CZ292296B6 - Deriváty nukleosidů s fotolabilními chránicími skupinami, způsob jejich přípravy a jejich použití - Google Patents

Abstract

Deriv ty nukleosid s fotolabiln mi chr nic mi skupinami obecn ho vzorce I, kde R.sup.1.n. znamen vod k, CN, OCH.sub.3.n., halogen, alkyl, alkenyl, alinyl nebo alkoxyalkyl s 1 a 4 atomy uhl ku, R.sup.2.n. znamen vod k nebo OCH.sub.3.n., R.sup.3.n. znamen vod k, fluor, chlor, brom nebo NO.sub.2.n., R.sup.4.n. znamen vod k, halogen, OCH.sub.3.n. nebo alkylovou, alkenylovou i alkinylovou skupinu s 1 a 4 atomy uhl ku, R.sup.5.n. znamen vod k nebo chr nic fosfitamidovou funk n skupinu, R.sup.6.n. znamen vod k, OH, halogen nebo zbytek O-methyl nebo O-ethyl, O-allyl, O-tetrahydropyranyl, O-methoxytetrahydropyranyl nebo O-t-butyldimethylsilyl, B znamen adenin, cytosin, guanin, thymin, uracil, 2,6-diaminopurin-9-yl, hypoxantin-9-yl, 5-methylcytosin-1-yl, 5-amino-4- (aminokarbonyl)imidazol-1-yl, 5-amino-4-(aminokarbonyl)imidazol-3-yl, p°i em v p° pad , e B znamen zbytek adeninu, cytostinu nebo guaninu, m prim rn aminoskupina eventu ln stabiln chr nic skupinu. Zp soby jejich p° pravy a jejich pou it pro synt zu oligonukleotid ° zenou sv tlem.\

Description

Deriváty nukleosidů s fotolabilními chránícími skupinami, způsob jejich přípravy a jejich použiti

Oblast techniky

Předmětem předloženého vynálezu jsou deriváty nukleosidů s fotolabilními chránícími skupinami, způsoby jejich přípravy a jejich použití.

Dosavadní stav techniky

Fotolabilní chránící skupiny pro hydroxylovou a fosfátovou funkci v nukleosidech nebo nukleotidech jsou zvlášť zajímavé, protože jsou vhodné např. pro paralelní, světlem řízené syntézy oligonukleotidů na pevném nosiči (S.P.A. Fodor a spol. Science 1991,251,767). S jejich pomocí se dají připravit takzvané DNA-činy (nosné destičky, na jejichž povrchu je umístěna řada různých oligonukleotidů), které se v molekulární biologii používají k rychlé analýze DNA sekvencí.

Podle dosavadního stavu techniky se používaly doposud jakožto fotolabilní chránící skupiny v chemii nukleotidů a nukleosidů především o-nitrobenzylové skupiny nebo jejich deriváty (V. N. R. Pillai Org. Photochem. 1987, 9, 225 nebo J. W. Walker a spol., J. Amer. Chem. Soc. 1988, 110, 7170). U těchto chránících skupin se ukázalo jako zvlášť nevýhodné, že odblokování odpovídajících nukleosidových nebo nukleotidových derivátů probíhá pomalu a často neúplně. Kromě toho vznikají při odštěpení o-nitrobenzylových sloučenin částečně také nežádoucí vedlejší produkty ve formě toxických nitrosofenylových sloučenin.

Jako další fotolabilní chránící skupina pro nukleosidy byla podle článku W. Pfleiderera a spol. v „Biophosphates and their Analogues - Synthesis, Structure, Metabolism and Activity“, Elsevier Science Publishers Β. V. (Amsterdam) 1987, 133 doporučena 2-(o-nitrofenyl)eťhylová skupina, která se ale zavádí výhradně jako chránící skupina v bazické části, zejména v poloze O⁶guanosinu. Ve stejné publikaci jsou popsány také p-nitrofenylethoxykarbonyl (NPEOC) a 2,4-dinitrofenylethoxykarbonyl (DNPEOC) skupiny jako chránící skupiny jak pro aminofunkci, tak pro hydroxylové funkce v cukerní části, odštěpení těchto skupin však probíhá výhradně bazicky katalyzovanou β-aliminací.

Podstata vynálezu

Základním úkolem předloženého vynálezu je vyvinout deriváty nukleosidů s fotolabilními chránícími skupinami pro 5'-OH funkci v cukerní části, které by nevykazovaly jmenované nevýhody podle stavu techniky, ale které se dají ochránit relativně rychle, kvantitativně a bez tvorby nežádoucích vedlejších produktů.

Tento úkol byl podle vynálezu vyřešen deriváty nukleosidů s fotolabilními chránícími skupinami obecného vzorce I

-1 CZ 292296 B6

R¹ znamená vodík, CN, OCH₃, halogen, alkyl, alkenyl, alkinyl nebo alkoxyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku,

R² znamená vodík nebo OCH₃,

R³ znamená vodík, fluor, chlor, brom nebo NO₂,

R⁴ znamená vodík, halogen, OCH₃ nebo alkylovou, alkenylovou či alkinylovou skupinu s 1 až atomy uhlíku,

R⁵ znamená vodík nebo chránící fosfitamidovou funkční skupinu vzorce

I ₇ I ₇

NC-CHrCH₂-O-P-N(R⁷)2 nebo {>-N02-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, kde skupiny R⁷ jsou stejné nebo různé a znamenají lineární nebo rozvětvené alkylové zbytky s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou ethylové nebo izopropylové skupiny,

R⁶ znamená vodík, OH, halogen nebo zbytek O-methyl nebo O-ethyl, O-allyl, O-tetrahydropyranyl, O-methoxytetrahydropyranyl nebo O-t-butyldimethylsilyl,

B znamená adenin, cytosin, guanin, thymin, uráčil, 2,6-diaminopurin-9-yl, hypoxanthin-9-yl, 5-methylcytosin-l-yl, 5-amino—4-(aminokarbonyl)imidazol-l-yl, 5-amino-4-(aminokarbonyl)imidazol-3-yl, přičemž v případě, že B znamená zbytek adeninu, cytosinu nebo guaninu, má primární aminoskupina eventuálně stabilní chránící skupinu.

Překvapivě se totiž ukázalo, že se chránící skupiny podle vynálezu dají odštěpit podstatně rychleji a úplněji než např. o-nitrobenzylové skupiny. Kromě toho se při odblokování nedaly zjistit nežádoucí vedlejší produkty, což se také nedalo předvídat.

Ve výhodném případě u derivátů nukleosidů obecného vzorce I znamenají R¹ a R² a R³ vodík, přičemž R⁴ neznamená vodík.

výhodou u derivátů nukleosidů podle obecného vzorce I když R³ znamená vodík, tak R² znamená OCH₃.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I s výhodou R⁴ znamená methylový zbytek.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I je R⁵ s výhodou fosfitamidová skupina se vzorcem

NC-CH₂-CH₂-O-P-N(R⁷)2 nebo p-NO2-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, kde skupiny R⁷ jsou stejné nebo různé a znamenají lineární nebo rozvětvené alkylové zbytky s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou ethylové nebo izopropylové skupiny. Přitom je R⁷ s výhodou ethylový nebo izopropylový zbytek.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I je jako R⁶ s výhodou zaveden zbytek O-methyl nebo O-ethyl, O-allyl, O-tetrahydropyranyl, O-methoxytetrahydropyranyl nebo O-t-butyldimethylsilyl.

U derivátů nukleosidů podle nároků 1 až 7, obecného vzorce I, je tam, kde B znamená zbytek adeninu, cytosinu nebo guaninu s výhodou stabilní chránící skupinou fenoxyacetylový nebo dimethylformamidinový zbytek.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I jsou tam, kde B znamená zbytek adeninu s výhodou stabilními chránícími skupinami benzoylové nebo p-nitrofenylethoxykarbonylové zbytky.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I jsou tam, kde B znamená zbytek guaninu s výhodou stabilními chránícími skupinami izobutyrylové nebo p-nitrofenylethoxykarbonylové zbytky.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I jsou tam, kde B znamená zbytek cytosinu s výhodou stabilními chránícími skupinami benzoylové nebo p-nitrofenylethoxykarbonylové zbytky.

U derivátů nukleosidů obecného vzorce I je s výhodou zaveden jako atom halogenu v R¹ nebo R⁶ atom fluoru, chloru nebo bromu.

Příprava derivátů nukleosidů obecného vzorce I podle vynálezu se provádí ve dvou stupních tak, že se nechá reagovat

a) alkohol obecného vzorce Π

kde R¹, R², R³ a R⁴ mají výše uvedené významy, s derivátem fosgenu zvoleným ze skupiny sestávající z fosgenu, difosgenu a trifosgenu a následně takto vytvořený ester chlorouhličité kyseliny ve stupni b) reaguje snukleosidy obecného vzorce ΙΠ

-3CZ 292296 B6

kde R⁵, R⁶ a B mají výše uvedený význam a případně se zavede v poloze 3' derivátů nukleosidů s R⁵ znamenajícím vodík fosfitamidová skupina

I ₇ I ₇

NC-CH₂-CH₂-O-P-N(R⁷)2 nebo í>-NO2-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, podle známých metod.

Způsob se s výhodou provádí tak, že se stupeň a) provádí v nepolárním organickém rozpouštědle při teplotách mezi -20 a +25 °C. S výhodou se používá ve stupni a) derivát fosgenu ve dvou až pětinásobném molámím přebytku vzhledem k alkoholu. S výhodou se rovněž ve stupni a) používá jakožto nepolární organické rozpouštědlo toluen nebo tetrahydrofuran. Koncentrace alkoholu ve stupni a) je s výhodou 0,1 až 10 molů na 10 ml rozpouštědla. Stupeň b) se s výhodou provádí ve směsi rozpouštědel, složené z dichlormethanu a polárního organického rozpouštědla, případně za přítomnosti báze při teplotách mezi -60 a +25 °C. Ve stupni b) se s výhodou používá jako polární organické rozpouštědlo dimethylformamid nebo pyridin. Ve stupni b) se s výhodou používá směsi rozpouštědel složené z dichlormethanu a dimethylformamidu a báze, která je vybrána ze skupiny pyridin, triethylamin a ethyldiizopropylamin. Molámí poměr dichlormethanu k pyridinu nebo dimethylformamidu ve směsi je s výhodou 1:1 až 3:1. Molámí poměr nukleosidu k esteru chlorouhličité kyseliny je s výhodou 1:1 až 1:2. Ve stupni b) se s výhodou předloží nukleosid rozpuštěný v pyridinu nebo směsi dimethylformamidu a báze a přikapává se roztok esteru kyseliny chlorouhličité v dichlormethanu. Koncentrace nukleosidu ve směsi rozpouštědel ve stupni b) je s výhodou 0,1 až 3 mmol na 10 ml rozpouštědla. Zavedení fosfitamidové skupiny ve stupni c) se s výhodou provádí reakcí derivátů nukleosidů, přičemž R⁵ v nich znamená vodík, s odpovídajícími fosfiny za přítomnosti lH-tetrazolu jakožto aktivátoru, ve směsi rozpouštědel z dichlormethanu a acetonitrilu a při teplotách mezi 0 a 25 °C.

Alkoholová složka je ve většině případů známá nebo je možné ji připravit analogickým způsobem známými postupy. Jako nepolárního organického rozpouštědla se používá ve stupni a) přednostně toluenu nebo THF. Reakční komponenty se dají použít ve stechiometrickém poměru, většinou se však nasadí derivát fosgenu ve zřetelném přebytku, např. ve 2 až 5 násobném přebytku vzhledem k alkoholové komponentě. I koncentrace alkoholové komponenty je možno široce obměnit, zvlášť výhodné jsou koncentrace od 0,1 až do 10 mmol na 10 ml rozpouštědla.

Při této reakci (doba reakce 1 až 6 hodin) vznikají v dobré čistotě a vysokém výtěžku (> 90 %) odpovídaj ící chlorouhličitany obecného vzorce IV

( IV) .4.

Zpracování odpovídajících produktů se přednostně provádí tím, že se nejdříve oddestiluje přebytek fosgenu a rozpouštědlo ve vakuu. Chlorouhličitan (IV) se podrobí pak bez dalšího zpracování ve stupni b) reakci s nukleosidy obecného vzorce ΙΠ

kde R⁵, R⁶ a B mají výše uvedený význam.

Reakce probíhá nejlépe ve směsi rozpouštědel složené z dichlormethanu a polárního organického rozpouštědla, případně v přítomnosti báze při teplotách mezi -60 a +25 °C. Jako polární organické rozpouštědlo se používá nejlépe DMF nebo pyridin, v případě pyridinu není třeba přidat další bázi. Pracuje-li se však se směsmi rozpouštědel dichlormethan/DMF, je vhodný přídavek báze jako např. pyridin, triethylamin neoethyldiizopropylamin, k odstranění protonů uvolněných v reakci. Poměr dichlormethanu k pyridinu, eventuálně DMF také není kritický, s výhodou se však nasazuje 1 až 3 objemové díly dichlormethanu na objemový díl pyridinu, resp. DMF.

Podle výhodného způsobu provedení se předloží odpovídající nukleosid (ΙΠ), rozpuštěný v pyridinu nebo DMF/bázi a přikapává se roztok chlorouhličitanu v dichlormethanu při odpovídající reakční teplotě. Molární poměr nukleosidu k chlorouhličitanu může být stechiometrický 1:1. S výhodou se však používá chlorouhličitan v přebytku a to tak, že molární poměr nukleosid k orthouhličitanu se upraví na 1:1 až 1:2. Konečně je však také možné měnit koncentraci nukleosidu ve směsi rozpouštědel v širokém rozmezí, přednostně se však pracuje při poměru 0,1 až 3 mmol na 10 ml rozpouštědla.

Po ukončené reakci (doba 1 až 5 hodin) je možno získané deriváty nukleosidu izolovat nebo čistit známými způsoby, jako např. zředěním dichlormethanem, vypíráním všech solí vodou, sušením organické fáze, zahuštěním roztoku nebo krystalizaci a navazující chromatografii na silikagelu. Tímto způsobem lze získat deriváty nukleosidu ve vysoké čistotě a v dobrých výtěžcích (60-85 %).

Podle vhodného způsobu provedení je možno v návaznosti na reakční stupeň b) zavést do polohy 3' nukleosidových derivátů s R⁵ = H fosfitamidovou skupinu

I ₇ I ₇

NC-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2 nebo p-NO2-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, známými způsoby. Obvykle se tato reakce provádí s odpovídajícími fosfiny v přítomnosti ΙΗ-tetrazolu jakožto aktivátoru ve směsi rozpouštědel dichlormethan-acetonitril při teplotách mezi 0 až 25 °C. S výhodou se používá dvoj- až trojnásobný molární přebytek fosfinu, zatímco poměr fosfinu k ΙΗ-tetrazolu se upraví na 3:1. Poměr množství dichlormethanu k acetonitrilu je relativně nedůležitý a je nejlépe 1:1 až 4:1. Po ukončené reakci (asi 10 až 20 hodin) se odpovídající nukleosid zpracovává, jak bylo popsáno ve stupni b).

Předmětem vynálezu je rovněž použití výše uvedeného derivátu nukleosidu obecného vzorce I pro syntézu oligonukleotidů řízenou světlem. Světlem řízená syntéza oligonukleotidů probíhá

-5CZ 292296 B6 s výhodou na pevném nosiči. Derivát nukleosidu je s výhodou definován tak, jak je to uvedeno ve výhodných provedeních derivátů nukleosidu obecného vzorce I.

Jak bylo prokázáno ozařovacími pokusy polychromatickým světlem >289 nm, dají se nukleosidy velmi rychle (to,s = 1 až 7 minut) a dalekosáhle odchránit (výtěžky až 97 %), takže je vynikajícím způsobem splněn zvláštní požadavek fotolability chránících skupin.

Na základě těchto zvláštních vlastností se tyto nukleosidy hodí velmi dobře k přípravě oligonukleotidů odštěpením chránících skupin řízeném světlem, zejména na pevných nosičích.

Příklady provedení vynálezu

Přikladl

a) 2-(2-nitrofenyl)ethanol (1,2)

Směs o-nitrotoluenu, (9,2 g, 67 mmol) a paraformaldehvdu (0,8 g, 25 mmol) v DMSO (10 ml syntetická kvalita, přesušeno molekulovým sítem 4 x 10 cm 0,4 nm) se nechá reagovat s KOH (21 mg, 0,37 mmol) za míchání po dobu 2,5 hod. při 95 °C. Rozpouštědlo se odpaří ve vysokém vakuu. Zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografií (S1O2, 20x3 cm, rozpouštědlo toluen 750 ml, toluen/EtOAc 10:1 500 ml, 7:1500 ml). Byl získán 2-(2-nitrofenylethanol (2,33 g, 21 % jako žlutý olej.

Rf (SiO₂, toluen)/EtOAC 10:1) 0,21.

UV (MeOH) k_max [nm] (log e): 205 (4,07), 256 (3,63), 348 (sh, 2,56).

’Η-NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,93 (dd, 1 arom. H, ortho kNO₂), 7,49 (m, 3 arorn H, 3,96 (t, a-CH₂), 3,17 (t, P-CH₂), 1,72 (s, OH).

CgH₉NO₃ (167,2).

Literatura:

[1] G. M. Bennet, Μ. M. Hafez, J. Chem. Soc. 1941,287 [2] E. Uhlmann, W. Pfleiderer, Helv. Chim. Acta 1981,64,16

b) 2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

Do roztoku 2-(2-nitrofenyl)ethanolu (5,2 g, 31 mmol) v THF (20 ml, destilovaný na dCaH₂) byl uváděn při pokojové teplotě za míchání fosgen. Po 1,5 hod. byl přebytek fosgenu a rozpouštědlo oddestilováno ve vysokém vakuu. Byl získán 2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (6,69 g, 94 %) jako žlutý olej.

Rf (SiO₂, CHC1₃) 0,84.

UV (CH₃CN), [nm] (log e): 202 (4,12), 218 (sh 3,74), 256 (3,70), 298 (sh, 3,16), 346 (sh, 2,59).

'H-NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,99 (dd, H-C(3)), 7,48 (m, 3 arom. H), 4,62 (t, a-CH₂), 3,31 (ί,β-€Η₂).

Anal. pro C₉H₈C1NO₄ (229,62):

-6CZ 292296 B6 vypočteno: C 47,08, H 3,51, N 6,10, nalezeno:C 47,30, H 3,70, N 6,00.

c) 5 '-O-(2-(2-Nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (1 g, 4,13 mmol) se kodestiluje s pyridinem (2x10 ml, p.a. ještě sušen nad molekulovým sítem 0,4 nm), pak se 10 minut přikapává roztok 2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (1,45 g, 6,31 mmol). Po dalších 4,50 hodinách míchání za chlazení iPrOH/N2 (-30 až -15 °C) byla směs zředěna CH2CI2 (150 ml) a promývána H₂O (150 ml). Vodné fáze byly ještě extrahovány CH₂C1₂ (2x150 ml). Spojené organické fáze byly sušeny nad MgSO₄, filtrovány, odpařeny a kodestilované s toluenem (5x 20 ml) a CH2CI2 (2x20 ml). Surový produkt pak byl přečištěn sloupcovou chromatografií (SiO₂, 15x3,5 cm, rozpouštědlo: CH₂C1₂ 1300 ml, CH₂Cl₂/aceton 20:1, 1200 ml, 10:1, 600 ml, 8:1 500 ml, 5:1 500 ml, 4:1 500 ml, 2:1 750 ml, 1:1 500 ml). Byl získán 5'-O-(2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (1,15 g, 64 %) jako bezbarvá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,46.

UV (MeOH) [nm] (log e): 205 (4,31), 262 (4,12), 334 (sh, 2,64).

'H-NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,92 (s (br, NH), 7,96 (dd, (H-C(3) vNPEOC), 7,55 (t, 1 arom. H. vNPEOC), 6,35 (t, H-C(l)), 4,44 (m, H-C(3'), 2x H-C(5'), a-CH₂ v. NPEOC), 4,15 (kv H-C-(4'), 3,34 (m, β-ΟΗ₂ v. NPEOC), 2,89 (d, OH-C-(3)), 2,41 (m, H-C-(2)), 2,22 (m, H-C-(2)), 1,85 (s, CH₃).

Anal. Vypočteno pro Ci₉H₂₁N₃O₉ (435,39): C 52,41, H 4,86, N 9,65, nalezeno: C 52,07, H 5,15, N 9,65.

Příklad 2

a) 2-(2,6-Dinitrofenyl)ethanol [1]

K 2,6-dinitrotoluenu (18,2 g, 0,1 mol, sušenému ve vysokém vakuu nad silikagelem) a paraformaldehydu (3 g, 0,1 mol) v DMSO (50 ml, l.č. sušeném nad molekulovým sítem 0,4 nm) byl přidán roztok terc.butylátu draselného (1,8 g, 8 mmol) v terc.butanolu (20 ml, l.č. 99 %). Po přídavku roztoku barva směsi se změnila ze žluté na temně fialovou. Bylo mícháno 5 minut při pokojové teplotě a 10 minut při 70 °C (teplota lázně). Pak bylo ochlazeno na pokojovou teplotu, směs byla neutralizovaná koncentrovanou HC1, zředěna vodou (300 ml) a nasycena NaCl. Vodná fáze byla extrahována EtOAc (3x 500 ml). Spojené organické fáze byly promyty nasyceným roztokem NaCl (300 ml), sušeny nad Na₂SO₄, filtrovány a odpařeny. Surový produkt (24,3 g) byl za varu rozpuštěn v malém množství EtOAc, byl přidán petrolether (PE) (100 ml) a byl ponechán v mrazicím boxu ke krystalizaci. Sraženina byla odsáta a čištěna sloupcovou chromatografií (20,7 g surového produktu, 300 g SiO₂, 18x6,5 cm, rozpouštědlo toluen/EtOAc 5:1, 4:1, 3:1). Směsné frakce byly odpařeny a znovu čištěny sloupcovou chromatografií (200 v SiO₂, 20x5,3 cm, toluen/EtOAc 7:1). Po odpaření čistých frakcí byl získán 2-(2,6-dinitrofenyl)ethanol (13,6 g, 64 %) jako žlutá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 9:1) 0,21.

T.t. 69-70 °C (lit[lj: 69 °C).

UV (MeOH), U[nm] (log e): 203 (4,20), 231 (4,00) 280 (sh, 3,17), 327 (sh, 2,80).

-7CZ 292296 B6

Ή-NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,00 (d, J= 8,1, H-C(3), H-C(5), 7,57 (t, J=8,l, H-C(4)), 3,97 (kv. a-CH₂), 3,33 (t, Í3-CH₂), 1,69 (t, OH).

Anal. Pro C₈H₈N₂O₅ (212,16): vypočteno C 45,29, H 3,80, N 13,20, nalezeno C 45,39, H 3,90, N 13,32.

Literatura [1] N. S. Girgis, Η. B. Cottam, R. K. Robins, J. Heterocycl. Chem. 1988, 25, 361

b) 2-(2,6-Dinitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

K roztoku trichlormethylesteru chloromravenčí kyseliny, (3,81 g, 2,33 ml, 19,28 mmol), vTHF (10 ml, destilovaný nad CaH₂), vychlazenému na 0 °C se přikapává během 20 minut roztok 2-(2,6-dmitrofenyl)ethanolu (4,08 g, 19,23 mmol) a Et₃N (2,7 ml, 19,28 mmol) v THF (30 ml).

Bylo 1,45 hod. mícháno při pokojové teplotě. Směs byla filtrována přes celit. Promýváním sraženiny THF, oddestilován rozpouštědla a přebytečného činidla ze spojených filtrátů a sušením ve vysokém vakuu bylo získáno 5,13 g 2-(2,6-dinitrofenyl)-ethoxykarbonylchlorid (97 %) jako světle hnědá pevná látka.

Rf (SiO₂, CH₂C1₂) 0,76.

T.t. 84 až 85 °C.

UV CH₃CN) [nm] (log e): 233 (4,02), 292 (sh, 3,11), 331 (sh, 2,82).

’Η-NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,10 (d, J = 8,2, H-C(3, H-C(5)), 7,67 (t, J = 8,1, H-C(4), 4,67 (t, a-CH₂), 3,50 (t, p-CH₂)

Anal. Pro C₉H₇N₂O6 (274,616): vypočteno: C 39,36; H 2,57; N 10,20; nalezeno: C 39,40; H 2,60; N 10,20.

c) 5'-0-(2-(2,6-Dinitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (1 g, 4,13 mmol) se kodestiloval s pyridinem (3x 10 ml, p.a., přesušen nad molekulovým sítem 0,4 nm) rozpuštěný v pyridinu (15 ml), byl ochlazen na -50 °C. K tomu byl během 1 hodiny přikapáván roztok 2-(2,6-dinitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (1,7 g, 6,19 mmol) vCH₂C1₂ (15 ml, destilovaný nad CaH₂). Po dalším 3,5hodinovém míchání za chlazení iPrOH/N₂ (-15 až -20 °C) byla směs zředěna 50 ml CH₂C1₂ a promyta 50 ml vody. Vodné fáze byly ještě extrahovány 2x50 ml CH₂C1₂. Spojené organické fáze byly sušeny nad Na₂SO₄, filtrovány, odpařeny a odpařeny spolu s toluenem. Surový produkt (2,66 g) se digeroval za varu v 60 ml CH₂Cl₂/MeOH 2:1. Získaná bílá sraženina byla odsáta a rekrystalizována z MeOH (25 ml). Bylo získáno 855 mg, (43 %) 5'-0-(2-(2,6-dinitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu jako bezbarvá pevná látka. Spojené filtráty byly odpařeny do sucha a přečištěny sloupcovou chromatografií (1,4 g surového produktu, 56 g SiO₂ 17x3 cm, CH₂Cl₂/MeOH 100:5 1240 ml, 100:7 105 ml, 100:10 330 ml). Bylo získáno 691 mg, (34,8 %) 5'-Q-(2-(2,6-dinitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu jako bezbarvá pevná látka. Výtěžek tedy dohromady obnášel 1,55 g (78%).

R_f (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,41.

UV (MeOH, [nm] (log e): 206 (4,28); 244 (sh.) 4,07; 256 (4,08); 355 (sh, 2,72).

-8CZ 292296 B6 'H-NMR (250 MHz, CDC1₃): 11,32 (s, NH), 8,27 (d, H-C(3), H-C(5)), 7,78 (t, H-C-(4)), 7,40 (s, H-C(6)) v thyminu, 6,18 (t, H-C(l')), 5,44 (d, OH-C(3)), 4,37 (t, a-CH₂, 4,23 (m, H-C(3),

2xH-C(5), 3,91 (m, H-C(4)), 3,29 (t, p-CH₂), 2,15 (m, 2xH-C(2')), 1,71 (s, CH₃).

Anal. Pro Ci9H₂oN₄On (480,386): vypočteno: C 47,51; H 4,20; N 11,66; nalezeno: C 47,40; H 4,15; N 11,57.

Příklad 3

a) 2-(2-Fluor-6-nitrofenyl)ethanol [1]

K 2-fluor-6-nitrotoluenu (776 mg, 5 mmol) a paraformaldehydu (150 mg, 5 mmol) v DMSO (2,5 ml, l.č., sušeném 2 d nad molekulovým sítem 0,4 nm) se přidával roztok terc.butylátu draselného (90 mg, 0,8 mmol) v terc.butanolu (1 ml, l.č., 99 %). Po přidání se barva změnila ze žluté na temně fialovou. Bylo dále mícháno 5 minut při pokojové teplotě a 30 minut při 70 °C (teplota lázně). Pak bylo ochlazeno na pokojovou teplotu a neutralizováno několika kapkami koncentrované HC1. Směs byla zředěna EtOAc (30 ml) a promývána 20 ml vody. Vodná fáze byla extrahována EtOAc (2x20 ml). Sušení organické fáze nad Na₂SO₄, filtrace a odpaření rozpouštědla poskytlo surový produkt (1,11 g), který byl čištěn sloupcovou chromatografií (20 g SiO₂, 12x2 cm, rozpouštědlo PE 40 ml, PE/EtOAc 10:1 110 ml, 8:1 270 ml, 6:1 210 ml, 5:1 60 ml, 4:1 50 ml). Bylo získáno 653 mg (71 %) 2-(2-fhior-6-nitrofenyl)ethanolu jako žlutá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 9:1) 0,24.

UV (MeOH) λπ^ [nm] (log e): 205 (4,06), 252 (3,61), 294 (sh 3,21).

'H-NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,73 (m, 1 arom. H, 7,36 (m, 2 arom H, 3,94 (t, a-CH₂), 3,21 (dt, J = 2,2; 6,5; β-ΟΗ₂), 1,67 (s, šir., OH).

Anal. Pro CgHgFNO₃ (185,154): vypočteno: C 51,90; H 4,36, N 7,57; nalezeno: C 51,92; H 4,40; N 7,42.

Literatura:

[1] Chem. Abstr. 1989,110, P 75032 k

b) 2-(2-Fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

K roztoku trichlormethylesteru chloromravenčí kyseliny (641 mg, 3,24 mmol) vTHF (6,75 ml, destilovaný nad CaH₂), vychlazenému na 0 °C byl během 5 minut přidáván roztok 2-(2-fluor-6nitrofenyl)ethanolu (500 mg, 2,7 mmol) a Et₃N (273 mg, 2,7 mmol, destilovaný nad KOH) v THF (6,75 ml). Bylo mícháno 1 hodinu za chlazení ledem a 1 hodinu při pokojové teplotě. Směs byla filtrována přes celit. Promývání koláče THF a oddestilován rozpouštědla a přebytečného činidla ze spojených filtrátů při 30 °C ve vysokém vakuu poskytlo 2-(2-fluor-6nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (620 mg, 93 %) jako světle hnědý olej.

Rf (SiO₂, PE/EtOAc 19:1) 0,25.

UV (MeOH), [nm] (log e): 204 (4,04); 251 (3,67); 293 (sh, 323),

-9CZ 292296 B6 ’Η-NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,83 (d, J = 7,7, 1 arom. H), 7,44 (m, 2 arom. H), 4,63 (t, a-CH₂),

3,37 (dt, J = 1,6,6,4, p-CH₂).

Anal. pro C₉H₇C1FNO₄ (247.609) vypočteno: C 43,66; H 2,85; N 5,66; nalezeno C 43,97; H 3,02; N 5,59.

c) 5'-0-(2-(2-Fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylthymidin

Thymidin (200 mg, 0,83 mmol) byl kodestilován s pyridinem (3x3 ml, p.a., sušen molekulovým sítem 0,4 nm), rozpuštěn v pyridinu a ochlazen na -60 °C (iPrOH/N₂). Během 20 minut byl přikapáván roztok 2-{2-fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (280 mg, 1,13 mmol) v CH₂C1₂ (destilovaný nad CaH₂). Bylo dále mícháno 3,40 hodin, za chlazení i-PrOH/N₂ (-60 až -15 °C), 1 hodinu bez chlazení, ke konci byla teplota směsi 0 °C. Reakční směs byla zředěna 10 ml CH₂C1₂ a promyta vodou (10 ml). Vodná fáze byla ještě extrahována 3x10 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází Na₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a kodestilace s toluenem (3x10 ml) poskytlo surový produkt, který byl čištěn sloupcovou chromatografií (20 g SiO₂, 12x2 cm, rozpouštědlo CH₂Cl₂/MeOH 100:1 50 ml, 100:2 102 ml, 100:3 206 ml, 100:3.5 ml 103 ml, 100:4 208 ml). Nejdřív byl eluován 3',5'-bis-O-(2-(2-fluor-6-nitrofenylethoxykarbonylthymidin, pak 3'-O-(2-(2-fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin a posléze 5'-O(2-(2-fluor-6-(mtrofenyl)ethoxykarbonyl)1hymidin. Po odpaření rozpouštědla a sušení ve vysokém vakuu byl získán 3',5'-bis-0-(2-(2-fluor-6-mtrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (27 mg, 5 %) jako světležlutá pěna, 3'-0-(2-(2-fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (15 mg, 4 %) jako bezbarvá pěna a 5'-0-(2-(2-fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (262 mg, 70 %) jako bezbarvá pevná látka.

5'-O-(2-(2-fluor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin:

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,44.

UV (MeOH), X_raax [nm] (log <=): 205 (4,29); 261 (4,10);

Ή-NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,09 (s (šiř.) NH), 7,76 (m, 1 arom H vFNPEOC), 7,41 (m, H-C-(6) thyminu, 2 ann. H z FNPEOC), 6,35, t, H-Cl')), 4,45 (m, H-C(3), 2xH(5'), a-CH₂ v. FNPEOC), 2,23 (m, H-C(2'), OH-C(3')), 1-85 (s, CH₃).

Anal: pro Ci₉H₂₀FN₃O₉ (453,379) vypočteno: C 50,34; H 4,45; N 9,27; nalezeno C 50,22; H 4,49; N9,18.

Příklad 4

a) 2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethanol [1,2]

Ke směsi 2-chlor-6-nitrotoluenu (25 g, 146 mmol) a paraformaldehydu (1,9 g, 60 mmol) v DMSO (20 ml, l.č. ještě dosušeno molekulovým sítem 0,4 nm) byl přidán Triton B (2 ml, 35% v MeOH) a bylo mícháno při 90 °C. Po 2 hodinách byla reakční směs neutralizována několika kapkami kc. HC1, ředěna 50 ml vody a extrahována 4x150 ml EtOAc. Spojené organické fáze byly sušeny MgSO₄, filtrovány a odpařeny. Surový produkt byl čištěn sublimací ve vysokém vakuu (6,7 Pa, teplota lázně 95 °C. Bylo získáno 8,01 g (66 %) 2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethanolu ve formě světležlutých krystalů.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 10:1) 0,36.

T.t. 59 až 61 °C.

-10CZ 292296 B6

UV (MeOH) [nm], (log e): 212 (4,13), 248 (3,48), 294 (sh 3,03); 336 (sh 2,58).

Ή-NMR (250 MHz, CDClj): 7,70 (dd, 1 arom. H), 7,62 (dd, 1 arom. H), 7,31 (t, H-C(4), 3,94 (kv, a-CH₂); 3,26 (t, β-CHj), 1,701 (OH).

Anal. Pro C₈H₈C1NO₃ (201,61): vypočteno: C 47,66; H 4,00; N 6,95; nalezeno: C 47,79; H 4,06; N 6,92.

Literatura:

[1] T. Morimoto, I. Hashimoto, H. Yamaoka, Chem. Abstr. 1978, 88,104880 v.

[2] Y. Tsuji, S. Kotachi, K.-T. Huh, Y Watanabe, J. Org. Chem. 1990, 55, 580.

b) 2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

Do roztoku 2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethanolu (31 g, 154 mmol) v THF (190 ml, destilovaný nad CaH₂) byl za míchání při pokojové teplotě zaváděn fosgen. Po 2,5 hodinách se přebytek fosgenu a rozpouštědlo oddestilovalo ve vysokém vakuu. Byl získán

2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (39,4 g, 97 %) jako žlutý olej.

R_f (SiO₂, CHCI3) 0,76.

UV (CH₃CN), [nm] (log ε): 211 (4,14); 253 (3,53); 300 sh. 3,02.

’H-NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,81 (dd, 1 arom. H, 7,69 (dd, 1 arom H, 7,41 (t, H-C(4)), 4,63 (t, a-CH₂), 3,46 (ζ |3-CH₂).

Anal. Pro CsHzCLNC^ (264,06) vypočteno: C 40,94; H 2,67; N 5,30; nalezeno: C 41,05; H 2,73; N 5,00.

c) 5 '-0-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (4 g, 16,5 mmol) byl kodestilován s pyridinem (3x40 ml), p.a. dosušeným nad molekulovým sítem 0,4 nm, rozpuštěn v pyridinu (48 ml) a ochlazen na -50 °C (iPrOH/N₂). Během 2,45 hodin se přikapával roztok 2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (5,2 g, 19,8 mmol) v CH₂C1₂ (48 ml, dest. nad CaH₂). Pak bylo ponecháno dalších 30 minut za chlazení iPrOH/N₂ (-50 až -30 °C) a za míchání. Reakční směs byla zředěna 100 ml CH₂C1₂ a promývána 100 ml vody. Vodná fáze byla extrahována 2x100 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází Na₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a kodestilace s toluenem (3x50 ml) poskytlo surový produkt, který byl čištěn sloupcovou chromatografií (305 g SiO₂, 22x5,9 cm, rozpouštědlo: CH₂C1₂ 200 ml, CH₂Cl₂/MeOH 100:2 1020 ml, 100:3 515 ml, 100:4 1560 ml, 100:5 850 ml, 100:6 318 ml, 100:8 324 ml, 100:9 654 ml). Nejdříve byla eluována směsná frakce (1,4 g) 3',5'-bis-O-(2-(2-chlor6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu a 3 '-0-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu, potom směsná frakce (367 g) 3'-0-(2-(2^chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylthymidinu a 5'-O-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu a nakonec čistá frakce 5'-0-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu (6,21 g, 80 %, bezbarvá pevná látka). Směsné frakce byly dále zpracovány sloupcovou chromatografií. Byl získán 3',5'-bis-O-(2-(2chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylthymidin (1,175 g, 10 %) jako světle žlutá pěna, 3'-O-(2-(2chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (203 mg, 3 %) jako bezbarvá pěna a 5'-O-(2-(2chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (182 mg, 2 %) jako bezbarvá pevná látka. Celkový výtěžek 5'-0-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidmu byl 6,392 g (82 %).

-11 CZ 292296 B6

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,53.

UV (MeOH) [nm] (log e): 210 (4,36,263 (4,05).

Ή-NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,11 s, NH, 7,74 (d, J= 8,2; 1 arom. H v. C1NPEOC, 7,67 (d, J = 8,0, 1 arom H v C1NPEOC, 7,39 (t, H-C(4) v. C1NPEOC, 7,38 (s, H-C(6) v. thymidinu), 6,36 (ζ H-C(l')), 4,44 (m, a-CH₂) v. C1NPEOC, H-C-(3'), 2x H-C(5)), 4,15 (kv, H-C(4')), 3,45 (t, P-CH₂ v.CINPEOC, 2,38 (m, H-C(2')), 2,26 (m, H-C(2')), 2,18 (d, J = 3,9; OH-C (3')), 1,86 (s,CH₃).

Anal. Pro C₁₉H₂oC1N₃09 (469,83) vypočteno: C 48,57; H 4,29, N 8,94; nalezeno: C 48,53; H 4,34; N 8,91.

Příklad 5

a) 2-(2-Brom-6-nitrofenyl)ethanol [1]

K 2-brom-6-nitrotoluenu (1,08 g, 5 mmol) a paraformaldehydu (150 mg, 5 mmol) v DMSO (2,5 ml, l.č., dosušeno molekulovým sítem 0,4 nm) byl přidán roztok terc.butylátu draselného (90 mg, 0,8 mmol) v terc.butanolu (1 ml, l.č., 99 %). Po přidání roztoku barva směsi se změnila ze žluté na temně fialovou. Bylo mícháno 5 minut při pokojové teplotě a 30 minut při 70 °C (teplota lázně). Pak bylo ochlazeno na pokojovou teplotu a neutralizováno několika kapkami konc. HC1. Směs byla zředěna 30 ml EtOAc a promývána 20 ml vody. Vodná fáze byla extrahována 2x20 ml EtOAc. Sušením organických fází Na₂SO₄, filtrací a odpařením rozpouštědla byl získán surový produkt (1,49 g), který byl přečištěn sloupcovou chromatografií (20 g SiO₂, 20x2cm, rozpouštědlo: PE 45 ml, PE/EtOAc 10:1 110 ml, 8:1 180 ml, 7,5:1 340 ml, 6:1 140 ml). Bylo získáno 867 mg (70 %) 2-(2-brom-6-nitrofenylethanolu jako žlutá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 9:1) 0,32.

UV (MeOH, X_max [nm] (log e): 204 (4,18), 210 (sh, 4,16), 251 (3,48); 293 (sh, 3,07).

'H NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,82 (dd, J = 1,1; 8,0; 1 arom. H), 7,74 (dd, J = 1,1; 8,2; 1 arom. H.), 7,26 (m, H-C(4), 3,96 (t, a-CH₂), 3,30 (t, β-ΟΗ₂); 1,75 (s (šiř.), OH).

Anal. Pro C_gHgBrNO₃ (246,06): vypočt. C 39,05; H 3,28; N 5,69; nalezeno: C 39,09; H3,26; N 5,56.

Literatura:

[1] Chem. Abstr. 1989,110, P 75032 k

b) 2-(2-Brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

K roztoku trichlormethylesteru chloromravenčí kyseliny (442 mg, 2,23 mmol) vychlazenému na 0 °C v 5 ml THF (dest nad CaH₂) se během 10 minut přidával roztok 2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethanolu (500 ml, 2,03 mmol) a Et₃N (206 mg, 2,03 mmol, dest. nad KOH) v THF (5 ml). Bylo mícháno 5 minut za chlazení ledem a 1,45 minut při pokojové teplotě. Směs byla filtrována celitem. Promývání filtračního koláče THF a oddestilování rozpouštědla a přebytku činidla ze spojených filtrátů při 30 °C ve vysokém vakuu poskytlo 2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (625 mg, 99,8 %) jako světle hnědý olej.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 19:1) 0,31.

-12CZ 292296 B6

UV (MeOH, [nm] (log e): 205 (sh), 4,14; 211 (4,16) 254 (3,52), 2,97 (sh), 3,05).

*H NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,85 (2 arom. H, 7,33 (t, H-C(4)), 4,62 (t, a-CH₂), 3,47 (t, β-ΟΗ₂).

Anal. Pro C9H₇BrClNO₄ (308,515) vypočteno: C 35,04, H2,29, N 4,54, nalezeno: C 35,50; H 2,58, N 4,50.

c) 5 '-O-(2-(2-Brom-6-mtrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin, (200 mg, 0,83 mmol) byl odpařen s přídavkem pyridinu (3x3 ml, p.a., dosušeno nad molekulovým sítem 0,4 nm), rozpuštěn v pyridinu (3 ml) a chlazen na -60 °C (iPrOH/N₂). Během 10 minut byl přikapáván roztok 2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (354 mg, 1,15 mmol) vCH₂C1₂ (3 ml, dest. nad CaH₂). Bylo mícháno 3,40 hodin za chlazení i-PrOH/N₂ (-60 až -20 °C). Reakční směs byla zředěna 10 ml CH₂C1₂ a promyta 10 ml vody. Vodná fáze byla dále extrahována 2x10 ml CH₂C1₂. Sušením organických fází Na₂SO₄, filtrací, odpařením rozpouštědla a odpařením spolu s toluenem (4x10 ml) byl získán surový produkt (552 mg). Krystalizaci z malého množství CH₂C1₂ a MeOH byl izolován 5'-O-(2-(2-brom-6nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (163 mg, 38 %) jako bezbarvá pevná látka. Zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografií (18 g SiO₂, 11x2 cm, rozpouštědlo: CH₂Cl₂/MeOH 100:1 50 ml, 100:3 103 ml, 100:4 208 ml, 100:5 52 ml). První byl eluován 3',5'-bis-0-(2-(2-brom-6nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin, potom 3 '-0-(2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin a posléze 5'-O-(2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxythymidin. Frakce byly odpařeny a sušeny ve vysokém vakuu: byl získán 3',5'-bis-0-(2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (62 mg, 10 %) jako bezbarvá pěna, 3'-0-(2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (8 mg, 2 %) jako bezbarvý olej a 5'-O-(2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (151 mg, 35 %) jako bezbarvá pevná látka. Úhrnný výtěžek 5'-O-2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu byl 314 mg, (73 %).

5'-O-2-(2-brom-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,38.

UV (MeOH, X_max [nm] (log e): 210 (4,37), 263 (4,06).

^JH NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,35 (s, NH), 7,85 (d, 1 arom. H, v. BNPEOC), 7,76 (d, 1 arom. H v. BNPEOC), 7,38 (s, H-C(6) v. thymin), 7,30 (t, H-(4) v. BNPEOC, částečně překrytý signálem CHC1₃), 6,37 (t, H-(ď), 4,45 (m, H-C(3'), 2x H-C (5'), a-CH₂ v. BNPEOC)), 4,15 (m, H-(C4')), 3,47 (t, p-CH₂ v BNPEOC), 2,41 (m, H-C(2'), OH-C(3')); 2,25 (m, H-C(2'), 1,86 (s, CH₃).

Anal. Pro Ci9H₂oBrN₃0₉ (514,285) vypočteno: C 44,37; H 3,92, N 8,17; nalezeno: C 44,31; H 3,96; N 8,11.

Příklad 6

a) 2-(4-ChIor-2-nitrofenyl)ethanol [1,2,3]

Směs 4-chlor-2-nitrotoluenu (50 g, 291 mmol) a paraformaldehydu (3,8 g, 120 mmol) v DMSO (40 ml, l.č., dosušen 2d nad molekulovým sítem 0,4 nm) byla 2,5 hodin míchána při 90 °C s Tritonem B (4 ml, 35% v MeOH). Bylo neutralizováno několika kapkami koncentrované HC1, zředěno 100 ml vody a extrahováno EtOAc (5x150 ml). Spojené organické fáze byly sušeny MgSO₄, filtrovány a odpařeny. Olejovitý zbytek byl přečištěn sublimací ve vysokém vakuu

-13CZ 292296 B6 (13 Pa, teplota lázně 110 °C). Bylo získáno 13,23 g, (55 %) 2-(4-chlor-2-nitrofenyl)ethanolu ve formě žlutých krystalů.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 10:1) 0,26.

T.t.: 61 až 64 °C.

UV (MeOH, [nm] (log e): 213 (4,29); 252 (3,61); 294 (sh, 3,10).

*H NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,94 (d, J = 2,2; H-C(3); 7,53 (dd, H-C(5)); 7,4 (d, H-C(6); 3,93 (t, a-CH₂); 3,14 (t, β-ΟΗ₂); 1,70 (s, OH).

Anal. Pro C₈H₈C1NO₃ (201,61) vypočteno: C 47,66, H 4,00; N 6,95; nalezeno: C 47,65; H 4,01; N 6,75.

Literatura:

[1] J. Bakke, Acta Chem. Scand. 1969,23, 3055.

[2] T. Morimoto, I. Hashimoto, H. Yamaoka, Chem. Abstr. 1978, 88,104880 v.

[3] Y. Tsui, S. Kotachi, K.-T. Huh, Y. Watanabe, J. Org. Chem. 1990, 55, 580.

b) 2-(4-Chlor-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

Do roztoku 2-(4-chlor-2-nitrofenyl)ethanolu (6,8 g; 34 mmol) v THF (50 ml, dest. nad CaH₂) byl při pokojové teplotě uváděn fosgen. Po 2,5 hod. byl přebytek fosgenu a rozpouštědlo oddestilováno ve vysokém vakuu. Byl získán 2-(4-chlor-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (8,53 g; 95 %) jako žlutý olej.

Rf (SiO₂, CHC1₃) 0,85.

UV (CH₃CN) [nm] (log e): 213 (4,26; 254 (3,63) 300 (sh, 3,14).

’H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,03 (d, H-C(3), 7,59 (dd, H-C (5), 7,36 (d, H-C(6), 4,62 (t, a-CH₂), 3,32 (β-ΟΗ₂).

Anal. pro C₉H₇C1₂NO₄ (264,06): C vypočteno 40,94; H 2,67; N 5,30, nalezeno: C 40,97; H 2,69; N 5,00.

c) 5'-0-(2-(4-Chlor-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (150 mg, 0,62 mmol) byl kodestilován s pyridinem (2x5 ml, p.a., sušeno molekulovým sítem), pak přikapán roztok 2-(4-chlor-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (255 mg, 0,97 mmol) v 3 ml CH₂C1₂, destilovaném nad CaH₂. Po 4-hodinovém míchání za chlazení i-PrOH/N₂ (-30 až -15 °C) byla směs ředěna 30 ml CH₂C1₂ a promyta 30 ml vody. Vodná fáze byla ještě vytřepána 2x30 ml CH₂C1₂. Spojené organické fáze byly sušeny MgSO₄, filtrovány a společně odpařeny s 4x10 ml toluenu a 20 ml CH₂C1₂. Surový produkt byl zpracován sloupcovou chromatografíí (SiO₂, 15x3 cm, rozpouštědlo CH₂Cl₂/MeOH 100:7 700 ml). Byl získán 5'-O-(4-chlor-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (219 g, 75 %) jako bezbarvá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,36.

UV (MeOH, [nm] (log e): 212 (4,43); 261 (4,08); 310 (sh, 3,07).

-14CZ 292296 B6

Ή NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,75 (s (šiř., NH), 7,94 (d, H-C(3) v.CNPEOC); 7,52 (dd, H-C(5));

7,31 (m, H-C(6) v. CNPEOC, H-C(6) zthyminu); 6,32 (t, H-C(l'); 4,41 (m, H-C(3');

2x H-C(5'); a-CH₂ v. CNPEOC); 4,12 (kv. H-C(4')); 3,27 (t, p-CH₂ v. CNPEOC), 2,75 (s, šiř., OH-C(3')); 2,39 (m, H-C(2')), 2,19 (m, H-C(2')), 1,86 (s, CH₃).

Anal. pro Ci₉H₂₀C1N₃O₉ (469,83) vypočteno: C 48,57; H 4,29; N 8,94; nalezeno: C 48,87; H 4,56; N 8,64.

Příklad 7

a) 2-(5-Methoxy-2-nitrofenyl)ethanol [1,2]

Ke směsi 5-methoxy-2-nitrotoluenu (25 g, 150 mmol) a paraformaldehydu (2,3 g, 73 mmol) v DMSO (20 ml, l.č., dosušeno 2 d nad molekulovým sítem 0,4 nm) byl přidán při 80 °C Triton B (2 ml, 35% v MeOH). Po 2,5 hodinovém míchání při této teplotě bylo ponecháno ochladit na pokojovou teplotu a bylo neutralizováno několika kapkami koncentrované HC1. Směs byla zředěna 50 ml vody a extrahována 5x100 ml EtOAc. Organické fáze byly sušeny MgSO₄, filtrovány a odpařeny. Zbytek byl podroben destilaci ve vysokém vakuu (13,3 Pa), přičemž byla získána při 70 °C frakce s eduktem (12,1 g). Zbytek surového produktu byl čištěn sloupcovou chromatografií (240 g SiO₂, rozpouštědlo: toluen/EtOAc 8:1 1400 ml, 7:1 1600 ml, 6:1 400 ml, 5:1 400 ml, 3:1 400 ml, 2:1 600 ml a 1:1 600 ml). Byl získán 2-(5-methoxy-2-nitrofenyl)ethanol (6,87 g, 48 %) jako žlutý olej.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 1:1) 0,34.

UV (MeOH), [nm] (log e): 204 (4,00); 231 (3,82); 301 (3,84).

Ή NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,04 (dd, H-C(4); 6,82 (m, H-C(3); H-C(6)), 3,94 (kv, a-CH₂); 3,87 (s, OCH₃); 3,20 (t, p-CH₂), 1,64 (s (šir., OH).

Anal. Pro C₉HnNO4 (197,19): vypočteno: C 54,82; H 5,62; N 7,10; nalezeno: C 54,78; H 5,86; N 7,00.

Literatura:

[1] T. Morimoto, I. Hashimoto, H. Yamaoka, Chem. Abstr. 1978, 88,104880 v.

[2] Y. Tsui, S. Kotachi, K.-T. Huh, Y. Watanabe, J. Org. Chem. 1990, 55, 580.

b) 2-(5-Methoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

Do roztoku 2-(5-methoxy-2-nitrofenyl)ethanolu (3,0 g, 15 mmol) v THF (40 ml, destilovaný nad CaH₂) byl za míchání při pokojové teplotě uváděn fosgen. Po 2,5 hodinách byl přebytek fosgenu a rozpouštědlo oddestilováno ve vysokém vakuu. Byl získán 2-(5-methoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (3,72 g, 96 %) jako žlutý olej.

Rf (SiO₂, CHC1₃) 0,79.

UV (CH₃CN), [nm] (log e): 222 (sh, 3,87); 230 (3,90); 303 (3,87).

Ή NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,12 (d, H-C(3)); 6,88 (dd, H-C(4)); 6,79 (D, J = 2,8, H-C(6)); 4,63 (t, a-CH₂), 3,89 (s, OCH₃); 3,35 (t, β-CHj).

Anal. pro C10H10CINO5 vypočteno: C 46,26; H 3,88; N 5,39; nalezeno: C 46,42; H 4,00; N 5,50.

-15CZ 292296 B6

c) 5'-O-(2-(-5-Methoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (150 mg, 0,62 mmol) byl kodestilován s 2x5 ml pyridinu, p.a., sušeným molekulovým sítem 0,4 nm), rozpuštěn v 5 ml pyridinu a vychlazen na -30 °C (i-PrOH/N₂). K tomu byl v 5 minutách přikapáván roztok 2-(5-methoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (250 mg, 0,96 mmol) vCH₂Čl₂ (5 ml, destilovaný nad CaH₂). Po dohromady 4 hodinách míchám za chlazení i-PrOH/N2 (-30 až -15 °C) byla směs zředěna 30 ml CH₂C1₂ a promyta 30 ml vody. Vodná fáze byla vytřepána 2x30 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází Na₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a odpaření spolu s 4x10 ml toluenem a 10 ml CH₂C1₂ poskytlo surový produkt, který byl přečištěn sloupcovou chromatografii (SiO₂, 16x3 cm, CH₂Cl₂/MeOH 100:6 800 ml). Byl získán 5'-0-(2-(5-methoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (205 mg, 71 %) jako bezbarvá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,32.

UV (MeOH), [nm] (log e): 205 (4,30; 234 (sh, 3,94); 270 (4,01); 302 (sh, 3,84).

’H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,79 (s, NH); 8,06 (H-C(3); MNPEOC), 7,34 (s, H-C(6); thymin); 6,85 (dd, H-C (4); MNPEOC), 6,77 (d, J = 2,7; H-C(6); MNPEOC), 6,32 (t, H-C(l')), 4,43 (m, H-C(3'); 2x H-C(5'), a-CH₂, MNPEOC), 4,12 (kv, H-C(4')), 3,85 (s, OCH₃); 3,33 (m, p-CH₂, MNPEOC), 2,75 (d, OH-C(3')); 2,38 (m, H-C(2')); 2,18 (m, H-C(2')); 1,83 (s, CH₃).

Anal. pro C20H23N3O10 (465,42) vypočteno: C 51,61; H 4,98; N 9,03; nalezeno: C 51,31; H 5,09; N 8,63.

Příklad 8

a) 2-(2,4-Dichlor-6-nitrofenyl)ethanol

Ke směsi 2,4-dichlor-6-nitrotoluenu (1,03 g, 5 mmol) a paraformaldehydu (150 mg, 5 mmol) v DMSO (2,5 ml, l.č., přesušeno nad molekulovým sítem) byl přidán roztok terc.butylátu draselného (90 mg, 0,8 mmol) v terc.butanolu (1 ml, 99%). Po přidání přešla barva směsi ze žluté na temně fialovou. Bylo mícháno 5 minut při pokojové teplotě a 30 minut při 70 až 80 °C (teplota lázně). Pak bylo ochlazeno na pokojovou teplotu, neutralizováno několika kapkami koncentrované HC1. Směs byla zředěna 30 ml EtOAc a promyta 30 ml vody. Vodná fáze byla vytřepána 2x30 ml EtOAc. Sušení organických fází Na₂SO₄, filtrace a odpaření rozpouštědla poskytlo surový produkt, který byl čištěn sloupcovou chromatografii (20 g SiO₂, 12x2 cm, rozpouštědlo PE 30 ml, PE/EtOAc 10:1 110 ml, 9:1 100 ml, 8:1 360 ml, 7:1 80 ml). Byl získán 2-(2,4dichlor-6-nitrofenyl)ethanol (769 mg, 65 %) jakožto žlutá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 9:1) 0,41.

UV (MeOH, /._mx [nm] (log e): 205 (4,32); 2,18 (4,20); 254 (sh, 3,40); 292 (3,08).

Ή NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,73 (d, J = 2,0; 1 arom. H); 7,65 (d, J = 2,0; 1 arom. H); 3,92 (m, a-CH₂); 3,26 (t, p-CH₂); 1,70 (s, šiř., OH).

Anal. Pro CgHyCy^TC^ (236,054) vypočteno: C 40,71; H2,99; N 5,93; nalezeno: C 40,36; H 2,96; N 5,85.

b) 2-(2,4-Dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

-16CZ 292296 B6

K roztoku trichlormethylesteru chloromravenčí kyseliny (503 mg, 2,5 mmol) v THF (5 ml, dest. nad CaH₂) se během 5 minut přidával roztok 2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethanolu (500 mg, 2,12 mmol) a Et₃N (214 mg, 2,12 mmol, dest. nad KOH) v THF (5 ml). Za chlazení ledem bylo mícháno 1 hodinu a 1 hodinu při pokojové teplotě. Směs byla pak filtrována přes celit. Promývání filtračního koláče THF a oddestilování rozpouštědla a přebytečného činidla ze spojených filtrátů při 30 °C ve vysokém vakuu poskytlo 2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (597 mg, 94 %) jako světle žlutou pevnou látku.

Rf (SiO₂, PE/EtOAc 19:1) 0,57.

UV (MeOH, [nm] (log e): 204 (4,35); 217 (4,25); 252 (sh, 3,47); 295 (3,10).

Ή NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,82 (d, J= 1,8; 1 arom H, 7,70 (d, J= 1,8, 1 arom. H, 4,59 (t, a-CH₂), 3,42 (t, β-€Η₂).

Anal. Pro C9HC1₃NO₄ (298.509) vypočteno: C 36,21; H 3,03; N 4,69; nalezeno: C 36,37; H 2,30; N 4,60.

c) 5 '-0-(2-(2,4-Dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (200 mg, 0,83 mmol) byl odpařen s přídavkem pyridinu (3x3 ml, p.a., sušeno molekulovým sítem 0,4 nm), byl rozpuštěn v pyridinu, (3 ml) a ochlazen na -60 °C (i-PrOH/N₂). V průběhu 15 minut byl přikapáván roztok 2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (320 mg, 1,07 mmol) v CH₂C1₂ (3 ml, destilovaný nad CaH₂). Po dohromady 6 hodinovém míchání pod i-PrOH/N₂ (-60 až -15 °C) směs byla zředěna 10 ml CH₂C1₂ a promyta 10 ml vody. Vodná fáze byla extrahována 2x10 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází Na₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a odpaření za přídavku 4x10 ml toluenu poskytlo surový produkt (543 mg), který byl čištěn sloupcovou chromatografií (20 g SiO₂, 12,5x2,1 cm, rozpouštědlo CH₂Cl₂/MeOH 100:1 50 ml, 100:2 204 ml, 100:3 360 ml). Nejprve byl eluován 3',5'-bis-O-(2(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin, potom 3 '-0-(2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin a 5'-O-(2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin. Frakce byly odpařeny a ve vysokém vakuu sušeny. Byl získán 3',5'-bis-O-(2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (53 mg, 8 %) jako světle žlutá pěna, dále 3'-O-(2-(-2,4-<iichlor6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (14 mg, 3%) a 5'-O-(2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (339 mg, 81 %) jako bezbarvé pěny.

5'-O-(2-(2,4-dichlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin:

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,40.

UV (MeOH, [nm] (log e): 203 (4,51); 214 (sh, 4,38); 263 (4,02); 304 (sh, 3,06).

^JH NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,91 (s, NH); 7,75 (d, J= 2,1; 1 arom. H, DCNPEOC), 7,68 (d, J = 2,1; arom. H, DCNPEOC); 7,37 (t, H-C(6), thymin), 6,37 (t, H-C(l')), 4,63 (m, H-C(3'), 2x H-C (5'), a-CH₂, DC1NPEOC), 4,16 (m, H-C(4')), 3,40 (t, p-CH₂, DC1NPEOC), 2,86 (d, OH-C(3')); 2,42 (m, H-C)2')); 2,24 (m, H-C(2')); 1,89 (s, CH₃).

Anal. Pro C₁₉Hi9Cl₂N₃O9 (504,279) vypočteno: C 45,25; H 3,80; N 8,33; nalezeno: C 45,02; H 3,89; N 8,04.

Příklad 9

a) 2-(4,5-Dimethoxy-2-nitrofenyl)ethanol [1]

-17CZ 292296 B6

Ke směsi homoveratrylalkoholu (3,02 g, 16,6 mmol) v ledové kyselině octové (30 ml), chlazené ledem a solí na -10 °C byla během 6 minut za míchání přikapávána konc. kyselina dusičná (4,8 ml, 65%, d=l,4). Pak bylo ponecháno během 30 minut ohřát na 23 °C. Po 1 hodině míchání při této teplotě byla směs zředěna 30 ml vody, neutralizována NaHCO₃ a extrahována 3x30 ml EtOAc. Spojené organické fáze byly sušeny Na₂SO₄, filtrovány a zahuštěny. Zbytek (3,25 g) byl čištěn sloupcovou chromatografií (90 g SiO₂, toluen/EtOAc 4:1, 500 ml, 3:1 400 ml, 2:1 300 ml). Bylo získáno 2,13 g, (56 %) 2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethanolu jako žlutá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 2:1) 0,24.

UV (MeOH), [nm] (log e): 202 (4,18); 216 (4,06, 242 (3,97); 297 (3,63); 340 (3,70).

Ή NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,61 (s, H-C(3)); 6,80 (s, H-C(6), 3,97 (s, OCH₃); 3,96 (m, a-CH₂, schovaný), 3,95 (s, OCH₃), 3,21 (t, β-ΟΗ₂), 1,70 (s šir., OH).

Anal. pro Ci₀Hi₃NO₅ (227,216) vypočteno: C 52,86; H 5,77; N 6,16; nalezeno: C 52,87; H 5,82; N 6,12.

Literatura [1] E. McDonald, R. D. Wylie, Tetrahedron 1979, 35. 1415.

b) 2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

Trichlormethylester chloromravenčí kyseliny (0,26 ml, 2,2 mmol) v THF (5 ml, dest. nad CaH₂) byl ledovou lázní chlazen na 0 °C. Pak byl přikapáván roztok 2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethanolu (500 mg, 2,2 mmol) a Et₃N (218 mg, 0,3 ml, 2,2 mmol) v THF (14 ml, dest. nad CaH₂) během 10 minut. Pak byla odstavena lázeň, bylo dále mícháno při pokojové teplotě. Po 30 minutách míchání bylo přidáno aktivní uhlí na špičku špachtle, reakční směs byla po dalších 2,5 hodinách míchání při pokojové teplotě odsáta přes celit. Rozpouštědlo a přebytek činidla byl z filtrátu oddestilováno ve vysokém vakuu a byl získán 2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (624 mg, 98 %) jako žlutohnědá pevná látka.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 2:1) 0,77.

UV (MeOH), [nm] (log e): 303 (4,18); 217 (4,08); 242 (4,01); 297 (3,67); 339 (3,73).

'Η NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,67 (s, H-C(3)); 6,74 (s, H-C(6)); 4,66 (t, a-CH₂); 3,99 (s, OCH₃); 3,96 (s, OCH₃); 3,36 (t, β-ΟΗ₂).

Anal. pro CiiHnNOeCI (289,671) vypočteno: C 45,61; H4,18; N 4,84; nalezeno: C 45,59; H 4,26; N 4,94.

c) 5'-O-(2-(4,5-Dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (200 mg, 0,83 mmol) byl kodestilován s 2x2 ml pyridinu, (p.a., sušen molekulovým sítem 0,4 Nm), rozpuštěn ve 2,4 ml pyridinu a vychlazen na -60 °C (iPrOH/N₂). Potom byl přikapáván roztok 2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (361 g, 1,25 mmol) v CH₂C1₂ (2,4 ml, dest. nad CaH₂). Po 6,5-hodinovém míchání při chlazení i-PrOH/N₂ (-^10 až -15 °C) byla směs zředěna 10 ml CH₂C1₂ a promyta 10 ml vody. Vodná fáze byla extrahována 2x10 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází Ňa₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a odpaření s přídavkem 4x20 ml toluenu poskytlo 530 mg surového produktu, který byl čištěn sloupcovou chromatografií (20 g SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH) 100:3 309 ml, 100:4 104 ml, 100:5 160 ml). Jako první byl eluován 3',5'-bis-O-(2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin a potom 5'-O-(2-(4,5-dimetiioxyfenyl)ethoxykarbonyl)thymidin. Frakce byly odpařeny a sušeny

-18CZ 292296 B6 ve vysokém vakuu. Byl získán 3',5'-bis-0-2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (154 mg, 25%) a 5'-O-(2-(4,5-dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonylthymidin (272 mg, 66 %) jako žluté pevné látky.

5'-0-(2-(4,5-Dimethoxy-2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,23.

UV (MeOH, [nm] (log e): 20R(4,33); 212 (sh), 4,30; 247 (4,13); 267 (4,03); 343 (3,69).

*H NMR (250 MHz, CDC1₃): 9,10 (s, NH); 7,62 (s, H-C(3)); 7,37 (d, J = 1,2; H-C(6), thymin);

6,73 (s, H-C(6)); 6,35 (t, H-C(l'), 4,44 (m, H-C(3'); 2x H-C(5'); a-CH₂, DMNPEOC); 4,15 (m, H-C (4')); 3,96 (s, OCH₃); 3,94 (s, OCH₃); 3,33 (dt, β-ΟΗ₂, DMNPEOC); 3,06 (s, šir., OH-C3')), 2,42 (m, H-C(2')), 2,20 (m, H-C(2')); 2,20 (m, H-C(2')); 1,88 (d, J = 0,9; CH₃).

Anal. Pro C₂iH₂₅N₃On (495,441) vypočteno: C 50,91; H 5,09; N 8,48; nalezeno: C 50,94; H 5,09; N 8,32.

Příklad 10

a) 2-(2-Nitrofenyl)propanol [1,2]

Ke 2-nitroethylbenzenu (3,02 g, 20 mmol) a paraformaldehydu (600 mg, 20 mmol) v DMSO (10 ml, l.č., sušen nad molekulovým sítem) byl přidán roztok terc.butylátu draselného (360 mg, 3,2 mmol) v terc.butanolu (4 ml, dest. nad CaH₂). Bylo mícháno 15 minut při pokojové teplotě a 1,45 hodin při teplotě lázně 70 °C. Pak bylo ochlazeno na pokojovou teplotu a neutralizováno několika kapkami konc. HC1. Směs byla zředěna 100 ml EtOAc a promývána nasyceným roztokem NaCl (60 ml). Vodná fáze byla extrahována 2x100 ml EtOAc. Sušení organických fází nad Na₂SO4, filtrace, odpaření rozpouštědla poskytlo surový produkt (5,06 g), který byl přečištěn sloupcovou chromatografií (80 g SiO₂, 19x3,4 cm, rozpouštědlo: toluen 150 ml, toluen/EtOAc 8:1 270 ml, 7:1 240 ml, 6:1 280 ml, 5:1 180 ml). Byl získán 2-(2-nitrofenyl)propanol (2,539 g, 70 %) jako světle žlutý olej.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc 9:1) 0,25.

UV (MeOH, [nm] (log e): 206 (4,08); 220 (sh, 3,75); 254 (3,53); 285 (sh, 3,27).

‘H NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,75 (dd, J = 1,2; 8,1; 1 arom. H, ortho kNO₂); 7,55 (m, 2 arom. H); 7,36 (m, 1 arom. H), 3,80 (m, a-CH₂); 3,52 (sextet, β-CH); s, (šir. OH, 1,33 (d, J = 6,9, CH₃).

Anal. pro C9HjiNO₃ (181,191) vypočteno: C 59,66; H 6,12; N 7,74; nalezeno: C 59,55; H 6,12; N 7,90.

Literatura:

[1] J.Org. Chem. 1986,3143.

[2] Chem. Abstr. 1989, 110, P 75032 k.

b) 2-(2-Nitrofenyl)propoxykarbonylchlorid

K roztoku trichlormethylesteru chloromravenčí kyseliny (655 mg, 3,3 mmol) vychlazenému na 0 °C v THF (6,75 ml, dest. nad CaH₂) byl během 5 minut přidáván roztok 2-(2-nitrofenyl)

-19CZ 292296 B6 propanolu (500 mg, 2,76 mmol) a Et₃N (279 mg, 0,385 ml, 2,76 mmol, dest. nad KOH v THF (6,75 ml). Potom bylo 1 hodinu mícháno v ledové lázni a 1 hodinu při pokojové teplotě. Směs byla filtrována celitem. Promývání filtračního koláče THF a oddestilování rozpouštědla a činidla ze spojených filtrátů při 30 °C ve vysokém vakuu poskytlo 2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonylchlorid (644 mg, 96 %) jako světlehnědý olej.

Rf (SiO₂, PE/EtOAc 19:1) 0,24.

UV (MeOH, [nm] (log e): 205 (4,07); 218 (sh, 3,75); 251 (3,59);

^lH NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,84 (dd, J = 1,2; 8,0; 1 arom. H ortho k NO₂); 7,62 (m, 1 arom H, 7,44 (m, 2 arom H); 4,50 (d, J = 6,3; a-CH₂); 3,80 (sextet β-ΟΗ₂); 1,42 (d, J = 7,0; CH₃).

Anal. pro C10H10CINO4 (243,646) vypočteno: C 49,30; H 4,14; N 5,75; nalezeno: C 49,71; H 4,32; N 5,70.

c) 5'-O-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (1 g, 4,1 mmol) byl kodestilován s 3x15 ml p.a. pyridinu (sušený molekulovými síty), pak rozpuštěn v pyridinu (15 ml) a byl ochlazen na -60 °C (i-PrOHZN₂). Během 20 minut byl přikapáván roztok 2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonylchloridu (1,31 g, 5,38 mmol) vCH₂C1₂ (18 ml, dest. nad CaH₂). Bylo dále mícháno 6 hodin za chlazení i-PrOH/N₂ (-60 až -20 °C). Reakční směs byla zředěna 50 ml CH₂C1₂ a promyta 50 ml vody. Vodná fáze byla extrahována 3x50 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází Na₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a kodestilace s toluenem (4x15 ml) poskytlo surový produkt (2,22 g), který byl čištěn sloupcovou chromatografií (80 g SiO₂,19x3,4 cm, rozpouštědlo: CH₂Cl₂/MeOH 100:1 101 ml, 100:2 204 ml, 100:3 206 ml, 100:3,3 207 ml, 100:4 520 ml, 100:5 53 ml, 100:6 53 ml. Jako první byl eluován 3 ',5 '-bis-0-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin, potom 3 '-0-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin a posléze 5'-O-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin. Po odpaření frakcí a sušení ve vysokém vakuu byl získán 3',5'-bis-0-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin (145 mg, 5 %) jako světle žlutá pěna, 3'-O-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin (71 mg, 4 %) a 5'-O-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin (1,307 g, 71 %) jako bezbarvé pěny.

5'-O-(2-(2-nitrofenyl)propoxykarbonyl)thymidin:

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,43.

UV (MeOH) [nm] (log e): 207 (4,30); 263 (4,07).

*H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,66 (s, NH, diastereomer); 8,64 (s, NH, diastereomer); 7,77 (m, 1 arom. H, NPPOC); 7,59 (t, 1 arom. H, NPPOC), 7,43 (m, 2 arom. H, NPPOC); 7,33 (s, H-C(6), thymin, diastereomer); 7,30 (s, H-c(6), thymin, diastereomer); 6,34 (t, H-C(l'), diastereomer, 6,32 (t, H-C(l'), diastereomer); 4,29 (m, H-C(3'), H-C(4',2xH-C(5'), a-CH₂, NPPOC); 3,80 (m, β-CH, NPPOC); 2,62 (d, J = 4,2; OH-C(3'), diastereomer, 2,60 (d, J = 4,4; OH-C(3), diastereomer, 2,39 (m, H-C(2')); 2,18 (m, H-C(2')); 1,86 (s, CH₃, thymin, diastereomer); 1,75 (s, CH₃, thymin, diastereomer); 1,38 (d, J = 7,0, CH₃, NPPOC, diastereomer); 1,37 (d, J = 7,0, CH₃, NPPOC, diastereomer).

Anal. pro C₂₀H₂₃N₃O₉ (449,416) vypočteno: C 53,45; H 5,16; N 9,35; nalezeno: C 53,14; H 5,21; N9,16.

-20CZ 292296 B6

Přikladli

a) 2-Chlor-2-(2-nitrofenyl)ethanol

Roztok 2-nitrobenzylchloridu (4,3 g, 25 mmol) v DMSO (3,5 ml, sušeno molekulovým sítem) byl smíchán s paraformaldehydem (750 mg, 25 mmol) a DBU (0,5 ml; 3,3 mmol) a bylo 20 minut mícháno při pokojové teplotě. Hodnota pH reakční směsi byla nastavena pomocí několika kapek AcOH na pH 3. Směs byla zředěna 120 ml CH₂C1₂, promyta 80 ml vody a extrahována 2x100 ml CH₂C1₂. Organické fáze byly sušeny Na₂SO4, filtrovány a odpařeny. Surový produkt (5,543 g) byl přečištěn sloupcovou chromatografii (150 g SiO₂, 22x4,1 cm, rozpouštědlo: toluen 150 ml, toluen/EtOAc 25:1 260 ml, 15:1 320 ml, 10:1 330 ml, 5:1 720 ml, 4:1 250 ml.) Jako první byl eluován edukt (2,587 g, 60 %), potom směsná frakce (267 mg) a nakonec 2-chlor-2-(2-nitrofenyl)ethanol (1,178 g, 23 % vztaženo na zreagovaný edukt). Získaná směsná frakce (267 g) byla čištěna další sloupcovou chromatografii (8 g SiO₂, 15x1,2 cm, rozpouštědlo: toluen 50 ml, toluen/EtOAc 100:1 50 ml). Nejdříve byl eluován další edukt (44 mg, 1 %) a potom 2-nitrostyrenepoxid (68 mg, 2 %, nebo 4 % vztaženo na zreagovaný edukt). Celkové množství zpátky izolovaného eduktu bylo 2,631 g (61 %).

2-Chlor-2-(2-nitrofenyl)ethanol (žlutá pevná látka)

Rf (SiO₂, CH₂C1₂) 0,23.

T.t. 49 až 50 °C.

UV (MeOH) [nm] (log e): 209 (4,11); 254 (3,64); 332 (sh, 2,70).

ΉNMR (250 MHz, CDC1₃): 7,94 (dd, J = 1,3; 8,3; 1 arom. H); 7,89 (dd, J = 1,3; 7,9; 1 arom H); 7,69 (m, 1 arom. H); 7,51 (m, 1 arom. H); 5,73 (dd, J = 4,6; 6,8; β-CH); 4,11 (dd, J = 4,6; 12,1; a-CH); 4,00 (dd, J = 6,8; 12,0; a-CH); 2,14 (s, OH).

*H NMR (250 MHz, DMSO-de): 7,94 (dd, J= 1,2; 8,1; 1 arom. H); 7,86 (dd, J = 1,5; 7,9; 1 aromH), 7,77 (dt, J= 1,2; 7,4; 1 arom H), 7,60 (dt, J= 1,6; 8,3; 1 arom H); 5,43 (t, J= 6,4; β-CH); s (šir. částečně schovaný, OH, 3,86 (d, J = 6,4; a-CH₂).

Anal. pro C₈H₈C1NO₃ (201,609): C 47,66; H 4,00; N 6,95; nalezeno: C 48,01; H 4,11; N 7,00.

b) 2-Chlor-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid

Roztok difosgenu (1,7 ml, 14 mmol) v THF (10 ml, dest. nad CaH₂) byl v ledové lázni ochlazen na 0 °C. Během 30 minut byl přidán roztok 2-chlor-2-(2-nitrofenyl)ethanolu (705 mg, 3,5 mmol) a Et₃N (354 mg, 0,485 ml, 3,5 mmol) v THF (10 ml, dest. nad CaH₂). Po další hodině míchání byla ledová lázeň odstavena, ještě bylo 3 hodiny mícháno při pokojové teplotě. Směs byla filtrována přes celit. Sraženina byla promyta THF (10 ml, dest. nad CaH₂). Spojené filtráty byly odpařeny a sušeny ve vysokém vakuu při pokojové teplotě. Byl získán 2-chlor-(2-(2nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (896 mg, 97 %) jako světle hnědý olej.

Rf (SiO₂, CH₂C1₂) 0,82.

UV (MeOH), [nm] (log e): 208 (4,11), 253 (3,66).

'H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,01 (dd, J = 1,1; 8,1; 1 arom. H); 7,93 (dd, J = 1,1; 7,9; 1 arom. H); 7,74 (dt, J = 1,1; 8,2; 1 arom. H); 7,57 (m, 1 arom. H); 5,89 (dd, H = 4,9; 6,4; β-CH); 4,80 (dd, J = 6,5; 11,4; a-CH); 4,73 (dd, J = 4,9; 11,5; a-CH).

-21CZ 292296 B6

Anal. pro C₉H₇C1NO₄ (264,064) vypočteno: C 40,94; H 2,67; N 5,30; nalezeno: C 41,39; H 2,89;

N 5,38.

c) 5'-O-(2-Chlor-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (250 mg, 1,03 mmol) byl kodestilován s 2x3 ml p.a. pyridinu (dosušeného nad molekulovým sítem), pak byl rozpuštěn v pyridinu (3,5 ml) a ochlazen na -40 °C (i-PrOH/N₂). Během 30 minut byl přidán roztok 2-chlor-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (356 mg, 1,35 mmol) v CH₂C1₂ (3,5 ml, dest. nad CaH₂). Za chlazení i-PrOH/N₂ (-40 až -10 °C) bylo dále mícháno 4,45 minut. Reakční směs byla zředěna 10 ml vody a extrahována 4x10 ml CH₂C1₂. Organické fáze byly sušeny Na₂SO₄, filtrovány, odpařeny a kodestilovány s 4x10 ml toluenu. Surový produkt (665 mg) byl čištěn sloupcovou chromatografíí (20 g SiO₂, 12x2,1 cm, rozpouštědlo CH₂C1₂ 100 ml, CH₂Cl₂/MeOH 100:1 101 ml, 100:2 102 ml, 100:2,5 102 ml, 100:3 206 ml, 100:4 104 ml, 100:5 105 ml. Jako první byl eluován bis-(2-chlor-2-(2-nitrofenyl)ethyl)karbonát (60 mg, 10 %) jako žlutý olej, potom 3',5'-bis-0-(2-chlor-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (48 mg) jako světležlutá pěna, potom 3'-O-(2-chlor-2-(nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (16 mg, 3 %) jako bezbarvá pěna a posléze 5-O-(2-chlor--(2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (394 mg, 81 %) jako bezbarvá pěna.

5'-O-(2-Chlor-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin:

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,34.

UV (MeOH), [nm] (log e): 209 (4,34); 262 (4,10).

*H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,37 (s, (šiř.), NH); 7,97 (d, J = 8,1; 1 arom H, CNPEOC); 7,91 (dd, J = 1,0; 7,9; 1 arom. H, CNPEOC), 7,72 (t, J = 7,3; 1 arom H, CNPEOC); 7,55 (m, 1 arom. H, CNPEOC); 7,34 (m, H-C (6), thymin); 6,35 (dd, J = 4,0; 6,7; H-C(l'), diastereomer); 6,32 (dd, J= 3,9; 6,5; H-C(l'), diastereomer); 5,89 (m, β-CH, CNPEOC); 4,57 (m, a-CH₂, CNPEOC); H-C(3'), 2xH-C(5')), 4,15 (kv, J= 3,2; H-C(4’)); 2,41 (m, H-C(2')); 2,22 (m, H-C(2')); 1,90 (s, CH₃, thymin, diastereomer); 1,86 (s, CH₃, thymin); diastereomer); 1,61 (s, šir., OH-C(3')).

Anal. pro Ci9H₂₀ClN₃O9 (469,834): vypočteno: C 48,57; H 4,29; N 8,94; nalezeno: C 48,17; H 4,40; N 8,47.

Příklad 12

a) 2-Methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethanol

K roztoku 2-nitrobenzylmethyletheru (4,18 g, 25 mmol) v DMSO (3,5 ml, sušeno nad molekulovým sítem) byl přidán paraformaldehyd (750 mg, 25 mmol) a DBU ((1,85 ml;

12,4 mmol) a bylo ponecháno reagovat 4 hodiny při pokojové teplotě. Hodnota pH byla několika kapkami AcOH nastavena od pH 9 na pH 3,5. Směs byla zředěna 120 ml CH2C1₂ a promyta 80 ml vody. Vodná fáze byla extrahována 2x80 ml CH₂C1₂. Spojené organické fáze byly sušeny nad Na₂SO₄, filtrovány a odpařeny. Surový produkt (5,56 g) byl čištěn sloupcovou chromatografií (140 g SiO₂, 21x4,2 cm, rozpouštědlo: toluen 300 ml, toluen/EtOAc 20:1 210 ml, 15:1 160 ml, 10:1 220 ml, 15:2 170 ml, 6:1 210 ml, 5:1 180 ml, 4:1 400 ml, 3:1 240 ml, 2:1 240 ml). Jako první byl eluován 2-nitrobenzylmethylether (2,442 g, 58 %) a potom 2-methoxy-2-(2nitrofenyl)ethanol (1,696 g, 34 % resp. 82 %, počítáno na zreagovaný edukt).

2-Methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethanol (žlutá pevná látka)

-22CZ 292296 B6

Rf (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH 100:3) 0,31.

UV (MeOH), [nm] (log e): 206 (4,09); 256 (3,66).

’H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,00 (m, 1 arom. H, 7,70 (m, 2 arom H); 7,48 (m, 1 arom H); 4,95 (dd, J = 3,2; 7,2; β-CH); 3,94 (ddd J = 3,2; 8,8; 11,8; -CH); 3,67 (ddd, J = 4,4; 7,2; 11,7; a-CH); 3,31 (s, OCH₃); 2,29 (dd, J = 4,4; 8,8; OH).

Anal. pro C9H11NO4 (197,19) vypočteno: C 54,82; H 5,62; N 7,10; nalezeno: C 55,14; H 5,57; N 7,15.

b) 2-Methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlor

K roztoku difosgenu (1,2 ml, 10 mmol) v THF (15 ml, dest. nad CaH₂), chlazenému na 0 °C byl během 1 hodiny přidán roztok 2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethanolu (986 mg, 5 mmol) a Et₃N (506 mg; 0,693 ml; 5 mmol) v THF (10 ml, dest. nad CaH₂]). Po dalším 15 minutovém míchání při 0 °C po odstavení ledové lázně bylo ještě 1,5 hodin mícháno při pokojové teplotě. Směs byla filtrována přes celit, sraženina promyta THF (30 ml, dest. nad CaH₂). Spojené filtráty byly odpařeny a sušeny ve vysokém vakuu při pokojové teplotě. Byl získán 2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (1,264 g; 97 %) jako světlehnědý olej.

Rf (SiO₂, CH₂C1₂): 0,73.

UV (MeOH) [nm] (log e): 205 (4,12; 253 (3,71; 348 (sh, 2,74).

^rH NMR (250 MHz, CDC1₃): 7,97 (dd, J = 1,1; 8,2; 1 arom. H, 7,81 (dd, J = 1,6; 7,8; 1 arom. H,

7,73 (dt, J= 1,1; 7,6; 1 arom. H, 7,54 (m, 1 arom. H, 5,13 (dd, J= 3,3; 6,3; β-CH); 4,60 (dd, J = 3,2; 11,2; a-CH); 4,54 (dd, J = 6,4; 11,3, a-CH).

Anal. Pro C10H10CINO5 (259,645) vypočteno: C 46,26; H3,88; N 5,39; nalezeno: C 46,74; H 3,88; N 5,40.

c) 5 '-0-(2-Methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

Thymidin (250 mg, 1,03 mmol) byl kodestilován s 2x3 ml p.a. pyridinu, sušeným nad molekulovým sítem 0,4 nm), rozpuštěn ve 3,5 ml pyridinu a ochlazen na -50 °C. Za 1,5 hodiny byl přidán roztok 2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (348 mg, 1,34 mmol) vCH₂Cl₂ (3,5 mí, dest nad CaH₂). Za chlazení i-PrOH/N₂ (-40 až -10 °C) bylo mícháno ještě 3,5 hodin. Reakční směs byla zředěna 10 ml vody a extrahována 3x10 ml CH₂C1₂. Organické fáze byly sušeny Na₂SO₄, filtrovány, odpařeny a kodestilovány se 4x10 ml toluenu. Surový produkt (578 mg) byl čištěn sloupcovou chromatografií (20 g SiO₂, 12x2,1 cm, rozpouštědlo: CH₂C1₂ 100 ml, CH₂Cl₂/MeOH 100:1 202 ml, 100:2 102 ml, 100:3 103 ml, 100:4 104 ml, 100:5 105 ml, 100:6 106 ml. Nejdříve byl eluován bis(2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)eťhyl)karbonát (88 mg, 16 %) jako světle žlutá pevná látka a potom směsná frakce 3'-0-(2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu a 5 '-0-(2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu (323 mg). Směsná frakce byla čištěna sloupcovou chromatografií (7 g SiO₂, 13x1,2 cm, rozpouštědlo CH₂C1₂ 30 ml, CH₂Cl₂/MeOH 100:1 50 ml, 100:2 51 ml, 100:2 51 ml, 100:2,5 51 ml, 100:3 51 ml, 100:4 52 ml, 100:5 52 ml). Byl eluován nejprve 3'-O-(2-methoxy2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (11 mg, 2 %), a potom 5'-O-(2-methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (290 mg, 60 %), každý jako bezbarvá pěna.

5'-O-(2-Methoxy-2-(2-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin

-23CZ 292296 B6

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,40.

UV (MeOH) λ™» [nm] (log e): 207 (4,33); 363 (4,12).

’H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,67 (s šiř., NH); 8,03 (d, J = 5,0; 1 arom. H, MNPEOC); 7,78 (m, 1 arom H, MNPEOC); 7,70 (t, J = 7,5; 1 arom. H, MNPEOC); 7,52 (m, 1 arom H, MNPEOC); 7,52 (m, 1 arom. H, MNPEOC); 7,43 (m, H-C(6), thymin); 6,38 (dd, J= 3,8; 6,7; H-C(l'), diastereomer); 6,35 (dd, J= 3,7; 6; 4; H-C(l'), diastereomer); 5,14 (m, β-CH, MNPEOC); 4,42 (m, a-CH₂, MNPEOC, H-C(3'); 2x H-C(5')); 4,15 (kv, J = 3,2; H-C(4')); 3,28 (s, OCH₃, diastereomer); 3,27 (s, OCH₃, diastereomer); 2,64 (s, šir., OH-C(3')); 2,42 (m, H-C(2')), 2,23 (m, H-C(2')); 1,94 (s, CH₃, thymin, diastereomer); 1,92 (s, CH₃, thymin, diastereomer).

Anal. pro C₂₀H₂₃N₃O₁₀ (465,514) vypočteno: C 51,51; H 4,98; N 9,03; nalezeno: C 51,65; H 5,18; N 8,94.

Příklad 13

5'-0-(2-(2-Chlor-6-mtrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁴-2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxycytidin

N⁴-(2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxycytidin (5 g, 11,9 mol) byl kodestilován s 2x60 ml p.a. pyridinu, sušeným nad 4Á molekulovým sítem), rozpuštěn v 60 ml pyridinu a vychlazen na -60 °C (i-PrOH7N₂). Během 75 minut byl přikapáván roztok 2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchloridu (4,7 g, 17,8 mmol) vCH₂C1₂ (60 ml, dest. nad CaH₂) a bylo mícháno 1 hodinu 45 minut za chlazení i-PrOH/N₂ (-40 až -25 °C). Směs byla zředěna 150 ml CH₂C1₂ a promyta 100 ml vody. Vodné fáze byly extrahovány 100 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází nad Na₂SO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a kodestilace s toluenem (3x50 ml) poskytlo surový produkt (9,8 g), který byl přečištěn sloupcovou chromatografií (440 g SiO₂, 32x5,9 cm, rozpouštědlo: CH₂Cl₂/MeOH 100:4). Byl získán 5'-O-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁴-2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxycytidin (5,247 g, 68 %) jako bezbarvá pěna.

Rf (SiO₂, CH₂Cl₂/MeOH 5:1) 0,82.

UV (MeOH) Xmax [nm] (log e): 205 (sh, 4,56); 211 (4,58; 242 (4,28); 275 (4,17).

^lH NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,18 (m, 2 arom. H NPEOC, ortho kNO₂); 8,04 (d, H-C(6); cytosin); 8,03 (s, šir. NH, částečně skrytý), 7,73 (dd, 1 arom. H, CNPEOC); 7,66 (dd, 1 arom. H, CNPEOC); 7,41 (m, 2 arom H, NPEOC, meta kNO₂); 7,37 (t, H-C(4); CNPEOC, částečně skryt); 7,22 (d, H-C(5), cytosin); 6,34 (t, H-C(l')); 4,43 (m, H-C(3'); 2x H-C(5'); a-CH₂, CNPEOC, a-CH₂, NPEOC); 4,26 (m, H-C)4')); 3,76 (s, šir., OH-C(3')); 3,43 (t, |3-CH₂, CNPEOC); 3,12 (t, p-CH₂, NPEOC); 2,73 (m, H-C(2')); 2,14 (m, H-C(2')).

Anal. pro C₂7H₂₆N₅Oi₂Cl (647,981) vypočteno: C 50,05; H 4,04; N 10,81; nalezeno: C 49,87; H 4,17; N 10,74.

Příklad 14

5'-O-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁶-2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxyadenosin

-24CZ 292296 B6

N⁶-2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxyadenosin (5 g, 11,3 mmol) byl kodestilován s 2x60 ml p.a. pyridinu sušeným ještě nad molekulovým sítem 0,4 nm), rozpuštěn v pyridinu a ochlazen na -60 °C (i-PrOH/N₂). Kněmu se přikapával roztok 2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylchlorid (4,17 g, 15,8 mmol) vCH₂C1₂ (60 ml, dest. nad CaH₂). Po dalších 2 hodinách míchání za chlazení na —40 až -60 °C byla směs zředěna 150 ml CH₂C1₂ a promyta 100 ml vody. Vodné fáze byly extrahovány 100 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází NaSO₄, filtrace, odpaření rozpouštědla a kodestilace s 3x50 ml toluenu poskytlo surový produkt (8,73 g), který byl čištěn sloupcovou chromatografií (400 g SiO₂,28x5,7 cm, rozpouštědlo: CH₂Cl₂/MeOH 100:3). Byl získán 5'-0-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl-N⁶-(2-(4-nitrofenylethoxykarbonyl)-2'-desoxyadenosin (6,318 g, 83 %) jako bezbarvá pěna.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,33.

UV (MeOH) ληκ» [nm] (log e): 209 (4,67); 266 (4,46).

‘H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,71 (s, H-C(8)); 8,53 (s, šir., NH, částečně skryt); 8,23 (s, H-C(2)); 8,17 (m, 2 arom. H, NPEOC, ortho kNO₂); 7,73 (dd, 1 arom H, CNPEOC); 7,65 (dd, 1 arom. H, CNPEOC); 7,44 (m, 2 arom. H, NPEOC, meta kNO₂); 7,36 (t, H-C(4), CNPEOC, částečně skryt); 6,54 (t, H-C(l')); 4,77 (m, H-(C3')); 4,55 (t, a-CH₂, CNPEOC); 4,41 (m, a-CH₂, NPEOC, 2x H-(C5')); 4,49 (kv, H-C(4')); 3,43 (t, β-ΟΗ₂, NPEOC); 3,16 (t, p-CH₂, NPEOC); 3,15 (s, šir., OH-C(3'), částečně skryt); 2,89 (m, H-C(2')); 2,60 (m, H-C(2')).

Anal. pro C^H^NyOnCl (672,007) vypočteno: C 50,05; H 3,90; N 14,59; nalezeno: C 49,62; H 3,96; N 14,33.

Příklad 15

5'-0-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonylthymidin-3'-0-((|3-kyanoethyl)(N,N-diizopropylamino)fosfitamid)

V baňce v atmosféře argonu byl 5'-0-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin (1,9 g, 4 mmol) a lH-tetrazol (140 mg, 2 mmol) suspendován vCH₂C1₂ (20 ml, dest. nad CaH₂) aCH₃CN (8 ml, p.a.) a byl přidán bis(diízopropylamino)(|3-kyanoethoxy)fosfin (1,87 g, 6,2 mmol). Po 16,5 hodinách míchání při pokojové teplotě byla směs zředěna 50 ml CH₂C1₂ a promyta 25 ml nasyceného roztoku NaHCO₃. Vodná fáze byla extrahována 2x25 ml CH₂C1₂. Sušení organických fází NaSO₄, filtrace a odpaření rozpouštědla poskytlo surový produkt (3,4 g), který byl přečištěn sloupcovou chromatografií (40 g SiO₂,12x3,1 cm, rozpouštědlo.Toluen/EtOAc 5:1 160 ml, 4:1 150 ml, 3:1 120 ml, 2:1 150 ml, 1:1 100 ml, 1:2 150 ml, 1:3 160 ml, vždy za přídavku 1 % obj. Et₃N. Byl získán 5'-0-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin3'-O-((P-kyanoethyl)(N,N-diizopropylamino)fosfitamid (2,012 g, 75 %) jako bezbarvá pěna.

Rf (toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,64 a 0,70 (diastereomery).

UV (MeOH) [nm] (log e): 205 (4,45); 262 (4,06).

‘H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,40 (s, NH); 78,74 (td, 1 arom. H, CNPEOC); 7,66 (dd, 1 arom. H, C NPEOC); 7,38 (m, H-C(4), CNPEOC); 6,37 (m, H-C(l')); 4,61 až 4,25 (m, H-C(3'), 2xH-C(5'); a-CH₂, CNPEOC); 4,28 (m, H-C(4'), diastereomer); 4,22 (m, H-C(4'), diastereomer); 3,90- 3,66 (m, a-CH₂ v kyanoethoxy); 3,57 (m, 2xNCH); 3,43 (td, β-ΟΗ₂, CNPEOC), 2,66 (t, |3-CH₂ v kyanoethoxy); 2,48 (m, H-C(2')); 2,23 (m, H-C(2')); 1,86 (d, CH₃); 1,23 (m, 2xNC(CH₃)₂).

³¹P-NMR (161,7 MHz, CDC1₃): 149,73 a 149,85 (diastereomery).

-25CZ 292296 B6

Anal. pro C^H^NsOioPCl (670,056) vypočteno: C 50,19; H 5,57; N 10,45; nalezeno: C 50,43; H

5,90; N 10,43.

Příklad 16

5'-0-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁴-(2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxycytidin-3'-0-(([3-kyanoethyl)(N,N-diizopropylamino)fosfitamid)

V atmosféře argonu byl smíchán 5'-O-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁴-(2-(4nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxycytidin (1,9 g, 2,9 mmol) a lH-tetrazol (102 mg, 1,45 mmol) v CH₂C1₂ (20 ml, dest nad CaH₂ a CH₃CN (8 ml p.a.) s bis(diizopropylamino)([3kyanoethoxy)fosfinem (1,32 g, 4,38 mmol) a bylo mícháno při pokojové teplotě. Po

13,5 hodinách byl roztok zředěn 50 ml CH₂C1₂ a promýván 25 ml nasyceného roztoku NaHCO₃. Vodná fáze byla extrahována 2x25 ml CH₂C1₂. Spojené organické fáze byly sušeny Na₂SO4, filtrovány a odpařeny. Surový produkt (2,99 g) byl přečištěn sloupcovou chromatografií (61 g SiO₂, 18x3,2 cm, rozpouštědlo PE/aceton 5:1 170 ml, 4:1 200 ml, 3:1 200 ml, 2:1 600 ml, 3:2 150 ml, 1:180 ml, 2:3 300 ml, 1:2 90 ml). Byl získán 5'-O-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁴-(2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxycytidin-3'-0-((P-kyanoethyl)(N,N-diizopropylamino)fosfítamid) (2,29 g, 93 %) jako bezbarvá pěna.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,61 a 0,67 (diastereomery).

UV (MeOH), [nm] (log e): 203 (4,66); 209 (sh, 4,64; 241 (30); 276 (sh 4,18).

*H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,18 (m, 2 arom. H, NPEOC, ortho k NO₂; 8,02 (H-C(6); cytosin);

7,74 (td, 1 arom. H, CNPEOC); 7,66 (dd, 1 arom. H, CNPEOC); 7,40 (m, 2 arom. H, NPEOC, meta kNO₂); 7,39 (m, H-C(4), CNPEOC, Částečně skryt); 7,17 (d, H-C(5), cytosin); 6,28 (m, H-C(l')); 4,47 až 4,29 (m, a-CH₂, NPEOC), a-CH₂, CNPEOC); H-C (3'), H-C(4'), 2x H-C(5')); 3,90 až 3,53 (m, a-CH₂, kyanoethoxy, 2x NCH); 3,43 (t, (3-CH₂, CNPEOC); 3,12 (t, β-ΟΗ₂, NPEOC); 2,73 (m, H-C(2'); částečně skrytý); 2,65 (t, β-ΟΗ₂, kyanoethoxy); 2,17 (m, H-C(2')); 1,23 (m, 2xNC(CH₃)₂.

³¹P-NMR (161,7 MHz, CDC1₃) 149,67 a 150,02 (diastereomery).

Anal. pro C₃6H₄₃N₇Oi₃PCl (848,203) vypočteno: C 50,98; H 5,11; N 11,56; nalezeno: C 50,88; H 5,18; NI 1,36.

Příklad 17

5'-0-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N⁶-(2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-<iesoxyadenosin-3'-O-((P-kyanoethyl)(N,N-diizopropylamino)fosfitamid

V baňce, vypláchnuté argonem, byla směs 5'-O-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-N^ó2-{4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxyadenosinu (2 g, 2,98 mmol) a lH-tetrazolu (104 mg, 1,49 mmol) v CH₂C1₂ (20 ml, dest. nad CaH₂) a CH₃CN (8 ml, p.a.) smíchána s bis(diizopropylamino)(P-kyanoethoxy)fosfmem (1,36 g, 4,51 mmol) a při pokojové teplotě bylo mícháno

13,5 hodin. Směs byla zředěna 50 ml CH₂C1₂, promyta 25 ml nasyceného roztoku NaHCO₃. Vodná fáze byla extrahována 2x25 ml CH₂C1₂. Spojené organické fáze byly sušeny Na₂SO₄, filtrovány a odpařeny. Surový produkt byl čištěn sloupcovou chromatografií (92 g SiO₂, 13x4,2 cm, rozpouštědlo: PE/aceton 6:1 140 ml, 5:1 180 ml, 4:1 200 ml, 2:1 750 ml, 3:2 150 ml, 1:1 400 ml, 2:3 600 ml, vždy za přídavku 1 % obj. Et₃N. Byl získán 5'-O-(2-(2-Chlor-6-nitro-26CZ 292296 B6 fenyl)ethoxykarbonyl)-N⁶-(2-(4-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)-2'-desoxyadenosin-3'-0-((pkyanoethyl)(N,N-diizopropylamino)fosfitamid (2,146 g, 83 %) jako bezbarvá pěna.

Rf (SiO₂, toluen/EtOAc/MeOH 5:4:1) 0,71 a 0,76 (diastereomery).

UV (MeOH), λ,^ [nm] (log e): 205 (4,68; 2,66 (4,43).

’H NMR (250 MHz, CDC1₃): 8,74 (d, H-C(8), adenin); 8,23 (s, H-C(2), adenin); 8,18 (m, 2 arom. H, NPEOC, ortho kNO₂); 7,73 (m, 1 arom. H, CNPEOC); 7,65 (m, 1 arom. H, CNPEOC); 7,44 (m, 2 arom H, NPEOC, meta kNO₂); 7,36 (T, H-C(4), CNPEOC); 6,52 (m, H-C(l')); 4,77 (m, H-C(3')); 4,54 (t, a-CH₂, CNPEOC); 4,39 (m, a-CH₂, NPEOC); H-C(4'); 2x H-C(5')); 3,93 až 3,59 (m, 2x NCH, a-CH₂, kyanoethoxy); 3,41 (td, 3~CH₂, CNPEOC); 3,16 (t, |3-CH₂, NPEOC); 2,90 (m, H-C(2')); 2,71 (m, H-C(2'), částečně zakrytý); 2,67 (m, β-CHj, kyanoethoxy); 1,23 (m, 2xNC(CH₃)₂.

³¹P-NMR (161,7 MHz, CDC1₃): 149,70 a 149,79 (diastereomery).

Anal. pro C^H^NgOnPCl (872,229) vypočteno: C 50,95; H 4,97; N 14,45; nalezeno: C 50,92; H 5,11;N 14,21.

-27CZ 292296 B6

Shrnutí příkladů přípravy

Bsp.	R3	R2	R3	R4	R5	R6	B
1	H	H	H	H	H	H	Thymin
2 .	H	H	W	H	H		Thymin
3	H	H	F	H	H	H	Thymin
4	H	H	Cl	H	H	H	Thymín
5	H	H	Br	Ji	H	H	Thymin
6	Cl	H	II	H	H	: H	Thymin
7	H	och3	H	H	H	H	Thymin
8	Cl	H	Cl	H	H	H	Thymin
9	och3	OCH^	H	H	H	H	Thymin
10	H	H	II	ch3	H	H	Thymin
11	H	H	H	cl	H	' H	Thymin
12	H	H	H	och3	H	H	Thymín
13	H	H	Cl	H	H	H	N4-(2-pNPEOC)Cytosin
14	H	H	Cl	H	H	Ή	N6- (2-pNPEOC) Adenin
15 '	H	H	Cl	H	O-ÍCHj^—CN 1 .CH(CH3)2 —ρ-χ CHfCtyj	H	Thymin
16	H	H	Cl	H	O—(CHžh—CN 1 .CHÍCH^ —P— CHfCH^	H	N4-(2-pNPEOC) Cytosin
17	H	H	Cl	H	O—(CH2)2—CN 1 CHÍCHsh —P— CHÍCHjfe	H	N6-(2-pNPEOC) Adenin

Ozařovací pokusy

1. Provedení

Vhodně chráněné thymidinové nukleosidy byly ozařovány s pomocí ozařovací aparatury, která se skládala z vysokotlaké Hg-lampy (OSRAM HBO, 200 W), spojky, uzávěru s elektronickým ío řízením k nastavení dob uzavírání a temperovatelného držáku kyvet. Kromě toho byl mezi lampu a vzorek zabudovaný tepelný filtr (0,032 molámí roztok CuSO₄). Byly ozařovány 0,2 mM roztoky nukleosidů vMeOH/HaO 1:1 při 20 až 30 °C s celým vlnovým spektrem (polychromatické světlo s vlnovými délkami >289 nm.

-28CZ 292296 B6

Odštěpení chránících skupin bylo kvantitativně sledováno pomocí HPLC. HPLC přístroj se skládal z následujících elementů: Merck-Hitachi L-6200 Intelligent Pump, Merck-Hitachi Intelligent Auto Sampler AS 4000, Merck-Hitachi Interface, Měrek Lichtrosorb-sloupec RP-18, 125x5 mm. UV/VIS-spektrofotometr byl přístroj UVIKON 730 LC firmy Kotron. Detekce byla provedena při 260 nm. Integrace chromatografických signálů byla provedena s pomocí Software firmy Měrek: D-6000 HPLC-Manager.

Zásadně bylo chromatografováno ve směsích MeOH/H₂O. Přitom byl použit následující gradient (flow: 1 ml/min):

doba (min)	MeOH/H2Ol:l	h2o	MeOH
0	10	90	0
5	10	90	0
15	90	10	0
30	50	0	50
35	10	90	0

Pro thymidin a chráněné nukleosidy byly vstřikováním zřeďovacích sérií do chromatografií sestrojeny kalibrační křivky.

Z ozařovaných roztoků byly v určitých časových intervalech odebrány vzorky (objem 20 μΐ). Každý vzorek byl vstřikován dvakrát. Pro další vyhodnocení byla vzata střední hodnota těchto stanovení. Plochy píků v chromatogramech byly přepočteny s pomocí kalibračních křivek na koncentrace chráněných nukleosidů, resp. thymidinu. Takto získané hodnoty koncentrací byly děleny maximálně dosažitelnou koncentrací 0,2 mM (= koncentraci chráněných nukleosidů při začátku ozařování) a vynášeny jako „relativní množství“ v procentech proti době ozařování. Na tabulce v odstavci 2.3 je uveden výsledek takového měření se sloučeninou 5'-0-(2-(2-chlor-6nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin.

2. Příklady

2.1. Kalibrace thymidinu

Pro kalibraci thymidinu byla sestrojena zřeďovací série s následujícími koncentracemi: 0,2 mM, 0,16 mM, 0,12 mM, 0,08 mM, 0,04 mM. S každou koncentrací byla provedena tři měření. Ze získaných středních hodnot a hodnoty nulového bodu (0 plocha píku= 0 koncentrace) byly spočítány s pomocí lineární regrese kalibrační přímky (viz tabulku)

Kalibrace thymidinu plocha píku koncentrace thymidinu (mM)

516,893	0,20
414,730	0,16
307,575	0,12
208,952	0,08
99,5080	0,04
0,0000	0,00

Z lineární regrese vychází: y = 4,96777.10^-4 + 3,85757.10^-7 x, kde x je plocha píku a y = koncentrace thymidinu, r = 0,9999.

-29CZ 292296 B6

2.2. Kalibrace

5'-O-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu

Byla sestrojena zřeďovací série z následujících 3 koncentrací: 0,2 mM, 0,14 mM a 0,08 mM. Střední hodnoty 3 měření při každé koncentraci a hodnota nulového bodu byly dosazeny k výpočtu regresní přímky (viz tabulku) ío Kalibrace CNPEOC-T

plocha píku	koncentrace CNPEOC-T (mM)
617,057	0,20
435,070	0,14
238,624	0,08
0,0000	0,00

Z lineární regrese vychází: y = 9,27999.10^-4 + 3,22516.10^-7 x kde x = plocha píku a y = koncentrace CNPEOC-T, r = 0,9998.

2.3. Výsledky (a) 5 '-0-(2-(2-Chlor-6-nitrofenyl)-ethoxykarbonyl)thymidin

Ozařování 5'-O-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidinu

Doba ozařování (min.)	plocha píku CNPEOC-T	koncentrace CNPEOC-T (mM)	rel. množství CNPEOC-T (%)
1,00000	458911	0,1489	74,5
2,00000	253292	0,0826	41,3
3,00000	250989	0,0819	40,9
5,00000	84081,0	0,0281	14,0
15,0000	24181	0,0088	4,4
30,0000	0	0	0
60,0000	0	0	0
120,000	0	0	0
Doba ozařování (min.)	plocha píku thymidin	koncentrace thymidin (mM)	rel. mn. thymidin %
1,00000	83460,0	0,0327	16,3
2,00000	221149	0,0858	42,9
3,00000	228893	0,0888	44,4
5,00000	330106	0,1278	63,9
15,0000	432514	0,1673	83,7
30,0000	437588	0,1693	84,6
60,0000	442230	0,1711	85,5
120,000	407543	0,1577	78,9

Z tabulky zřetelně vyplývá, že fotolýza probíhá přes velký časový úsek podle kinetiky prvního řádu, což poukazuje na jednoznačný mechanismus odštěpení, bez vedlejších reakcí, snižujících 25 výtěžek.

-30CZ 292296 B6 (b) Další sloučeniny podle vynálezu

V následující tabulce jsou shrnuty vyhodnocené výsledky některých dalších derivátů a dvou srovnávacích sloučenin VI (5'-0-(2-nitrobenzyloxykarbonyl)thymidinu a V2 (5'-O-(2,4-dinitrobenzyloxykarbonyl)thymidinu, které byly získané podle výše uvedené metody vzhledem k poločasu a výtěžku (procento odblokovaného derivátu nukleosidů, vztaženo na maximálně dosažitelnou koncentraci).

Sloučenina č.	to.s (min)	výtěžek (% Cmax)
1	2,6	79
2	1,37	92
4	1,71	86
5	1,71	89
6	2,3	70
8	1,68	77
9	7,2	77
10	0,7	89
11	1,46	97
VI	2,5	55
V2	3,3	38

Z tabulky je zřejmé, že deriváty nukleosidů podle předloženého vynálezu z hlediska fotolytického odštěpení chránící skupiny na 5' co do rychlosti a vysokých výtěžků významně předčí dosavadní chránící skupiny VI a V2 (porovnej zejména sloučeniny 10 a 11).

Průmyslová využitelnost

Sloučenina 5'-O-(2-(2-chlor-6-nitrofenyl)ethoxykarbonyl)thymidin a jiné deriváty nukleosidů podle předloženého vynálezu byly podle metodiky S. P. A. Fodora a spol., Science 1991, 251, str. 767 použity k přípravě oligonukleotidů na DNA-čipu. Ukázalo se, že sloučeniny podle předloženého vynálezu dovolují nekomplikovanou syntézu oligonukleotidů s velmi vysokými výtěžky a tímto se hodí v praxi pro paralelní syntézy oligonukleotidů, řízené světlem.

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Deriváty nukleosidů s fotolabilními chránícími skupinami obecného vzorce I ( I),

   -31 CZ 292296 B6 kde

   R¹ znamená vodík, CN, OCH₃, halogen, alkyl, alkenyl, alkinyl nebo alkoxyalkyl s 1 až 4 atomy uhlíku,

   R² znamená vodík nebo OCH3,

   R³ znamená vodík, fluor, chlor, brom nebo NO₂,

   R⁴ znamená vodík, halogen, OCH3 nebo alkylovou, alkenylovou či alkinylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,

   R⁵ znamená vodík nebo chrániči fosfitamidovou funkční skupinu vzorce

   I ₇ I ₇

   NC-CH₂-CH2-O-P-N(R⁷)2 nebo p-N02-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, kde skupiny R⁷ jsou stejné nebo různé a znamenají lineární nebo rozvětvené alkylové zbytky s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou ethylové nebo izopropylové skupiny,

   R⁶ znamená vodík, OH, halogen nebo zbytek O-methyl nebo O-ethyl, O-allyl, O-tetrahydropyranyl, O-methoxytetrahydropyranyl nebo O-t-butyldimethylsilyl,

   B znamená adeninu, cytosinu, guaninu, thyminu, uracilu, 2,6-diaminopurin-9-yl, hypoxanthin-9-yl, 5-methyIcytosin-l-yl, 5-amino-4-(aminokarbonyl)imidazol-l-yl, 5amino-4-(aminokarbonyl)imidazol-3-yl, přičemž v případě, že B znamená zbytek adeninu, cytosinu nebo guaninu, má primární aminoskupina eventuálně stabilní chránící skupinu.
2. 2. Deriváty nukleosidů podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R¹ a R² a R³ znamenají vodík, přičemž R⁴ neznamená vodík.
3. 3. Deriváty nukleosidů podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R³ znamená vodík, přičemž R² znamená OCH3.
4. 4. Deriváty nukleosidů podle nároku 1, obecného vzorce I, kde R⁴ znamená methylový zbytek.
5. 5. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 4, obecného vzorce I, kde R⁵ je fosfitamidová skupina vzorce

   I ₇ I ₇

   NC-CH2-CH₂-O-P-N(R⁷)2 nebo p-NO2-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, kde skupiny R⁷ jsou stejné nebo různé a znamenají lineární nebo rozvětvené alkylové zbytky s 1 až 4 atomy uhlíku, s výhodou ethylové nebo izopropylové skupiny.
6. 6. Deriváty nukleosidů podle nároku 5, obecného vzorce I, kde R⁷ je ethylový nebo izopropylový zbytek.
7. 7. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 6, obecného vzorce I, kde jako R⁶ je zaveden zbytek O-methyl nebo O-ethyl, O-allyl, O-tetrahydropyranyl, O-methoxytetrahydropyranyl nebo O-t-butyldimethylsilyl.
8. 8. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 7, obecného vzorce I, kde v případě, že B znamená zbytek adeninu, cytostinu nebo guaninu je stabilní chránící skupinou fenoxyacetylový nebo dimethylformamidový zbytek.

   -32CZ 292296 B6
9. 9. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 7, obecného vzorce I, kde v případě, že B znamená zbytek adeninu jsou stabilními chránícími skupinami benzoylové nebo p-nitrofenylethoxykarbonylové zbytky.
10. 10. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 7, obecného vzorce I, kde v případě, že B znamená zbytek guaninu jsou stabilními chránícími skupinami izobutyrylové nebo p-nitrofenylethoxykarbonylové zbytky.
11. 11. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 7, obecného vzorce I, ve kterých v případě, že B znamená zbytek cytosinu jsou stabilními chránícími skupinami benzoylové nebo p-nitrofenylethoxykarbonylové zbytky.
12. 12. Deriváty nukleosidů podle nároků 1 až 11, obecného vzorce I, ve kterých je zaveden jako atom halogenu v R¹ nebo R⁶ atom fluoru, chloru nebo bromu.
13. 13. Způsob přípravy derivátů nukleosidů podle nároků 1 až 12, obecného vzorce I, vyznačující se tím, že se nechá reagovat

    a) alkohol obecného vzorce Π kde R¹, R², R³ a R⁴ mají výše uvedené významy, s derivátem fosgenu zvoleným ze skupiny sestávající z fosgenu, difosgenu a trifosgenu a následně takto vytvořený ester chlorouhličité kyseliny ve stupni

    b) reaguje s nukleosidy obecného vzorce ΙΠ kde R⁵, R⁶ a B mají výše uvedený význam a případně se zavede v poloze 3' derivátů nukleosidů s R⁵ znamenajícím vodík fosfitamidová skupina

    NC-CH₂-CH₂-O-P-N(R⁷)2 nebo p-NO2-C6H4-CH2-CH2-O-P-N(R⁷)2, podle známých metod.

    -33CZ 292296 B6

    13. Způsob podle nároku 13, v y z n a č u j í c í se t í m, že se stupeň a) provádí v nepolárním organickém rozpouštědle při teplotách mezi -20 a +25 °C.
14. 14. Způsob podle nároků 13 a 14, vyznačující se tím, že se používá ve stupni a)

    5 derivát fosgenu ve dvou až pětinásobném molámím přebytku vzhledem k alkoholu.
15. 15. Způsob podle nároků 13 až 15, vyznačující se tím, že ve stupni a) se používá jakožto nepolární organické rozpouštědlo toluen nebo tetrahydrofuran.

    10
16. 16. Způsob podle nároků 13 až 16, vyznačující se tím, že koncentrace alkoholu ve stopni a) je 0,1 až 10 mol na 10 ml rozpouštědla.
17. 17. Způsob podle nároků 13 až 17, vyznačující se tím, že se stupeň b) provádí ve směsi rozpouštědel, složené z dichlormethanu a polárního organického rozpouštědla, případně za

    15 přítomnosti báze při teplotách mezi -60 až +25 °C.
18. 18. Způsobpodle nároků 13 až 18, vyznačuj ící se tím, že se ve stupni b) používá jako polární organické rozpouštědlo dimethylformamid nebo pyridin.
19. 20 19. Způsob podle nároků 13 až 19, vyznačující se tím, že se ve stupni b) používá směs rozpouštědel složená z dichlormethanu a dimethylformamidu a báze, která je vybrána ze skupiny pyridin, triethylamin a ethyldiizopropylamin.

    20. Způsob podle nároků 13 až 20, vyznačující se tím, že molámí poměr dichlor-

    25 methanu k pyridinu nebo dimethylformamidu ve směsi je 1:1 až 3:1.
20. 21. Způsob podle nároků 13 až 21, vyznačující se tím, že molámí poměr nukleosidů k esteru chlorouhličité kyseliny je 1:1 až 1:2.

    30
21. 22. Způsob podle nároků 13 až 22, vyznačující se tím, že se ve stupni b) předloží nukleosid rozpuštěný v pyridinu nebo směsi dimethylformamidu a báze a přikapává se roztok esteru kyseliny chlorouhličité v dichlormethanu.
22. 23. Způsob podle nároků 13 až 23, vyznačující se tím,že koncentrace nukleosidů ve

    35 směsi rozpouštědel es tupni b) je 0,1 až 3 mmol na 10 ml rozpouštědla.
23. 24. Způsob podle nároků Baž 24, vyznačující se tím, že se zavedení fosfitamidové skupiny provádí reakcí derivátů nukleosidů, přičemž R⁵ v nich znamená vodík, s odpovídajícími fosfiny za přítomnosti ΙΗ-tetrazolu jakožto aktivátoru, ve směsi rozpouštědel z dichlormethanu

    40 a acetonitrilu a při teplotách mezi 0 a 25 °C.
24. 25. Použití derivátu nukleosidů podle nároku 1 obecného vzorce I pro syntézu oligonukleotidů řízenou světlem.

    45
25. 26. Použití podle nároku 26 s tím, že syntéza oligonukleotidů probíhá na pevném nosiči.
26. 27. Použití podle nároku 26 nebo 27 derivátu nukleosidů podle nároků 2 až 12.