CZ293599A3

CZ293599A3 - Nehemolytické cytolytické činidlo, peptid, cyklický peptid, cyklický derivát nepřírodního syntetického peptidu, Leu/Lys diastereomer, komplex provázaných peptidů, směs, nehemolytický cytolytický neuspořádaný kopolymer a farmaceutický prostředek

Info

Publication number: CZ293599A3
Application number: CZ19992935A
Authority: CZ
Inventors: Yechiel Shai; Ziv Oren
Original assignee: Yeda Research And Development Co. Ltd.
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1998-02-19
Publication date: 2000-04-12

Abstract

Nehemolytická cytolytická činidla volená z peptidů, komplexů provázaných peptidů, směsí peptidů nebo nahodilých kopolymerů peptidů mající selektivní cytolytické účinky na patogenní buňky, které se v těle nevyskytují přirozeně, zahrnující mikrobiální patogenní organismy a zhoubné buňky, přičemž tato činidlajsou nehemolytická, nemají žádné cytolytické účinky na červené krevní buňky. Peptidymohou představovat cyklické deriváty přírodních peptidů, takových jako pardaxin a mellitin ajejich částí, ve kteiých L-amino kyselinové zbytkyjsou zaměněny odpovídajícími D-amino kyselinovými zbytky, nebo představují diastereomeiy lineárních peptidů tvořené různými poměry alespoňjedné pozitivně nabité amino kyseliny a alespoňjedné hydrofobní amino kyseliny, ve kterých alespoňjeden z amino kyselinových zbytkůje LLamino kyselina. Faramaceutické prostředky obsahující nehemocytolytická činidla mohou být použity pro ošetření různých chorob způsobených patogeny, jako bakteriální, plísňové, virové infekce, mykoplasma a infekce způsobené prvoky a pro ošetření rakoviny

Description

Oblast vynálezu

P ř e cl .1. o ž e n ý vy π á 1 e z z a h r n u. j e n o v á n e h e m o 1 y t i c k. á c y t o .1. y t i c: k. á činidla, prostředky obsahující tyto peptidy a jejich použití při oŠ£ÍA»ft4- ra o i ]. i η n ý c h-f=t4k a z a n em ocA. a *

AZ (u /rtí

Dosavadní stav techniky

P o z n á m k y v n á s 3. e d u j í c í m t e i u j s o u v ě n o v á n y d o k u m e n t ů m ρ o p i s u j í cím současný stav techniky, veškeré podrobnosti těchto dokumentů mohou být shledány v oddíle Seznam literatury uvedeném v textu,, Zvyšují c í s e o cl o 1 n o s t m i k r o o r g a n i s m ů n a cl o s t u ρ n é a n t i m i k r o b i á 1 η í. léky vedla k rozsáhlému výzkumu zaměřenému na vývoj al terna·i. i v η í c: h a n t i m i k robi á I η í c h s 1 o u č e η i n „

V dodatku nebo jako doplněk k velmi specifické imunitní reakci zprostředkované buňkami mají obratlovci a jiné organismy obranný s y s t é m t v o ř e n r o z cl ί 1 n ý mi s k u p i n a m i š i r o k é h o s p e k t r a c y i o 1 y.....

t i c k ý c h 1 á t e k, n a p ř „ a n i11::) akte r i á 3. η í m i 3. á t k a m i, p e p t i cl y,,

Studium vzájemných reakcí lipidů a peptidů, takových cytoly.....

tických peptidů také známých jako cytolysiny, vede ke zdůraznění a ιϊι f i p a t i. c k é ix h e 3. i k á 3. η í s t r u k t u r y cl ů 3. e ž i t é p r o j e j i. c h c y t o 3. y t i o k ý účinek,, Tento závěr je založen především na výzkumu cytoly sinů, které působí buď na savčí buňky nebo na samostatné bakterie, nebo na oba typy uvedených buněk. Hlavní skupinou cytoly tických pepti-dů uvedené skupiny jsou krátké lineární peptidy s obranným účinkem proti hostitelům (i 40 amino kyseliny), které jsou zbavené disulfidových můstků (Boman, 1995)„ Tyto peptidy se podstatně ritu mění v délce jejich řetězce, hydrotobnosti a celkové distribuci nábojů, ale při spojení s tukovou dvojnou vrstvou mají obvyklou strukturu, jmenovitě amfipatickou κ-helixovou strukturu (Segrest a spol,,, 1990).

Vzorky známých cytolysinů zahrnují: (i) antibakteriální peptidy, které jsou cytálytické pouze k bakteriím, např. cekropiny izolované z cekropia molů (Steiner a spol., 1981), magaininy (Zasloff, 1987) a dermaseptiny (Mor a spol.., 1991) izolované z kůže žab; (ii) cytolysiny, které jsou selektivně cytotoxické k savčím buňkám, takové jako 8-hernolysin izolovaný z Staphylacaccus aureus^- (Dhople a Nagaraj, 1993); a (iii) cytolysiny, které nejsou selektivní k buňkám, takové jako včelí živočišný jed -·· mel litin (Habermann a Jentsch, 1967) a neurotoxin pardaxin (Shai a spol., 1988), který lýzuje jak savčí buňky tak i bakterie.

A ni. i b akte ri á 1 ηí p e pt i dy b y 1 y pů v o dn ě o bjeve ny u tae z o bra 11ý ch a teprve následně u obratlovců a u lidí. Tento druhotný chemický imunní systém, jako pomocný nebo doplňkový obranný systém, zabezpečuje organismus souborem instrukcí malých peptidů, které jsou syntetizovány ihned po indukci, a které působí proti vniknu.....

tí nahodilých a obligátních pa to genů stejně jako proti nekont.ro.....

1ovánému bujení kamenzálnich mikroorganismů (Boman, 1995). Doposud bylo izolováno a charakterizováno více jak 100 různých antibakteriálních peptidů. Největší skupina a pravděpodobně nejvíce studovaná zahrnuje peptidy, které mají pozitivní náboj a p ř i v .1 a s t ň u j í s i a m f i p a t i c k o u ix.....h e 1 i k á 1 η í s t r u k t u r u. P a d a s i u d i í spojených s různými přírodními antibakteriálními peptidy vede ke zdůraznění amfipatické (x-helikální struktury a čistého pozitivního náboje důležitého pro jejich cytolytické účinky. Pozitivní náboj podporuje vzájemné působení peptidů s negativně nabitými membránami (Andreu a spol., 1985) objevenými v patogenních buněčných membránách ve vyšších koncentracích v porovnání s normálními eukaryontními buňkami, amfipatická (x-helikální • · · · struktura je základní pro lytický účinek peptidů (Chen a spol,, 1988), Takové vzájemné působení bylo navrženo s cílem potlačit energii metabolismu cílového organismu zvýšením propustnosti m em b rá η p řen áše j ících energii (0 k ada a Na to r i, 1984). V z h1edem k amfipatické struktuře peptidů bylo navržena, aby tyto antibakteriální peptidy pronikaly membránou způsobem vytváření iontových kanálků/pérů prostřednictvím mechanismu sudových družin (Rizzo a spol,,, 1987),, 9 souladu s tím, modelové trans-membránové amfipatické tx-helixy tvoří uzlíky, ve kterých zevně usměrněné hydrofóbní povrchové vrstvy vzájemně působí se složkami 'lipidů membrány, zatímco vnitřní čelní povrchové vrstvy vy tvá ře j ί ρéry„ A11e rn a ti vně, p e p ti dy váží para 1e1u na pov r c h membrány, pokrývají povrch membrány kobercovítým způsobem a rozpouštějí tento povrch jako smáčedlo (Shai, 1995),, Přes rozsáhlá studia není přesná funkce účinků krátkých lineárních buněčně neselektivních peptidů, takových jako pardaxin a mel litin, doposud známá a není jasné, zda podobné strukturální tvary jsou požadovány pro jejich cytotoxicitu k savčím buňkám a bakteriím,

R a i' d a x i η, 3 3 m e r p e p t i. d, j e e c i t a č η ί n e u r o t o :·: i η, k t e r ý b y 1 získán z mláďat platýzů Červeného moře Pardachirus marmoratus (Shai a spal,,, 1988) a z pavích platýzů západního Pacifiku

Pard ach i ras pavoninus (Thompson a spol,, 1986), Pardaxin projevu.....

je různé biologické účinky v závislosti na jeho koncentraci (popsáno v Shai, 1994), Pardaxin při koncentraci nižší než 10.....⁷

M vyvolává uvolnění nervavých med iátorů způsobem závislým na vápníku. Při koncentracích od 10-⁷ 1*1 do 10'“·^E 1*1 je tento způsob nezávislý na vápníku a při koncentrac ích vyšších než IO™·' M pardaxin vyvolává cytolýzu. Pardaxin také ovlivňuje účinky různých fyziologických příprav in vitro. Biologické funkce parda·- xinu byly přisouzeny jeho vlivu na iontový přenos osmoregulačního systému v epiteiu a presynaptickým účinkům díky vytváření iontových kanálků, které jsou napěťově závislé a nepatrně selektivní na kationty. Mechanismus sudových družin, kterým je pardaxin zaváděn do membrán, byl navržen na základě struktury pardaxinu a na základě různých biofyzikálních studií (přehled v Shai, 1994). Pardaxin má strukturu helix-kloub~helix! N-helix zahrnuje zbytky 1-lí a C-helix zahrnuje zbytky 14-26. Helixy .jsou odděleny prolinovým zbytkem umístěným na pozici 13. Tento strukturální typ je shledán .jak v antibakteriálních peptidech, k t e r é m o h o u p ů s o b i t s p e o i f i c k y n a b a k t e r i e (n a p ř. c e k r o p i n), t. a k i v cytotoxických peptidech, které mohou lýzovat různé buňky (např. mel 1 itirt) „

Mellitin, 26-mer amfipatický peptid, „je hlavní složkou živočišného .jedu medonosných včel 4pis mell ifera (Habermann a Jentsch, 1967) a je jedním z nejvíce studovaných peptidů působících na m e m b r á n y (D e m p s e y ·, 1990). I^vl e 11 i. t. i. n je vy s o c e c y t o t o i c k ý k s a v č í m buňkám, ale je také vysoce účinným antibakteriálním činidlem (Steiner a spol,,, 1981),, Byla provedena řada studií s cílem určit v 1 a s i n o s t i v z á j e m n é h o p ů s o b e n í m e 11 i t i n u a m e m b r á η p r o ρ o r o z u m ě n í molekulárního mechanismu hernolýzy vyvolané mellitinem a modelové s t u d i e p r o p o r o z u m ě n í v š e o b e c n ý c h via s i n o s i í s i. r u k t u r p r o t e i n ů m e m b r á n a v z á j e m n é h α p ů s o b e n í i a k o v ý c h p r o t e i n ů s f o s f o 1 i p i d y membrán. Ve většině popsaných dokumentech je vymezena skutečnost, ž e i'·· o z d í 1 n é m o 1 e k u 1 á r η í (n e c h a n i s m y m o h o u p o d m i. ň o vat r ů z n é p ů s o b e ····· n í m e 11 i i i n u „ N i. c m é n ě, a m f i p a t i c k á tx ·· h e 1 i k á 1 n í s t r u k t u r a b y 1 a u k á z á n a jak o n e z b y t n ý p i^!í e d p o k 1 a d r ů z n ý c h ú č i. n k ů m e 11 i. t i n u (F¹ e r e z a spol,,, 1994),, r u k t u i' a m e 11 i t i. n u b y 1 a z k o u m á n a ř a d o u t e c h n i k,, V ý s 1 e d k y r e n t g e ·· nové krystalografie a jaderné magnetické rezonance jsou důkazem toho, že molekula se sestává ze dvou <x~helikálních částí (zbytků 1-10 a 13-26), které se protínají v úhlu 120 ⁰. Tyto části jsou spojeny kloubem ¢11--12) a tvoří lomené tx-helikální spojení hydrofilní a hydrofobní strany, které jsou obráceny v opačných w

směrech. Čtyři takové monomerické molekuly mellitinu se díky vnitřnímu hydrofobnímu působení seskupují dohromady, vzniká tetramer (Anderson a spol., 1980; Bazzo a spol., 1988; Terwilliger a Eisenberg, 1982; Terwilliger a Eisenberg, 1982). Na základě původního vnitřního působení na vnější vrstvy membrán bylo shledáno, že tetramer se rozštěpuje do monomerů, které dříve, než vnikají do membrán, si zachovávají tx-helikální st ru k tu ru (A11en b a c h a Hu b be11, 1988).

Mellitin a pardaxin mají. některé podobnosti. Jak pardaxin, tak i mellitin jsou tvořeny dvěma helixy s prolínovým kloubem umístěným mezi nimi. Dále, mellitin i pardaxin ukazují významné souhlasné skupiny v jejich N-helixech, které jsou většinou hydrofobní (Thompson a spol., 1986). Avšak, pardaxin (čistý náboj +1) obsahuje v jeho Okaneové jednotce dodatečných sedm amino kyselinových zbytků s nábojem -2, zatímco mellitin (čistý náboj +6) k o n č í a m i d o v o u s k u p i n o u a o b s a h u j e p o z i t i v n ě n a b i t o u t e t r a p e p t i d o v o u p o s 1 o u p n o s t L. y s - A r g - L. y s - Arg. I^vl e z i p a r d a x i n e m a m e 11 i t i n e m e x i s t u j e n ě k o 1 i. k f u n k č η í c h r o z d í 1 ů „ P a r d a x i. n s e váže p o d o b n ě jak k zwitteriontovým tak i k negativně nabitým fosfolipidům (Rapaport a Shaí, 1994), zatímco mellitin se váže lépe k negat i v n ě n a b i. tým n e ž k z w i t i. e r i o n t o v ý m f o s f o 1. i p i dům (B a t e n b u r g a spol., 1987; Batenburg a spol., 1987). Pardaxin se váže k fosfolipidům s pozitivní kooperativou (Rapaport a Shai, 1991), zatímco mellitin se váže s negativní a spol,,, 1987; Batenburg a spol., 1987). I tak .i. mellitin j s o u a n t i b a k. t e r i á 1 η í m i p e p t i d y s účinky p rotí grampoz.it.ivním a gramnegativním bakteriím, pardaxin je 40.....100 krát méně hernolytický k lidským erytrocytům než mellitin (Oren o o p e r a t i v o u (B a t e n b u r g P ř e s t o, jak p a r d a i η, a Shai, 1996).

Analogy pardaxinu s L~ a D- substitucemi se projevily jako schopné lýzovat lidské erytrocyty (Rouny a Shai, 1992). Později , bylo ukázáno (seznamte se s výsledky, které jsou uvedeny dále v textu), Že dva z peptidů, které jsou popsané v Pouny a Shai, 1992, jmenovitě D-Pro⁷-pardaxin a D-Leu¹⁸Leu^1<?-pardaxin, i přestože jsou hemolytické, mají velmi nízké antibakteriální účinky. Analogy magaininu s L- a D- substitucemi se také projevily jako postrádající antibakteriální účinky (Chen a spol., 1988). V následujícím textu bude vysvětleno několik pojmů vytvořených pro účely rychlého čtení a snadnějšího porozumění vynálezu. Mělo by však být uvedena, Se pro celkové porozumění těchto pojmů a u c e 1 e n o s t ρ o p i s u b u d o u tyt o u vedeny t a k é v n á s 1 e d u jícím text u. Pojmy a jejich významy v tomto textu jsou následující;

Pojem nestejnorodý peptid použitý v textu označuje peptid obsahující D- a L- amino kyselinové zbytky.

Pojem stejnorodý peptid použitý v textu označuje peptid obsahující pouze přírodní L-amino kyselinové zbytky nebo pouze D-amino k y s e 1 i n o v é z b y t k y „

Pojmy stejnorodý L-peptid a stejnorodý D-peptid použité v textu označují stejnorodý polypeptid zcela obsahující pouze buď L - a m i η o n e b o D - a m i n o k y s e 1 i n o v é z b y t k y, j e d n o 11 i. v ě.

Po j my s te j norodý L-zák1 adη ί peptid a sie j norodý D-zák1 adηí peptid použité v textu označují stejnorodý peptid obsahující hlavně L-amino kyselinové zbytky, např,, peptidy odvozené ze stejnorodých L-peptidů, ve kterých jeden nebo více L-amino kyselinových zbytků bylo zaměněno doplňujícím D-optickým izomerem a stejnorodý peptid obsahující hlavně D-amino kyselinové zbytky, ve kterém jeden nebo více D-amino kyselinových zbytků bylo zaměří ě n o d o ρ 1 ή u j í c í m I.... - o p t i c k ý m i z o m e r e m, j e d n o 11. i v ě „

Ρ o j e m h e 11 k á 1 η ί p e p t i. d¹¹ p o u žitý v t e x i u o z n a č u j e p e p t i. d m a j í c í spojitý «-hel ixový úsek přes většinovou část své délky,, Hel i kál ní P o d í 1 h e I i k á 1 η í h o p e p t i d u o b s a h u jez o e 1. a b uď L - a m i n o k y s e 1 i n o v é zbytky nebo D-amino kyselinové zbytky,,

Pojem nehelikální peptid použitý v textu označuje peptid, který nemá žádnou «-helixovou strukturu nebo má nespojité oc-helixové * struktury rozptýlené po své délce. Nehelikální peptid v souladu s vynálezem může mít κ-helixový úsek, který v případě, jestliže je konečný, má délku úseku menší než je polovina šířky buňky membrány, např. menší než přibližně 10 až 15 amino kyselinových • · zbytků, a jestliže α-helixová část není konečná, má délku menší než je plná šířka buňky membrány, např. menší než přibližné 20 až 25 amino kyselinových zbytků. Nehelikální peptid může být stejnorodým peptidem s ix-helixovou přerušovací částí (podívejte se dále) nebo může být nestejnorodým peptidem.

Pojem α-helixová přerušovací část použitý v textu označuje část, která jestliže je inkorporována do α-helixové struktury přerušuje její spojitost. Takovou částí může být. např. amino kyselinový zbytek prolinu nebo glycinu, (x-methyl substituovaný (x - a m i n o k y s e .1. i n a m i, n e - a - a m i n o k y s e .1 i n a m i j a k o y k 1 i o k ý ni i, t a k i necyklickými, takovými jako kyselina 6-amino-kapronová, kyselin a 3-am i. η o-1 -c y k 1 o k a p ron ová, k y se 1 i n a 4-am i no-1 -c y k 1 o k a p ron ová, nebo L- nebo D- optický izomer inkorporovaný do α-helixového úseku tvořený úsekem amino kyselinových zbytků opačného optického i zornéru.

Pojem patogenní buňky použitý v textu označuje buňky, které vznikají v těle nepřirozeně, tyto buňky zahrnují buňky rakoviny a patogenní organismy, takové jako bakterie, houby, prvoci, viry a mykoplasma, stejně jako savčí buňky napadené patogenními organismy, takovými jako parazitičtí prvoci, např. Leishmania a Plasmodium.

Pojem selektivní cytolytícké účinky použitý v textu označuje účinky činidla během vyvolané cytolýzy patogenní buňky, selektivita se projevuje tak, že činidlo je schopno vyvolat cytolýzu patogenních buněk v mnohem nižší koncentrací než je koncentrace požadována pro cytolýzu normálních nepatogenních buněk, takových jako červené krevní buňky.

Pojem nehemoiytická použitý v textu označuje činidla, které vyvolávající hemolýzu červených krevních buněk v mnohem vyšší . koncentraci než je koncentrace požadovaná pro vyvolání cytolýzy jiných buněk, takových jako patogenní buňky, např. buňky mikroorganismů, rakovinné buňky a podobné.

Pojem diastereomery použitý v textu označuje synonymum • * ·· ·· ·· nejstejnorodého peptidu.

Podstata vynálezu

Před ložený vynález poskytuje nehemolytické cytolytické činidlo valené z peptidu, komplexu svázaných peptidů, směsi peptidů nebo nahodilého kopolymerů peptidů, uvedené činidlo mající selektivní cytolytické účinky projevující se v tom, že činidlo má o y to 1y t i o k é úč i n k y n a pa to geη η í bu ňk y p ředs ta v u jící bu ήk y, k teré se v těle nevyskytují přirozeně zahrnující mikrobiální patogenní organismy a zhoubné buňky; a činidlo je nehemolytické, totiž nemá žádné cytolytické účinky na červené krevní buňky nebo má cytolytické účinky na červené krevní buňky v koncentracích, které jsou podstatně vyšší než koncentrace při které projevují uvedené cytolytické účinky; uvedené nehemolytické cytolytické činidla je valena ze skupiny zahrnující:

(1) cyklický derivát peptidu mající čistý pozitivní náboj, který j e vy š š ί n e ž +1, a o b s a h u j ί o í j a k L ·· a m i n o k y s e 1 i n o v é z b y t k y, tak i D-amino kyselinové zbytky, nebo obsahující buď L••amino kyselinové zbytky nebo D-amino kyselinové zbytky nebo oba tyto typy a obsahující «-helixovou přerušovací část;

(2) peptid obsahující jak L.-amino kyselinové zbytky, tak i D-amino kyselinové zbytky, mající čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1, a mající posloupnost amino kyselin t a k o v o u , ž e o d ρ o v í d a j ί c ί p o s I o u ρ n o s t a m i. n o k y s e 1 i n o b s a h u j í c í pouze L-amino kyselinové zbytky se v přírodě nevyskytuje, a jeho cyklické deriváty;

(3) komplex obsahující velké množství 2 nebo více nehemolytických cytolytických peptidů, každý peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1, a obsahuje jak L-amino kyselinové zbytky, tak i D-amino kyselinové zbytky, nebo obsahuje buď

L-amino kyselinové zbytky nebo D-amino kyselinové zbytky nebo oba tyto typy a obsahuje «-helixovou přerušovací část, nebo • · · • · • · jeho cyklické deriváty, uvedené peptidy jsou společně provázané použitím spojovací molekuly kovalentně vázané ke každému z peptidů;

(4) směs obsahující velké množství 2 nebo více nehemolytických cytolytických peptidů, každý peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1, a obsahuje jak L-amino kyselinové zbytky, tak .i. D-amino kyselinové zbytky nebo obsahuje buď L-amino kyselinové zbytky nebo D-amino kyselinové zbytky nebo oba tyto typy a obsahuje α-helixovou přerušovací část, nebo j e j í cy k1 ické d eri váty; a (5) neuspořádaný kopolymer obsahující různé poměry hydrofobní, pozitivně nabité a D-amino kyseliny.

Podle jednoho celku jsou cyklické deriváty výše uvedeného bodu (1) o d v o z e n y z n e s e 1 e k t. i v η í h o c y t o 1 y t. i c k é h o p ř í r o d η í h o p e p t i d u, takového jako např. pardaxin a mellitin, nebo z jeho části. Tyto c y k .1 i c k é d i a s t e r e o m e r y j s o u z í s k á v á n y běž n ý m i m e t o d a m i. c y k 1 i z a c e peptidů. Podle jednoho celku je cyklický diastereomer odvozen z části 1 až 22 pardaxinu, ke kterému byly dodány í až 3 Lys zbytky k N-koncové části a zbytky cysteinu byly dodány jak k N-koncové části, tak i k C-koncové části z důvodu cyklizace.

Čistý pozitivní náboj peptidů může být díky přírodnímu amino k y s e 1 i n o v é m u s 1 o ž e η í, díky n e u t r a 1 i z a c i v o 1 n ý c h k a r b o x y 1 o v ý c h skupin a/nebo díky dodání pozitivně nabitých amino kyselinových z I::í y t k ΰ n e b o p o z i t i v n ě n a b i t. ý o h c h e m i c k ý c h s k u p .i. n.

V da 1 š í m ce 1 k u vy n á 1 e z z a bez peču .:i e n ehemo 1 y t i c ký cy t o 1 y t .i c k ý peptid a jeho cyklické deriváty definované v bodě (2) výše mající n á s 1 e d u jící c h a r a k t e r i s t. i k y s (a) p e p i i d j e n e p ř i r o z e n ý m s y n t e t i c k ý m p e p t i. d e m t v o ř e n ý m r ů z n ý m i poměry alespoň jedné hydrofobní mino kyseliny a alespoň jedné pozitivně nabité amino kyseliny, ve kterém posloupnost alespoň jednoho z amino kyselinových zbytků je D-amino kyselina;

(b) peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +í; a (c) poměr hydrofobních k. pozitivně nabitým amino kyselinám je • ·· · · · · ··· ··· ···· · • ·· · · ·· ·· ·· · · takový, aby peptid vyvolával cytolytické účinky k patogenním buňkám, ale nevyvolával cytolýzu červených krevních buněk. Příklady pozitivně nabitých amino kyselin představují lysin, arginin a histidin a hydrofobních amino kyselin představují leucin, isoleucin, glycin, alanin, valin, fenylalanin, prolin, tyrosin a tryptofan. Čistý pozitivní náboj je přítomen díky amino kyselinovému složení, ale dodání pozitivně nabitých chemických skupin může být také zvažováno,, V dodatku, polární amino kyseliny takové jako serin, threonin, methionin, asparagin, glutamin a cystein mohou být dodány s cílem snížení hydrofobnosti a/nebo toxicity molekuly. Ve výhodném celku je peptid tvořen jednou hydrofobní amino kyselinou, takovou jako leucin, alanin nebo valin a jednou pozitivně nabitou amino kyselinou, takovou jako lysin nebo arginin,, Syntetický nepři rodní peptid může mít alespoň 6, výhodně 10 nebo více amino kyselinových zbytků. Syntetický diastereomer podle výhodného celku představuje 12·- mer- peptid tvořený leucinem, alaninem nebo valinem a lysinem, s alespoň j e d n o u t e t i. n o u j e h o p o s 1 o u p n o s t i t v o ř e η a u D - a m i n o kyselina m i „ Vynález v jeho dalším celku poskytuje nehemolytický cytolytický komplex podle definice bodu (3) výše obsahující velké množství 2 nebo více nehemolytických cytolytických peptidů spojených nebo '' s váza ný ch¹¹ do h romady, na př. po u žití m spo j o v a cί ne bo ¹¹ m a tri c o vé molekuly kovalentně vázané na každý z peptidů,, Svazek může být složen ze nebo více, výhodně 5, molekul stejného peptidu nebo různých peptidů. Spojovačem/matricí může být peptid vynálezu nebo běžně používané spojovače, např, polymery, takové jako polyestery, polyamidy, pólypeptidy, polyaminokyseliny (např. polylysin) n e s o u c í a k i i v η í s k u p i n y, t a k o v é j a k o 0 Η, S H , C 0 ϋ Η, M Ha , C Ha B r „

V dalším výhodném celku vynález poskytuje nehemolytickou cytolytickou směs podle definice bodu (4) uvedeného výše získanou dodáním směsi tvořené z 1 ekvivalentu každé z požadovaných hydrofobních, pozitivně nabitých a D-amino kyselin v každém kroku interakce pevné fázové metody syntézy peptidů. Tímto způsobem ·· ·· byla získána směs ze 3*2 různých peptidů promícháním lysinu, leucinu a D-leucinu a po HF (vysoko frekvenčním) štěpení, extrakci s vodou a lyofilizaci byla z táto směsi získána hydrofilní směs.

V dalším celku vynález poskytuje nehemolytický cytolytický náhodný kopolymer podle definice bodu (5) výše obsahující různě poměry hydrofobní, pozitivně nabité a D-amino kyseliny, např. ls lal, 2:1:1 a 3:1:1 (mol) kopolymery posloupnosti Lys;Leu:D”Leu. Přednostně, nehemolytický cytolytický peptid nemá žádnou íx - h e I i o v o u s i r u k t u r u n e b o ni á « - h e 1 i x o v o u s t r u k t u r u, k t e r é d é 1 k a není dostatečná pro překlenutí šířky buněčné membrány. Peptid tedy neobsahuje nepřerušený úsek buď všech D~ nebo všech L-- amino kyselinových zbytků délky schopné tvořit část transmembránového póru. Taková délka je běžně přibližně 20 až 22 amino kyselin, pokud tento úsek není v konečné části peptidu a přibližně polovinu, tj. 10 až 11 amino kyselin, pokud je úsek konečnou částí peptidů, protože v takovém případě dva peptidy mohou spojit jejich konečné části dohromady a překlenout buněčnou membránu. Přerušení úseku D- nebo L- amino kyselinových zbytků může být provedeno zaměněním jedné nebo více amino kyselin v úseku amino kyselinou opačného optického izomerů nebo umístěním (x-helixové přerušovací části do spojitého úseku, takové jako prolin, glycin, k y s e 1 i n a <x - m e t h y I -«a m i η o n e b o k y s e 1 i n a ne- a - a m i. n o.

Peptidy podle vynálezu a peptidy obsažené v komplexech, směsi a kopolymery vynálezu mají čistý pozitivní náboj vyšší než +1. Čistý pozitivní náboj může být přítomen díky složení přírodních amino kyselin vynálezu, neutralizaci volných COOH skupin, např. amidací, nebo vzhledem k dodání pozitivně nabitých amino kyselin nebo chemických skupin., Bylo shledáno, že selektivní cytolytické účinky mohou být občas zvýšeny přírůstkem čistého pozitivního náboje, např, připojením molekuly pozitivně nabité amino kyseliny a/nebo pozitivně nabité skupiny na jakoukoliv pozici. Např. polyaminová skupina, alkylamino skupina nebo aminoalkylamino • · · · · · · ····· · · ·· ·· skupina, atd. mohou být připojeny k jedné z jeho koncových částí, běžně k jeho karboxylové koncové části. Výhodné skupiny zahrnují aminoethylamina skupinu -IMH-CHs “NHs, která je dále v textu označována jako 77Γ.

Peptidy, které jsou odvozeny z neselektivních cytolytických přírodních peptidů, např. pardaxinu a mellitinu, jsou amfipatické, což znamená, že tyto mají jednu povrchovou vrstvu, která je tvořena hlavně hydrofobními amino kyselinovými zbytky a opačnou povrchovou vrstvu, která je tvořena hlavně hydrofilními amino kyselinovými zbytky. Amfipatická přirozenost peptidů může ověřena metodami známými ze současného stavu techniky. Příkladem i a k o v é meto d y j e p o u ž i i í S h iffe r-Edmon d sonova kru hové pro j ekce, ve které jsou amino kyselinové zbytky zapsány podle jejich posloupnosti v kruhu tak, že každá amino kyselina v posloupnosti je úhlově posunuta o 100 o od jejich sousedících amino kyselinových zbytků (3,6 amino kyselin na jeden kruh). Pokud je na jedné straně kruhu nejvyšší koncentrace hydrofilních amino kyselin a nejvyšší koncentrace hydrofobních amino kyselin je na opačné straně kruhu, potom peptid může být považován za amfipatický. Peptidy vynálezu, které nejsou odvozeny z neselektivních cyto 1 ytických přirozených peptidů, např. syntetické d.i.astereomery t v o ř e n é h y d r o f o b η ί, p o z i. t i v n ě n a b i. t o u a D.....a m i n o k y s e 1 i n a m i n e j s o u amfipatické. Tyto mají čistý pozitivní náboj vyšší než +1 a vhodný poměr hydrofobní k pozitivně nabité amino kyselině takový, aby výsledný peptid byl. cytolytický k patogenním buňkám, ale ne hernolyt.ický. Tyto peptidy mohou být podle vynálezu zkoumány velmi jednoduše použitím antibakteriálních a hemolytických testů popsaných v dále tomto textu. Podle jednoho celku vynálezu může být vhodný poměr peptidu složeného z leucinu a lysinu Leu:Lys 64 7.

: 36 7, pra diastereomer ze 6 amino kyselinových zbytků a 66 Z : 34· 7. pro diastereomer ze 12 amino kyselinových zbytků.

Je domněnkou, bez teoretického omezení, že cytolytické účinky mohou být vyvolány nahromaděním řady peptidů na povrchové vrstvě • · · • · membrány, které společně mohou být příčinou poškození buněčné membrány. V souladu s tím a podle popisu uvedeného výše je také zvažováno použití velkého množství peptidů vynálezu buď ve směsi nebo spojené (nebo svázané) dohromady, např. použitím spojovací molekuly kovalentně vázané ke každému z peptidů.

Jednotlivý peptid běžně obsahuje alespoň 6 a výhodně 10 nebo více amino kyselinových zbytků. Podle vynálezu může každý jednotlivý peptid mít běžně délku přibližně 5 amino kyselinových zbytků. Předložený vynález také poskytuje farmaceutický prostředek obsahující nehemolytický cytolytický peptid vynálezu jako aktivní příměs a farmaceuticky akceptovatelný nosič. Prostředky jsou určeny pro použití při ošetření chorob a nemocí způsobených různými patogenními organismy, takovými jako grampozitivní a gramnegativní bakterie, viry, houby, mykoplasma a parazitičtí prváci, např. druhu Leishmania, které jsou příčinou leischmaniózy a druhu Plasmodium, které jsou příčinou malárie. Ve výhodném c e 1 k u j e a n t i p a t o g e η η í p r o s i ř e d e k a n t i m i k r o b :i. á 1 n í m, pře d e v š í m an ti bakte ri. á 1 n í m p rostřed k em „ V d od a t k u, prostřed k y vy ná 1 e z u j sou použitelné proti zhoubným buňkám a mohou být použity při ošetření rakoviny.

Předložený vynález také popisuje metodu ošetření zahrnující podá.....

v á n í u v e d e n é h o h e m o 1 y t i c k é h o n e c y t o 1 y t i c k é h o p e p t i d u o š e t ř o v a n é m u subjektu. Metoda vynálezu stejně jako výše zmíněný prostředek j s o u a ρ 1 i k o vatě 1 n é jak v lékař s t ví tak i v e t e r i. n á r n í m e d i. c í n ě«

V souladu s vynálezem je poskytnuto také použití uvedeného nehem o .1 y t i c k é h o c y t o 1 y t i c k é h o p e p t i d u v p ř í p r a v ě fa r m a c e u t i c k é h o prostředku určeného pro ošetření chorob nebo nemocí v lidském n e b o z v í ř e c í m t ě 1 e, d e t a i 1 n ě j i a n t i b a k t e r i á 1 n í c h p r o s t ř e d k ů.

V dalším celku mohou být selektivní peptidy vynálezu použity jako dezinfekční prostředek pro ničení mikroorganismů, tj. peptid může být použit jako ochranný prostředek v roztoku pro smáčení kontaktních čoček, dále v kosmetickém nebo potravinářském průmyslu a také jako pesticid, např. fungicid, baktericid • · · ·· ·· ♦♦ *· ··· · · ·· · · ·· · • · · ···· «··· • · ··· ·« ·· ··· ·«· • · · ·«·· · · ♦ ···· ·· ·· ·· ·· v zemědělství nebo pro ochranu zemědělských produktů, např. ovoce a zeleniny.

Současní vědci překvapivě zjistily, že nestejnorodé L--základní peptidy mají selektivní cytolytické účinky projevující se selektivním ničením patogenních buněk, např. bakterií, s malým nebo žádným vlivem na nepatogenní buňky, tj. červené krevní buňky. Tento objev je velmi překvapující z pohledu dosavadní domněnky vyplývající ze současném stavu techniky, že cytolytické normálních savčích buňkách, vyplývá z jednoduchého skrytého mec han ismu spoj eného s tx-he 1 i xovou kon f i gurac í „

Studie funkcí a struktury inkorporovaných analogů D-amino kyselin (diastereomerů) pardaxinu a mel litinu, dvou známých buněčně neselektivních cytolysinů, provedené s cílem objasnit molekulární m e c h a n i s m u s s k r ý v a j í c í s e z a b u n ě č n o u s e 1 e k i i v i t o u u k a z u j ί, ž e vý s1ed n é di as te reomery nemá j í z achovan ou j e j i ch a-he1 i k á1η í s t r u k i u r u, <::: o ž je p ř í č i n o u p o 11 a č e η í j e j i <::: h c y t o i o i c k ý c h ú č i n k ů k s a v č í m b u ň k á m. A v š a k, d i a s t e r e o m e r y s i z a c h o v á v a j í v y s o k é a n i i bakteriální účinky, které se projevily ucelenou lýzou jak grampoz i t i v η í c h t a k i g r a m n e g a t i v η í c h b a k t. e r i í. tx - h e 1 i. k á 1 η í s t r u k i u r a P a i'- d a x i n u a m e 11 i t i n u b y 1 a u k á z á n a jak o d ů 1 e ž i t á p o d m ί n k a p r o cytotoxicitu k savčím buňkám, ale ne jako nezbytná podmínka a k t i b akte r i. á 1 η í h o p ů s o b e η í. Avšak, s a m o s t a i n á D.....a m i n o k y s e 1 i n a

i. n k o r p o r o v a n á d o n e h e m o 1 y t i c k é h o a n t i b a k t e r i á 1 n i h o p e p i i. d u magaininu eliminovala podle dalších studií téměř zcela jeho antibakteriální účinky (Chen a spal,,, 1988),, Výsledky získané na tomto místě s di.astereomery pardaxinu a me 11 i tinu podotýka j ί, že hydrofobnost a čistý pozitivní náboj dává neselektivním c y t o 1 y i i c k ý m p e p i i d ů m s e 1 e k t i v η í a n i i b a k t e r i á 1 η í ú č i n k y, až e amfipatická tx-helikální struktura není nutně požadována. Avšak, diastereomery pardaxinu a mellitinu obsahovaly dlouhé úseky L-amino kyselin (14 až 17 amino kyselin dlouhé), které zvyšovaly možnost vzniku membránové vazby a destabilizace přítomností malé, ale možně dostatečné, zbytkové helicity.

• ·« « · • · · · · · • * · * * · · ··

Pro zkoušku modulace hydrofobnosti a čistého pozitivního náboje lineárních cytotoxických peptidů, která dostatečné ověří jejich selektivní antibakteriální účinky, byly prověřeny diastereomery peptidů krátkého modelu (12 amino kyselin dlouhé) tvořené různými poměry leucinu a lysinu s jednou třetinou jejich posloupností tvořenou D-amino kyselinami» Délka peptidu a pozice D-amino kyselin byly takové, aby byly vytvořeny krátké peptidy s velmi krátkými posloupnými úseky 1 až 3 L.-amino kyselin, které nebyly schopné tvořit α-helikální strukturu» Diastereomery byly hodnocen y z po h 1 edu n a (1) j ej ic h cy t.o to x ic i tu p roti bak teri í m a 1 i dsk.ý m erytrocytům, (2) jejich strukturu a (3) jejich schopnost vzájemně působit, a rozrušovat morfologii bakteriální hradby a modelové fosfolipidy membrán» Údaje ukazují, že modulace hydrofobnosti a pozitivního náboje je dostatečná pro ověření antibakteriálních účinků a cytolytické selektivity» Dále, výsledné antibakteriální P e p t i d y p ů s o b í s y n e r g i. c k y v n e ···· s m r t e 1 n ý c h k o n c ent r a <::: í c h s dostupnými antibakteriálními léky, takovými jako tetracyklin, a dále jsou zcela odolné proti inaktivaci lidským sérem, které drasticky snižuje aktivitu přírodních antibakteriálních peptidů» Dále byly připraveny a zkoušeny krátké diastereomery (6 amino kyselin a Ei amino kyselin dlouhé), které byly shledány jako nehe.....

m o 1 y t i c k é c y t o 1 y t i c k é „ b j e v j i s t ý c h c y t. o 1 y i i c k ý c h n e h e 1 i k á I η í c h p e p t i. d ů m a j í c í c h a n t i. P a t o g e η η í ú č i n k y za h r n u je z p ů s o b p ř í p r a v y a n t i - p a t o g e η η í o h č i n i ····· d e 1. o b s a h u j í c í c h t a k o v é n e h e 1 i k á 1. η ί p o 1 y p e p t i d y» P o k u d j s o u n e h e.....

likální peptidy nesourodými peptidy složenými jak z I....-·amino kyše.....

lin tak i D-amino kyselin, anti-patogenní činidla mají na jedné straně dodatečnou výhodu tu, že jsou více odolné proti rozkladu, např. proteázou, než stejnorodé L-peptidy, ale na druhé straně nejsou zcela odolné proti rozkladu jako plně stejnorodé

D-peptidy. Odolnost, proti rozkladu může být nevýhodou z pohledu pomalého vylučování z těla s možnými přidruženými následnými toxickými postranními vlivy. Ne-a-helikální antipatogenní peptidy • ·« • · · v • 4 · • · « · • · * · Λ Λ «· mohou být použity v různých terapeutických procedurách.

Protože je známá, že stejnorodá D-peptidy mají především shodná cytolytická účinky jako stejnorodé L-peptidy (Bessalle a spol., 1990), potom je? v souladu s tím jasná, že nestejnorodá B~založená peptidy mají stejná anti-patogenní vlastnosti jako nestejnorodá L--založené peptidy.

Objev, tj. skutečnost, že určitá ne-a-helikální peptidy mají cytolytická účinky proti bakteriím bez cytolytickým účinkům proti červeným krevním buňkám, je založen na skutečnosti, že bakteriální buňky se liší od červených krevních buněk ve složení jejich buněčných membrán. Rozdíly ve složení buněčná membrány mohou být taká shledány mezi řadou patogenních buněk, takových jako rakovinná buňky a normální buňky. Podle objevu předloženého vy n á 1 e z u, ted y č i n .i. d 1 a p řed 1 o ž en á ho vy n á 1 e z u z a k 1 ád a j í z půso b vývoje různých léčiv majících selektivní cytolytická účinky proti jedná třídě buněk uvnitř těla, takových jako bakteriální buňky, buňky parazitů, buňky hub, buňky prváků nebo rakovinová buňky, s m a 1 ý m i n e b α ž á d n ý ni i ú č i n k y p r o t i n e - p a i o g e η η í m b u ň k á m η o r m á 1 η í ho těla.

Ne-hemolytická cytolytická činidla podle vynálezu mající selektivní cytolytická účinky proti patogenním buňkám a mající mnohem nižší nebo žádná cytolytická účinky proti, normálním, ne-patogenním buňkám, mohou být použity pro různá terapeutická a ρ 1 i k a c e i) e z n e b o s m a 1 ý m t o ;·; i. c k ý m p o s t r a η η í m v 1 i. v e m.

Cyklická peptidy jedná skupiny v souladu s vynálezem jsou o d v o z e n y z n e - tx - h e 1 i. k á 1 η í c h n e s t e j n o r o d ý c h p e p t i d ů o d v o z e n ý c h z e stejnorodých peptidů s α-helikální strukturou majících široká rozmezí cytolytických účinků. Předložený vynález tímto poskytuje v souladu s jedním celkem nestejnorodý cyklický derivát peptidu obsahující D- a L- amino kyselinová zbytky mající posloupnost takovou, že stejnorodý peptid s otevřeným řetězcem obsahující pouze L- nebo pouze D- amino kyselinové zbytky a mající stejnou posloupnost amino kyselin jako uvedený nestejnorodý peptid, má flfl • · α-helikální strukturu a má široké spektrum cytolytických účinků projevujících se na řadě buněk; uvedený nestejnorodý cyklický peptid projevuje cytolytické účinky pouze k některým z buněk, ke kterým je uvedený stejnorodý peptid cytolyticky aktivní. Např.

cytolytické účinky nestejnorodého cyklického peptidů se projevují • flfl • »· • <

• · ·· · ·* • · · · » 9 t · · • · · fl flfl flfl ·· fl· • ·· · • e · · • · * · · · • · ·« ·« pouze k patogenním buňkám, zatímco tento peptid zůstává k normálním buňkám, takovým jako červené krevní buňky, necytolytický.

Příklady nehemolytických cytolytické cyklických peptidů v souladu s vynálezem jsou odvozeny z přírodních peptidů, které mají a-helikální strukturu a mají cytolytické účinky. Ne-a-helikální peptidy podle vynálezu mají posloupnost především odpovídající celé nebo částečné posloupnosti přírodního peptidů, ve kterém D-amino kyseliny jsou inkorpárovány podél N- a C- helixů molekuly a čistý pozitivní náboj je získán buď dodáním pozitivně nabitého a m i n o k y s e 1 i n o v é h o z b y t k u, n a p ř. 1 y s i. n u, a r g i n :i. n u, h i s i i. d i n u, např. na N- koncovou jednotku a/nebo pozitivně nabité skupiny, n a p ř. a m i n o a 1 k. y 1 a m i n o s k u p i n y, t a k o v é j a k o a m i n o e t h y 1 a i rt i η o, n a p ř. na C- koncovou jednotku molekuly nebo neutralizací valných karba;·: y 1 o v ý c h s k u p i η, n a p ř „ p ř e m ě n o u t ě c h t o s k u p i. η n a a m i d o v é s k u p i n y. Pří k lady t a k o v ý c h p ř i r o zených p e p t i d ů j s o u m e 11 i. t i n a p a r d a ;·; i n a jejich fragmenty.

Např. ne-a-helikální cyklický peptid může být odvozen z p a i' d a i n u, k t e r ý je 3 3 ····· m e r p e p t i d, n e b o z m e 11 i t i n u, k t e r ý je 2 6 - m e r p e p t i. d, n e - a - h e 1 i k á 1 n í c y k 1 i c k ý p e p t i d m úže b ý t 3 3 - m e r n e b o 2 6.....me r pe p ti d o bsa hu j í cí po s1 o upnost o d povida j í c í ce1é p o s 1 o u p n o s t i p a r d a i. n u n e b o m e 11 i t i n u, j e d n o 11 i v ě, n e b o můž e b ý t n e h e1 i k á1n í c y k1 i c ký pe p i i d ma j í c í po sIou pnost odpovídající částečné posloupnosti, pardaxinu nebo mellitinu, např. 8 až 23 mer ' mel litinovou posloupnost. V případě nestejnorodého cyklického peptidů odvozeného z pardaxinu, nestejnorodý cyklický peptid v souladu s vynálezem může obsahovat částečnou posloupnost odpovídající posloupnosti pardaxinu obsahující nejméně 10 amino kyselinových zbytků a mající rozmezí mezi 10 a 24 amino kyselinovými zbytky.

Další skupinou peptidů v souladu s vynálezem jsou nehelikální peptidy, které mají posloupnost obsahující nepřirozené homoiagy a které jsou tvořeny alespoň jednou hydrofobní a alespoň jednou pozitivně nabitou amino kyselinou, a ve kterých posloupnost alespoň jednoho amino kyselinového zbytku je D- amino kyselina, Předešlá studia modelů peptidu vysvětlovaly strukturální a funkční studie antibakteriálních peptidů zaměřené na tři parametry; helikální strukturu, hydrofobnost a náboj (Anzai a spal., 1991; Agawa a spal., 1991), Každá změna jednoho z těchto parametrů má současně za následek změny dalších dvou, určit jednoznačný podíl každého parametru na celkových antibakteriálních účincích je tedy velmi složité, 9 souladu s předloženým vynálezem byl vliv helikální struktury vyloučen, studie byly tedy zaměřeny pouze na dva parametry, jmenovitě hydrofobnost a čistý Ρ o z i t i v π ί n á b o j, o v I i v n i t e 1 n é z m ě n o u p o m ě r u 1 e u c i n u a 1 y s i. n u „ P r o úč e1y vý z k umy by 1 y vy b r ány mod e1y di as t e r eome r ů k rá t ký ch pe pt i dů (12 amino kyselin dlouhé) obsahující úseky pouze 1 až 3 návazných L~ amino kyselin, které jsou pra vytvoření «“helikální struktury příliš krátké,,

CD spektroskopie ukázala, že tyto Leu/Lys diastereomery sani o z ř e j m ě z c e 1 a p o s t r á d a j í « ~ h e 1 i k á 1 η í s t r u k t u r u (ú d a j e n e j s o u u vede n y ), n e p o d a b n ě k d i a s t e r e o m e r ů m m e 11 i. t i n u a p a r d a i n u p o d 1 e vynálezu, ve kterých zůstává malá část «.....helikální struktury,,

M i c m é n ě, I.... e u /1.... y s d i a s t e r e o m e r y p r o jev u j í s i 1 n é ant i b akte r i. á 1 η í účinky, které jsou podobné nebo větší než účinky přirazených • antibakteriálních peptidů, takových jako dermaseptin S nebo anti“ biotický lék tetracyklin, Nejvíce účinné peptidy

CD]-L3’4,8₇io-K4L₈ a LD]”L3’4’8,ío-k_el₇ (peptid jednotlivě, příklad 3 uvedený v textu) byly zbaveny hemolytických účinků proti vysoce cytolyticky-náchyIným lidským erytrocytům. Mělo by být zmíněno, že CDLI-L³’⁴’ ío-KbL? (peptid 22) je zbaven • · · · · · • · · · • · · · · · ··· ·· ·· ·· «-helikální struktury, ale projevuje značné hemolytické účinky, které jsou srovnatelné s účinky přírodního cytolytického peptidu, pardaxinu. Tato skutečnost by mohla znamenat, že rovnováha mezi hydrofobností a pozitivním nábojem vyvažuje amfipatickou «-helikální strukturu. Zvyšující se pozitivní náboj však drasticky snižuje hemolytické účinky, přičemž antibakteriální účinky zůstávají zachovány, což znamená, že amfipatická α-helikální struktura není pro antibakteriální účinky nezbytná. Vnitřní působení Leu/Lys diastereomerů s negativně nabitými i zWitteriontovými fosfolipidovými membránami bylo zkoušeno s cílem objasnit podstatu jejich selektivní cytotoxicity proti bakteriím. Negativně nabité PE/PG vezikuly byly použity pro simulaci lipidového prostředku E, coli (Shaw, 1974) a zwitteriontové F'C vezikuly byly použity pro simulaci vnějšího obalu lidských erytrocytů (Verkleij a spol., 1973). Biologické účinky Leu/Lys peptidů na erytrocyty (obrázek 12) a E. coli (tabulka 5) dobře koreluje ve vztahu s jejich schopností pronikat modelovou membrán o u „ P e p t i d, k t e r ý p r o n ;i. k 1 P C v e z i k u I y, b y 1 p e p t i d e m m a j í c í m značné hemolytické účinky. Tyto výsledky ukazují, že fosfolipidové složení bakteriálních membrán je funkcí důležitou pro prop u s i n o s t t é t o s k u p .i. n u a n t i b a k teriálních p e p t i d ů» S c h α ρ n o s t a n t i bakteriálních a nehemolytických peptidů vázat a pronikat nega.....

tivně nabité, ne však zwitteriontové, fosfolipidové vezikuly, je c h a i' akte r i s t i k o u p ř í r o d η í c h a n t i b akte r i á 1 η í c h p e p t i d ů (G a z i t a spol,,, 1994) přisuzovanou obsahu 1 i papaly sacharidů (LPS, u g i' amnegativn í c h b akte r i í c h) a ρ o 1 y s a c h a r i d ů (k y s e 1 i n a t e i c h o o v á u grampozitivních bakteriích) ve? vnějších vrstvách bakterií a fosfatidyIglycerolu (PG) ve vnitřních membránách bakterií, všechny tyto jsou negativně nabity, zatímco normální eukaryontní buňky, takové jako erytrocyty, převážně obsahují zwitteriontový fosfolipid PC na jejich vnějším obalu.

Antibakteriální peptid magaininu je nehemolytický peptidem, zatímco mellitin, pardaxin a modelový peptid s posloupností podobnou jako u ED3—L³ ’⁴ ’β , ío-K₄|_8 , ale tvořený pouze L.-amino kyselinami, jsou hemolytické především díky jejich vysoké hydrofobnosti. Pakliže «-helikální struktura magaininu byla přerušena inkorporací tří D-amino kyselin, výsledný diastereomer neměl žádné antibakteriální účinky (Chen a spol., 1988), přestože jeho pozitivní náboj byl podobný pozitivnímu náboji přírodního magaininu. Optimální rovnováha, která již existuje mezi «-helikální strukturou, hydrofobností a čistým pozitivním nábojem přírodního magaininu, takto umožňuje selektivní antibakteriální účinky a jakákoliv změna jedné z těchto tří vlastností by mohla být příčinou ztráty antibakteriálních účinků magaininu, V protikladu, hydroťobnost pravděpodobně hraje důležitou roli při ztrátě α-helikální struktury v mellitinu, pardaxinu a Leu/Lys d i a s i e r e o m e r ů v y n á 1 e z u.

V ý s1edky v sou1adu s vy n áIez em n avr hu j í novou s t ra te g i i vý vo j e n o v é h o i' o z s a h u k r á t k ý c h, j e d n o d u c h ý c h a s n a d n o m a n i p u 1 ovát e 1 n ý c h a n t i b a k t e r i. á 1 η í c h p e p i. i d ů. K a ž d ý d i a s i e r e o m e r .1. c k ý m o d e 1 L. e u /1.... y s p e p i i d ů m á je d η o z n a č n é s p e k t r u m ú č i. n k ů (t a b u 1 k a 5). E x i s t e n c e u c e 1 e n é ř a d y d i a s t e r e o m e r i c k ý c h a n t i b a k t e r i á 1 η í c h p e p t i d ů b u d e umožňovat výběr nejvíce efektivního peptidu s ohledem na cílovou buňku. Dále, souběžná aplikace složených forem diastereomerů peptidů, působících odděleně nebo společně, má také selektivní zbytkovou hodnotu a zabezpečuje lepší ochranu proti široké škále i n f e k č η í c h m i k r o b ů, Vše c h n y I.... e u / L y s d i a s t e r e o m e r y p r o jev o vály zvýšené a n t i b akte r i á 1 η í ú č i n k y p r o ti. g r a m p o z i t i v η í m b akte r i. í m v porovnání s gramnegativnimi bakteriemi. Tyto výsledky jsou důležité uvážíme-li zvyšující se odolnost grampozitivních bakterií, takových jako Staphylacoccus aureus, ent&rcicacci a pneumococci na běžná antibiotika (Russell a spol,, 1995). V dodatku oproti, přírodnímu antibakteriálnímu peptidu - dermaseptinu S, CD1-L³’⁴’⁸’ío-KeL? (peptid 24) si zachovává své antibakteriální účinky i při přítomnosti usazeného lidského séra.

Diastereomerické peptidy by měly mít oproti známým · · · · ·· · · • · • ·· · ··· · · · ··· ···· · ····· ·· ·· · · ·· antibakteriálním peptidům několik výhod: (1) peptidy by neměly mít různé patologické a farmakologioké vlivy vyvolané α-helikálními lytickými cytolysiny. Např. staphy lococcus

S-toKin, antibakteriální peptid alamethicin, ochranný usměrněný lytický faktor a pardaxin vyvolávají několik histopatologických vlivů na různé buňky prostřednictvím vytváření pórů a aktivace kaskády kyseliny arachidonové. Avšak, diastereomery pardaxinu nevyvolávají tyto účinky. V dodatku, mnoho amfipatických α-helikálních peptidů se váže na ka 1 modu.1 in a vyvolávají něko.1 ik buněčných reakc. ί, ste jně jako všechny D-amino kyselinové «-helixy zahrnující mellitin mají podobné účinky (Fisher a spol., 1994). Diastereomery s přerušenou α-helikální strukturou se pravděpodobně neváží na kalmodulin; (2) místní substituce D-amino kyselinou by vedla ke kontrolovanému čištění antibakteriálních peptidů proteolytickými enzymy na rozdíl od celkové ochrany požadované úplnou substitucí D-amino kyselin (Wade a spol., 1990). Celková odolnost lytických peptidů P r o t i i' o z p a d u je v ý h o d n á p r o t e r a p e u t i c k é p o u ž i t í „ D á 1 e, a n t i g e n i t a k r á i. k ý o h f r a g m e n t ů o b s a h u j ί o í c h D, L. a m i n o k y s e 1 i n y j e d r a maticky pozměněna v porovnání s jejich plně L- nebo D- amino kyselinovými výchozími molekulami (Denkirane a spol., 1993); (3) celkový útlum růstu bakterií vyvolaný diastereomery je spojován s celkovou lýzou bakteriální stěny, což je ukázána díky elektronové mikroskopii (obrázek 14)„ Proto bakterie nemohou snadno vy.....

vinout odolnost proti lékům a vyvolat ničivý mechanismus; (4) L D ] - LP ''^{4 1 s 110} - Ke I....? ( p e p t i d 2 4) m á s c h o ρ n o s t p r o n i k n o u t b u n ě č n o u stěnu bakterie v koncentracích nižších než je jejich MIC, což vití ě t po m o c í eIe k t ro n ov é m i k ros k o p i e (o b rá z e k 14)„ Sou bě ž n á a ρ1 i k ace klinicky používaných antibiotik, které nemají účinky vzhledem k jejich neschopnosti proniknout buněčnou stěnou bakterie, společně s peptidem 24 může dávat řešení tohoto mechanismu odolnosti bakterie.

Vynález bude dále v textu doplněn poznámkami k některým nákresům • · • · · · · · • · a příkladům, které však nejsou nikterak omezeny.

Prostředky a metody použité v příkladech vynálezu (i) Materiály, Butyloxykarbonyl-(amino kyselina)-(fenylacetamido)--methylová pryskyřice byla získána od Applied Bioszstems (Foster City, CA) a butyloxykarbony1 (Boc) amino kyseliny byly získány od Peninsula Laboratories (Belmont, Ca), Další činidla použitá pro syntézu peptidů zahrnovala kyselinu trifluorooctovou (TFA, Sigma), N,N-diisopropylethylamin (DÍLA, Aldrich, destilovaný přes ninhydrin), dicyklohexylkarbodiimid (DCC, Fluka), 1-hydro xy ben z o t r i a z o1 (Η0Β T, P i e rce) ad i me t hy1f o rmam i d (pe p i i d syntézní značka, Biolab). Vaječný fosfatidylehalin (PC) a fosfatidylserin (PS) z míchy hovězího dobytka (sodná sůl - úroveň I) byly získány od Lipid Products (South Wutfield, U.K.). Vaječný fosfatidylglycerol (PG) a fosfatidylethanolamin (PE) (typ V, z Escherichia coli) byly získány ze Sigmy. Cholesterol (extra čistý) byl dodán od Merck (Darmstadt, Německo) a dvakrát přek r y s i. a 1 i z o v á n z e i h a η o 1 u, 3, 3' - d i e t h y 1 i h i o d i k a r b o c y a n i. n j o d i d [ d i. S ····· Ca - 51 b y 1 z í s k á n o d Μ o 1 e c u I a r P r o b e s (E u g e n e, 0 R). P ř í r o d η í mellitin byl získán ze Sigmy. Obchodně dostupný mellitin obvykle obsahuje stopy fosfolipázy Aa, která vyvolává rychlou hydrolýzu f o s f o 1 i. p i d ů. P r o t o b y 1 a v ě n ována z v 1 á š t η í p o z o r n o s i o d s t r a n ě η í celkové fosfolipázy Aa z mel litinu použitím RP-HPLC, Všechna d a I š í č i n i d 1 a m ě I a a n a 1 y t i c k o u k v a 1 i i u. T1 u m i v é r o z t o k y b y 1. y Ρ ř i p r a v e n y v s o d n o - d r a s e 1 n é m d e s t i. 1 o váném v o d η í m s k 1 e.

(ii) Syntéza a čištění peptidů, Peptidy byly syntetizovány použitím pevné fázové metody aplikované pro buty1oxykarbonyl-(amino kyselina)-( feny lacet.amido)methylovou pryskyřici (0,05 meq) (Merrifield a spol., 1982). Peptidy vázané na pryskyřici byly odštěpeny od pryskyřic použitím fluorovodíku (HF) a po HF odpaření podrobeny extrakci suchým etherem. Tyto surové peptidové přípravy obsahovaly jeden hlavní pík, jak je odhalena prostřednictvím RP-HPLC, pík byl 50 7. až 70 7. hmotn. čistým peptidem. Syntetizované peptidy byly dále čištěny pomocí RP-HPLC na Cis zpětné fázi Bio-Rad polo-preparativní koloně (300 A velikost pórů). Kolona byla eluována po dobu 40 minut použitím přímého spádu 10 7 až 60 7. acetonitrilu ve vodě, obě směsi obsahovaly 0,05 7, TFA (v/v), při rychlosti 1,8 ml/min. Čištěné peptidy, které se prostřednictvím analytické HPLC ukázaly jako stejnorodé (~ 95 Z) byly podrobeny analýze amino kyselin a hmotnostní spektrometrii pro ověření jejich posloupností.

(i i i ) Ί r a n s a m i n a c e p e p t i d ů. P e p t i d y v á z a n é n a p r y s k y ř i c e j a k o v případě (ii) výše byly transaminovány 30 7. ethylendiaminem v BMP po dobu 3 dnů, následovala filtrace pryskyřice, vysrážení chráněných peptidů, jmenovitě aminoethylamino (TA) peptidů, s etherem a odstranění chránících skupin prostřednictvím HP. Syntetické TA-peptidy byly čištěny (> 95 Z stejnorodost) zpětnou fází HPLC na Cis koloně použitím přímého spádu 25 Z až 80 7. aceton i tri lu v 0,1 7 TFA po dobu 40 minut a následně podrobeny amino kyselinové analýze ověřující jejich složení.

( i v) A m i d a c e p e p t i d ů „ P e p t i d v á z a n ý na p r y s k y ř i c i (2 0 m g) b y 1 upravován po dobu 3 dnů směsí složenou z nasyceného roztoku čpavku (30 7«) v methanolu v poměru 1:1 v/v a DM50 (1:1 v/v), což v e d .1 o k a m i. n a c i k a r b o x y 1 á t o v é s k u p i n y g 1 u t. a m i n o v é h o z b y i. k u um í s těné ho na C- k onečné j edno tce C D Ί -’⁸ ,1¹⁷ , K² i -me 11 i. t inu.

Ίa k to by 1 y pe p t i. dy z í s kán y, ve k 11 zůstaly připojené, ale jejichž C jednou amidovou skupinou. Methanol a čpavek byly odpařeny pod proudem dusíku a chráněné peptidy byly podrobeny extrakci z pryskyřice prostřednictvím DM50 a vysráženy suchým etherem. Produkty byly následně podrobeny HF štěpení a dalšímu čištění e i' ý c h vše c h n y <::: h r á n i c í s k u p i n y k o n e č n é z b y t. k y b y 1 y p ř e m ě n ě n y použitím RP-HPLC podle popisu uvedeného výše.

(v) Příprava lipidových vezikul. Malé jednotně lamelární vezikuly (SOV) byly připraveny sonikací PC/cholesterolu (10:1 w/w) nebo PC/PS (1:1 w/w) disperzí. Suchý lipid a cholesterol (10:1 w/w) • · · · · • · · · byly rychle rozpuštěny v CHCh/MeQH směsi (2:1 v/v). Roztoky byly následně odpařeny pod proudem dusíku a lipidy (v koncentraci 7,2 mg/ml) byly upravovány ve vakuu po dobu i hodiny a následně opět suspendovány ve vhodném tlumivém roztoku vířením. Výsledné lipidové disperze byly následně sonikovány po dobu 5 až 15 minut v sonikátoru lázňového typu (G1125SP1 sonikátor, Laboratory Supplies Company Inc., NY) až do okamžiku jejich vyčištění. Koncentrace lipidů výsledných příprav byla určena analýzou fosforem (Barlett, 1959). Vezikuly byly zobrazeny použitím JEOL JEM 10OB elektronového mikroskopu [Japan Electron Optics Laboratory Co. (japonská elektronová optická laboratoř), Tokyo, Japan! následovně. Kapka vezikul byl umístěna na mřížku upravenou uhlíkem a negativně zbarvena uranylacetátem. Zkouška mříží ukázala, že vez ikuly byly jednotně lamelární s průměrným průměrem 20 až 50 nm (Papahadjopoulos a Miller, 1967).

(vi) Příprava séra. Krev byla získána od pěti dobrovolných dárců a ponechána se srážet při pokojové teplotě po dobu 4 hodin. Krev byla následně centrifugována po dobu 15 minut v 1500 g, sérum bylo odstraněno a spojeno. Pérový komplement byl inaktivován zahříváním při teplotě 56 ®C po dobu 30 minut.

(v i i) C D s pe k t. r os k o p i e „ CD s pe k t r a pe p t i d ů by 1 a mě řen a J a sc o J -500A s p e k t r o p o 1 a r i. m e t r e m p o r o z d ě 1 e η 1. s t u p n i c e p ř í s t r o j e (+) -10 - k a f r s u 1 f o n o v o u k y s e 1 i n o uS p e k t r a b y 1. a z k o u m á n a p ř i. t e p I o tě 23 °C ve cloněných krystalových optických buňkách s optickou délkou 0,5 mm. Spektra byla získána při vlnových délkách 250 až 190 nm. Pro každý peptid bylo provedeno osm zkoušek s rychlostí snímání 20 nm/min. Peptidy byly prohlíženy v koncentraci 1,5 :! 10-^;: až 2,0 :·; 10--^: M v 40 7, trifluoroethanolu (TFE), rozpouštědle silně podporujícím S-helikální strukturu. Frakční helicity (Greenfield a Fasman, 1969; Wua spol., 1981) byly propočteny následovně:

• · · · · • · • · •ItM \mJ

C 0 3ώ 2 2 [ 0 3 ⁰ 2 2 2

		fn =	1(03^^^222 ” C03^<::>222
kde C01222 je	ex	perimentálně pozorovaná střední	zbytková
eliptičnost	při	'•ηςγς·)	nm a hodnoty C03°222 a CO3¹⁰⁰	222, které
odpovídají	0 7 a	100	7 obsahu helixů při 222 nm, jsou	odhadnuty
hodnotami	2000	a	32000 de g.c m²/d mo1 (stu pňů.c m²	/decimol),
jednotíivě	(Nu a	spol	., 1981).

(viii.) Antibakteriální účinky peptidů. Antibakteriální účinky diastereomerů byly zkoušeny ve sterilních deskách s 96 otvory (Nunc F96 mikrotitrační desky) v konečných objemech 100 jjL. následovně i: Al i kvót ní části (50 jjl) suspenze obsahující bakterie v koncentraci 10⁶ jednotek tvorby kolonií (Colony-Forming Units CF'U)/ml LB (Lauria broth) média byly dodány do 50 jjL vody nebo 66 7. spojeného normálního lidského séra v PBS obsahujícího peptid ve 2-složkovém postupném ředění. Utlum růstu byl určen měřením 492 nm automatickým čtecím přístrojem mikrodesek 1 n s t r u m e n t s) n á s 1 e d o v n ě p o i. n k u b a c i i r v a j í <::: ί 18 až 20 hodin při teplotě 37 0C. Antibakteriální účinek byl vyjádřen jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které byl pozorován 100 7, útlum růstu po 18 až 20 hodinách inkubace„ Byly použi.ty nás 1 eduj ící bakterie; Escherichia co 1 i. D21, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Ac inetobacter calcoac.et.icus A c 11, Sal man e 11 a t yph i mu r i u m L. '1' 2, Sací 11 u s meg a £ e r i u m B m 11, Micrococcus luteus ATCC 9341, Sací Hus subtilis ATCC 6051.

(ix) Hemolýza lidských červených krevních buněk. Byly testovány absorbance při El309 (Bio-tek hemolytické účinky peptidů vůči lidským červeným krevním buňkám (hRBC). Čerstvá hRBC s EDTA byla 3 krát promyta s PBS (35 mM fosfátového tlumivého roztoku/0,15 M NaCl, pH 7,3) centrifugací trvající 10 minut v 800 g a opět suspendována v PBS. Peptidy rozpuštěné v PBS byly následně dodány do 50 jjL roztoku uskladněné • · • · · · · · · · · • ·· ·»·· « hRBC v PBS, čímž se získal konečný objem 100 jjL (konečná koncentrace erytrocytů, 5 7 v/v). Výsledná suspenze byla po dobu 30 minut podrobena inkubaci při promíchávání a teplotě 37 °C. Vzorky byly následně po dobu 10 minut podrobeny centrifugaci v množství 800 g. Uvolnění hemoglobinu bylo monitorováno měřením absorbance povrchově aktivní látky při 540 nm. Kontrolní hodnoty pro 0 7 hemolýzy (prázdná) a 100 7 hemolýzy byly získány z hRBC suspendované v PBS a Tritonu 1 7, jednotlivě,, (:·:) Zviditelnění vlivů peptidů na bakterie použitím elektronové m i k i' o s k o p i e,, V z o r k y o b s a h u j ící E« c o li (10^ά C F U /ml) v L B m é d i u byly po dobu 16 hodin podrobeny inkubaci s různými peptidy v jejich MIC, jedno zředění byla nižší než MIC, a následně centrifugovány po dobu 10 minut v 3000 g„ Peletky byly opět suspendovány a k a p k a o b s a h u jící b a k t e r i e byl a u m í s t. ě n a n a m ř í ž p o v r c h o v ě u p r a vénou uhlíkem, která byla následně negativně zbarvena 2 7 kyselinou fosfowolfrámovou (PTA), pH 6,8. Mřížky byly zkoušeny P o u ž i t í m J E 0 L. J Ε Μ 10 0 B e 1 e k t r o n o v é h o m i k r o s k o p u „ (i ) P i'- ů c h o d m e m b r á n y vyvolá n ý p e p t i d y „ P r o s t u ρ n o s t m e m b r á n y byla o d h a d n u t a p r o s t ř e d n i c t v í m analýzy d i f u z n i h o pot e n c i á I u (L. o e w a spol,,, 1983; Sims a spol,., 1974) podle popisu uvedeného výše (Shai a spol,,, 1991)» Pro běžnou zkoušku ve skleněné trubici byly 4 jj 1 s u s p e n z e 1 i p o s o m ů ( k o n e č n á f o s f o 1 i p i d o v á k o n c e n t r a c e 3 3 jj M) v K+ tlumivém roztoku (50 mM K2SO4, 25 mM HEPES-S0₄~2, pH 6,8) zředěny v 1 ml izotonického K¹” volného tlumivého roztoku (50 mM Na₂S0_4í 25 mM HEPES-S0₄-2, pl-l 6,8), následně bylo dodána f 1 u o r e s ceně η í p o t e n c i á 1 o v ě ····· s e n z i t i v η í barvivo d i S ···· C 2 - 5,, V a 1 i n o m y cín (1 jjl ΙΟ“⁷ M) byl dodán do suspenze tak, aby uvnitř vezikul. P o m a 1 u v z n i k a 1 n e g a t i v η í d i f u z η í p o t e n c i. á 1, k t e r ý z p ů s o b u j e prudké ochlazování barvivové fluorescence. Jakmile byla fluorescence stabilizována, což trvalo 3 až 10 minut, byly dodány peptidy. Následný rozptyl difuzního potenciálu odražený zvýšením fluorescence byl monitorován na Perkin Elmer LS-50B spektrofluoromet.ru s excitačním zařízením upraveným na 620 nm,

vyzařováním Procentický tak to :

při 670 nm a přírůstkem upraveným na 100 7..

podíl normalizace fluorencence Ft byl definován

Ft = < It - Ιο / 1+ lo) >: 100 kde lo = původní f luorescence, l-f = celková fluorescence pozorovaná před dodáním valinomycinu a It = fluorescence pozorovaná po dodání peptidu v čase t.

(x i i ) Vazby pe p ti d ů k ve z i kuIám. V z á jemn é půso beη í

CD3-V^E,s,I¹⁷,K²¹-mel litinu s vezikulami obsahujícími zwitteriontové (PC) nebo negativně nabité fosfolipidy (PC/PS) bylo charakterizováno měřením změn intenzity vyzařování intrinsického tryptofanu peptidu při SUV titračních zkouškách» Stručně, SUV byly při teplotě 24 °C dodány do stálého množství peptidu (0,5 jj M) r o z p u š t ě n é h o v 11 u m i v é m r o z t o k u o b s a h u j í c í m 5 0 m M Naa SO4, 25 mM HEPES-S04^-2» pH 6,8. 1-cm optické délky křemenné kyvety, která obsahovala konečný reakční objem 2 ml, byly použity ve všech zkouškách,, Intenzita fluorescence byla měřena jako funkce mo1 á i'- η í h o p o m ě r u 1 i p i d u / p e p t i d u (4 o d děle n é z k o u š k y ) n a Perkin-Elmer L..S-5 Spektrofluorometru s excitací upravenou na 280 nm použitím 5 nm zářezu a vyzařováním upraveným na 340 nm použitím 2,5 nm zářezu,, Izo termy vazeb byly analyzovány jako částečná i'- o v n o v á h a p o u ž i t í m n á s 1 e d u j í o í h o v z o r c e::

Xb = KeCt k d e X b j e d e f i n o v á n o j a k o m o I á r η í p o m ě r v á z a n é h o p e p t i d u (Cb ) k celkovému lipidu (Cl.), Kp odpovídá rozdělovacímu koeficientu a C-f představuje rovnovážnou koncentraci volného peptidu v roztoku. Praktickým účelovým předpokladem bylo, že peptidy byly původně rozdělovány pouze na vnější vrstvě (60 7.) SUV. Odtud tedy rozdělovači rovnice:

X_b* = K_P* Ct kde Xb * je definována jako molární poměr vázaného peptidu na 60 7.

celkového lipidu a Kp* je odhadnutá povrchově rozdělovači konstanta. Křivka vychází z nákresu Xb* oproti valnému peptidu,

Of je označena jako běžná izoterma vazby.

(xiii) Zkoušky útlumu (rychlého chlazení) tryptofanu. Tryptofan, který je citlivý na své prostředí, byl použit v přecházejících m e i o d á c h v k o m b i n a c i. s b r o m o váný m i f o s folipidy (B r - P Os cíl e m zjistit rozmístění peptidů v membráně (Bolen a Holloway, 1990; De Kroon a spol,, 1990). Br-PC použité jako tlumicí (ochlazovací) látka fluorescence tryptofanu jsou vhodné pro zkoušku absorpce peptidů v membráně, jelikož tyto působí při krátké vzdálenosti a d r a s t i c k y n e p o r u š u j í ni e m b r á n u „ M e 11 i t i n a j e h o d i a s t e r e o m e r, jednotlivě obsahující jeden tryptofanový zbytek, byly dodány (ko.....

nečná koncentrace 0,5 j.il^vl) do 2 ml tlumivého roztoku (50 mM NaaSOzi., 25 mM HEPES-SO4², pH 6,8) obsahujícího 20 .ul (50 jjM) B r - P C / P S < 1 s 1 w / w) S U V, ta k i. o u p r a v u j í c ί p o m ě r 1 i p i d u / p e p t i. d u n a 100:1. Po 2 minutách inkubace při pokojové teplotě bylo zaznamenáno emisní spektrum tryptofanu použitím Perkin-elmer L..S-50B Spektrofluorometru s excitací stabilizovanou na 280 nm (8 nm zářez). Byly použity SLIV tvořené PC/PS (1:1 w/w), které obsahovaly

7„ buď 6,7-Br.....PC nebo 9,10.....BrPCnebo 11, 12-Br-PC. Pro každý peptid byly provedeny tři oddělené zkoušky. V kontrolních zkouškách byly použity PC/PS (1:1 w/w) SLIV bez Br-PC„

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 znázorňuje cyklický dichroismus (CD) spektra aminoethylaminopardaxinu (TApar)-odvozeného peptidu. Spektra byla zachycena při koncentraci peptidu 0,8 až 2,0 x 10~~ M v 40 X 2,2,2-trifluoroethanolu (TFE)/vodě. Symboly: TApar ( );

οο

Χμ /

LD3F'⁷-TApar (.....) ; LD]LA⁸LA⁹--TApar( ) a LD]P⁷LA⁸Li⁷-TApar(._);

Obrázek 2 znázorňuje reakční křivky hemolytických účinků podle dávkování TApar-odvozených peptidů v lidských červených krevních buňkách (hRBC). Příloha znázorňuje výsledky testů při nízkých koncentracích» Symboly: plné čtverce, mellitin; plné trojúhelníky, TApar; plné kruhy, [D3P⁷-TApar; prázdné kruhy, CD JL^a·⁸ L¹⁹-TApar; prázdné čtverce, LD]R⁷L¹⁸L¹⁹-TApar; prázdné trojúhelníky, dermaseptin.

Obrázek 3A-B znázorňuje maximální rozptyl difuzního potenciálu ve vezikule vyvolaný TApar-odvazenými peptidy. Peptidy byly dodány do izotonického K+ valného tlumivého roztoku obsahujícího malé jednotné lamelární vezikuly (SUV) složené z vaječného f o s íati d y1c ho1 i n/f os f a ti d y1seri n u (P0/PS) (o b r á z e k 3A) nebo PC (o b r á z es k 3 Β), p ř ed em vyváže n é f 1 u o r es s c e n č n í m ba r v i v e m d i S- Ca - 5 a valinomycinem. Normalizace fluorescence byla měřena 10 až 20 minut po promíchání peptidů s vezikulami. Symboly: plné trojú h e 1 n í k y, T A p a r; ρ 1 n é k r u h y, L D1P⁷ - Ί A p a r; p r á z d n é k r u h y, E D 31..A·⁸ LA· * -TApar; prázdné č tverce, L D3P⁷1..A-⁸ LA* -TApar;

Obrázek 4A-C znázorňuje elektronové mikrografy negativně zbarvených E.cali buněk neošetřených (obrázek 4A) nebo ošetřených LI33P⁷LA⁸LA·⁹-TApar v koncentracích nižších než minimální útlumová koncentrace (MIC) (4B) nebo v MIC koncentracích (40;

O b i' á z e k 5 z n á z es r ň u j e C D s p e k t r a m e 11 i. t i. n u a m e 11 .'i. t i. n - o d v o z e n ý c h d i a s t e r e o m e r ů. S p e k t r a b y 1 a z a c h y c e n a p ř i k o n c e n t r a c i p e p i i d u 0,8

Έ/voda,, Symboly: mellitin, (..................);

. . .); LB3~V^E’⁸,1¹⁷,K²i-me11 iaž 2,0 10.....M 40

LD3-V^E’⁸,1¹⁷ ,K²¹-mel lit; tin-COOH, (- .............);

Obrázek 6 znázorňuje reakční křivky hemolytických účinků podle dávkování mellitin odvozených diastereomerů v hRBC. Symboly: plné kruhy, mellitin, prázdné kruhy, LD3-V^E’⁸,1¹⁷,K²¹-mel litin-COOH; plné trojúhelníky, LD3-V-” ’⁸ , I¹⁷ , K² i-mel litin ;

Obrázek 7A-C znázorňuje elektronové mikrografy negativně zbarvených E. coli neošetřených (obrázek 7A) nebo ošetřených CD]-V^E’⁸,I¹⁷,K2i-mellitin v koncentraci nižší než NIC (7B5 nebo ' MIC koncentraci (70;

Obrázek 8A-B znázorňuje maximální rozptyl difuzního potenciálu ve »

vezikulách vyvolaný mellitinem a mellitin-odvozenými diastereomery. Peptidy byly dodány do izotonického K+ tlumivého roztoku obsahujícího SUV složené z PC (8A) nebo PC/PS (8B), předem vyvážené fluorescenčním barvivém diS-Cjj-S a valinomycinem. Normalizace fluorescence byla měřena 10 až 20 minut, po promíchání peptidů s vezikulami. Symboly; plné kruhy, mellitin; plné trojúhelníky, [Dl-V*,s,117,ks i-mellitin;

Obrázek 9A-B znázorňuje zvýšení fluorescence [D3“V^E’⁸,1¹⁷ ,K²¹-mellitinu (0,5 jjM celkové koncentrace) po titraci s PC/PS vezikulami (plné trojúhelníky) nebo PC vezikulami (prázdné trojúhelníky), s excitační vlnovou délkou sestavenou na 2S0 nm a vyzařováním při 340 nm. Pokus byl proveden při 25 °C v 50 mM Ma₂S0₄, 25 mM HEPES-SO4-2, pH 6,8 (obrázek 9A); a návaznou isotermu odvozenou z obrázku 9A nákresem Xb* (molární poměr vázaného peptidu na 60 X lipidu) oproti Cf (rovnovážná koncentrace volného peptidu v roztoku) (obrázek 9B);

Obrázek 10A-B znázorňuje rychlé ochlazení tryptofanu senzitivního n a p r o s t ř e d í b r o m o v a n ý m i. f o s f o 1 i p i d y. M e 11 i. t. i n (o b r á z e k 10 A) a [ D ] - V- ’⁸ , 117 , |<;> :i. - _{m e} i ] j t. i η (10 Ef) b y I d o d á n d o ú 1.1 u m o v é h o r o z t o ku obsahujícího PC/PS (I:;:!, w/w) SIJV. SIJV obsahovala 25 7„ buď

6,7-Br-Pc (..........„.....) nebo 9,10-Br.....Pc (..................) nebo 11,12-Br-PC

(..........). Po 2 minutách inkubace bylo zaznamenáno spektrum vyz a ř o vání t r y p t. o f a n u p o u ž i t i m s p e k i. r o f 1 u o r o m e i. r u s výmeze η í m e x c i , táce při 280 nm. Pro porovnání bylo použito PC/PS (1:1 w/w) SUV bez Br-PC (-).

Obrázek 11 znázorňuje vliv hydrofobnosti Leu/Lys diastereomerů na RP-HPLC retenční dobu.

Obrázek 12 znázorňuje reakční křivku hemolytických účinků podle dávkování Leu/Lys diastereomerů v hRBC. Příloha znázorňuje • ft • · · · · · · ··· ftft ·· · · výsledky testů v nízkých koncentracích. Symboly: prázdné čtverce, mellitin; plné čtverce, CD3-L³ ’⁴ ’⁸ ’ 10-K3L<? ; plné kruhy, CD1-L³’⁴’⁸’¹⁰-K4L8; prázdné trojúhelníky, CD]—L³’⁴’^e’¹KeL7; plné trojúhelníky, [D3-L³’⁴’⁸’¹⁰-K7,Le.

Obrázek Í3A-B znázorňuje maximální rozptyl difuzního potenciálu ve vezikulách vyvolaný Leu/Lys diastereomery. Peptidy byly dodány do izotonického K+ volného tlumivého roztoku obsahujícího SUV složené z PO (obrázek 13A) nebo PE/PG (13B), předem vyvážené fluorescenčním barvivém diS-C^-S a valinomycinem. Normalizace fluorescence byla měřena 3 až 10 minut po promíchání peptidů s vezikulami. Symboly: plné čtverce, EB1-L^3,4 ’⁸ ’¹L.9 ; plné k r u h y, [ D 3 - L³ '>⁴ ’^{8 110} - K4 Ls ; plné t r o j ú h e 1 η í k y,

ED1-L³’⁴’⁸’ío-KeLt; křížkované kruhy, CD3-L³’⁴’⁸’io-K₇Le«

Obrázek 14A-H znázorňuje elektronové mikrografy negativně zbarvených E. coli n e o š e t ř e n ý c h a o š e t ř e n ý c h r ů z n ý m i L e u / L. y s d i a s t. e.....

reomery v 80 Z jejich MIC. Obrázek 14A, kontrolní; obrázek 14B, E„ coli ošetřené s C D3-L³ '>⁴ ’⁸ ’10-K3 I....? : obrázek 140, E. coli ošetřené s Π33····Ί.„.^{3 74}’⁸ > io~-|<4Ls ; obrázek 14D, E. coli ošetřené s C D 3 -1....³ ’⁴ ’⁸ ’¹° - Ke I....-/ ; o b r á z e k 14 Ε, E s C B 3 - L^{3 14} ’^{8 11} - K7 Le ; o b r á z e k 14 F, k o n t r o) c o 1 i o š e t ř en é s [ D 3 - L..³ ’⁴ ’⁸ >¹⁰ -K4 Ls ; o b r á z e k coli ošetřené : obrázek 140, Ε» 4H, E« coli ošetřené

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 - Syntéza a biologické účinky diastereomerů odvozených z pardaxinu

1.1 Syntéza, Pro zkoušku funkce a-helikální struktury polyká. tiontového cytolysinu při jeho cytotaxicitě na savčí buňky a bakterie byla syntetizována řada peptidů odvozených ad pardaxinu podle popisu odstavců (ii) a (iii) metod zkoušek, byla charakterizována jejich struktura, hemolytické účinky na hRBC, antibakteriální účinky a vliv na morfologii bakterie.

Pardaxin (par) je 33-mer peptidem s následující posloupností:

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lys-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lys-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-Gly-Ser-Ala-Leu-Ser-Ser-Ser-Gly-Gly-Gln•« · · a · ·· ♦ · · * · · · * « • · · · · · a · » · * · • · · · · « » ·· ·» · · ·· · ~Glu

Modifikace molekuly pardaxinu s cílem zavést pozitivní náboj byla provedena buď zrušením kyselé C-koncové jednotky pardaxinu nebo přeměnou kyselé C-koncové jednotky pardaxinu nebo jeho fragmentu na pozitivní reakcí obou karboxylových skupin Glu zbytku C-koncové jednotky s ethylendiaminem (TA) a/nebo dodáním pozitivně nabitých amino kyselinových zbytků, takových jako Lys, k M-koncové jednotce diastereomerů pardaxinu, ve kterých N-helix a/nebo C-helix byly přeměněny buď záměnou zbytku Pro na 7 pozici TApar nebo fragmentu pardaxinu za D-Pro (zde označované jako CD1P⁷) nebo dvou Leu zbytků na pozicích 18 a 19 TApar nebo fragmentu pardaxinu za D-Leu (zde označované jako ED1L¹⁸L¹⁹), nebo společnou záměnou těchto dvou (zde označované ED.1P⁷L^:I-⁸L^:I<? )«

D-amino kyseliny byly zavedeny do středu M..... a C- helixů.

N á s 1 e d u j í c í d i a s t e r e o m e r y o d voze n é z p a r d a x i. n u b y 1 y s h 1 e d á n y jak o n e h e m o 1 y t i <::: k é, p r o j e v u j ící se .'I. e k t i v π í c y t o 1 y t i c k é ú č i n k y (tu č n é a p o d t r ž e n é u v e d e n é z b y t k y j s o u D - a m i n o k y s e 1 i n y ). P e p t i d y b y 1 y označeny v textu tučnými číslicemi.

1. EDIP⁷LisLi-<?-TApar s posloupností::

G1 y - P h e - P h e - A1 a.....L e u -11 e.....Pro.....L y s -11 e.....11 e - Ser - S e r - P r o - L e u - P h e.....L y s.....

-Thr-Leu-Leu-Ser-A 1 a-Va 1 -G1 y-Ser-A 1. a-Leu-Ser-Ser-Ser-G 1 y-G I y.....

-Gln-Glu-(NH-CH₂~CH₂.....MH₂)₂

2. ED1F⁷ L¹⁸ L..¹⁹ El až 221-TApar s posloupností:

G1y-P h e-P he-A1 a-Leu-11e-Pro -Ly s-11e-11e-Se r-S e r-P ro-Leu-Ph e-Ly s-Thr-Leu~Leu-5er-Ala-Val-(NH-CH₂-CH₂NH₂)₂

3. ED]P⁷L¹⁸L¹⁹Ε1 až 221-par s posloupností:

Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-I le-Pro-Lvs-I le-I le-Ser~Ser-Pro-L.eu-Phe-L.ys~ -Thr-Leu-Leu-Ser-A1a-Va1 • · 4 99 ·· 99 «9 »99 9 9 9» 9 9 «*«' · · · * « 9 9 * *· * 999 9 β 9« 9 » < 9» • 9 · 9999 9

99994 99 99 94 99 ·ζτ ·2· · J·

4. Κ¹ ED3F'⁷L¹⁸L^1<? Ε1 až 223-TApar s posloupností:

Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Ecfl-Lys-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe--Lvs-Thr-Leu-Leu-Ser-A1a-Va1-(NH-CHa-CHa-NHa)a

5. kJK² Ε03Ρ⁷Ι_¹⁸Ι_¹⁹ El _až 223-TApar s posloupností:

Lys-Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lvs-Ile-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Ly s-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val-(NH-CHa ~~CHa -NHa )a

6. KiK2ED3P7L.i8L.ini až 223-par s posloupností:

Lvs-Lvs-Glv-Phe-Phe-Ala-Leu-Ile-Pro-Lvs-ne-Ile-Ser-Ser-Pro-Leu-Phe-Lvs-Thr-Leu-Leu-Ser-Ala-Val

7. ED3P7-E1 až 113-TApar s posloupností:

G1y-Phe-Phe-A1a-Leu-I1e-Pro-Lvs-11 e~ I1e-Ser-NH-CHa-CHaMHa Byly syntetizovány následující deriváty pardaxinu, které byly shledány jako hemolyticky aktivní, což je ukázáno v tabulce 1 uvedené dále v textu,,

8.	TA par
9.	ED3Pi3-TApar
10.	ED3LMJ·⁹-TApar
11.	ED3P⁷ L4⁹-TApar
12.	ED3P7~TApar
13.	ED JP⁷-par
14.	ED3L.i8Li^<?-TApar
15.	ED3LJ·⁸1..J·⁹-par
16.	ED3P⁷LJ·⁸1..J·⁹-par
17.	ED3P7 El až 223••••TApar
.1 /·} .1. κ	U r č e η í s e k u n d á r η í (o d v o z e n é) s t r u k. t u r y	□eptidů.	Sekundární
s t r	uktury peptidů 1, 8, 12, 14 byly ohodnoceny	z jejich CD
spe	kter v 40 7. TFE, rozpouštědle které	s i 1 n ě	podporovalo

(x h e 1 i k. á η í s t r u k t u r u, p o d 1 e p o p i s u m e t o d z k o u š e k, o d s t a v e c (v i i ), a v PBS (35 mM fosfátového tlumivého roztoku/O,15 M NaCl, pl-l 7,0).

CD spektra diastereomerů odvozených z pardaxinu jsou znázorněny na obrázku 1, na kterém E83 ( ), Ε123 (....), E143 (-----) a E13 (-.-.-.-). Dramatický pokles α-helixového obsahu peptidů je podle očekávání pozorován u peptidů s vyšším obsahem D-amino kyselin, což se odráží minimálními hodnotami v 208 a 222 nm v 40 !. TPE.

Byl pozorován více jak 90 1 pokles oc-helixového obsahu mezi peptidy 8 (TApar) (50 l α-helix) a 1 (CB1P⁷L..¹⁸L^:t<?TApar) (4 /).

Obsahy κ-helixů peptidů 12 (ED3P⁷-TApar) a 14 (CD3L¹⁸L^1<?-TApar) byly 25 % a 15 Z, jednotlivě. Mělo by být poznamenáno, že prolin na pozici 7 nezavádí do struktury ohyb, ale spíše se podílí na vytváření N-helixu, což je zřejmé podle NMR spektroskopie (Zagorski a spol., 1991). Pardaxin v PBS dal nízkou hodnotu '12 % α-helixového obsahu, zatímco všechny analogy s D-amino kyselinovými zbytky projevovaly velmi malé znaky, které nemohly být přisuzovány specifickým strukturám (údaje nejsou uvedeny).

1.3 Hemolytické a antibakteriální účinky. Peptidy 1 až 17 odvozené od pardaxinu byly následně zkoušeny pro jejich hemolytické účinky proti vysoce senzitivním lidským erytrocytům a pro jejich vysoké účinky potlačení růstu rozdílných druhů bakterií podle popisu metod zkoušek, odstavec (ix) a (xviii), jednotlivě. V dodatku, cytotoxický včelý jed mellitin, antibakteriální peptid dermaseptin S a antibiotický tetracyklin byly použity jako kontrolní látky.

Na obrázku 2 je znázorněna křivka hemolytických účinků peptidů 1, 8, 12, 14. Ukazuje se, že D-amino kyseliny inkorporované do

Τ A p a r d r a m a t i c k y s n i ž u j í j e h o h e m o I y t i c k é ú č i n k y, k t e r é k o r e 1 u. j í s e z 11' á t o u (x - h e I i. x o v é h o o b s a h u o d p o v í d a j í c í c h a n a I o g ů „ P e p t i d 8 TApar s nejvyšším obsahem (x-helixů je nejvíce hemolytický, zatímco peptid 1 CD3P⁷L¹⁸L¹⁹-TApar s nejnižším obsahem α-helixů je prakticky zbaven hemolytických účinků až do maximální testované koncentrace (50 .μΜ) „ Neschopnost lýzovat RBC je charakteristická pro většinu přirozeně vznikajících antibakteriálních peptidů, takových jako dermaseptin (podívejte se na obrázek 2), magainin a cekropin.

Tabulka 1 ukazuje hodnoty MIC (v jjM) peptidů 1 až 17 pro • · · *>····· · · ·· ·· ·· ·· ·· předložené druhy testovaných bakterií, které zahrnují dva gramnegativní druhy, Escherichia coli a Acinetobacter calcoaceticus a dva grampozitivní druhy, Bacillus megaterium a Bacillus subtilis·, a také 7. hemolýzy pro 50 jjM peptidů. Tabulka 2 ukazuje hodnoty MIC (v jjM) peptidů 1, 8, 12, 14 a mellitinu, dermaseptinu 8 a tetracykIinu pro některé druhy bakterií. Údaje ukazují, že, i přes snížený obsah tx-helixů a pokles hemolytických účinků diastereomerických analogů 1 až 7, si tyto analogy pon eeháva j í větěi n u silných an t i ba k ter i á1η í c h úč i n k ů původní ho peptidu pardaxinu, který je porovnatelný se známými přírodními an t i bak ter iá 1. nimi pe p t i d y.

• · · · · 1 >6 (O »-4

Λ <5

Η «3 θ' Ο —ι <3 Β Β >,

Β ι-Ι >υ '3 'φ

Λ!

υ

H ι-4

Ο !

X!

Ο £

Φ υ

<ο ρ

+>

Β

0) υ

Β

Ο

Κ3

Ο Ξ 3 ι—t +> '3

Ή

Β ι-4 χο

Ε •rt β

•Η £

Β •rt

X <5

Ό

Ρ <5

0.

(4 ο

ε ο

φ ρ

0) +>

W <0

0. >, ω ν ο. '>

-Η S ο =4 ε φ ο £ tn

Κ > <ο c\ W CQ • ο ιη Β C0

VI

Ο ο η — οο

Ό

VI

CM oo

14 S	Ω	Ω	o n	. Ω	Ω
3 f4 O	2	2	Λ	2	2

ο

Ό

Α) ο <0 Η • tí ο. ν •

ρ ε ο •Η Ν

Η .0. J ^ι'44

V)

W co φ σ>

•·3 ω ι ο • Η £ tí ν

Ρ •Φ 44 <3 .

θ' 5 Φ Ο ε Μ φ ο <0 ο υ .-4 Φ <3 tí

υ

I ‘tí ι-ι r\ r4 Η Ο Μ υ .

• Q Ν

Τ3 ι-Ι &Ι

Φ

α.

Ο

CM

Ω	Ω	Ω
2	2	2

Ω	Ω	o m	Ω	Ω	o	O CM
2	2	Λ	2	2	CM	Λ

Q Ω - ζ · ν»

CM

cs Ω	Ω	Ω	Ω	Ω	Ω		Ω	Ω	Ω
2	2	2	2	2	2	tn	2	2	2

C\

Ó ν>

CM «η

VI ο

CO VI ο — ’Ώ

CM

Ό Ι-

	tn	Ώ		CM		Ω	Ω	Ω
Λ		ci	Ό	Λ	Cl	2	2	2

V}

CM

V» γί ο

οι ν> —« tn

Tabulka 1 - pokračování

Cv	Cl	O o			Γ-
^r	cn		N-	O
Q	o o	Q		o o	Q
			o
Z	Λ	Z	Ό	Λ	z
<-> >·«	o o	Q		o o	Q
•			O
z	A	Z	VO	Λ	Z
	C	V-1	G	Q	Q
v-i	Z	ni	Z	Z	Z
	v-1	\o	r-~	o
	ci	o		v-1
	V»	v->	V)	O O	Q
v-1			cí		Z
o	o	V-1	V-l	O o	o
	ci	ci

ní	ci		tri	VO	n
	Ύ—*		*—·.	T“*	T·^

Tabulka «3

Ό •Μ +J

c.

fl)

Q.

nj

3.

o

Q)

U <q

-p c

fl) o

c o

λ;

X3 >

O ε

□ •p '3

N3 ε

c

P) >.

fl) (3

U •P fl)

H ιη ιη (N ví ~ — d c

•P

-p a

on w

flj ε

ρ fl) a

fl) <n

OO fl) +J

Pí «3

O'

Ό c-i vi CN

Vl c-l vi d

c-l Ό O O

C\

O

Vl Ό Vl d d — o

— Vl

CN

CN ca in c-i· c-ι d —

O a 3

Vl o

Pí

Pí ->

>

C. P= □

r ό o o •M Ή

Vl c *3 > P

X3 <5

N 73 fl) C

C ffl

+) ω vi fl) ~ ui . δ XD •P c <3 c >

*3 O

O Pí

CN

Q fl)

Vl fl)

O s

L fl) •P

Vl o

o

Si fl) )k

-P

Vl w

0.

Λ u

fl)

-c fl) á

P *tji fl) .fl) fl)

Vl •P' •Q •Vl 'Vl fl) fl) «5 >.

Pí fl)

Vl

U '>

C fl) fl) >

P

o.

XD >

+) o

c fl)

1.4 Destabilizace membrány vyvolaná peptidy odvozenými z pardaxinu. Běžné doposud studované vlastnosti všech α-helikálních, pozitivně nabitých, přírodně vzniklých antibakteriálních peptidů vyjadřují jejich schopnosti vzájemně působit na a pronikat negativně nabité fosfolipidy lépe než zwitteriontové fosfolipidy, Význam těchto objevů pro jejich biologické cílové membrány byl přisuzován skutečnosti, že povrch bakterií obsahuje lipopoly™ sacharidy (LPS, v gramnegativních bakteriích) a polysacharidy (kyseliny teichoové, v grampozitivních bakteriích), oba tyto jsou ky se1é, z a t í mco no rmálη í sav čí bu ήk y (n a př. e ry t ro cy ty) ob sa hu j í převážně na jejich vnitřních vrstvách zwitteriontové fosfolipidové PC. Rozptyl difuzního potenciálu určujícího schopnosti peptidů pronikat membránami obou PC a PC/PS fosfolipidových vezikul ( p i¹'· i p r a v e n ý c h p o d 1 e m e t o d z k o u š e k, o d s t a v e <::: v) byl z k o u š e n p odle popisu v metod zkoušek, odstavec xi„ Ma obrázku 3 jsou znázorněny výsledky získané z peptidů 1, 8, 12, 14, které ukazují, že

B - a m i n o k y s e 1 i n y i. n k o r p o r o v a n é d o p a r d a x i. n u n i. j a k p o d s t a t n ě n e o v 1 i v ή u j í s <::: h o p n o s t p e p t i d ů p r o n i k a t f o s f o 1 i. p i d o v ý m i m e m b r á n a mi. Avšak, peptid 1, diastereomer, který jediný je zbaven hemolytických účinků a který si zachováná svoje antibakteriální účinky, proniká negativně nabité fosfolipidy podstatně lépe než zwitte.....

ri onto v é f osf α1 i p i dy„ Tento di aste re o me r půso b í podo bn ě jak o p řírodní antibakteriální peptidy i přesto, že je zbaven ix-helikální struktury. Ztráta podstatných přechodných účinků peptidů 12 a 14 by mohla být vysvětlena skutečností, že oba tyto peptidy mají jak h y d i' o f o I::j η ί N ····· h e 1 i x o v o u tak i a m f i p a t i. c k o u C - h e 1 i x o v o u c e 1 i s t v o s t, která je dostatečná pro podporu silné vazby na oba typy vezikul P i' o s t ř e d n i c t v í m h y d r o f o b η í h o v z á j e m n ého p ů s o b e η í.

1.5 Zviditelnění lýzy bakterií použitím elektronové mikroskopie, Vliv peptidů odvozených od pardaxinu na morfologii neošetřených a ošetřených bakterií byl zviditelněn použitím negativní barevné elektronové mikroskopie podle popisu metod zkoušek, odstavec xx. Peptidy byly aplikovány na bakterie v hodnotách jejich MIC nebo • · • · • ·

nižších při stejných podmínkách, které byly použity pro antibakteriální zkoušku (podívejte se na příklad 1.3 výše). Vzorky byly vyjmuty po 18 hodinách inkubace, ihned byly ustáleny a testovány přechodovou elektronovou mikroskopií. Obrázek 4 ukazuje snímané grafy získané s nehemolytickým analogem 1 [D1P7L18L19-TApar jako příklad,, Bylo shledána, že při MIC peptid lýzoval bakterie zcela a pozorovány mohly být pouze malé fragmenty (obrázek 40. Avšak při koncentraci nižší než MIC byly pozorovány stopy na bakteriální hradbě (obrázek 4B). Tyto stopy by mohly indikovat původní krok zahrnutý v procesy lýzy.

Příklad 2 - Syntéza a biologické účinky diastereomerů odvozených od mel Iitinu „ 1 8 y n t é z a „ C t. y ř i. d i a s t e r e o m e r y m e 11 i i. i n u b y 1 y syn t. e t i z o v á n y s c ί 1 e m p r o v é s t d a I š í z k o u š k y f u n k c e <x - h e I i k á I η í s t r u k t u r y cyt o lysinů při jejich cytotoxické reakci proti savčím buňkám a bakteriím a také pro větší porozumění mechanismu skrývajícím se pod těmito reakcemi,,

Me 11 i.tin je 26-mer peptidu s pos 1 ouρností:

G1 y - Ile ··· Cly - A1 a - V a 1 - L e u - L y s - Val - L. e u - T h r - T h r - G1 y - L. e u - P r o - Ala -1.... e u -11 e - S e r - T r ρ -11 e - L. y s - A r g - L y s - A r g - G1 n - GI n - IM Hs

Modifikace molekuly mel litinu s cílem upravit pozitivní náboj byla provedena přeměnou C-koncové jednotky mel litinu nebo jeho f Γ' a g m e n t ů n a p o z i. t. i v η í r e a k o í k a r b o x y 1 o v é s k u p i n y G.....k o n c o v é j ed no t k y s e t hy 1 en cl i am i n em v cl i. as tereome r ec h me 11 i t i.n u, ve k ter ý c: h IM - h e I i x a C - h e 1. i x byly p ř e m ě n ě n y zaměň ě η í m cl v o u Val z b y t k ů na pozici 5 a 8 mellitinu, Ile zbytku na pozici 17 a Lys zbytku na pozici 21 za D-Val, Β-Ile a D-Lys zbytky, jednotlivě (na tomto místě v te :·: tu C D1 - V^!=: V⁸ 1¹⁷ K* * ).

Následující diastereomery odvozené z mellitinu byly shledány jako nehemolytické, projevující selektivní cytolytické účinky (tučná a podtržená označení zbytků jsou B-amino kyseliny);

18. CD3-V⁵ V⁸ I¹⁷K²i-mel s posloupností:

Glv-Ile-Glv-Ala-Val-Leu-Lvs-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-Trp-Ile-Lvs-Arg-Lvs-Arg-Gln-Gln-NHg

19. [ D 3 -V^E V⁸ 1¹⁷ K^{2 J}·-me 1-C00H s posloupností:

Gly-Ile-Glv-Ala-Val-Leu-Lvs-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu- Ile-8 e r - T r p - II e - Lvs- A r g -Lys - Arg- G ln-Gln-COO H

20. CD3-VSV⁸I17K2i-C1 až 223-TAmel s posloupností:

Gly-II e-G ly-A 1 a-Val-Leu-Lys-Val- L. e u - T h r - T h r - G ly-Leu-Pro-A 1 a-Leu-He~ -Ser-Trp-Ile-Lxs-Arg-NH-CHa-CH₂-NH₂

21. CD3-V^EV⁸ B⁷K²W4 až 223-TAmel s posloupností:

A1a-Val-Leu-Lvs-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-A1 a-Leu-I1e-Se r-T r p-11e~ -~LxSArg-NH”CH₂ -CH₂ -NH₂

Peptidy 18 až 21 byly následně charakterizovány s ohledem na jejich strukturu, biologickou funkci a vzájemné působení proti bakteriím a membránové modely složené buď ze zwitteriontovýoh n e b o n e g a t i v n ě n a b i t ý <::: h f o s f o 1 i p i d ů,, „ 2 C Γι s p e k t r o s k o p i e „ R o z s a h α - h e 1 i k á 1 η í s t r u k t u r y p e p t i d ů 18 a 19 byl určen z jejich CD spekter v 40 7« ΤΡΈ, rozpouštědle silně p o d p o r u j í c í m tx - h e 1 i k á I η í s t r u k t u r u „ tx - h e I i k á 1 η í o b s a h d i a s t e reomerů byl podle očekávání mnohem nižší (80 7. pokles) než u me11 i t i nu, u r č en o pod1e odra z u mi n i má1 ηí ch hodn o t v 20 8 n m a 222 nm (obrázek 5)„ Obsah tx-helixů mellitinu byl 73 7. v porovnání s 15 7, a 7 7« obsahem v jeho diastereomerech 18 a 19, jednotlivě,,

2„3 Ant i ba k ter i á i η í a hemolytické účinky di a ste re ome r ů mellitinu 18 až 21„ Byly zkoumány hemolytické účinky peptidů 18 až 21 proti hRBC a jejich útlumové účinky proti růstu různých druhů bakterií,,

A n t i b i o t i c k ý t e t r a c y k I i n s 1 o u ž i 1 v a n t i b a k t e r i á I η í z k o u š c e j a k o k o n t r o1ηί 1á t k a. Byla z í s k án a r ea k čη í k ři v k a hemo1y t i ck ý c h ú či n k ů v závislosti na dávkování peptidů (obrázek 6). Tabulka 3 znázorňuje hodnoty MIC pro předložené druhy testovaných bakterií,, Může být pozorováno, že inkorporace D-amino kyselin do mellitinu dramaticky snižuje jeho hemolytické účinky, což odpovídá ztrátě tx-hel ikáln í ho obsahu u odpovídajících analogů. Mellitin ··· · 3 · · « ····· · · ·· ·· ·· s nejvyšším α-helikálním obsahem byl nejvíce hemolytický až do maximální testované koncentrace (50 jjM) , zatímco peptidy 18 a 19 s nejnižším α-helikálním obsahem byly prakticky zbaveny hemolytických účinků. Avšak, navzdory drastickému snížení hemolytických účinků u diastereomerů mellitinu 18 a 19, oba tyto diastereomery si uchovávaly většinu silných antibakteriálních účinků původního peptidu. Dále, antibakteriální účinky peptidu 19 byly pouze mírně nižší než peptidu 18, což ukazovala, že amidová skupina na

C-koncové jednotce mellitinu nepřispívá nikterak významně k anti.....

bakteriálním účinkům. Opačně je známo, že cekropin s volnou karboxylovou C-koncovou jednotkou měl výrazně nižší antibakteriální účinky než přírodního cekropin s amidovanou C-koncovou jednotkou (Li a spol,, 1988),

CT

Tabulka a

φ ε

o φ

p

P

M «5 <a &

o <0 c

(3 >.

δ:

c >0 '3 'Φ

Δί

Φ —4 jJ r\

S a

□

Π3 c

C

O δ:

XO >

o λ3 '3

-U

2Q

M s

a o

in rs vH in o \QO ω • <

CQ '-r «

CT φ ω

4J

O u • ř2 fZ ε

•*4

P rs Φ Ή +J H <0 ε θ' α φ -/ e

CQ

Φ rs O Ή tO vH o a □ rt to o

f-l r\ O Ή O CM • a u «3

Ί3 •r4 +>

a a

>υ to c

N

O xr o

xr o

rn o

o

CN sn c

h +J

CS sn rn sn d

>n

CN

O sn

CS

CN co

CN

CO CN o —’

CO CN d — sn d

CN

IN

CN xr r- —

OO — CO oo cs o — — CN

CN a

φ w

to ~ a

CN rs

Δ!

>.

U to

P

4J

Φ

H • ·

2.4 Studie bakteriální lýzy elektronovou mikroskopií. Vliv peptidu 18 na morfologii neošetřených a ošetřených bakteriích byl zviditelněn použitím přechodové elektronové mikroskopie. Podle ukázek na obrázku 7 způsobil peptid 18 v MIC celkovou lýzu bakterií (obrázek 70. Avšak, při koncentracích nižších než MIC byly pozorovány stopy bakteriální stěny (obrázek 7B). Tyto stopy by mohly představovat původní krok lytického procesu.

2.5 Způsob vzájemného působení s fosfolipidovými membránami. Protože biologické účinky peptidů 18 a 19 byly podobné, byla porovnávána pouze forma vzájemného působení peptidů 18 a modelových fosfolipidových membrán s farmou působení mellitinu s cílem objasnit podstatu pozorované membránové selektivity. Za tímto účelem byla měřena schopnost peptidů rozptýlit difuzní potenciál vytvořený jak v PC a PC/PS vezikulách, dále byly určeny rozdělovači koeficienty peptidů u obou typů vez ikul a rozšíření peptidů, pokud jsou tyto vázány k membránám.

2.5. 1 P r ů c h o d m e m b r á n o u v y v o 1 a n ý p e p t i. d y „ R ú z n é k o n c e n t r a c e mellitinu a peptidů 18 byly promíchávány s vezikulami, které byly nejdříve ošetřeny fluorescenčním barvivém diS-Cs-S a valinomycínem. Kinetika obnovy fluorescence byla zachycena časem a dále byla stanovena maximální úroveň dosažená jako funkce koncentrace peptidů. Podle ukázky na obrázku 18, jak mel litin tak i peptid m ě 1 y p o d o b n ý v 1 i v n a p r o p u s t n o s t m e m b r á η P C /PS v e z i. k u 1 u k a z u.....

j í c í, že inkorporace D.....amino kyse 1 in do me 11 i tinu n i.k.terak neovlivňuje schopnost výsledného diastereomeru pronikat negativně na b i i é f o s f o1 i pi do v é (P 8/PC) me mbrá ny. Avšak, zatím c o mel I i t i n by1 vy s o c e a k ti vní s P C vez i k u1 a mi, d i as te reome r tay1 z c e1 a z ta a v en schopnosti pronikat membrány PC vez i kul (až do maximální zkoušené koncentrace).

2.5.2 Studie vazeb. Neschopnost diastereomeru 18 proniknout PC vezikuly se může projevovat vzhledem k jeho neschopnosti se vázat na PC vezikuly, nebo alternativně se tento může vázat na PC vezikuly, ale jakmile je jednou vázán nemůže se dále vpravit do struktury a tím vyvolat proniknutí membránou. Studie vazeb byly provedeny s cílem rozlišit mezi těmito dvěma možnostmi. Samostatný Trp zbytek na pozici 19 peptidu 18 byl použit pro vnitřní -fluorescenční zkoušku sledující jeho vazby na PC a PC/PS vezikuly. Ustálená koncentrace ( + 0,5 jjM) peptidu byla titrovaná s požadovanými vezikulami (PC nebo PC/PS) a v případě vzniku vazby bylo pozorováno zvýšení v intenzity -fluorescence. Nákresem výsledných zvýšení intenzit fluorescence Trp jako funkce molárního poměru lipiduspeptidu vznikly běžné vazebné křivky (obrázek 9A). Vazebná křivka peptidu 18 na PC/PS odhaluje, že téměř všechny molekuly peptidu byly vázány na vezikuly v molárním poměru lipiduspeptidu 100:1. Avšak, při zkoušce s PC vezikulami nebylo pozorováno žádné čisté zvýšení fluorescence Trp, a to ani v případě maximálního testovaného molárního poměru lipiduspeptidu, což ukazovalo, že peptid se na PC vezikuly nevá.....

že, Isotermy vazeb byly vytvořeny nákresem X*b (molární poměr vá.....

z n é h o p e p t i d u n a 6 0 % c. e 1. k o v é h o 1 i p i d u) o p r o t .1. C-f ( r o v n o v á ž n á koncentrace volného peptidu v roztoku) (obrázek 5B)„ Povrchové r o z d ě 1 o v a c í k o e f i c i. e n t y b y 1 y u r č e n y e x i r a p o 1 a c í p ů v o d η í c h s m ě r n i o křivky pro nulové O hodnoty. Hodnota odhadu povrchového rozdělovacího koeficientu Hp* peptidu 18 byla 1,1+:0,2 χ 10⁴ M”¹ (získáno ze čtyř měření), Tato hodnota je podobná hodnotě uvedené pro v a z b y m e 1.1 i t i n u k f o s f a t i d y 1 g 1 y c e r o 1 / f o s f a t i d y 1 o h o 1. i. n u (4,5 ± 0,6 χ 10+ M.....) (Beso It i aso hv i 1 i. a See 1 i g, 1990),

Tvar vazebné isotermy peptidu může poskytovat informace o uspořá.....

daní peptidů v membránách (Schwarz a spol,, 1987), Isotermna va.....

zeb peptidu 18 má ohyb směrem dolů naznačující negativní součinnost. Možné vysvětlení této negativní součinnosti je, že při nízké koncentraci je peptid 18 vázaný na PS/PC obohacen negativním nábojem fosfolipidových hlavních skupin, porovnáno s částečnou rovnováhou bez vlivu náboje. V dodatku, peptid, podle vazby na membránu, částečně neutralizuje negativní náboj povrchu membrány. Avšak, jakmile je náboj povrchu membrány neutralizován,

další vazba peptidu 18 není snadná, protože dominantním faktorem se stává odpudivost podobných nábojů. Podobné výsledky byly získány při studiích vazby mellitinu k negativně nabitým fosfolipidovým membránám (Batenburg a spol., 1987; Beschiaschvi1 i a Seelig, 1990). Zajímavostí je, nepodobně u mellitinu, který se silně váže také k PC vezikulám (Kuchinka a Seelig, 1989), že peptid 18 se na PC vezikuly neváže.

2.6 Zkoušky útlumu (ochlazení) tryptofanu. Tryptofanový zbytek, přírodně se vyskytující v posloupnosti proteinu nebo peptidu, může sloužit jako intrinsická sonda lokalizace peptidu uvnitř membrány. Mel litin obsahuje tryptofanový zbytek na pozici 19 Ν-koncové strany C--helixu. (J mellitinu i peptidu 18 bylo pozorov á η o n e j v ě t š í u 11 u m e η í t r y p t o f a n o v é f 1 u o r e s c e n c e s 6,7 - B r - P C / P S vezikulami (obrázek 10). Nižší útlum byl pozorován s 9, 10-Br-F'C/PS a nejnižší s 11, 12-Br-PC/PS. Tyto výsledky podle vazby na vezikuly ukazují, že peptidy byly rozmístěny v blízkosti h 1 a v η í c h s k u p i n f o s f o 1 i p i d ů,

Příklad 3 - Syntéza a biologické účinky modelových Lys/Leu diastereomerů „ 1 S p e c i f i k a c e I.... y s / L e u d i a s t e r e o m e r ů „ Byly s y n i e t i z o v á n o š e s t d i a s t e r e o m e r ů k r á t k ý c h 1 i n e á r η í c h m o d e 1 o v ý c h 12 - m e r p e p t i d ů t v o řených různými poměry lysinu a leucinu s cílem (.1.) prověřit dostatečnost kriteria rovnováhy mezi hydrofobností a čistým poz i.....

tivním nábojem nezbytného pro selektivní bakteriální lýzu a (2) získat přehled o mechanismu, který se skrývá pod těmito účinky. V první řadě modelových Lys/Leu 12-mer peptidů 22 až 25, byla jedna třetina jejich posloupnosti tvořena B-amino kyselinovými • zbytky. Rozmístění B-amino kyselin vytvořené pro maximální rozrušení (x-helikální struktury zůstávala ve všech peptidech konstantní. B-amino kyseliny byly rozmístěny v peptidu tak, aby ponechávaly pouze velmi krátké úseky 1 až 3 posloupných L-amino kyselin. Byly syntetizovány následující peptidy:

22. CD1-L³’⁴’β , io-|<₃L9 s posloupností:

Lys-Leu-Leu-Leu-L.eu~L.eu-L v s-Leu-Leu-Leu-Leu-Lvs-NH^

23. CD1-L³ ’^{4 18} ’ I_8 a posloupností:

Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-NHg

24. CDJ-L³ ’⁴’⁸’ í°“Ke: I...7 s posloupností:

Lys-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Lvs-Leu-Lys-Leu-Lvs-Leu-Leu-Lvs-NH?

25. CB1-L³’⁴’⁸ ’ ¹⁰-K7Le; s posloupností:

Lv s-Lv s-Leu-1eu-Lvs-Leu-Lv s-Leu-Lvs-Leu-Lvs-Ly s-MI-fe V druhé řadě modelových Lys/Leu 12-mer peptidů 26 až 27 byly dvě třetiny jejich posloupnosti tvořeny B-amino kyselinovými zbytky u m í s t ě n ý m .i. n a p ř e s n ý c h p o z i c í c h L - a m i n o k y s e 1 i n ový c h z b y t k ů peptidů 23 a 24 následovně:

26. L'B.'.'I-K¹ ’ ¹²L² >*>>?> iÍ-K4L.8 s posloupností:

Lvs-Leu- Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu- Leu-Lvs -L.eu -Leu-Lvs- MHz

27. CD].....Kl Έ ,7 ,9,121 2 7 f,, 1:1.l_{7 5} pos 1 oupností:

Lvs-Leu- L. e u ····· L e u -Lvs-Leu-Lvs L. e u -Lvs L. e u -Leu-Lvs N Hs

Ve třetí řadě modelových Lys/Leu peptidů byly syntetizovány

6-mer a 8-mer diastereomery (peptid 28 a 29, jednotlivě):

28. i: D :i -L² ' 4 -K₂ Lži. s pos l oupnost í:

Ly s-Leu-Leu-Leu-Leu-L vs

29. L^{2 74} ’^ά™K:jLe s posloupností:

Lv s-Leu-Leu -Leu-Lv s-Leu.....Leu-Lys

P o d 1 e vy ná1e z u by 1 y s y nt e t i z o v á ny da 1ší di a s te re o me ry:

30. Ly s.....Leu.....I....eu.....I....eu.....Ly s-Leu-Ly s-Leu.....L...y s-Leu-Leu-L.y s

31. Ly s.....Leu-Leu-Leu L y s -Leu.....Ly s--Leu-Ly s-Leu-Leu-Ly s

32. L y s - L. e u -Leu-L e u -Lvs-L e u - Ly s-Leu-Lv s-L e u -Leu-L y s ’· 3.2 Syntéza Lys/Leu diastereomerů. Peptidy byly syntetizovány podle popisu metod zkoušek, odstavec (ii). Peptidy byly následně ’ charakterizovány s ohledem na jejich strukturu, biologickou funkci a vzájemné působení s bakteriemi a modelovými membránami tvořenými buď zwi tteriontovými nebo negativně nabitými fosfolipidy.

3.3 Hydrofobnost. Hydrofobnost a čistý pozitivní náboj peptidů 22 až 25 jsou uvedeny v tabulce 4. Střední hodnoty hydrofobnosti byly propočteny použitím dohodnuté hodnoty stupnice hydrofobnosti (Eisenberg a spol., 1984). Přímá korelace byla podle ukázky na obrázku 11 shledána mezi hydrofobnosti a časem retence peptidů, tato naznačuje, že struktura se nikterak významně nepodílí na celkových hydrofobních vzájemných vlivech se stacionární fází.

Tabulka 4

Hydrofobicita a čistý náboj Leu/Lys diastereomerů

Označení peptidu	w Čistý náboj	Hydrofobicita
/··) /··)	-I- 4	0 1 7
Jmi iImi II
Γη ·~ι· iL. '.i.¹ ii	+ 5	..... 0,01
0/1 .1... ^A1 II	-i·· 6	- 0,15
	+ R	···· () 49
lit. S.J II		7 1 .1...

3.4 CD spektroskopie. Rozsah tx-helikální struktury diastereomerů až 25 byl určen z jejich CD spekter v 40 7. TFE. Podle očekává.....

η ί, n á e 1 e d n ě p o i n k o r p o r a c i D a m i n o k y ís e 1 i η, n e b y 1 a n i. u j e d n o h o z diastereomerů pozorován žádný znak, který by prokazoval ztrátu jaké kα1 i v s peci f i cké se kundá rηí s t ruktury (úda j e ne j sou uvedeny)„ Podle současných výzkumných prací by mělo být uvedeno, že peptid s posloupností totožnou s posloupností peptidu 23, který je však tvořen pouze L--amino kyselinami, obsahuje přibližně 40 7. tx-helikální struktury v methanolu a v DMPC vezikulách (Cornut a spol., 1994).

3.5 Antibakteriální a hemolytické účinky peptidů 22 až 29. Byly testovány hemolytické účinky peptidů 22 až 29 proti hRBC. Reakční • · · • · · 9 * • · · · • · křivka hemolytických účinků padle dávkování peptidů 22 až 25 je znázorněna na obrázku 12, ve kterém hemolytické účinky mellitinu sloužily jako kontrolní údaje. Přímý vzájemný vztah byl zjištěn mezi hydrofobností (tabulka 4) a hemolytickými účinky diastereomerů. Peptid 22, CDl-LP ’⁴’⁸’ío-KsL..<?, který má nejvyšší hydrofobnost, byl nejvíce hemolytickým peptidem. Jeho hemolytické účinky jsou však v porovnání s mellitinem velmi nízké < >60 krát nižší účinky). Všechny další peptidy až do maximální testované koncentrace (100 ,uM) neprojevovaly výrazné hemolytické účinky. Hemolytické účinky peptidů 22 až 29 jsou znázorněny v tabulce 5. Mělo by být uvedeno, že ačkoliv peptid 23, CD1 -1...³ ’⁴ ’⁸ ’¹ °-l<₄Ls , neη ί př i ko nc en t raci c h rovn a j í c í c h se >100 n áso bk u kon c en tr ac e požadované pro výraznou hemolýzu vyvolanou mellitinem hemolytický, jeho ucelená L-amino kyselinová forma projevila v nedávných v ý z k u m e c h h e m o 3. y t i c k é ú č i n k y p o d o b n é h e m o 1 y t i c k ý m ú č i n k ů m melittinu (~ 5 krát nižší) (Cornut a spol., 1994).

Byly také provedeny testy antibakteriálních účinků peptidů 22 až 29 proti předloženým druhům bakterií, ve kterých tetracyklin, dermaseptin 5 a melittin sloužily jako kontrolní látky. Výsledné MIC jsou uvedeny v tabulce 5. LJdaje ukazují, že antibakteriální účinky diastereomerů 22 až 29 byly modulovány rovnováhou mezi hydrofobností a pozitivně nabitými amino kyselinami. Jak nejvíce hydrofobní peptid 2.2 tak i nejvíce hydrofilní peptid 25 projevují ne j n i ž š í ú ro v e ή a nii bakte r i áIηíc h úč i n ků (ta b u1k a 5). Avšak, peptidy 23 a 24 projevovaly vysoké antibakteriální účinky proti v ě t ši n ě t e st o váný c h ba k te r i ί, d ř í v e uv ede n ý p r o jevová 1 mí r n ě silnější účinky. Dále, každý peptid měl jednoznačné spektrum antibakteriálních účinků a všechny byly účinnější proti grampozitivním bakteriím ve srovnání s účinky proti gramnegativním bakteriím.

3.6 Synergické vlivy mezi tatracyk1inem a Lys/Leu diastereomery v séru. Pro zkoušky možného synergického vztahu mezi antibiotickým tetracyklinem a diastereomery byl tetracyklin testován při 2-násobném sériové ředění proti Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853) za přítomnosti konstantní ekvimolární koncentrace (1 jjM) peptidu 24 CD3-L--¹ ’⁴,8 > io-k^Lt . Antibakteriální účinky směsi byly určeny podle popisu metod zkoušek, odstavec (xii).

Synergický vliv byl pozorován mezi tetracyklinem a diastereomerem 24. Tetracyk1in projevoval malé účinky proti P. aeruginosa. Avšak, jestliže je tetracyklin smíchán s 1 jjM roztokem peptidu

24, bylo pozorováno, že koncentrace, která je 10 krát nižší než koncentrace požadovaná pro lytické účinky proti P. aeruginosa, 8 k r á t z v y š u j e ú č i n k y t. e t r a c y k 1 i n u (ta b u 1 k a 6). Možné v y s v ě 11 e η í synergický vlivů je, že peptid lehce narušuje bakteriální hradbu, což zvyšuje rozložení tetracyklinu do bakterií. Toto vysvětlení je podpořeno studiemi elektronové mikroskopie, která ukazuje, že peptid 24, při koncentraci nižší než je jeho MIC, vyvolá morfologie ké změny v bakteriální hradbě (obrázek 14),, V dodatku, vliv spojeného lidského séra na antibakteriální účinky peptidu 24 a p ř í i' o d η í h o a n t i b akte r i á I η í h o p e p t i d u d e r m a s e p t i n u p r o t i P . aeruginosa a E, coli byl shledán značně rozdílným (tabulka 6)„ Zatímco dermaseptin byl za přítomnosti séra 8 až 10 krát méně aktivní, peptid 24 si uchoval jeho antibakteriální účinky,, • * · · ♦ · • · · * · *

Σ

O co

O v> O O O O O O O vi o

Ό <

o o

H <

vi

G

CN

O

c	Q	Q	Q
z	Z	Z	Z

\q vi o vo tn <o

Λ (5

H

Minimální útlumová koncentrace CjjM) peptidů

Φ

U <3 +J

Φ

O c

o

Pí '«3 >

O ε

p '3 'rl c

'<3 ε

lH c

r-t s

a *<

fe

P £

0) <3 (Λ a

•N u>

a t

<b a

VI a

a

-P <b

B a

<3 υ

o a

tj «3

Ό

-P

Q.

Φ a

>υ <3 e

N α

ro vo co rCM i

O o

vo

CM

O

CM

Λ

VO ó

CM

O

O vo vq ó

ro cm o ~ ~ o o CM <

CM

Q c\ vo co

CM

CM ro

CM

ΟΓ

CM

Q	Q	Q	O
Z	Z	Z	Z

VO

CM

O

CM

O	Q	Q	Q	Q
o CM	Z	Z	Z	Z

VO ro ' CM —«

O co in

CM

VO

CM

O vo o

o

V* CM ro vs r* CM CM

CO

CM

CA

CM

Ό Ό ω

c •rM

-P

3 φ ·π « -P

C\j —ί ε -¹ u φ φ

Q Z vo

Pí >

O <3

P

Φ

a. výsledky jsou středními hodnotami 3 nezávislých pokusů, jednotlivě provedených dupllkovaně se standardní odchylkou 20 %. ^ai‘d dcvialíOh θΓ20% • ·« ·· ftft · · · « · · • ·· · * *« • · ♦ · · · »·· *9 · » a·

Tabulka 6

Minimální útlumová koncentrace (jjM)⁸ za přítomnosti lidského séra a synergické účinky peptidu 24.

Minimální útlumová koncentrace <jjM)

P. a&rugirtosa (ATCO27853) E, coli (D21)

Označení peptidu	0 7. séra	33 7. séra	0 7. séra	33 7» séra
24	10	10	7	7
Dermaseptin 8	.li..	200	6	50
Tc^b	50
Tc-i-24 Cl. jjM)	6

^a Výsledky jsou středními hodnotami 2 nezávislých pokusů, každý proveden dvakrát se standardní odchylkou 20 7.. ^l::) Tc ···· Tetracyklin „ 7 P e p t i d e m v y v o 1 a n é p r o n i k n u t í m e m b r á n o u. R ů z n é k o n c e n t r a c e Ρ e p t i d ů b y 1 y s m í c h á n y sí v e z i k u 1 a m i, k t. e r é b y 1 y n e j d ř í v e u p r a v e n y f 1 u o i' e s c e n č η í m b a r v i v e m d i 8 ·- Ca.....5 a v a 1 i n o my o i. n e m. Byla z a z n a m e n á -·na kinetika obnovy fluorescence, maximální úroveň fluorescence b y 1 a u r č e n a j a k o f u n k c e k o n c e n t r a c e p e p t. i d u (o b r á z e k 13). PC/cholesterol vezikuly (10:.1.) sloužily jako modelové fosfolipidové prostředky vnější vrstvy erytrocytů (Verkleij a spal», 1973) a PE/PG vezikuly (7:3) byly použity jako modely fosfolipi” dového prostředku E. coli (Shaw, 1974). Přímý vzájemný vztah byl zjištěn mezi účinky peptidů, které pronikají modelovými fosfoli pidovými membránami, a jejich lytickými účinky proti erytrocytům • ·· ·· ·· ·· *· • · · · · « · · ·· · • · · · « · « » 3 ·

9 9 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 99 9 9 a E. coli. Zwitteriontovými fosfolipidavými vezikulami pronikl pauze hemolytický peptid 22. Dále, schopnost peptidů pronikat PE/PG vezikulami byla ve vzájemném vztahu s antibakteriálními účinky peptidů proti E. coli (tabulka 5). Peptid 25, který má nejnižší antibakteriální účinky, měl v porovnání s dalšími třemi peptidy 22 až 24 výrazně sníženou schopnost pronikat PE/PG vezikulami .

3.8 Studie elektronové mikroskopie bakteriální lýzy. Vliv diastereomerů 22 až 25 na morfologii ošetřených E. coli byl zviditelněn použitím přechodové elektronové mikroskopie. Všechny peptidy vyvolaly při jejich MIC celkovou lýzu bakterií (údaje nejsou uvedeny). Avšak, jestliže peptidy byly použity v koncentracích odpovídajících 80 “Z jejich MIC, byly pozorovány některé rozdíly v morfologii ošetřených bakterií podle použitého peptidu. Nejvíce hydrofobni peptid 22 vyvolal, nejvyšší poškození buněčné stěny a membrány, zatímco nejméně hydrofobni peptid 25 vyvolal pouze ]. o k á I η ί p o r u c h y (o b r á z e k 14·)«

P ř í k 1 a d 4 „ - 8 y n t é z a a b i o I o g .i. <::: k é ti č i. n k y m o d e 1 o v ý c h I.... y s / A1 a a L y s / V a 1 d i a s t e r e o m e r ů.

4.1 Specifikace diastereomerů. Pro další zkoušky dostatečnosti m o d u 1 a c e h y d r o f o b i c i t y a č i s t é h o p o z i t i v η í h o n á b o j e 1 i n e á r η í c h c y t o t a i c k ý c h p e p t i d ů v y v o láva j í c í c h s e 1 e k t i. v η í a n t i b akte r i á 1 η í účinky, byly syntetizovány dva další modelové 12-mer peptidy 33 a 34 až 37 tvořené Lys/Ala nebo Lys/Val zbytky, jednotlivě, které měly alespoň jednu třetinu jejich posloupnosti tvořenou D-Ala nebo D-Val zbytky;

33. CD3-A³’⁴’⁸’¹⁰-Kfl.As s posloupností;

Ly s-A1a-Ala-Ala-Lvs-A1a-A1a-Ala-Lvs-Ala-A1a-Ly s-NHs

34. EDU-V³ ’^{4 78} ’ 10-Kq.Vs s posloupností;

Ly s-Va1-Val-Val-Lvs-Va1-Va1-Val-Lvs-Val-Va1-Lys-NH₂

35. Lvs-Val-Va 1-Val-L.vs-Val-Lvs-Val-Lvs-Val-Val-Lys • ·· ·· ·· · · ·· • · · · · ·· · · · * • ·· ···· ··* • · ··· ·· · · ··· ·· ··· «··· · ····· ·· ·· · · ··

36. Lvs-Val-Val-Val-I vs-Va1-Lys-Val-Lys-Val-Val-Lvs

37. Lys-Va1-Val-Va1-Lvs-Va1-Lys-Val-Lvs-Va1-^al-Ly s • 4.2 Syntéza. Lys/Ala a Lys/Val diastereomery byly syntetizovány ‘ podle popisu, který je uveden v části Metody zkoušek (Experimentální procedury), část (ii).

«

4.3 Antibakteriální a hemolytické účinky. Peptidy 33 a 34 byly testovány proti E. coli·, S. megaťerium a hRBC. Výsledky v tabulce 7 ukazují, že oba modely diastereomerů jsou antibakteriální a nehemolytické:

Tabulka 7

Minimální útlumová koncentrace (jjM) a hemolytické účinky peptidů 28 a 29

M i n i m á 1 η í ú 11 u m o v á k o n c e n t r a c e ( jj M)

Označení peptidů	E. coli (D 21)	B. megaterium (Bml1)	7« herno lýzy Při 100 uM
	•j n	•1	()
	.1.	.1.
34	···!· (···· ·.·>,	0,8	0

Příklad 5 ···· Syntéza dalších modelových diastereomerů

Byly syntetizovány následující modelové diastereomery podle vynálezu tvořené posloupností 6, 8, 12, 14, 16, 19, 25, 26 a 30 zbytků dvou, tří nebo více různých amino kyselin:

38. Lvs-Leu-Ile-Leu-Lvs-Leu

39. Lvs-Val-Leu-His-Leu-Leu

40. L e u-Lvs-L. e u - A r g - L e u-Leu • · • ·

41.

42.

43.

44.

45.

46.

47.

48.

49.

50.

51.

52.

53.

54.

55.

56.

57.

58.

59.

60.

61.

62.

63.

64.

Lys-

-Pro-

-Leu-

-His-

“ L. G? U “

-Leu

Lys-

-Leu-

dle:

-Leu-

-Lys-

-Leu-

-Val-

-Arg

Lys-

-Vad

-Phe-

-His:

:Leu:

-Leu-

-His-

-Leu

His-

-Lys-

-Phe-

-Arg-

-11 e-

-Leu:

-Lvs-

-Leu

Lys-

-Pro-

-Phe-

-His-

dle-

- L. e u -

-His-

-Leu

Lys-

dle-

-Ile-

-Lys-

-Ile-

-Lys-

-He-

-Lys-

-11 e-

-dle-

-Lys

Lys-

-Ile-

dle:

-Lys-

-Ile-

-Lys-

dle

-Lys-

-dle:

dle

-Lys

Lys-

-Ile-

dle

-Ile-

-Lys-

-Ile-

-Lys-

-dle:

zLys-

-Ile-

-Lys

Lys-

-Ile-

-Pro-

-Ile-

-Lys-

-Ile-

-Lys-

-Ile-

-Lys-

-Ile-

-Pro-

-Lys

Lys-

-Ile-

-Pro-

-Ile-

-Lys-

-dle-

-Lys-

-Ile-

-Lys-

-dle·

-Val-

-Lys

Arg-

-Ile-

Ile-

-Arg-

-He-

-Arg-

dl£-

-Arg-·

-Ile-

-dle-

-Arg

Arg-

-dle:

dle:

-Ile-

-Arg-

Ile-

-Arq-

dle-

-Arg-

-Ile:

-Ile-

-Arg

Arg-

-Ile-

dle-

-Ile-

-Arg-

-Ile-

-Arg-

-dle:

ZŮES

-Ile-

-dle-

Arg

Arg-

-ile-

-Val-

-Ile-

-Arg-

-Ile-

-Arg·-

-Jde-

-Arg-

-Leu-

-dle

-Arg

Arg-

dle:

:Vad

-Arg-

-Ile-

-Arg-

-Leu-

-Arg-·

dle:

:Arg

Arg-

-Ile-

-Glv-

-Ile-

-Arg

-Leu-

-Arg-

-Vad

zAra

-Ile-

-Ile-Arg

Lys-

ile

-Val·-

-Ile-

-Arg-

Ile-

-Arg-

dle

-Arg···

-Leu-

dle

-Arg

Arg-

Ile-

-Ala-

-Val

-Lys-

-•Trp-

-Arg-

-Leu-

-Arg-

-Phe-

-Ile

-Lys

Lys-

-Ile-

-Glv

-T rp-

Lys

-Leu-·

-Arg-

-Vad

-Arg

-Ile-

-Ile

-Arg

Lys-

-Lys-

-11 e-

-QlY-

-Trp-

-Leu·-

-Ile

-I le~

-Arg-

-Vad

-Arg-

-Arg

Arg-

ll£~

-Val-

-Ile-

-Arg-

-dle-

-Arg-

Ile

-Arg-

-Leu-

dle

-Arg-·

dle

Arg

ÉES:

dle:

:Val-

-Arg-

-Ile-

-Arg-

-Leu-

-Arg-

Ile:

zdle

-Arg-

-Vad

-Arq

Arg-

-Ile-

-Glv-

-Ile-

-Arg

-Leu-·

-Arg-

-Vad

-Arg

-Ile-

-dle-

-Arg·-

-Arg-

-Val

Lys:

dle

-Val-

-Ile-

-Arg-

dle:

-Arq

-Ala-

-Arg-

-Leu·

Ile

-Arg-

-Ile-

-Arg·

-Ile-Arg

65. Arg-Ile-Ile~Val -Lys-11 e Arg-Leu Arg-Ile-Ile-1....ys-Lys-Ile- Arg-Leu

66. Lvs- 11 e Glv~ 1' 1 e -Lys-A1 a - A r g -Val-Arg-11 e -Ile- A r g -Val-Lvs- Ile -Ile

67. Arg-Ile-Ile-Val-His-Ile-Arg-Leu-Arg-Ile-Ile-His-His-Ile-Arg-Leu

68. His-Ile-Glv-Ile-Lys-Ala-His-Val-Arg-Ile-Ile-Arg-Val-His-Ile~dle

69.	Arg-	-Ile-	-Tvr-Val-Lvs-	-I le-His-Leu-Arg-	-Tvr-Ile-	-Lys-	-Lys-Ile~	-Arg-
-Leu
70.	Lys-	-Ile-	-Glv-His-Lvs-	-Ala-Arg-Val-His-	-Ile-ll£-	-Arg-	Τυγ-Lys-	-Ile-
-Ile
71.	Arg-	-Ile:	-Tvr-Val-Lys-	-Pro-His-Pro-Arg-	Tvr-Ile-	-Lys-	-Lvs-Ile-	-Arg™
•Leu
72.	Lys-	-Pro-	-GIy-Hís-LyS	-Ala-Arg-Pro-His-	-Ile-llfi-	-Arg-	-Tvr-Lvs-	-Ile-
Ile
73.	Lys-	-ll£-	-Val-I le-Arg-	-I le-Arg-1 le™ Arg-	-Leu-I le-	-Arg-	-I le-Arg-	-Ile-
-Arg	-Lys-	-llfi-	-Val
74.	Arg-	-Ile:	-Ile-Val-Lvs-	-Ile-Arg-Leu-Arg-	-Ile-llfi-	-Lys-	-Lys-Ile-	-Arg-
“Leu:	-Ile-	-Lys-	-Lys
75.	Lys-	-Ile-	-Glv-Trp-Lvs-	- L. e u - Arg -Val-Arg-	-Ile-llfi-	-Arg-	Val-Lys-	-Ile-
-Gly.:	~Arq-	zLeu-	-Arg
76.	Lys-	-ll£-	-Val-Ile-Arg-	• Ile-Arg-1le-Arg-	-Leu-I le-	-Arg-	-I le-Arg-	-Ile-
ÉES-	-Lys-	-ne-	-Val -Lvs-Va .1 -	-Lvs-Arg-Ile-Arg
77.	Arg-	Ehe:	-Ala-Val -Lys	-Ile-Arg-Leu Arg-	-Ile-lle	-Lys···	-Lys-Ile	-Arg-
-Leu-	-Ile	-Lys-	Lvs-I le-Arg-	-L v s- A r g - Va 1 -11 e-	—Lys
78.	Lys-	-Ala-	-Glv-Trp-Lvs	•Leu-Arg-iZalzAra-	-Ile-llfi-	-Arg··	-Val-Lvs-	-Ile-
GlY:	Arg-	±eu-	-Arg-Lys.....I le-	-Glv-Trp-Lvs-Ly s -	-Ar a •••••Val-	-Arq-	-Ile-Lvs
79.	Arg-	-Ile:	-Tvr-Val-Lvs-	-Pro-His-Pro-Arg-	Tyr-lle-	-Lys-	-Lvs-Ile	••Arg-
.....Leu
80.	Lys:	-Pro-	HIy-Hís-Lys-	A1a-Arg-Pro-His-	-Ile-lle-	-Arg-	Iyt-Lys	-I le.....
.....Ile
81.	Lys-	Ile	-Val-Ile-Arg-	-Ile-Arg-Ile Arg-	Leu-I le-	-Arq-	-I le-Arg-	Ile
Arg	-Lys··	Ile	-Val
82.	Arg-	-He	-I le-Val-Lvs-	• Ile-Arq-Leu-Arq-	-Ile-lle-	-Lys-	-Lvs-Ile-	-•Arg-
-Leu:	ile-	-Lys-	-Lys
83.	Arg-	-Ile:	-Tvr-Val-Ser-	-Lvs-Ile-Ser-Ile-	-Tyr-lle-	-Lys-	-Lvs-Ile-	-Arg-
-Leu
84.	Lys-	-Ile-	-Val-Ile-Phe-	-Thr-Arg-Ile-Arg-	-Leu-Thr-	iSfiL:	-Hfi-Arg-	-He-

-Arg-Ser-Ile-Val • · · · · ·

85. Lvs-Pro-Ile-His-Lvs-A1a-ftrq-FrQ-Thr-Ile-Ile-Arg-TYr-Lvs-Met

-Il£

Příklad 6 - Syntéza a biologické účinky cyklických diastereomerů

6.1 Specifikace. Byly syntetizovány následující cyklické deriváty diastereomerů fragmentů pardaxinu s cysteinovými zbytky jak na Ntak i C- koncových jednotkách:

86. Cyklický K^{* 1}CD]P⁷L¹⁸ L^1<? [ 1 až 221 -par s posloupností: Cys-Lys-Gly-Phe-Phe-Ala-Leu-I le-Pro-Lvs-I le-I le-Ser- S e r - P r o - L e u -P h e-L v s - T h r -Leu-Leu-5 e r - A1 a-Va 1 -Cy s

87.

Cyklický l<M<²Cys-Lys-LysCDIP⁷ Lisu? LI 1 až 221-par s posloupností:

G1 y -P' he.....P h e- A1 a -L.eu-11 e-Pro-L. y s -11 e -11 e -Se r

Ser

O

.. e u ··· P h e - L y s - T h r -Leu-Leu

-Ala-Val-Cyí

88. Cy k 1 i. c k ý K^:l· K² K^{3 * * *} C Β1 Ρ⁷1....¹⁸ L¹⁹ ί' 1 až 221 - par“ s pos 1 ou pn os t í:

C y s - L y s - L. y s - L. y s - G1 y - P h e - P h e - A1 a - L e u -11 e -Pro L. y s -11 e -11 e e - L. y s - T h r-Leu-Leu-S e r - A1 a - 7 a 1 -Ser-Ser-Pro-LeuByly s y n t e t i z o v á n y n á s 1 e d u j í c í d e r i v á t y d i a s t. e r e o m e r ů r ů z n ý c h amino kyselinových zbytků s cysteinovými zbytky jak na N- tak i na C..... koncových jednotkách:

89. Cy k1 i cký Cy s-A r g-Ile-Va 1 -11e-A r g-Ile-A r g-Ile-A r g-Leu-Ile-Arg-Ile-Arg-Cvs

90. Cyklický Cvs-Lvs-Pro-Glv-His-Lvs-Ala-flrg-Pro-His-Ile-Ile-Arq-Tvr-Lvs-I1e-Ile-Cvs

9Í. Cy k1ic ký Cys-Arg-Phe-Ala-Val-Lvs-1le-Arg-Leu-Arg-Ile-Ile-Ly s-Lxs-Ile-A r g~Leu~Ile~Ly s-Lvs-Ile-Arg-Lvs-A r g-Val-Ile-Ly s-Cy s

92. Cyklický Cvs-Lys-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu-Leu-Leu-Lvs-Cys

93. Cyklický Cvs-Lvs-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Lvs-Leu-Leu-Lys-Cys

Byly syntetizovány následující cyklické deriváty diastereomerů různých amino kyselinových zbytků bez přítomnosti cysteinových zbytků jak na N-konoové části, tak i na C-koncové části:

94. Η N -1... y s - L e u-Leu-Leu-L y s - L e u -1... e u-Leu-L y s-Leu-L e u -Ly s-C0

95. Η N - L y s - L e u-Leu-Leu-L y s - L. e u - L. y s-Leu-L y s -Leu- L e u - Lys- C 0

6.2 Syntéza cyklických diastereomerů,, Cyklické peptidy s přítomností cysteinových zbytků jak na N- tak i na C- koncových jednotkách peptidů nebo bez přítomnosti těchto zbytků byly syntetizovány pevnou fázovou metodou podle popisu metod zkoušek, č á s t ( i i ) „ C y k 1 i. z a o e b e z p ř í t o m n o s t i o y s t e i n u b y 1 a p r o vede n a ochráněním N-koncové části, aktivací C-koncové části, deprotekcí

N-koncové části a reakcí C..... a N-koncových skupin, zatímco tyto stále zůstávaly vázány na pryskyřici,, F'o HF' štěpení a RP-HPLC čištění byly peptidy rozpuštěny v malé koncentraci PBS (pH 7,3) a cyklizace byla dokončena po 12 hodinách,, Cyklické peptidy byly dále· čištěny na RP.....HPLC a podrobeny analýze amino kyselin o v ě ř u j ί o í j e j i o h s 1 o ž e η í a 8 B 8.....P A G E o v ě ř u j í cj e j .'i. o h m o n o m e r i c k ý stav,,

6.3 Antibakteriální a hemolytické účinky. Peptidy 86 až 88 byly testovány proti E. Cal i·, fí. megaterium a hRBC, Výsledky v tabulce 8 ukazují, že všechny tři cyklické diastereomery odvozené z pardaxinu jsou antibakteriální a nehemolytické:

Tabulka 8

Minimální útlumová koncentrace (jjM) a hemolytické účinky cyklických diastereomerů odvozených od pardaxinu

Minimální útlumová koncentrace (jjM)

Označen í peptidů	£, co.l i (D21)	B. megaterium (Brn 11)	X hernolýzy v 100 jjM
86	30	10	0
87	15	6	0
88	7,5		0
6.4 A n t i b a k t. e r i á 1 n í	a herno lytickt	t účinky,, Peptidy	92 až 95 byly

testovány proti E, coli, B„ suhtilis a P„ aeruginosa. Výsledky v t a b u I c e 8 a u k a z u j í ·, ž e v š e c h n y č t y ř .i. c y k I i c k. é d i a s t e r e m e y j s o u a n t i b akte r i. á 1 n í a n e h e m o 1 y t i c k é „

Tabulka 8a

Minimální útlumová koncentrace (jjM) a hemolytické účinky cyk 1 ických diastereomerů

Minimální útlumová koncentrace (jjM)

0zn„ peptidu	E, coli	B. subtilis	P„ aeruginosa	7. hemolýzy v 50 jjM
	12,5	J γ .ÍM.	4!,. vJ	0
9j	15	5		0
94	•i 9 1.·:. 1. ,I,M ')	1,5	30	0
PS		L
	>1. \.J	u

Příklad 7 ·- Syntéza a biologické účinky d i a s t e r e o m e r ú p e p t i d u '' s váza n ý c h'¹ L y s / L. e u

7,, 1 Specifikace,, Použitím peptidu 23 jako vzoru a peptidu 23 nebo

4 o b s a h u. j í c í h o d o d a t. e č n é c y s t e i n o v é zbytky n a C.....k o n c o v é jed n o t c e (2 3 C a 2 4 C) jak o m o n o m e r u, j e d n o 11 i v ě, b y 1. y p ř i. p r ave n y n á s I e d u j í ··· c í s v á z a n é p o s .1 o u ρ n o s t i :

96. (L'D]-Ί....³ ’⁴ i s 11La C)e [D J-L^{3 7 4} ’⁸ ’^{1 <::,}-··Ί<4La % pos 1 oupnost í::

(Ly s -~L eu - Leu-Leu - L v s - L e u·- Le u- Leu·- L v s-Leu- Leu-L v s~Cv s-NHo ) e - L. y s - L e u-Leu-Leu-L y s - L e u - L e u - Leu-Lys- Leu-Leu-Lys-IMHa

97. ( CD3-L³’⁴’^{8 7 10}“KeL7C)e”CB]-L³’⁴’⁸ ’ ¹⁰~K4L9 s posloupností:

(Lys-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Lys-Leu-Lvs-Leu-Leu-Lvs-Cys-NHs)e ~ -Lvs-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu-Lvs-NHo

7.2 Syntéza. DCC a kyselina bromooctová v molárním poměru 1:1 byly ponechány reagovat v DMSO při teplotě 25 °C po dobu 1 hodiny s cílem připravit diastereomer vázaný na vzoru. Do reakční směsi • byl dodán vzor (peptid 23) a směs byla ponechána promíchávat po dobu 12 hodin, DMSO bylo následně lyofilizováno. Zůstávající kyselina bromooctová byla podrobena extrakci se suchým etherem. Reakční směs byla následně ponechána reagovat po dobu 1 hodiny s přebytkem diastereomerů 230 a 240 obsahujících cysteinové zbytky na jejich C-koncových jednotkách v PBS pH 7,3 při teplotě 25 ^aC. Diastereomery 96 a 97 vázané na vzoru byly dále čištěny použitím RP-HPL.0 a posouzeny prostřednictvím SDS-PAGE ověřující j e j i o h s o u d r ž n é s t a v y.

7.3 Antibakteriální a hemolytické účinky. Diastereomery 92 a 93 vázané na vzoru byly testovány proti £'„ coli·, B. megaterium a h R B 0 „ V ý s 1 e d k y v t a b u I c e 9 u k a z u j ί, ž e o b ě s v á z a n é p o s I o u ρ n o s t i jsou antibakteriální a nehemolytické.

Tabulka 9

M i n i m á 1 η í ú 11 u m o v á k o n c e n t r a c e ( jj M) a h e m o I y t i c k é p ů s o b e η í diastereomerů

Minimální útlumová koncentrace (jjM)

Označen í peptidů	£4 coli (D21)	5. megaterium (Brn 11)	/ hernolýza ve 100 jjM
96	0,2	0,05	0
97	0,1	0,02	0

ζ.'Τ)

Ο 4Í..

Příklad 8 - Syntéza a biologické účinky směsí Lys/Leu 12-mer peptid-diastereomerů

Peptidy byly syntetizovány pevnou fázovou metodou podle popisu metod zkoušek, odstavec (ii), uvedeném výše v textu. V každém kroku interakce byla do reakce dodána směs tvořená z í ekvivalentu lysinu, leucinu a D-leucinu. Byla syntetizována směs ze 3¹² různých peptidů. Po HF štěpení byly hydrofilní peptidy podrobeny extrakci s dvakrát destilovanou vodou (ddw) a lyofilizovány. Směs Lys/Leu 12-mer peptid-diastereomerů byla testována proti E. coli D21 (MIC; '15 yg/ml), J3, roegateriuro Bmll D21 (MIC; 3 jjg/ml) a hRBC (0 7. hemolýzy ve 100 jiM). Podle očekávání měla hydrofilní směs a n t i b a kte ri áIηí úč i n k y, a1e tay1a n ehe moIy t i c ká.

Příklad 9 - Syntéza a biologické účinky Lys/Leu/D-Leu nahodilých kopolymerů.

P ř e b y t k y N - k a r b o x y a n h y d r i d o v ý c h z b y t. k ů p r o t i i. n i c i a 1 i. z a č η í m volným amino kyselinám byly ponechány polymerizovat v DMF při teplotě 25 °C po dobu 4 hodin (Katchalski a Sela, 1958) s cílem P ř i p r a v .i. t d i a s t e r e o m e r y p o 1 y m e r ů r ů z n ý c h v e 1 i k o stí. P o 1 y m e r y obsahující různé poměry lysinu, leucinu a D-leucinu byly připrav e n y p o u ž i t í m r Ů z n ý c h p o m ě r ů 1 y s i η - N - k a r b o x y a n h y d r i d u ,

I e u c i η - N - k a r b o x y a n h y d r i d u a D -1 e u c i n.....M.....k a r b o x y a n h y d r i d u. T ř i t a.....

kové polymery a jejich antibakteriální a hemolytické účinky jsou uvedeny v tabulce 10.

• · · · · · • · ·

Tabulka 10

Minimální útlumová koncentrace (jjM) a hemolytické účinky L.ys/L.eu/B-L.eu kopolymerů.

M i n i m á I η í ú 11 u m o v á k o n c e n i r a c e ( jj g / m I)
Molární poměr amino kyselin Lys;Leu: Πλ'1-Leu	E. coli (B21)	fí, megaťerium (Bmll)	X hernolýza ve 100 jjM
1 : 1 : 1	90	15	0
'··' ¹¹ 1 1	j....	o	Λ
	·...' u	u
3 s 1 : 1	80	Of)	0

Příklad 10 ··· Účinky diastereomerů proti houbám

Účinky parda:·; in-ad voženým peptidů 1 a 16 proti houbám (podívejte se na příklad 1 výše) byly prověřeny ve strerilních deskách s 96-komůrkámi (Munc F96 mi krotítrační desky) při konečném objemu 100 jjL následovně: 50 jjL suspenze obsahující houby v koncentraci 1 χ 10^ά jednotek tvořících kolonie (CPU)/ml v kultivačním médiu (Sabouraud glukózové médium) bylo dodána do 50 jjL vody obsahující peptid v sériovém '2-násobném ředění ve vodě. Utlum růstu byl určen měřením absorbance v 492 nm využitím automatického čtecího zařízení mikrodesek E1309 (Bio-ter Instruments) následně po inkubaci trvající 48 hodin při teplotě 30 °C. Účinky proti houbám byly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které byl pozorován 100 7. útlum růstu po 48 hodinách inkubace. Byly použity následující houby: Caridida albicans • · · · ·· ·· (IF'886-65) a Cryptacoccus necríarmans (IP960-67). Jak je ukázána v tabulce 11, oba peptidy 1 a 16 projevovaly antifugální účinky.

Tabulka 11

Minimální útlumová koncentrace (.μΜ) diastereomerů 1 a 16 proti houbám

M i n i m á 1 η í ú 11 u m o v á koncentrace ( jj M)

0 z n a č e η ί p e p t i d ů	C and id a al hic. a n s CΙΡ88ύ-ό5)	Cr y p t ocaccu snecrfo rn) a n s <ΙΡ?άΟ-ά7)
1	35	50
16	120	150

P ř í k 1 a d 11 ····· P r o t i r a k o v i. η n é ú č i n k y d i a s t e r e o m e r ů

Protirakovinné účinky Lys/Leu diastereomerů 23 a 24 (podívejte se d o p ř í k 3. a d u 3 výše) b y 1 y p r o věře n y z k o u š k o u p r o t i a d e n o k a r c i n o m u u myší. Buňky byly uchovány v množství 5 až 10.000/komůrka mikro.....

t i 11' a č η í c h d e s e k s 9 6 k o m ů r k a m i v D u 1 b e c c o' s m o d i f i k o váné m Eagle's médiu. Po uchycení buněk bylo do komůrek přeneseno 20 .ul.... ředěného roztoku peptidu v normálním solném roztoku, čímž se získala celková koncentrace v rozmezí 20 až 150 jjM. Následovala inkubace s peptidy po dobu 1 hodiny, životaschopnost rakovinných buněk byla měřena zkouškou zbarvení živých tryptanovou modří (0,1 / w/v). V kontrolních pokusech byl do buněk dodán samotný roztok peptidu. Protirakovinné účinky byly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které byl pozorován 100 / útlum růstu po 1 hodině inkubace. Výsledky v tabulce * · · · · · ·· ·« ukazují, že oba zvolené peptidy jsou aktivní proti savčím buňkám.

Tabulka 12

Minimální útlumová koncentrace (jjM) diastereomerů proti adenokareinomu u myší

M i n i mální ú 11 u m o v á k o n c e n t r a c e ( jj M)

Označení peptidu	Adenokarcinom u myší
/η Ί· X..	50

.u. 1	O u

Příklad 12 ·-·· Účinky diastereomerů proti Leishmania mexicana

Diastereomer peptid 20 odvozený z mel ittinu (podívejte se na příklad 2 výše) a Leu/Lys diastereomer peptidu 23 (podívejte se na příklad 3 výše) byly testovány proti Leishmariia. Promastigoty Leishmani a mexicana NR kme nu v y bran é pro z kouš ku byly ku11 i vová ny při teplotě 27 °C v RPMI 1640 médiu doplněném 10 7„ Totálním hově.....

zim sérem, Parazity byly získány centrifugací v 1200 x g trvající 10 minut při teplotě 4 °C a dvakrát promyty s PBS (50 mM fosfátu sodného, 150 mM NaCl, pH 7). Promyté promastigoty byly spočteny hemocytometrem a upraveny na koncentraci 1 x 10^A parazitů/ml. Alikvotní části této suspenze byly analyzovány v konečném objemu 100 yl propočtením živých (pohyblivých) buněk po 24 hodinách inkubace při teplotě 26 °C bez nebo za přítomnosti různých koncentrací diastereomerů. Účinky proti Leishmania byly vyjádřeny jako minimální útlumová koncentrace (MIC), koncentrace při které • · ·

• · bylo pozorováno 100 7. mrtvých buněk po 24 hodinách inkubace. Bylo shledána, že pro peptid 23 je hodnota MIC 17 jjM a pro peptid 20 je hodnota MIC 32 jjM.

/

Příklad 13 - Účinky diastereomerů 23 proti virům

Senci a i virus (Z kmen) byl pěstován v alantoickém vřecku 10 až 11 dní starých slepičích vejcí se zárodky, viry byly získány 48 hodin po injikování a čištěny. Virus byl opět suspendován v útlumovém roztoku složeném z 160 mM NaCl, 20 mM tricinu, pH

7,4 a skladován při -70 °C. Virové hemaglutinační účinky byly měřeny v hemaglutinačních jednotkách (HAD). Jeden mikrolitr obsahoval ~ 60.000 HAU. Čerstvá lidská krev byla získána z krevní banky a skladována až 1 měsíc při teplotě 4 °C. Před použitím b y I y e r y t. r o c y t. y d v a k r á t p r o m y t y s P B S, p 14 7, 2 a ř e d ě n y n a p o ž a d o v a n o u k o n c e n i r a c i. (Z v / v) s t e j n ý m i1 u m i v ý m r o z i o k e m. V i r i o n y, erytrocyty a peptidy byly promíchány v různých pořadích a různých množstvích. Konečná inkubace byla provedena vždy při 37 °C po dobu 60 minut, následovala centrifugace v 5700 g po dobu 10 minut pro odstranění nedotčených buněk. Ve všech případech byly použity duplikátní vzorky a dva alikvotní díly byly odebrány ze supernatantu každého vzorku do dvou komůrek desky s 96-komůrkami. Μ n o ž s i v í u v o I n ě n é h o h e m o g I o b i n u b y 1 o z a z n a m e n á n o m ě ř e η í m absorbance komůrek použitím ELISA čtecího zařízení desek v 540 t

nm. Účinky proti virům byly vyjádřeny jako minimální útlumová k o noe ntrace (ΜIC), konc e nt ra c e př i které neb y1 o po z o ro váno ž á d né uvolnění hemoglobinu po inkubaci. Bylo určeno, že hodnota MIC pro Lys/Leu diastereomer peptidu 23 je 80 jjM.

• *

Seznam posloupností (1) Všeobecné informace (i) Zadatels (A) Jméno: YEDA RESEARCH AND DEVELOPMENT CO. LTD (B) Ulice: ve Weizmann Vědeckém Ústavu

P.O. Box 95 (C) Město: Rehovot (E) Stát: Izrael (F) Poštovní kód (ZIP): 76100 (0) Tel. číslo: 972--08-9470617 (H) Fax: 972-08-9470739 (ii) Název vynálezu: Antipatogenní peptidy a farmaceutické

P r o s t ř e d k y o b s a h u j í c í tyty p e p t i d y

(.i. i i.) Poče t pos 1 oupnos t í: 95 (i v) Po rma č tec í ho médi a pro počí tač:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC.....DOS/MS-DOS (D) Software: Patentová žádost 1.0, verze 1,30 (EPO) (v) Běžné informace týkající se žádosti:

Číslo aplikace:

(vi) Údaje o prioritě žádosti:

(A) Číslo aplikace: PCT/IL97/00066 (B) Datup padání: 20-únor-1997

(2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 1:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) To po log i e: 1 i neárη í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon; peptid 1 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k I í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (7, 18, 19) < D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t.- ¹¹D - a m i n o k y s e 1 i n o v é zbytky (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o /klíč: S t r a η n ě m o d i. f i. k o v a n ý (B) Umístění: 33 (D) D a 1 š í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t= ji n é¹' / p o z n á m k a= '' d v ě a m i n o e t h y 1 a m i n o s k u p i n y jsou připojeny k C-koncové části (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č„ 1:

Gly

Phe

Ala

Leu

Ile

Pro

Lys

I Ie

Ile

Ser

Pro

Leu

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Ala

Val

Gly

Ser

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Glu

• * * 9 9 · 9 · · ··· · * · 9 · « ·« • ·· 9 ♦ · · « fr * (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 2:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 22 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché (D5 Topologie: lineární (ii) Typ molekuly; peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon; peptid 2 ( i x) C h a r a k t e r i s t i. k a:

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (7, 18, 19) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky¹¹ ( i x ) C h a i'” a k t e r i s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č s S t r a η n ě m o d i f i. k o v a n ý (B) Umístění; 22 (D) D a 1 ě í i n f o r m a c e: / p r o d u k t= ¹¹ j i n é¹¹ / p o z n á m k a= ami n o e t h y 1 a m i n o s k u p 1. n a je připojena k C.....koncové části (xi) Popis posloupnosti: SEQ IB č. 2:

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val • » (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 3:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 22 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché (D) Τ o p o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon; peptid 3 ( i ) C h a r akte r i s t i k a:

(A) Jm éη o ίk1í č: S t ran n ě m o di f i k ov a n ý (B) Umístění: skupiny (7, 18, 19) (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t= ¹' D ·· a m i. n o k y s e I i n o v é zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č

Cly Phe Phe Ala Leu lle Lys Thr Leu Leu Ser Ala

Pro Lys lle lle Ser Ser Pro Leu Phe Val (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 4:

( i ) C h a r a k t e r i s t i. k y p o s I o u p n o s t i :

(A) Délka: 23 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid ♦♦ ·· ·· ·« • · * · · · c (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 4 (i;·;) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (8, 19, 20) (B) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky ( i x) C h a r a k t e r i s t i k a s (A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 23 (D) D a 1 ě í i n f o r m a o e: / p r o d u k t- ¹' j i n é'' / p o z n á m k a= '¹ a m i n o e t h y 1 a m i n o s k u p i. n a je připojena k 8-koncové části (1.) P o p i s p o s I o u p n o s t i.: 8 E Q ID č,, 4:

Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 5:

a i'- akte r i s t i. k y p o s .1 o u p n o s
(A)	Délka: 24 amino kyše
(B)	Typ: amino kyselina
(C)	Větvení: jednoduché
(D)	Topologie: 1ineárn í

(ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 5 *

• *· ·· ·· ·« • · · · · ·· · « • · · « ” a · tt • · »φ· * · «« ♦ « < . _tt.

*·· · · « · 9

·.· J· .t ..

(i:·;) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (9, 20, 21) (B) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (i x) C h a r a k t e r i s t i k a::

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 24 (D) Další informace: /produkt- jiné / p o z n á m k a- a m i n o e t h y 1 a m i n o s k u p i n a je připojena k C-koncové části (i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i s S E Q ID č. 5::

Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 6:

< i) C h a r akte r i. s t i k y p o s 1 o u ρ η o s t i::

(A) Délka: 24 amino kyselin (D) Typ: amino kyselina (C) Větveηí: j e dn oduc hé (D) T o p o 1 o g i e: 1. i. n e á r η í ( i i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 6 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč; Stranně modifikovaný • 9 f * • te • · « * 9 9 • 99 99 • v «· «9 i* • '♦ * · · fe « » 9« <

• * · 9 9 »··. ♦ .

• * « 9 fe ·· ·· ·« ·· (B) Umístění: skupiny (9, 20, 21) (B) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 6:

Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 7:

(i) C h a r a k t e r i s t i k y p o s .1 o u ρ n o s t i:

(A) Délka: 11 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e η í: j e d n o d u c h é (D) Τ o p o .1 o g i e: I i n e á r n i ( i i ) T y p m o 1 e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 7 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í č : S i r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 7 (D) Další informace: /produkt·- D-amino kyselinový zbytek (i x) C hara k te ri st i ka:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 11 (D) Další informace: /produkt-· jiné /poznámka- aminoethylamino skupina je připojena k C-koncové části (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 7;

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č, 8:

(i.) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větv ení: j edn od u c hé (D) Topologie: lineární ( i i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (v) Typ fragmentu (části): lineární (vii5 Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 8 (i. ) C h a r akte r i s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č : 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 33 (D) D a 1 š í .i. n f o r m a c e: / p r o d u k t^;= ji n é¹' / po z n á m k a= ¹¹ d vě am i n oe t h y 1 a m i n o s k u p i n y jsou připojeny k C-koncově části (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 8:

Gly

Phe

Ala

Leu

Ile

Pro

Lys

Ile

I le

Ser

Pro

Leu

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Ala

Val

Gly

Ser

Ala

Leu

Ser

Gly

Gin

Glu

• ·· v · *· ···· ··· ···· · · ····· ·· *· ·· ·· (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 9:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení, jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 9 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 13 (D) Další informace: /produkt-- D.....amino kyselinový zbytek ( i x) C h a r akte r i. s t i k a;

(A) Jméno / k 1 í č: S iranně (nad i. f i. kováný (B) Umístění: 33 (D) D a 1 š í i. n f o r m a <::: e: / p r o d u k t.= ji n é¹¹ / p o z n á m k a=^: '¹ d v ě a m i n o e t h y 1 a m i n o s k u p i n y jsou připojeny k C.....koncové části

( x i ) P o p i s p o s 1 o u p n o s ti: SEQ	ID č. 9:
Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro	Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe
Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val	Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly
Gly Gin Glu

(2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 10:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka; 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Τ o ρ α I o g i e: I i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu (části): lineární (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 10 (1. ) C h a r akte r i s t. i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i. k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (5, 19) (D) Další informace; /produkt™ D-amino kyselinové zbytky (1. :·;) C h a r akte r i s i i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a n ně m o d i. f i k o v a n ý (B) Umístění: 33 (D) DaIší i.nformace: /produkt- já.né'' / p o z n á m k. a^::™ ¹¹ d v ě a m i n o e i h y 1 a m i n o s k u p i n y jsou připojeny k C-koncové části

(i)

Pof

3Í5

posloupno

stí:

: SEQ

ID č

. 10:

Cly

Phe

Ala Leu

Ile

Pro

Lys

Ile Ile

Ser

Pro

Leu

Phe

Lys

Thr

Leu

Leu Ser

Ala

Val

Gly

Ser Ala

Leu

Ser

Gly

Cly

Gin

G1 u

(Ξ) Informace ο posloupnosti SEQ ID č. 11:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché (D) To ρoIo gi e: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (v) Typ fragmentu (části): lineární (vii) Přímý zdroj:

(B) l< n i h o v n a: p e p i i d 11 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k I í č: S t r a η n ě m o d i f i. k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (7, 19) (D) D a 1 ě í i n f o r m a c e: / p r o d u k t= '¹D.....a m .i. n o k y s e 1 i n o v é zbytky (i. x ) C h a r akte r i s t i. k a:

(A) J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 33 (D) D a 1 š í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t= ji n é¹¹ / p o z n á m k a= d v ě a m i n o e t h y I a m i n o s k u p i n y jsou připojeny k C-koncové části (xi) Popis posloupnosti: SEQ l'B č. 11:

Gly

Phe

Ala

Leu

Ile

Pro

Lys

Ile

1 1 θ

Ser

Pro Leu

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Ala

Val

Gly

Ser

A13

Leu

Ser

Ser Ser

Gly

GI n

G1 u

• · · · · · · · • · 9 · · · · ·· tt ·· (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 12:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché (D) T o ρ o 1 o g i e: 1 i. n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 12 ( i x ) C h a r a k t e r i s t i. k a:

(A) Jmén o/k1í č: St ra ηn ě modi f i k ováný (B) Umístění: 7 (B) D a 1 š í i n f o r m a c e s / p r o d u k t ¹¹D -· a m i n o k y s e 1 i. n o v ý zbytek (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i. f i k o váný (B) Umístění: 33 (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r cd d u k t.= j i n é /p o z ná mka= ¹¹ dv ě ami n o e th y1 a mi n o skup in y jsou připojeny k C.....koncové části (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 12:

Gly

Phe

Ala

Leu

Ile Pro

Lys

Ile

Ile Ser

Ser

Pro

Leu

Phe

Lys

Thr

Leu

Ser

Ala Val

Gly

Ser

Ala Leu

Ser

Gly

Gin

Glu

γη (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 13:

(i) Charakteristiky pošloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) To po1o gi e: li n eární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 13 (i ) C h a r akte r i štika:

(A) J m é n o / k I í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 7 (D) D a 1 š í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t™ '' D ····· a m i n o k y s e 1. i n o v ý zbytek (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č„ 13:

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gin Glu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě„ 14:

( i ) C h a i'- a k t e r i s t i k y p o s I o u ρ n o s 11.:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (G) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly; peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 14 ( i ) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (18, 19) (D) Další informace; /produkt“ D-amino kyselinové zbytky (i x) C h a r a k t. e r i s t i k a;

(A) Jmé no/k 1 í č : S t r aη n ě mo d i f i kovaný (B) Umístění; 33 (D) DaIš í i n f o rmace: /produ k t~ ji né'' / p o z n A m k a= d v ě a m i n o e t h y .1. a m i n o s k u p i n y jsou připojeny k Οkoncové části (i.) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S13 Q ID č „ 14:

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe

Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly

G1 y G1. n G1 u (2) I n f o r m a c e o p o s I o u ρ n o s t. i S E Q (i.) C h a r akte r i s t i k y p o s I o u ρ π o s t i :

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ; amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Topologie: lineární ··· ···· · ··· ·· ·· ·· ·t ·· (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 15 (i χ) Charakteristi ka:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (18, 19) (D) Další informace: /produkt™ D-amino kyselinově zbytky (xi) Popis posloupnosti: 888 ID č. 15:

Gly	Phe Phe	Ala	Leu Ile Pro	Lys Ile Ile	Ser Ser Pro Leu Phe
Lys	Thr	Leu	Leu	Ser	Ala Val	Gly Ser Ala	Leu Ser Ser Ser Gly
Gly	Gin	Glu

(2) Informace o posloupnosti SEQ ID č,, 16:

( i ) C h a i' akte r i s t i. k y p o s 1 o u ρ η o s t i :

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě i v e n í: j e d n o d u c h é (D) Τ α ρ o 1 o g i e: I i n e á r n í (i. i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i. d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 16 ( i x ) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (7, 18, 19) (D) Další informace: /produkt“ D-amino kyselinové zbytky

ΦΦ Φ · ·φ (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 16:

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly Ser Ala Leu Ser Ser Ser Gly Gly Gin Glu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č, 17:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 22 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jedno du ché (D) T o p o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii.) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 17 (i x) C ha rakte ri st i ka;

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 7 (D) D a 1 š i i n f o r m a c e: / p r o d u k t= '' D.....a m i n o k y s e 1 i n o v ý (i x) C h a r a k t e r i s tiká:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 22 (D) Další informace: /produkt= jiné /poznámka- aminoethylamino skupina • · · · • · · je připojena k C-koncové části (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 17:

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 18:

( i ) C h a r a k t e r i s t i k y p o s 1 o u p n o s t i ;

(A) Délka: 26 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e η í: j e d n o d u o h é (D) T o p o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 18 (ix) Ch a rakte ri st i k as (A) J m é n o / k I í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (5, 8, 17, 21) (D) Další, informace: /produkt“ D-amino kyselinové (i. x ) C h a r akte r i s i i k a:

(A) Jm é n o/k1í č : 81r a η n ě m o di f i ko váný (B) Umístění: 26 (D) Další informace: /produkt- jiné /pozná m k a- k a r bo x y1ov á s k u pi n a na C-koncové části je zaměněna amino skupinou • ·» • · * · (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 18:

Gly lle Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu lle Ser Trp lle Lys Arg Lys Arg Gin Glrt (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 19:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 26 amino kyselin (EU Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) To po1o g i e: 1 i neárn í ( i i ) T y p m o 1 e k u I y : p e p t. i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 19 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í Č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (5, 8, 17, 21) (D) Da1ěí informaoe: /produk t“ D-amino kyseI inové

(.i.) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i.: 8 E Q ID č. 19:

Gly lle Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu lle Ser Trp lle Lys Arg Lys Arg Gin Gin (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 20:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 22 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (B) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 20 ( i ) C h a r a k t e r i s t i k a;

(A) J m é n o /klíč: 8 i. r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (5, 8, 17, 21) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbyt ky¹¹ (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k I í č: 81 r a η n ě m o d i. f i. k o v a n ý (B) Umístění: 22 (D) Další informace: /produkt- jiné / p o z n á m k a- a m i n o e t h y I a m i n o s k u p i n a je připojena k C-koncové části (:! i ) Ρ o p i. s p o s I o u ρ n o s t i.: 8 E Q ID č „ 2 0 :

Gly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 21:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 19 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 21 (i :<) C hara k ter i s t i k a;

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 5, 14, 18) (D) ϋ a 1 š í i n f o r m a c e: / ρ r o d u k t = '¹D - a m i n o k y s e 1 i n o v é zbytky (i x) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 19 (D) Další informace: /produkt- jiné / p o z n á m k a=^: a m i. n o e t h y 1 a m i n o s k u p i n a je připojena k C-kaneové části ( x i.) Ρ α p i. s ρ o s 1 o u ρ n o s t i s S Ε 0 ID č „ 21:

Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Tle Ser Trp Lle Lys Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 22:

( i ) C h a r akte r i. s t i k y p o s 1 o u ρ n o s t i. s (A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě i v e η í: j e d n o d u c h é (D) Τ α ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í • ·· ·· ·« ·· ·· ··· * » ··· · · » • ·· · ··· · · · • · ··· ·· ·· ··· ·· ··· · · · · · • ·· «· ·· « · · · ·· (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon; peptid 22 ( i x ) C h a r a k t e r i s t i k a s (A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 4, 8, 10) (D) Ba i š í informace: /produkt= D-amino kyšeIinové zbytky (i χ) C h a r a k t e r .i. s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 12 (D) Další informace: /produkt- jiné / p o z n á m k a= k a r b o ;·: y I o v á s k u p i n a n a C.....koncové části je zaměněna amino skupinou (:·: i ) P o p i s p o s 1 o u p n o s i i : S E Q ID č „ 22:

Lys Leu Leu Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 23:

(.i.) C I) a i' akte r i. s t i. k y p o s I o u p n o s i i. s (A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid • · · · · «Μ Φ Φ · · • Φ Φ Φ · Φ · · ΦΦ Φ • Φ Φ · Φ * · Φ · Φ

Φ « Φ · Φ · · ·

ΦΦΦ Φ· ·· «Φ · · ΦΦ (vii) Přímý zdroj:

(Β) Klon: peptid 23 (i;·;) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč; Stranně modifikovaný (B) Umístění; skupiny (3, 4, 8, 10) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (i. ) C h a r akte r i štika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 12 (D) Další informace: /produkt- jiné /poznámka- karboxylová skupina na C-koncové části je zaměněna amino skupinou ( x i.) Ρ o p i s p o íí; 1 o u p it o s t i. s S E (2 ID č. 2 3::

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SE(2 ID č„ 24:

( i ) C h a i' akte r i s t i k y p o s 1 o u ρ n o s t i ::

(A)	Délka: 12	amino kyselin
(B)	Typ: amino	kysel ina
(C)	Větvení: j	ednaduché
(D)	Topologie s	Iineárn í

( i i ) T y p m o I e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 24 • 9 9 ·* ·· ·· ·· • · ♦ 9 9 ·· 9 · ·· · • 9· ···· ···· (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 4, 8, 10) (D) Další informace: /produkt^ D-amino kyselinové zbytky ( i x ) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 12 (B) Další informace: /produkt- jiné /poznámka- karboxylová skupina na C-koncové části je zaměněna amino skupinou ( x i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E (3 ID č. 2 4:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 25:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ α ρ o 1 o g i e; 1 i n e á r η í (i i ) T y p m o I e k u I y : p e p i i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 25 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 4, 8, 10) • ·· · · ·· ·· ·· ··· · · ·· · · ·· • ·· · · · · ·*· • · · · · ·· ·· ··· · · • · · · · · · · • · · · · ·· ·· »· · · (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (ix) Charakteristika;

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 12 (D) D a 1 š í i. n f o r m a c e: / p r o d u k. t= j i né /poznámka= karboxylová skupina na

C-koncové části je zaměněna amino skupinou (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 25:

Lys Lys Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Lys Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ IB č« 26:

(i) C h a i'“ akte r .i. s t .i. k y p o s I o u ρ n o s t i:

(A) Délka: 12 amino kyselin (Β) I y p: a mi n o k y s e 11 n a (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 26 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 12 (D) Další informace: /produkt= jiné /poz nám ka= kar box ylová skupina na Okaneové části je zaměněna amino skupinou (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 26:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 27;

( i ) C h a i- a k t e r i s i. i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: j ed n o d u c hé < D) T o ρ o I o g i e: I i n e á r η í ( i i ) Ί y p m o 1 e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 27 ( i x) C h a i' akte r i s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (1, 2, 5, 6, 7, 9, 11, 12) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky ( i x ) C h a r akte r i s t i. k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 12 (B) Další informace: /produkt= jiné /poznámka= karboxylové skupina na

C--koncové části je zaměněna amino skupinou (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 27:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 28:

( i ) Chara k te r is t i ky pos 1 oupnos ti:

(A) Délka: 6 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě i v e n í: j e d n o d u c h é (D) Ί o p α 1 o g i e: 1 i. n e á r n í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj;

(B) Klon: peptid 28 (i x) C ha rakte ri s ti ka:

(A) J m é n o / k 1 í č ; 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 4) (D) D a 1 š í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t-~ ¹' D.....a m i. n o k y s e 1 i n o v é ( x i ) P o p i. s p o s 1 o u p n o s t i : 8 E Q ID č „ 2 8:

Lys Leu Leu Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 29:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: S amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topo1og ie: 1 ineární ( i i.) T y p m o I e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 29 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/kIí ě: Stranně modi f i kovaný (B) Umístění: skupiny (2, 4, 6) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě„ 29:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Lys (2) I n f o r m a c e o p o s 1 o u ρ n o s t i S E Q ID ě,, 3 0:

( i ) C h a i'“ akte r i s t i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e n í: j e d n o d u c h é (I j) Τ o ρ o I o g i e:: .1 i n e á r n í (ii) Typ molekuly: peptid · · e ♦ « · · · · · · • · · · » ·» « · * · • · ·>·« ·· ♦ · ··* · * 4 • 99 ···· · · «···· · · 9 ♦ · · · 9 (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 30 (i;·;) Charakteristika:

(A) J m é n o /klíč: S t r a η n ě ni o d i f i k ováný (B) Umístění: skupiny (2, 6, El, 11) (D) Další informace: /produkt D-amino kyselinové zbytky (x i.) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : S E (3 ID ě „ 3 0:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys (2) I n f o r m a c e o p o s 1 o u p n o s t i El ΙΞ (3 ID č. 31:

(i.) C h a r a k t e r i s t i k y p o s 1 o u p n o s t i :

(A)	Délka: 12	amino kyše
(B)	Typ: amino	kyselina
(C)	Větvení: j	ednoduché
(D)	Topologie:	lineární

( i i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 31 ( i x ) C h a r akte r i. s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í ě : El t r a η n ě m o d i. f i. k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, Ei, 10, 11) (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky • ** 94 94 94 9»

9 4 9 9 9 · 4 · « · · • ·· « · · · « «, » ·

9 9 9 9 4 9 * · • · · 9 4 »9 9 9 9 9 9 9 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 31:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 32:

( i) Ch a r a kt e r i s ti k y pas 1 o u p n o st i:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ o μ) o I o g i e: 1. i n e á r η í ( i i) T y p m o I e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 32 ( i x ) C h a i' akte r i s t i k a:

(A) Jméno/k1í ě: Stranně mod i fi kovaný (B) Umístění: skupiny (3, 5, S, 9, 11) (D) D a1š í i nf o rmace: /p ro du k t= ¹¹D-am i n o k y se1 i nové zbytky ( x i ) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : S E Q ID č. 3 2:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 33:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché »«

I • · *« ·9 ·* ·· • · · · · > · · • · · · » í f · ♦ · · · · 9 • · ·« II ·· (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 33 (i x) Cha ra k teri s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 4, S, 10) (D) Další informace: /produkt= B-amino kyselinově zbytky (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o /klí č : S i. r a η n ě m o d i f i k o váný (B) Umístění: 12 (D) B a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t^::::: jiné /poznámka- karboxylové skupina na C - k o n c ové č á s i i b y 1 a z a m ě n ě n a a m i n o s k. u p i. n o u'' ( x i.) F' o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E Q ID č.

Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Ala Lys Ala Ala Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 34:

( i ) C h a i'- a k t e r i s t i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (B) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid • ·· ·· ·· ·· «· • · · · · · · · · ·· · • ·· 1 * ·· 9 ^9 · • · · · · » » ·· ··« ·«· ······· · · »9 *9 99 99 tt 99 γγ (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 34 ( i:·:) Charakteristika;

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 4, 8, 10) (D) Další informace: /produkt.- D-amino kyselinové zbytky (i ;·!) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 12 (D) D a ]. š í i n f o r m a c e : / p r o d u k t = ji n é'' /poznámka- karboxylová skupina na C.....koncové části byla zaměněna amino skupinou ( x i.) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : S E (3 ID č. 3 4:

Lys Val Val Val Lys Val Val Val Lys Val Val Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 35:

( i ) C h a i'- akte r i s t i. k y p o s 1 o u p n o s t i ::

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid • · · ···· · · • ·· · · e· ·· ·· ·· (vii) Přímý zdroj:

(B) Klan: peptid 35 (ix) Charakteristika:

(A) Jména/klíě; Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 6, 8, 11) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky ( x i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E Q 1' D ě. 35:

Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 36:

( i ) C h a r a k t e r i s t i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t. v e η í: j e d n o d u c h é (D) Topologie: lineární

(.i. i ) Ί y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 36 (i x ) C h a r akte r i s ti k a:

(A) J m é n o / k .1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o váný (B) Umístění: skupiny (1.,4, 8, 10, 11) (D) Další informace: /produkt™ D-amino kyselinové zbytky

(xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 36:

Lys Val Val Val Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě„ 37:

(i) Cha rakte r i s t i k y pos1oupn os t i:

(A) Délka; 12 amino kyselin (B) Typ; amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Τ o ρ o I o g i e: 1 i n e á r η í (i. i) T y p m o 3. e k u 1 y s p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 37 (i x) C ha rakte r i s t i k a:

(A) Jméno/ k 3. í č : Stranně mod i f i kovaný (B) Umístění: skupiny (3, 5, 8, 9, 3.3.) (D) Další informace: /produkt D-amino kyselinové zbytky ( x i ) Ρ α p i s p o s 1 o u ρ n o s t i.: 8 E Q ID ě „ 3 7:

Lys Val Val Va). Lys Val Lys Val Lys Val Val Lys (2) Informace? o posloupnosti SEQ ID č. 38:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka; 6 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché

100 ··· · · · · · · ·«··· ·· · · ·· · · (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 38 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 6) (D) Další informace: /produkt-· D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 38:

Lys Leu Ile Leu Lys Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 39:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 6 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větveηí: jednoduché (D) T o p o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 39 ( i x ) C h a r a k t e r i. s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 6)

101 (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 39:

Lys Val Leu His Leu Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID £. 40:

(i) Cha ra k te r i s t i k y poslau ρnos t i:

(A) Délka: 6 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větveηí s jednoduché (D) Τ o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(Β) K1 o n ; p e p t i d 4 0 (i. x) C h a r akte r i s t i k a:

(A) J méno/k1í £: S traηně modi f i kováný (B) Umístění: skupiny (2, 6) (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t.= '¹D.....a m i n o kyselí n o v é zbytky (i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E Q ID £. 4 0:

Leu Lys Leu Arg Leu Leu • · • · · · · ·

102 (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 41;

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 6 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ apologie: 1 i n e á r η í (i i) Ty p moIek uIy: pe pi i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 41 ( i :·:) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/k1íč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 4 (D) Další informace: /produkt= D.....amino kyselinový zbytek (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č„ 41:

Lys Pro Leu His Leu Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 42:

(i) C har akte r i s tiky po s1o uρn o s t i:

(A) Délka: 8 amino kyselin (B) Typ; amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid ί 03 (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 42 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/k 'lič: Stranně mod i f i kovaný (B) Umístění; skupiny (2, 3, 4, 6) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky ( x i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E Q ID č,, 4 2;

Lys Leu Ile Leu Lys Leu Val Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 43:

(i) C ha ra k te ri s t i k y pošlou ρn o s t i:

(A) Délka: 8 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: j ednoduch é (D) T o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 43 ( i x ) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) J m é n o / k I í č: S t r a η n ě ni o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 4, 5, 6) (D) Další informace: /produkt³⁵ D-amino kyselinové zbytky «· ·· · · «· ··

104 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 43:

Lys Val Phe His Leu Leu His Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 44:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 8 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché (D) Τ o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (i i) Ty p molek u1y: pe p ti d (vii) Přímý zdroj::

(B) Klon: peptid 44 (i. x ) C h a i' akte r i s t i k a::

(A) J m é n o / k 1 í č :: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (1, 2, 4, 6, 7) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky ( x i ) Ρ o p 1. s p o s 1 o u ρ n o s t i.:: S E Q ID č. 4· 4·::

His Lys Phe Arg Ile Leu Lys Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 45:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 8 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché

105 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 45 (i;·:) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 5 (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinový zbytek (i.) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : S E (3 ID č. 4 5:

Lys Pro Phe His Ile Leu His Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 46:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (i i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 46 (i;·;) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (1, 2, 6, 8, 11) • · • · · · · ·

106 (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 46:

Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 47:

( i ) C h a r a k t e r i s t .i. k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e η í s j e d n o d u c h é (D) Τ o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í ( i i ) T y p m o 1 e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj ii (B) Klon: peptid 47 ( i x ) C h a i'- akte r i s t i. k a:

(A) J m é n o / k 1 í č n S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění:: skupiny (2, 3, 4, 8, 10, 11) (D) D a I š í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t.= ¹¹D - a m i n o k y s e I i η o v é zbytky ( x i ) Ρ o p i s p o s I o u ρ n o s t i : S E Q ID č. 4 7::

Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys • · • · · ·

107 (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 48:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Ί o p o 1 o g i e: I i n e á r η í (i i) Ty p mo1e k ulys pe p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 48 (i;·;) Charakteristika:

(A 5 J m é n o / k I í č: 81 r a η n ě m o d i. f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (1, 3, 5, 8, 9, 11) (D) D a I ě í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t~ D - a m i n o kyše 1 i n o v é (:·; i ) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : 8 E Q ID čí. 4 8:

Lys Ile Ile Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Ile Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID čí. 49:

( i ) C h a i'“ akte r i s t i k y p o s 1 o u p n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: j e dn od uché (D) Topologie; lineární (ii) Typ molekuly; peptid • · ·· ·· ·· »·

108 (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 49 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 7 (D) Další informace: /produkt- B-amino kyselinový zbytek“ (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 49:

Lys Ile Pro Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Pro Lys (2) 1' n f o r m a c e o p o s 1 o u ρ n o s t i S E Q ID č „ 5 0 s

C h a r a k t e r i s t .i. k y p o s I o u ρ n o s t i :
(A)	Délka: 12	amino kyselin
(B)	Typ; amino	kyselina
(C)	Větvení: j	ednoduché
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 50 (i x) Cha rakte r i s t i k a:

(A) Jm én o/klíč: St raη n ě mod i fi kovan ý (B) Umístění: skupiny (6, 10) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky • · · · · · · · · · ·· · ··· · ·· • · · · · · · · • · · · · ·· ·· ·· ··

109 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 50:

Lys Ile Pro Ile Lys Ile Lys Ile Lys Ile Val Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 51:

(i ) C ha ra k ter i s t i ky pos .1 ou pnos t i :

(A) Délka; 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) T o p o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (i i) T y p m o 1 e k u 1. y: p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 51 (i. χ ) C h a r akte r i s t i k a:

(A) J m é n o / k I í ě: S t r a η n ě m o d .'i. f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 4, 6, 8, 11) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové (:·: i ) P o p i. s p o s 1 o u p n o s t i : 8 E Q ID š „ 51:

Arg Ue Ile Ile Arg Ile Arg Ile Arg Ile Ile Arg (2) Informace a posloupnosti SEQ IB č. 52:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení; jednoduché

110 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 52 (ix) Charakteristika:

(A) J m é η o ί k 1 í č: S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11) (D) D a 1 š í i n f o r m a c: e: / p r o d u k t= D ~ a m i n o k y s e 1 i. n o v é zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č« 52:

Arg lle lle lle Arg lle Arg lle Arg lle lle Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 53:

( i ) C h a r a k t. e r i s t i k. y p o s 1 o u ρ n o s t i.:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větveηí: j e dn o duch é (D) Τ o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 53 ( i x) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (1, 3, 5, 8, 9, 11) • · ·· · · ·· ·· ·· · · ·· · * · · ······ · · ·· ·· ·· ·· ··

111 (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 53:

Arg Ile Ile Ile Arg Ile Arg l'.le Arg Ile Ile Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 54:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (i. i ) T y p m o 1. e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 54 ( i x ) C h a i'- akte r i s t i. k a:

(A) J m é η o ί k I í č: S t r a η n ě m o d i f i. k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 6, 8, 11) (D) Další informace: /produkt- D.....amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě. 54:

Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg • ·· · · 9 9 9 9 *· ··· · · 9 9 · · · · 9 • · · ···· ·«·· ······· 9 9 • 9 9 99 ·· 9» 9 9 ··

112 (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 55:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ; amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ o p o 1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 55 ( i x ) C h a rakte ri s tiká:

(A) J m é n o / k 1 í ě: S i r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 8, 10, 11) (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t= D a m i n o kyše I i n o v é zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě. 55:

Arg Ile Ile Val Arg Ile Arg Leu Arg Ile Ile Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID íí. 56:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid

113 (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 56 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 5, 8, 9, 11) (D) Další informace: /produkt·- D-amino kyselinově zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 56:

Arg Ile Cly Ile Arg Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg (2) I n f o r m a c e o p o s I o u p n o s t i 8 E Q ID č» 5 7:

( i ) C h a r a k t e r i s t i k y p o s I o u p n o s t i :

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větve ηí: j edn odu ché (D) T o p o .1 o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

OB) Klon: peptid 57 (ix) Charakteristika;

(A) J m é n o / k I í č s 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 6, 8, 11) (D) Další informace: /produkt»· D-amino kyselinové zbytky • ·* ·· »« ·· r· * ♦ · · Φ · · » · · » » • · · · · · · ···· ···«·· · · « • · · · · · · · · ·· ··

114 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 57:

Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 58:

( i ) C h a r a k t e r i s t. i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka; 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τα ρoIo g i e: 1 i n eární (i i) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t .i. d (vii) Přímý zdroj:

(Β) K1on: pe p t i d 58 (i. x ) C h a r akte r .'i. s tiká s (A) J m é n o / k 1 í ě: 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 8, 10, 11) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (:·: i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : 8 E Q ID ě. 58:

Arg Ile Ala Val Lys Trp Arg Leu Arg Phe Ile Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 59:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 12 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché φ φ« φφφ · • φ« • · < · • · * · · ΦΙ « Φ ·

115 (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 59 (ix) Charakteristika;

(A) Jmén o/klič: St r aη ně mod i fi k ova n ý (B) Umístění: skupiny (3, 5, 8, 9, 11) (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (x i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : 8' E 0 ID č. 59:

Lys Ile Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg (2) Informace o posloupnosti SEC ID č. 60:

h a r akte ri s t i k y po s1o u ρn os t i: (A) Délka: 12 amino kyselin (Β) T y p: a m i n o k y s e I i n a (C) Větvení: j edno duché (D) Ί o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í
Typ	molekuly: peptid

(vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 60 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 4, 7, 10, 11) *

44

4· tf • 4· • 4 4 • · 4

4 44 • · »

ι ·

<4

4 « • · ·« « * «* • tf

116 (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 60:

Lys Lys Ile Gly Trp Leu Ile Ile Arg Val Arg Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 61:

(i ) C h a r a k t e r i s t. i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka; 14 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e η í s . j e d n o d u c h é (D) To po 1 o g i. e: .1 i. neA rη í ( i i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t. i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 61 (i. x) C h a i' akte r i. s t i k a:

(A) Jméno/kl. íč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 6, 8, 11, 13) (D) Další informace: /produkt™ D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti; SEQ ID č» 61:

Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg

117 (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 62:

(i) Charakteristiky posloupnosti;

(A) Délka: 14 amino kyselin (D) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topo.1 ogie: 1 ineárn í (i i) Typ mo1e k uIy: pe p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 62 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (1..4, 8, 10, 11, 13, 14) (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: ί p r o d u k t D - a m i n o k y s e I i. n o v é zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 62:

Arg Ile Ile Val Arg Ile Arg Leu Arg Ile Ile Arg Val Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 63;

(i) Cha rakte ri s t i ky p o s1 o uρηo st i:

(A) Délka; 14 amino kyselin (Β) T y p: a m i n o k y s e 1 i n a (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid

118 (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 63 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (3, 5, 8, 9, 11, 14) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (x i ) P o p i. s p o s 1 o u p n o s t i : 8 E (3 ID č. 6 3:

Arg lle Cly lle Arg Leu Arg Val Arg lle lle Arg Arg Val (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 64:

(i) C ha r a kte r i s t i k y poslau pn os ti:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větve ηí: j e dnoduo hé (D) Ί o p o 1 o g i e: I i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 64 (i x) C ha ra kte r i s tiká:

' (A) J m é n o / k 1 í č: 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (1, 2, 6, 7, 11, 15, 16)

119 • ·· · · · · · · · • · ··· ·· ·· ··· ··· ·«·· · ····· · · ·· · · (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 64:

Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ala Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 65:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e η í: . j e d n o d u c h é (D) Topologie: lineární

(.i. i ) T y p m o 1 e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj :

(B) Klon: peptid 65 ( i x ) C h a i' akte r i s t i k a:

(A) J mén o / k 1 í č:,: S t. ran n ě mod .i f i k ován ý (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14,

16) (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t.= ¹¹D - a m i n o kyše 1 i n o v é zbytky ( x i ) P o p i s p o s 1. o u ρ η o s t i.: S E Q ID ě „ 6 5:

Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu ϊ 20 (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 66:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r η í ( i i ) Ty p mo 1. e k u 1 y : pe p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 66 (ix) Charakteristika:

(A) Jmén o/klíč: St raη ně mo d i f i k ov aný (B) Umístění: skupiny (1, 3, U, 8, 9, 11, 13, 14, 16) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 66:

Lys Ile Cly Ile Lys Ala Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Ile (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 67:

( i ) C h a i' akte r i. s t i k y p o s 1. o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Topologie: lineární (:i.i) Typ molekuly: peptid

121 (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 67 (i x) Charak teristi ka:

(A) Jméno/k1íě: Stranně mod i f i kovaný (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14,

16) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č„ 67:

A r g 11 e 11 e Val H i s 11 e A r g I... e u A r g 11 e 11 e H i s H i. s 11 e A r g Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě„ 68:

( i ) C h a r a k t e r i s t i. k y p o s 1 o u p n o s t i :

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) T o p o 1 o g i e: .1 i n e á r η í ( i i ) T y p m o I e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 68 (ix) Charakteristika:

(A) Jmén o/k1í ě: S traη n ě mod i f ikovaný (B) Umístění: skupiny (1, 3, 5, 8, 9, 11, 13, 14, 16) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEG ID č. 68:

His Ile Gly Ile Lys Ala His Val Arg Ile Ile Arg Val His Ile Ile (2) Informace o posloupnosti

SEG ID č. 69:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina < C) V ě t v e η í: j e d n o d u c h é (D) Topologie: lineární ( i .i.) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klan: peptid 69 (i. !;) C h a r akte r i. s t i k a:

(A) Jméηa/klíč: St r a η n ě modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 4, 7, 9, 10, 11, 13, 14, 16) (D) D a 1. š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t~= ¹¹D -- a m i n o k y s e 1 i n o v é zbytky ( x i ) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : S E (3 ID č „ 6 9:

Arg Ile Tyr Val Lys Ile His Leu Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu (2) Informace o posloupnosti SEG ID č. 70:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 16 amino kyselin

Η Π7 (Β) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (B) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 70 ( i:·:) Charakteristika:

(A) J m é n o / k I í č : S i r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (1, 3, 5, 8, 9, 11-, 13, 14, 16) (B) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (x i ) Ρ o p i. s p o s 1 o u ρ n o s t i.: S E Q 1D ě. 7 0:

Lys Ile Gly His Lys Ala Arg Val His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 71:

( i ) C h a r akte r i s t i. k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) D é I k a: 16 a m i n o k y s e 1 i n (Β) T y p: a m i n o k y s e 1 i n a (G) Větve η í: je dn o duc hé (D) T o ρ o 1 o g i e: I i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon; peptid 71

124 (i;·:) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 7, 8, 10, 11, 13, 14,

16) (D) Další informace: /produkt-™ D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č« 71:

Arg Ile Tyr Val Lys Pro His Pro Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 72:

( i ) C h a r akte r i. s t i. k y p o s 1 o u ρ n o s t i.:

(A)	Délka: 16	amino kyše
(B)	Typ: amino	kyselina
(C)	Větven í: j ed n oduo hé
(D)	Topologie:	lineární

(ii) Typ molekuly (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 72 ( i x ) C h a i' akte r i s t i k a:

(A) J m é n o / k I í č : S t r a η n ě m o d i. f i. k o váný (B) Umístění: skupiny (3, 5, 8, 9, 11, 13, 14, 16) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky • · • ·

125 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě. 72:

Lys Pra Gly His Lys Ala Arg F'ro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 73:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 19 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e n í: j e d n o d u c h é (D) Topologie: lineární ( i i ) T y p m o 1 e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 73 ( i z ) C h a r akte r i. s t i k a s (A) J m é n o / k 1. í ě : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 6, 7, 11, 15, 16, 18) (D) D a I š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t- '¹D - a m i. n o k y s e I i n o v é zbytky (;: i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E Q ID ě „ 7 3:

Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě„ 74:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 19 amino kyselin • · <

126 (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 74 ( i ) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 13,

14, 16, 17, 19) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky

(:·: .i.)	Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E (3 ID č „ 7 4:
A i' g	Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile
Leu	Ile Lys Lys
Infor	•mace o posloupnosti SEQ ID č. 75:
(i)	C ha r akte ri s t i ky po s1o u ρn o s ti: (A) Délka: 19 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Vě tve ní: jed nodu ché (D) Ί o ρ o 1 o g i e: 1 i n e á r n í

(i i) T y p m α I e k u 1 y: p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 75

127 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíě: Stranně modifikovaný (ED Umístění: skupiny (3, 4, 5, 8, 9, 11, 13, 14, 16,

17, 18) (ED Další informace: /produkt--· D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 75;

Lys Ile Cly Trp Lys Leu Arg Val Arg Ile Ile Arg Val Lys Ile Cly Arg Leu Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 76:

(i.) C ha rakter i s tiky pos 1 ou pn ost i :

(A) Délka: 25 amino kyselin (ED Typ: amino kyselina (C) Větveηí: . j edno du c hé (D) Ί o p o 1 o g i e: I i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(D) Klon: peptid 76 ( i x) C h a i' akte r i s t i. k a:

(A) J m é n o / k 1 í ě : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (ED Umístění: skupiny (2, 6, 7, 11, 15, 16, 18, 20, '?ζι. o¹-·; ί .1... 1 ·!·« *»»»/ t (ED Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky

128 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 76:

Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg Lys Ile Val Lys Val Lys Arg Ile Arg (2) I n f o r m a c e o p o s 1 o u ρ n o s t i 8 E Q ID ě „ 7 7:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 26 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární ( i i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 77 ( i x) C h a r akte r i s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í ě : 8 i r a η n ě m o d i f i. k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 6, 7, 8, 10, 11, 13,

14, 16, 17, 19.,,22, 24, 25) (D) D a 3. š í i n f o r m a c es / p r o d u k t= ¹¹D ····· a m i n o k y s e 3. i n o v é zbytky ( x i.) Ρ o p i s p o s 3. o u ρ n o s t i : S E Q ID ě „ 77:

Arg Phe Ala Val. Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys Lys Ile Arg Lys Arg Val Ile Lys

129 (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 78;

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka; 30 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Τ α ρ α I o g i e; I i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 78 (i. x ) C h a r akte r i s t i k a s (A) J m é n o / k 1 í ě : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (3, 4, 5, 8, 9, 11, 13, 14, 16,

17, 18, 22, 23, 24, 27, 28, 30 (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě. 78:

Lys Ala Gly Trp Lys Leu Arg Val Arg lle lle Arg Val Lys lle Cly Arg Leu Arg Lys lle Cly Trp Lys Lys Arg Val Arg IIe Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě„ 79:

·, ( i ) C h a r a k t e r i s t i k y p o s I o u ρ n o s t i:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Topologie: lineární

130 (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 79 ( i ) C h a r a k t e r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně mod ifikováný (B) Umístění: skupiny (2..5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky¹¹ (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 79:

Arg Ile Tyr Val Lys Pro His Pro Arg Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu (2) I n f o r m a o e o p o s 1 o u ρ n o s t i.

SEQ ID č

80:

(i.) C h a r akte r i. s t. i k y p o s 1 o u ρ n o s t i s (A) D é 1 k a: 16 a m i n o k y s e I i n (B) Typ: amino kyselina (C) Větve ηí: j e dnodu c hé (D) Τ α ρ o 1 o g i e: I i n e á r η í < i i) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i. d (vii) Přímý zdroj:

\ (B) Klon: peptid 80 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í č s S t r a η n ě m o d i f i k o v a π ý (B) Umístění: skupiny (1, 2, 3, 5, 7.«11, 13, 14, 16) (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové

131 zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 80:

Lys Pro Gly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 81:

( i ) C h a r a k t e r i s t. i k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 19 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (G) Větvení: .jednoduché (D) T o ρ o I o g i e: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 81 ( i ) C h a r akte r i s t i. k a:

(A) J m é n o / k 1 í ě : 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 4,,,,8, 10,,,,13, 15, 16, 18) (D) D a I ě í i. n f o r m a c e: / p r o d u k t = '' D.....a m i η o k y e e 1 i n o v é zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě„ 81:

Lys Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Ile Arg Lys Ile Val

132 • · · · · ·· ·· · · • · · · · · · · · « • ·· · ··· · · · • · ··· ·· ·· ··· ·· • · · ···· · • · · · · · · · · ·· · (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 82:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 19 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) T o p o I o g i e: I i n e á r η í

Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 82 ( i ) C h a r akte r i s t i k a:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 6»„11, 13, 14, 16, 17

19) (D) Další informace: /produkt- D.....amino kyselinové zbytky < X i.) P o p i. s p o s I o u p n o s t i : 8 E Q ID č „ 8 2:

Arg Ile Ile Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys Lys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č„ 83:

( i ) C h a r akte r i s t i k y p o s 1 o u p n o s t i.:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (B) Topologie: lineární

1~7 (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 83 (ix) Charakteristikas (A) Jméno/kIí č: St ranně mod i fi kováný (B) Umístění: skupiny (2..5, 7, 8, 10, 11, 13, 14, 16) (D) Další informace: /produkt™ D-amino kyselinově zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě„ 83:

Arg Ile Tyr Val Ser Lys Ile Ser Ile Tyr Ile Lys Lys Ile Arg Leu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 84:

(i) Cha r akte r i st i ky posIou ρ nost i:

(A) Délka: 19 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ o ρ o I o g i e: I i n e á r η í ( i i ) Ί y p m o I e k u 1 y : p e p t i. d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 84 (ix) Charakteristika:

(A) J m é n o / k 1 í ě : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (2, 4..8, 10..13, 15, 16, 18) (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové

134 zbytky • · · * »· ·· • * · · » « • · · · · · (xi) Popis posloupnosti: SEQ l'D C, 84:

Lys lle Val lle Phe Thr Arg lle Arg Leu Thr Ser lle Arg lle Arg (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 85:

(i) C ha rakte r i s t i k y pošlou pn os t i:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větve n í s .je d n o d u c h é (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 85 (i. x ) C h a i' akte r i. s i i k a:

(A) Jméno/k1í č: Stranně mod i f i kovaný (B) Umístění: skupiny (1, 2, 3, 5, 7,,,,11, 13, 14, 16) (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID ě„ 85:

I.... y s P r o 11 e 14 i s L y s A1 a A r g P r o T h r 11 e 11 e A r g T y r L y s M e t lle (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 86:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 25 amino kyselin

135 (B) Typ; amino kyselina (C) Větvení; jednoduché (D) Topologie; kruhová ( i i ) T y p m o 1 e k u 1 y: p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 86 ( i :·:) C h a r a k t e r i. s t i k a:

(A) Jm é no/k1í š: 8 i raηně mod i fi k ováný (B) Umístění; skupiny (9, 20, 21) (D) Další informace: /produkt^ D-amino kyselinové zbytky ( χ i ) P o p i s p o s 1. o u ρ n o s t i : 8 E (3 ID š „ 8 6:

Cys Lys Cly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Cys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 87:

( i ) C h a i'·· akte r .i. s 11. k y p o s I o u ρ n o s t i :

(A) D éIka: 26a mino ky se 1 i n (Β) T y p: a m i n o k y s e I i n a (C) Větve η í: je d n o d u <::: h é (D) T o ρ o 1 o g i e: k r u h o v á (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 87 ·« • ·

136 (2) (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (10, 21, 22) (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové zbytky ( x i ) Ρ o p i s p o s 1 o u ρ n o s t i : S E Q ID č. 87:

Cys Lys Lys Cly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Cys

Informace o posloupnosti SEQ ID č. 88:

(i) C h a r akte r i s t i. k y p o s 1 o u ρ n o s t i :

(A) Délka: 27 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: .jednoduché (D) Τ α ρ α I o g i e: k r u h o v á

(.i. i ) Ί y p m o 1 e k u I y : p e p t i. d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 88 ( i :·;) C h a r akte r i s t i k a;

(A) Jméno/k1í č: 81ra ηně modi f i ková n ý (B) Umístění; skupiny (11, 22, 23) (D) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 88:

Cys Lys Lys Lys Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Ile Ile Ser ·· ·· ·* ·· «« » · ···· · * « ·

137

Ser F'ro Leu Phe Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Cys (2) Informace o posloupnosti SEC ID č. 89:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 16 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e ní: j e d n o d u c h é (D) Τo ρo1o g i e: k ru hová (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj;

(B) Klon: peptid 89 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID čí, 89:

Cys Arg Ile Val Ile Arg Ile Arg Ile Arg Leu Ile Arg Ile Arg Cys (2) Informace o posloupností SEQ ID čí, 90:

(i) C ha rakte ri s ti ky po sI ou ρn o s ti:

(A)	Délka: 18	amino kyše
(B)	Typ: amino	k y se 1 i. n a
(C)	Větve ηí: j ed no du c hé
(D)	Topologie:	kruhová

(ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj;

(B) Klon; peptid 90

138 (ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: skupiny (2, 3, 4, 6, 8..12, 14, 15, 17) (B) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č„ 90:

Cys Lys Pro Cly His Lys Ala Arg Pro His Ile Ile Arg Tyr Lys Ile Ile Cys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 91:

(i) C ha rakte r i s t i k y p o sI o u ρn os t i:

(A)	Délka: 28	amino kyselin
(B)	Typ: amino	kyselina
(C)	Větvení: jednoduché
(D)	Topologie:	k rubová

( i i.) T y p m o 1 e k u I y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 91 ( i x ) C h a i' akte r .i. s t i k a:

(A) J m é n o / k I í č: 81 r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (3, 4, 5, 7, 8, 9, 11, 12, 14,

15, 17, 18, 20.„23, 25, 26) (B) Další informace: /produkt= D-amino kyselinové by tky • · · · · · · • · · · · ·· · • · · · · · · ··· · · · · · · ····· ·· ·· ·· ··

139 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 91:

Cys Arg Phe Ala Val Lys Ile Arg Leu Arg Ile Ile Lys Lys Ile Arg Leu Ile Lys Lys Ile Arg Lys Arg Val Ile Lys Cys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 92:

(i.) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 13 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) V ě t v e η í: j e d n o d u c h é (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 23C (část peptidu 92) (ix) Charakteristikas (A) J m é η o /klíč : S i r a η n ě m o d i f i. k o váný (B) Umístění: skupiny (3, 4, 8, 10) (D) Další informace: /produkt- D-amino kyselinové zbytky (A) (B) (D) k ten štika:

J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý

Umístění: 13

D a 1 š í i n f o r m a c e: / p ro d u k t- '' j i n é¹' / p o z n á m k a= '' k a r b o y I o v á s k u p i n a n a C-koncové části byla zaměněna amino skupinou

140 (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 92:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Leu Leu Lys Leu

Leu Lys Cys (2) Informace o posloupnosti SEQ ID č. 93:

(i) Cha ra kte r i s ti k y pošlou ρn os t i:

(A) Délka: 13 amino kyselin (B) Typ: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) Τ o ρ o 1 o g i e:: 1 i n e á r η í (ii) Typ molekuly; peptid (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: peptid 24C (část peptidu 93) ( i ) C h a r akte r i. s t i k a s (A) J m é n o / k 1 í č s S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: skupiny (3, 4, 8, 10) (D) D a 1 š í i n f o r m a c e: / p r o d u k t= '' D ~ a m i n o k y s e I i n o v é ( i ) C h a r akte r i s t i k a:

(A) J m é n o / k 1 í č : S t r a η n ě m o d i f i k o v a n ý (B) Umístění: 13 (D) Další informace: /produkt- jiné /poznám k a - '¹ k a r b o x y 1 o v á s k u p i n a rt a C-koncové části byla zaměněna amino skupinou (xi) Popis posloupnosti: SEQ ID č. 93:

Lys Leu Leu Leu Lys Leu Lys Leu Lys Leu Leu Lys Cys

141 (2) Informace ο posloupnosti SEQ ID č. 94:

(i) Charakteristiky posloupnosti:

(A) Délka: 33 amino kyselin (B) lyp: amino kyselina (C) Větvení: jednoduché (D) To p o 1o gi e: lineární (i. i ) T y p m o 1 e k u 1 y : p e p t i d (vii) Přímý zdroj:

(B) Klon; pardaxin (i ) P o p i s p o s 1 o u p n o s t i : S E Q ID

Gly Phe Phe Ala Leu Ile Pro Lys Lys Thr Leu Leu Ser Ala Val Gly

č. 94:

Ile Ile Ser Ser Pro Leu Phe Ser Ala Leu Ser Ser Ser Cly

Gly Gin Glu (2) Informace o posloupnosti SEQ ID ě. 95:

(i ) C h a r akte r i s t i. k y p o s 1 o u p n o s t. i:

(A) Délka: 26	amino kyše
(B) Typ: amino	kyselina
(C) Větvení; j	ednoduché
(D) Topologie:	1 irieárn í
(ii) Typ molekuly: p	eptid
(vii) Přímý zdroj:

(B) Klon: mellitin

• · · ·

142 <ix) Charakteristika:

(A) Jméno/klíč: Stranně modifikovaný (B) Umístění: 26 (D) Další informace: /produkt.- jiné /pozná m k a= kar ta o xylová s k u p i na n a

C-kancové části byla zaměněna amino skupinou (xi) Popis posloupnosti: SEG ID č. 95:

Cly Ile Gly Ala Val Leu Lys Val Leu Thr Thr Gly Leu Pro Ala Leu Ile Ser Trp Ile Lys Arg Lys Arg Gin Gin

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Nehemoiytické cytolytícké činidlo valené z peptidu, komplexu svázaných peptidů, směsi peptidů nebo nahodilého kopolymeru peptidů, uvedené činidla mající selektivní cytolytícké účinky projevující se v tom, že činidlo má cytolytícké účinky na P a to ge η η í b u ή k y p ř eds t a v u j í c í bu ή k y, k t e r é se v tě1e n e vy s k y tu j í přirozeně zahrnující mikrobiální patogenní organismy a zhoubné buňky; a činidlo je nehemoiytické, totiž nemá žádné cytolytícké účinky na červené krevní buňky nebo má cytolytícké účinky na červené krevní buňky v koncentracích, které jsou podstatně vyšší n e ž k o n c e n t r a c e p ř i k t e r é p r o j e v u j í u v e d e n é c y t o 1 y i i c k é ú č i n k y; uvedené nehemoiytické cytolytícké činidlo je voleno ze skupiny zahrnuj íc í:

(1) cyklický derivát peptidu mající čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1, a obsahující jak L-amino kyselinové zbytky, tak i D-amino kyselinové zbytky, nebo obsahující buď L-amino kyselinové zbytky nebo D.....amino kyselinové zbytky nebo oba tyt o t y p y a o b s a h u j í c í « - h e I i x o v o u p ř e r u š o v a c í č á s t;
(2) peptid obsahující jak L-amino kyselinové zbytky, tak i D.....amino kyselinové zbytky, mající čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1, a mající posloupnost amino kyselin t a k o v o u, ž e o d ρ o v í d a j í c ί ρ o s I o u ρ n o s t a m i. n o k y s e 1 i n o b s a h u j í c í pouze L.....amino kyselinové zbytky se v přírodě nevyskytuje, a j e h o c y k 1 i. c k é d e r i v á t y ;
(3) komp 1 ex obsahu j í c í ve 1 ké množství 2 nebo v í ce nehemo I y ti.c k.ýc h cytolytických peptidů, každý peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +.1., a obsahuje jak L-amino kyselinové zbytky, tak i D-amino kyselinové zbytky, nebo obsahuje buď L-amino kyselinové zbytky nebo D-amino kyselinové zbytky nebo oba tyto typy a obsahuje «-helixovou přerušovací část, nebo jeho cyklické deriváty, uvedené peptidy jsou společně

144 provázané použitím spojovací molekuly kovalentně vázané ke každému z peptidů;
(4) směs obsahující velké množství 2 nebo více nehemolytických cytolytických peptidů, každý peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1, a obsahuje jak L-amino kyselinové zbytky, tak i D-amino kyselinové zbytky nebo obsahuje buď L-amino kyselinové zbytky nebo D-amino kyselinové zbytky nebo oba tyto typy a obsahuje «-helixovou přerušovací část, nebo její cyklické deriváty; a (5) n e u s p o ř á d a n ý k o ρ o 1 y m e r o b s a h u j í c í r ů z n é p o m ě r y h y d r o f o b η ί, pozitivně nabité a D-amino kyseliny.

2. Cyklický peptid podle nároku 1(1) obsahující jak D-, tak i Lamino kyselinové zbytky mající posloupnost, takovou, že stejnorodý peptid otevřeného řetězce obsahující pouze L- nebo Da m i n o k y s e 1 i n o v é z b y t. k y a m a j í c í s t e j nou pos 1 o u ρ n o s t a m i n o kyselin jako uvedený peptid, má α-helixovou konfiguraci a má š i r o k é s p e k t r u m c y t o 1 y t i c k ý c h ú č i π k ů p r o j e v u j í c í c h s e n a různých buňkách.

3. Cyklický peptid podle nároku 2, který představuje cyklický diastereomer odvozený z pardaxinu nebo mellitinu nebo z jejich částí.

4. C y k I i c k ý p e p t. i d ρ o d I e n á r o k u 3, ve k t e r é m č i s t ý ρ o z i t i v η í náboj vyšší než +1 je díky přírodnímu amino kyselinovému s I o ž e η ί n e b o je z í s k á η n e u t r a 1 i z a c í v o 1 n ý c h k a r b o y I o v ý c h skupin nebo dodáním pozitivně nabitých amino kyselinových z b y i. k ů a / n e b o p o z i t i v n ě n a b i t ý c In c h e m i c k ý c h s k u p i. n „

5. Cyklický peptid podle nároku 4, který je volen z cyklického diastereomerů pardaxinu nebo jeho části, ke které byly dodány Lys zbytky k N-koncové části a/nebo aminoethylamino skupiny • · · ··· · · · ·

145 byly dodány k C-koncové části.

6. Cyklický peptid podle nároku 5 volený z cyklických peptidů odvozených z pardaxinu v textu označených jako peptidy 86 až 88 s posloupností:

86: Cyklický K^{* 1} [ D .1P⁷ LJ-⁸ L¹ ? C1 až 22 3-par s posloupností:

Cvs-Lvs-Glv-Phe-Phe-flla-Leu-Ile-Pro-Lvs-Ile-Ile-Ser-Ser-P ro-Leu-P he-Lys-Thr-Leu-Leu - Se r-Ala-Va1-Cy s

87: Cyklický kU-K² CD3P⁷L¹⁸L^1<? C 1 až 223-par s posloupností:

Cys-Lys-Lys-Gly- P h e - Phe ····· A1 a - L e u ··· 11 e - Pro L y s - Ile-Ile-Ser„c jer r o -L e u P h e L v s - T h r-Leu-Leu-Se r-A1 a-Va 1 -C

88: Cyklický l<^:Ll<²K^{3 *} CD3P⁷L.^:L8L.^:I·⁹ Cl až 223.....par s posloupností:

C y s ·· L y s ·- L y s - ί... y s ····· G1 y - P h e.....P h e - AI a -1.... e u -11 e.....Pro- L y s 11 e -11. e ber ·· S e r ··· P r o --Leu ··· P h e ··· L y s ··· T h r ··· Leu-Leu-Ser - Ala - V a I - C y s

7. Peptid podle nároku 1(2) obsahující jak L-amino kyselinové zbytky, tak i D-amino kyselinové zbytky a mající posloupnost a m i n o k y s e 1 i n t a k o v o u, ž e o d p o v í d a j í c í a m i n o k y s e I i. n o v á

P o s 1 o u ρ n o s t o b s a h u j í c ί p o u z e I.........a m i n o k y s e 1 i. n o v é z b y t k y s e v

P ř í r o d ě n e v y s k y t u j e _v 8. P e p t i d p o d 1 e n á r o k u 7 m a j í c ί n á s 1 e d u j í c í. c h a r a k. t e r i s t i k y :

(a) peptid představuje nepřírodní syntetický peptid tvořený ¹ různými poměry alespoň jedné hydrofobní amino kyseliny a alespoň jedné pozitivně nabité amino kyseliny, ve kterém posloupnost alespoň jednoho z amino kyselinových zbytků je D-amino kyselina;

• 9 · · ·· ·· ··

146 (b) peptid má čistý pozitivní náboj, který je vyšší než +1; a (o) poměr hydrofobních k pozitivně nabitým amino kyselinám je takový, že peptid je cytolytický k patogenním buňkám, ale nevyvolává cytolýzu červených krevních buněk.

9. Peptid padle nároku 8, ve kterém pozitivně nabitá amino k y s e 1 i n a j e v α I e n a z e s k u p iny z a h r n u j í c í 1 y s i η, a r g i n i. n a histidin a hydrofobní amino kyselina je volena ze skupiny z a h i' n u j í c ί 1 e u c i η, i. z o 1 e u c i η, gly c i η, a I a n i η, váli η, fenylalanin, prolin, tyrosin a tryptofan.

10. Peptid podle nároku 9, ve kterém čistý pozitivní náboj vyšší než +1 je díky amino kyselinovému složení nebo díky dodání P o z i t i v n ě n a b i. t ý c h c h e m i c k ý c h s k u p i η n e b o k t e r é h o h y d r o f o b n o s t může být snížena dodáním polárních amino kyselin, takových jako serin, threonin, methionin, asparagin, glutamin a cystein„

11. Peptid podle nároku 10 mající alespoň 6 amino kyselinových z b y t k ů, v e k t e r é m h y d r o f o b η í a m .i. n o k y s e I i n a p ř e d s t a v u. j e leucin, alanin nebo valin a pozitivně nabitá amino kyselina představuje lysin.

12. P’ e p t i d p o d 1. e n á r o k u 11 p ř e d s tav u j í c í d i a s t e r e α m e r 6 ··· m e r, 8-mer nebo 12-mer peptidu tvořeného leucinem a lysinem, ve kterém alespoň jedna třetina posloupnosti je tvořena D-amino kyselinami, ale s vyloučením peptidu, který je v textu označen .1... ·...' II

23 ? Lys ···· L e u -Leu-Leu-L y s - Leu-Leu -Leu-Lys -Leu-L e u - L y s - M Ha

13. Leu/Lys diastereomer podle nároku 12 volený ze skupiny peptidů označených v textu 24 až 29 (SEQ ID č.: 24 až 29, jednotlivě) s posloupností:

··· · · · · · · • ·· · · ·· · · ·· ··

147

24: Lys-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Lvs-Leu-Lys-Leu-Leu-Lvs-NH?

25: Lvs-Lvs-Leu-leu-Lvs-Leu-Lvs-Leu-Lvs-Leu-Lvs-Lvs-NH?

26: Lvs-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu - Le li Lvs-L e u-Leu—Lvs-N H₂

27: Lvs-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-LvsLeu-LYS~Leu-Leu-Lvs-NHs

28: Ly s-Leu-L..eu-Leu-Leu-Ly s

29: Lys-Leu-L.eu-Leu-L.ys-Leu-Leu-Lys

14. Cyklický derivát, nepři radního syntetického peptidu padle kteréhokoliv z nároků 7 až 13 volený ze skupiny peptidů v textu označovaných 92 až 95 s posloupností:

92: C y k 1 i c k ý C y s- Ly s-L.e u-Leu-Leu-L y s -L. e u ····· Le u -Leu- L e u -Lys - C y s 93: Cy k 1 ický C v s -1... v s - L e u - Leu-Leu- L v s - L e u -L. v s - Leu- L e u - L v s~Cv s 94: ΗM-Ly s-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-L.eu-Ly s-C0

95: Η Ν -1.... y s - L e u-Leu-Leu-L y s - L e u - L y s -Leu- L y s -Leu- L e u - L y s - C C

15. I< o m ρ I e x p r o váza n ý c h p e p t i d ů p o d I e n á r o k u 1 (3) o b s a h uj í c í velké množství 2 nebo více nehemolytických cytolytických peptidů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, uvedené peptidy jsou vzájemně provázané přes spojovací molekulu kovalentně vázanou na každý z peptidů,,

16. Komplex podle nároku 15, ve kterém je svazek tvořen 2 nebo více, výhodně 5, molekulami stejného peptidu nebo různých peptidů a spojovací molekula představuje peptid podle kte ré ho k o I i v z p ředcházející ch n á ro k ů ne b o bě ž n ě pou živa nou s p o j o v a c í m o 3. e k u 1 u „

17. Komplex podle nároku 16 volený z provázaných Lys/Leu diastereomerů v textu označovaných 96 a 97:

• · · · · · ··· · · ·· ··

148

96: (CDl—L³,ío-«₄L8C)e LD3-L³’⁴’⁸¹í^-KaLs s posloupností:

(Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Lys-Cvs-NH?)e”

-Lvs-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu-Lvs-NH?

97: (L D 3 -LA ’ 4 ’ 8 ’ i o “Ke L₇ C) e - L D 3 -LA ’ 4, s , i o ~|<₄1„_{(? s} posloupností:

(Lvs-Leu-Leu-Leu-Lv s-Leu-Lv s-Leu-Lv s-Leu-Leu-Lv s-Cv s-M 1-b )e “

-Lvs-Leu-Leu-Leu-Lys-Leu-Leu-Leu-Lvs-Leu-Leu-Lvs-NH?

18. Směs podle nároku 1(4) vyznačující se tím, že obsahuje velké množství 2 nebo více nehemolytických cytolytických peptidů, ve které peptidy představují ty definované v kterémkoliv z nároků .1. až 4.

19. Smě s po d1e n á r o k u 18 v y z nač u j í c í s e L y s / L. e u 12 - m e r d i a s t e r e o m e r ů p e p t i d u, tím, že zahrnuje směs

20. Ne hemo Iy t i c k ý c y to 1y ti c k ý neus po řádaný k o ρo1y me r pod1e n á ro k u 1(5) obsa hu j íc í rů z n é poměry hydrofobηί, po z i t i vn ě n a bi i é a 13.....amino kyseliny„

21. Ne hemo 1y t ick ý c y to 1y t i cký neus po řád aný k α ρo 1y me r pod1e n á ro k u 20 tvořený lysinem, leucinem a D-leucinem v poměru 1:1:1, 2:1s1 nebo 3:1:1 (mol)„

22. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje n e h e m o 1 y i. i c k é c y t o 1 y i. i c k é č i n i d 1 o p o d 1. e k t e r é h o k o 1 i v z n á r o k ú 1 až 21 a farmaceuticky akceptovatelný nosič,,

23. Farmaceutický prostředek podle nároku 22 vyznačující se tím,

V že prostředek je určen pro ošetření infekcí způsobených , p a t o g e η η í m i o r g a n i s m y,,

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 23 vyznačující se tím, že patogenní organismy jsou voleny ze skupiny zahrnující * · · · tf · « ·· ··· · · ·· · · ·· « • · · · · · · ·««· • · ··· ·« ·· ··· ··> ··· · · · ♦ · « • 9 9 9 9 9 9 9 9 Λ 9 99

149 bakterie, plísně, prvoky, mykoplasmu a viry.

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 24 vyznačující se tím, že patogenními organismy jsou bakterie.

26. Fa i'mac eu t i c k ý p r os t i¹edek pod 1 e n á r o k u 22 vy z n ač u jící se t í m, že prostředek je určen pro ošetření rakoviny.

1/14