CZ294941B6 - Farmaceutický prostředek pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce a vektor - Google Patents

Abstract

Řešení se týká specifické exprese heterologních sekvencí v nádorových buňkách; jedná se zejména o geny kódující cytotoxické produkty pod kontrolou regulační sekvence P3 promotoru genu IGF-2. Řešení poskytuje prostředky využitelné při léčbě rakoviny.ŕ

Description

Vynález se týká oblasti nádorové buněčné biologie a léčby rakoviny. Konkrétně se vynález týká specifické exprese heterologních genů v nádorových buňkách, zejména genů kódujících cytotoxické produkty.

Dosavadní stav techniky

Geny růstového faktoru podobného insulinu (Insulin-like Growth Factor. IGF)

IGF-2 je imprintovaný gen, jehož exprese závisí na tom, z kterého rodiče pochází. Avšak na rozdíl od H19 je IGF-2 mateřsky imprintován, jak u myši, tak u lidí, a proto je exprimován z otcovské alely (Rainier et al.. 1993, Nátuře 363:747-749). Lidský IGF-2 gen vykazuje komplikovaný transkripční profil. Existují čtyři IGF-2 promotory, jež jsou tkáňově a vývojově specificky aktivovány. Pouze tři z promotorů. P2, P3 a P4 jsou imprintovány a jsou aktivní během fetálního vývoje a v rakovinných tkáních. Čtvrtý promotor. Pí, není imprintován a je aktivován pouze v dospělých játrech a v choroidální pleteni (viz Holthuizen et al.. 1993. Mol. Reprod. Dev. 35:391-393). P3 promotor IGF-2 genu snad hraje roli v progresi jaterní cirhózy a hepatocelulárního karcinomu (Kim a Park, 1998, J. Korean Med. Sci. 13:171-178).

Ztráta imprintingu IGF-2 byla zjištěna v případě Wilmsova nádoru (Ogawa et al., 1993, Nátuře 363, 749-751). Toto pozorování vedlo mnoho badatelů k představě, že ztráta imprintingu a bialelická exprese imprintovaných genů může hrát roli v poruchách růstu a ve vývoji rakoviny (viz také Rainier et al., 1993, Nátuře 362:747-749, Glassman et al., 1996, Cancer Genet. Cytogenet. 89:69-73).

GenH19

Gen H19 je jedním z mála genů, o nichž se ví, že jsou u člověka imprintovány (Hurst et al., 1996, Nátuře Genetics 12:234-237). Na samém začátku embryogeneze je H19 exprimován z obou chromosomálních alel (DeGroot et al., 1994, Trophoblast 8, 285-302). Krátce poté však dochází k umlčení otcovské alely a transkribuje se pouze alela zděděná od matky.

H19 je vysoce exprimován během embryogeneze a poprvé byl identifikován jako gen, který je v játrech koordinovaně regulován společně s alfa-fetoproteinem účinkem trans-působícího lokusu raf (Pachnis et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:5523-5527). H19 byl vedle toho nezávisle nakloňován řadou laboratoří, které se zabývaly izolací genů exprimovaných během diferenciace tkání. Například Davis et al. (1987, Cell 51:987-1000) identifikovali myší homolog H19 při vyhledávání genů aktivních v časných fázích diferenciace buněk C3HIOTI/2. Pourier et al. (1991. Development 113:1105-1114) zjistili, že myší H19 se exprimuje při diferenciaci kmenových buněk a v době implantace. Transkripce lidského H19 genu byla rovněž pozorována v diferencujících se cytotrofoblastech z lidské placenty (Rachmilewitz et al.. 1992, Molec. Reprod. Dev. 32:196-202).

Zatímco v průběhu fetálního života dochází k transkripci H19 RNA v řadě různých embryonálních tkání, po narození je exprese H19 zastavena. Avšak ve svalu a játrech dospělých myší (Brunkow aTilghman, 1991, Genes & Dev. 5:1092-1101) byla zjištěna určitá relativně nízká hladina transkripce H19. Postnatálně je H19 aktivován rovněž v nádorových buňkách. Ariel et al. (1997, Molec. Pathol. 50:3444) prokázali expresi H19 v řadě nádorů vzniklých v tkáních, ve kterých je H19 exprimován prenatálně. Dále tito autoři zjistili H19 RNA v nádorech odvozených

-1 CZ 294941 B6 z neurálních tkání, zejména v astrocytomech a ganglioneuroblastomech, o nichž není známá asociace s expresí H19. Vzhledem k velkému množství nádorů exprimujících H19 RNA tito autoři uvažovali o možnosti, že H19 je onkofetální RNA a navrhli výzkum H19 jako nádorového markéru pro lidské neoplazie.

Lidský i myší H19 gen byl nakloňován a sekvenován (Brannan et al., 1990, Molec. Cell. Biol. 10:28-36). Srovnání lidského a myšího genu H19 ukázalo celkovou 77 % identitu nukleotidové sekvence. Navzdory této mezidruhové homologii na nukleotidové úrovni, aminokyselinové sekvence odvozené z otevřených čtecích rámců obou genů vykazovaly nízkou identitu (Id.). Dále, ačkoliv H19 RNA je transkribována RNA polymerasou 11, dochází u ní k sestřihu a polyadenylaci, zdá se, že není překládána. Namísto toho bylo zjištěno, že H19 RNA asociuje s 28S cytoplasmatickou RNA, což vedlo k úvahám, že H19 RNA by mohla působit jako RNA složka ribonukleoproteinového komplexu (Id.).

Skutečná fyziologická role H19 není zcela jasná. H19 může působit jako dominantně letální gen; vysoká ektopická exprese H19 transgenu u myší je příčinou letality krátce před narozením (Brunkow et al., supra). Tento časový úsek letality se shoduje s dobou, kdy nastává represe transkripce H19 genu. Na druhé straně však nebyl pozorován žádný defekt u myší nesoucích heterozygotní nebo homozygotní knockout H19 alely (alel) (Leighton et al., 1995, Nátuře 375:34-39). Knockout mateřské alely brání imprintingu geneticky vázaného a opačně imprintovaného IGF-2 genu; výsledné myši jsou při narození větší než jejich sourozenci z vrhu díky zvýšené prenatální expresi IGF-2 (Id.). Jelikož tyto dva opačně imprintované geny sdílejí cis-působící regulační sekvence. Leighton se spolupracovníky uvažovali o možnosti, že H19 by mohl hrát roli v imprintingu IGF-2 genu.

Produktu H19 genu je dále též přisuzována funkce nádorové supresorové RNA. Hao et al. (1993, Nátuře 365:764-767) popsali, že transfekce dvou embryonálních nádorových buněčných linií. RD a G401, DNA konstruktem exprimujícím H19, vedla k retardaci buněčného růstu, kmorfologickým změnám a ke snížení tumorigenity v nudě myších. Takováto nádorová supresorová aktivita je v souladu s pozorovanou letalitou ektopické exprese (Hao et al., supra), jakož i se zvětšenou velikostí myší majících knockout mateřské alely H19 (Leighton et al., supra). Představa, že H19 je nádorový supresor však zůstává kontroverzní. Některé výsledky nebyly údajně reprodukovány a případný jiný nádorový supresorový gen může existovat v těsné vazbě k H19 (Ariel et al., supra). Navrhovaná funkce H19 jako nádorového supresoru je také v rozporu s experimentálními údaji, podle kterých dochází k aktivaci H19 v širokém spektru nádorových buněk (viz například Lustig-Yariv et al., 1997, Oncogene 23:169-177).

Nádorově specifická genová terapie

Regulační oblasti genů asociovaných s nádory se používají k cílené selektivní expresi sebevražedného genu v buňkách odvozených z nádorů. Například v hepatocelulámím karcinomu je indukována exprese alfa-fetoproteinu. Huber et al. (1991, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88:80398043) použili regulačních sekvencí genů albuminu nebo alfa-fetoproteinu k cílené expresi thymidin kinasy viru varicella-zoster (N7N TK) v buňkách hepatomu. Hepatomové buňky infikované in vitro retrovirovým vektorem obsahujícím jeden z těchto expresních konstruktů exprimovaly VZV TK a staly se citlivé vůči normálně netoxickému 6-methoxypurin arabinonukleosidu (araM). Kaneko et al. (1995, Cancer Res. 55:5283-5287) sestrojili adenovirový vektor exprimující HSV TK pod kontrolou regulačních sekvencí alfafetoproteinu. Rekombinantní adenovirové částice obsahující tento vektor byly přímo injikovány do nádorů odvozených z hepatocelulárního karcinomu, vytvořených v bezthymových nudě myších. Následné intraperitoneální injekce gancicloviru způsobily regresi nádorů odvozených z hepatocelulárního karcinomu.

Osaki et al. (1994, Cancer Res. 54:5258-5261) transfekovali plicní karcinomové buňky A54 expresním vektorem, který obsahoval regulační sekvence genu pro antigen plicního

-2 CZ 294941 B6 embryonálního karcinomu spojené s kódující sekvencí thymidin kinasy viru Herpes simplex (HSV TK). Transfekované buňky byly citlivé vůči gancicloviru. Navíc i růst nádorů v nudě myších vyvolaný podkožní injekcí transfekovaných buněk byl inhibován opakovanými intraperitoneálními injekcemi gancicloviru. Nedávno však bylo zjištěno, že gen karcinoembryonálního antigenu je exprimován v normální střevní sliznici, což omezuje použitelnost těchto regulačních sekvencí jakožto nádorově specifických regulačních oblastí (Osaka et al., supra). Přetrvává tedy potřeba vývoje vektorů pro genovou terapii, které by specificky exprimovaly genové produkty v nádorových buňkách.

Podstata vynálezu

Vynález se týká použití polynukleotidu, obsahujícího regulační sekvenci IGF-2 P3 promotoru funkčně spojenou s heterologní sekvencí, jež kóduje cytotoxický genový produkt, pro výrobu farmaceutického prostředku pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce, kde nádorovou buňkou není buňka hepatokarcinomu.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde nádorová buňka je buňka nádoru močového měchýře.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde buňka nádoru močového měchýře je vybrána ze skupiny sestávající z Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde heterologní sekvence je vybrána ze skupiny sestávající z kódujících sekvencí pro β-galaktosidasu, difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu, p53, thymidinkinasu viru herpes simplex, thymidinkinasu viru varicella zoster, cytosindeaminasu, nitroreduktasu, cytochrom p-450 281, thymidinfosforylasu, purinnukleosidfosforylasu, alkalickou fosfatasu, karboxy-peptidasu A a G2, linamarasu, β-laktamasu a xanthinoxidasu.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde heterologní sekvence je antisense sekvence, jež specificky hybridizuje k sekvenci kódující gen vybraný ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun. Krras a Her2/neu.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde heterologní sekvence kóduje ribozym, který specificky štěpí RNA kódovanou genem vybraným ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8. cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyclinE. cyclinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun. Krras a Her2/neu.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde nádorová buňka je v pacientovi.

V dalším provedení se vynález týká použití, kde pacient má nádor vybraný ze skupiny zahrnující karcinom močového měchýře, hepatoblastom, rabdomyosarkom, karcinom vaječníku, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom.

V dalším provedení se vynález týká vektoru pro expresi sekvence v nádorové buňce, kde vektor obsahuje polynukleotid, který obsahuje regulační sekvenci IGF-2 P3 promotoru funkčně spojenou s heterologní sekvencí kódující cytotoxický genový produkt.

V dalším provedení se vynález týká hostitelské buňky obsahující vektor uvedený výše.

V dalším provedení se vynález týká použití polynukleotidu kódujícího cytotoxický nebo cytostatický genový produkt funkčně spojený s regulační sekvencí IGF-2 P3 promotoru, pro výrobu

-3 CZ 294941 B6 farmaceutického prostředku pro léčení rakoviny, kde rakovinou není hepatokarcinom, zvláště kde cytotoxický genový produkt je vybrán ze skupiny zahrnující difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu a p53.

V dalším provedení se vynález týká použití vektoru uvedeného výše pro výrobu farmaceutického prostředku pro expresi heterologní sekvence v tumorové buňce, kde tumorovou buňkou není buňka hepatokarcinomu.

Podrobný popis vynálezu

Vynález částečně vychází z objevu, že k cílené expresi žádoucích kódujících sekvencí v rakovinných buňkách lze využít regulačních oblastí z genomové imprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách. Bylo zjištěno, že v nádorových buňkách jsou specificky aktivovány rekombinantní DNA konstrukty, jež obsahují promotor P3 genu IGF-2 funkčně spojený s heterologním genem. Exprese může být aktivována v širokém spektru karcinomů, jež zahrnují, ale bez omezení, karcinom močového měchýře, hepatoblastom, rabdomyosarkom, ovariální karcinom, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom, přičemž vyloučen je hepatocelulární karcinom. Dále bylo zjištěno, že v nádorových buňkách jsou specificky aktivovány rekombinantní DNA konstrukty, jež obsahují promotor P3 genu IGF-2 funkčně spojený s heterologním genem, v kombinaci se spodním (downstream) H19 enhancerem.

V jednom ze svých aspektů tedy vynález poskytuje prostředky pro změnu fenotypu rakovinných buněk nebo pro jejich selektivní zabití. Tohoto cíle je dosaženo tím, že do buněk se vpraví polynukleotid zahrnující regulační oblasti z genomové imprintovaného genu IGF-2, který je exprimován v rakovinných buňkách, funkčně spojené s heterologním genem. Heterologní gen může kódovat například cytostatikum nebo cytotoxické agens (např. toxin, antisense RNA nebo ribozym).

Regulační oblastí exprimovánou v rakovinných buňkách je IGF-2 promotor P3.

Pro účely vynálezu zde popsaného, výraz funkčně spojený znamená, že nukleotidová sekvence je připojená k regulační sekvenci způsobem umožňujícím, aby exprese nukleotidové sekvence byla řízená regulační sekvencí.

Heterologní genová sekvence se týká, v bezprostředním smyslu, genové sekvence, jež normálně není funkčně spojená s regulačními sekvencemi genu IGF-2. Obecně, heterologní genové sekvence zahrnují sekvence, jež kódují cytostatické nebo cytotoxické genové produkty.

Výraz exprese jak se zde užívá, se týká transkripce určité DNA, a dále sestřihu, opracování, stability a případně translace odpovídajícího mRNA transkriptů. V závislosti na struktuře vnesené molekuly DNA může být exprese přechodná nebo kontinuální.

Regulační sekvence promotoru P3 genu IGF-2

Níže jsou popsány regulační sekvence IGF-2, jež mohou být použity k specifické aktivaci exprese heterologní kódující sekvence v nádorové buňce.

Při expresi IGF-2 genu se využívá jednoho ze čtyř různých promotorů. Tři z těchto promotorů jsou imprintovány a jsou exprimovány v embryonálních tkáních; promotor Pl je však aktivován pouze v dospělých tkáních (Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9). P3 promotor hraje roli v hepatokarcinomu. Rovněž bylo zjištěno, že imprintovaný promotor P4 (nukleotidová sekvence -546 až +102 genu IGF-2) a promotor P3 (nukleotidová sekvence -1229 až +140 genu IGF-2)

-4 CZ 294941 B6 jsou aktivovány v lidských rakovinných buňkách močového měchýře a mohou být využity k směrování exprese funkčně spojeného heterologního genu do nádorových buněk. Promotory P3 a P4 genu IGF-2 mohou být použity v kombinaci s H19 enhancerem nebo s jeho aktivními fragmenty. Předmětem předkládaného vynálezu jsou regulační sekvence promotoru P3 genu IGF-2.

Tyto regulační sekvence z genomové imprintovaných i neimprintovaných genů, jež jsou exprimovány v rakovinných buňkách, mohou být dále analyzovány, aby se stanovily minimální regulační sekvence nutné k dosažení žádoucí nádorově specifické exprese. Promotorová oblast může být například pozměněna adicemi, substitucemi nebo delecemi a testována na funkčnost v nádorově specifické expresi.

Změny v regulačních sekvencích lze provést pomocí řady chemických a enzymatických metod, které jsou dobře známy v oboru. Například úseky sekvenci vymezené restrikčními místy mohou být deletovány. Místně cílenou mutagenezou lze definovaným způsobem měnit sekvenci a/nebo vnášet do specifických úseků sekvence restrikční místa. Deleční mutanty mohou být generovány i s použitím DNA nukleas jako jsou Bal31 nebo ExoIII a Sl nukleasa. Progresivně větších delecí v regulačních sekvencích se dosahuje inkubací DNA s nukleasami po delší dobu (pro přehled technik používaných k mutageneze, viz Ausubel et al., 1989, Current Protocols for Molecular Biology).

Pozměněné sekvence se vyhodnocují podle schopnosti aktivovat nádorově specifickou expresi heterologních kódujících sekvenci ve vhodných hostitelských buňkách. Jakékoli pozměněné regulační sekvence, jež mají zachovanou schopnost řídit nádorově specifickou expresi budou zahrnuty do rekombinantních expresních vektorů pro další využití, a spadají do rozsahu předkládaného vynálezu.

Pod kontrolou těchto regulačních sekvencí mohou být exprimovány mnohé různé heterologní geny, jako například geny kódující toxické genové produkty, potenciálně toxické genové produkty a genové produkty s antiproliferační nebo cytostatickou aktivitou. Mohou se exprimovat i markerové geny, včetně enzymů (např. CAT, beta-galaktosidasa, luciferasa). fluorescenčních proteinů, jako je zelený fluorescenční protein, nebo antigenních markérů.

Cytotoxické genové produkty zahrnují, v širší definici, jak toxiny, tak činitele indukující apoptosu Pro účely vynálezu se kromě toho mezi cytotoxické genové produkty zahrnují enzymy metabolismu, které konvertují prekursor na cytotoxický produkt. Příklady cytotoxických genových produktů, které mohou být podle vynálezu použity, zahrnují záškrtový toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin. PE40 a nádorové supresorové geny jako jsou gen retinoblastomu a p53. Vedle toho mohou být použity sekvence kódující apoptické peptidy, které indukují buněčnou apoptosu. Takovéto apoptické peptidy zahrnují A β peptid u Alzheimerovy choroby (viz LaFerla et al., 1995, Nat. Genet. 9:21-30). atriální natriuretický peptid (viz Wu et al., 1997, J. Biol. Chem. 272:14860-14866), peptid podobný calcitoninu (viz Sakuta et al., 1996, J. Neuroimmunol. 67:103-109), jakož i další známé nebo dosud neobjevené apoptické peptidy.

Mezi metabolické enzymy, které konvertují prekursory na cytotoxický produkt, patří thymidinkinasa (z viru herpes simplex nebo varicella zoster), cytosindeaminasa, nitroreduktasa, cytochrom P-450 281, thymidinfosforylasa, purinnukleosidfosforylasa, alkalická fosfatasa, karboxypeptidasa A a G2, linamarasa, laktamasa a xanthinoxidasa (viz Rigg a Sikora. August 1997, Mol. Med. Today, str.359-366).

Expresními konstrukty zde popsanými lze do rakovinných buněk vnášet i antisense, antigenní nebo aptamerní oligonukleotidy. V rakovinné buňce mohou být dále exprimovány ribozymy nebo jednořetězcové RNA s cílem inhibovat expresi konkrétních genů. Cílové geny pro zásah těmito antisense nebo ribozymovými molekulami jsou geny, jejichž produkty jsou nezbytné pro

-5 CZ 294941 B6 přežití buňky nebo pro udržení rakovinového fenotypu. Takovéto cílové geny zahrnují, ale bez omezení, cdk2, cdk8. cdk21. cdc25A, cyklinDl, cyklinE, cyklinA a cdk4.

Do buněk se například zavádějí vektory, které pod kontrolou regulačních sekvencí imprintovaných genů, aktivních v rakovinných buňkách, exprimují antisense RNA molekuly nebo ribozymy specifické vůči transkriptům onkogenních forem p53, c-fos, c-jun. K-ras a/nebo Her2/neu, aby se zastavila exprese endogenních genů. Nádorové buňky, které specificky aktivují promotory IGF-2 P3, mohou být specifickými terči pro expresi antisense RNA nebo ribozymové RNA.

Přístupy využívající antisense techniku zahrnují návrh oligonukleotidů (v tomto případě mRNA) komplementárních k cílové mRNA. Antisense olígonukleotídy se budou vázat ke komplementárním cílovým mRNA transkriptům a bránit jejich translaci. Absolutní komplementarita, byť výhodná, není nutná. Výraz sekvence komplementární k části RNA, jak se zde užívá, znamená sekvenci komplementární natolik, že je schopná hybridizovat k RNA a tvořit s ní stabilní duplex. Schopnost hybridizovat bude záviset jak na stupni komplementarity, tak na délce antisense nukleové kyseliny. Obecně, čím delší je hybridizující nukleová kyselina, tím více nepárujících bází vůči RNA může obsahovat a přesto s ní může vytvářet stabilní duplex (nebo triplex, podle okolností). Osoba zběhlá v oboru může určit tolerovatelný stupeň nekomplementarity pomocí standardních postupů na stanovení teploty tání hybridizovaného komplexu.

V inhibici translace by měly být nejúčinnější olígonukleotídy, jež jsou komplementární k 5' konci cílové mRNA, např. k 5' nepřekládané sekvenci až po (a včetně) iniciační AUG kodon.

V nedávné době se však prokázalo, že i sekvence komplementární k 3' nepřekládaným sekvencím molekul mRNA účinně inhibují translaci. Viz, obecně. Wagner, 1994, Nátuře 372:333-335. Olígonukleotídy komplementární k 5'- nebo 3'- nepřekládaným nekódujícím oblastem transkriptů cílových genů mohou tedy být použity v tomto antisense přístupu k inhibici translace endogenních genů. Olígonukleotídy komplementární k 5' nepřekládané oblasti mRNA by měly zahrnovat komplement iniciačního kodonu AUG. Antisense olígonukleotídy komplementární ke kódujícím oblastem mRNA jsou méně účinnými inhibitory translace, mohly by ale v souladu s vynálezem být použity. Antisense nukleové kyseliny, ať již mají hybridizovat k 5', 3' nebo kódující oblasti cílové mRNA, by měly mít délku alespoň šest nukleotidů, s výhodou od 6 do asi 50 nukleotidů. Ve specifických aspektech je délka oligonukleotidů alespoň 10 nukleotidů, alespoň 17 nukleotidů, alespoň 25 nukleotidů nebo alespoň 50 nukleotidů.

Bez ohledu na volbu cílové sekvence je výhodné provést nejprve in vitro pokusy, aby se kvantitativně vyjádřila schopnost antisense oligonukleotidů inhibovat genovou expresi. V těchto studiích by měly být i kontroly na rozlišení inhibice genu antisense oligonukleotidem od nespecifických biologických účinků oligonukleotidů. Je rovněž výhodné, aby se v těchto studiích porovnaly hladiny cílové RNA nebo proteinu s hladinami RNA nebo proteinu vnitřní kontroly.

Translaci cílové mRNA lze také bránit použitím molekul ribozymu navrženého tak, aby katalyticky štěpil příslušný cílový gen. (Viz např. PCT Intemational Publication WO90/11364, publikovanou 4.října 1990; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225). Je-li ribozym specifický pro genový transkript kódující protein, který je nezbytný pro růst rakovinné buňky' může takový ribozym vyvolat ztrátu fenotypu rakovinné buňky. K cílenému zničení molekul mRNA mohou být použity ribozymy, které štěpí tyto mRNA ve specifických rozpoznávacích místech, avšak výhodnější je použití hammerhead ribozymů. Hammerhead ribozymy štěpí molekuly mRNA v místech diktovaných ohraničujícími oblastmi, jež tvoří komplementární páry bází s cílovou mRNA. Jediným požadavkem je, aby mRNA měla následující sekvenci dvou bází: 5'-UG-3'. Konstrukce a produkce hammerhead ribozymů je dobře známá v oboru a je podrobněji popsána v práci Haseloff a Gerlach, 1988, Nátuře 334:585-591. Ribozym se s výhodou konstruuje tak, aby rozpoznávané štěpící místo leželo blízko 5'konce cílové mRNA; tedy tak, aby se zvýšila účinnost a minimalizovala akumulace nefunkčních mRNA transkriptů.

-6CZ 294941 B6

Ribozymy pro použití podle vynálezu také zahrnují RNA endoribonukleasy (dále v textu ribozymy Čechova typu), jejichž prototyp se vyskytuje přirozeně v Tetrahymena thermophila (známé jako IVS nebo L-19 IVS RNA), a které podrobně popsal Thomas Cech se spolupracovníky (Zaug et al.. 1984, Science 224:574-578; Zaug a Cech, 1986. Science 231:470-475; Zaug et al.. 1986, Nátuře 324:429-433; publikovaná Mezinárodní Patentová Přihláška WO 88/04300 University Patents lne.; Been a Cech, 1986, Cell 47:207216). Ribozymy Čechova typu mají aktivní místo o osmi párech bází, které hybridizuje k sekvenci cílové RNA, načež nastává štěpení cílové RNA. Vynález předpokládá použití těch ribozymů Čechova typu, jejichž 8 bp sekvence aktivního místa hybridizuje k sekvencím přítomným v cílových genech.

Aktivace genů v nádorových buňkách

Buňky, ve kterých dochází k reaktivaci exprese imprintovaného genu budou též schopné specificky aktivovat expresi heterologního genu z vektoru obsahujícího regulační oblasti takovéhoto imprintovaného genu funkčně spojené s heterologním genem. Takovéto buňky, zejména nádorové buňky jsou vhodným terčem pro postupy genové terapie podle vynálezu. Exprese specifická pro IGF-2 P3 může být stanovena v nádorech i v buněčných liniích technikami analýzy RNA, in šitu hybridizace a s použitím konstruktů obsahujících reportérové geny.

Ve většině aplikací RNA analýzy se používá značená sonda, specificky hybridizující s transkriptem sledovaného genu, kterou lze připravit kteroukoli z technik dobře známých v oboru.

Ve specifickém provedení vynálezu, jež je níže ilustrováno příkladem, se značená antisense RNA sonda připravila in vitro s použitím T7 nebo T3 expresního plasmidu. Sondy se dají též značit s použitím náhodných primerů a značeného nukleotidu, například se soupravou Prime-lt (Stratagene. La Jolla. CA, katalog, č. 300392). Jinak lze připravit značenou sondu i pomocí PCR reakce s použitím cDNA klonu obsahujícím kódující oblast genu a primerů navržených tak, aby se amplifikovala část kódující oblasti. Další možností je standardní reakce posunu jednořetězcového zlomu (nick translation).

Vhodný způsob označení polynukleotidových sond zahrnuje nukleotidy obsahující radioaktivní izotopy (jako jsou ³⁵S a ³²P), fluorescentní, luminiscentní a barevné značky, a enzymové molekuly.

Značená sonda se in šitu hybridizuje k buňce nebo k vzorku tkáně s použitím standardních technik, jak je popsáno níže příkladem a ve spolupodané patentové US přihlášce 08/704 786, která je zde zahrnuta odkazem. Je-li k dispozici dostatečné množství příslušných buněk, lze stanovení hladiny exprese mRNA sledovaného genu provést standardní RNA analýzou (jako je např. northernová analýza, chránění před RNAsou, nebo extense primerů).

Takovéto analýzy genové exprese je možné provádět též in šitu, tzn. přímo v tkáňových řezech (fixovaných a/nebo zmražených) připravených ze vzorků tkání pacientů, odebraných při biopsiích nebo resekcích, takže není nutná purifíkace nukleových kyselin. K těmto in šitu postupům se mohou použít sondy a/nebo primery popsané výše. (Viz např. Nuovo. G.J., 1992, PCR ln Šitu Hybridization: Protocols And Applications, Raven Press. NY).

Jinou možností jak určit, zda v buněčném typu nebo nádoru bude možná specifická aktivace expresních konstruktů obsahujících konkrétní regulační oblasti funkčně spojené s heterologním genem, je přímá transfekce takovýchto expresních konstruktů do buňky. Pro tyto účely je výhodné, aby heterologní gen byl markerový gen. Pozitivní výsledek testu na produkt markerového genu znamená, že buňka nebo buněčná linie jsou schopné aktivovat expresi z použitých regulačních oblastí.

-7CZ 294941 B6

Aplikací shora uvedených technik lze určit i nádory, které aktivují IGF-1 a promotory P3 a P4 genu IGF-2. Takovéto nádory jsou rovněž léčitelné způsoby podle vynálezu. Například IGF-2 je aktivován v nádorech dětského věku, jako jsou Wilmsův nádor, rabdomyosarkomy, neuroblastomy a hepatoblastomy.

Způsoby jak vnášet do hostitelských buněk polynukleotidy, jež jsou pod kontrolou regulačních sekvencí

Vynález se rovněž vztahuje na hostitelské buňky transfekované polynukleotidy, jež obsahují regulační oblasti funkčně spojené s heterologním genem. Takovéto hostitelské buňky se mohou udržovat v kultuře nebo mohou být součástí zvířete, s výhodou savce. Uvedené polynukleotidy se typicky ligují do kteréhokoli z široké škály vektorů, které se pak následně vnášejí do buněk s použitím zde presentovaných postupů a materiálů. Takovéto vektory mohou být konstruovány s použitím dobře zavedených technik molekulární biologie (viz obecně. Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, sv, I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. New York; a Current Protocols in Molecular Biology, 1989, John Wiley & Sons, všechny svazky tohoto manuálu a jejich pravidelné doplňky jsou zde zahrnuty odkazem). V případech, kdy je požadována i translace, bude heterologní gen konstruován tak, aby obsahoval i vhodný 3' polyadenylační signál.

Kultivované buňky

Hostitelské buňky transfekované polynukleotidy obsahujícími regulační oblasti imprintovaného genu funkčně spojené s heterologním genem mohou být jakékoli prokaryotické nebo eukaryotické buňky. Ligace polynukleotidu do genového konstruktu, jako je vektor, a transformace nebo transfekce do hostitelských buněk, buď eukaryotických (kvasinky, buňky ptačí, hmyzí nebo savčí), nebo prokaryotických (bakteriální buňky), jsou standardní postupy široce používané v mikrobiálních technologiích nebo v kultivaci tkáňových kultur.

Vektory vhodné pro kultivaci předmětných polynukleotidů v bakteriálních buňkách, jako jsou E. coli, zahrnují plasmidy následujících typů: plasmidy odvozené od pBR322, plasmidy odvozené od pEMBL, plasmidy odvozené od pEX, plasmidy odvozené od pBTac, a plasmidy odvozené od pUC. V kvasinkách S. cerevisiae se jako užitečné klonovací a expresní vektory pro vnášení genetických konstruktů uplatňují plasmidy YEP24, YIP5, YEP51, pYES2 a YRPI7 (viz například Broach et al., 1993 v Experimental Manipulation of Gene Expression, ed. M. lnouye. Academie Press, str. 83). Tyto vektory se mohou replikovat jak v E. coli, díky přítomnosti replikačního počátku ori z pBR322, tak i v kvasinkách, díky přítomnosti počátku replikace z kvasinkového 2pm plasmidu. Kromě toho mohou být použity markéry resistence k antibiotikům, jako např. k ampicilinu.

Podobně i výhodné savčí vektory pro nukleotidy podle vynálezu obsahují prokaryotické sekvence, které umožňují namnožení vektoru v bakteriích. Takovéto vektory pro transfekci do savčích buněk se mohou konstruovat tak, aby se integrovaly do savčího chromosomu a získaly tak dlouhodobou stabilitu; pro tento účel mají připojený selektovatelný markerový gen. Pro transientní expresi je možné použít deriváty virů, jako jsou např. bovinní papillomavirus (BPV-1) nebo virus Epsteina-Barrové. Různé metody používané při přípravě plasmidů a jejich transformaci do hostitelských organismů jsou dobře známy v oboru. Další vhodné vektorové systémy, jakož i obecné postupy rekombinantní technologie uvádí Sambrook et al., supra.

Genová terapie

Vynález rovněž zahrnuje využití polynukleotidů, obsahujících regulační oblast genu funkčně spojenou s heterologním genem, v genové terapii rakoviny a hyperproliferačních onemocnění.

-8CZ 294941 B6

Pro účely genové terapie se mohou expresní konstrukty podle vynálezu podávat v jakémkoli biologicky účinném nosiči, např. jakémkoli přípravku nebo prostředku schopném účinně dopravit rekombinantní gen do buněk in vivo. Přístupy zahrnují inserci předmětného genu do virových vektorů, včetně rekombinantních retrovirů, adenoviru, adenoasociovaného viru a viru herpes simplex-1, nebo do rekombinantních bakteriálních nebo eukaryotických plasmidů. Virové vektory transfekují buňky přímo; plasmidová DNA může být vpravena do buněk např. pomocí kationických polymerů, kationických liposomů (např. lipofectinu, derivátů cholesterolu jako D.D.A.B. a kationických fosofolipidů) nebo derivatizovaných (např. s protilátkou konjugovaných) konjugátů polylysinu, gramicidinu S, umělých virových obálek nebo jiných takovýchto nitrobuněčných nosičů, jakož i přímou injikací holého genového konstruktu, elektroporací nebo CaPO₄ koprecipitací. Současný přehled pojednávající o přenosu genů a expresních systémech při genové terapii rakoviny podává Cooper, 1996, Seminars in Oncology 23:172-187.

Transduce vhodných cílových buněk je prvním důležitým krokem při genové terapii; je zřejmé, že volba konkrétního gen-vnášejícího systému bude záviset na faktorech jako jsou fenotyp uvažovaného cíle a způsob aplikace, např. místní nebo systémové. Je rovněž jasné, že konkrétní genové konstrukty poskytované pro in vivo transdukci expresních konstruktů jsou použitelné i pro in vitro transdukci buněk, jako např. pro použití v ex vivo tkáňových kulturách popsaných shora.

Výhodný způsob jak zavést do buňky in vivo nukleovou kyselinu je použít virový vektor obsahující nukleovou kyselinu, např. konkrétní cytotoxický gen pod kontrolou regulačních sekvencí, infekce buněk virovým vektorem je výhodná tím, že nukleová kyselina se dostane do velké části použitých buněk. Další výhodou je, že molekuly, např. cDNA kódované virovým vektorem, jsou v těchto buňkách, do nichž se dostane virový vektor, účinně exprimovány. Vhodné vektory, jež mohou být vnášeny do buněk s použitím zde uvedených způsobů a prostředků zahrnují, ale bez omezení, vektory na bázi viru herpes simplex, adenoviru, adeno-asociovaného viru, retrovirů, viru pseudorabies, alfa-herpes viru, a podobně. Podrobný přehled virových vektorů, zejména virových vektorů vhodných k modifikaci nereplikujících se buněk, jakož i způsoby užití těchto vektorů v souvislosti s expresí požadovaných polynukleotidů, lze nalézt v knize Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, ed. Caplitt and Loewy. Academie Press. San Diego(1995).

Bylo prokázáno, že infekční spektrum virů a tedy i vektorů odvozených z virů lze omezit, modifikují-li se obalové proteiny na povrchu virové částice (viz např. publikace PCT WO93/25234 a W094/06920). Strategie používané k modifikaci infekčního spektra retrovirových vektorů například zahrnují: připojení protilátek specifických vůči antigenům buněčného povrchu k virovému env proteinu (Roux et al.. 1989, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:9079-9083; Julan etal„ 1992, J. Gen. Virol.. 73:3251-3255; a Goud et al., 1983, Virology 163:251-254); nebo připojení ligandu buněčného povrchového receptorů k virovým env proteinům (Nedá et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:14143-14146). Připojení může být formou chemického kovalentního přisíťování proteinu nebo jiné molekuly (např. laktosy, čímž se env protein převede na asialoglykoprotein), jakož i vytvořením fúzovaných proteinů (např. fúzované proteiny typu jednořetězcová protilátka/env). Touto technikou mohou být například nasměrovány rekombinantní viry na nádorové buňky tak, že k povrchu rekombinantního viru se připojí protilátky namířené proti nádorovým povrchovým proteinům nebo proti molekulám asociovaným s nádorem. Tato technika je použitelná nejen k omezení tropismu virových částic na určité buněčné typy, ale i ke konverzi ektotropního vektoru na vektor amfotropní.

Výhodný virový gen-vnášející systém, užitečný v předkládaném vynálezu, využívá vektory odvozené z adenoviru. Genom adenoviru se dá modifikovat takovým způsobem, že kóduje a exprimuje požadovaný genový produkt, ale jeho schopnost replikace v normálním lytickém životním cyklu je inaktivována. Viz například Berkner et al., 1988, BiOTechniques 6:616; Rosenfeld et al., 1991, Science 252:431434; a Rosenfeld et al., 1992, Cell 68:143-155. Vhodné adenovirové vektory odvozené z adenoviru kmene AD typu 5 dl324 nebo jiných adenovirových

-9CZ 294941 B6 kmenů (např. Ad2, Ad3, Ad7 atd) jsou dobře známy osobám zběhlým v oboru. Výhoda rekombinantních adenovirů může za jistých okolností spočívat v tom, že jsou použitelné k infekci širokého spektra buněčných typů, včetně epitelu dýchacích cest (Rosenfeld et al., 1992, supra), endoteliálních buněk (Lemarchand et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:64826486). hepatocytů (Herz a Gerard, 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:2812-2816) a svalových buněk (Quantin et al., 1992, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89:2581-2584). Dále, virové částice jsou relativně stálé, lze je purifikovat a koncentrovat a mohou být modifikovány za účelem ovlivnění spektra infektivity. Kromě toho, vnesená adenovirová DNA (a cizí DNA v ní obsažená) se neintegruje do genomu hostitelské buňky, nýbrž zůstává episomální, čímž se lze vyhnout potenciálním problémům, jež mohou nastat v důsledku inserční mutageneze v případech, kdy se vnesená DNA integruje do hostitelského genomu (např. retrovirová DNA). Dále, volná kapacita adenovirového genomu pro cizí DNA je v porovnání s jinými vektory pro vnášení genů velká (až 8 kb) (Berkner et al., supra; Haj-Ahmand a Graham, 1986 J Virol. 57:267). Většina replikačně-defektních adenovirových vektorů v současnosti používaných, a proto předkládaným vynálezem upřednostňovaných, mají zcela nebo zčásti deletovány virové geny El a E3, ponechávají si však až 80 % adenovirového genetického materiálu (viz např. Jones et al., 1979, Cell 16:683; Berkner et al., supra; a Graham et al., v Methods in Molecular Biology. E. J. Murray. Ed. (Humana. CliftonNJ. 1991) sv. 7, str. 109-127).

Jiný virový vektorový systém použitelný k vnášení předmětných expresních konstruktů je adenoasociovaný virus (AAV). Adenoasociovaný virus je přirozeně se vyskytující defektní virus, který pro účinnou replikaci a produktivní životní cyklus vyžaduje jiný, pomocný virus, jako např. adenovirus nebo herpes virus. (Pro přehled viz Muzyczka et al., 1992, Curr. Topics in Microbiol, and immunol. 158:97129). Je též jedním z mála virů, jež mohou integrovat svoji DNA do nedělících se buněk, a který vykazuje vysokou frekvenci stálé integrace (viz například Flotte et al., 1992, Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7:349-354; Samulski et al., 1989, J. Virol. 63:38223828, aMcLaughlin et al., 1989, J. Virol. 63:1963-1973). Vektory obsahující pouhých 300 bp AAV sekvence jsou schopné zabalení a mohou se integrovat. Místo pro exogenní DNA je omezeno na zhruba 4,5 kb. K zavedení DNA do buněk může být použit AAV vektor, který popisují Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260. Pomocí AAV vektorů byly do buněk různých typů zavedeny mnohé různé nukleové kyseliny (viz například Hermonat et al.. 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6466-6470; Tratschin et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 4:20722081; Wondisford et al., 1988, Mol. Endocrinol. 2:32-39; Tratschin et al., 1984, J Virol. 51:611-619; a Flotte et al., 1993, J. Biol. Chem. 268:3781-3790).

Vedle metod přenosu DNA pomocí virů, například uvedených shora, se pro řízenou expresi žádaného heterologního genu ve tkáni zvířete používají i nevirové metody. Většina nevirových metod přenosu genů využívá normálních mechanismů používaných savčími buňkami pro vychytávání a intracelulární transport makromolekul. Ve výhodných provedeních vynálezu se uplatňují nevirové systémy vnášení genů, které k vychytání a pohlcení předmětných expresních konstruktů terčovou buňkou využívají endocytosu. Příklady takovýchto gen vnášejících systémů zahrnují systémy odvozené z liposomů, polylysinové konjugáty a umělé virové obaly.

Při klinickém použití mohou být terapeutické expresní konstrukty vnášeny do pacienta jakýmkoli z mnoha způsobů, jež jsou dobře známy v oboru. Například, farmaceutický prostředek obsahující gen-vnášející systém může být zaváděn systémově, např. nitrožilní injekcí, přičemž k specifické expresi konstruktu v cílových buňkách dochází převážně na základě specifity transfekce dané buněčnou nebo tkáňově specifickou expresí, vyplývající z regulačních sekvencí předřazených heterolognímu genu, nebo z kombinace regulačních sekvencí s gen-vnášejícim systémem namířen ným na konkrétní typy buněk. V jiných provedeních je počáteční vnesení rekombinantního expresního konstruktu do zvířete omezenější, neboť je místně lokalizováno. Gen-vnášející systém může být například zaveden prostřednictvím katétru (viz Patent US 5 328 470) nebo stereotaktické injekce (např. Chen et al., 1994, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 91:30543057). Expresní konstrukt podle vynálezu může být pro genovou terapii vnesen též pomocí

-10CZ 294941 B6 elektroporace s použitím technik popsaných například v Dev et al., 1994, Cancer Treat. Rev. 20:105-115.

Farmaceutický preparát konstruktu pro genovou terapii může v podstatě sestávat z genvnášejícího systému v přijatelném ředicím roztoku, nebo může obsahovat gen-vnášející systém zakotvený v matrici, odkud se pomalu uvolňuje. V případech, kdy rekombinantní buňky mohou produkovat kompletní gen-vnášející systém, např. retrovirové vektory, může farmaceutický prostředek zahrnovat jednu nebo více buněk, jež produkují gen-vnášející systém.

Terapeutické použití a dávkování

Je zřejmé, že z hlediska lékaře nebo pacienta je žádoucí každé zabránění nebo zmírnění nepříznivých symptomů doprovázejících nádorové onemocnění (např. bolesti, citlivost, úbytek váhy a podobně). Dále je žádoucí jakékoli snížení nádorové masy nebo rychlosti růstu nádoru, jakož i zlepšení histopatologického obrazu nádoru. Pro účely této přihlášky se budou tedy zde používané výrazy léčba, terapeutické využití nebo lékařské využití týkat jakýchkoli a všech využití nárokovaných prostředků, jež jakýmkoli způsobem napravují stav nemoci nebo symptomy, nebo jinak zamezují, brání, brzdí nebo obracejí postup choroby nebo jiných nežádoucích symptomů.

Účinné dávkování a postup při léčbě může být stanoven obvyklým způsobem, přičemž se začíná s nízkou dávkou u laboratorních zvířat, postupně se dávky zvyšují a sledují se účinky a současně se systematicky pozměňuje dávkovači schéma. Studie na zvířatech, s výhodou na savcích, se běžně používají ke stanovení nejvyšší tolerované dávky bioaktivního agens na kilogram hmotnosti. Osoby znalé oboru extrapolují dávky pro další druhy, včetně člověka tak, aby byly účinné a přitom netoxické.

Před zahájením zkoušek účinnosti na lidech se provádí klinické studie Fáze I na normálních jedincích k určení bezpečných dávek. Při určování optimální dávky pro daného jedince musí klinici vzít do úvahy četné faktory. Hlavní roli hrají toxicita a biologický poločas konkrétního heterologního genového produktu. Další faktory zahrnují hmotnost pacienta, jeho stáří, celkový stav, konkrétní nádorové onemocnění a jeho vážnost, přítomnost jiných použitých léků, in vivo aktivita genového produktu a podobně. Zkušební dávkování se zvolí na základě výsledků studií na zvířatech a údajů v klinické literatuře.

Například, typická lidská dávka adenovirového vektoru, který obsahuje regulační oblast H19 funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt jako je např. thymidinkinasa, je od 1 x 10⁷ pfu do 1 x 10¹⁰ pfu injikovaných denně, přímo do nádorové masy. Výhodnější denní dávka takovéhoto adenovirového vektoru injikovaného přímo do nádoru je mezi 1 x 10⁸ pfu a 1 x 10¹⁰ pfu, v závislosti na velikosti nádoru. Samozřejmě, u adenovirového vektoru obsahujícího H19 regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem pro cytotoxický produkt s jinou mírou toxicity, budou tyto hodnoty příslušně upraveny. Podobné dávky se mohou použít jako doporučený výchozí bod v případě adenovirového vektoru obsahujícího IGF-2 promotor P4 funkčně spojený s heterologním genem, kódujícím cytotoxický produkt jako je např. thymidinkinasa.

Různé biochemické složky podle vynálezu mají mít s výhodou, zejména pro in vivo použití, vysokou čistotu a být v podstatě prosty potenciálně škodlivých kontaminujících látek a vyhovovat jakostním normám např. alespoň jakosti NF (National Food grade, tj. národní potravinové normě), obecně alespoň analytické jakosti, a s výhodou alespoň farmaceutické jakosti). Pokud musí být daná sloučenina před použitím nejdříve syntetizována, měl by výsledkem takovéto syntézy nebo následné purifíkace s výhodou být produkt, jenž je v podstatě prost jakýchkoli potenciálně toxických látek, jež mohly být použity v průběhu syntetických nebo purifikačních postupů.

- 11 CZ 294941 B6

Pro použití k léčbě pacienta s rakovinou mohou být také použity souprava nebo balíček ve formě sterilně plněné lahvičky nebo ampule, jež obsahuje polynukleotidový vektor, který obsahuje regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt, nebo buňku, jež uvolňuje takovýto vektor. V jednom provedení souprava obsahuje polynukleotidový vektor, který obsahuje regulační oblast funkčně spojenou s heterologním genem kódujícím cytotoxický produkt, a to jako přípravek připravený k aplikaci, s jednou nebo více dávkami, přičemž součástí balení je návod k použití při léčbě rakoviny. Alternativně balíček poskytuje sterilně plněnou lahvičku nebo ampuli obsahující buňku nebo buněčnou linii uvolňující takovýto vektor. Vektor-uvolňující buňky nebo buněčná linie by měly být skladovány a převáženy ve zmraženém stavu. Souprava může také obsahovat médium a reagencie potřebné ke kultivaci vektoruvolňujících buněk nebo buněčné linie.

Po popisu vynálezu následují příklady, jež slouží k ilustraci a nijak neomezují.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1A-1C. Nukleotidová sekvence promotorové oblasti lidského H19. Obrázek ukazuje promotorovou oblast od nukleotidové pozice -837 do -7 (relativně k začátku transkripce) (SEQ IDNO:1)

Obrázek 2. Schéma vektorů použitých k expresi heterologního genu pod kontrolou regulačních sekvencí H19.

Obrázek 3A-3E. Regulační sekvence H19 řídí expresi heterologního genu (CAT) v liniích rakovinných buněk močového měchýře. Specifická aktivita CAT (cpm/pg proteinu) je vynesena pro pět různých uvedených buněčných linií jako funkce vektoru použitého k transfekci. Obrázek 3A: HT-1376 buňky. Obrázek 38: EJ28 buňky. Obrázek 3C: T24P buňky. Obrázek 3D: 1197 buňky. Obrázek 3E: UM- UC-3 buňky. Následující vektory jsou podrobněji popsány níže v části 6: (1) pCAT-basic: (2) pCAT-control; (3) pH19E; (4) pH19EHI9D; a (5) pH19EHI9R.

Obrázek 4A-4E. Promotory P3 a P4 IGF-2 řídí expresi heterologního genu (luciferasy) v liniích rakovinných buněk močového měchýře. Specifická aktivita luciferasy (jednotky/pg proteinu) je vynesena pro pět různých uvedených buněčných linií jako funkce IGF2 promotoru použitého v transfekovaném konstruktu k aktivaci exprese luciferasy. Obrázek 4A: T24P buňky. Obrázek 4C: 1376 buňky. Obrázek 4C: UM-UC3 buňky. Obrázek 4D: 1197 buňky. Obrázek 4E: EJ28 buňky. Vektory jsou popsány podrobněji níže v části 10.

Obrázek 5. Nukleotidová sekvence promotorového fragmentu lidského H19 (SEQ ID NO:2).

Obrázek 6. Nukleotidová sekvence 0,9 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:3).

Obrázek 7A a 7B. Nukleotidová sekvence 2 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:4).

Obrázek 8A-8C. Nukleotidová sekvence 4 kb enhancerového fragmentu H19 (SEQ ID NO:5).

Obrázek 9A-9C. Exprese luciferasy v nádorových buňkách po transfekci s vektory obsahujícími různé kombinace H19 regulační oblasti a P4 promotoru. Obrázek 9A: 5637 buňky. Obrázek 9B: Huh7 buňky. Obrázek 9C: 293T buňky.

Obrázek 10A-10E. Exprese luciferasy v nádorových buňkách po transfekci s vektory obsahujícími H19 regulační oblasti. Obrázek 10A: 293T buňky. Obrázek 10B: T24P buňky. Obrázek 10C: Huh7 buňky. Obrázek 10D: 5637 buňky. Obrázek 10E: RTI 12 buňky.

- 12 CZ 294941 B6

Příklady provedení vynálezu

Srovnávací příklad 1: Regulační sekvence H19 napomáhají expresi heterologního genu v nádorových buněčných liniích

Tato část popisuje konstrukci různých expresních vektorů obsahujících CAT reportérový gen umístěný pod kontrolou H19 regulačních sekvencí, a jejich přenos do několika různých linií rakovinných buněk močového měchýře.

Materiály a metody

Buněčné linie a transfekce

Linie rakovinných buněk močového měchýře HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3 byly získány z americké sbírky buněčných linií ATCC a byly udržovány podle doporučení ATCC.

Transientní transfekce byly prováděny postupem používajícím kalcium fosfátový precipitát. Precipitáty (obsahující 7 pg plasmidu) byly přidávány v 1 ml média k 0,3 x 10⁶ buněk v 30 mm miskách. Po 16 hodinách bylo transfekční médium odstraněno a vyměněno za čerstvé médium. Buňky byly sklízeny 24 až 96 hodin po transfekcí a CAT aktivita byla stanovena postupem používajícím extrakci butyryl-COA do organické fáze (Sambrook et al.. 1989). Alikvot horní organické fáze (100 μΐ) byl přenesen do scintilační lahvičky obsahující 3 ml scintilační kapaliny a byla změřena radioaktivita vzorku.

Konstrukce expresních vektorů

Plasmidy pCAT-basic (obsahující CAT reportérový gen, jemuž předchází mnohočetné klonovací místo), pCAT-promoter (obsahující CAT reportérový gen pod kontrolou SV40 promotoru), pCAT-enhancer (obsahující SV40 enhancer pod CAT reportérovým genem a mnohočetné klonovací místo pro insercí promotoru nad CAT reportérovým genem) a pCAT-control (obsahující CAT reportérový gen pod kontrolou promotoru i enhanceru z SV40) jsou komerční produkty firmy Promega (Madison. WI).

Pro konstrukci plasmidu pH19E, obsahujícího CAT reportérový gen pod kontrolou H19 promotoru, byla nejprve promotorová oblast H19 (SEQ ID NO:1) klonována do plasmidu pBluescript 11 SK⁺ (Promega). Polynukleotid obsahující H19 promotorovou sekvenci byl amplifíkován z DNA lidské placenty s použitím následujícího páru primerů,

ESPCR21: CGGTTCCCCACTTCCCCAGTTT (SEQ ID NO:6) a

ESPCR22: CGGAAGTCGACAACCCTCACCAAAGGCCAAGGT (SEQ ID NO:7).

Konce PCR produktu byly zatupeny pomocí Klenowova enzymu a klonovány do EcORV místa plasmidu pBluescriptIISK+. Správnost DNA insertu byla potvrzena přítomností štěpících míst pro restrikční enzymy PvuII. EcORI a Apal. Promotor byl orientován opačně vůči kódující oblasti IacZ vektoru. Promotorová oblast pak byla vyštěpena enzymy HindlII a Pstl a výsledný 0,9 kb fragment byl klonován mezi HindlII-Pstl místa plasmidu pCAT-basic, za vzniku pH19E.

Expresní plasmidy, které obsahují H19 enhancerovou oblast v obou orientacích pod segmentem H19 promotor/CAT reportérový gen, byly konstruovány následujícím způsobem: 5 kb Sací fragment obsahující H19 spodní enhancer (vymezený oblastí +6kb až +llkb vzhledem k začátku

- 13 CZ 294941 B6 transkripce genu H19) byl klonován do Sací místa plasmidu pUCI9. Tento enhancer pak byl vyštěpen jako fragment EcORI-HindlII a ligován mezi EcORI-HindlII místa plasmidu pBluescript 11 SK⁺ za vzniku pBhH19En-Sa. Plasmid pBhH19En-Sa byl parciálně štěpen enzymem BamHI a 5 kb fragment obsahující H19 enhancer (a interní BamHI místo) byl klonován do BamHI místa plasmidu pH19E pod segment H19 promotor/CAT reportérový gen. Takto byly získány plasmidy obsahující H19 enhancer v obou orientacích, přímé (pH19EHI9D, direct) a opačné (pH19EH19R, reversní).

Výsledky a diskuse

Pět různých linií rakovinných buněk močového měchýře. HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC3 bylo transfekováno plasmidem pCAT-basic (v Obr. 2 označeným P-E). plasmidem pCAT-control (v Obr. 2 označeným pSV40ESV40), plasmidem pH19E, plasmidem pH19EHI9D a plasmidem pH19EHI9R Výsledky exprese pro každý konstrukt jsou uvedeny v Obr. 3A-3E. V každé buněčné linii byla pozorována nejvyšší hladina CAT aktivity s plasmidem pCATcontrol, který obsahuje jak SV40 enhancer, tak SV40 promotor. Tento konstrukt sloužil jako pozitivní kontrola, neboť regulační sekvence SV40 představují osvědčené prvky pro indukci genové exprese. Avšak SV40 regulační sekvence nejsou ve své schopnosti indukovat genovou expresi specifické pro nádorové buňky. Buněčné linie transfekované plasmidem pH19E, který obsahuje CAT reportérový gen pod kontrolou H19 promotoru, rovněž vykazovaly expresi CAT významně zvýšenou nad pozadí. Hladina CAT aktivity indukované H19 promotorem se pohybovala od pětinásobku v HT-1376 buněčné linii do desetinásobku v buněčné linii UM-UC3. Přítomnost H19 enhanceru v konstruktech obsahujících H19 promotor/CAT reportérový gen dále zvýšila hladinu exprese v některých buněčných liniích. Například v liniích EJ28, T24P a 1197 enhancer H19 významně zvyšuje expresi konstruktu H19 promotor/CAT reprotérový gen. Orientace enhanceru však dala v různých buněčných liniích odlišné výsledky. V buněčných liniích HT-1736 a UM-UC-3 pak enhancer měl na expresi malý nebo žádný účinek.

Výsledky ukázaly, že lidský H19 promotor aktivuje expresi funkčně spojeného heterologního reportérového genu v širokém spektru buněčných linií odvozených z karcinomu močového měchýře. V některých z těchto linií může expresi reportérového genu pod kontrolou H19 promotoru ještě dále zvýšit H19 enhancer.

Srovnávací příklad 2: Gen toxinu pod kontrolou H19 regulačních sekvencí

Materiály a metody

Expresní konstrukty popsané shora v části 6 se modifikovaly tak, aby místo CAT exprimovaly toxický produkt nebo prekursor toxického produktu. Použitím standardních klonovacích postupů, jež jsou dobře známy v oboru, se například odstranily sekvence kódující produkt genu CAT a nahradily se sekvencí kódující thymidinkinasu viru herpes simplex (HSV-TK).

Expresní plasmidy H19/HSV-TK se transfekují do buněčných linií odvozených z karcinomu močového měchýře jak bylo popsáno v části 6. Po transfekci do linií rakovinných buněk močového měchýře, expresní plasmid H19/HSV-TK indukuje v přítomnosti gancicloviru cytotoxicitu specifickou pro rakovinné buňky močového měchýře.

Srovnávací příklad 3: Exprese H19 v myším modelu chemicky indukovaného karcinomu močového měchýře

Materiály a metody

- 14 CZ 294941 B6

Sedmdesát samic myší kmene C3 H/He (Charles River), 5 týdnů starých, bylo umístěno po 6 v klecích a ponecháno, aby se adaptovaly na klimatizovanou místnost s 12 hodinovým cyklem světlo/tma. Pokus byl zahájen v 8 týdnech věku, kdy byly myši náhodně rozděleny do kontrolní (10 myší) a experimentální (60 myší) skupiny. Experimentální skupina dostávala k pití ad libitum vodu obsahující 0,05 % N-butyl-N-(4-hydroxybutyl)nitrosamin (BBM) (Tokyo Kasei Kogyo Co. Ltd., Tokyo. Japonsko). Myši kontrolní skupiny dostávaly vodovodní vodu. Zvířata z obou skupin byla po 4, 8, 12, 16, 20 a 26 týdnech od začátku experimentu usmrcena a jejich močové měchýře byly standardním postupem vyříznuty, fixovány a zality do parafinu.

Příprava sondy

2,1 kb fragment obsahující kódující oblast myšího H19 byl subklonován do plasmidu pBluescript 11 KS (Stratagene. La Jolla. CA) za vazebná místa pro T7 a T3 RNA polymerasu. Po štěpení plasmidu enzymem HindlII, byla z linearizované plasmidové DNA in vitro připravena s použitím T7 RNA polymerasy (Boehringer Mannheim) a Amersham RPN 2006 soupravy [³⁵S]-značená antisense H19 RNA. Takto připravený transkript měl specifickou aktivitu 10⁷ cpm/pg. Jako kontrolní sonda byla z EcORI-linearizovaného templátu a s použitím T3 RNA polymerasy (Boehringer Mannheim) připravena sense H19 RNA.

In šitu hybridizace

Parafinové řezy (5μηι) tkání fixovaných formalinem byly přichyceny na mikroskopická podložní skla potažená 3-aminopropyltriethoxylanem (Tespa. Sigma) a vysušeny pres noc při 37 °C. Řezy byly zbaveny parafinu xylenem, fixovány 4 % paraformaldehydem a poté enzymaticky opracovány proteinasou K (Sigma). Skla byla acetylována, aby se snížila nespecfická vazba sondy, a nakonec dehydratována promytím vzestupnou ethanolovou řadou.

[³⁵S]-značené RNA sondy (o aktivitě 50 000 cpm/μΐ) byly hybridizovány jak popisuje Rangini et al., 1991, Mech. Dev. 35:13-24, s vynecháním thio-AMP kroku. Skla byla přiložena k filmu na 10 dnů a poté vybarvena hematoxylinem a eosinem. Skla byla prohlížena a fotografována pod mikroskopem Polyvar (Reichert Jung) ve světlém a tmavém poli. Kontroly zahrnovaly hybridizaci se sense RNA sondou a předhybridizační působení RNAsou. Vedle toho sloužily jako negativní kontroly řezy močových měchýřů z dospělých zdravých myší (které neexprimují H19) a jako pozitivní kontroly řezy z myších embryonálních močových měchýřů (které exprimují H19).

Výsledky a diskuse

Do 26 týdnů se u všech přežívajících myší experimentální skupiny vytvořily pohmatem zjistitelné nádory močového měchýře. V těchto chemicky indukovaných nádorech močového měchýře byla pozorována vysoká exprese H19. Naproti tomu žádná exprese H19 nebyla detegována v normálních dospělých močových měchýřích. Uvedený myší model chemicky indukované rakoviny močového měchýře tedy může být použit jako zvířecí model k průkazu nádorově specifické in vivo cytotoxicity genových konstruktů obsahujících regulační oblasti H19 funkčně spojené s genem toxinu.

Srovnávací příklad 4: Genová terapie využívající H19 regulačních sekvencí k expresi heterologního genu v myším modelu karcinomu močového měchýře

Plasmidy exprimující H19/toxin nebo H19/prekursor toxinu se pro in vivo vnesení do myšího močového měchýře zabudují do liposomů jak popisují Takashita et al.. 1993, J. Clin, lnvest. 93:652651 (zahrnuto zde odkazem). Myši pro tento experiment mají chemicky indukované nádory močového měchýře jak popsáno shora v části 8.

- 15 CZ 294941 B6

Ve stručnosti, 50 pg plasmidové DNA rozpuštěné v 500 μΐ Optimenova bezsérového média (BRL Life Technologies. Gaithersburg. MD) se přidalo k 250 μΐ Lipofectaminu a 250 μΐ vody. Směs se inkubovala 30 min při pokojové teplotě a pak se zředila v 10 ml vyváženého roztoku solí (BSS(-): 140 mM NaCl, 5, 4 mM KCI, 10 mM Tris-HCI, pH 7, 6). Roztok se centrifugoval (30 min, 15 000 ot/min) a peleta obsahující liposomy resuspendovala v 1 ml BSS(-) obsahujícím 1 mM CaCl₂. Myším s chemicky indukovanými nádory močového měchýře se pomocí katetru podalo přibližně 0,2 ml koncentrovaných liposomů. Kontrolní skupina myší s nádory močového měchýře obdržela liposomy bez DNA nebo s konstruktem, který pod kontrolou H19 regulačních sekvencí nesl irelevantní gen. V definovaných časových bodech byly myši z každé skupiny obětovány a močové měchýře vyříznuty, fixovány a zality do parafinu standardními postupy. Střídajícící se řezy byly zpracovány pro in sítu hybridizaci, při které byla použita buď H19 sonda, popsaná shora, nebo sonda specifická pro kódující sekvenci genu toxinu z Pseudomonas. Kontrolní a experimentální skupiny byly kromě toho porovnány z hlediska velikosti, počtu a nekrosy nádorů. V nádorech močového měchýře myší z experimentální skupiny byla prokázána kolokalizace exprese toxinu Pseudomonas a H19. Kromě toho byly nádory močového měchýře myší experimentální skupiny menší a nekrotické ve srovnání s nádory myší kontrolní skupiny.

Příklad 1

Exprese v nádorových buněčných liniích řízená promotory P3 a P4 genu IGF-2

Materiály a metody

V tomto pokuse byly sestrojeny různé expresní konstrukty obsahující luciferasový reportérový gen umístěný pod kontrolou jednoho ze čtyř různých promotorů genu IGF-2 a ty byly vneseny do několika různých linií rakovinných buněk močového měchýře. Sestrojeny byly následující konstrukty obsahující lidský IGF-2 promotor a gen luciferasy:

Plasmid	Nukleotidová sekvence IGF-2 genu	Promotor
Hupl	-980 až +54	Promotor 1
Hup2	-379 až+271	Promotor 2
Hup3	-1229 až+140	Promotor 3
Hup4	-546 až+102	Promotor 4

Sekvence IGF-2 promotoru jsou popsány v Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. a jsou zde zahrnuty odkazem. Vektor s luciferasovým reportérovým genem je komerčně dostupný od firmy Promega. Madison. WI (katalogové č. El641).

Výsledky a diskuse

Expresní plasmidy byly transfekovány do lidských linií rakovinných buněk močového měchýře HT-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3 jak bylo popsáno shora ve srovnávacím příkladu 1. Luciferasová aktivita byla stanovena s použitím komerčně dostupného kitu (Promega. Madison. WI, katalog, č. El 500). Výsledky uvedené v Obr. 4A-4E ukazují, že P4 promotor IGF-2 aktivuje expresi luciferasového reprotérového genu v každé testované linii rakovinných buněk močového měchýře. V buněčné linii 1197 aktivoval expresi luciferasového reprotérového genu též P3 promotor IGF-2. V následujících experimentech bylo zjištěno, že P3 a P4 IGF-2 promotory aktivují expresi luciferasového genu v dalších nádorových buněčných liniích, včetně buněk choriokarcínomu a rabdomyosarkomu.

- 16CZ 294941 B6

Srovnávací příklad 5: H19 promotor a IGF-2 promotor s H19 enhancerem napomáhají expresi heterologního genu

Materiály a metody

Čtyři luciferasové vektory, pGL3-Basic, pGL3-Promotér, pGL- Enhancer a pGL3-Control, byly získány od firmy Promega. Tyto vektory byly transfekovány do buněk s použitím řady různých transfekčních reagencií zahrnujících lipofetamin (Gibco/BRL), fugene (Boehringer). Perfect Transfection Kit s 8 různými lipidickými činidly (lnvitrogen), TFX-10, TFX-20 transfast (Promega) a kalcium fosfátový postup (Gorman et al. 1982, Mol. Cell. Biol. 2:1044-1051).

H19 promotor klonovaný do EcoRV místa plasmidů pBluescript 11 SK (pbhl9p#l) je popsán v části 6.1, supra. H19 promotor byl vyštěpen restrikčními enzymy Smál a HindlII a výsledný 0, 9 kb fragment byl vnesen do Smal-HindlII míst vektoru pGL3-Basic za vzniku konstruktu Luc-pbhl9.

H19 promotorové oblast pokrývající nukleotidy -818 až +14 byla amplifikována z plasmidů pbhl9p#l pomocí PCR s použitím primerů 5 '-ATATGGTACCGACAACCCTCACCAAAG-3' (horní. SEQ ID NO:8) a 5'-ATATAAGCTTCTTCTCCCTCACCCTGCTC-3' (spodní. SEQ ID NO:9). Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy KpnI a HindlII a ligován do KpnI-HindlII míst vektoru pGL3-Basic za vzniku konstruktu Luc-PBHI9. Tento H19 promotor získaný pomocí PCR byl sekvenován z obou řetězců na automatickém sekvenátoru (ABT Prism 377 DNA Sequencer Perkin Elmer). Nukleotidová sekvence H19 promotoru (SEQ ID NO:2), který byl generován pomocí PCR, je ukázána na Obr. 5.

kb spodní H19 enhancer, popsaný v části 6 shora, byl štěpen enzymem BamHI za vzniku dvou fragmentů o velikosti 4,1 kb a 0,9 kb na 3' konci, lnsercí 0,9 kb BamHI fragmentu H19 enhanceru do BamHI místa plasmidů Luc-PBHI9 vznikl konstrukt Luc-PBH19-0.9EH19 a insercí 4,1 kb BamHI fragmentu H19 enhanceru do BamHI místa plasmidů Luc-PBH19 vznikl konstrukt Luc-PBH19-4EH19. Enhancerové sekvence byly tímto klonováním umístěny pod sekvencí H19 promotor/luciferasový gen směrem k3' konci.

BamHI enhancerový fragment o velikosti 0,9 kb byl ligován do BamHI místa vektoru pGL-Basic za vzniku vektoru Luc-0.9EH19. Z plasmidů pbhl9p#l byl enzymy KpnI a BamHI vyštěpen H19 promotor a poté ligován do KpnI-BglII míst konstruktu Luc-0.9EH19, čímž vznikl expresní konstrukt Luc-pbhl9-0.9EH19, který obsahoval promotor popsaný v části 6 shora a 0,9 kb enhancer umístěný pod H19/Luc reportérovým genem

Expresní vektory označené Hup-1. Hup-2, Hup-3 a Hup-4, které obsahují luciferasový gen pod kontrolou lidského IGF-2 promotoru Pl, resp. P2, resp. P3. resp. P4. byly konstruovány jak je popsáno v Sussenbach et al., 1992, Growth Reg. 2:1-9. Z konstruktu Hup-4 byla pomocí primerů 5-ACAGGTACCTCTAGAGTCGACCT-3' (horní. SEQ ID NO: 10) a 5'ATATAAGCTTGCTCCCATCCTGCA-3' (spodní. SEQ ID NO:11) amplifikována 512 bp oblast promotoru P4. Výsledný PCR produkt byl štěpen enzymy KpnI a HindlII a ligován do KpnIHindlII míst vektoru pGL3-Basic nesoucím reportérový gen, za vzniku vektoru Luc-P4.

Rovněž byly připraveny expresní vektory obsahující IGF-2 P4 promotor a H19 enhancer. Enhancerový 2 kb BamHI fragment odvozený z 4,1 kb fragmentu popsaného výše, byl klonován do BamHI místa konstruktu Luc-P4, čímž vznikl expresní vektor Luo-P4-2EH19.

Sekvence H19 enhancerových 0,9 kb, 2 kb a 4,1 kb fragmentů byly určeny automatickým DNA sekvenováním. Nukleotidová sekvence 0,9 kb enhanceru je ukázána na Obr. 6 (SEQ ID NO:3). Nukleotidová sekvence 2 kb enhanceru je ukázána na Obr. 7A a 7B (SEQ ID NO:4). Nukleotidová sekvence 4,1 kb enhanceru je ukázána na Obr. 8A-8C (SEQ ID NO:5).

- 17 CZ 294941 B6

Výsledky a diskuse

K zavedení čtyř vektorů obsahujících luciferasový gen do buněčných linií bylo použito několika transfekčních protokolů, přičemž u většiny buněčných linií poskytl nejvyšší účinnost transfekce postup využívající kalcium fosfátový preicipitát. Proto byl tento postup použit při následných transfekcích různých expresních vektorů. Navíc, zvyšování koncentrace plasmidové DNA nesnižovalo transfekční účinnost ani v koncentracích přesahujících plato.

Buněčná linie 5637 karcinomu močového měchýře, buněčná linie Huh7 hepatocelulámího karcinomu (HCC) a buněčná linie 293T ledvinného nádoru byla každá transfekována různými konstrukty obsahujícími luciferasový reportérový gen pod kontrolou promotoru H19 nebo IGF-2 P4 v kombinaci s H19 enhancerem.

Buňky transfekované plasmidy Luc-phl9 a Luc-PH19, které obsahují reportérový gen a H19 promotor, vykazovaly zvýšenou genovou expresi nad pozadí (Obr. 9A-9C). Konstrukt Luc-PH19 obsahující promotor získaný PCR amplifíkací měl ve všech testovaných buněčných liniích vyšší aktivitu než konstrukt Luc-phl9. Přidání 0,9 kb H19 enhancerového fragmentu do Luc-phl9 vektoru (Luc-phl9-0.9EH19) zvýšilo dále dvakrát, resp. čtyřikrát hladinu exprese v buněčných liniích 5637 a 293T.

IGF-2 P4 promotor rovněž zvýšil ve všech buněčných liniích expresi luciferasy nad pozadí. Přidání 2 kb H19 enhancerového fragmentu do Luc-P4 expresního vektoru vedlo k zvýšení P4 promotorové aktivity. Hladina indukce luciferasové aktivity 2 kb enhancerovým fragmentem se pohybovala v rozmezí dvojnásobku pro buněčnou linii 293T až šestinásobku pro buněčnou linii Huh7, zatímco v buněčné linii 5637 bylo zvýšení promotorové aktivity účinkem enhanceru pouze marginální.

Obrázek 10A-10E ukazuje expresi z konstruktu Luc-phl94EH19, který obsahuje jak H19 promotor získaný pomocí PCR amplifikace, tak 4,1 kb H19 enhancerový fragment. Enhancer výrazně zvyšuje aktivitu promotoru, a to v rozmezí 3 až 28 krát podle buněčné linie, s výjimkou buněčné linie 5637.

Uložení klonu

Následující plasmid byl deponován u Američan Type Culture Collection (ATCC), Manassas. VA, v souladu s podmínkami Budapešťské smlouvy o mezinárodním uznávání uložených mikroorganismů pro účely patentového řízení:

Klon ATCC přírůstk. číslo Datum uložení pH19EH19 209322 2. října 1997

Ekvivalenty

Předchozí písemná specifikace postačuje, aby osoba zběhlá v oboru mohla provádět vynález. Různé modifikace shora popsaných způsobů provádění vynálezu, které jsou zřejmé osobám zběhlým v oboru molekulární biologie, medicíny a příbuzných oborů, spadají do rozsahu následujících nároků.

Všechny publikace zde citované jsou zahrnuty v úplnosti odkazem.

-18 CZ 294941 B6

SEZNAM SEKVENCÍ <110 > Yissim Researoh Develcomaxt: Compar.y of Tle Hebraw Universicy of Jerusalem <120=. MHUHODS AND CCMPOSITIONS FC= XNDUCXNG TDMOF.-SPECZr XC csTOToxxciTy <130> 9457-0014-223 <140> PCT/XD98/00436 <141> 1998-10-04 <150> US 09/165,240 <151=> 1998-10-01 <1SO> US 05/943,608 <151> 1997-10-03 <16Q> 11 < 17 0 >

<210>	1
<21X>	830
<212 >	DNA
<213 >	Herno sapie:

<400> 1

120

180

240

300

360

420

430

540

600

660

720

780

830

<210>	2
<2L1>	S33
<212>	DNA
<213>	Herní
<400>	2

c-acaacccoc	acoaaggcco	aa^CT	cccacTCacc	cacagcggcj		60
agccraaad	cgccaoxcrc	GB€*ccacrc	ccaac-^z^-r	ccccccacgc	cg-Gcatccrga	120
csgfCTctca	cocogcccac		Cagacccccc	cccc^acccg	Caaccacagc	180
ccrocaacac	ocgocczzca	cacac-gaaag			gcgcccacrcg·	240

- 19CZ 294941 B6 ccacgzcctg ==55=333== ccccaccccc tctg=gc=a= gcagggcgcc tgggagggag gacgccaaag gagagagacg g^ccctcc: taagaaaaag cggaaaccgc ==cac=g=g= ac=c=ccagg c==ag=c=cc cgcacgcagg aagtecGggc caggggtgcg egzgccggaa c-gattggcc ========3= ggagacgagc ccaccagggg aacgcgag-a 3===3===== cagcagcagg ccLgagggag =5=aggccga ======3=== .cggacgtggg ===a====a= caccgaggag =====5=33t =3====3^=5 acaagczcgg g=gcggea ===3=====3 3========= cacggngzcc 5==3=55=5= cttcggagaa

ccaac=ggat	300
cc~c=====g	360
acggcggcag	420
cag-ccazgcg	480
ccagagggga	540
aa==c=cagc	500
túccaggacg	6o0
c=========	720
***· - -sj-yC— *y*y
gag	833

<210>

<211>

<212>

<213>

877

DNA

E=~.a sapien .

<400>

caaggaeacg	gaa===cg=a	==========	c=ac===c==	t===ga===c	aggaac=tc=	60
cagcagcagg	aaggc====g	gtc=agagc=	tagaaatgga	cs==sacg=c	cacctgccca	120
ccczagaccc	c=ag=at==a	35====5==3	gac==cc=g=	cagaggaagc	caccaagcgg	180
ga-ggacacc	a=c====ac=	c=ac==gg==	c=====a===	c=====ag=c	cagcccag==	240
cagcccacúc	c=gc====cc	c*gc====c=	cagccaagcz	ca========	ctacccagcc	3CC
cagcGZzgzc	==========	c’c;c:=c:c	cagcccag·::-	c=====cgcc	ctsccccgcc	360
c====ca===	c:?acozzcc	==========	cags==a===	cazGcczgcc	czacccagcz	42C
	==========	czgccczgcs	cacccc:acc	==========	czgccczgcc	480
c==c==a===	cag====g==	cáccc:ac:c agaaagaggc aagcccagag gzgcazggcc	ca====a=== ===caac=a=	==========	tc=====a==	540 600 660 720
gxgagcacag	===£= = --	3=--3^33==	ac=a===cac
=========3	===3==3=3= ====5===3=	tcagggczgc	==========	cggggc^gi-c
accgccacca	= 33----s==	c=======gc
==========	gaggc=accc		a==aac==z=	crccizaccc	acozczgagc	7S0
tagGaaggaa.	========== 5=333=====	========== aa_~z_ca	a=cag===== =======		a=g=gagc==	640 877

<~10> 4 <2L1> 1950 <212> DNA <213 > Ecss sapien <400> 4 ======3=== =c=gagcac= aaca====== ========== agacctgagc tgnggccagc: gcg====g== cgcacccrgg =55=55==== cagaggcncc c;t:g:cajc c=gc===acc ========== ========== agcagtggga =3===5=3== a=c===ca== cagag==aag c=a==a=g== tgg===agc= =3======== ggaga=c==g ========== ========== cc=g=tc==g t====gaaa= cg===gc=== ac=gtgct== acccaacacc ggg==ggac= c==ag=g=== gcagaacaag ========== aagacaaaag =3=3=35=55 a=c==c=caa =======?== a=ac====ca c=taaggc=g ======gcgc g=gacacc== c==ac==gca gca======= caaagaaags =====3=3=3 a==aaacaca ==g==cacag c====g==aa &CCC *·** iGGg acctcczccz 5 - — = 333=53 c====ac=== t*=a=a=ggg =g=gatg=== aaag==g=a= tggcaaccae ========== =gg======= 5===55===5 c==ggaac=a agacactgcg cacgcgggag caagggegcc gca=g=g==a 55======3= =5======ac c==zagaga= cggc===c== ====55==== tgtgcacggg cacaagc=== tggaagg=== aaaaggcaca ========== ==^a555===3 cagggaaggg g=cgc=g=gg

5==555===5 agg=aczg=a agc=c=cagg ggcggacccc g==gcagaaa

5===3====3 ========== cagggaatgg ========== agacagccaa gagaaagagc gca=ag=cc= c=====a=== gggaagccag gc=gc=c=cg g=a==c=g== ==ag==agc= ====33=C== ggc==ctc== ccaggaggcc cggggagaag ac=ggix=gc=

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

780

840

900

960

1020

-20 CZ 294941 B6 tggctggaag a=gggggaga tgccaagcxz czgaggcaga acgagcaggg tgcaaggagg c==g==cgcg 9==·£?3=-=c aczcsacca- g=ac==caaa g===ar.aggg agrggagacc aggcGGzgga aacgagaag“ agaaaggcgg c~rggaggcc zcggaaccgg etcacstccs acagagcggg tccccagccc ggcactgooo egccgcacgz c==cz==c=g cattaceagg cexagagccc ccagccccgg tggccccaag cccgagggtg aacggcazca c-ccgggccg cgggacagag ggcacgrtca tcaagagtgg ccc==aag=g a=a=gcgg=z grtcgcagcz caeaggaagc azccgagata aggagczxgc tatcceagrg ggcacgcagc cagcaggggg gctgcggggc agcccaggg- gcaaggccag gcGgtggggc zgcagsagcs tegggeacca ccc=eagg=c tatgcgggag g-gggaggcg cgaggcggea gz^gcaeagt cgccccaggc gaggcíctaa gccccagscg czccccgggc ggg-agccca agagggacag gccgagcccc ccacaccxgg gacGcea^ca cccaacaacc caactaacg= zgaatztcac gxgzcccgrg accagggcag acaaagcccc tgtxccaaagg ggcagccagc czaaggcagc ggggacggcg cgggcggcgg gcgacggggg agasggacaa caggaccgag ggcgtgcggg cgacggggga gazggacaaG aggaccgagg ccgtgcgggc gatgggggag azggacaaca ggaccgaggg tgcgegggae acgcacgcca cccatgcacg ccaa==g=gg gcgzgggagg ccggggagca gacagac^gg cecgggcxgg gcgggaagga cgggcagacg <2io> s <211> 4085 <2Z2> DNA <213 > Hctno sagien <400> S ccgggaaczg agctzcscagg aaga~aaa-g ai2ic=z=cc srzzagaga- cggggGggga cc-gagcaca cagagcsaag cgcgcagagg cr=cggg=gg gggccszscc cggccctscc aacacggggg c=aggaggt;c ag=c==zcaa =c=gga==== 55“5==-= cagggaatgg tctcssKac cggcccagct tgcctgzgca cxcagatgcg -==g=az=gg tgcgrgcgcg Cgcgtgagag -gcgzgGgzg cgcgGgzgcg cgrgaagc” =a=aag~== agagagecaa agacscgag- ggagancTxg cgactzzrca aaaggggga; zggaaggzzc gagaaagagc sgzggz-agc cccgccczcc cataaggczg tggtaaccac a=“aggcata gcacaggcct: gcg=c==gz= cctscztcci tcccccgags ct:zcc:: zzzzzzzzzz csz:Zsza.tzzz cgcxccczgg cctgccccrg gcgacaccgz zz^czzzzzz c=agggc=ga gggaagccag Cs5S£5C=c: zticctgaaag cccacccgca cgcacgczzg gggaaggg gcegcectcg cagaggc-== cgeccgcccí caagccgztx ccnggaagca gcagczgzgg gcacGGGgcc ccctgtcagc ac=gGgcccg caaagaaagc agaeaczgzg zzzzzzzzzz t-agggag=c ccgc^ccaca acccaacací tggctggaca caggacggag zzzzzzzzz~ cggggagcgg cgcggggceg cggccggacc atcaaacaca cacgggcgcz aggcaccgca ggcccc=ccz cczccccccg cccagsgccz c-gczcacag gcacgrgcca agc===tagg ccaggaggcc ag=agcgggz gaagaacaag ciactgggaa gggpgzgcag ggcggacccc cggggagaag ggczggcagg ga=g=ggggg acgczgaccg tggpcozca: =~cg=agaaa aetggncgcc cggctggaag acgggggaga cgc=aag=G~ cxgacgaagc acgagcaggg Ggcacggagg ccggggcgcg cggaggctgc accgcagca- gcacczcaaa gc==anaggg agtggaga.cc aggccctgga atcgagaagt agaaaggcgg czzzzzzzzz tcggaaccgg ccgaccccca acagagtggg gccggccczg gaggcaaaga ςςζζζζζζζζ zzzzzzzccz gcc^gggggs. gctatgtgtc atgggcaagc cacaggatat gtagcccgcz zzza.$zzza.z ggacccaggg cagggctgca aggcagggea cgggagacag cacgggggag caacgagcag agagggggcc ccaggctctc ccaggaggaa cactctcccg acacgaggaa gagacggccc aggggcgacz ř-ggggagcc acggcggcag czggggtcgc ggcagatggg agagaggctg gcgaggcgaa ggtgcacggg tcacggctct ggggcccaca tgcctgtggg accacgcagg cccagggcrc tccgccaccc cccactcccg cttggcccat acgctgggcz caagggtggg gtgggacgac cacgagatgg cgcccagggg gcaagcagcg ccccaaagae atttagaaaa accggcttac gcaggcagca cccagagcag ccggcgtgcg tggcgggggc cctgggagca cagagaggca cacgtagggc ccccgagggg ccccccattg gecggcagrg acatcacccc Cgcgtcaaca gtgatgcccg cagctccggc eagccagggt ccacggagsg agacctagcc cggcccgggc cctcactccc caggcccaca caccagccca ccgttsaggg tccggggtgg cggcacggcc tgccggcccc ggcaccgczc ctcctczgcc caccccaacc tcccggcatc gcggctgccc losa 1140 1200 1250 1320 1380 1440 1500 1550 1520 1530 1740 1800 1860 1520 1560

120

180

240

300 jSQ 420 430 540 600 660

720

780

840

500

560 1020 1080 114 0 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1550 1620 1680 1740 1800 1850 1520 1580

-21 CZ 294941 B6 cczozgagzg tccccaacca czaagzgzgg cgcccaccac cccrsccjtc ctcctcctct t::ccctac aeacaaac ggaggzczzg ggjczggggg cgszzazagc cczgtgacac aggegcazgg ggzcaggggz cccagaacgg ccczzgggaa c=ac::cacc zgggccggcg getezaggcz zcaggggzcz czczgcacag gggxzacczo czcccacacc tczgzgaagc cagzacgggc ctczccís== tgccccgzgc zczgcccggc cczccczgga ctccac^jsg ggccactggz gagagggzgg acagggaagg gccgecgzgg tgcccgczcc zgcccacczg gczgzgtggt cccezccaag tagggacaac ccttccgacg gsctcggggc accczggggx cgccagggca tzccagagcc czgtgagccc czggggggzc cggcczgacg čcecccccaa cgzccagggc cggczgzggc caacaacccc agczzcczag caggczggzg cgcggcggzg aczcaggaca ggccccgccz ccaczgaggg gccaccgacc tzzgzeagac cacagagacc cscaaggagc czgaagg-czg gagacccggg gczgggacca ggtgggaazz tcczacggag ccgzccccag gcccagczgg ggacacgzzc cccztczczz cacacacacc ctgczcgcca ccaggacaca caggcczgcc gggggecrcc tztaagzgcz zzccaczzzg aggcgaczgt cczzzxczaa agaggzztcz ggggcccagg tgggacgcgc cggczz=agc acgaggaccz cggecgccag gggczgggga czgzzccccg gggaagcaag zgsczgggag cgcgzgzgcz gacczaggác catcaaggga ggcccgzczg tggggeaagc gggaacggag cggccggaga cpctzggccg ccaccgcca“ gestescazz ecttagczec azgcczgzca acczctgtca cccagcgagz gacgzccagg ggczctggaa aggzzacagc atgrztgagz ggggtgagag agagcggaaa ggcgggggcg· gggaaaagza cgzggaggaa cczzzaggcz caaggaagga gacagggzcc zgggagggag ggagccaczg gggzcgccgg caaggzcczz gcccccsgct cccacccaga accczcgccz cztagczagz caczgcagcz czagcczztc zggcnzgzgg acszzzceco cazecacagg cgzcczgzgc aaccaggczz ccgacscaaa ccczzczccc ccczcctczc ccícsckcc cccc=aa=gc agtggzczzz agczzggczc cgccczgccg caggzsczcz cccctcatca ccaggczzag agcezccagz cccggzggcc cccagcccga gcgzgaacgg cczcaccczg cgzcgzggga cagagggcac gzzcazcaag agcggazccc aagggacacg zggszgzczg cagzzcacag gaagzaczzg agacaaggag KCgttctcí cagtgggzac ggagccacca ggggggctgz ggggcagzcc agggtgcaag gccaggccgz cgggczgaag czgcczzggg ccccacczcz aggcszzzgc cggaggzggg aggcgggagg cggcagczgz acagccgczs caggcgagga zzzcagaccc agzagccczz cgggzgggca gczcaagagg gzzzggczga cccccccaza zczgggazzc catcacczaa caaczzaazz aaggczgaaz zzaacgcgzc czgzgaczzg ggzagacaaa ccczczgzzz aaaggggcag ccagcczaag gcagzgggga cggcgzgggz ggcgggcgaz gggggagazg gacaacagga ccgagggzgz gcgggcgazg ggggagazgg acaacaggaz cgagggzgzg cgggcgatgg c-ggagazgga eaacacsac: cagggzgtgc cggacazgza zgzcaczcac gcacgccaaz S=“?3== S=aE=e==S3 gagcacazag aezgggz-gz cczgggcggg aaggacgggc ácatg <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213 > Hc-o sapien <4oo> e cggztzcsca czzcccsagz tt

2040 2100 2150 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2530 2640 2700 2760 2820 2880 2540 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 36CC 36=0 3720 3780 3840 390C 3960 4020 4080 4085 <210> 7 <211» 33 <212> DNA <213 > Hozxo sapisn <400> 7 ccgaagzcga caaczczcae caaaggccaa ggz <210> 8 <211» 27 <212> DNA

-22 CZ 294941 B6 <213 > Herno sapien <4C0> 8 acata^cacc cacaacccto acoaaac 27 <210> 9 <211> 29 <212> DNA <213 > Hct.o sapien <400> 9 atataapctP cctcpcccte accecgccc 29 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Herno sapisn <400* 10 aeacetaccz ccacagccia cac 23 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Herno sapien <400> 11 aeacaapc gceceeaecc eg ca 24

Claims (13)

1. Použití polynukleotidu, obsahujícího regulační sekvenci IGF-2 P3 promotoru funkčně spojenou s heterologní sekvencí, jež kóduje cytotoxický genový produkt, pro výrobu farmaceutického prostředku pro expresi heterologní sekvence v nádorové buňce, kde nádorovou buňkou není buňka hepatokarcinomu.

2. Použití podle nároku 1, kde nádorová buňka je buňka nádoru močového měchýře.

3. Použití podle nároku 2, kde buňka nádoru močového měchýře je vybrána ze skupiny sestávající z Ht-1376, EJ28, T24P, 1197 a UM-UC-3.

4. Použití podle nároku 1, kde heterologní sekvence je vybrána ze skupiny sestávající z kódujících sekvencí pro β-galaktosidasu, difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu, p53, thymidinkinasu viru herpes simplex, thymidinkinasu viru varicella zoster, cytosindeaminasu, nitroreduktasu, cytochrom p-450 281, thymidinfosforylasu, purinnukleosidfosforylasu, alkalickou fosfatasu, karboxypeptidasu A a G2, linamarasu, β-laktamasu a xanthinoxidasu.

5. Použití podle nároku 1, kde heterologní sekvence je antisense sekvence, jež specificky hybridizuje k sekvenci kódující gen vybraný ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, cjun. Kr-ras a Her2/neu.

-23 CZ 294941 B6

6. Použití podle nároku 1, kde heterologní sekvence kóduje ribozym, který specificky štěpí RNA kódovanou genem vybraným ze skupiny zahrnující cdk2, cdk8, cdk21, cdc25A, cyklinDl, cyclinE, cyclinA, cdk4, onkogenní formy p53, c-fos, c-jun. Kr-ras a Her2/neu.

7. Použití podle nároku 1, kde nádorová buňka je v pacientovi.

8. Použití podle nároku 7, kde pacient má nádor vybraný ze skupiny zahrnující karcinom močového měchýře, hepatoblastom, rabdomyosarkom, karcinom vaječníku, cervikální karcinom, karcinom plic, karcinom prsu, karcinom dlaždicových buněk na hlavě a krku, karcinom jícnu, karcinom štítné žlázy, astrocytom, ganglioblastom a neuroblastom.

9. Vektor pro expresi sekvence v nádorové buňce, kde vektor obsahuje polynukleotíd, kteiý obsahuje regulační sekvenci IGF-2 P3 promotoru funkčně spojenou s heterologní sekvencí kódující cytotoxický genový produkt.

10. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 9.

11. Použití polynukleotidů kódujícího cytotoxický nebo cytostatický genový produkt funkčně spojený s regulační sekvencí IGF-2 P3 promotoru, pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení rakoviny, kde rakovinou není hepatokarcinom.

12. Použití podle nároku 11, kde cytotoxický genový produkt je vybrán ze skupiny zahrnující difterický toxin, toxin Pseudomonas, ricin, cholerový toxin, gen retinoblastomu a p53.

13. Použití vektoru podle nároku 9 pro výrobu farmaceutického prostředku pro expresi heterologní sekvence v tumorové buňce, kde tumorovou buňkou není buňka hepatokarcinomu.