ES2232815T3 - Procedimientos para el tipaje de virus de la hepatitis c y reactivos para su uso en los mismos. - Google Patents
Procedimientos para el tipaje de virus de la hepatitis c y reactivos para su uso en los mismos.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION PROPORCIONA METODOS Y COMPOSICIONES PARA SU UTILIZACION EN EL METODO QUE TIPIFICAN LOS VIRUS DE LA HEPATITIS C.
Description
Procedimientos para el tipaje de virus de la
hepatitis c y reactivos para su uso en los mismos
La presente invención se refiere al tipaje de
virus de la hepatitis C (VHC). En particular, esta invención se
refiere a un procedimiento para el tipaje de VHC usando péptidos
novedosos dependientes del tipo.
Se sabe que las hepatitis virales están causadas
por cinco virus diferentes conocidos como hepatitis A, B, C, D y E.
El VHA es un virus ARN y no da lugar a síntomas clínicos a largo
plazo. El VHB es un virus ADN. El VHD es un virus dependiente que es
incapaz de infectar células en ausencia de VHB. El VHE es un virus
que se transmite por el agua. El VHC se identificó y caracterizó
primero como una causa de hepatitis no-A
no-B (HNANB). Houghton y col., EPO Pub. número
388.232. Esto llevó a la descripción de una serie de polipéptidos
generales y específicos útiles como reactivos inmunológicos para
identificar el VHC. Véase, por ejemplo, Choo y col. (1989) Science,
244:359-362; Kuo y col. (1989) Science,
244:362-364; y Houghton y col. (1991) Hepatology,
14:381-388. El VHC es la causa principal de
hepatitis relacionadas con transfusiones de sangre.
El aislado prototipo del VHC se caracterizó en la
Publicación de las Patentes Europeas Número 318.216 y 388.232. Tal
como se usa en este documento, el término "VHC" incluye
especies virales de HNANB aisladas recientemente. El término
"VHC-1" hace referencia al virus descrito en
las publicaciones anteriormente mencionadas.
Desde la identificación inicial del VHC, se han
identificado al menos seis tipos de virus diferentes y se han
nombrado VHC-1 a VHC-6. Cha y col.
(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:7144-7148.
Dentro de estos tipos hay numerosos subtipos. El tipo de virus que
infecta a un paciente puede afectar al pronóstico clínico y también
a la respuesta a distintos tratamientos. Yoshioka y col. (1992)
Hepatology, 16:293-299. En vista de que la
consecuencia clínica más seria de la infección por VHC es el
carcinoma hepatocelular, sería útil ser capaces de determinar con
qué tipo o tipos de VHC está infectado un paciente.
El procedimiento que se encuentra en la
actualidad en uso para determinar el tipo de virus es el genotipaje;
esto es, el aislamiento de ARN viral y la determinación de la
secuencia de varios segmentos por reacción en cadena de la
polimerasa (PCR). Este procedimiento no solamente es laborioso y
consume tiempo sino que además no es adecuado para su uso en
muestras que han sido almacenadas en condiciones que no permiten la
conservación del ARN o muestras procedentes de pacientes que no
tienen un título de virus suficientemente elevado. Sería útil tener
un procedimiento para el tipaje de VHC por inmunoanálisis o
serotipaje.
El procedimiento actual para el cribado de la
sangre y el diagnóstico de pacientes es un inmunoensayo. El
inmunoensayo utiliza un antígeno de VHC-1 que
contiene un número suficiente de epítopos comunes para la detección
de anticuerpos frente a otros tiposde VHC. El inmunoensayo no
distingue entre infecciones por distintos tipos de
VHC.
VHC.
El documento WO94/25602 describe secuencias
únicas específicas de tipo en las regiones NS4, NS5 y del núcleo de
los tipos de VHC 4, 5 y 6 así como un ensayo de competición
peptídico para el tipaje de cepas de VHC, basado en un epítopo
hallado en la región NS4 del genoma del VHC.
El documento EP 388 232 describe epítopos
concretos de las regiones del núcleo, NS4 y NS5 del genoma del VHC
así como un inmunoensayo que emplea epítopos de los mismos o
diferentes péptidos. Sin embargo, en este documento no se aprecia
cual de los epítopos podría ser específico de tipo.
La presente invención incluye composiciones y
procedimientos para el tipaje de VHC por genotipaje y serotipaje.
Las composiciones incluyen epítopos específicos de tipo.
Un aspecto de la invención es un procedimiento
para el tipaje de un virus de la hepatitis C que comprende las
etapas de:
- a)
- aporte de una muestra biológica;
- b)
- puesta en contacto de la muestra con un primer reactivo que comprende una combinación de polipéptidos que contienen epítopos específicos de tipo, específicos de un primer tipo de virus de la hepatitis C, en condiciones que permitan la formación de unos primeros complejos epítopo-anticuerpo; y
- c)
- ensayo para la presencia de estos primeros complejos epítopo-anticuerpo en la muestra,
en el que dichos epítopos se
seleccionan a partir de epítopos localizados entre los residuos de
aminoácidos 67 y 84, 1689 y 1718, y 2281 y 2313 del
VHC-1 o regiones homólogas de otros tipos de virus
de la hepatitis C y dichos polipéptidos tienen una longitud entre 8
y 10
aminoácidos.
El procedimiento puede comprender además las
etapas de
- d)
- puesta en contacto de la muestra con un segundo reactivo que comprende un epítopo más, específico de tipo, específico de un segundo tipo de virus de la hepatitis C, en condiciones que permitan la formación de un segundo complejo epítopo-anticuerpo; y
- e)
- ensayo para la presencia de un segundo complejo epítopo-anticuerpo en la muestra.
En particular, los epítopos se seleccionan de
entre las secuencias de aminoácidos PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ,
FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG
y PDYRPPVVHG.
Otro aspecto de la invención se refiere a un
procedimiento para el tipaje de un virus de la hepatitis C que
comprende las etapas a) a c) tal como se han identificado más
arriba, en el que los epítopos se seleccionan de entre las
secuencias de aminoácidos CSQHLPY, CASHLPY, CASRAAL, CASKAAL,
SQLHPY, ASRAAL y ASKAAL.
Otro aspecto más de la invención proporciona un
procedimiento para el tipaje de virus de la hepatitis C que
comprende las etapas de:
- a)
- aporte de una muestra biológica;
- b)
- puesta en contacto de la muestra con una combinación de anticuerpos específicos de un primer epítopo, tal como se ha definido más arriba, en condiciones que permitan la formación de complejos epítopo-anticuerpo; y
- c)
- ensayo para la presencia de complejos epítopo-anticuerpo en la muestra.
El procedimiento puede comprender además las
etapas de:
- d)
- puesta en contacto de la muestra con un segundo reactivo que comprende una combinación de anticuerpos específicos de un segundo epítopo, tal como se ha definido más arriba, en condiciones que permitan la formación de complejos epítopo-anticuerpo; y
- e)
- ensayo para la presencia de estos segundos complejos epítopo-anticuerpo en la muestra.
Otro aspecto de la invención se refiere al
agrupamiento de polipéptidos o reactivos polipeptídicos que
contienen combinaciones de epítopos específicos de tipo y/o epítopos
específicos de una serie de tipos. Los polipéptidos proceden de tres
regiones diferentes del genoma del VHC. Un grupo de polipéptidos
incluye un epítopo específico de tipo o epítopos específicos de una
serie de tipos obtenidos a partir de la región del núcleo de VHC.
Esta primera serie se halla entre los residuos de aminoácidos
sesenta y siete y ochenta y cuatro del VHC-1 y
regiones homólogas de otros tipos de VHC. Tal como se usan en este
documento, las abreviaturas de los residuos de aminoácidos son las
siguientes: A, alanina; I, isoleucina; L, leucina; M, metionina; F,
fenilalanina; P, prolina; W, triptófano; V, valina; N, asparagina;
C, cisteína; Q, glutamina; G, glicina; S, serina; T, treonina; Y,
tirosina; R, arginina; H, histidina; K, lisina; D, ácido aspártico;
y E, ácido glutámico.
Las secuencias concretas de aminoácidos derivadas
de la región del núcleo y los subtipos de los que derivan son los
siguientes:
1. PEGRTWAQ, subtipo 1a o 1b.
2. STGKSWGK, subtipo 2a o 2b.
3. SEGRSWAQ, subtipo 3a o 4.
Otro grupo de polipéptidos incluye un epítopo
específico de tipo obtenido de la región no estructural 4 (NS4) del
VHC. Este segundo grupo se halla entre los residuos de aminoácidos
1689-1718 del VHC-1 y las regiones
homólogas de otros tipos de VHC.
Las secuencias concretas de aminoácidos y los
tipos o subtipos de los que derivan son los siguientes:
1. CSQHLPY, subtipo 1a.
2. CASHLPY, subtipo 1b.
3. CASRAAL, subtipo 2a o 2b.
Otro grupo de polipéptidos incluye un epítopo
específico de tipo o epítopos específicos de una serie de tipos
obtenidos a partir de la región no estructural 5 (NS5) de un virus
de la hepatitis C. Este grupo se halla entre los residuos de
aminoácidos 2281-2313 de VHC-1 y las
regiones homólogas de otros tipos de virus de la hepatitis C.
Las secuencias concretas de aminoácidos y los
tipos o subtipos de los que derivan son los siguientes:
1. PDYEPPVVHG, subtipo 1a.
2. PDYVPPVVHG, subtipo 1b.
3. PDYQPATVAG, subtipo 2a.
4. PGYEPPTVLG, subtipo 2b.
5. FAQASPVW, subtipo 1a.
6. FPPQALPTW, subtipo 1b.
7. FPQALPAW, subtipo 2a.
8. FPPQALPPW, subtipo 2b.
La figura 1 es un diagrama de flujo de la
estrategia experimental del serotipaje.
La figura 2 es un diagrama de flujo de la
estrategia del mapeo exhaustivo de epítopos.
La figura 3 es una recopilación de gráficos que
representan los resultados del mapeo de epítopos del VHC 1a
(Rodney).
La figura 4 es una recopilación de gráficos que
representan los resultados del mapeo de epítopos del VHC 2b
(Nomoto).
"Virus de la hepatitis C" o "VHC" hace
referencia a las especies virales de las cuales los tipos
patogénicos ocasionan HNANB, y a los tipos atenuados o partículas
defectuosas causantes de interferencia derivadas de las mismas.
Véanse en general, las publicaciones citadas en la sección titulada
"Antecedentes". El genoma del VHC se compone de ARN. Los virus
que contienen ARN tienen tasas relativamente elevadas de mutación
espontánea, según se dice del orden de 10^{-3} a
^{10-4} por nucleótido incorporado. Fields y Knipe
(1986) "Fundamental Virology" (Raven Press, NY). Puesto que la
heterogeneidad y la fluidez del genotipo son inherentes a los virus
ARN, existen múltiples tipos/subtipos entre las especies de VHC, que
pueden ser virulentos o no. La propagación, identificación,
detección y aislamiento de distintos tipos o aislados del VHC están
documentados en la literatura. Tal como se representan en este
documento, todas las secuencias de nucleótidos y de residuos de
aminoácidos pertenecen a los tipos de VHC mencionados. El número de
genomas y de las secuencias de residuos de aminoácidos del
VHC-1 y de residuos de aminoácidos es tal como lo
describieron Choo y col. (1990) Brit. Med. Bull.,
46:423-441. La descripción en este documento permite
el diagnóstico de los distintos tipos.
Tal como se usa en este documento, "tipo"
hace referencia a VHC que difieren genotípicamente en más de
aproximadamente el 30%; "subtipo" hace referencia a VHC que
difieren genotípicamente en aproximadamente el
10-20% y "aislado" hace referencia a VHC que
difieren genotípicamente en aproximadamente menos del 10%.
"Tipaje" hace referencia a la distinción entra un tipo de VHC y
otro tipo.
En la publicación internacional número
WO/93/00365 se desvela información acerca de varios tipos/subtipos
diferentes de VHC, especialmente el tipo o subtipo CDC/HCV1 (también
llamado VHC-1). La información acerca de un tipo o
subtipo, como una secuencia parcial genómica o de aminoácidos, es
suficiente para permitir a los expertos en la materia aislar nuevos
tipos de VHC, usando técnicas estándar. Se cribaron, por ejemplo,
varios tipos diferentes de VHC tal como se describe más abajo. Estos
tipos, que se obtuvieron a partir de una serie de sueros humanos (y
procedentes de distintas áreas geográficas), se tiparon usando el
procedimiento y los reactivos descritos en esta
inven-
ción.
ción.
Se ha deducido la estructura genómica y la
secuencia de nucleótidos del ARN genómico del VHC-1.
El genoma se presenta como ARN de cadena simple, que contiene 10.000
nucleótidos. El genoma consta de una cadena en sentido positivo y
posee un marco de lectura abierto (ORF) traduccional que codifica
una poliproteína de aproximadamente 3.000 aminoácidos. En el ORF,
la(s) proteína(s) estructural(es)
aparece(n) codificada(s) aproximadamente en el primer
cuarto de la región amino-terminal, con la mayoría
de la poliproteína responsable de la proteínas no estructurales
(NS). Cuando se compara con todas las secuencias virales conocidas,
se observan homologías colineales pequeñas pero significativas con
las proteínas no estructurales (NS) de la familia flavivirus y con
los pestivirus (que también se consideran ahora parte de la familia
Flavivirus).
En la tabla 1 se presentan los posibles dominios
proteicos de la poliproteína codificada por el VHC, así como los
límites aproximados, basándose en los supuestos residuos de
aminoácidos codificados en la secuencia de nucleótidos del
VHC-1 y otras evidencias.
| Supuesto dominio | Límite aproximado (aminoácidos número) |
| C (proteína de la nucleocápside) | 1-191 |
| E_{1} (proteína de la envoltura del virión) | 192-383 |
| E_{2}/NS1 (envoltura) | 384-800 |
| NS2 (función desconocida) | 800-1050 |
| NS3 (proteasa) | 1050-1650 |
| NS4 (función desconocida) | 1651-2100 |
| NS5 (polimerasa) | 2100-3011 (final) |
Estos dominios no son definitivos. Por ejemplo,
el límite E1-NS2 se encuentra probablemente en la
región 750-810 y el límite NS3-NS4
está aproximadamente en 1640-1650. También hay
evidencias de que la versión de 191 aminoácidos (aa) de C es un
precursor que se procesa más tarde hasta aproximadamente 170 aa de
largo y que las proteínas NS2, NS4 y NS5 se procesan, cada una de
ellas, más tarde para dar dos proteínas maduras.
Se definen distintos tipos de VHC de acuerdo con
diversos criterios como, por ejemplo, un ORF de aproximadamente
9.000 nucleótidos hasta aproximadamente 12.000 nucleótidos, que
codifica una poliproteína similar en tamaño a la del
VHC-1, una proteína de carácter hidrófobo y/o
antigénico similar a la del VHC-1 y la presencia de
secuencias colineales de polipéptidos que se encuentran conservadas
con respecto a VHC-1.
Los siguientes parámetros de homología de ácidos
nucleicos y homología de aminoácidos son aplicables, tanto solos
como en combinación, para la identificación de los tipos de VHC. En
general, tal como se ha descrito más arriba, distintos tipos de VHC
son homólogos aproximadamente en el 70% mientras que los subtipos
son homólogos aproximadamente en un 80-90% y los
aislados son homólogos aproximadamente en el 90%.
Tal como se usa en este documento, un
polinucleótido "derivado de" una secuencia indicada hace
referencia a una secuencia polinucleotídica que se compone de una
secuencia de al menos aproximadamente 6 nucleótidos, preferentemente
al menos aproximadamente 8 nucleótidos, más preferentemente al menos
aproximadamente 10-12 nucleótidos y aún más
preferentemente al menos aproximadamente 15-20
nucleótidos que se corresponde con una región de la secuencia de
nucleótidos indicada. "Correspondientes" significa homólogos a
o complementarios a la secuencia indicada. Preferentemente, la
secuencia de la región de la que deriva el polinucleótido es
homóloga o complementaria a una secuencia que es única en el genoma
de un VHC. Las técnicas de hibridación para determinar la
complementariedad de secuencias de ácidos nucleicos son conocidas en
la materia. Véase, por ejemplo, Maniatis y col. (1982). Además, los
malos emparejamiento de parejas de polinucleótidos formadas por
hibridación se pueden determinar por técnicas conocidas, incluida
por ejemplo, la digestión con una nucleasa como SI que digiere
específicamente áreas de cadena simple en parejas de
polinucleótidos. Las regiones a partir de las que pueden
"derivar" secuencias típicas de ADN incluyen, pero no se
encuentran limitadas a, por ejemplo, regiones que codifican epítopos
específicos de tipo, así como regiones no transcritas y/o no
traducidas.
El polinucleótido derivado no deriva
necesariamente de forma física de la secuencia de nucleótidos
mostrada, sino que puede ser generado de cualquier forma, incluida
por ejemplo, la síntesis química o replicación de ADN o
transcripción inversa o transcripción. Además, las combinaciones de
regiones correspondientes a las de la secuencia indicada se pueden
modificar de una forma conocida en la materia de manera que
concuerde con el uso deseado.
De forma similar, un polipéptido o secuencia de
aminoácidos "derivado de" una secuencia indicada de aminoácidos
o de ácidos nucleicos hace referencia a un polipéptido que tiene una
secuencia de aminoácidos idéntica a la de un polipéptido codificado
por la secuencia, o una porción de la misma, en el que la porción
consiste en al menos 3-5 aminoácidos, y más
preferentemente al menos 8-10 aminoácidos, y aún más
preferentemente al menos 11-15 aminoácidos, o que es
inmunológicamente identificable con un polipéptido codificado por la
secuencia. Esta terminología también incluye un polipéptido
expresado a partir de una secuencia indicada de ácidos
nucleicos.
Un péptido recombinante o derivado no es
necesariamente traducido a partir de una secuencia indicada de
ácidos nucleicos; puede ser generado de cualquier forma, incluida,
por ejemplo, la síntesis química, o la expresión de un sistema de
expresión recombinante, o el aislamiento a partir de VHC, incluido
VHC mutado. Los polipéptidos descritos en este documento son, en
general, relativamente cortos y son, de este modo, más fácilmente
sintetizados química-
mente.
mente.
Un péptido recombinante o derivado puede incluir
uno o más análogos de aminoácidos o aminoácidos no naturales en su
secuencia. Los procedimientos para insertar análogos de aminoácidos
en una secuencia son conocidos en la materia. También puede incluir
uno o más marcajes, que son conocidos por los expertos en la
materia. Una descripción detallada de análogos y "mimotopos" se
encuentra en la Patente de Estados Unidos Número 5.194.392.
Los análogos peptídicos incluyen deleciones,
adiciones, sustituciones o modificaciones de los mismos que
mantienen la capacidad para tipar VHC. Las "sustituciones"
preferidas con las que son conservadoras, es decir, en las que un
residuo se reemplaza por otro del mismo tipo general. Como es bien
sabido, los aminoácidos existentes en la naturaleza se pueden
subclasificar en ácidos, básicos, neutros y polares o neutros y
apolares. Además, tres de los aminoácidos codificados son
aromáticos. Generalmente se prefiere que los péptidos codificados
distintos del epítopo natural contengan codones sustituidos para
aminoácidos que son del mismo grupo que el del aminoácido
reemplazado. De este modo, en general, los aminoácidos básicos Lys,
Arg y His son intercambiables; los aminoácidos ácido aspártico y
glutámico son intercambiables; los aminoácidos neutros polares Ser,
Thr, Cys, Gln y Asn son intercambiables; los aminoácidos alifáticos
apolares Gly, Ala, Ile y Leu son conservadores los unos con respecto
a los otros (por su tamaño Gly y Ala están más estrechamente
relacionados y Val, Ile y Leu están más estrechamente relacionados)
y los aminoácidos aromáticos Phe, Trp y Tyr son intercambiables.
Aunque la prolina es un aminoácido neutro apolar, genera
dificultades debido a su efecto sobre la conformación, y
sustituciones por o de prolina no se prefieren, salvo cuando se
puedan obtener los mismos resultados conformacionales o resultados
similares. Los aminoácidos polares que representan cambios
conservadores incluyen Ser, Thr, Gln, Asn y, en menor medida, Met.
Además, aunque estén clasificados en distintas categorías, Ala, Gly
y Ser parecen ser intercambiables, y Cys encaja también en este
grupo o se puede clasificar con los aminoácidos neutros polares.
Debería observarse además que si los péptidos se
fabrican sintéticamente, también se pueden hacer sustituciones por
aminoácidos que no son codificados por el gen. Los residuos
alternativos incluyen, por ejemplo, los omega aminoácidos de fórmula
H_{2}N(CH_{2})_{n}COOH, en la que n es
2-6. Éstos son aminoácidos neutros, apolares, como
lo son la sarcosina (Sar), t-butil alanina
(t-BuA), t-butil glicina
((t-BuG), N-metil Ile
(N-MeIle) y norleucina (NLe). La fenilglicina puede
sustituir a Trp, Tyr o Phe, un aminoácido neutro aromático; la
citrulina (Cit) y el metionina sulfóxido (MSO) son polares pero
neutros, la ciclohexil alanina (Cha) es neutra y apolar, el ácido
cisteico (Cya) es ácido y la ornitina (Orn) es básica. Las
propiedades que confieren la conformación de los residuos de prolina
se puede mantener si uno o más de éstos se sustituyen por
hidroxiprolina (Hyp).
El término "polinucleótido recombinante" tal
como se usa en este documento está destinado a un polinucleótido de
origen genómico, ADNc, semisintético o sintético que, en virtud de
su origen o manipulación: (1) no está asociado con todo o una
porción de un polinucleótido con el que se encuentra asociado en la
naturaleza, (2) está unido a un polinucleótido que no sea al que se
encuentra unido en la naturaleza o (3) no existe en la
naturaleza.
El término "polinucleótido" tal como se usa
en este documento hace referencia a una forma polimérica de
nucleótidos de cualquier longitud, tanto ribonucleótidos como
desoxirribonucleótidos. Este término solamente hace referencia a la
estructura primaria de la molécula. De este modo, este término
incluye ADN de doble cadena y de cadena simple y ARN. También
incluye tipos conocidos de modificaciones, por ejemplo, marcajes
conocidos en la materia, metilación, "caps", sustitución de uno
o más nucleótidos existentes en la naturaleza por un análogo,
modificaciones internucleótidos como, por ejemplo, aquellos con
enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres,
fosforamidatos, carbamatos, etc.) y con enlaces con carga (por
ejemplo, fosforotioatos, fosforoditioatos, etc), aquellos que
contienen radicales sueltos, como, por ejemplo, proteínas que
incluyen, pero no se encuentran limitadas a, nucleasas, toxinas,
anticuerpos, péptidos señal y
poli-L-lisina; aquellos con
intercalantes (por ejemplo, acridina, psoraleno, ect.), aquellos que
contienen quelantes (por ejemplo, metales, metales radioactivos,
boro, metales oxidantes, etc.), aquellos que contienen alquilantes,
aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa
anoméricos, etc.), así como formas no modificadas del
polinucleótido. Los polinucleótidos descritos en este documento son
relativamente cortos y son, de este modo, más fácilmente
sintetizables químicamente.
Un polipéptido "purificado" hace referencia
a un polipéptido que se encuentra en un estado en que está
sustancialmente libre de otros polipéptidos, es decir, en una
composición que contiene un mínimo de aproximadamente el 50% en peso
(polipéptido deseado/ polipéptido total en la composición),
preferentemente un mínimo de aproximadamente el 70% y aún más
preferentemente un mínimo de aproximadamente el 90% del polipéptido
deseado, sin tener en cuenta los materiales no proteináceos de la
composición. Las técnicas para la purificación de polipéptidos
virales son conocidas en la materia. Los anticuerpos purificados se
definen, en la materia, de forma similar.
Tal como se usa en este documento, "epítopo"
hace referencia a un determinante antigénico de un polipéptido. Un
epítopo podría comprender 3 o más aminoácidos que definan el sitio
de unión de un anticuerpo. Generalmente, un epítopo se compone de al
menos 5 aminoácidos y, a veces, se compone de al menos 8
aminoácidos. Los procedimientos para el mapeo de epítopos son
conocidos en la materia.
Tal como se usa en este documento, "epítopo
específico de tipo" hace referencia a un epítopo que se encuentra
en un tipo de VHC. Un "epítopo específico de una serie de
tipos" se encuentra en más de uno, pero menos que en todos los
tipos de VHC. Por ejemplo, un epítopo concreto puede ser reconocido
por anticuerpos procedentes de un paciente infectado con
VHC-1 pero no ser reconocido o ser reconocido de
forma menos eficiente por anticuerpos procedentes de un paciente
infectado con VHC 2. De forma similar, un epítopo específico de una
serie de tipos, derivado de VHC-3 puede ser
reconocido por anticuerpos procedentes de un paciente infectado con
VHC-3 o VHC-4 pero no por
anticuerpos procedentes de un paciente infectado con
VHC-1 o VHC-2. Los "epítopos
conservados" son aquellos que son reconocidos por anticuerpos
específicos para todos los tipos de VHC.
Un polipéptido es "reactivo
inmunológicamente" con un anticuerpo que se une al péptido debido
al reconocimiento por parte del anticuerpo de un epítopo específico
contenido en el interior del polipéptido. La reactividad
inmunológica se puede determinar por la unión de anticuerpos, más
especialmente por las cinéticas de unión de anticuerpos y/o por
competición por la unión usando como competidores polipéptidos
conocidos que contienen un epítopo frente al cual está dirigido el
anticuerpo. Las técnicas para determinar si un péptido es reactivo
inmunológicamente con un anticuerpo son conocidas en la materia.
Tal como se usa en este documento, el término
"anticuerpo" hace referencia a un polipéptido o grupo de
polipéptidos que consisten en al menos un sitio de combinación de un
anticuerpo. Un "sitio de combinación de una anticuerpo" o
"dominio de unión" está formado a partir del pliegue de
dominios variables de una(s) molécula(s) de anticuerpo
para formar espacios de unión tridimensionales, con una forma de la
superficie interna y una distribución de carga complementarias a las
características del epítopo de un antígeno, que permiten la reacción
inmunológica con el antígeno. Un sitio de combinación de un
anticuerpo se puede formar a partir de una dominio de cadena pesada
y/o ligera (V_{H} y V_{L}, respectivamente), que forman bucles
hipervariables que contribuyen a la unión del antígeno. El término
"anticuerpo" incluye, por ejemplo, anticuerpos de vertebrados,
anticuerpos híbridos, anticuerpos quimera, anticuerpos alterados,
anticuerpos univalentes, las proteínas Fab y anticuerpos con un
único dominio.
Los anticuerpos específicos de polipéptidos y los
polipéptidos se pueden generar por cualquiera de los procedimientos
conocidos en la materia. Por ejemplo, los polipéptidos se
resuspenden, en general, en un tampón fisiológicamente aceptable,
mezclados con un adyuvante adecuado y se inyectan en un animal. Los
procedimientos para generar anticuerpos policlonales y monoclonales
son conocidos en la materia y no se describirán con detalle en este
documento.
El término "polipéptido" hace referencia a
un polímero de aminoácidos y no hace referencia a una longitud
específica del producto; de este modo, polipéptidos, oligopéptidos y
proteínas se incluyen dentro de la definición de polipéptido. Por
otro lado, este término no hace referencia o excluye las
modificaciones post-expresión del polipéptido como,
por ejemplo, glicosilación, acetilación, fosforilación y similares.
Se encuentran incluidos en la definición, por ejemplo, polipéptidos
que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluidos, por
ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), polipéptidos con enlaces
sustituidos, así como otras modificaciones conocidas en la materia,
tanto existentes en la naturaleza como inexistentes en la misma.
"Tratamiento", tal como se usa en este
documento, hace referencia a la profilaxis y/o terapia.
Un "individuo", tal como se usa en este
documento, hace referencia a vertebrados, especialmente miembros de
la especie de los mamíferos, e incluye, pero no se encuentra
limitado a, animales (por ejemplo, perros, gatos, ganado bovino,
cerdos, ovejas, cabras, conejos, ratones, ratas, cobayas, etc.), y
primates, incluidos monos, chimpancés, babuinos y el hombre.
Tal como se usa en este documento, la "cadena
sentido" de un ácido nucleico contiene la secuencia que tiene
homología en su secuencia con la del ARNm. La "cadena
antisentido" contiene una secuencia que es complementaria a la de
la "cadena sentido".
Tal como se usa en este documento, un "genoma
con una cadena en sentido positivo" de un virus es uno en el que
genoma, ARN o ADN, es de cadena simple y que codifica una(s)
proteína(s) viral(es). Ejemplos de virus ARN con
cadena en sentido positivo incluyen Togaviridae, Coronaviridae,
Retroviridae, Picornaviridae y Caliciviridae. También están
incluidos los Flaviviridae, que se clasificaban antiguamente como
Togaviridae. Véase Fields y Knipe (1986).
Tal como se usa en este documento, "una muestra
corporal que contiene anticuerpos" hace referencia a un
componente del cuerpo de un individuo que constituye una fuente de
los anticuerpos de interés. Los componentes del cuerpo que contienen
anticuerpos son conocidos en la materia e incluyen, pero no se
encuentran limitados a, por ejemplo, plasma, suero, líquido
cefalorraquídeo, fluido linfático, las porciones externas de los
tractos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva,
leche, leucocitos y mielomas.
Tal como se usa en este documento, una "muestra
biológica" hace referencia a una muestra de tejido o fluido
aislado a partir de un individuo que incluye, pero no se encuentra
limitada a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo,
fluido linfático, las porciones externas de los tractos
respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche,
células sanguíneas, tumores y órganos. También se incluyen muestras
de constituyentes de cultivos celulares in vitro (que
incluyen, pero no se encuentran limitados a, medio condicionado que
resulta del crecimiento de células en medio de cultivo, células
supuestamente infectadas con un virus, células recombinantes y
componentes celulares).
La práctica de la presente invención empleará, a
menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de
biología molecular, microbiología, ADN recombinante, síntesis de
polipéptidos y ácidos nucleicos e inmunología, que se encuentran
dentro de las habilidades en la materia. Estas técnicas están
explicadas con todo detalle en la literatura. Véanse, por ejemplo,
Maniatis, Fitsch y Sambrook, "Molecular Cloning: A Laboratory
Manual" (1982); "DNA Cloning, Volumes I and II" (ediciones
D.N. Glover, 1985); "Oligonucleotide Synthesis" (ediciones M.J.
Gait, 1984); "Nuclei Acid Hybridization" (ediciones B.D. Hames
y S.J. Higgins, 1984); "Transcription and Translation"
(ediciones B.D. Hames y S.J. Higgins, 1984); "Animal Cell
Culture" (ediciones R.I. Freshney, 1986); "Immobilized Cells
And Enzymens" (IRL Press, 1986); B. Perbal, "A Practical Guide
To Molecular Cloning" (1984); la serie, "Methods in
Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Gene Transfer Vectors For
Mammalian Cells" (ediciones J.H. Miller y M.P. Calos, 1987, Cold
Spring Harbor Laboratory), Meth. Enzymol., Vol. 154 y Vol. 155
(ediciones Wu y Grossman, y Wu, respectivamente), ediciones Mayer y
Walker (1987), "Immunochemical Methods In Cell And Molecular
Biology" (Academic Press, London); Scopes, (1987) "Protein
Purification: Principles and Practice", segunda edición
(Springer-Verlag, N.Y.); y "Handbook of
Experimental Immunology", Volúmenes I-IV
(ediciones D.M. Weir y C-C- Blackwell, 1986).
La invención incluye procedimientos para la
detección de VHC y la identificación de la infección por distintos
tipos de VHC. La invención también incluye moléculas de polipéptidos
y de ácidos nucleicos para su uso en los procedimientos.
Los procedimientos para la detección y el tipaje
de la infección por VHC incluyen tanto inmunoensayos como la
identificación de ácidos nucleicos mediante procedimientos que
incluyen, pero no se encuentran limitados a, la técnica de
hibridación tipo Southern y la reacción en cadena de la polimerasa.
Con objeto de identificar la infección por VHC, se incuba una
muestra biológica con uno de los polipéptidos descritos en este
documento en condiciones que permitan la unión
antígeno-anticuerpo y se realiza una determinación
para ver si los anticuerpos de la muestra se han unido al epítopo
que se halla en el polipéptido.
Los péptidos que contienen los epítopos
específicos de tipo y los epítopos específicos de una serie de tipos
son útiles en inmunoensayos para detectar la presencia de
anticuerpos frente al VHC, o la presencia del virus y/o antígenos
virales, en muestras biológicas. El diseño de los inmunoensayos está
sujeto a muchas variaciones y se conocen muchas versiones en la
materia. El inmunoensayo utilizará al menos un epítopo específico de
tipo o epítopo específico de una serie de tipos. En una forma de
realización, el inmunoensayo usa una combinación de epítopos
específicos de tipo y/o epítopos específicos de una serie de
tipos.
Los polipéptidos son útiles para el tipaje de VHC
debido al uso de los epítopos para determinar la presencia de
anticuerpos específicos de tipo o específicos de una serie de tipos.
Los polipéptidos también son adecuados para generar anticuerpos
específicos de tipo o de una serie de tipos que se pueden usar en un
inmunoensayo para distinguir entre diversos tipos de VHC.
Los polipéptidos derivan de las tres regiones
diferentes del genoma del VHC. Un grupo de polipéptidos incluye un
epítopo específico de tipo o de una serie de tipos obtenido a partir
de la región del núcleo de VHC. Otro grupo de polipéptidos incluye
un epítopo específico de tipo o de una serie de tipos obtenido a
partir de la región no estructural 4 (NS4) del VHC. Otro grupo de
polipéptidos incluye un epítopo específico de tipo o de una serie de
tipos obtenido a partir de la región no estructural 5 (NS5) de un
virus de la hepatitis C. Este grupo se encuentra entre los residuos
de aminoácidos 2281-2313 de VHC-1 y
las regiones homólogas de otros tipos de virus de la hepatitis
C.
Los polipéptidos son adecuados para su uso en
inmunoensayos para uno o más tipos de VHC. Con objeto de determinar
un tipo, la muestra se pone en contacto con uno o más polipéptidos
que contienen un epítopo específico de una serie de tipos en
condiciones que permitan la unión
antígeno-anticuerpo y se determina si anticuerpos de
la muestra se unen al epítopo.
En un inmunoensayo para distinguir un tipo
concreto de VHC, se obtiene una muestra biológica de un individuo,
ésta se pone en contacto con un primer epítopo específico de tipo o
epítopo específico de una serie de tipos, en condiciones que
permitan la unión antígeno-anticuerpo; se pone en
contacto con un segundo epítopo específico de tipo o epítopo
específico de una serie de tipos, en condiciones que permitan la
unión antígeno-anticuerpo y se determina si
anticuerpos de la muestra se unen al primero o al segundo epítopo.
Estas etapas se pueden repetir con cualquier número de polipéptidos
que contengan epítopos específicos de tipo y/o de una serie de
tipos.
Por regla general, un inmunoensayo para
anticuerpos anti-VHC implica la selección y la
preparación de la muestra a ensayar que se sospecha contiene los
anticuerpos, como una muestra biológica, y, a continuación, la
incubación de la misma con el epítopo específico de tipo o epítopo
específico de una serie de tipos, en condiciones que permitan la
formación de complejos antígeno-anticuerpo y la
detección, a continuación, de la formación de dichos complejos. Las
condiciones de incubación adecuadas son bien conocidas en la
materia. El inmunoensayo puede ser, sin limitaciones, de formato
heterogéneo u homogéneo y de tipo estándar o competitivo.
En un formato heterogéneo, el epítopo específico
de tipo o epítopo específico de una serie de tipos está generalmente
unido a un soporte sólido para facilitar la separación de la
muestra, tras la incubación, del polipéptido. Ejemplos de soportes
sólidos que se pueden usar incluyen, pero no se encuentran limitados
a, nitrocelulosa (por ejemplo, en forma de membrana o en pocillo de
placa de microtitulación), cloruro de polivinilo (por ejemplo, en
hojas o pocillos de placas de microtitulación), látex de
poliestireno (por ejemplo, en bolas o placas de microtitulación),
fluoruro de polivinilideno (conocido como Immunlon®), papel
diazotado, membranas de nylon, bolas activadas y bolas de Proteína
A. Por ejemplo, en el formato heterogéneo se pueden usar placas de
microtitulación Dynatech Immunlon® o Immunlon® 2 o bolas de
poliestireno de 6,25 mm (0,25 pulgadas) (Bolas de plástico de
precisión). Generalmente, el soporte sólido que contiene el epítopo
específico de tipo o epítopo específico de una serie de tipos se
lava tras separarlo de la muestra a ensayar y antes de la detección
de los anticuerpos unidos. Los formatos estándar y competitivo son
conocidos en la materia.
En un formato homogéneo, la muestra a ensayar se
incuba con el epítopo específico de tipo o epítopo específico de una
serie de tipos en solución. Puede ser, por ejemplo, en condiciones
que precipiten cualquier complejo
antígeno-anticuerpo formado. Los formatos estándar y
competitivo de estos ensayos son conocidos en la materia.
En el formato estándar, la cantidad de
anticuerpos frente al VHC que forman el complejo
anticuerpo-epítopo específico de tipo o de una serie
de tipos se monitoriza directamente. Esto se puede llevar a cabo
determinando si se unen anticuerpos marcados
anti-xenogénicos (por ejemplo,
anti-humanos) que reconocen un epítopo en los
anticuerpos anti-VHC, debido a la formación de
complejos. En un formato competitivo, la cantidad de anticuerpos
frente al VHC en la muestra se deduce monitorizando el efecto
competitivo de la unión de una cantidad conocida de un anticuerpo
marcado (u otro ligando competitivo) sobre el complejo.
En un ensayo de inhibición, se determina la
capacidad de los anticuerpos para unirse a polipéptidos que
contienen varios epítopos específicos de tipo o epítopos específicos
de una serie de tipos distintos. Los anticuerpos se exponen en
primer lugar a polipéptidos que contienen un epítopo(s) de un
tipo o de una serie de tipos de VHC y a continuación a polipéptidos
que contienen un epítopo(s) de otro tipo u otra serie de
tipos de VHC. El procedimiento se puede repetir para un tipo o una
serie de tipos adicionales de VHC.
Los complejos formados que comprenden anticuerpos
anti-VHC (o, en el caso de los ensayos competitivos,
la cantidad de anticuerpo competitivo) se detectan mediante una
técnica cualquiera de una serie de técnicas conocidas, dependiendo
del formato. Por ejemplo, los anticuerpos no marcados frente a VHC
en el complejo se pueden detectar usando un conjugado de Ig
anti-xenogénicas con un marcaje (por ejemplo, un
marcaje enzimático).
En inmunoensayos típicos, la muestra a ensayar,
generalmente una muestra biológica, se incuba con polipéptidos que
contienen uno o más epítopos específicos de tipo o epítopos
específicos de una serie de tipos en condiciones que permita la
formación de complejos antígeno-anticuerpo. Se
pueden emplear distintos formatos. Se puede emplear, por ejemplo, un
"ensayo sándwich" en el que el anticuerpo unido a un soporte
sólido se incuba con la muestra a ensayar; se lava; se incuba con un
segundo anticuerpo marcado frente al analito, y el soporte se lava
de nuevo. El analito se detecta determinando si el segundo
anticuerpo está unido al soporte. En un formato competitivo, que
puede ser heterogéneo u homogéneo, una muestra a ensayar se incuba
generalmente con el anticuerpo y se incuba también un antígeno
competitivo marcado, de forma secuencial o simultánea. Este y otros
formatos son bien conocidos en la materia.
Los anticuerpos dirigidos frente a los epítopos
específicos de tipo o los epítopos específicos de una serie de tipos
se pueden usar en inmunoensayos para la detección de antígenos
virales en pacientes con HNANB causada por VHC, y en donantes
infecciosos de sangre. Además, estos anticuerpos pueden ser
extremadamente útiles para la detección de donantes y pacientes en
fase aguda.
Un inmunoensayo puede usar, por ejemplo, un
anticuerpo monoclonal dirigido frente a un epítopo específico de
tipo o epítopos específicos de una serie de tipos, una combinación
de anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epítopos de un
antígeno viral, anticuerpos monoclonales dirigidos frente a epítopos
de distintos antígenos virales, anticuerpos policlonales dirigidos
frente a un mismo antígeno viral o anticuerpos policlonales
dirigidos frente a distintos antígenos virales. Los protocolos se
pueden basar, por ejemplo, en la competición o la reacción directa o
ensayos de tipo "sándwich". Los protocolos también pueden usar,
por ejemplo, soportes sólidos o pueden ser por inmunoprecipitación.
La mayoría de los ensayos implica el uso de un anticuerpo o
polipéptido marcado; los marcajes pueden ser, pero no se encuentran
limitados a, moléculas enzimáticas, fluorescentes,
quimioluminiscentes, radioactivas o tintes. También se conocen
ensayos que amplifican la señal a partir de la sonda; ejemplos de
éstos son los ensayos que emplean biotina y avidina y los
inmunoensayos marcados y mediados por enzimas, como los ensayos
ELISA.
La invención incluye además moléculas de ácidos
nucleicos que codifican secuencias de residuos de aminoácidos de los
epítopos específicos de tipo o epítopos específicos de una serie de
tipos descritos. Estas moléculas de ácidos nucleicos son útiles como
sondas, por ejemplo en técnicas de hibridación de tipo Southern u
otros ensayos de reconocimiento del ADN como el ensayo de captura
descrito en las Patentes de Estados Unidos Número 4.868.105 y
5.124.246.
Los estudios de mapeo antigénico mediante la
expresión de ADNc de VHC mostró que una serie de clones que
contenían estos ADNc expresaban polipéptidos que eran
inmunológicamente reactivos con suero procedente de individuos que
presentaban HNANB. Ningún único polipéptido fue inmunológicamente
reactivo con todos los sueros. Cinco de estos polipéptidos fueron
muy inmunogénicos puesto que anticuerpos frente a los epítopos del
VHC de estos polipéptidos se detectaron en muchos sueros de
distintos pacientes, aunque la detección no se solapó completamente.
De este modo, los resultados acerca de la inmunogenicidad de los
polipéptidos codificados en los distintos clones sugieren que
sistemas eficientes de detección para la infección por VHC pueden
incluir el uso de paneles de epítopos. Los epítopos del panel se
pueden construir dentro de uno o varios polipéptidos. Los ensayos
para los distintos epítopos pueden ser secuenciales o
simultáneos.
Los kits adecuados para el inmunodiagnóstico y
que contienen los reactivos marcados apropiados se constituyen
empaquetando los materiales apropiados, incluidos los polipéptidos
de la invención que contienen epítopos específicos de tipo y
epítopos específicos de una serie de tipos o anticuerpos dirigidos
frente a epítopos específicos de tipo y epítopos específicos de una
serie de tipos, en envases adecuados junto con el resto de los
reactivos y materiales necesarios para llevar a cabo el ensayo, así
como una colección adecuada de instrucciones para el ensayo.
La invención incluye además moléculas de ácidos
nucleicos complementarias a las regiones flanqueantes de las
secuencias de ácidos nucleicos que codifican epítopos específicos de
tipo y epítopos específicos de una serie de tipos. Dichas moléculas
de ácidos nucleicos son útiles para la realización de una PCR para
determinar el genotipo de un VHC concreto.
Debería observarse que existen regiones variables
e hipervariables dentro del genoma del VHC; por lo tanto, se espera
que la homología en estas regiones sea significativamente menor que
en el genoma en su conjunto.
Las técnicas para la determinación de homología
en secuencias de ácidos nucleicos y aminoácidos son conocidas en la
materia. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos se puede
determinar directamente y compararla con las secuencias que se
proporcionan en este documento. De forma alternativa, se puede
determinar la secuencia de nucleótidos del material genómico del
supuesto VHC (generalmente a través de un ADNc intermedio), así como
la secuencia de aminoácidos codificada por ella y se pueden comparar
las regiones correspondientes.
La discusión anterior y los ejemplos solamente
ilustran la invención. Los expertos en la materia apreciarán que la
invención se puede llevar a cabo de otras maneras y la invención se
define exclusivamente tomando como referencia las
reivindicaciones.
Se comparó la homología de los residuos de
aminoácidos de distintas regiones entre distintos tipos y subtipos
de VHC. El subtipo de VHC es tal como se describe en el análisis
filogenético de Simmonds. La numeración de la secuencia de
aminoácidos se corresponde con la que se describió para la secuencia
prototipo de VHC-1. Choo y col. La tabla 2 muestra
el porcentaje de homología de los residuos de aminoácidos para los
epítopos específicos de tipo y epítopos específicos de una serie de
tipos de la región NS4 y el principal epítopo conservado. La tabla 3
muestra la homología de los residuos de aminoácidos entre dos
epítopos específicos de tipo o epítopos específicos de una serie de
tipos de la región NS5. La tabla 4 muestra el porcentaje de
homología de los residuos de aminoácidos de los principales epítopos
conservados y los epítopos específicos de tipo de la región del
núcleo.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Se sintetizaron dos grupos de polipéptidos. El
primer grupo se diseñó para realizar el mapeo de epítopos de
VHC-1 y el segundo grupo se diseñó para determinar
qué epítopos identificados en los estudios de mapeo de epítopos
contenían epítopos específicos de tipo. En el primer grupo de
polipéptidos, se sintetizaron sesenta y cuatro grupos (por
duplicado) de octapéptidos solapantes por Mimotopes a lo largo de
toda la poliproteína de VHC-1 (3011 residuos de
aminoácidos).
El segundo grupo de polipéptidos se realizó de
acuerdo con el procedimiento descrito por Geysen (1990) J. trop.
Med. Pub. Health, 21:523-533; y Merrifield (1963) J.
Am. Chem. Soc., 85:2149-2154.
En el segundo grupo de polipéptidos, se
seleccionaron cuatro regiones antigénicas que representaban los
principales epítopos de las secuencias no conservadoras en el
VHC-1 del núcleo, NS4 y NS5 y sus secuencias
correspondientes en los subtipos de VHC 1b, 2a, 3a y tipo 4 para la
síntesis de epítopos específicos de tipo. La secuencia del núcleo se
seleccionó dentro de la región de residuos de aminoácidos menos
conservada 67-88. La secuencia de la región NS4 se
seleccionó dentro de la región de residuos de aminoácidos
1689-1718. Las secuencias de la región NS5
seleccionadas pertenecían a las regiones de los residuos de
aminoácidos 2281-2313 y
2673-2707.
Con objeto de determinar la efectividad de los
polipéptidos para distinguir entre anticuerpos específicos frente a
distintos tipos de VHC, se obtuvieron antisueros de veinticuatro
pacientes con HNANB crónica, procedentes de distintas áreas del
mundo incluidas la costa este y oeste de los Estados Unidos, Japón,
países del oeste de Europa occidental, países del sur de Europa y
África del sur. El aislamiento del ARN viral, la síntesis de ADNc,
la amplificación por PCR, la secuenciación de ADN y la hibridación
con sondas de oligonucleótidos se realizaron tal como describieron
Cha y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:7144-7148.
Con objeto de determinar qué regiones del VHC
contienen epítopos específicos de grupo o conservados, la
poliproteína completa del VHC-1 se sometió a un
mapeo de epítopos. El procedimiento es esencialmente tal como se
perfila en la figura 2.
Se sintetizaron sesenta y cuatro grupos (por
duplicado) de octapéptidos solapantes por Mymotopes® a lo largo de
la poliproteína completa del VHC-1 (3011
aminoácidos). Se seleccionó un panel de 40 muestras que contenía 25
muestras reactivas para anticuerpos del VHC procedentes de Estados
Unidos, 9 muestras reactivas para VHC de Japón y 6 muestras control
negativo no reactivas para VHC para el mapeo de epítopos y el
análisis de grupos. Los inmunoensayos se realizaron usando
procedimientos de ELISA estándar.
Los criterios para identificar los principales
epítopos se basaron en la frecuencia de reacción de anticuerpos y la
intensidad de la reacción de los anticuerpos (título) frente estos
epítopos. Los resultados se presentan en las figuras 3 y 4.
Con objeto de determinar el inmunoensayo óptimo
que use los polipéptidos descritos en el ejemplo 2, se llevaron a
cabo dos tipos distintos de ensayos de inmunoabsorción ligados a
enzima (ELISA) derivados de los polipéptidos y se compararon los
resultados. El primer tipo de ELISA fue el Nunc Maxisorb™, sobre el
que los péptidos están simplemente adsorbidos, y el segundo tipo
utilizado fue el Nunc Covalink NH™ en el que los péptidos están
unidos covalentemente. La formación de enlaces amida entre ácidos
carboxílicos y aminas se promueve mediante la adición de
carbodiimida. Para disminuir la hidrólisis, el éster activo se puede
generar añadiendo N-hidroxisuccinimida (NHS) a los
procedimientos anteriores de conjugación.
Las placas de microtitulación para el primer tipo
de ELISA se prepararon tal como se indica a continuación. Los
polipéptidos se pusieron en los pocillos de las placas de
microtitulación Nunc MaxiSorb™ a una concentración de 1
\mug/pocillo en 100 \mul de tampón fosfato salino (PBS). Se dejó
que los polipéptidos se absorbiesen durante toda la noche a
temperatura ambiente. A continuación, las placas de microtitulación
se lavaron cuatro veces con PBS sin detergente. A continuación, los
pocillos se revistieron, de nuevo, con 220 \mul de Superblock®
(Pierce) durante 1 hora y se aspiraron sin lavar ni secar al vacío
después.
El ensayo se llevó a cabo como sigue. La muestra
de suero de 5 \mul se añadió a los pocillos con 100 \mul de
leche desnatada al 5% y se incubó durante 1 hora a 37ºC. A
continuación, los pocillos se lavaron cinco veces con PBS con un 5%
de Tween. A continuación, se usó un conjugado de IgG de cabra
anti-humanas purificadas por afinidad marcadas con
peroxidasa de rábano picante (Jackson Laboratories) para determinar
el grado de unión de anticuerpos humanos a los polipéptidos. El
conjugado se había diluido previamente hasta el 5% de IgG en NaCl
150 mM, PBS, suero de caballo al 5% (desnaturalizado por calor). Se
pusieron 100 \mul del conjugado en los pocillos y se incubaron
durante una hora a 37ºC. A continuación, los pocillos se lavaron
cinco veces con PBS/Tween y OPD
[o-fenilen-diamina-2HCl,
una pastilla por tampón de revelado (tampón fosfato citrato con
H_{2}O_{2} al 0,02%); Sigma] durante treinta minutos a
temperatura ambiente y se determinó la Abs a 492 nm y 620 nm. El
punto de corte se determinó a partir de 200 muestras aleatorias
(normales) en las que siete desviaciones típicas de la media o
aproximadamente 0,45.
Las placas de microtitulación para el segundo
tipo de ELISA se prepararon como sigue. Los polipéptidos se pusieron
en los pocillos de las placas de microtitulación Nunc MaxiSorb™ a
una concentración de 10 mg/pocillo en 50 \mul de agua. Se
añadieron 25 \mul de NHS
(sulfo-N-hidrosuccinimida) 0,1 M y
25 \mul de EDC
[1-etil-3(3-dimetilaminopropilcarbodiimida)
Sigma] 0,1 M a los polipéptidos y se mezcló a temperatura ambiente
durante 30 minutos sobre una plataforma basculante. El contenido en
su totalidad se añadió a 52 ml de carbonato de sodio 0,1 M, pH 8,6,
frío. Se usaron 100 \mul de la mezcla para revestir los pocillos
de las placas de microtitulación y se incubaron a 4ºC durante 30
minutos. A continuación, las placas de microtitulación se lavaron
cuatro veces con PBS/0,1% de Triton X-100. A
continuación, las placas se trataron con Superblock y el ensayo se
llevó a cabo tal como se ha descrito más arriba.
Los resultados obtenidos se presentan en las
tablas 5-14 a continuación.
Los ensayos de inhibición se llevaron a cabo para
determinar si los péptidos podían competir entre ellos para unirse a
los anticuerpos. Se sintetizaron tres grupos de polipéptidos cortos
de las regiones del núcleo, NS4 y NS5 de secuencias de distintos
tipos de VHC. Estos polipéptidos cubren la región de la secuencia de
aminoácidos 1689-1695, 1696-1702 y
1711-1917. Los ensayos de inhibición se llevaron a
cabo añadiendo 10 \mug de los polipéptidos anteriormente
mencionados a la muestra, incubando a 37ºC durante una hora y, a
continuación, realizando el ensayo ELISA tal como se ha descrito más
arriba. Si se observaba una inhibición mayor del 50% de unión de
anticuerpo, el péptido se consideraba inhibidor. Los resultados
obtenidos se presentan en la tabla 15 a continuación.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Los epítopos específicos de tipo o de una serie
de tipos de la tabla 16 se usaron en el ensayo ELISA del ejemplo 5
para ensayar 13 muestras clínicas de pacientes con hepatitis
no-A no-B (10 donantes remunerados,
3 pacientes con hepatitis crónica no-A
no-B relacionada con una transfusión). La tabla 17
muestra los resultados de estos ensayos. Cada muestra clínica se
ensayó para su reactividad con doce péptidos distintos
correspondientes a las regiones determinadas (aa
67-84, 1689-1718 o
2281-2313) que representan distintos epítopos
específicos de tipo o de una serie de tipos. Cada muestra da una
respuesta no reactiva (NR), débilmente reactiva (WR) o reactiva (R)
con cada péptido de tipaje. Estos resultados predicen un genotipo de
VHC en cada muestra, que se correlaciona con el genotipo del VHC
determinado por PCR y que se da en la columna de la derecha.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (12)
1. Un procedimiento para el tipaje de un virus de
la hepatitis C que comprende las etapas de:
- (a)
- puesta en contacto de una muestra biológica con un primer reactivo que comprende una combinación de polipéptidos que contienen epítopos específicos de tipo específicos de un primer tipo de virus de la hepatitis C en condiciones que permitan la formación de primeros complejos epítopo-anticuerpo; y
- (b)
- ensayo de la presencia de primeros complejos epítopo-anticuerpo en la muestra,
en el que dichos epítopos se
seleccionan de entre epítopos localizados entre los residuos de
aminoácidos 67 y 84, 1689 y 1718, y 2281 y 2313 del
VHC-1 o regiones homólogas de otros tipos de virus
de la hepatitis C y dichos epítopos tienen entre 8 y 10 aminoácidos
de
largo.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 que comprende además las etapas de:
- (c)
- puesta en contacto de la muestra con un segundo reactivo que comprende otro epítopo específico de tipo específico para un segundo tipo de virus de la hepatitis C en condiciones que permitan la formación de un segundo complejo epítopo-anticuerpo; y
- (d)
- ensayo para la presencia de un segundo complejo epítopo-anticuerpo en la muestra,
en el que dichos epítopos se
seleccionan de entre epítopos de las regiones del núcleo, NS4 o NS5
del
VHC.
3. El procedimiento de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 y 2 en el que dichos epítopos se seleccionan de
entre las secuencias de aminoácidos PEGRTWAQ, STGKSWWGK, SEGRSWAQ,
FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG
y PDYRPPVVHG.
4. Un procedimiento para el tipaje de un virus de
la hepatitis C que comprende las etapas de:
- (a)
- puesta en contacto de una muestra biológica con una combinación de anticuerpos específicos para un primer epítopo tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones que permitan la formación de complejos epítopo-anticuerpo; y
- (b)
- ensayo de la presencia de primeros complejos epítopo-anticuerpo en la muestra.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 4 que comprende además las etapas de:
- (e)
- puesta en contacto de la muestra con un segundo reactivo que comprende una combinación de anticuerpos específicos para un segundo epítopo tal como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 en condiciones que permitan la formación de complejos epítopo-anticuerpo; y
- (f)
- ensayo para la presencia de segundos complejos epítopo anticuerpo en la muestra.
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera
de las reivindicaciones precedentes en el que la etapa de ensayo se
realiza por medio de un ensayo de competición, un ensayo tipo
"sándwich", un ensayo de inmunofluorescencia, un
radioinmunoensayo o un ensayo de inmunoabsorción ligado a
enzima.
7. Un grupo de polipéptidos en el que dicho grupo
de polipéptidos comprende más de un polipéptido y en el que uno de
los polipéptidos del grupo contiene un epítopo específico de tipo
derivado de la secuencia de aminoácidos que abarca los aminoácidos
67 a 84 de la región del núcleo del virus de la hepatitis C
VHC-1 y regiones homólogas de otros tipos de VHC,
seleccionando dicho polipéptido de entre los polipéptidos que tienen
las secuencias PEGRTWAQ, STGKSWGK o SEGRSWAQ.
8. Un grupo de polipéptidos en el que dicho grupo
de polipéptidos comprende más de un polipéptido y en el que uno de
los polipéptidos del grupo contiene un epítopo específico de tipo
derivado de la secuencia de aminoácidos que abarca los aminoácidos
1689 a 1718 de la región NS4 del virus de la hepatitis C
VHC-1 y regiones homólogas de otros tipos de VHC,
seleccionando dicho polipéptido de entre los polipéptidos que tienen
las secuencias CSQHLPY, CASHLPLY, CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL o
ASKAAL.
9. Un grupo de polipéptidos en el que dicho grupo
de polipéptidos comprende más de un polipéptido y en el que uno de
los polipéptidos del grupo contiene un epítopo específico de tipo
derivado de la secuencia de aminoácidos que abarca los aminoácidos
2281 a 2313 de la región NS5 del virus de la hepatitis C
VHC-1 y regiones homólogas de otros tipos de VHC,
seleccionando dicho polipéptido de entre los polipéptidos que tienen
las secuencias FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG,
PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG y PDYRPPVVHG.
10. Un reactivo que tiene una combinación de
polipéptidos que contienen epítopos específicos de tipo en los que
dichos epítopos se seleccionan de entre los epítopos localizados
entre los residuos de aminoácidos 67 y 84, 1689 y 1718, y 2281 y
2313 de VHC-1 o regiones homólogas de otros tipos de
virus de la hepatitis C y en el que los epítopos se seleccionan de
entre las secuencias de aminoácidos PEGRTWAQ, STGKSWGK, SEGRSWAQ,
FAQALPVW, FPPQALPPW, PDYEPPVVHG, PDYVPPVVHG, PDYQPATVAG, PGYEPPTVLG
y PDYRPPVVHG.
11. Un reactivo que tiene una combinación de
polipéptidos que contienen epítopos específicos de tipo en el que
dichos epítopos se seleccionan de entre las secuencias de
aminoácidos CSQHLPY, CASHLPY, CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL y
ASKAAL.
12. Un procedimiento para el tipaje de un virus
de la hepatitis C que comprende las etapas de:
- (a)
- puesta en contacto de una muestra biológica con un primer reactivo que comprende una combinación de polipéptidos que contienen epítopos específicos de tipo específicos de un primer tipo de virus de la hepatitis C en condiciones que permitan la formación de primeros complejos epítopo-anticuerpo; y
- (b)
- ensayo de la presencia de primeros complejos epítopo-anticuerpo en la muestra,
en el que dichos epítopos se
seleccionan de entre las secuencias de aminoácidos CSQHLPY, CASHLPY,
CASRAAL, CASKAAL, SQHLPY, ASRAAL y
ASKAAL.
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