

Val

Clu

Leu

Arg

Leu

Arg

Asn

Tyr

Tyr

tyr

610

615

620

Αβρ Val Val Asn

625 (2) Informace o sekvenci indentifikační číslo: 7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 34 (B) Typ: nukelokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 7:

ATGGCAGACA GTGCCAACCA CTTGCCCTTC TTCT 34 (2) Informace o sekvenci indentifikační číslo: 8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 39 (B) Typ: nukleokyselinová (C) Vláknitost: jednoduchá (D) Topologie: lineární (xi) Popis sekvence: sekv. id. č.: 8:

CGCGGGGCGG CCGCTTTAAT TCACCACGTC GTAGTAGTA 39

Claims (22)

1. Proteinový chimemí receptor vázaný k membráně terapeutické buňky, který sestává z (a) intracelulámí části protein-tyrosin kinázy, která je schopna signalizovat terapeutické buňce, aby likvidovala cílovou buňku vázanou receptorem nebo cílové infekční agens vázané receptorem a (b) extracelulámí části, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, přičemž tato terapeutická buňka je schopna specifického rozpoznávání a likvidace cílové buňky nebo cílového infekčního agens.

2. Proteinový chimemí receptor podle nároku 1, ve kterém je protein-tyrosin kináza ze skupiny Syk kináz.

3. Proteinový chimemí receptor podle nároku 2, ve kterém protein-tyrosin kináza je Syk.

4. Proteinový chimemí receptor podle nároku 2, ve kterém intracelulámí část zahrnuje lidské Syk aminokyseliny 336-628 nebo vepřové Syk aminokyseliny 338-630.

5. Proteinový chimemí receptor podle nároku 1, ve kterém extracelulámí část zahrnuje HIV část CD-4 vázající obal.

6. Proteinový chimemí receptor podle nároku 1, ve kterém extracelulámí část zahrnuje ligand - vázající část receptoru, receptor - vázající část ligandu, antigen - vázající část protilátky nebo jejich funkční derivát.

7. Terapeutická buňka, která exprimuje proteinový chimemí receptor vázaný k membráně, který sestává z (a) intracelulámí části protein-tyrosin kinázy, která je schopna signalizovat terapeutické buňce, aby likvidovala cílovou buňku vázanou receptorem nebo cílové infekční agens vázané receptorem a (b) extracelulámí části, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, přičemž tato terapeutická buňka je schopna specifického rozpoznávání a likvidace cílové buňky nebo cílového infekčního agens.

8. Terapeutická buňka podle nároku 7, která exprimuje druhý proteinový chimemí receptor vázaný k membráně, přičemž tento druhý chimemí receptor sestává z (a) intracelulámí části druhé protein-tyrosin kinázy, která je schopna signalizovat terapeutické buňce, aby likvidovala cílovou buňku vázanou receptorem nebo cílové infekční agens vázané receptorem a (b) extracelulámí části, která je schopna specificky rozpoznávat a vázat cílovou buňku nebo cílové infekční agens, přičemž tato terapeutická buňka je schopna specifického rozpoznávání a likvidace cílové buňky nebo cílového infekčního agens.

9. Terapeutická buňka podle nároku 7, ve které je protein-tyrosin kináza ze skupiny Syk kináz.

10. Terapeutická buňka podle nároku 9, ve které protein-tyrosin kináza je Syk.

11. Terapeutická buňka podle nároku 10, ve které intracelulámí část zahrnuje lidské Syk aminokyseliny 336-628 nebo vepřové Syk aminokyseliny 338-630.

12. Terapeutická buňka podle nároku 8, ve které je jedna z protein-tyrosin kináz ze skupiny Syk kináz a jiná protein-tyrosin kináza je ze skupiny Src kináz.

13. Terapeutická buňka podle nároku 12, ve které jedna z protein-tyrosin kináz je ZAP-70 a jiná protein-tyrosin kináza je Fyn.

-34CZ 291754 B6

14. Terapeutická buňka podle nároku 12, ve které jedna protein-tyrosin kináza je ZAP-70 a jiná protein-tyrosin kináza je Lek.

15. Terapeutická buňka podle kteréhokoliv z nároku 13 nebo 14, ve které ZAP-70 část zahrnuje lidský ZAP-70 Typ 369.

16. Terapeutická buňka podle kteréhokoliv z nároku 7 nebo 8, kdy jsou terapeutické buňky vybrány ze skupiny sestávající z: (a) T lymfocytů; (b) cytotoxických T lymfocytů; (c) buněk přirozených zabíječů; (d) neutrofílů; (e) granulocytů; (f) makrofágů; (g) mastocytů; (h) buněk HeLa a (i) embryonálních kmenových buněk (ES).

17. Terapeutická buňka podle nároku 7, kdy cílové infekční agens je virus selhání imunity.

18. Terapeutická buňka podle nároku 17, ve které extracelulámí část zahrnuje část CD-4 vázající obal HIV.

19. Terapeutická buňka podle nároku 7 nebo 8, jejíž vázání je MHC-nezávislé.

20. Terapeutická buňka podle kteréhokoliv z nároku 7 nebo 8, ve které extracelulámí část zahrnuje ligand - vázající část receptoru, receptor - vázající část ligandů, antigen - vázající část protilátky nebo j ej ich funkční derivát.

21. DNA kódující chimemí receptor exprimovaný buňkou podle nároku 7 nebo 8.

22. Vektor, který zahrnuje chimemí receptor kódovaný DNA podle nároku 21.