CZ292995A3 - Classification method of hepatitis c virus and agents used in the process - Google Patents

Description

Předložený vynález se týká způsobu klasifikace virů hepatitis C (HCV). Zejména se předložený vynález týká způsobu klasifikace HCV za^použití^nových _peptidů___ příslušných pro tyto typy.

Dosavadní stav techniky virové hepatitis je známo, že je vyvolávána pěti různými typy virů, které jsou známy jako hepatitis A,B,C,D a E. HAV je RNA virus a nepůsobí dlouhodobé klinické symptomy. HBV je DNA virus. HDV je závislý virus, který je neschopen infikovat buňky za nepřítomnosti HBV. HEV je ve vodě se rozmnožující virus, HCV byl nejprve identifikován a charakterizoyán_jako........

působící non-A, non-B hepatitis (NANBH). Houghton a spol., EPO pub. č. 388322. Toto vedlo k popisu mnoha obecných a specifických polypeptidú vhodných jako imunologická činidla pro identifikaci HCV. Viz také např. Chooa spol. (1989) Science, 244:359-362; Kuo a spol., (1989) Science, 244:362-364 a Houghton a spol. (1991) Hepatology, 14:381-388. HCV je hlavní příčinou hepatitis zprostředkované krevní transfuzí.

Prototyp izolátu HCV byl charakterizován EP publikacemi č. 318 216 a 388 232, Jak je zde používán, zahrnuje výraz HCV nově izolované NANBH virové druhy. Výraz HCV-l označuje virus popsaný ve výše citovaných publikacích.

Proti počáteční identifikaci HCV bylo identifikováno alespoň šest různých virálních typů a označeno HCV-1 aŽ HCV-6. Cha a spol., (1992)

Proč.Nati.Acad.Sci.USA, 89:7144-7148. V těchto typech je mnoho subtypů. Typ viru, kterým je pacient infikován, může ovlivňovat klinickou prognózu a také odpověd na ______různé léčby, Yoshioka a spol. (1992) Hepatology, 16:293299. Vzhledem k tomu, že nejčastějším klinickým následkem infekce HCV je hepatocelulární karcinom, bylo by vhodné stanovit, jakým typem nebo typy HCV je pacient infikován.

V současné době se stanovení typu viru provádí genovou klasifikací; to je izolací virální RNA a stanovením sekvence různých segmentů polymerásovou . řetězovou reakcí (PCR). Nejen Že tato metoda je pracná a časově náročná, ale není vhodná pro použití u vzorků, které byly skladovány za podmínek, které neumožňují ochranu RNA nebo vzorků od pacientů, které nemají' dostatečný virální titr. Bylo by vhodné, aby existovala metoda pro klasifikaci HCV imunoanalýzou nebo

...........seroklasifŤkací.- -- - '-.. ....

......Metodou pro screening krve,.a diagnostiku .pacientů ' ^ θ“ϊπί^ο·ζ1?ο'ύ^)^^ϊπϊΰΰοζ^οΰζ1^^ζροΰ^?ζϊ·να^ΐϊ£^ζΐ9'θη-ζ--Η&ν-'-Ηί^·* ' který obsahuje dostatečné množství běžných epitopů pro , detegování.protilátek .k.jiným .typům .HCV, Imunozkouška ~ nerozlišuje mezi infekcemi různými typy HCV.

^v

Podstata vynálezu d

Předložený vynález zahrnuje přípravky a metody pro klasifikaci HCV genoklasifikací .a seroklasifikací, Přípravky zahrnují typově specifické epitopové, typově klusterově specifické epitopové nukleové kyseliny, kódující epitopy pro použití jako sondy a nukleové kyseliny komplementární k regionům přiléhajícím k těmto epitopú pro použití jako primery.

Jeden aspekt vynálezu je způsob klasifikace HCV , zahrnující stupně poskytnutí vzorku, obsahujícího proti látku, od jednotlivce; kontakt vzorku s... typově _ ......

specifickým epitopem' nebo typově-klastrově specifickými epitopy za podmínek, které umožňují navázání antigen- t protilátka; a stanovení, které protilátky v krevním vzorku se vážou k epitopu.

-.,z

Další aspekt vynálezu zahrnuje způsob klasifikace * HCV, zahrnující stupně poskytnutí vzorku, obsahuj ícího ···' ·$ protilátku od jednotlivce; kontakt vzorku s prvním typově specifickým epitopem nebo typově-klasterově specifickým epitopem za podmínek, které umožňují vazbu W antigen-protilátka; kontakt vzorku se druhým typově _ _____* 5 specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým * epitopem za podmínek, které umožňují vazbu antigenprotilátka; a stanovení, zda protilátky ve vzorku se vážou bud k prvnímu nebo druhému epitopu.

Další aspekt vynálezu se týká polypeptidů, obsahujících typově specifické epitopy nebo typově klastrově specifické epitopy. Polypeptidy jsou odvozeny od tří různých regionů HCV genomu. Jedna sada polypetidú zahrnuje typově specifický epitop nebo typově-klastrově specifické epitopy získané z HCV jaderné oblasti. Tato první sada se nachází mezi aminokyselinovými zbytky šedesát sedm a osmdesát čtyři HCV-1 a homologními regiony jiných typů HCV. V popise jsou použity následující zkratky aminokyselinových zbytků; A 4 alanin, I - isoleucin, L - leucin, M -- methionin, F fenylalanin, P - prolin, W - tryptofan, V - valin, N asparagin, C - cystein, Q -glutamin, G - glycin, S serin, T - threonin, Y - tyrosin, R - arginin, H - * histidin, K - lysin, D - kyselina aspartová a E kyselina glutamová.

Konkrétní sekvence aminokyselinových zbytků odvozené od jádrové oblasti a subtypy, ze kterých jsou odvozeny, jsou následující:

1..PEGRTWAQ, subtyp la nebo lb. 2. STGKSWGK, subtyp 2a nebo 2b.

3. SEGRWAQ, subtyp 3a nebo 4. ' .

I

Další sada.polypeptidů zahrnuje typově specifický, epitop získaný z HCV nestrukturálního regionu 4 (NS4).

Tato druhá sada se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 1689-1718 HCV-1 a homologních oblastí jiných typů HCV.

Konkrétní aminokyselinové sekvence a typy. nebo subtypy, ze kterých jsou odvozeny, jsou následující:

i:.-csQHLPY, subtyp .la.- ? -...... ........... .. 2. CASHLPY, subtyp lb.

-3. CASRAAL, subtyp 2a nebo 2b. ....

Další sada polypeptidů zahrnuje typově specifický ,, epitop.nebo^typově-klástrově specifické epitopy^ získané_t z nestrukturálního regionu 5 (NS5) hepatitis C viru.

Tato sada se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 22812313 HCV-1 a homologních regionů jiných typů hepatitis C ' í . ...... viru... .. ... .... .. . ...... . .... .. .. . ·. ..... ., . .

Konkrétní aminokyselinové sekvence a typy nebo subtypy, ze kterých jsou odvozeny, jsou následující:

1. PDYEPPWHG, subtyp la.

2. PDYVPPWHG, subtyp lb.

3. PDYQPATVAG, subtyp 2A.

4. PGYEPPTVLG, subtyp 2b.· .5. FAQASPVW, subtyp la.

6. FPQALPIW, subtyp lb.

7. FPQALPAW, subtyp 2a.

⁸' subtyp 2b. ...............

. Další aspekt vynálezu zahrnuje nukleokyselinové molekuly, kódující sekvence aminokyselinových zbytků popsaného typově specifického a typově-klastrově specifického epitopu, Tyto nukleokyselinové molekuly jsou vhodné jako sondy například v Southern blot-analýze nebo jiných analýzách pro rozpoznání DNA jako je zachycovací zkouška popsaná v US patentech Č. 4868105 a 5124246.

Další aspekt vynálezu zahrnuje nukleokyselinové molekuly komplementární k nukleokyselínovým sekvencím přiléhajících regionů, kódujících typově specifické a typově-klasterově specifické epitopy. Takové nukleokyselinové molekuly jsou použitelné pro provedení PCR ke stanovení genotypu konkrétního HCV.

fc I

Popis obrázků na připojených výkresech .

Obr. 1 je průtokový diagram seroklasifikaění * experimentální strategie.

Obr. 2 je průtokový diagram komprehenzivní strategie ? mapování epitopu.

Obr. 3 je kompilaČní graf, znázorňující výsledky mapování epitopu HCV la (Rodney)

Obr? 4 je kompilační graf, znázorňující výsledky mapování epitopu HCV 2b (Nomoto).

Definice

Hepatitis C virus nebo HCV se týká virálních druhů, které jsou patogenními typy působícími NANBH a zeslabených typů nebo defektních interferujíHchTčástlc’ z nich odvozených. Viz obecně, publikace citované v dosavadním stavu techniky. HCV genom obsahuje RNA. Viry, obsahující RNA mají relativně vysoké rychlosti spontánní mutace uváděné řádově 10'³ až IQ'⁴ na inkorporovaný nukleotid. Fields & Knipe (1986) Fundamental Virology” (Raven Press, NY). Protože heterogenita a fluidita genotypu jsou v RNA virech inherentní, existuje zde mnoho typů/subtypú HCV druhů, které mohou být virulentní nebo avirulentní. Propagace, identifikace, detekce a izolace různých HCV typů nebo izolátú je dokumentována v literatuře . Jak je zde vyjádřeno,/nukleotidová sekvence a sekvence aminokyselinových zbytků jsou od uvedených typů HCV, číslo HCV-l-.genomu a_aminokyselinoyých.sekvencí je... počítáno v Choo a spol..(1990) Brit.Med.Bull, 46:423441). Popis umožňuj.e (diagnózu různých typů.

Jak je zde použit,výraz typ” se týká HCV, které se liší .genotypicky, o více než asi 30 ; /'subtypj^ označuje

HCV, které se liší genotypicky o asi 10-20 % a izolát označuje HCV, které se genotypicky liší o méně než asi 10 %. Klasifikace označuje odlišení.jednoho typu HCV od jiného typu.

Informace o některých odlišných HCV typech/subtypech je uvedena v Mezinárodní publikaci č.

WO 93/00365 zejména pro typ nebp subtyp CDC/HCV1 (také nazývaný HCV-1) . Informace o jednom typu nebo podtypu, jakož i parciální genomové nebo aminokyselinové sekvenci, je dostačující pro to, aby mohl odborník v oboru za použití standardních technik izolovat nové typy HCV. Například několik různých typů HCV bylo screenováno jak je popsáno dále. Tyto typy, které byly získány z mnoha lidských sér (a z různých geografických^oblas tí.).,_ jsou klasifikovány za použiti metody a Činidel, které jsou zde dále popsány.

Genomová struktura a nukleotidová sekvence HCV-1 genomové RNA byly dedukovány. Genom se jeví jako jednořetězcová RNA, obsahující 10000 nukleotidů. Genom ⁴

I je pozitivní řetězec a vykazuje kontinuální, translační* otevřený čtecí rámeček (ORF), který kóduje polyprotein o asi 3000 aminokyselinách. V ORF se jeví strukturální protein(y) jako kódované v přibližně první čtvrtině amino-koncového regionu, s převahou polyproteinú. odpovědného za nestrukturální (NS) proteiny. Ve srovnání se všemi známými virálními sekvencemi jsou pozorovány malé, ale významné ko-lineární homologie s nestrukturálními (NS) proteiny rodu Flavivirů a s pestíviry (které jsou nyní také považovány za část rodu Flavivirů).

Na základě domnělých aminokyselinových zbytků kódovaných v nukleotidové sekvenci HCV-1 a jiných případech, jsou možné proteinové domény kódovaných HCV polyproteinú, jakož i přibližné hranice, uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Domnělá doména přibližná hranice (aminokyseliny č.)

C(nukleokapsidový protein) 1-191

E₁(virionový obalový protein) 192-333

Eg/NSl (obalový) 384-800

NS2(neznámá funkce) 800-1050

NS3(proteása)__' 1050-1650

NS4(neznámá funkce)' 1651-2100

NS5(polymerása) 2100-3011(konec)

Tyto domény jsou tentativni. Například E1-NS2 pás je přibližně v regionu,750-810 a NS3-NS4 pás je asi 1640-1650. Je zde také zřejmé, že 191 aminokyselin (aa) verze C je prekurzor, který je dále zpracováván na asi 17 0 aa délky a že NS2, NS4 a NS5 proteiny jsou každý dále zpracováván do dvou zralých proteinu.

A.

Různé typy HCV jsou definovány podle různých kriterií, jako je například ORF přibližně 9000 nukleotidů ,na přibližně 12000 nukleotidů, kódující · polyprotein podobného hydrofobního a/nebo antigenního charakterů’ jako' HCV-r-ar přítomností·-kor.lineárních ......

polypeptidových sekvencí, které jsou konzervovány v HCV1.

Při identifikaci HCV typů jsou aplikovatelné ·- “následující parametry -nukleokyselinové.homologíe_a . _ aminokyselínové homologie, bud samotné nebo v kombinaci. Obecně, jak je popsáno výše, jsou různé typy HCV z asi 70 % homologní zatímco subtypy jsou z asi 80-90 %

- homologní->a izoláty j sou homologní z. asi 90. %. .

Jak je zde použito, polynukleotid odvozený od označené sekvence se týká polynukleotidové sekvence,která obsahuje sekvenci alespoň asi 6 nukleotidů, výhodně alespoň asi 8 nukleotidů, výhodněji alespoň asi 10-12 nukleotidů a výhodněji alespoň asi 1520 nukleotidů, odpovídajících regionu označené nukleotidové sekvence. Odpovídající znamená homologní k nebo komplementární k označené sekvenci. Výhodně je sekvence regionu, ze kterého je polynukleotid odvozen homologní k nebo_komplementářní _k_se.kvencikterá-j.e__ unikátní pro HCV genom. Hybridizační techniky pro stanovení komplementarity nukleokyselínových sekvencí jsou v oboru známé. Viz např. Maniatis a spol. (1982). Navíc mohou být chyby dvojných polynukleotidú vytvořených při hybridizaci stanoveny známými technikami, zahrnujícími například, štěpení nukleásou ? jako je Sl, která specificky štěpí jednořetězcové plochy v duplexu polynukleotidú. Regiony, ze kterých mohou byt typické DNA odvozeny zahrnují, ale neomezují se na., například regiony, kódující typově specifické epitop;., jakož i netranskribované-a/nebo ne.translatov.ané. regiony'.Odvozený polynukleotid není nezbytně fyzicky odvozen od uvedené nukleotidové sekvence, ale může být získán mnoha způsoby, zahrnujícími například chemickou syntézu nebo DNA replikaci nebo reverzní transkripci nebo transkripci. Navíc mohou být kombinace regionů, odpovídajících regionům požadované sekvence, modifikovány způsoby známými v oboru, které jsou v souladu se zamýšleným účinkem.

Podobně polypeptidová nebo aminokyselinová sekvence odvozená od označené aminokyselinové nebo nukleokyselinové sekvence se týká polypeptidů, majících aminokyselinovou sekvenci identickou se sekvencí polypeptidu kočovaného v sekvenci nebo její Části, kde

Část zahrnuje alespoň 3-5 aminokyselin a výhodně alespoň

8-10 aminokyselin a ještě výhodněji alespoň asi 11-15 aminokyselin, nebo která je imunologicky shodná s polypeptidem kódovaným v sekvenci. Terminologie také zahrnuje polypeptid exprimovaný z označené nukleokyselínové sekvence.

Rekombinantní nebo od\/ožěný’pdlýprótě’ih'“ňen“í nezbytně translatován z označené nukleokyselínové sekvence, může být generován jakýmkoliv způsobem, zahrnujícím například chemickou syntézu nebo expresi rekombinantního expresního systémů nebo izolaci z HCV, včetně mutovaného HCV. . Zde popsané polypeptidy jsou obecně.relativně krátké a proto. jsou.snadno, chemicky syntetizovatelné.

Rekombinantní nebo odvozený polypeptid může zahrnovat jeden nebo více analogů aminokyselin nebo nepřirozených aminokyselin ve své sekvenci·.· Způsoby inzertování analogů aminokyselin do sekvence jsou známé odborníkům v oboru. Mohou také obsahovat jedno nebo více • značení, která jsou., známa.odborníkům_τγ oboruDetailní______ popis analogů a mimotopů se nachází v US patentu č. .519439 2,...

Peptidové analogy zahrnují delece, adice, subs ti tuce.nebomodi fikace, které zachovávají schopnost klasifikace.HCV. Výhodné substituce” jsou ty, které jsou konzervativní, tj. kde zbytek je nahrazen jiným stejného obecného typu..Je třeba chápat, že přirozeně se, vyskytující_faminokyseliny.mohou být subklasifikovány jako kyselé, bázické, neutrální a polární, nebo neutrální, a nepolární. Dále jsou tři z kódujících aminokyselin aromatické. Obecně je výhodné, že kódované

II polypeptidy se liší od přirozeného epoitopu tím, Že obsahují kodony pro aminokyseliny, které jsou ze stejné skupiny, jako je nahrazená aminokyselina. Obecně, bázické aminokyseliny Lys, Arg a His jsou vzájemně zaměnitelné, kyselé aminokyseliny - kyselina aspartová a glutamová - jsou zaměnitelné; neutrální polární aminokyseliny Ser, Thr, Cys, Gin a Asn jsou vzájemně zaměnitelné; nepolární alifatické aminokyseliny Gly,

Ala, Val, Ile a Leu jsou konzervativní s ohledem na ostatní (ale z důvodů velikosti jsou Gly a Ala vzájemně si bližší a Val, Ile a Leu jsou si rovněž bližší) a aromatické aminokyseliny Phe, Trp a Tyr jsou vzájemně zaměnitelné. Protože prolin je nepolární neutrální aminokyselina, činí tato obtíže vzhledem k jejímu vlivuna konformaci a substituce prolinem nebo prolinu nejsou preferovány s výjimkou, kdy může být dosaženo stejných nebo podobných konformačních výsledků. Polární aminokyseliny, které představují konzervativní změny zahrnují Ser,.Thr, Gin, Asn a v menším rozsahu Met.

Dále, i když jsou klasifikovány v různých kategoriích se Ala, Gly a Ser jeví jako zaměnitelné a Cys navíc patří do této skupiny nebo může být klasifikován s polárními neutrálními aminokyselinami.

Dále by bylo třeba uvést, že jestliže jsou polypeptidy vyrobeny synteticky, mohou být také provedeny substituce aminokyselinami, které nekódují gen. Alternativní zbytky zahrnují například omega aminokyseliny vzorce H₂N(CH₂)_nCOOH, kde n je 2 až 6.

Jsou to neutrální, nepolární aminokyseliny jako je sarkosin (Sar), terč.butylalanin (t-BuA), terč.butylglycin (t-BuG), N-methyl Ile(N-Melle) a norleucin (Nle). Fenylglycin, například, může nahradit Trp, Tyr nebo Phe neutrální aromatickou aminokyselinu;

citrulin (Cit) a methionin sulfoxid (MSO) jsou polární ale neutrální, cyklohexylalanin (CHa) je neutrální a nepolární, cysteinová kyselina (Cya) je kyselá a ornitin (Orň) je bazický. Konformační vlastnosti prolinových zbytků mohou být zachovány jestliže je jeden nebo více z nich nahrazeno hydroxyprolinem (Hyp).

Výraz “rekombinantní polynukleotid” jak je zde použit, zahrnuje polynukleotidy genomického, cDNA, semisyntetického nebo syntetického původu, který díky svému původu nebo zpracování:(1) není spojen-se všemi nebo částí polynukleotidu, se kterým je spojen v přírodě, (2) je napojen k polynukleotidu jinému než ke kterému je napojen v přírodě, nebo (3) nevyskytuje se v přírodě.

Výraz polynukleotid“ jak je zde použit, označuje polymerní formu nukleotidů jakékoliv délky, bud ribonukleotidů nebo desoxyribonukleotidú. rento výraz zahrnuje dvoj- a jednořetězcovou DNA a RNA. Zahrnuje . také známé typy modifikací, například značení, která jsou -známá --v- obořu,:-me-thylac-i,.. caps, .náhradu. jednoho., nebo více přirozeně se vyskytujících nukleotidů -analogem, internukleo.tidové modifikace jako jsou “ňapř nes© uc-ím-i—náboj'-- tnapř^^- -—- - ..· methylfosfonáty, fosforoteiestery, fos.foroamidáty, -karbamáty atd.) ..a'se. spoji, nesoucími náboj. (např..

fosforothioáty, fosforodithioáty atd.'), ta, které obsahují pendant skupiny jako jsou například proteiny, zahrnující, ale neomezující se na nukleásy, toxiny, protilátky.,signální peptidy a poly-L-lysin; obsahující interkalátory (např. akridin, psoralen atd.), obsahující chelátory (např. kovy, radioaktivní kovy, bor, oxidující kovy atd.), obsahující alkyiátory, obsahující «I modifikované spojení (např. alfa anomerní nukleové kyseliny atd.) jakož i nemodifikované formy polynukleotidů. Zde popsané polynukleotidy jsou relativně krátké a jsou proto snadno chemicky syntetizovatelné.

Čištěný polypeptid označuje polypeptid, který je ve stavu, kdy je v podstatě prostý jiných polypeptidu, tj. ve složení, které obsahuje minimálně asi 50 % hmotn. (požadovaný, polypeptid/celkový polypeptid ve složení), výhodně minimálně asi 70 % a výhodněji i minimálně asi 90 % požadovaného polypeptidu, bez ohledu na neproteinové materiály ve složení. Techniky pro čištění v.irálních polypeptidu jsou známé v oboru. Čištěné protilátky jsou podobně definovány v oboru.

Jak je zde použit,.označuje výraz epitop antigenní determinantu polypeptidu. Epitop by měl obsahovat 3 nebo více aminokyselin, které definují vazebné místo protilátky. Obecně epitop obsahuje alespoň 5 aminokyselin a někdy obsahuje alespoň 8 aminokyselin. Způsoby mapování epitopu jsou v oboru známé.

Používaný výraz typově specifický epitop označuje epitop, který se nachází v jednom HCV typu. Typověklastrový specifický epitop se nachází na více než jednom ale méně než všech HCV typech. Například jednotlivý epitop může být rozpoznáván protilátkami od pacienta infikovaného HCV 1, ale rozpoznáván méně účinně protilátkami od pacienta infikovaného HCV-2. Podobně typ-klastrově specifického epitopu odvozeného od HCV-3 může být rozpoznáván protilátkami od pacienta infikovaného HCV-l nebo HCV-2. Konzervované epitopy jsou ty, které jsou rozpoznávány protilátkami specifickými pro všechny HCV typy.

Polypeptid je imunologicky reaktivní s protilátkou, která se váže k peptidů díky·tomu, že protilátka rozpoznává specifický epitop obsažený v

_. polypeptidu. Imunologická reaktivita může být determinována vazbou protilátky, konkrétnějikiňěFíkou vazby protilátky a/nebo soutěžením ve vazbě za použití známých polypeptidu jako soutěžících látek, obsahujících epitop proti kterému je protilátka řízena. Techniky -pro.....

stanovení, který polypeptid je imunoLgicky reaktivní s β

ř protilátkou jsou známé v oboru.

Zde používaný výraz protilátka označuje polypeptid nebo skupinu polypeptidu, které obsahují alespoň jedno kombinované místo pro protilátku.

Kombinované místo pro protilátku nebo vazebná doména jsou vytvořeny ze složení různých domén molekuly(molekul) protilátek za vzniku trojrozměrnéhovazebného spojení se vnitřním povrchovým tvarem a '··= - - distribucí·.-náboje-komplementárním -k.rysům ..ep._i.topu. ................

antigenu, které umožňuje imunologickou reakci s antigenem-. Kombinované prot i látkové místo může být ·'·· ^;'vyxvbrěrio-^⁷fě'Žk^_é-á/ňebb'--l'eb.k-é=Ť-e-tězcov.é^domény^--(-iíyj:::a--_:--τ---....

V_L) ., které tvoří hypervariabilní smyčku, která přispívá -- --.k vazbě antigenu.. Výraz ^protilátka zahrnuje, například, protilátky obratlovců, hybridní protilátky, chimérní protilátky, změněné protilátky, jednovazné protilátky, Fab proteiny a jednotlivé domény protilátek.

Protilátky specifické k polypeptidům a polypeptidy mohou být vyrobeny jakoukoliv metodou známou v oboru.

Například jsou polypeptidy obecně suspendovány ve fyziologicky přijatelném pufru, smíseny se vhodnou přísadou a injektovány zvířeti. Způsoby výroby polyklonálních a monoklonálních protilátek jsou známé v oboru a nebudou zde podrobně popisovány.

*

Výraz polypeptid označuje polymer aminokyselin a neoznačuje specifickou délku produktu; v rozsahu definice po ly pe p t i du jsou proto zahrnuty polypeptidy, , oligopeptidy a proteiny. Tento výraz také neznamená nebo vylučuje postexpresní modifikace polypeptidu, například glykosylaci, acetyláci, foeforylaci a podobně. V definici jsou například zahrnuty polypeptidy, obsahující jeden nebo více analogů aminokyseliny (zahrnující* například nepřirozené aminokyseliny atd.), polypeptidy . se substituovanými vazbami jakož i jiné modifikace známé v oboru, jak přirozeně se vyskytující tak nepřirozeně se vyskytuj ící.

Léčení jak je zde používáno, znamená jak _____________ profylaxi tak terapii. ’

Jednotlivec jak je zde tento výraz používán, označuje obratlovce, zejména příslušníky rodů savců a zahrnuje, ale není takto omezen, živočichy (např. psy, kočky, hovězí dobytek, vepře, ovce, kozy, králíky, myši, krysy, morčata atd.) a primáty, včetně opic, šimpanzů, paviánů a lidí.

Používaný výraz negativní řetězec (sense strans) nukleové kyseliny obsahuje sekvenci, která má sekvenci homologní k sekvenci mRNA, Pozitivní řetězec obsahuje sekvenci, která je komplementární se sekvencí negativního řetězce.

Jak je zde použit je pozitivně řetězcovaný genom viru ten, ve kterém genom, at RNA nebo DNA, je jednořetězcový.a který kóduje virální polypeptíd(y). Příklady pozitivně řetězcových RNA virů zahrnují Togaviriade, Coronaviridae, Tetroviridae, Picornaviridae a Caliciviridae. Zahrnuty jsou rovněž Flavivirldae, které byly dříve označovány jako Togaviriade, Viz Fi.elds & Knipe (1986) .

Zde použitý výraz tělový vzorek, obsahující protilátky označuje komponentu jednotlivcova těla, která je zdrojem zájmových protilátek. Komponenty, obsahující tělové protilátky jsou známy v oboru a zahrnují, ale nejsou tak omezeny, například plasmu, seum, míšní kapalinu, lymfatickou kapalinu, vnější sekce dýchacího, intestinálního a genitourinárního traktu, sliny, mléko, bílé krvinky a myelomy. i.

Biologický vzorek“ se týká vzorku tkáně nebo kapaliny izolované z jednotlivce, zahrnující, ale neomezující se například na plasmu, sérum, míšní mok, ···· lymfatickou -kapal-inu; vně jš i-části -kůže,, resp-itační, intestinální a«genitourinární trakty, slzy, sliny, mléjo, krevní buňky, nádory, orgány. Zahrnuty jsou' také vžoř'ky s iOžek=buněc~ale neomezující se na, kondicionované medium vzniklé při —růstu buněk,-domněle -virálně infikovaných buněk, rekombinantních buněk a složek buněk).

Způsoby provedení vynálezu

Pří provedení předloženého vynálezu se využívá, pokud není jinak uvedeno, běžných technik molekulární biologie, mikrobiologie, syntézy rekombinantní DNA, ·* polypeptidú a nukleových kyselin a imunologie, které jsou odborníkům známé. Takové techniky jsou plně v literatuře popsány. Viz např. Maniatis, Pitsch &

Sambroook, Moleculary Cloning: A Laboratory Manual (1982); DNA Cloning, sv.I a II (D.N.Glover ed. 1985);

*

Oligonukleotide Synthesis (M.J.Gáit ed., 1994); Nucleic Acid Hybridization; (B.D.Hames & S.J.Higgins

-vyd. 1984) ;JlTianscription-and'Translaťion--(B;Dr-'Hames-*í<* S.J.Higgins vyd.1984); Animal Cell Culture (R.I.Freshney ed. 1986); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B,.Rerbal, .A Practicál Guide To Molecular Cloning (1984); serie, Methods in Enzymology (Academie Press, lne.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J.H.Miller a M.P.Calos vyd., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Meth.Enzymol., sv/154 a sv.155 (Wu a Grossmán a Wu, vyd.), Mayer aWalker, vyd. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academie Press,. .Londýn)..;.. Scopes.*.( 1987) - Protein—Pu-r-Lf-icatiom-Pr incipJes and Practice, druhé vydání (Sptinger-Verlag,. N.Y.) a Handbook of Experimental. Imraunology, sv.I-IV (D.M.WEir a C.C.Blackwell vyd. 1986) .

Všechny, patenty, patentové přihlášky a.publikace uvedené v tomto popise, jak výše tak dále, jsou zde zahrnuty jako odkazy.

Vynález zahrnuje metody pro detekci HCV a identifikaci infekce různých typů HCV.’Vynález také zahrnuje polypeptidy a molekuly nukleové kyseliny pro použití v těchto metodách.

Metody detekce a klasifikace infekce HCV zahrnují jak imunozkoušky tak identifikace nukleové kyseliny metodami, zahrnujícími, ale neomezujícími se na ně, Southern blot analýzu a polymerásovou řetězcovou reakci. Za účelem identifikace infekce HCV se biologický vzorek inkubuje s jedním ze zde popsaných polypeptidů za podmínek, které umožňují vazbu antigen-protilátka a stanovení, zda se protilátky ve vzorku vážou k epitopu, který se nachází v polypeptidů. ___________________

Imunozkouška a diagnostické kity

Peptidy, obsahující specifické epitopy a typ· klastrově specifické epitopy jsou vhodné v imunozkouškách pro detegování přítomnosti HIV protilátek, nebo přítomnosti viru a/nebo virálních antigenů, v biologických vzorcích. Provedení imunozkoušek se může různě měnit a v oboru je známo., mnoho provedení. ImunozkouŠka bude využívat alespoň; jeden typově.specifický epitop nebo typ-klastrově specifický epitop. V jednom provedení používá imunozkouška kombinace typově specifických epitopů a typ-klastrově specifických epitopů.

Polypeptidy jsou použitelné pro klasifikaci HCV za použití epitopů pro stanovení přítomnosti typově specifických nebo”týpově^kla^trově“specí“f'ických“ protilátek. Polypeptidy jsou také vhodné pro použití při generování typově nebo typově-klastrově specifických- ... protilátek, které mohou být použity v imunozkoušce pro rozlišení mezi různými typy HCV.

Tolypeptidy. jsou odvozeny od tří . různých regionů HCV genomu. Jedna sada polypeptidů zahrnuje typově nebo typově-klastrově·specifický epitop získaný z regionu HCV jádra.. Další sada polypeptidů zahrnuje typově nebo typově-klastrově specifický epitop získaný z HCV nestrukturálního regionu 4 (NS4). Další set polypeptidů ' zahrnuje typově nebo typově-klastrově specifický epitop získaný z nestrukturálního regionu 5 (NS5) viru hepatitidy C. Tento set se nachází mezi aminokyselinovými zbytky 2281-2313 HCV-1 a homolognfmi oblastmi jiných typů viru hepatitis C.

—Polypeptidy- j sou“ použité lné-v‘“imunozkouškáchprd’^” jeden nebo více typu HCV. Při zkoušce jednoho typu se vzorek uvede do kontaktu s jedním nebo více polypeptidy, obsahujícími typově-klastrově specifický epitop za podmínek, kterě umožňují vazbu antigen-protilátka a stanovení, kdy se protilátky vážou ve vzorku k epitopu.¹

V imunozkoušce k rozlišení jednotlivého typu HCV se získá biologický vzorek od jednotlivce, uvede se do kontaktu s prvním typově specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým.epitopem za podmínek, které —umožňu-j-í-vazbu antigen-protilátka;kontaktuje“se' se ' druhým typově specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým epitopem za podmínek, které umožňují vazbu antigen-protilátka a stanoví se, které protilátky ve vzorku se vážou bud k prvnímu nebo druhému epitopu.· Tyto stupně mohou být opakovány s mnoha polypeptidy, obsahujícími typově a/nebo typově-klastrově specifické epitopy.

Typicky, imunozkouška na. anti-HCV protilátku(y) zahrnuje výběr a příptravu zkušebního vzorku, o kterém se předpokládá, že obsahuje protilátky, jako je biologický vzorek, potom inkubaci tohoto vzorku s typově specifickým epitopem nebo typově-klastrově specifickým epitopem za podmínek, které umožňují vznik komplexů antigen-protilátka a pak detekci tvorby takových komplexů. Vhodné inkubační podmínky jsou v oboru známé.

Imunozkouška může být, bez omezení, v heterogenním nebo homogenním provedení a standardního nebo kompetitivního typu. ·

V heterogenním provedení se typově specifický “epitop^- nebo^typově-k-las tr ový-spec-i-f-ický-ep itoptypic ky—vážou k pevnému nosiči pro usnadnění oddělení vzorku od polypeptidu po inkubaci. Příklady pevných nosičů, které mohou být. použity zahrnují,, ale nejsou tak omezeny, nitrocelulózu (např. ve formě membrán nebo .....* mikrotitračních destiček), polyvinylchlorid (např. v deskách nebo mikrotitračních jamkách), polystyrénový latex (např. v kuličkách nebo mikrotitračních plotnách), polyvinylidenfluorid (známý jako Immunolon^R), diazotizovaný papír, nylonové membrány, aktivované kuličky a kuličky Proteinu A. Například Dynatech Immunclo? l nebo Immunolon^ mikrotitrační.destičky nebo 0,25 palcové polystyrénové kuličky (Precision Plastic Balí) mohou být použity v heterogenním provedení. Pevný nosič, obsahující typově specifický epitop nebo typově klastrově specifický epitop je typicky promyt po jeho oddělení ze zkoušeného vzorku a před detekcí navázaných -protilátek,. _Jak_st_ari_da_rdni tak kompetitivní provedení_ jsou v oboru známé.

V homogenním provedení se'zkoušený’vzorek inkubuje s typově specifickým epitopem nebo typově klastrově specifickým epitopem v roztoku. Například to může být za podmínek, kdy se budou srážet jakékoliv komplexy antigen-protilátka, které se vytvoří. Jakstandardní'tak“ kompetitivní provedení pro tyto zkoušky jsou známé v obor u.

Ve standardním provedení se možství HCV protilátek tvořící komplex protilátka-typově- nebo typově-klastrově . specifický epitop sleduje přímo. Toto muže být provedeno stanovením, jak se značené anti-xenogenní (např.

* antihumánní) protilátky, které rozpoznávají epitop na anti-HCV protilátkách, budou vázat díky tvorbě komplexu. V kompetitivním provedení se množství HCV protilátek

-1-i--— odvodí- od - kompet it ivní ho - účinku- na~vazbu~známého— množství značené protilátky (nebo jiného kompetitivního ligandu) v komplexu.

• V inhibiční zkoušce se stanoví schopnost protilátek vázat se k polypeptidům, obsahujícím různě odlišné typově specifické epitopy k typově klastrově specifickým epitopúm. Protilátky se nejprve vystaví polypeptidům, obsahujícím epitop(y) z jiného typ nebo typ-klastru HCV. Proces může být opakován pro další typy nebo typové klastry HCV.

Vytvořené komplexy obsahující anti HCV protilátky (nebo v případě kompetitivní zkoušky, množství soutěžící , protilátky) se detegují mnoha známými technikami, v závislosti na provedení. Například neznačené HCV protilátky v komplexu mohou být detegovány za použití konjugátu antoxenogenního Ig komplexovaného se značením (např. enzymovým značením).

V typických imunozkouškách se testovaný vzorek, typicky biologický vzorek, inkubuje s polypeptidy, obsahujícími jeden nebo více typově specifických epitopů nebo typově-klastrově specifických epitopů za podmínek, které umožňují tvorbu komplexů antigen-protilátka. Různá provedení mohou být použita. Například sendvičová být použita tam, kde se protilátka váže k pevnému nosiči a je inkubována zkoušeným vzorkem; promyta; inkubována se druhou, značenou protilátkou k analytu a nosič je opět promyt. Analyt se geteguje stanovením, je-li navázána druhá protilátka k nosiči. V kompeptitivním provedení, které muže být bud heterogenní nebo homogenní, se zkoušený vzorek obvykle inkubuje s .protilátkou a značí, Komtetitujíci antigen se také inkubuje, bud postupně nebo současně), Tato a jiná provedení jsou známa v oboru.

Protilátky řízené proti typově specifickým epitopum nebo typově-klastrově specifickým epitopům mohou být použity v imunozkoušce pro detekci virových antigenů u pacientů s HCV vyvolanou NANBH a v infekční krvi dárců. Navíc jsou tyto protilátky extrémně vhodné pro použití v detekci akutní fáze dárců a pacientů.

Xmunozkuška může použít například monoklonální protilátku řízenou proti typově specifickému epitopu nebo typově - klastrově .specifickému epitopu., kombinaci monoklonálnich protilátek řízenou proti epitopům jednoho . virálhího ' antig’enu, monokionálních protilátek-řízených-„· proti epitopům různých vitálních protilátek, polyklonálních protilátek řízených proti .stejnému vitálnímu antigenu neboholyřforíáTn^-prtítvlátký^řýzěrří'·· proti různým vitálním antigenúm. Protokoly mohou také -například používat< pevné-nosiče-nebo může .být .provedena _ imunoprecipitace. Nejvíce zkoušek zahrnuje použití značené protilátky nebo polypeptidů;značení může být, ale nemusí být omezeno na molekuly enzymatické, f luorescentníchemiluminiscentní.,, radioaktivní, nebo. barviv. Jsou také známy zkoušky, které amplifikují signály ze sond; příklady takových zkoušek, které využívají biotin a avidin a enzymem značené a zprostředkované imunozkoušky, jako je ELISA zkouška.

Vynález dále zahrnuje nukleokyselinové molekuly, kódující sekvence aminokyselinových zbytků popsaných typově specifických epitopů a typově-klastrově specifických epitopů. Tyto nukleokyselinové molekuly jsou použitelné jako sondy například pro Southern bloty nebo-jiné-DNA-1ozpoz náva j íc í-zkoušky *j ako“j é*žachycovác í zkouška popsaná v US patentech Č. 4868105 a 5124246.

Studie antigenního mapování expresí HCV cDBA ukazují, že mnoho z klonů, obsahujících tyto cDNA exprimuje popyleptidy, které jsou imunologicky reaktivní se šerem z jednotlivů, vykazujících NANBH. žádná jediný polypeptid nebyl imunologicky reaktivní se všemi séry.

Pět z těchto polypeptidů bylo velmi imunogenických v ^; *

tom, že protilátky k HCD epítopům v těchto polypeptidech byly detegovány v seru různých pacientů i když přesah v detekci ..nebyl -úplný. Proto výsledky imunogeríiciťý......

polypeptidů kódovaných v různých klonech potvrzují, že účinné detekční systémy pro HCV infekci mohou být

Z provedeny za použití panelů epitopů. Epitopy v panelu mohou být konstruovány v jednom nebo více polypeptidech. Zkoušky pro různé epitopy mohou být postupné nebo současné,

Kity vhodné pro imunodiagnosu a obsahující vhodně značená činidla jsou konstruovány balením vhodných materiálů, zahrnujících polypeptidy podle vynálezu, obsahující typově specifické epitopy a typově-klastrově specifické epitopy nebo protilátky řízené proti typově specifickým epitopům a typově-klastrově specifickým epitopům ve vhodných kontejnerech, spolu s ostatními

Λ

Činidly a materiály, potřebnými pro provedení zkoušky jakož i příslušným návodem pro použití.

Vynález dále zahrnuje nukleokyselinové molekuly komplementární k nukleokyselínovým sekvencím, lemujícím regiony, kódující typově specifické epitopy a typověklastrově specifické epitopy, Takové nukleokyselinové---mo-lek-y-l—-jsou-vhodné-pr opr ovedení^--PCR'pr o““stanoveni “ genotypu jednotlivého HCV.

Bylo by třeba poznamenat., že se vyskytují různé a hypervariabilní regiony v HCV genomu/ proto*je homologie v těchto regionech považována'za významně nižší, než v celém genomu.

í

- Techniky pro stanovení nukleokyselinové a , aminokyselinové homologie jsou v oboru známé. Například aminokyselinová sekvence může být stanovena přímo a porovnána se_ sekvencemi-zde uvedenými. Alternativně může být nukleotidová sekvence genčmického materiálu domnělého HCV stanovena (obvykle přes cDNA meziprodukt), může být stanovena kódující aminokyselinová sekvence a odpovídající regiony porovnány.' _ Předchozí d i s.kus_e__a._p,ř.ik l.ady__po.u.ze_ilustr-uj-í - _r· . vynález pro odborníky v oboru bude zřejmé, že vynález může být proveden jinými cestami a vynález je definován ‘'rozsahem*předložených nároků.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Porovnání hlavních epitopS různých odlišných typů HCV

Homologie aminokyselinových zbytků mezi různými ' ty py ~ a“ s ub ty py HCV ‘ by 1 á”póřovnáváňá~pro“”různě r eg i onyl· Subtyp HCV je popsán Simmondsemovou fylogenetickou analýzou. Číslování aminokyselinové sekvence odpovídá číslování popsanému pro prototypovou HW-1 sekvenci. Choo a spol. tabulka 2 ukazuje procento homologie aminokyselinových zbytků pro NS4 region typově specifických epitopů a typově-klastrové specifických epitopů a konzervovaného hlavního epitopu. Tabulka 3 ukazuje homologii aminokyselinových zbytků mezi dvěma typově specifickými epitopy a typově-klastrové specifickými epitopy NS5 regionu. Tabulka 4 ukazuje procento” homologie’ anfiriokýseTinových zbytku' pro jaderný region konzervovaných hlavních epitopů a typově specifických epitopů.

Tabulka 2

Aminokyselinová homologie (%) mezi různými HCV subtypy

HCV	příklad	zkratky	NS4 region typ	NS4 region
subtyp	typu		specidifkých	konzervovaného
			hlavních epitopů hlavního epitopu
			(1689-1718aa)*	(l910-1936aa)*
la HCV-l	(la) vs	(la)	100 %	100 %
lb HCV-J	(la) vs	(lb)	83 %	100 %

2a

HCV-J6 (la) vs (2a) %

%

2b HCV-Je (la) vs .(2b, 43 * 93 %

Tabulka 3

Aminokyselinová homologie (%) mezi různými HCV subtypy

HCV příklad 2kiatky NS4 region typ NS4 region subtyp typu specidifkých konzervovaného

... . ~Kiavfríchepit“opů“hTavního“epit'opu (2201-2313 aa)* (2673-2707 aa)*

la	HCV-l (la) ve (la)	. . .100 % . .	100	% .
lb	HCV-J (la,vs (lb,	'76 %	89	%
2a	HCV-J6 (la) vs (2a)	70 %	83	%
2b	HCV-J8 . (la) vs (2b)	73 %	83	%
3a	'HCV-E-bl (la)vs(lb)		77	%
3b '	HCV-Tb (ia) vs (3b)	V	83	%
Tabulka 4
niiui	Λ i a, λ 1 ί λ at r £ ViAřnA Ί a A OCXXliV* U llVHlVXV^	na ΓηΩσΊ r. -X. \ v t	.UCV e.nHt-.vnv
HCV	příklad zkratky	NS4 region typ	NS4	region
subtyp typu	specidifkých	konzervovaného

hlavních epitopů hlavního epitopu

			(10	-45	aa) *	(67-	84 aa}*
	··--.— —	. _ ------	- - -.....			—------	—-... . «,.—
la	HCV-l (la)	vs .(la)		100	%	100	%
lb	HCV-J (la)vs (lb)	98	*		100	*
-- ..	» , - -to .T-	. u-h ΈΛ- e toto. i.			-
2a	HCV-J6 (ia)	vs (2a)	98	%		61	%
2b	HCV-J8 (la)	vs (2b)	98	%		61	%

%

3a HCV-E-bl (la)vs(3a) 93 %

HCV-EG-21(la) vs (4) 98 % %

Příklad 2 _g

Syntéza peptidů

Byly syntezizovány dvě sady polypeptidů. Pivní sada byla sestavena pio provedení epitopového mapování HCV-1 a diuhá sada byla sestavena pro zjištění, který epitop . ident i f ikovaný-ve-studi ích-mapování- epi topů- obsahuj e “— typově specifické epitopy. V první sadě bylo syntetizováno šedesát čtyři sad (dvojmo) přesahujících oktapeptidú . pomocí Momotopes přes celý HCV-1 polyprotein (3011 aminokyselinových zbytků).

Druhá sada polypeptidů byla provedena podle metody popsané Geysenera (1990) J.Trop.Med.Pub.Health, 21:523533 a Merriťield (1063) J.Am.Chem.Soc., 85:2149-2154.

Ve druhé sadě polypeptidů byly vybrány čtyři ..antigenní regiony,, kter-é-představuj-í- -hlavní-epitopy nebo kozervativních sekvencí v HCV-1 z jádra, ΝΞ4, NS5 a jejich odpovídajících sekvencí z HCV subtypú lb, 2a, 3a a typu 4 pro typově stecifickou epitopovou syntézu. Sekvence z jádra byla vybrána z méně konzervovaného regionu aminokyselinových zbytků 67-88. Sekvence z NS4 regionu byla vybrána z aminokyselinových zbatkú 16891718. Sekvence vybrané z NS5 regionu byly regiony .aminokyselinových zbytků 2281-2313 a 2673-2707.

Příklad 3

Biologické vzorky

Za účelem stanovení účinnosti polypetidů v rozlišování mezi protilátkami specifickými k různým

-typům-HGV— by-la-z-ískána-ant-iser a-od- dv-ac e t i č tyř---—cftbnických NANBH pacientů z různých oblastí Spojených států - východní a západní pobřeží, Japonska, zemí západníEvropy, jižní Evropy a jižní Afriky. Virální RNA izolace, cDNA syntéza, PCR amplifikace, DNA sekvenování a hybridizace oligonukleotidovou sondou byly provedeny jak popsal. Cha a spol. (1992.) Proč .Nati .Acad. Sci. USA,. 89:7144-7148.

Příklad 4

Postupy mapování epitopu

Za účelem stanovení,kkteré regiony HCV obshují epitopy, jak skupiny konzervované tak specifické, byl celý HCV-l polyprotein podroben epitopovému'mapování Metoda je v podstatě znázorněna na obr. 2.

Šedesát čtyři (dvojmo) přesahujících oktapeptidů bylo syntetizováno pomocí Mimotopes^R přes celý HCV-l polyprotein (30lí aminokyselin) .'Panel '4 0 vzorků, který obsahuje 25 US HCV protilátka reaktivních vzorků , 9 japonských HCV reaktivních vzorků a 6 HCV nereaktivních negativních kontrolních vzorků, které byly vybrány pro épitopové mapování á klásterovou analýzu. Imunozkoušky byly provedeny za použití standardních ELISA postupů.

Kriteria pro identifikování hlavních epitopů byla založena na četnosti protilátkové reakce a intenzitě (titru) protilátkové reakce k těmto epitopům. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3 a 4.

Příklad 5

Studie peptidový odvozený enzym-napojený imunosorbent

Za účelem stanovení optimální imunozkoušky využívající polypeptidy popsané v příkladu 2, byly provedeny dva rozdílné typy zkoušky polypeptid odvozený enzym-napojený.imunosorbent (ELISA) a výsledky byly porovnány. První typ ELISA byl Nunc MaxiSorb™ na kterýbyly peptidy jednoduše adsorbovány a druhý typ použil Nunc Convalink NH™, na který jsou polypeptidy navázány kovalentně. Tvorba amidových vazeb mezi karboxylovými kyselinami a aminy je iniciována přídavkem karbodiimidu. Pro snížení hydrolýzy může být aktivní ester vyroben přídavkem -N-hydroxy-sukcinimidu- (NHSj k výše“ uvedeným' konjugačním postupům.

Mikrotitrační plotny pro první typ ELISA byly provedeny následovně. Polypeptidy byly umístěny do jamek Nunc MaxiSorb™ mikrotitračních ploten v koncentraci 1 μ g/jamka ve 100 μ! fosfátem pufrovaného salinického roztoku (PBS). Polypeptidy byly ponechány absorbovat přes noc při teplotě místnosti. Mikrotitrační plotny byly pak promyty čtyřikrát PBS bez deteigentu. Jamky pak byly následně potaženy 220 μΐ Superblock™ (Pierce) po jednu hodinu a pak aspirovány bez dalšího promývání a vakuově sušeny.

Zkouška byla provedena následovně. Vzorky sera o velikost 5 /tl byly přidány do jamek se 100 /ii 5% netuČného mléka a inkubovány po jednu hodinu při 37 °C. Jamky pak byly promyty pětkrát v PBS s 0,05 % Tweenu. Konjugát afinitně čištěného kozího anti-humánního IgG značeného s křenovou peroxidásou (Jackson Laboratories) byl pak použit pro stanovení stupně navázání lidských -pr o t-i-l-á t e k—k- -po -Ly pep t i dům. —Kon j-ug á t. -by. l _př eden _z ředěn _ na . 5 % IgG ve 150 mM NaCl, PBS, 5% koňské sérum (tepelně děnaturováné). 100 «1 konjugátu bylo umístěno do jamek a inkubováno jednu hodinu při 37 °C. Jamky pak byly promyty pětkrát PBS/Tween a OPD [o-fenyl-diamin-2HCl, jedna tableta na vývojku pufru (citrát fosfát pufrováný 0,02% H2O2) ; Sigma] po třicet minut, při teplotě < místnosti a byla stanovena absorpce při 492 a 620 nm. Vzorek byl stanoven ze 200 náhodných (normálních) vzorků při sedmi standardních odchylkách od průměru nebo asi 0,45.

Mikrotitrační plotny pro druhý ,typ ELISA byly provedeny následovně. Polypeptidy byly umístěny v jamkách Nunc MaxiSorbR mikrotitračních ploten v koncentraci lO mg/jamká v '50 (ii vody 25“ /tl 0', ÍM NHS ‘ ^; ' (sulfo-N^hyďroxysukcinimid,' Pieice) a 25 μΐ Q,1M EDC [1Athy 1 -3 -;(3 -djmethýlaminčpropylkárbodiimíd) Sigma] bylo - ’ přidáno k polypeptidům a mícháno při teplotě místnosti 30 minut na kývající se plošině. Celé obsahy byly přidány k 52 ιϊϊΓ ledově'studeného 0, ÍM uhličitanu “ ” ~ sodného, pH 8,6. 100 /tl směsi bylo použito pro potažení jamek mikrotitračních ploten a pak inkubováno při 4 °C po 30 minut, Plotny byly promyty čtyřikrát PBS/0,1%

Tr iton X^:10O . Plotny''byly pak zpracovány-se Superb-lock a - - > zkoušky byla provedena jak popsáno výše. Výsledky jsou uvedeny v následujících tabulkách 5-14.

Nl

w	X		X	H4
>1	x	X	J	u
CL	CL	X	.ή*
j	u	CL	2	2
X	X	u	2	2
σ	σ	X	w	ť)
«	w	tfl	tt	*
υ	o	tt	u	υ
ω	u	υ	hl	ω
ω	u	bl	hl	ω
X	X	hl	X	£
hl	hl	X	hl	ω
□	Q	hl	Q	ο
h.	b.	a	hi	fu
ω	hl	h.	tt	<
tí	tt	Ol	hl	U
i~	X	X	X	>4
j	J	•j	•4	*4 *
>	>	>	>	w
ω	w	w	hl	fú
tt-	-tt-	oc-	hC“	'
o	Q	et	Q	O
CL	CL	CL	CL	Ů4
x	l-l	X	rt	<
H	X	> '
<		tt	&
0.	CL	Cl	tt	5 *
SC	tt	CC	2	CC
o	O	O	σ	D *
w	w	w	z	Z

>*		>4
x4		u
> w		> X·
w tt «	—J-	’ hl tt hC
Q		o
		ÍX,

-x
*σ	Xí	·«	XI
rd	rd	Cí	Cí
·*—·	Xr	Xw—	*w-
O	rd	Cí	n
rd	rd	rd	rd
1	1	1	I
Cí	CJ	Cí	Cí '
O	o	O	o
xř	'T	dy	v
a	α	O.	a
u	υ	U	υ

<a Δ fla d d fM Γ4 'w' Ί—r

O x rs tn d d H d tlil fs M M M O O O O ff ff ff «ί *CL Οι Qi £L u υ u u *c w

X

J w

o o

X

O

Ό

JS

IN <fl n (0 ja <H H f\ (S

OHtsn d d d d I I I I rs n rs rs O O O o ff ff ff ff CL CL Ou CL ο u υ o <

w l-l u

hl

O

O

X

O

Ό

O

o) iS <0

CS

JD rs

ID rs «3 υ

ρ '3

X!

£, υ

'>1 c

<D υ

nl l—J

Π fÚ H CS ff CD ff

ΓΙΑ ff to »0 n vo

O t£> cd o ff in η-i r— co rs σ' ff -U «ci r- \c eo 01 <D rt sD

Os		. >φ Λ	ií tt)	c >N 10)
0			M	jQ
0		01	0
			Ν,σ.	01
y	U5 O	tt) rt	> Ά Ά • co	<D •rt
M	«7	3	rd	3
0		CP	—O	S'
N	tn		►d | ’	s
*	J	<1)	►d dy *-* QQ	u

CO σ>

co \D

Tj «Λ

Z

CE □

r|

	w	M		M	t-4
	>4	5-1 ’	Hí	J
	x	X	X	<£
	u	u	X	2	2
	s	X	»3	K
	o<	σ	X	cc	v)
	w	M	V)	X	< <
<u	o	o	X	u	o
o	bl	bl	o	ω	bl
c	bl	bl	bl	u	ω
flj	£	X	bl	£	X
>	bl	W	X	bl	bl
&	Q	Q	bl	D	a
CJ	u.	fa	O	X	u
tn	w	ω	tu	X	X
X	X	o	bl	bl
	X	X	X	X	X
J		u		J «
ΰ}	>	>	>		A
>r|	bl	bl	ω	bl	bl
>	X	X	X	X	X
MO	a	O	Q	O	O
N	X	cu	X	X	X
	M	M	t-4	X	X
,0	M	M	>		pr
>	X	X	X	>
Q	cu	X	X	X	”> «
ň,	.. X.	X	X	2	t£
ζζ	o	o	o	o	a *
u	w	w	V3	z	z

EC

N

JE Ό O rl '>1 •U C O O. N Oj tí Ν'

Pí <u W n-i

Q.& (0 >1 J -> ω x x o X

				-*b ** 1-*,	w	K.	·—· —.
«0	XI	(0	X)	rti .0 (fl XL	(-<	El	<ti Xl (ti Xl
i-4	A	CM	CM	' *4 A (M CM	u		A A rs CM
	b*1	i»>	w*	'w* “W< >	bl	9	-—·* -w >b-* *—*
O	•-4	CM	m	o η μ n		4-J j	O A CM n
^4 1	A |	r4 1	A 1	A A A A 1 I I (	O O	u	•4 «-4 i-4 r4 1 t 1 1
<M	CM	rs	(M	cs cm cm rs	X	Φ	CN CN CN CN
O	O	O	O	o o o o	o		O O O O
			5T	ry kT *9	•o	c
Cu	Od	CL	Cu	tx Cl Q< (X	0	1¾.	(X CL Q. Cl.
a	ϋ .	ϋ*	ϋ	ϋ o u u	Λ £1	i?	U U U U

.NI X.C0..l*l„ Ul f> (\ lO⁷ r' O m cn co Φ to fl!

CN rT co Oc t~ *r CO in tn t- co a

&	4Í- —		·-. <- -		b	*« . 1		. . „ >t)	.0
M	h	>-			u	<ti		Λ	N
	0				0	r4			>
M	N	kj						tn
C	' >	0			' >
>V		N			Jí	o		(U		f-4
Č	tn	>			kl	«Μ		-n		O
0	-H				0	σ*		_ a		<T>
p> ·	Oj				N	lA		&		LA
ií	Q				>	CM		<e	**4	CM
Q)	Q*	M				U.		<0		U.
W						Ix,		M		tu

>*

J >Jť1 w

x xl Q X

X

V) w

J ω

o o

i—t υ

•o o

a ui

CN (0

CM reaguje s běžným epitopen ,

*3 U		Ω Ω
*5 5		*5 *5
2 < *		2 <
κ		α. 2
νο νο		νο «0
< <		< <
υ υ		ο υ

Μ	Μ	Μ
Μ	Μ	>
Cb	0. ·	Cb
Ω	Ω	Ω
X		X
σ	5	«
Μ	W	<
υ	ο	υ
ω	W	u
ω	ω	ω
X	X	X
W	U	ω
Ω	Ω	Ω
k.	U-	t,
Cd	ω	ω
(£	c:	C*
>		>4
Ω	Ω	Ω
>	>	>
«Ω-	_„ω	-W,
Κ	χ	Οί
ο	Ω	Ω
α,	Cb	Cb
	W	Μ
Μ	Η	>
<	<	<
Cb	Cb	Cb
sí	Sí	α:
ο	O	ο
<Λ	w	W

<Λ <

υ ω

ω χ

ω

Ω

b.

<

U >ι

Ω >

. ω. sí Ω Cb £

ί δ

<0

Ν ι—I <β

C

σ)

I

Ο φ

Ή

Ή ♦Η

Μ π3 γ—1 i

φ

-r-| · Γ* «-<

I σ* φ

%£>

ΗΝ ω<υ >Μ '

Ό -ϊ /ά

—ta	—		rf—	χ·— .	w	. w—. ta .	«
fl	XI	fl	XI	α χι α X)	W	fl XJ fl x>	Μ
•Η		<Ν	<Ν	r-( rH (Ν Γ4	Ω	«“t Ή CN CN	1-3
	«ι—	»»*	•w	Mrf —rf —rf.	w	«rf —rf —rf —rf	ω
Ο	Γ-4	<Ν	<*>	Ο Η CS ίή		o ^-1 CN í*»
»—ι	*Ι	•Η	r“t	Η Κ Η rl	o	κ κ Η H	ο
1	1	1	1	1111	o	1111	ο
CN	04	<Ν	CN	ťN CN ÍN CN		CN CN fN CN	rM
Ο	Ο	Ο	Ο	O O O O/	υ	O O O O	Ο
V	ν’	V	V	*7 V V V	Ό	v v· v v	Τ5
α	α	Λ	α	(X Cb 0. Cb	0	cx o, íx a	0
υ	υ	.υ	υ	υ υ u o	tn	υ υ υ o	W

	4J C	C0 Γ” Ή C0	ΓΊ	Γ- V ΓΊ (Ν	rK
V	α	Ο φ CQ Q	CN	<Ν ΓΊ ι/Ί Γ-	V
νο	Φ »Η	....	.	· · ♦	,
X	ο* νο	Ο Ο Ú	Ο	Q Ο ui ν	ο

•8 §

•Η £

U

Μ

C >υ c

Φ >

Λί

Φ ω

ο

Ν >

•Η (X a

η

Φ f—4

Λ e

φ

W

U ο

C ο

Ω ο

π) α

’δ

·□	ΐ	X		rf-
4	0	• CN		X
α	Ν			CN
α.	>	(Ν ι»	0Ί
		ΓΊ	r*	-
r—		ι Α3	, ι	fl
►—τ		Η CN	,Η	ÍN
			C	*r*

.υ

f-1	H	H	H		(-·
H	f-	fci	t4	μ	Ob
J	-5		•J	re	J
>	>	>	>	>	>
O	O	O	O	o	tl
ω <	V) <	to re	(0 re	to re	V) <
2 u	2 o	2 o	2 o	2 υ	2 o
re	K	0£	z	re	re
&	re	re	re	re	CÉ
X	>4	>4	>4	>4	>4
(5	u	O	tl	tl	tl
O	o	o	o	o	o
Z	z	f-	w	to	O
ω	0*	o·	o	σ	re
o	o	tl	tl	o	0
(X	re	re.	re	re	re
to	(ň	w	to	to	to
z	Z	z	z	z	z
H	f-	re	b.	H	b.
►1	•4	x	X	X	X
re	ti.	o.	cu	re	A,
-0-	-0-	-o-	0	-o-	-0-
o	O	tl	O	o	0
>	M	>	>	> ,	u
>4	>.	>4	>4	>4	>*
J	u	J	►J	J	J
(X	a	tx	re	re	re
M	ω	ω	ω	ω	ω
H	h	H'	fí	H	(->
J	u	J	u	J	j
W	to	to	to	to	to
ti	-re		to	£	LO
M	M.	K	M	w	K

§1

Ol °í <1

Ol £

c

N *2

N r—1 §

‘0

I

JJ

H

o.·

Φ c

’8

X

Ή

M-J <c r-*f re a

p-í $

’3 „Š

τ) o

H '> x) c Ch N

8/S· £

>

Γ

O r·

CM

I rtO

CM

ΙΛ

W

Z •3

U íi '0 *Ú

-i

4·^

_

re

B

• S—r

fl5

A

fti

Λ

Λ

ra

10

g

<0 '

A

d

Λ

n

«3

rM '

1—í

CM

rO

CM

n

,w

0

rd

CM

<Ώ

CN

CO

—-

*—

«_»

j

+j

•w

·—^

<—»

%-r

*w>-

Tj

in

to

O>

Γ-

co

w

v

m

Φ

σ»

t-

<8

1

1

I

1

t

1

>

t

1

1

1

1

ÍN

(N

CM

CM

CM

CM

ď)

CN

CM

CN

CM

CM

(N

o

o

o

o

o

o

to

x:

o

o

O

o

o

o

TJ

Ν’

Tj

tj

tj

4j

- z

o

Ν’

tT

Ν'

Tj

TJ

a.

Cu

a.

a

9*

a

í

©

a

re

re

re

re

re

υ

U

u

u

íj

u

>4

υ

υ

0

O

u

υ

B

Cb

ťU

w

>

o

'0

o

c

<D

to

Ή

re

>

M

cn ,

υΊ,„

CM

\0.

/0 „

<0

O

. 0

o

Lfl

CD

m

<*)

M

ΓΊ

Γ*

to

ďj

m

Lfl

n

k

ÍM

’Ό

CN

o

Tř

'TJ

n

ΤΓ

V

n

n

o

tj

CU

rH

T*Í

CM

o

<

to _3 ω

in to

Ό-u •P

Cb

Ůí §

d1		'0	co
Φ	3	3í
		U	— n
	M	-H
Ή C >0	8 >	C	co t-4 £ O <N 1 —
1	m *H	s	TJ CO
	84
U)	Si	K4	r-4 ' --4*

JL.,

M

C >0 j . ,

0) -<

_m m ~ σ> m ífl in p IJ ru — o ř•H k 4J

U IN * I •H a

o

§ tí

C '0 <—I .ω.

•rl £

N s

Tabulka 9 Seraklasifikační epitopová analýza různých HCV typů í

0) •3

Ν X ^•P ό υ .

•rl '>

a n

8,-3

ΓΟ o

<N n

rV)

CN

ΙΛ <Zl ω

Ol υ

-rj

4J a

o

Em

ti	H	H	P	P	P
H	H	P	P	P	X
J	►4	p	p	X	P
>	>	£	ί-	>	£
O	O	o	ο	C5	u
b)	« 5	w	w <	W •C	V) *c
x a	X υ	S υ	2 υ	2 u	2 u
CC	cc	oc	X	X	X
PC	x	X	X	X	X
>1	>1	X	X	X	X
C5	O	o	15	u	15
o	o	υ	O	υ	□
2	2	P	W	b)	a
w	σ	Ol	σ	Ol
o	u	o	o	o	o
X		X	X	X	X
w	w	w	to	b)	w
2	2	2	2	2	2
H	η	X	X	P	X
	j	2	X	X	X
cu	cu	cu	X	X	X
O	O	15	o	O	o
O“	u	O	Ό	'15	(5
>	W	>	>	>	O
X	X	X	X	X	X
J	4	4	J	4	4
e	x	pc	X	X	X
u	ω	ω	ω	w	[4
t»		P	P	P	P
j	•4	4	4	,4	4
b)	«	W	tn	bi	(Λ
xí	OC	X	w	»v	«
M	K	►u	M		n

Ul

Λ

U5 u

N >

Μ V ^υ

V)

<

4J

_

<

rO

4

4

X

Xi

4

w

4

XI

4

X3

Xi

4

to

1—<

r—1

CN

n

CN

ro

M

,A

r-<

r-1

CN

m

(N

w

v*

•M*

sr

—*

vx

4

*^·

4

tn |

σ*

r-

to

ω

>

IA

Φ

σ\

r-

ω

ω

cs

CN

CN

CN

CN

CN

in

<N

CN

Λ

CN

CN

CN

tn

o

o

o

o

o

o

w

£

o

o

o

o

o

o

w

*7

*7

<7

2

2

v

*7

v

-7

2

X

X

X

X

X

X

1

X

X

X

X

X

X.

1

u

u

L>

υ

o

a

u -

i

u

u

υ

u

u

(J

Ul

XJ *rí

a

G)

> 'ja

-

c rS

Φ .£

Γ-

rH

CN

LĎ

co

00

ω

P

o

in

CN

tH

Ch

o

*7

o

O

in

lA

<7

ÁĎ

w a

to

lA

Γ*

tů

m

·—1

o

o

Í*I

í~l

CN

m

o

o

lA

				'rl
		i		tí >0
s				tí
q		'flj
r|		ií	Φ	>
EP		υ	Ά	ύί
0	q	•r|	P>	(U
Ρ	ϋ	tí	co	tn
		p	iH		Γ*
'rl tí	0 N	h	O	3	CN Γ-*
>u	>	υ	v	o	kO
Sí	t A		co	•H	σ*.

•H £

a	JQ			XI * ΓΊ
0			ρ ®	Ό
-Ρ	«α		Ρ m	»
'Η			’λ **	ιβ
Q.			Íi	>1 <Ν
(D			OJ I	(-3 —
•	<0 2	—	Ν ® £ΐ0	> Η
Ν	( α.	ÍU| _	ω
S	Γ-	Κ *1
5	Φ 0 -* CL			ο Cu

θ'«ία < οΙ< 2 3 3 Η ΜΙ «I α ΐί|« ΟΟ Ο ΗΜω Cu ΜΙ ΜΙ I I 1 Xi Χ3 r-l (Μ

<d Λ

W (JI Η H • ω ι i &Φ > > fr-* υ υ c* —χ χ ·-· ic· - ---— Ljj-· » - .. ....

>.

Ή

Gi υ

- Φ χ.

• ··—z*

.. N — > C G ΙΛ >

O O η x -I Jí Τ' H φ'Η t “?S

-o· d cn M I-I cMl >

X z

o

..z £. —-Οί

Ο (30 <1J! 2, , > > > 2 η| «Μ > ·ΜΜ>|0.

CU ·, tf I Οι CU U cu α, α. J d wi>IO(M tf θ' > >, 5μ Ol Cul

Q O Ol tf 1 Cul

O. CU Cu t*. ů.

o_n:

? *-í n t Γ4 « Λ, &S:

r? (j

Λ

CJ

C

Cl c x> α

CN ťN r-| r-l

I I I > > > υ o υ

X X X x *> “ '· V* Π| * c Q O 4J σι >U'H (*N cnOjCM z o <D i > cc j ro o

N co cu ΙΛ G <N GC M O <n < ζϋ 2 «3 n

I >

O

X

I f->

XI <N

I >

υ

X

I

H š S o e cc ÍH O o υ cc tí.

>< o § ol

O 0 Ml Ml

-jfl ís •H r&Λ) Φ i • ri N iC M O cn X ω fV <fl Λ Xl r* ·—, n Ί l i > > > o υ υ

XXX ΐ

Η

J >

Ο

Μ :š— υ κ χ > ο Ο ζ ω ο α χ:ι s:i

Οί ί ’ι< 5

η < a

a.a a. a a a o

>

Η a

α o

a

I a

φ t

•γΊ

U-) *d a

Ifí >o

I

			<t
			r“J	<*““··
β	X (0	XI	v	(0 X Π3 Xl
rH	OJ	<N	< .	r-f rl Ol OJ
v—*			tn
O	rH.OJ	ΓΊ	H	O Η οι n
O	O o	O	X	O O O O
l	1 1	1	w	1 t 1 1
OJ	O) Ol	OJ	tn	Ol OJ Ol OJ
O	0.0	o	tn	o o o č>
-y	’Γ XT	o·	A.	<j“^T —
a	a a	a	1	a a a a
υ	u u	0	u.	υ υ υ υ

-NS5ELISA(la)

σ*	r·	\0	r~	’Γ	τΗ	Γ”	σ	Μ	f\J
ιη	tn	rd	Γ4	VD		’Γ	ο		’Γ
»	·	«	' *	•	4	i	4	•	•
	rH		ο	ιη	ΟΙ	ο	ιη	Ο	Ο

		ιυ PJ
ίθ	..-. 1 -Λ Λί ,- rtrt^t rt	CO
Μ	r*
V-'		Γ-
Ο		rH
ο		Ο
<0		1
		’Γ
ο		C0
__
ιΗ		ΓΜ

ka 13 Seroklasifikační epitopová analýza různých typů HCV sekvencí /1/ chronické HANBU od plac. dárců sek.regio: NS5 /2261-2313/ í rl

I <

ω g .

jj o, a

η a ±j λ;

cj

M

N :>

x a čí ta ua uc 5 2 3 E-* v) tn ω ca cu > J J J J j

CU CU CU > CU Oj CU Oj

E-i ca

H □

Ζ2ΖΖ > > > > Q Q Q Q CU CU CU CU o: pí os κ < < < < 5 2 2 2 > H < CU CU CU < < < o< o. cu < CU Cl, Ca Cn Cu cu cu hJ <

Cb cu

Ca

ro Λ πγχϊ		«5 U	ns	X3
Η Η N Cl		Η H	ni	OJ
*—'	w	a™*
O H « D	Hl	... r O Ή.		.n
Ό o o' O	J	O o	O	O
liti	ta	1 1	1	r
m ni cm <m	in	OJ OJ	<N	OJ
o O o o	M	o o	O	O
f 1? v v	Z		rr
CU CU CU Q.	1	cu cu cu	a
0 U U U	S-i	υ υ	0	υ
ω σι o r-	to	rr CO	OJ	o
Μ n rl U	r>		tn	ΓΊ
....		v 1 ·	4	•
r- Ό o o	to	to rr	tn	tn

tn

O <

Z <0

IN

Ή

O m

OJ

Um

Um oj

netypově specifické /konzervované/ epitopy

I

	y—. .-. ._-	<—« »*-*,
	<fl XI <0 Xi	<0 XI
	tH «-( N ΓΊ	τ-ť *U
υ o c ο	<3 O O O	o 0		O
X X < _)	X X rf J *	X X		rf
5 £ Η	·££££*	H -		> Η
Ο-i CU *£ Oj	X CU rf CU	X X
CU Ο4 CU CU	{X Cu cu cu	X X		cu
w> ow	ω > σ w *	M >		θ'
ín >1 > >	>1 >< >1 >	>< >		>
O Q Q U	0 Q 0 0 *	Q O		Ci
X X X X	CU PU pu tu	X X		CU

XI <2

Kl β, *

Ο Οι tn rf Η

Seroklasif: chronické !	3 4J
*ř	O
Μ	M

	$	<0
Z1-	•H	. tH	••v ·—> *'«.Á..·
0 o (tru	Ή	ClirúX!'—	® Λ e í ^-
Η H TJ OJ ,	rl <	Η ιΗ N N rf	H i-l N CO
·'	δ w	-_- 'JI	. — '
O ι-l OJ O	QjH	0 H (N n w	0 h oj n
OOOO	m,xs	0 0 0 0 J	OOOO
lili	ω	I1IIU	lili
OJ N N N		N N N N ΙΠ	Ol OJ OJ OJ
OOOO	ň ω	0 0 0 O W	OOOO
-τ -τ ίτ -τ	X2	nr -ř -τ 'í· 2	T
0, o, x x,	£ 1	X X X X 1	X X X X
-O -U -.U- U T		- ...... ...0.. .0. .0.0 L	O 0 0 0
co σ o r-	Φ	O η Φ c3 Φ	co σ t \a
cm ιη η τ?	,. „ n	co τ m in co	\D O O O
· « *	•	·····# * · · *	• » * · .·
		. . r- ma ou	O 0- ΙΛ O

σ>

ο

-NS5 ELISA

X!

* I <5 ν

α l

C

Ν >

ιη

U

C <0 \Ο ιη

L·

Σ

Ν' 41 d

CM

Λ

-Q

CM

SQHLPY CHIEN-101 NS4 Region 1712-1717

ASRAAL CHIEN-102 | 1712-1717

f*	CM	r>	n	CO	co
*-<	r*	rM		CQ	co
c*	σ·	n	Π	Cl	CM
rH	♦H	CM	CM	CM	CM
I	|	1	1	1	|	CD	m
CM	ω	*7	xr	w-<	«Η	P*	c-
	0\	O	O	co	CO	1	»
r*	ID	n		CM	CM	i-M	rM
tH	W	Cl	CM	CM	CM	C*	Γ

.0 p

O O K	VO vfl rvn
	β) o
ld	U Μ
w	0 0
Z	o o

rUTlfilDrOJCTlO OOOOOOO—l lili zzzxzxxz UUUMUUMU hhhhhmhh xxxxxxxx u o υ-o u u-o u o

X *5

U J & < > a.

SU X Λ >1 w o o < a. o.

Ό > a tu ac α H > fL O < <£LjS 3 0. J rf W W Oí o*« K >i CXB- O U q < a. η m

CL U. Ul W w

.........o

ΗΙΝΓι^ΛΟΓΌσΉ

Příklad 6

Byly provedeny imunozkoušky pro stanovení, které peptidy by mohly vzájemně soutěžit v navázání k protilátkám. Byly syntetizovány tři sady krátkých polypeptidu z jaderných NS4 a NS5 regionů různých typů HCV sekvencí. Tyto polypeptidy pokrývají sekvenční regiony od aminokyselin 1689-1695, 1696-1702 a 1711-

1917. Inhibiční zkoušky byly provedeny přídavkem 10 výše uvedených polypeptidů ke vzorku a inkubovány pí i 37 °C po jednu hodinu a pak byly'provedeny ELISA zkoušky jak popsáno výše. Jestliže byla nalezena inhibice více než 50 % protilátkové vazby polypeptid byl považován na inhibiční. Získané výsledky jsou uvedeny v následující tabulce 15.

c o

•rd ff

P m

§

P

Ό '(C n

Sb •rf

Q.

5r t4. n

.. 0)

jJ

<0 *n

-Q CJ
	·»
	tf
	rs
	*.			-Q -Q
	J2		ω	rd Cí
	rd		·—i	%. *»
**	>.		r>	<0 tf
Ί7	<0		rd	h rs
co	rd		1
1	*-*		Ct
P*			co	><
tf	O,		tf	μ) W
	s		rd	>
	Ol	*7		ω
	>			X X
	o			o
	cu	fr,		X

	oa o
	tf tí tf		Sh !m J
	ΪΪ3		X X tf
	H W tO		J J tf
	XXX		χ χ 5
	o o o		σ w to
	ω Η ω		<0 tf <
	Okr tf tf		υ υ υ
		co
	X) -Q v	rd	ů
	*-< rs	r·	rs
*7	u	rd
03	<£ 4 o
1		cn
P'	AAA	o	A JO A
10	»-( ct n	tf	fH rd f\t
*—'	1 1 1	H	1 1 1
	> > >		> > >
	u υ u		υ υ υ
	«El		X.X X

tn 'í i

in •rl

•ΓΊ íw >

tí o — > rl Í-Μ I o o u tí X u —

Ct θ' O Ct X α «

X X 2 U í- tJ

	o X X ω >< O X	Z)	o o ££ Η H tf X X X 0>ω >t > Q tí X X	FAQALPVW
rd
m	J0
rs |	rd
1 rd
CO
CS	tf		A JZ	A
CS	rd		cs rs	rd
u>	l		l i	í
	>		> >	>
	u		υ υ	υ
	X		χ χ	X

tf		^7
n		cn
fft		rs
rd t		rs
1 in		1 co
rs	rd	C0
cn	J	CS
rd	υ	rs
	χ

c 0 —d	> > X	c 0 **d
D* Φ	o.	σ» φ	2
oc	w >	Pí	>< O
^7 to	X z	tf tf	0, oc
2	o PC	z	5

M

X ►J tf

O

X

Cm x

Λ

CJ tj

A d

ύ •H

I >

o

X tf X | rO r· ct

I ro

ΓΙΟ ct

A n

i >U

X

I

I

H

Cm «

J >

O to s

u

X

X >.

tí

O o

tf o

KGQSCGYRRCRASGVFTT-HCV-2b

- ... fljft fH •J >

O

V)

Ž υ

x

X >

u u

u o

X

Λ JO <-i n

I >

u

X

SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

T v <27Ζ7 - 75

Claims (15)

1. Způsob klasifikace hepatitis C viru, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

a) poskytnutí biologického vzorku, _ _ _______

b) kontakt vzorku s prvním Činidlem, obsahujícím alespoň jeden epitop vybraný ze skupiny, zahrnující první typově specifický epitop specifický pro první typ hepatitis C viru a první typově-klastrově specifický epitop specifický pro první typ klášter hepatitis C viru za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu první epitopprotilátka a

c) vyhodnocení na přítomnost komplexu první epitopprotilátka.ve vzorku.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačující se tím, že dále zahrnuje stupně ...

d) kontaktu vzorku se druhým činidlem, obsahujícím druhý epitop vybraný ze skupiny, zahrnující druhý typově specifický epitop specifický pro druhý typ viru hepatitis C a druhý typově-klastrově specifický epitop specifický pro druhý typ klastr hepatitis C viru za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu druhý epitopprotilátka a

e) vyhodnocení na přítomnost komplexu druhý epitopprotilátka ve vzorku.

3. „Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující s e t í m, že vyhodnocení se provede kompetitičnízkouškou, sendvičovou zkouškou, imunofluorescenční

-4Í>zkouškou, radiomunozkouškou nebo zkouškou enzym-navázaný imunosorbent.

4. Způsob podle nároku 1,2 nebo 3, vyznačující se tím, že se získá alespoň jeden epitop typově specifického epitopů nebo typověklastrového epitopů z regionu jádra hepatitis Cviru, regionu, hepatitis C nestruktuxálního 4 regionu nebo * hepatitis C nestrukturálního regionu 5.

5. Způsobrpodle nároku 4, vyznačuj íc í- se t í m,že alespoň jeden epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84,

1689 a 1718 nebo 2281 a.2313 hepatitis C viru 1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.

6. Způsob klasifikace hepatitis C viru, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

a) poskytnutí biologického vzorku,

b) kontakt vzorku s prvním činidlem, obsahujícím alespoň jednu protilátku specifickou pro první epitop vybraný ze “'skupiny,.zahinuj'ícá ·první-typově ^:speci-fický epitop --specifický pro první typ hepatitis C viru a prvnítypově-klastiově specifický epitop specifický pro první . ey^klasYer' h^^'Fii?i'š~čvrřiŤza” podmíneký-^ťěf é-umč'ž'ňu'j-í- tvorbu komplexu první epitop-protilátka a

-cl· vyhodnocení na přítomnost .komplexu první,epitop- _.....

protilátka, ve vzorku;

7 . Způsob podle nároku 6, vyznačuj íc í

_.s.e... -t- í m.,, Že.. dále. zahrnuje, stupně ..... * * _ ; _; _

d) kontaktu vzorku se druhým činidlem, obsahujícím protilátku specifickou pro druhý epitop vybraný ze skupiny, zahrnující druhý typově specifický epitop

-47specifický pro druhý typ viru hepatitis C a druhý typově-klaštrově specifický epitop specifický pro druhý tap klastr hepatitis C viru za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu druhý epitopprotilátka a

e) vyhodnocení na přítomnost komplexu druhý epitopprotilátka ve vzorku.

8. Způsob podle nároku 6 nebo 7, vyznačuj íc í se tím, že vyhodnocení se provede kompetitiční zkouškou, sendvičovou zkouškou, imunofluorescertční zkouškou, radiomunozkouškou nebo zkouškou enzym-navázaný imunosorbent. . · '

9. Způsob podle nároku 6,7 nebo 8,.

vyznačující se tím, že se získá první epitop je typově specifický epitop nebo typově-klaštrově specifický epitop získaný z regionu jádra hepatitis C .viru, regionu, hepatitis. C nestrukturálního 4 regionu .. . nebo hepatitis C nestrukturálního regionu 5.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím,že první epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84, 1689 a 1718 nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru 1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru.

11. Polypeptid, mající aminokyselinové sekvence odpovídající typově specifickému epitopu nebo typově klaštrově specifickému epitopu hepatitis C viru.

12. Polypeptid podle nároku 11, kde první epitop je typově specifický epitop nebo typově-klaštrově specifický epitop získaný z regionu jádra,

-48nestrukturálního regionu 4 nebo nestrukturálního jádra regionu 5 hepatitis C viru.

%

13. Polypeptid podle nároku 12, kde první epitop je umístěn mezi aminokyselinovými zbytky 67 a 84, 1689 a ’

1718 nebo 2281 a 2313 hepatitis C viru-1 nebo homologními regiony jiných typů hepatitis C viru_Λ______________

14. Molekula nukleové kyseliny, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující genom viru hepatitis C, odpovídající aminokyselinovému zbytku sekvence typově specifického epitopi nebo typově klastrově' specifického epitopů získaného z. hepatitis C viru.

15. Molekula nukleové kyseliny podle nároku 14, kde epitop je získán z jádrového regionu viru hepatitis; C, nestrukturálního regionu 4 viru hepatitis C nebo * nestrukturálního regionu 5 viru hepatitis C.