CZ294539B6

CZ294539B6 - Serin-acetyltransferáza, sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu, mikroorganismus, který má metabolismus cysteinu deregulovaný a způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu

Info

Publication number: CZ294539B6
Application number: CZ19981269A
Authority: CZ
Inventors: Walfred Dr. Leinfelder; Peter Dr. Heinrich
Original assignee: Consortium für elektrochemische Industrie GmbH
Priority date: 1995-10-26
Filing date: 1996-10-24
Publication date: 2005-01-12
Also published as: WO1997015673A1; HUP9900078A2; HUP9900078A3; JP2000504926A; CA2235752A1; PL327187A1; HU224097B1; JP3329825B2; BR9610910A; DK0858510T3; KR19990067120A; DE59608521D1; PL186403B1; US6218168B1; MX9803317A; KR100275287B1; EP0858510A1; ES2169269T3; CZ126998A3; CN1155711C

Abstract

Řešení se týká serin-acetyltransferázy, která vykazuje ve srovnání a divokým typem enzymu sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a proteinovou sekvenci, která ve srovnání se sekvencí divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, přičemž mutace se nachází v sekvenční oblasti od aminokyseliny v pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 nebo delece v sekvenční oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 227, přičemž pozice 1 je iniciační methionin z obrázku 5 (SEQ ID č.: 1) a přičemž je vyloučena mutace Met na Ile v pozici 256. Dále se týká sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu, mikroorganismu, který má metabolismus cysteinu deregulovaný nejméně jednou uvedenou sekvencí DNA a způsobu výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a sloučenin odvozených od L-cysteinu, při kterém se uvedené mikroorganismy kultivují v živném médiu.ŕ

Description

Serin-acetyltransferáza, sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu, mikroorganismus, který má metabolismus cysteinu deregulovaný a způsob výroby Oacetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L-cysteinu

Oblast techniky

Vynález se týká serin-acetyltransferáza, sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu, mikroorganizmu, který má metabolismus cysteinu deregulovaný a způsobu výroby Oacetylserinu, L-cysteinu a od něj odvozených sloučenin obsahujících síru.

Dosavadní stav techniky

L-cystein a jeho deriváty se používají ve farmacii (ošetřování bronchiálních onemocnění), v kosmetice (jako součást vlasových šamponů a přípravků pro trvalou ondulaci) a v potravinářství (jako antioxidans, zesilovač chutě a jako adjuvans při zpracování těsta). Lcystein se dosud získává extrakcí z materiálů obsahujících keratin, jako vlasy, štětiny, rohy, kopyta a pera nebo enzymatickou přeměnou prekurzorů. Nadprodukce L-cysteinu mikroorganizmy je velmi žádoucí, protože hospodářsky zajímavou sloučeninou je nejenom L-cystein, ale protože navíc představuje, jak vyplývá z obrázků 1-3, důležitou mezisloučeninou pro syntézu glutathionu, methioninu a biotinu.

L-cystein zaujímá ve všech organizmech klíčovou pozici při metabolizmu síry a používá se při syntéze proteinů, glutathionu, biotinu, methioninu a dalších metabolitů obsahujících síru. Navíc slouží L-cystein jako prekurzor pro biosyntézu koenzymu A, navíc se může L-cystein snadno oxidovat na cystin. Mezi biosyntézou L-cysteinu a dalších aminokyselin jako L-serin, glycin a L-methionin existuje úzká souvislost.

Syntéza L-cysteinu (obrázek 4) v prokaryontech, obzvláště bakteriích, je podrobně prozkoumána (Kredich, N. M. a G. M. Tomkins 1966, J. Bio. Chem. 241, 4955-4965; Kredich, N. M., 1987, Biosyntesis of Cysteine. V: Neidhardt F. C., Ingraham, J. L., Magasanik B., Low. K. B., Schaechter M., Umbarger Η. E. (eds) Escherichia Coli and Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, Vol. 1 Američan Society for Microbiology, Washington D. C., 419-428). Klíčová reakce spočívá v přenosu acetylové skupiny na serin k přípravě O-acetylserinu 1), následovaná výměnou acetylové skupiny za skupinu-SH, čímž se syntetizuje L-cystein 2).

1) L-serin + acetyl-koenzym A -> O-acetylserin + koenzym A

2) O-acetylserin + H₂S -> L-cystein + acetát

V mikroorganizmech a v rostlinách slouží O-acetylserin a nikoliv serin jako předstupeň uhlíkové struktury pro L-cystein (Kredich, N. M. a G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241, 4955-4965). Reakce přenosu acetylové skupiny ke tvorbě aktivované formy L-serinu se katalyzuje serinacetyl-transferázou kódovanou genem cysE (EC 2.3.1.30) a podléhá striktní kontrole konečným produktem, L-cysteinem. Gen pro serin-acetyltransferázu byl již klonován a sekvence aminokyselin odvozená od sekvence DNA je známá (Denk, D. a Bock, A. 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 515-525).

Tvorba L-cysteinu samotného je katalyzována dvěma izoenzymy O-acetylserin-sulfohydrolázy (EC 4.2.99.8), kódovanými geny cysK (O-acetylserin-sulfhydroláza-A) a cysM (O-acetylserinsulfhydroláza-B), reakce, ve které funguje O-acetylserin jako donor β-alanylu a H₂S jako akceptor β-alanylu (Kredich, N. M. a G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241, 4955-4965), přičemž O-acetylserin-sulfhydroláza-A má hlavní podíl na syntéze cysteinu. Navíc je O-acetylserinsulfhydroláza-B (cysM) schopná využít thiosulfát jako zdroj síry (Sirko, A. a spol., J. Gen.

-1 CZ 294539 B6

Microbiol. 133, 2719-2725). O-acetylserin-sulfhydroláza-B katalyzuje reakci mezi O-acetylserinem a thiosulfátem za vzniku S-sulfocysteinu, který se pak může konvertovat na cystein (Nakamura, T. a spol. 1983, J. Bacteriol. 156, 656-662).

Potlačení konečného produktu formy divokého typu serin-acetyltransferázy L-cysteinem je fyziologicky významným faktorem při kinetické regulaci biosyntézy cysteinu (Kredich, N. M. 1971, J. Biol. Chem. 246, 3474-3484; Kredich, N. M. a G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241, 4955-4965). Aktivita divokého typu serin-acetyltransferázy je potlačena cysteinem. Toto potlačení bylo kineticky vyšetřováno a vykazuje kompetitivní charakteristiku. Byla stanovena inhibiční konstanta K = 1,1 x ΙΟ^-6 M v přítomnosti 0,1 mM acetyl-koenzymu A a 1 mM Lserinu (Kredich, N. M. a G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241, 4955-4965).

Z literatury je znám příklad, že se chemickou mutagenezí cystein-auxotrofního kmene ethylesterem kyseliny methansulfonové může izolovat cystein-prototrofní revertant, jehož serinacetyltransferázová aktivita na základě výměny aminokyselin v kódované oblasti vykazuje mírné potlačení inhibiční aktivity konečným produktem L-cysteinem (Denk, D., Bóck, A., 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 515-525). Feedback-rezistence těchto mutantů je podle známých literárních pramenů desetinásobně zvýšena. K, těchto mutantů tak činí asi 0,01 mM oproti formě divokého typu.

Předložený vynález se týká serin-acetyltransferáz, které ve srovnání s divokým typem enzymu vykazují sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a jejichž proteinová sekvence ve srovnání se sekvencí divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, vyznačující se tím, že se mutace nachází v sekvenční oblasti aminokyseliny v pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 nebo delece v oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 227, přičemž pozice jedna je iniciační methionin z obrázku 5 (SEQ ID č.: 1) a přičemž je vyloučena proteinová sekvence s mutací Met na Ile v pozici 256.

Podstata vynálezu

Překvapivě bylo objeveno, že výměny aminokyselin podle vynálezu a/nebo delece aminokyselin karboxylovém konci serin-acetyltransferázy vedou ke snížení citlivosti vůči cysteinu za zachování dostatečné enzymatické aktivity.

Předmětem předloženého vynálezu je serin-acetyltransferáza, která ve srovnání s divokým typem enzymu vykazuje sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a jejíž proteinová sekvence ve srovnání se sekvencí divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, ve které se mutace nachází v sekvenční oblasti od aminokyseliny v pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 nebo se delece nachází v sekvenční oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 248 až včetně aminokyseliny 259, přičemž pozice jedna je iniciační methionin z obrázku 5 (SEQ ID č.: 1) a přičemž je vyloučenina mutace Met na Ile v pozici 256, a že serin-acetyltransferáza má inhibiční konstantu K, 0,02 až 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA.

Výhodně její proteinová sekvence zahrnuje výměnu aminokyselin nejméně jednoho z mutantů cysE uvedených v tabulce 1 a nebo deleci podle tabulky lb.

Inhibiční konstanty (K) obzvláště výhodných mutantů enzymu oproti L-cysteinu leží mezi 0,02 a 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA.

Serin-acetyltransferázy podle vynálezu vykazují dostatečnou aktivitu pro růst mikroorganizmů, které ji obsahují.

-2CZ 294539 B6

Tabulka la

: Feedback-rezistentní cysE-alely s jednotlivými nebo násobnými výměnami aminokyselin v kódované oblasti

Mutanty cysE	Výměna nukleotidu(č.)	Výměna aminokyseliny (č.)	Κ_±(μΜ)	spec. akt pmol/min *
cysEII	GGC->AGC (934)	Gly238->Ser238	10	0,068
cysEIII	GGT->GAT (176)	Glyl65->Asp/165	10	0,030
cysEIV	GCT->GTT (932) GGC->AGC (934)	Ala237->Val237 Gly238->Ser238	40	0,170
cysEV	GCT->GTT (932) GGC->AGC (934) ATG->ATA (990)	Ala237->Val237 Gly238->Ser238 Met256->Ile256	10	0,246
cysEVI	GGC->AGC (934) ATG->ATA (990)	Gly238->Ser238 Met256->Ile256	10	0,075
cysEVII	GCT->GTT (932)	Ala237->Val237	10	0,253
cysEVIII	ATG->ATA (990) GCT->GTT (932)	Met256->Ile256 Ala237->Val237	30	0,160

-3CZ 294539 B6

Tabulka la: Feedback-rezistentní cysE—alely s jednotlivými nebo násobnými výměnami aminokyselin v kódované oblasti (dokončení).

Mutanty cysE	Výměna nukleoxidu(č.)	Výměna aminokyseliny (č.)	Κ_£(μΜ)	spec. akr gmol/min x mg
cysEX	ACG-X3CG (721)	Thrl67->Alal67	50	0,156
cysEXI	ACG->GCG (721) GGT->AGT (955)	Thrl67->Alal67 Gly245->Ser245	700	0,117
cysEXII	AAA->CAA (511) GGC->AGC (934) TTT->TTG (1023)	Lys97->Gln97 Gly238->Ser238 Phe267->Leu267	40	0,254
cysEXIII	GTT->GTT (713) TTT->TTG (1023)	Vall64->Alal64 Phe267->Leu267	30	0,213
cysEXIV	ACG->GCG (721) ATG->TAG (988+989)	Thrl67->Alal67 Met256->Stop256	>1000	0,453
cysEXVI	GAT->GGT (971) AAG->TAG (973)	Asp250->Gly250 Lys251->Stop251	50	0,554
cysEXVII	GGT->GAT (716) ACG->GCG (721)	Glyl65- Aspll65 Thrl67- Alal67	100	0,052
cysEXXIII	ACG->GCG GCT->GTT GGC->AGC	Thrl67- Alal67 Ala237- Val237 Gly238- Ser238	2300	0,085

-4CZ 294539 B6

Tabulka 1 b: Feedback-rezistentní cysE-alely s delecemi na karboxylovém konci

Mutant cysE	Deletované aminokyseliny	Terminální aminokyseliny	Ki(pM)	spec. akt gmol/min x mg
cysE-Del259	14	His259	7,5	0,328
cysE-Del258	15	Gln258	5	0,256
cysE-Del257	16	Asp257	7,5	0,394
cysE-Del256	17	Met256	12,5	0,366
cysE-Del255	18	Asp255	30	0,624
cysE-De!250	23	Asp250	20	0,405
cysE-Del249	24	Ser249	15	0,420
cysE-Del248	25	Asp248	12,5	0,270

Serin-acetyltransferázy insenzitivní vůči cysteinu podle vynálezu se mohou získat příkladně expresí sekvencí DNA, které kódují pro serin-acetyltransferázy podle vynálezu.

Těmito sekvencemi DNA kódované varianty enzymů vykazují vždy rozdílnou citlivost oproti 10 inhibitoru L-cysteinu, přičemž ve všech případech však byla ve srovnání s divokým typem nalezena nejméně pětkrát zvýšená rezistence serin-acetyltransferázy oproti inhibitoru Lcysteinu.

Předložený vynález se dále týká sekvencí DNA, které kódují pro serin-acetyltransferázy podle 15 vynálezu.

Tyto sekvence DNA se vyznačují tím, že v kódované sekvenční oblasti DNA daného genu cysE od bp 510 do bp 1040 vykazují nejméně jednu mutaci, přičemž bp 1 je první báze z obrázku 6 (SEQ ID NO: 2), přičemž je vyloučenina mutace guaninu na adenin, thymidin nebo cytosin 20 v pozici 990.

Dále budou sekvence DNA podle vynálezu označovány také jako feedback-rezistentní cysEalely.

Tyto sekvence DNA je možné vyrobit příkladné nespecifickými nebo cílenými mutagenezními metodami z výchozích materiálů popsaných dále.

Nespecifické mutace v rámci uvedené oblasti DNA se mohou provádět příkladně chemickými agenciemi (příkladně nitrosoguanidin, kyselina ethylmethansulfonová) a/nebo fyzikálními meto30 dami (Miller, J. H., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory,

USA, 113-185) a/nebo reakcemi PCR, prováděnými za určitých podmínek (Gibbs, R. A. 1990, Anal. Chem. 62, 1202-1214).

Metody k zavedení mutací ve specifických pozicích v rámci jednoho fragmentu DNA jsou známy 35 a jsou popsány příkladně v následujících pramenech: Sarkar, G., Sommer, S. S., 1990,

BioTechniques 8, 440-407 popisují ortospecifické mutageneze podle PCR; Ausubel, F. M. a

-5CZ 294539 B6 spol., 1987, s. 8.01-8.3.6 Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, popsány metody k ortospecifické mutagenezi pomocí fágů M13.

Další metodou k výrobě feedback-rezistentní cysE-alely spočívá v kombinaci různých bodových mutací, vedoucích k feedback-rezistenci k multiplenovým mutantům snovými vlastnostmi.

Jako výchozí materiál pro mutageneze slouží s výhodou DNA divokého typu genu cysE nebo mutací inaktivovaný gen cysE nebo mutovaný cysE gen již kódovaný pro feedback-rezistentní serinacetyltransferázu.

Mutovaný gen cysE může být chromozomálně nebo extrachromozomálně kódovaný.

Výchozí DNA-fragment, příkladně obsahující divoký typ genu cysE, se může rekombinovat známými standardními technikami za vzniku rekombinantní DNA na jednom vektoru. Použitím výše uvedených mutagenezních metod se jeden nebo několik nukleotidů sekvence DNA změní tak, že nyní genem kódovaná sekvence aminokyselin vykazuje nejméně jednu mutaci v sekvenční pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 a nejméně jednu deleci v sekvenční oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 227, přičemž pozice jedna je startovacím methioninem podle obrázku 5 (SEQ ID č.: 1) a přičemž mutace z Met na Ile v pozici 256 je vyloučena.

Popsanými technikami je možné zavést do libovolného genu cysE jednu nebo několik mutací v uvedené oblasti DNA, které způsobí, že kódovaná serin-acetyltransferáza má sekvenci aminokyselin vedoucí k insenzitivitě vůči cysteinu.

V návaznosti na provedenou mutagenezi, jak je popsáno výše, se provádí selekce mutantů s požadovaným fenotypem příkladně plátováním na médiu neobsahujícím cystein a následným stanovením rozsahu citlivosti mutované serin-acetyltransferázy vůči cysteinu.

Dalším předmětem vynálezu jsou mikroorganizmy, které obsahují feedback-rezistentní cysEalely.

Takové kmeny mikroorganizmů se vyznačují tím, že obsahují nejméně jednu cysteinovou výměnu, deregulovanou pomocí feedback-rezistentní cysE-Alle.

Protože látková výměna cysteinu probíhá u všech mikroorganizmů principiálně stejným, obecně známým způsobem látkové výměny a techniky použité k výrobě kmenů podle vynálezu jsou obecně známé příkladně ze standardních učebnic a použitelné na všechny mikroorganizmy, je možné vyrábět kmeny podle vynálezu z libovolných mikroorganizmů.

S výhodou jsou k výrobě kmenů podle vynálezu vhodné bakterie.

Obzvláště výhodné jsou gramnegativní bakterie, obzvláště E. coli.

Dalším předmětem vynálezu je výroba L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu kultivací mikroorganizmů podle vynálezu.

Feedback-rezistentní cysE-alely umožňují vyloučení kontroly důležitého biosyntetického kontrolního bodu, přičemž se produkce četných sloučenin ležících ve směru tohoto kontrolního bodu zesiluje. K tomu patří zejména O-acetylserin, L-cystein a produkty příbuzné L-cysteinu. Produkty příbuzné L-cysteinu jsou všechny odvozené od L-cysteinu, to znamená sloučeniny obsahující síru, k jejichž výrobě je L-cystein nezbytný. Příklady takových produktů jsou kyselina 2(R,S)-methyl-thiazolidin-2(R,S),4(R)-dikarboxylová, homocystein, methionin, biotin a glutathion.

-6CZ 294539 B6

Feedback-rezistentní cysE-alely se transformují k expresi se změněným serin-acetyltransferázovým enzymem pomocí obvyklých způsobů na hostitelském kmenu. „Screening“ kmenů se změněnými serin-acetyltransferázovými vlastnostmi se provádí příkladně podle metod popsaných dále.

Ke stanovení míry insenzitivity vůči cysteinu změněného enzymu se nejprve měří vylučování cysteinu kmenů v semikvantitativním tak zvaném křížovém vyživovacím testu. K tomu se pěstují testované kmeny na minimálním médiu neobsahujícím cystein, ale obsahujícím cysteinauxotrofní indikátorový kmen. Růstová zóna indikátorového kmenu okolo dané očkovací linie (halo) slouží jako semikvantitativní míra vylučování cysteinu. Všechny kmeny, které v křížovém vyživovacím testu vykazují odezvu s průměrem > 2 mm, se v „křížovém vyživovacím testu označují jako pozitivní“. S vybranými kmeny se provádí test enzymové aktivity ke stanovení míry cysteinové tolerance změněné serin-acetyltransferázy.

Ke stanovení senzitivity serin-acetyltransferázy vůči cysteinu se může použít každá metoda, která umožňuje stanovit aktivitu tohoto enzymu v přítomnosti cysteinu. Příkladně se může stanovení serin-acetyltransferázové aktivity provádět metodou, kterou popsal Kredich a Tomkins v J. Biol. Chem. 241, 4955-4565 (1966). V případě tohoto testu obsahuje enzymová testovací směs substrát L-serin a kofaktor acetyl-koenzym A. Reakce se nastartuje přídavkem enzymu a sleduje na základě poklesu absorpce při 232 nm, který je vyvolán štěpením thioesterové sloučeniny v acetylkoenzymu A pomocí spektrálního fotometru.

Popsaný enzymový test je vhodný ke stanovení senzitivity každého serin-acetyltransferázového enzymu vůči cysteinu, včetně enzymů s modifikovaným karboxylovým koncem. Potlačení serinacetyltransferázové aktivity se testuje v přítomnosti různých koncentrací L-cysteinu. Katalytická aktivita různých serin-acetyltransferázových enzymů se stanovuje jednak v přítomnosti a jednak v nepřítomnosti L-cysteinu a z výsledků se stanovuje inhibiční konstanta Ki (Kredich, N. M. a G. M. Tomkins 1966, J. Biol. Chem. 241,4955-4965).

Ve většině případů je výhodná enzymaticky aktivní serin-acetyltransferáza se sníženou cysteinovou aktivitou. Pro jiné účely může být požadováno současné snížení senzitivity konečného produktu a katalytické aktivity.

Zpravidla není žádoucí silná nadprodukce rezistentní serin-acetyltransferázy jako konečného produktu, protože se přitom ve zvýšené míře tvořený O-acetylserin, L-cystein nebo od něj odvozené metabolity hromadí v buňce, toxifíkují ji a mohly by vyvolat selekci mutantů s redukovanou serin-acetyltransferázovou aktivitou. Proto se s výhodou integrují do genomu cysE-alely feedback-rezistentní s výhodou jako jednotlivá kopie pomocí obvyklých způsobů.

Metody pro integraci jednotlivých genů do chromozomu s pomocí vhodných vektorů odpovídají stavu techniky (příkladně Winans a spol., 1985, J. Bacteriol. 161, 1219-1221; Shevell a spol., 1988, J. Bacteriol. 170, 3294-3296; Kulakauskas a spol., 1991, J. Bacteriol. 173, 2633-2638).

Rovněž je výhodné exprimovat feedback-rezistentní serin-acetyltransferázy na plazmidech s nízkým počtem kopií.

Jak je známo, že vykazuje expresní vektor vedle feedback-rezistentní cysE-alely s výhodou ještě další dodatečné elementy, popsané dále.

Kódované sekvence, nacházející se na vektoru jsou s výhodou spojeny s regulačními elementy, které jsou nutné pro expresi kódovaných sekvencí v požadované míře.

Příklady těchto regulačních elementů jsou promotory, ribosomální spojovací místa a terminální sekvence. Ve většině případů se použijí pro expresi mutantů podle vynálezu přirozené regulační sekvence cysE. Mohou se však použít libovolné jiné regulační sekvence.

-7CZ 294539 B6

Vedle regulačním elementů se s výhodou nacházejí na expresním vektoru také sekvence, které kódují pro selektivní markér a/nebo reporterový gen. Exprese selekčních markérů tohoto druhu usnadňují identifikaci transformantů. Jako selekční markéry jsou vhodné geny, které kódují rezistenci vůči příkladně ampicilinu, tetracyklinu, kanamycinu, chloramfenikolu nebo dalším antibiotikům.

Pokud se mají mutanty podle vynálezu extrachromozomálně replikovat, měl by plazmidový vektor s výhodou obsahovat původní bod replikace. Strategie k integraci genů do chromozomů s pomocí vektorů, z nichž byl odstraněn původní bod replikace, jsou podle stavu techniky známé (Winans a spol., 1985, J. Bacteriol. 161, 1219-1221; Shevell a spol., 1988, J. Bacteriol. 170, 3294-3296; Kulakauskas a spol., 1991, J. Bacteriol. 173, 2633-2638).

Příklady vektorů, které jsou autonomně replikovatelné na E. coli uvádí příkladně Pouwels, P. H., Enger-Valk, B. E., Brammer, W. J. 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam.

Takovými vektory jsou příkladně:

- plazmidy s vysokým počtem kopií jako příkladně pBR322, pUC 18

- plazmidy se středním až nízkým počtem kopií jako příkladně pACYC184, pACYC177 a pSCIOl

- fágové vektory jako příkladně vektory Μ13.

S výhodou jsou vhodné vektory se středním až nízkým počtem kopií; obzvláště výhodné jsou vektory s replikonem pl5A, jako pACYC184 (ATCC37033) nebo pACYC177 (ATCC37031).

Pro jiné bakterie je rovněž v literatuře popsán velký počet vektorů (Pouwels, P. H., Enger-Valk, B. E., Brammer, W. J. 1985, Cloning Vectors, Elsevier, Amsterdam). S těmito vektory je možné exprese mutantů podle vynálezu na jiné bakterie.

Vhodné rekombinantní vektory se mohou vyrábět standardními technikami pro výrobu rekombinantní DNA. Tyto techniky jsou podrobně uvedeny ve standardních učebnicích.

Vhodný hostitelský kmen se transformuje expresním vektorem, který obsahuje transkripční jednotku kódující pro cystein-insenzitivní serin-acetyltransferázu.

Jako hostitelské kmeny se používají kmeny, které obsahují proteiny senzitivní vůči cysteinu, jako příkladně prokaryonty nebo kvasinky.

S výhodou se použijí kmeny divokého typu nebo kmeny E. coli, ve kterých je endogenní gen cysE inaktivován a komplementován cysE genem podle vynálezu. Takové buněčné systémy jsou vhodné pro nadprodukci L-cysteinu a z něj odvozených metabolitů.

Při fermentaci kmenů, obsahujících nejméně jednu feedback-rezistentní cysE-alelu se ukazuje, že kmeny, které přijmou feedback-rezistentní cysE-alelu s hodnotou Kj mezi 0,015 a 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA vylučují výrazně větší množství cysteinu.

Serin-acetyltransferázy podle vynálezu je možné získávat také použitím antisense-RNA. Blokovat nebo modifikovat cíleně genovou aktivitu tak zvanou reverzní genetikou (Reverse Genetik) odpovídá stavu techniky (Inouye, 1988, Gene 72, 25-34). Antisense-RNA je transkripční produkt toho řetězce DNA, který je komplementární k řetězci kódujícímu protein. Je možné redukovat senzitivitu serin-acetyltransferázy vůči cysteinu in vivo tím, že se z expresního vektoru produkuje antisense-RNA, která je komplementární k definované oblasti 3-kódovaného řetězce přirozeného nebo transformovaného genu cysE. Přitom se antisense-RNA specificky váže na cílové sekvence cvsE-mRNA a umožňuje tím syntézu serin-acetyltransferázových

-8CZ 294539 B6 enzymů podle vynálezu, které jsou na karboxylovém konci zkráceny a analogicky jako u deletovaných mutantů z příkladu 3 vykazují sníženou senzitivitu vůči inhibitoru L-cysteinu.

Dalším úkolem bylo dát k dispozici vhodné zdroje síry pro optimální nadprodukci cysteinu pomocí mikroorganizmů podle vynálezu.

Překvapivě bylo objeveno, že intracelulámí nadprodukce O-acetylserinu, vyvolaná použitím serin-acetyltransferázových mutantů podle vynálezu ve sloučeninách s vhodným vyživovacím médiem vede k výraznému vzestupu extracelulární koncentrace cysteinu. Na základě toho jsou serin-acetyltransferázové mutanty vhodné k nadprodukci cysteinu.

K tomu musí být pro mikroorganizmy podle vynálezu být v produkčním médiu k dispozici dostatečné množství donoru síry.

Vhodnými donory síry pro nadprodukci cysteinu jsou všechny anorganické sloučeniny síry. Výhodné jsou sírany, siřičitany, sulfidy, dithionit a thiosulfáty. Obzvláště výhodný k optimální nadprodukci cysteinu je thiosulfát.

Dalšího zvýšení výtěžku cysteinu se může dosáhnout dodatečnou nadprodukci enzymů redukujících sulfáty (kódované pomocí genů cvsD, C, H, G. I, J) a sulfohydrogenačních enzymů (kódované geny cysK a cysM),

Další zvýšení výtěžku cysteinu je možné:

a) deregulací regulačního proteinu cysB na genové úrovni ve smyslu konstitutivní exprese. Protein cysB vystupuje ve funkci nadřazeného regulačního proteinu biosyntézy cysteinu v E. coli (Kredich, N. M., 1987, Biosynthesis of Cysteine. V: Neidhardt F. C., Ingraham, J. L., Magasanik, B., Low. K. B., Schaechter, M., Umbarger, Η. E. (eds) Escherichia coli a Salmonella typhimurium: cellular and molecular biology, Vol. 1 Američan Society for Microbiology, Washington D. C., 419-428).

b) kombinací genů ser-A, vybraných ze skupiny divokého typu serA a genů serA kódujících pro fosfoglycerát-dehydrogenázu se sníženou senzitivitou vůči šeřinu s geny cys-E podle vynálezu.

c) externím dodáváním šeřinu.

S výhodou se gen přirozené serin-acetyltransferázy senzitivní vůči cysteinu v hostitelském kmenu inaktivuje, takže je zaručena pouze syntéza cystein-insezitivní serin-acetyltransferázy zavedené do daného kmenu před transformací. K inaktivaci přirozených genů v E. coli existují četné předpisy (Hamilton a spol., 1989, J. Bacteriol. 171, 4617-4622; Russel a spol., 1989, J. Bacteriol. 171, 2609-2613; Shen a Huang, 1986, Genetics 112, 441-457; Jasin a Schimmel, 1984, J. Bacteriol. 159, 783-786).

Rovněž tak výhodná je integrace jedné kopie stejného genu, který kóduje pro změněnou serinacetyltransferázu do hostitelského genomu.

Popisy a odkazy na tyto techniky lze nalézt v následujících publikacích: Shevell a spol., 1988, J. Bacteriol. 170, 3294-3296; Kulakauskas a spol., 1991, J. Bacteriol. 173, 2633-2638.

S výhodou se klonují cysE-alely o rozdílných K, na vektor s nižším počtem kopií a transformuje se do odpovídajícího produkčního kmenu.

-9CZ 294539 B6

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 zobrazuje biosyntézu glutathionu, vycházející z homoserinu.

Obrázek 2 zobrazuje biosyntézu glutathionu, vycházející z glutamátu.

Obrázek 3 zobrazuje biosyntézu glutathionu, vycházející z dethiobioninu.

Obrázek 4 zobrazuje biosyntézu L-cysteinu v E. coli, vycházející z glukózy.

Obrázek 5 zobrazuje pořadí aminokyselin serin-acetyltransferázy z E. coli.

Obrázek 6 zobrazuje sekvenci DNA E. coli cysE-genu a od této sekvence odvozenou sekvenci aminokyselin serin-acetyltransferázy.

Obrázek 7 zobrazuje restrikční mapu plazmidů pPl z příkladu 1 obsahující feedback-rezistentní cysE-alely, klonovaný jako 2,25 kb PvuII-fragment v pUC219.

Obrázek 8 zobrazuje plazmid pPC43 z příkladu 2, obsahující divoký typ genu cysE jako 1,15 kb velký fragment EcoRI/BamHI v pBluescript.

Obrázek 9 zobrazuje mapu plazmidů pACYC184-LH z příkladu 3 obsahující feedback-rezistentní cysEalely s deleci v karboxylovém konci, a z příkladu 4 obsahující feedback-rezistentní cysE-alely s rozdílnými výměnami bází.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady provedení slouží k bližšímu vysvětlení vynálezu:

Příklad 1

Izolace mutantů E. coli se serin-acetyltransferázovými enzymy insenzitivními vůči cysteinu

Reverzí auxotrofních kmenů E, coli je možné připravit regulativní mutanty. Mutanty s požadovanými vlastnostmi (insenzitivita serin-acetyltransferázy vůči cysteinu) se vyhledají mezi revertantními cystein-auxotrofními kmeny cysE-E. coli.

Pro izolaci revertantů se používají cystein-auxotrofními kmeny E. coli JMI5 (CGSC # 5042: cysE50, trf-8) a JM39 (CGSC # 5043 cysE51, trf-8), založené v Deutschen Sammlung fiir Mikroorganismen v Braunschweigu pod zakládacím číslem DSM 10173. K výrobě cysteinprotrofních revertantů byly tyto kmeny zpracovávány mutagenem nitrosoguanidinu podle Miller, J. H. (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory. Na minimálním médiu neobsahujícím cystein byly hledány cystein protrofní revertanty. Nejprve

-10CZ 294539 B6 bylo asi 1000 získaných revertantů testováno křížovým vyživovacím experimentem z hlediska vylučování cysteinu. Ktomu byly testované revertanty očkovány na minimální médium neobsahující cystein (12 g/1 K₂HPO₄, 3 g/1 KH₂PO₄, 5 g/1 (NH₄)₂SO₄, 0,3 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, 0,015 g/1 CaCl₂ x 2 H₂O, 0,02 g/1 FeSO₄ x 7 H₂O, 1 g/1 Na₃-citrátu x 2 H₂O, 0,1 g/1 NaCl, 15 g/1 bactoagaru, 1 ml/1 roztoku se stopovými prvky, sestávajícího z 0,15 g/1 Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 2,5 g/1 H₃BO₃, 0,7 g/1 CoCl₂ x 6 H₂O, 0,25 g/1 CuSO₄ x 5 H₂O, 1,6 g/1 MnCl₂ x 4 H₂O, 0,3 g/1 ZnSO₄ x Ί H₂O, který byl suplementován 1 % glukózy. Bylo očkováno 5 x 10⁶ buněk cysteinauxotrofního indikátorového kmenu JM39 na ml a inkubováno po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C. Průměr narostlé plošky kolem testované kolonie (halo) byl posuzován jako semikvantitativní míra vylučování cysteinu testovaným kmenem. Všechny revertanty, které vykazovaly růstovou zónu větší než 2 mm, byly hodnoceny jako pozitivní a po několika čisticích přeočkovacích izolovány a konzervovány.

K vyšetření biochemické podstaty pro vylučování cysteinu revertanty byla stanovena aktivita serin-acetyltransferázy in vitro a rovněž její inhibice cysteinem. Ke stanovení se použije extrakt S30 (dezintegrované buňky se centrifugují 20 minut při 30 000 g a teplotě 4 °C) vybraných revertantů, výchozích kmenů a srovnávacího kmenu E. coli W3110 (ATTC 27325). Byla nalezena řada revertantů, jejichž serin-acetyltransferázová aktivita v přítomnosti různých koncentrací inhibitoru L-cysteinu vykazovala ještě významnou zbytkovou aktivitu (hodnota K; mezi 5 a 50 μΜ).

Ke stanovení schopnosti vylučovat cystein v kapalném médiu pomocí kvantitativního stanovení cysteinu se inkubuje 50 vybraných revertantů cysE v 20 ml standardního produkčního média po dobu 48 hodin při teplotě 30 °C a 170 otáčkách za minutu. Standardní produkční médium sestává z 15 g/1 glukózy, 0,08 g/1 bactotryptonuy, 0,04 g/1 kvasinkového extraktu, 5 mg/1 vitaminu Bl, 3 g/1 KH₂PO₄, 12 g/1 K₂HPO₄, 0,3 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NH₄)₂SO₄, 14,7 mg/1 CaCl₂ x 2 H₂O, 2 mg/1 FeSO₄ x 2 H₂O, 1 g/1 Na₃-citrátu x 2 H₂O, 5 g/1 Na₂S₂O₃ x 5 H₂O a 1 ml/1 roztoku stopových prvků (viz výše). Po 24 a 48 hodinách se vždy odebere vzorek (10 μΐ), případně se zředí a ve zbytku neobsahujícím buňky se stanovuje koncentrace cysteinu kalorimetricky podle Gaitonde, Μ. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633. Míra vylučování cysteinu těchto mutantů kolísá mezi 5 až 60 mg/1 cysteinu ve zbytku kultury. V kmenech divokého typu E. coli se oproti tomu nemohlo prokázat žádné vylučování cysteinu. Z tohoto screeningu bylo vybráno 8 revertantů, jejichž vylučování cysteinu leží mezi 40 a 60 mg/1.

K exaktní analýze genetické podstaty rezistence konečných produktů serin-acetyltransferázy těchto 8 mutantů byly jejich strukturní geny cysE klonovány a stanovena jejich sekvence DNA.

Protože DNA sekvence divokého typu genu cysE a rovněž chromozomální restrikční mapa oblastí navazujících na gen cysE E. coli jsou známé (Denk a Bóck, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 515-525), je zřejmé, že strukturní gen cysE leží na 2,25 kb velkém fragmentu PvuILDNA.

Ke klonování genu cysE kódujícího pro cystein-insenzitivní serin-acetyltransferázy se chromozomální DNA selektovaných revertantů úplně štěpí pomocí PvuII, hydrolyzát DNA se rozdělí přes preparativní agarový gel a DNA se izoluje v rozmezí velikostí 2 až 3 kb. Izolovaný hydrolyzát PvuII se pomocí ligázy T4 DNA spojí s plazmidovém vektorem pUC19, linearizovaným pomocí Smál a defosforylovaným alkalickou fosfatázou (dodávaný fou Boehringer Mannheim).

Cystein-auxotrofní kmen cysE JMI 5 (CGSC # 5042) se transformuje s danou ligační směsí a provede se selekce na minimálním médiu neobsahujícím cystein a obsahujícím ampicilin (50 mg/1). Selektované plazmidy a plazmidy komplementující cystein-auxotrofii hostitelského kmene (viz obrázek 7) vykazují v restrikčním vzorku štěpící vzorek potřebný pro gen cysE (Denk a Bock, 1987, J. Gen. Microbiol. 133, 515-525). Také v křížovém vyživovacím testu vyvolávají selektované transformanty intenzivní růst indikátorového kmene JM35 (halo > 4 mm). Stanovení aktivity serin-acetyltransferázy v buněčném extraktu těchto mutantů cysE, které se získají

-11 CZ 294539 B6 minutovou centrifugací při 30 000 g a teplotě 4 °C, svědčí o redukované senzitivitě vůči Lcysteinu. K. exaktní identifikaci změn ve strukturních genech jednotlivých cysE*-alel. vedoucích k rezistenci konečného produktu, se jejich DNA sekvenují za použití cysE-gen specifických oligonukleotidů a zjištěné sekvence nukleotidů se srovnávají s divokým typem genu cysE. Toto 5 srovnání sekvencí nukleotidů poskytuje rozdíly v sekvenci DNA a aminokyselin formy divokého typu, shrnuté v následující Tabulce 2 (srovnej obrázky 5 a 6).

Tabulka 2: Feedback-rezistentní cysE-alela, vzniklá chemickou mutagenezí

Mutanty cysE	Výměna nukleotidu (č.)	Výměna aminokyseliny (č.)	Κ_£(μΜ)
cysEII	GGC->AGC (934)	Gly238->Ser238	10
cysEIII	GGT-X3AT (716)	Glyl65->Aspll65	10
cysEVII	GCT-X3TT (932)	Ala237->Val237	10
cysEX	ACG->GCG (721)	Thrl67~>Alal67	50
cysEXI	GGT->AGT (955) ACG-X3CG (721)	Gly245->Ser245 Thrl67->Alal67	700
cysEXII	AAA->CAA (511) GGC->AGC (934) TTT->TTG (1023)	Lys97->Gln97 Gly238->Ser238 Phe267->Leu267	40
cysEXIII	GTT->GCT (713) TTT->TTG (1023)	Vall64->Alal64 Phe267->Leu267	30
cysEXVI	GAT->GGT (971) AAG->TAG (973)	Asp250->Gly250 Lys251->Stop251	50

Příklad 2

Výroba serin-acetyltransferáz insenzitivních ke konečnému produktu cílenou výměnou bází ve strukturním genu cysE.

V příkladu 1 se popisuje celkem 8 různých cysE-alel. které na základě výměny bází a s tím spojených změn aminokyselin vykazují značnou insenzitivaci serin-acetyltransferázy oproti inhibitoru L-cysteinu. Tyto změněné enzymy se nerozlišují pouze v pozici výměny aminokyselin vedoucí k rezistenci, nýbrž také v míře senzitivity vůči inhibitoru L-cysteinu. Ortospecifickou mutagenezí byly konstruovány serin-acetyltransferázové enzymy rezistentní vůči konečnému produktu s novými vlastnostmi, ve kterých byly navzájem kombinovány výměny aminokyselin popsané v příkladu 1. K tomu potřebné mutageneze byly provedeny způsobem podle stavu techniky, metodou, kterou popsal Kunkel a spol., (1987), Meth. Enzymol. 154, 367-382.

Jako výchozí plazmid pro mutagenezí se použije cysE plazmid pPC43 zobrazený na obr. 8 (založené v Deutschen Sammlung fur Mikroorganismen v Braunschweigu pod zakládacím číslem 30 DSM 171), který obsahuje 1,15 kb velké divoké typy genu cysE na pozici EcoRI-BamHI fágemidového vektoru pBluescriptlI SK+ (firma Stratagene, Heidelberg). Tento gen divokého

- 12CZ 294539 B6 typu cysE se amplifíkuje metodou polymerázové řetězové reakce (PCR) (Saiki a spol., 1988, Science 239, 487-491 z genomické DNA E. coli divokého typu kmene W3110 (ATTC 27325). Používají se oligonukleotidy cysE-fwl (SEQ ID č.: 3) („sense-Primer“) a cysE-revl (SEQIDč.:4) („anti-sense-Primer“). Sekvence nukleotidů tohoto primeru má následující sestavu:

cysE-fwl: (SEQ ID č:3)

-GCCTGGATTCTGCAGTCGACCTGGCGCATCGCTT(XX3CX7rTC-3 , tučně značená část odpovídá bázím 9 až 30 ze sekvence cysE-DNA podle obrázku 6, podtržené je místo inkorporované BamHI.

cysE-revl: (SEQIDč:4)

-GTAGGAGCTCTGCAGAATTCGGGTATCCGGGAGCXjGTATTG- 3 , tučně značená část odpovídá bázím 1106 až 1126 ze sekvence cysE-DNA podle obrázku 6, podtržené je místo inkorporované EcoRI.

PCR-experimenty se provádějí ve 30 cyklech v přítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), po 1 μΜ odpovídajícího oligonukleotidu, 100 ng W3110-DNA, vreakčním pufru (10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % želatiny) a 5 jednotek teplotně stabilní polymerázy Vent-DNA (firma Biolabs) v termocykleru (GeneATAQ-Controler, firma Pharmacia) za následujících podmínek: 96 °C, 1,5 min; 62 °C, 1 minuta; 72 °C, 3 minuty. Produkt amplifíkace se hydrolyzuje s BamHI a EcoRI, čistí přes agarový gel a jako 1,15 kb velký fragment DNA se klonuje vfágemidovém vektoru Bluescriptll SK+ linearizovaném s BamHI a EcoRI, přičemž vznikne cysE plazmid pPC43 (obrázek 8).

Požadované násobné mutanty se připravují následujícím postupem:

1) Výroba cysE-IV-alely: Dvojitý mutant Val₂₃7 + Ser₂₃₈

Vycházejíce z divokého typu plazmidu cysE pPC43 se ortospecifickou mutagenezí za použití mutačního oligonukleotidu cysE-Mut-1 (SEQ ID č.:5) (tabulka 3) zavede nejprve na pozici 238 glycinu serin a do přitom vyrobeného mutantu cysE pPC34 za použití mutačního oligonukleotidu cysE-Mut-3 (SEQ ID č.:6) (tabulka 3) na pozici 237 místo alaninu valin, přičemž vznikne cysEIV-alela.

2) Výroba cys-VIII-alely: Dvojitý mutant Val₂₃7 + Ile₂5₆

Vycházejíce z divokého typu plazmidu cysE pPC43 se ortospecifickou mutagenezí za použití mutačního oligonukleotidu cysE-Mut-6 (SEQ ID č.:7) (tabulka 3) zavede nejprve na pozici 256 za methionin izoleucin, přičemž vznikne cysEI-alela. Do tohoto se za použití mutačního oligonukleotidu cysE-Mut-3 (SEQ ID č.:6) (tabulka 3) zavede na pozici 237 místo alaninu valin, přičemž vznikne alela cysE-VIII.

3) Výroba cysE-VI-alely : Dvojitý mutant Ser_23g + Ile₂56

Do cysE-I-alely (mutant Ile₂₅6) se s pomocí mutačního oligonukleotidu cysE-Mut-1 (SEQ ID č.:5) (tabulka 3) zavede na pozici 238 místo glycinu serin, přičemž vznikne cysE-VIalela.

-13CZ 294539 B6

4) Výroba cysE-V-alely : Trojitý mutant Val₂37 + Ser₂3s + He₂56

V cysE-IV-alele (dvojitý mutant Val₂37 + Ser₂3g) se s pomocí mutačního oligonukleotidu cysE5 Mut-6 (SEQ ID č.:7) (tabulka 3) nahradí na pozici 256 methioninizoleucinem. Přitom vznikne cysE-V-alela.

5) Výroba cysE-XIV-alely : Dvojitý mutant Ala_I67 + Stop₂5i ío Vycházejíce z alely-cysE-Del 255 (srovnej příklad 3) se za použití mutačního oligonukleotidu cysE-Mut-10 (SEQ ID č.:8) (tabulka 3) zavede na pozici 167 místo threoninu alanin, přičemž vznikne cysE-XIV-alela.

6) Výroba cysE-XVII-alely : Dvojitý mutant Aspi6₅ + Ala_]67

Vycházejíce z cysE-III-alely (mutant Asp_]65, srovnej příklad 1) se za pomoci oligonukleotidu cysE-Mut-10 (SEQ ID č.:8) (tabulka 3) nahradí na pozici 167 aminokyselina threonin alaninem. Přitom vznikne alela-cysE-XVII.

7) Výroba cysE-XXIII-alely : Trojitý mutant Ala₁₆₇ + Val₂3₇ + Ser₂38

Do cysE-IV-alely (dvojitý mutant Val₂3₇ + Ser₂₃₈) se s pomocí mutačního oligonukleotidu cysEMut-10 (SEQ ID č.:8) (tabulka 3) zavede na pozici 167 místo threoninu alanin, přičemž vznikne cysE-XXIII-alela.

Správnost zavedených mutací se přezkoumá sekvenční analýzou DNA celého strukturního genu daného mutantu. Přehled násobných mutantů cysE* je uveden v tabulce 4.

Ke stanovení biochemických parametrů jako je enzymová aktivita a inhibiční konstanta K; se 30 postupuje analogicky, jako je popsáno v příkladu 1.

Tabulka 3: Oligonukleotidy, používané pro ortospecifícké mutace k výrobě nových feedbackrezistentních cysE-alel

SEQ ID č	Mutační oligonukleotid	Sekvence nukleotidu	Pozice na obr. 6	Výměna aminokyselin
5	cysE-Mut-1	viz A	928-945	Gly238->Ser238
6	cysE-Mut-3	viz B	913-933	Ala237->Val237
7	cysE-Mut-6	viz C	976-999	Met256->Ile256
8	cysE-Mut-10	viz D	709-732	Thrl67->Alal67

Sekvence A: 5 -GCCGCTAGCGTTCCGGCT-3

B: 5 -CCGCCGCATACCACCGCCGTT-3

C: 5-CCATCAATGGATATAGACCAGCAT-3

D: 5 -GTCGTTGGTGAAGCGGCGGTGATT-3

-14CZ 294539 B6

Tabulka 4: Feedback-rezistentní cysE-alela vzniklá cílenou ortospecifickou mutagenezí

Mutanty cysE	Výměna nukleotAsp (č.)	Výměna aminokyseliny (č.)	ΚμμΜ)
cysEIV	GCT->CTT (932)	Ala237->Val237	40
	GGC->AGC (934)	Gly238->Ser238
cysEV	GCT->GTT (932)	Ala237->Val2375	10
	GGC->AGC (934)	Gly238->Ser238
	ATG->ATA (990)	Met256->Ile256
cysEVI	GGC->AGC (934)	Gly238->Ser238	10
	ATG->ATA (990)	Met256->Ile256
cysEVIII	GCT-XJTT (932)	Ala237->Val237	30
	ATG->ATA (990)	Met256->Ile256
cysEXIV	ACG->GCG (721)	Thrl67->Alal67	>1000
	ATG->TAG (988+989)	Met256->Stop256
cysEXVII	GGT-XJAT (716)	Glyl65->Aspl65	100
	ACG->GCG (721)	Thrl67->Alal67
cysEXXIII	ACG-XJCG (721)	Thrl67->Alal67	2300
	GCT->GTT (932)	Ala237->Val237
	GGC->AGC (934)	Gly238->Ser238

Příklad 3

Výroba serin-acetyltransferáz insenzitivních ke konečnému produktu řízeným zkrácením karboxylového konce enzymu pomocí PCR

Cílené změny jednotlivých nebo několika aminokyselin v rámci jednoho proteinu odpovídají stavu techniky a je možné je dobře provádět pomocí technologie PCR (Saiki a spol., 1988, Science 239, 487-491) za použití vhodných mutačních primerů na rovině DNA. Pro expresi změněných proteinů se získané produkty PCR klonují do vhodného plazmidového/hostitelského systému.

Za použití oligonukleotidového primeru uvedeného v Tabulce 5 se z genomické DNA E, coli kmene divokého typu W3110 (ATTC 28325) vyrobí cysE mutanty sdelecemi v karboxylovém konci rozdílné délky, které jsou shrnuty v Tabulce 6.

- 15CZ 294539 B6

PCR-experimenty se provádějí ve 30 cyklech v přítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), po 1 μΜ odpovídajícího oligonukleotidu „sense primer“ cvsELHfwl (SEQ ID č. 9) a odpovídajícího „antisense primer“ (SEQ ID č. 10-23) (Tabulka 5), 100 ng W3110-DNA, v reakčním pufru (10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM K.C1, 1,5 mM MgCI₂, 0,01 % želatiny) a 5 jednotek teplotně stabilní polymerázy Vent-DNA (firma Biolabs) v termocykleru (Gone-ATAQ-Controler, firma Pharmacia) za následujících podmínek: 96 °C, 1,5 min; 62 °C, 1 minuta; 72 °C, 3 minuty.

cysE-LHfwl (SEQ ID č. 9) ⁵ -TGGACCAGAGCTCTGgCTGGCC^ATfXYn^rGGrf7TTr^ 3 tučně značná část odpovídá bázím 9 až 30 ze sekvence cysE podle obrázku 6, podtržena jsou místa inkorporované BstXI/SacI.

Produkt vzniklý po amplifikaci se štěpí enzymy Sací a Nsil, následně se čistí přes agarózový gel a dané izolované cysE-DNA-fragmenty se ligují ve vektoru pACYC184-LH/DSM 10172 linearizovaném pomocí Sací a Nsil (viz obrázek 9). Daná násada ligázy se transformuje v cystein-auxotrofním kmenu cysE JMI5 (CGSC # 5042) a provádí se selekce na minimálním médiu neobsahujícím cystein, ale obsahujícím tetracyklin (20 mg/1).

Plazmidy vzešlé z tohoto klonování se označují způsobem odpovídajícím míře jejich delece jako pACYC184/cysE-Del (srovnej obrázek 9 k plazmidové mapě). Stanovení enzymatické aktivity a inhibiční konstanty Kj a rovněž křížového vyživovacího testu se provádí analogicky, jak se popisuje v příkladu 1. Správnost zavedených delecí se potvrzuje sekvenční analýzou DNA.

Výsledky těchto šetření jsou uvedeny v tabulce 6.

-16CZ 294539 B6

Tabulka 5

Antisens-oligonukleotidy pro výrobu cysE-alely s delecemi v karboxylovém konci

		CM n	XO CM	r-4 1-4	OX <JX	«3 σχ	c-i σχ
O	u	O	O	O	σχ	CX	σχ
o	X)	H	H	i-4
N	o	1	1	1		»	I
O	cc*	XO	O	m	r*x	o	Ό
C-4	c	O	o	co	r-	Γ-	XO
		o	o	σχ	σχ	GX	σχ

Η r-4

o	r-	CM	σχ	χο	η·	σχ	η
σχ	co	Γ-	Ό	Χθ	ιη	η	Ο
σχ	σχ	σχ	σχ	σχ	σχ	σχ	σχ
1	ι	I	i	»	1	1	I
v	ι-4	ΧΟ	c-x	ο	Η	<*χ	Γ~
χο	ΧΟ	ď	xř	ΧΤ	rx	ι-4
σχ	σχ	σχ	σχ	σι	σχ	σχ	C0

		«< Ε-«
Μ-*	Ε-«	ΙΗ
Ό		><
« W-*	ÍH	ΙΗ
ο	Ο	Ο
ο	υ	Ο
		<
•τέ	ΙΗ	Η
	Η	Η
C5 5*?	<	2
Ο δβ » »»*	GC	GC
	Ε-<	Η
ο	<	<
ο	0	0
ο	Ο	0
«ΜΜ	ΙΗ	Ε4
4>	ο	ο 1
>	I
	%	>
α	m	ιη
00

ιη ιη ιη in

0	0	0
	ΙΗ	e-i
<	<	-ι<ζ
0	0	0
U	0	0
Ε-.	Η	Ε-ι
0	0	Ο

I I i

	• •»4	ο	C0	η	σχ	co
	XR>*	Γ	χο	χο	ιη	ιη
	ο	ΓΜ	CM	CM	CM	CM
		r4	>-4	r-4	r-4	1-4
α		Φ Q	Φ 0	0) α	Φ Q.	Φ Q
>ο	C	1	1	1	1
<tí	ο	Μ	Μ	W	ω	W
*5	δΰ	W	«	Φ	ιη	ιη
	• «-Μ 1Ι»··Ι	>5	>,	>1
Ο	Ο	0	0	υ	υ

Γ*	χο	ιη	Ο	σ>	€0	ιη	σχ	Γ-
m	ιη	ιη	ιη		ΧΤ	χτ	Π	η
CM	CM	CM	04	04	04	OJ	04	ΓΜ
r-4	1-4	r-4	ιΉ	f—i	γΗ	rH	r-4	r-4
φ	Φ	Φ	0)	Φ	Φ	Φ	Φ	Φ
α	Ω	α	Q	Q \|	Q »	Ο 1	Ο )	Q \|
I Μ	1 Μ	I ω	1 W	W	W	Μ	ω	ω
ιη	ιη	ιη	ιη	ω	ιη	10	W.	ιη
>1		>Ί			>1	>!	><
0	ϋ	Q	0	ο	0	υ	υ	0

tú (Z)

Ο	γΗ	CM	η	χτ	ιη	Μ3	0*
γ4.	Γ“4	r-4	r-4	rH	r-4	r-4

C0	Φ	Ο	τ-4	OJ	η
r-4	«Η	04	OJ	04	OJ

- 17CZ 294539 B6

Tučně značená část odpovídá daným bázím v sekvenci podle obrázku 6, podtržená jsou místa NsiL

Tabulka 6: Feedback-rezistentní cysE-alela vzniklá delecí v karboxylovém konci

Mirtanty cysE	Počet deletovaných aminokyselin	TermináLní aminokyseliny	Ki(pm)
cysE-Del259	14	His259	7,5
cysE-Del258	15	Gln258	5
cysE-Del257	16	Asp257	7,5
cysE-Del256	17	Met256	12,5
cysE-Del255	18	Asp255	30
cysE-De!250	23	Asp250	20
cysE-Del249	24	Ser249	15
cysE-Del248	25	Asp248	12,5

Příklad 4

Transformace hostitelského kmenu E. coli se změněnou serin-acetyltransferázou k nadprodukci L-cysteinu případně produktů příbuzných L-cysteinu v třepací baňce.

K výrobě se použije vektor pACYC184-LH, který se vyznačuje nízkým počtem kopií. K tomu se amplifíkují cysE geny pomocí PCR na plazmidy z příkladů 1 a 2.

PCR-experimenty se provádějí ve 30 cyklech v přítomnosti 200 μΜ deoxynukleotidtrifosfátů (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), po 1 μΜ oligonukleotidu „sense-primer“ cysE-LHfwl (SEQ ID č.:9) a odpovídajícího „antisense primer“ cysE-LHrevl (SEQ ID č. 24), 10 ng daného plazmidů DNA, v reakčním pufru (10 mM tris-HCl pH 8,3, 50 mM KC1, 1,5 mM MgCl₂, 0,01 % želatiny) a 5 jednotek teplotně stabilní polymerázy Vent-DNA (firma Biolabs) v termocykleru (Gene-ATAQ-Controler, firma Pharmacia) za následujících podmínek: 96 °C, 1,5 min; 62 °C, 1 minuta; 72 °C, 3 minuty.

cysE-LHfwl (SEQ ID č.:9)

- TC^ACCAGAGCTCTGGCTGGCXXZATCGCTTCGGCGrTG- 3

Podtržené báze odpovídají inkorporovaným štěpícím místům restrikčních enzymů BstXI a Sací, zbývající, tučně vytištěné báze odpovídají pozicím 10 až 30 sekvence cysE obrázku 6.

cysE-LHrevl (SEQ ID č.:24),

-18CZ 294539 B6

- CTCGATGCATTACGTAGGGGTATCCGGGAGCGGTATTG- 3

Podtržené báze odpovídají inkorporovanému štěpícímu místu restrikčního enzymu Nsil, zbývající, tučně vytištěné báze odpovídají pozicím 1106 až 1127 sekvence cysE podle obrázku 6.

Produkt vzniklý po amplifikaci se štěpí enzymy Sací a Nsil, následně se čistí pomocí agarózového gelu a izolovaný fragment cysE-DNA se liguje do vektoru pACYC184-LH (DSM 10172) linearizováného Sací a Nsil.

Daná násada ligázy se transformuje v cystein- autotrofním kmenu cysE JMI5 (CGSC # 5042) a provede se selekce v minimálním médiu neobsahujícím cystein s obsahem tetracyklinu (20 mg/1). Rada feedback-rezistentních cysE-plazmidů vzniklých z tohoto klonování se označuje jako pACYC184/cysE (viz obrázek 9), přičemž každý klon je opatřen odpovídajícím číslem cysEalely.

Ke stanovení enzymatické aktivity, inhibiční konstanty K, a vyživovacího testu se postupuje analogicky, jak je popsáno v příkladu 1.

Ke stanovení produkční kapacity v kapalném médiu se očkuje 20 ml standardního produkčního média jednotlivou kolonií a inkubuje se 48 hodin při teplotě 30 °C a 170 otáčkách za minutu. Produkční médium sestává z 15 g/1 glukózy, 0,08 g/1 bactotryptonu, 0,04 g/1 kvasinkového extraktu, 5 mg/1 vitaminu Bl, 3 g/1 KH₂PO₄, 12 g/1 K₂HPO₄, 0,3 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NH₄)₂SO₄, 14,7 mg/1 CaCl₂ x 2 H₂O, 2 mg/1 FeSO₄ x 2 H₂O, 1 g/1 Na₃-citrátu x 2 H₂O, 5 g/1 Na₂S₂O₃ x 5 H₂O a 1 ml/1 roztoku stopových prvků, 0,025 mg/1 tetracyklinu. Roztok stopových prvků sestává z 0,15 g/1 Na₂MoO₄ x 2 H₂O, 2,5 g/1 H₃BO₃, 0,7 g/1 CoCl₂ x 6 H₂O, 0,25 g/1 CuSO₄ x 5 H₂O, 1,6 g/1 MnCl₂ x 4 H₂O, 0,3 g/1 ZnSO₄ x 7 H₂O. Po 24 a 48 hodinách se vždy odebere vzorek (10 μΐ), přiměřeně se zředí a ve zbytku neobsahujícím buňky se stanovuje koncentrace produktu kalorimetricky podle Gaitonde, Μ. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633. Pro produkční kmeny JM15 s rozdílnými cvsE-mutantv se přitom naměří koncentrace cysteinu mezi 50 a 300 mg/1.

Příklad 5

Konstrukce chromozomálně kódované, feedback-rezistentní cysE-alely pomocí rekombinantního Ζα/wMo-profágu a produkce L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu v 1 1 fermentoru

K integraci do chromozomální „attachment site“ (att-lambda) se klonují cysE-alely cysEIV, cysEX a cysEXI do plazmidů pRS551 (Simons a spol., 1987, Gene, 53, 85-96). K tomu se vždy daná cysE-alela amplifíkuje PCR zodpovídajícího cysE-plazmidu. Použité oligonukleotidy cysE-fwl a cysE-revl jsou popsány v příkladu 1. Amplifikace se provádí stejně, jako se popisuje v příkladu 3. Získané fragmenty se štěpí EcoRI/BamHI, čistí přes agarózový gel a ligují do vektoru pRS551 štěpeného v EcoRI/BamHI. Přitom vzniknou rekombinantní plazmidy pRCcysEIV, X a XI odvozené z vektoru pRS551.

Přípravou lyzátu na kmenu recA⁺ nesoucím pRScysE (příkladně YMC9, ATCC 3397) s fágem ZčwwMaRS45 se in vivo vyrobí homologní rekombinací heterogenní lambda-lysát, který vedle fágů lambdaRS45 obsahuje také rekombinantní deriváty lambdaRS45 nesoucí cysE-alelu (Simons a spol., 1987, Gene, 53, 85-96).

K selekci na rekombinantní deriváty RS45 se použije cysE kmen JMI5, který se nejprve infikuje heterogenním Zn/MÓútar-lysátem a následně se plátuje na LB-miskách obsahujících kanamycin (25 mg/1). Získané lysogenní, vůči kanamycinu rezistentní klony se potom testují z hlediska

-19CZ 294539 B6 jejich schopnosti růstu na deskách s minimálním médiem bez cysteinu. Vybere se vždy jeden cystein-protrofní klon a použije se k výrobě homogenního cysE-/awóí/a-lyzátu (UV-indukcí, Simons a spol., 1987, Gene, 53, 85-96.

S těmito získanými homogenními cysE-/a/MZ><7a-lyzáty se infikuje kmen JM 15. Z toho vzešlé kmeny JM15att/a?n/>da::cysE se fermentují stejně, jako se popisuje v příkladu 6. Dané médium obsahuje místo tetracyklinu jako selekční činidlo vždy 25 mg/1 kanamycinu.

Výtěžky cysteinu činí pro cysEIV 0,5, pro cysEEX 1,8 a pro cysEEXI 2,1 g/1 viz Tabulka 7).

Příklad 6

Vliv rozdílných cysE-alel kódovaných plazmidem na produkci L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu v 1 1 fermentoru za použití hostitelského kmenu JMI 5 ml média LB (1 % tryptonu, 0,5% kvasinkového extraktu, 0,5 % NaCl) se ve 100 ml Erlenmeyerově baňce očkuje jednotlivou kolonií produkčního kmenu JMI5 (CGSC#5042) transformovaného daným cysE-plazmidem.

Po 7 hodinové inkubaci v třepačce (150 otáček/minuta, 30 °C) se získané předkultury převedou do 100 ml média SMI. Médium SMI obsahuje 5 g/1 glukózy, 5 mg/1 vitaminu Bl, 3 g/1 KH2PO4, 12 g/1 K2HPO4, 0,3 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, 0,1 g/1 NaCl, 5 g/1 (NHOjSO^ 14,7 mg/1 CaCl₂ x 2 H₂O, 2 mg/1 FeSCL x 2 H₂O, 1 g/1 Na3-citrátu x 2 H₂O, a 1 ml/1 roztoku stopových prvků, 25 mg/1 tetracyklinu. Roztok stopových prvků sestává z 0,15 g/1 Na₂MoC>4 x 2 H2O, 2,5 g/1 H3BO3, 0,7 g/1 C0CI2 x 6 H₂O, 0,25 g/1 CuSO₄ x 5 H₂O, 1,6 g/1 MnCl₂ x 4 H₂O a 0,3 g/1 ZnSO₄ x 7 H₂O. Kultury se třepou v 1 1 Erlenmeyerově baňce při teplotě 30 °C po dobu 17 hodin při 150 otáčkách za minutu. Po této inkubaci činí OD₆₀o mezi 4 a 5. Další fermentace se provádí v pokusných reaktorech Biostat M firmy Braun-Melsungen. Použije se nádoba na kulturu s celkovým obsahem 2 1.

Fermentační médium obsahuje 15 g/1 glukózy, 5 g/1 NaCl, 0,3 g/1 MgSO₄ x 7 H₂O, 15 mg/1 CaCl₂ x 2 H₂O, 75 mg/1 FeSO₄ x 2 H₂O, 1 g/1 Na₃-citrátu x 2 H₂O, 1,5 g/1 KH₂PO₄ a 1 ml/1 roztoku stopových prvků (viz výše), 5 mg/1 vitaminu Bl, 2,5 g/1 extraktu kvasinek (Difco), 2,5 g/1 tryptonu (Difco) a 25 mg/1 tetracyklinu.

Koncentrace glukózy ve fermentoru se na počátku nastaví přičerpáváním 700 g/1 (w/v) roztoku glukózy (sterilovaný) na hodnotu 15 g/1 a hodnota pH se nastaví přičerpáním 25 % roztoku NH4OH na 7,0. Po dosažení OD₆₀o 10 se přidá sterilní thiosulfátový zásobní roztok o koncentraci 100 g/1 (w/v) 300 mg za hodinu. Do nádoby fermentoru se k naočkování přečerpá 100 ml předkultury. Počáteční objem činí asi 1 1. Kultury se nejprve míchají při 400 otáčkách za minutu a zavzdušňují se 1,5 vvm tlakového vzduchu sterilovaného přes sterilizační filtr. Fermentace se provádí při 30 °C.

Hodnota pH se automatickou korekcí pomocí 25% roztoku NH₄OH udržuje na 7,0. Nasycení kyslíkem ve fermentačním roztoku by nikdy nemělo klesnout pod 20 %, řídí se rychlostí míchání. Ve dvou až tříhodinových intervalech se zjišťuje obsah glukózy v živném roztoku, optická hustota a obsah cysteinu. Stanovení glukózy se provádí enzymaticky s pomocí glukózového analyzátoru firmy YSI. Koncentrace glukózy se kontinuálním dodáváním udržuje mezi 10 a 20 g/1.

Obsah produktu v médiu se stanovuje kalorimetricky ze zbytku vzorku neobsahujícího buňky podle Gaitonde, Μ. K. (1967), Biochem. J. 104, 627-633.

-20CZ 294539 B6

Po 44 až 50 hodinách se fermentace přeruší. Vyprodukovaná množství cysteinu v g/1 po 48 hodinách jsou v Tabulce 7.

Tabulka 7: Výtěžky cysteinu z produkčního kmenu JM 15, transformovaného rozdílnými cysE-Alleny (1 1 fermentor)

cysE-alela	Výtěžek cysteinu [g/1] [48 h]
_PACYC184/cysEIV	1,6
pACYC184/cysEV	1,3
pACYC184/cysEVI	1,4
pACYC184/cysEX	3,4
pACYC184/cysEXI	3,4
_PACYC184/cysEXII	1,2
_PACYC184/cysEXlV	2,3
pACYC184/cysEXV	3,0
pACYC184/cysEXVI	2,2
pACYC184/cysEXXIII	2,7
pACYC184/cysEDell255	3,9

Příklad 7

Produkce L-cysteinu nebo produktů odvozených od L-cysteinu s bakteriemi Coryne

Feedback-rezistentní cysE-alely cysEIV, cysEX, cysEXI a cysEXIV (viz Tabulka 2, v příkladu 1) se restrikčními enzymy BamHI aEcoRI (firma Boehringer Mannheim) štěpí z jejich odpovídajících plazmidů a vždy 1,15 kb velký fragment DNA se vyčistí přes agarový gel a izoluje. V daném fragmentu DNA se působením Klenowova fragmentu DNA polymerázy I z E. coli (firma Boehringer Mannheim) zatupí konce. Vektor pWSTl se hydrolyzuje restrikčním 20 enzymem Smál (firma Boehringer Mannheim) a spojí se s fragmentem DNA s tupým koncem pomocí T4 DNA ligázy. Vektor pWSTl je „shuttle“ vektor E. coli/Coiyne a může se replikovat jak v E. coli tak i v bakteriích Coryne. Replikon z bakterií Coryne pochází z kmene Corynebacterium glutamicum ATCC 19223. Výroba vektoru pWSTl se popisuje v US 4 965 197. Použije se ligační násada, aby se transformoval pro cystein auxotrofní mutant 25 JMI5. Komplementující plazmidy se označují způsobem odpovídajícím jejich inzertovaným cysE-alela, pWSTl-cysEIV, pWSTl-cysEX, pWSTl-cysEXI a pWSTl-cysEXIV.

Plazmidy pWSTl-cysE se použijí k transformaci Coryne-bacterium glutamicum ATCC 21851. Transformace se provádí elektrokorporací technikou podrobně popsanou v Liebl, W. a spol., 30 1 989, FEMS Microbial, Letters, 65, 299-304. Selekce rekombinantních klonů se provádí přes plazmidově kódovanou kanamycinovou rezistenci na agarových deskách s 25 mg/1 kanamycinu.

-21 CZ 294539 B6

Fermentace se provádí za podmínek, které jsou analogické podmínkám popsaným v příkladu 6 s tou výjimkou, že místo tetracyklinu se jako selekční antibiotikum použije kanamycin v koncentraci 50 mg/1.

Při fermentaci se ukazuje, že kmen, kteiý na plazmidu nese cysEXI-alelu, dosahuje nejvyšších výtěžků cysteinu.

SEKVENČNÍ PROTOKOL (1) Všeobecné informace (1) Přihlašovatel:

(A) Jméno: Consortium fuer elektrochemische Industrie, GmbH (B) Ulice: Zielstattstr. 20 (C) Místo: Muenchen (E) Země: Germany (F) Poštovní směrovací číslo: 81379 (G) Telefon: 085/748440 (H) Telefax: 089/74844350 (I) Telex: 5215553 consd (ii) Název přihlášky: Způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a produktů příbuzných L- cysteinu (iii) Počet sekvencí: 24 (iv) Forma uložená v počítači:

(A) Nosič dat: pružný disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Provozní systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, verze #1,30 (EPA) (2) Informace k SEQ ID č. 1:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 273 aminokyselin (B) Druh, aminokyselina (C) Struktura:

(D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: protein (vi) Prvotní původ:

(A) Organizmus: Escherichia Coli (B) Kmen: W3110 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 1:

-22CZ 294539 B6

Met Ser Cys Glu Glu Leu Glu Ile Val Trp Asn Asn Ile Lys Ala

10 15

Glu Ala Arg Thr Leu Ala Asp Cys Glu Pro Met Leu Ala Ser Phe

25 30

Tyr

His

Ala

Thr

Leu

Lys

His

Glu

Asn

Leu

Gly

Ser

Ala

Leu

35

40

45

Ser

Tyr

Met

Leu

Ala

Asn

Lys

Leu

Ser

Pro

Ile

Met

Pro

Ala

50

55

60

Ile

Ala

Ile

Arg

Glu

Val

Glu

Ala

Tyr

Ala

Asp

Pro

65

70

75

Glu

Met

Ile

Ala

Ser

Ala

Cys

Asp

Ile

Gin

Ala

Val

Arg

Thr

80

85

90

Arg

Asp

Pro

Ala

Val

Asp

Lys

Tyr

Ser

Thr

Pro

Leu

Tyr

Leu

95

100

105

Lys

Gly

Phe

His

Ala

Leu

Gin

Ala

Tyr

Arg

Ile

Gly

His

Trp

Leu

110

115

120

Trp

Asn

Gin

Gly

Arg

Ala

Leu

Ala

Ile

Phe

Leu

Gin

Asn

Gin

125

130

135

Val

Ser

Val

Thr

Phe

Gin

Val

Asp

Ile

His

Pro

Ala

Lys

Ile

140

145

150

Giy

Arg

Gly

Ile

Met

Leu

Asp

His

Ala

Thr

Gly

Ile

Val

Gly

155

160

165

Glu

Thr

Ala

Val

Ile

Glu

Asn

Asp

Val

Ser

Ile

Leu

Gin

Ser

Val

170

175

180

Thr

Leu

Gly

Thr

Gly

Lys

Ser

Gly

Asp

Arg

His

Pro

Lys

185

190

195

Ile

Arg Glu Gly

Val Met 200

Ile Gly Ala

Gly Ala 205

Lys

Ile Leu Gly 210

Asn

Ile

Glu

Val

Gly

Arg

Gly

Ala

Lys

Ile

Gly

Ala

Gly

Ser

Val

215

220

225

Val

Leu

Gin

Pro

Val

Pro

His

Thr

Ala

Gly

Val

Pro

230

235

240

Ala

Arg

Ile

Val

Gly

Lys

Pro

Asp

Ser

Asp

Lys

Pro

Ser

Met

Asp

245

250

255

Met

Asp

Gin

His

Phe

Asn

Gly

Ile

Asn

His

Thr

Phe

Glu

Tyr

Gly

260

265

270

Asp Gly Ile

-23CZ 294539 B6 (2) Informace k SEQ ID č. 2:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 1135 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: dvouřetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Genom-DNA (ví) Prvotní původ:

(A) Organizmus: Escherichia Coli (B) Kmen: W3110 (vii) Bezprostřední původ:

(B) Clon(E): pPC43 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 2:

TCCGCGAACT GGCGCATCGC TTCGGCGTTG AAATGCCAAT AACCGAGGAA ATTTATCAAG60

TATTATATTG CGGAAAAAAC GCGCGCGAGG CAGCATTGAC TTTACTAGGT CGTGCACGCA120

AGGACGAGCG CAGCAGCCAC TAACCCCAGG GAACCTTTGT TACCGCTATG ACCCGGCCCG180

CGCAGAACGG GCCGGTCATT ATCTCATCGT GTGGAGTAAG CAATGTCGTG TGAAGAACTG240

GAAATTGTCT GGAACAATAT TAAAGCCGAA GCCAGAACGC TGGCGGACTG TGAGCCAATG300

CTGGCCAGTT TTTACCACGC GACGCTACTC AAGCACGAAA ACCTTGGCAG TGCACTGAGC360

TACATGCTGG CGAACAAGCT GTCATCGCCA ATTATGCCTG CTATTGCTAT CCGTGAAGTG420

GTGGAAGAAG CCTACGCCGC TGACCCGGAA ATGATCGCCT CTGCGGCCTG TGATATTCAG480

GCGGTGCGTA CCCGCGACCC GGCAGTCGAT AAATACTCAA CCCCGTTGTT ATACCTGAAG540

GGTTTTCATG CCTTGCAGGC CTATCGCATC GGTCACTGGT TGTGGAATCA GGGGCGTCGC600

GCACTGGCAA TCTTTCTGCA AAACCAGGTT TCTGTGACGT TCCAGGTCGA TATTCACCCG660

GCAGCAAAAA TTGGTCGCGG TATCATGCTT GACCACGCGA CAGGCATCGT CGTTGGTGAA720

ACGGCGGTGA TTGAAAACGA CGTATCGATT CTGCAATCTG TGACGCTTGG CGGTACGGGT780

AAATCTGGTG GTGACCGTCA CCCGAAAATT CGTGAAGGTG TGATGATTGG CGCGGGCGCG840

AAAATCCTCG GCAATATTGA AGTTGGGCGC GGCGCGAAGA TTGGCGCAGG TTCCGTGGTG900

CTGCAACCGG TGCCGCCGCA TACCACCGCC GCTGGCGTTC CGGCTCGTAT TGTCGGTAAA960

CCAGACAGCG ATAAGCCATC AATGGATATG GACCAGCATT TCAACGGTAT TAACCATACA1020

TTTGAGTATG GGGATGGGAT CTAATGTCCT GTGATCGTGC CGGATGCGAT GTAATCATCT1080

ATCCGGCCTA CAGTAACTAA TCTCTCAATA CCGCTCCCGG ATACCCCAAC TGTCG1135

-24CZ 294539 B6 (2) Informace k SEQ ID č. 3:

(1) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 42 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE3-fwl (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 3:

GCCTGGATCC TGCAGTCGAC CTGGCGCATC GCTTCGGCGT TG (2) Informace k SEQ ID č. 4:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 41 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-revl (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 4:

GTAGGAGCTC TGCAGAATTC GGGTATCCGG GAGCGGTATT G (2) Informace k SEQ ID č. 5:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 18 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická

-25CZ 294539 B6 (B) Clon(E): cysE-Mut-1 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 5:

GCCGCTAGCG TTCCGGCT (2) Informace k SEQ ID č. 6:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Mut-3 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 6:

CCGCCGCATA CCACCGCCGT T (2) Informace k SEQ ID č. 7:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Mut-6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 7:

CCATCAATGG ATATAGACCA GCAT (2) Informace k SEQ ID č. 8:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 24 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární

-26CZ 294539 B6 (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc - „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Mut-10 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 8:

GTCGTTGGTG AAGCGGCGGT GATT (2) Informace k SEQ ID č. 9:

(1) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-LHfwl (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 9:

TGGACCAGAG CTCTGGCTGG CGCATCGCTT CGGCGTTG (2) Informace k SEQ ID č. 10:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 46 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del270 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 10:

CGCGATGCAT TACGTATTAC CCATACTCAAA ATCTATGGTT AATACC

-27CZ 294539 B6 (2) Informace k SEQ ID č. 11:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del286 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 11:

CTCGATGCAT TACGTATTAC TCAAATGTAT GGTTAATACC GTTGAA (2) Informace k SEQ ID č. 12:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del263 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 12:

CTCGATGCAT TACGTATTAA ATACCGTTGA AATGCTGGTC CATATC (2) Informace k SEQ ID č. 13:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del259

-28CZ 294539 B6 (xi) Popis sekvence: SEQIDč. 13:

CTCGATGCAT TACGTATTAA TGCTGGTCCA TATCCATTGA TGGCTT (2) Informace k SEQ ID č. 14:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del258 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 14:

CTCGATGCAT TACGTATTAC TGGTCCATAT CCATTGATGG CTTATC (2) Informace k SEQ ID č. 15:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 47 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del257 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 15:

CGCGATGCAT TACGTATTAG TCCATATCCA TTGATGGCTT ATCGCTG (2) Informace k SEQ ID č. 16:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 46 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární

-29CZ 294539 B6 (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del256 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 16:

CTCGATGCAT TACGTATTAC ATATCCATTG ATGGCTTATC GCTGTC (2) Informace k SEQ ID č. 17:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del255 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 17:

CTCGATGCAT TACGTATTAA TCCATTGATG GCTTATCGCT GTCTGG (2) Informace k SEQ ID č. 18:

(1) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del250 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 18:

CTCGATGCAT TACGTATTAA TCGCTGTCTG GTTTACCGAC AATACG (2) Informace k SEQ ID č. 19:

-30CZ 294539 B6 (i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del249 (xi) Popis sekvence: SEQIDč. 19:

CTCGATGCAT TACGTATTAG CTGTCTGGTT TACCGACAAT ACGAGC (2) Informace k SEQ ID č. 20:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del248 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 20:

CTCGATGCAT TACGTATTAG TCTGGTTTAC CGACAATACG AGCCGG (2) Informace k SEQ ID č. 21 :

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del245

-31 CZ 294539 B6 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 21:

CTCGATGCAT TACGTATTAA CCGACAATAC GAGCCGGAAC GCCAGC (2) Informace k SEQ ID č. 22:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del239 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 22:

CTCGATGCAT TACGTATTAA ACGCCAGCGG CGGTGGTATC CGGCGG (2) Informace k SEQ ID č. 23:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-Del227 (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 23:

CTCGATGCAT TACGTATTAC AGCACCACGG AACCTGCGCC AATCTT (2) Informace k SEQ ID č. 24:

(i) Sekvenční charakteristika:

(A) Délka: 38 párů bází (B) Druh: nukleotid (C) Struktura: jednořetězcová (D) Topologie: lineární

-32CZ 294539 B6 (ii) Druh molekul: Jiné nukleové kyseliny (A) Popis: /desc = „oligonucleotide“ (vii) Bezprostřední původ:

(A) Knihovna: syntetická (B) Clon(E): cysE-LHrevl (xi) Popis sekvence: SEQ ID č. 24:

Claims

1. Serin-acetyltransferáza, která ve srovnání s divokým typem enzymu vykazuje sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu a jejíž proteinová sekvence ve srovnání se sekvencí divokého typu vykazuje nejméně jednu mutaci nebo deleci, ve které se mutace nachází v sekvenční oblasti od aminokyseliny v pozici 97 až včetně aminokyseliny v pozici 273 nebo se delece nachází v sekvenční oblasti karboxylového konce od aminokyseliny v pozici 248 až včetně aminokyseliny 259, přičemž pozice jedna je iniciační methionin z obrázku 5 (SEQ ID č.: 1) a přičemž je vyloučena mutace Met na Ile v pozici 256, a že serin-acetyltransferáza má inhibiční konstantu Kj 0,02 až 2,3 mM v přítomnosti 1 mM L-serinu a 0,1 mM acetyl-CoA.

2. Serin-acetyltransferáza podle nároku 1, jejíž proteinová sekvence zahrnuje výměnu aminokyselin nejméně jednoho z mutantů cysE uvedených v tabulce la nebo deleci podle tabulky lb.

3. Sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu podle jednoho z nároků 1 nebo 2.

4. Sekvence DNA, která kóduje serin-acetyltransferázu podle jednoho z nároků 1 nebo 2, která ve srovnání s divokým typem enzymu vykazuje sníženou citlivost vůči inhibitoru L-cysteinu, obsahující nejméně jednu mutaci od bp 510 do bp 1040, přičemž bp 1 je první báze podle obrázku 6 (SEQ ID č.: 2), přičemž je vyloučena mutace guaninu na adenin, thymidin nebo cytosin v pozici 990.

5. Mikroorganizmus, který má metabolismus cysteinu deregulovaný nejméně jednou sekvencí DNA podle nároků 3 nebo 4.

6. Způsob výroby O-acetylserinu, L-cysteinu a sloučenin odvozených od L-cysteinu, vyznačující se t í m , že se mikroorganizmy podle nároku 5 kultivují v živném médiu.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že živné médium obsahuje dostatečné množství donoru síry.

8. Způsob podle nároku 7, vyznačující se tím, že se jako donor síry použije thiosulfát.