CZ295444B6 - Rekombinantní protein, protilátka, kompozice a krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí, nukleová kyselina, vektor a rekombinantní organismus - Google Patents
Rekombinantní protein, protilátka, kompozice a krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí, nukleová kyselina, vektor a rekombinantní organismus Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295444B6 CZ295444B6 CZ1998520A CZ52098A CZ295444B6 CZ 295444 B6 CZ295444 B6 CZ 295444B6 CZ 1998520 A CZ1998520 A CZ 1998520A CZ 52098 A CZ52098 A CZ 52098A CZ 295444 B6 CZ295444 B6 CZ 295444B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- protein
- fragments
- seq
- amino acids
- recombinant
- Prior art date
Links
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 34
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 34
- 239000012530 fluid Substances 0.000 title claims abstract description 34
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 title claims abstract description 20
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 15
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 15
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 title claims abstract description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 69
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000001262 anti-secretory effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 14
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims abstract 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 44
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 30
- 241000282412 Homo Species 0.000 claims description 7
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 claims description 4
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 claims description 3
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 claims description 3
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 abstract description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract 1
- 108010038288 antisecretory factor Proteins 0.000 description 53
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 41
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 41
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 36
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 36
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 31
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 23
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 22
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 20
- COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O Chemical compound CC1=C(C=CC(=C1)C1=CC(C)=C(C=C1)\N=N\C1=C(O)C2=C(N)C(=CC(=C2C=C1)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)\N=N\C1=CC=C2C(=CC(=C(N)C2=C1O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O COXVTLYNGOIATD-HVMBLDELSA-N 0.000 description 19
- 229960003699 evans blue Drugs 0.000 description 19
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 16
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 16
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 14
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 13
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 13
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 13
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 12
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 12
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 12
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 11
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 10
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 10
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 10
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 9
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 9
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 9
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 9
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 8
- 206010012735 Diarrhoea Diseases 0.000 description 8
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 7
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 7
- 230000035987 intoxication Effects 0.000 description 7
- 231100000566 intoxication Toxicity 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- 102100033479 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Human genes 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 6
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 5
- 101710084578 Short neurotoxin 1 Proteins 0.000 description 5
- 101710182532 Toxin a Proteins 0.000 description 5
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 5
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 5
- 101001057426 Archaeoglobus fulgidus (strain ATCC 49558 / DSM 4304 / JCM 9628 / NBRC 100126 / VC-16) Iron-sulfur flavoprotein AF_1896 Proteins 0.000 description 4
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 101710141955 RAF proto-oncogene serine/threonine-protein kinase Proteins 0.000 description 4
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 4
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 4
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 4
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 4
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000005720 Glutathione transferase Human genes 0.000 description 3
- 108010070675 Glutathione transferase Proteins 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 101800004192 Peptide P1 Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 3
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 3
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 3
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 3
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 3
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000018044 dehydration Effects 0.000 description 3
- 238000006297 dehydration reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 3
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 3
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 2
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 2
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 208000002720 Malnutrition Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- -1 antidiabetics Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 description 2
- 210000001100 crypt cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 210000000959 ear middle Anatomy 0.000 description 2
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 2
- 210000003890 endocrine cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N glyoxal Chemical compound O=CC=O LEQAOMBKQFMDFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 210000002011 intestinal secretion Anatomy 0.000 description 2
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 2
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000003140 lateral ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 210000005240 left ventricle Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 230000001071 malnutrition Effects 0.000 description 2
- 235000000824 malnutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 208000015380 nutritional deficiency disease Diseases 0.000 description 2
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 2
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 2
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- 201000009395 primary hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 2
- 230000012743 protein tagging Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- GSNSZGRVLRAJCA-UHFFFAOYSA-N (2-bromo-4-chloro-1H-indol-3-yl) dihydrogen phosphate Chemical compound C1=CC(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=C(Br)NC2=C1 GSNSZGRVLRAJCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 101100393868 Arabidopsis thaliana GT11 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100519160 Arabidopsis thaliana PCR4 gene Proteins 0.000 description 1
- 101000609456 Beet necrotic yellow vein virus (isolate Japan/S) Protein P26 Proteins 0.000 description 1
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 1
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101100245381 Caenorhabditis elegans pbs-6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589875 Campylobacter jejuni Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 1
- 241000193403 Clostridium Species 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 208000016998 Conn syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102400000739 Corticotropin Human genes 0.000 description 1
- 101800000414 Corticotropin Proteins 0.000 description 1
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 1
- 208000014311 Cushing syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 208000017701 Endocrine disease Diseases 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010015866 Extravasation Diseases 0.000 description 1
- 206010051283 Fluid imbalance Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 206010018364 Glomerulonephritis Diseases 0.000 description 1
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 101000987581 Homo sapiens Perforin-1 Proteins 0.000 description 1
- 206010020571 Hyperaldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 206010020772 Hypertension Diseases 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 1
- 206010028665 Myxoedema Diseases 0.000 description 1
- 108700015679 Nested Genes Proteins 0.000 description 1
- 108090000189 Neuropeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000003797 Neuropeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000669618 Nothes Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N O-Xylene Chemical compound CC1=CC=CC=C1C CTQNGGLPUBDAKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000097929 Porphyria Species 0.000 description 1
- 208000010642 Porphyrias Diseases 0.000 description 1
- 102000003946 Prolactin Human genes 0.000 description 1
- 108010057464 Prolactin Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 206010037596 Pyelonephritis Diseases 0.000 description 1
- 101800001693 R-peptide Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000242677 Schistosoma japonicum Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 241000607768 Shigella Species 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 1
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 102100026383 Vasopressin-neurophysin 2-copeptin Human genes 0.000 description 1
- 241000607626 Vibrio cholerae Species 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 230000003444 anaesthetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003178 anti-diabetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001142 anti-diarrhea Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003793 antidiarrheal agent Substances 0.000 description 1
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 229940125717 barbiturate Drugs 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000036770 blood supply Effects 0.000 description 1
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 1
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 210000002987 choroid plexus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003749 cleanliness Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N corticotropin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO)C1=CC=C(O)C=C1 IDLFZVILOHSSID-OVLDLUHVSA-N 0.000 description 1
- 229960000258 corticotropin Drugs 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 239000000824 cytostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000001085 cytostatic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 201000010064 diabetes insipidus Diseases 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028023 exocytosis Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 230000036251 extravasation Effects 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000013373 food additive Nutrition 0.000 description 1
- 239000002778 food additive Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 description 1
- 239000003629 gastrointestinal hormone Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 229940015043 glyoxal Drugs 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007825 histological assay Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008991 intestinal motility Effects 0.000 description 1
- 230000003870 intestinal permeability Effects 0.000 description 1
- 210000003093 intracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 201000006370 kidney failure Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000036445 liquid secretion Effects 0.000 description 1
- RDOIQAHITMMDAJ-UHFFFAOYSA-N loperamide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(C=1C=CC=CC=1)(C(=O)N(C)C)CCN(CC1)CCC1(O)C1=CC=C(Cl)C=C1 RDOIQAHITMMDAJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001571 loperamide Drugs 0.000 description 1
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 208000004396 mastitis Diseases 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N methyl alpha-D-glucopyranoside Chemical compound CO[C@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O HOVAGTYPODGVJG-ZFYZTMLRSA-N 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 208000003786 myxedema Diseases 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004081 narcotic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003533 narcotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024717 negative regulation of secretion Effects 0.000 description 1
- 230000002644 neurohormonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000712 neurohormone Substances 0.000 description 1
- 102000008434 neuropeptide hormone activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040002669 neuropeptide hormone activity proteins Proteins 0.000 description 1
- FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L nitro blue tetrazolium dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].COC1=CC(C=2C=C(OC)C(=CC=2)[N+]=2N(N=C(N=2)C=2C=CC=CC=2)C=2C=CC(=CC=2)[N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 FSVCQIDHPKZJSO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000003071 parasitic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 150000002990 phenothiazines Chemical class 0.000 description 1
- 208000024335 physical disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 1
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 208000013846 primary aldosteronism Diseases 0.000 description 1
- 229940097325 prolactin Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M pyronin Y Chemical compound [Cl-].C1=CC(=[N+](C)C)C=C2OC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 INCIMLINXXICKS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000026267 regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 206010039083 rhinitis Diseases 0.000 description 1
- PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N rhodamine B Chemical compound [Cl-].C=12C=CC(=[N+](CC)CC)C=C2OC2=CC(N(CC)CC)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C(O)=O PYWVYCXTNDRMGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005245 right atrium Anatomy 0.000 description 1
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L sodium thiosulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=S AKHNMLFCWUSKQB-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000019345 sodium thiosulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000002731 stomach secretion inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 150000005075 thioxanthenes Chemical class 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 229940118696 vibrio cholerae Drugs 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000008096 xylene Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
- A23K—FODDER
- A23K20/00—Accessory food factors for animal feeding-stuffs
- A23K20/10—Organic substances
- A23K20/142—Amino acids; Derivatives thereof
- A23K20/147—Polymeric derivatives, e.g. peptides or proteins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/08—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for nausea, cinetosis or vertigo; Antiemetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/12—Antidiarrhoeals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/02—Drugs for disorders of the nervous system for peripheral neuropathies
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/24—Antidepressants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/30—Drugs for disorders of the nervous system for treating abuse or dependence
- A61P25/36—Opioid-abuse
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
- A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/16—Otologicals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
- A61P5/38—Drugs for disorders of the endocrine system of the suprarenal hormones
- A61P5/40—Mineralocorticosteroids, e.g. aldosterone; Drugs increasing or potentiating the activity of mineralocorticosteroids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/12—Antidiuretics, e.g. drugs for diabetes insipidus
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Polymers & Plastics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Hematology (AREA)
- Addiction (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Obesity (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
Abstract
Rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, nebo jeho homology, nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu; protilátka specifická vzhledem k tomuto proteinu a její použití při in vitro zkouškách pro detekci uvedeného proteinu. Kompozice pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u zvířat, včetně člověka s obsahem tohoto proteinu a použití tohoto proteinu pro výrobu této kompozice. Krmivo, které obsahuje jako účinnou přísadu tento protein nebo rekombinatní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který je schopen ho produkovat. Nukleová kyselina kódující tento protein a její použití pro výrobu odpovídajících proteinů, vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu a rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který obsahuje tento vektor nebo je schopen produkovat tento protein.ŕ
Description
(57) Anotace:
Rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO:1, nebo jeho homology, nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu; protilátka specifická vzhledem k tomuto proteinu a její použití při in vitro zkouškách pro detekci uvedeného proteinu. Kompozice pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u zvířat, včetně člověka s obsahem tohoto proteinu a použití tohoto proteinu pro výrobu této kompozice. Krmivo, které obsahuje jako účinnou přísadu tento protein nebo rekombinatní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který je schopen ho produkovat. Nukleová kyselina kódující tento protein a její použití pro výrobu odpovídajících proteinů, vektor obsahující tuto nukleovou kyselinu a rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který obsahuje tento vektor neboje schopen produkovat tento protein.
Rekombinantní protein, protilátka, kompozice a krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí, nukleová kyselina, vektor a rekombinantní organismus
Oblast techniky
Vynález se týká antisekrečního faktoru ovlivňujícího transport kapaliny a/nebo zánětlivé reakce. Konkrétněji se vynález týká určitého rekombinantního proteinu, protilátky, kompozice a krmivá pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí, nukleové kyseliny, vektoru a rekombinantního organismu.
Dosavadní stav techniky
Všechny buňky a tkáně jsou kriticky závislé na konstantním a normálním tekutém prostředí v kombinaci s adekvátním krevním zásobením. Porucha jednoho nebo obou těchto systémů se může rychle stát pro organismus fatální. Existují dva různé systémy nerovnováhy tekutiny:
A. edém, který je charakterizován abnormální akumulací tekutiny v intracelulámím prostoru tkáně nebo v tělních dutinách;
B. dehydratace, která v přísném slova smyslu znamená jen ztrátu vody, ale která je často používána pro popis kombinované ztráty vody a iontů.
Nejběžnějšími příčinami edému a dehydratace jsou: průjem, nemoci spojené se zánětem, mozkový edém, astma, rhinitida, konjunktivitida, artritida, glaukom, různé formy patologických změn tlaku v intrakraniálním prostoru, (hypotenze a hypertenze), změny tlaku ve středním uchu, jako například morbus meniere, dermatitida, chemické nebo fyzikální poruchy kůže a kožních žláz, jako například mastitida, různé formy endokrinních poruch, jako například diabetes insipidus, Connův syndrom, Cushingův syndrom a morbus Addison, poruchy ledvin, jako například pyelonefritida a glomerulonefritida, metabolické poruchy, jako například myxedém a akutní interminentní porfyrie. Dále jsou to vedlejší účinky způsobené různými léky, jako například antidiabetiky, cytostatiky, barbituráty, narkotiky a analogy narkotik.
Průjem je způsoben změnou permeability pro vodu a ionty ve střevě. Tato porucha je často způsobena bakteriálními enterotoxiny, které produkuje například Escherichia Coli, Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, Shigella dysenteria a Clostridium dificile. Porucha může být také způsobena střevním zánětem. Protože transport vody je spjat se vstřebáváním elektrolytů a živin, trpí zvířata pravidelně průjmy a malnutricí, která se projeví snížením hmotnostních přírůstků u rostoucích zvířat. Organismus může ovlivnit tuto nerovnováhu neurohormonálními mechanismy, například uvolněním somatostatinu a peptidů opiátového typu z intemeuronů ve střevní sliznici. Tyto polypeptidy jsou zodpovědné za zpomalení sekrece tekutiny a zmírnění průjmu.
Nedávno popsaný antisekreční faktor (AF) byl zčásti purifíkován z vepřové hypofýzy a ukázalo se, že zastavuje patologickou sekreci indukovanou různými enterotoxiny. Vysoké hladiny AF ve vepřovém mléce chrání kojená mláďata proti neonatálním průjmům.
Při léčbě průjmů u lidí i zvířat se běžně používá různých antimikrobiálních látek. Jsou také často užívány jako potravinová aditiva u vepřů, skotu a drůbeže. S ohledem na rychlý vývin rezistentních bakterií ve střevech je nyní používání antibiotik při terapii enteritidy omezováno jak u lidí, tak ve veterinární medicíně.
Jiná antidiarhetika čelí sekreci ve střevní sliznici. Poněvadž tyto látky jsou zaměřeny proti organismu hostitele, je nepravděpodobné, že se v tomto případě časem rozvine rezistence. Mezi
-1 CZ 295444 B6 tyto látky patří neuroaktivní léky, jako například fenothiaziny a thioxantheny. Díky značným nežádoucím účinkům těchto látek nebyly v mnoha zemích zahrnuty mezi léky pro antidiarhetickou terapii. Další látky jsou deriváty opiátů, jako například kodein a loperamid. Protože mnohé z těchto látek mají také inhibiční vliv na střevní motilitu, zamezují tak rychlé clearenci patogenních bakterií ze střevního prostředí a rozhodně nemohou být proto doporučeny pro terapii enteritidy dyzenterického nebo parazitárního původu. Deriváty somastatinu byly zavedeny nedávno, ale jejich použití je limitováno obtížným podáváním těchto látek a možnými interakcemi s endokrinní regulací růstu.
Antisekreční faktor AF nebyl dosud přímo použit k léčbě malnutrice a průjmů pro obtížnou přípravu tohoto proteinu v dostatečné čistotě. Nicméně bylo možné indukovat podobné proteiny u domácích zvířat, kterým bylo podáváno speciální krmivo (SE patent č. 9000028-2). Vepři, kterým byla taková potrava podávána, měli vysokou hladinu AF-podobného proteinu a vykazovali značně vyšší hmotnostní přírůstek oproti kontrolním zvířatům. AF u krys provokovaných toxinem A z C. diffícicile poskytuje ochranu nejen proti intestinální sekreci, ale potlačuje i zánět a krvácení ve střevě.
Podstata vynálezu
Hlavním objektem vynálezu je nový rekombinantní protein a jeho homology a fragmenty (peptidy) pro použití k normalizaci patologických transportů tekutiny. Tyto proteiny a peptidy se souborně označují jako antisekreční faktory (AF). Při použití AF dochází také k částečné inhibici nebo totální eliminaci vývoje zánětlivých reakcí různé etiologie. Návratu k normálnímu stavu (normální transport tekutin a nepřítomnost zánětu) je docíleno při použití těchto proteinů nebo peptidů. AF proteiny či peptidy jsou efektivně absorbovány přes sliznici střeva bez ztráty svého účinku (v porovnání s intravenózním podáním). V důsledku toho existují různé režimy léčby a správné podání tohoto proteinu nebo peptidů může rychle restaurovat narušenou rovnováhu tekutiny (vody a iontů) v organismu a zvrátit vývoj zánětu nebo obojí.
Souhrnně lze uvést, že rekombinantní AF (rAF) a jeho homology a fragmenty mohou být použity k imunodetekci, jako přísady do krmiv pro urychlení růstu zvířat a jako protiprůjmová léčiva, a to proti onemocněním spojeným s edémem, dehydratací a/nebo zánětem.
Předmětem vynálezu je rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology, nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.
Ve výhodném provedení je fragment uvedený výše vybrán ze skupiny zahrnující: a) aminokyseliny č. 35 až 42, b) aminokyseliny č. 35 až 46, c) aminokyseliny č. 36 až 51, d) aminokyseliny č. 36 až 80 a e) aminokyseliny č. 1 až 80 aminokyselinové sekvence znázorněné v SEQ ID NO: 1.
Zvláště pak je předmětem vynálezu peptid XiVCX2X3KX4R odpovídající fragmentu, který obsahuje aminokyseliny č. 35 až 42 rekombinantního proteinu znázorněného v SEQ ID NO: 1, kde X] je nebo není zastoupen, X2 je H, R nebo K, X3 je S, L nebo jiná neutrální aminokyselina a X4 je T nebo A.
Předmětem vynálezu je dále také protilátka specifická vzhledem k proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homologům nebo fragmentům, které mají antisekreční aktivitu.
Kromě toho je předmětem vynálezu také kompozice pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u zvířat, včetně člověka, která jako aktivní složku obsahuje účinné množství rekombinantního proteinu nebo jeho homologu nebo fragmentu definovaného výše.
-2CZ 295444 B6
Ve výhodném provedení obsahuje tato kompozice jako fragment výhodný fragment uvedený výše.
Dále je předmětem vynálezu také použití rekombinantního proteinu uvedeného výše pro výrobu kompozice pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u zvířat, včetně člověka.
Předmětem vynálezu je také krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u obratlovců, které obsahuje jako účinnou přísadu rekombinantní protein definovaný výše nebo rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který je schopen ho produkovat.
Předmětem vynálezu je dále také použití protilátky specifické, vzhledem k výše uvedenému rekombinantnímu proteinu, při in vitro zkouškách pro detekci uvedeného proteinu nebo jeho homologů nebo fragmentů.
Dále je předmětem vynálezu také nukleová kyselina kódující tento rekombinantní protein, homolog nebo fragment.
Dále je předmětem vynálezu také použití této nukleové kyseliny pro výrobu odpovídajících proteinů nebo homologů nebo fragmentů.
Dalším předmětem vynálezu je vektor obsahující výše uvedenou nukleovou kyselinu a rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který obsahuje tento vektor.
Konečně je předmětem vynálezu i rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus schopný produkovat výše uvedený rekombinantní protein.
Jako organismů, které jsou schopny produkovat rekombinantní protein, lze použít různých typů organismů, jako rekombinantních bakterií a eukaryontních organismů, jako například kvasinek, rostlin a obratlovců, kromě člověka.
V posledních deseti letech proběhlo mnoho pokusů o izolaci čistého proteinu AF konvenčními biochemickými metodami, ale protein se nepodařilo získat v homogenní formě. Pomocí nové metody se podařilo získat poločistý protein AF pro imunizaci a selekcí antisér pomocí imunohistochemické metody bylo vybráno vhodné antisérum. Pomocí tohoto antiséra bylo možno vyklenovat rekombinantní lidskou cDNA, exprimující AF v E. coli.
Byla stanovena sekvence nové cDNA a zjistilo se, že je jedinečná. Se znalostí této sekvence byly zkonstruovány oligonukleotidové sondy, které hybridizovaly s lidskou hypofyzámí RNA. Velikost této RNA okolo 1400 párů bází je ve shodě s velikostí sekvenované cDNA, která obsahuje 1309 párů bází plus póly(A)zakončení. Částečná cDNA sekvence z krysí hypofýzy se ukázala jako identická s lidskou cDNA, což ukazuje, že se jedná o všudypřítomnou strukturu konzervovanou v AF genech z různých druhů. Tato podobnost umožňuje použít stejné oligonukleotidové sondy k identifikaci AF kódující RNA a DNA z různých druhů.
Kromě toho bylo možno exprimovat rAF v biologicky aktivní formě. AF protein jako fúzní protein s gluthation S-transferázou byl exprimován ve velkém množství v E. coli a čištěn do homogenního stavu pomocí afinitní chromatografie. Po rozštěpení fúzního proteinu trombinem se ukázalo, že rekombinantní AF (rAF) je extrémně účinný, 44 ng (10-12 mol) má ve střevě krysy poloviční maximální inhibiční schopnost na sekreci kapaliny indukovanou cholera toxinem.
Pomocí genové technologie byly produkovány malé fragmenty rAF. Ukázalo se, že aktivita sídlí v malé sekvenci obsahující 7-8 aminokyselin. To bylo prokázáno pomocí chemické syntézy na pevné fázi, při které byl produkován technický oktapeptid. Ukázalo se, že tento oktapeptid je na
-3 CZ 295444 B6 molární bázi víceméně stejně biologicky aktivní jako rAF. Pomocí místně orientované syntézy byly vytvořeny různé sekvence uvnitř aktivního místa a zjistilo se, že záměny určitých aminokyselin se obešly bez ztráty biologické aktivity.
byla sešita dvěma stehy. Do kličky bylo injikováno určité množství enterotoxinu. Při testování antisekretorických látek jsou tyto látky podány mezi jednou hodinou před a dvěma hodinami po provokaci toxinem. Injekce byla aplikována třemi různými způsoby intravenózně, intraintestinálně a intranasálně. Tekutina se akumulovala ve střevní kličce pět hodin po podání toxinu. Sekrece byla počítána podle hmotnosti akumulované tekutiny na 1 cm střeva.
Sekvence proteinu byla určena jednak sekvenováním aminokyselin a jednak nepřímo dedukcí ze sekvence cDNA.
Rekombinantní AF má velmi malé toxické nebo systemické účinky. Nebyly zaznamenány žádné toxické reakce u krys, kterým byla podávána lOOx vyšší dávka než ta, která vyvolává polovinu maximální inhibice. Protože je látka účinná i po podání do průsvitu střeva, bude možné tuto látku podávat i perorálně.
Rekombinantní AF inhibuje sekreci také při podání po provokaci toxinem, na rozdíl od přirozeného AF, který se zdá být účinný pouze, pokud je injikován před podáním toxinu. AF by tedy mohl být podáván jak profylakticky, tak terapeuticky.
Ukázalo se, že rAF a jeho peptidové fragmenty inhibují cytotoxické reakce a zánět způsobený 25 toxinem A z Clostridium diffícile ve střevě. Pomocí testu permeability barviva bylo zjištěno, že rAF a jeho fragmenty mohou zvrátit patologické změny permeability indukované cholera toxinem nejen ve střevní sliznici, nýbrž i v plexus choroideus, který reguluje tlak likvoru v mozku. U králíků byla vyrobena antiséra proti rAF a použita při imunostanovení ELISA (enzyme linked immuno assy). Tato metoda může být použita k měření hladiny AF v tělesných tekutinách nebo 30 krmivu.
Metoda purifíkace protilátek proti AF (přirozenému nebo rekombinantnímu), která se provádí pomocí afínitní chromatografíe na kolonách s agarózou, s kopulovaným rAF, je popsána níže.
Také se potvrdilo, že tyto protilátky jsou vhodné pro detekci AF v tkáňových řezech pomocí imunohistochemických technik a pro detekci AF ve Westem-blotu.
Vynález je dále popsán na neomezujících příkladech doprovázených obrázky.
Přehled obrázků na výkresech
Obr. la a dále obr. lb
Sekvence nukleové kyseliny a dedukovaná aminokyselinová sekvence nového lidského proteinu. Potvrzená aminokyselinová sekvence je podtržena.
Obr. lc
Horizontální mapa ukazující klonovanou cDNA a oligonukleotidové primery.
Obr. 2
Coomassie briliantovou modří zbarvený SDS-polyakrylamidový minigel (A) a imunoblot 55 zkoušený s antisérem proti AF (B) vepře. Linie s neindexovanými čísly obsahují fúzní proteiny glutathion-agaróza-čištěný GST-AF s proteinem AF-1, AF—2 a AF-3, zatímco linie s indexovanými čísly obsahují fúzní proteiny rozštěpené trombinem. Nalevo jsou uvedeny molekulové hmotnosti (R), (BDH). GST-AF-1 fúzní protein je vysoce degradován, ale immunoblotová analýza ukazuje jen detekci celé délky proteinu a spontánního trombónového štěpení. V GST-AF-3 je 26 kDa produkt, pravděpodobně glutathion S-transferázový konec, který je nezávisle exprimován.
Obr. 3 a
Western blot používající antisérum proti rekombinantnímu proteinu AF-2. Byly použity tyto složky: nalevo porcin (P) a tři lidské hypofýzy (Hl, H2, H3) a napravo tři rekombinantní proteiny AF-1, AF-2 a AF-3 obr. 2. V centrální části standard molekulární hmotnosti (R).
Obr. 3b
ELISA u rAF používající surové antisérum a afinitně čištěné protilátky vypěstované v těle králíka.
Obr. 4
Autoradiogram Nothem blotů RNA z lidské a vepřové hypofýzy (p = směsný, i = individuální materiál). Bylo použito 5 pg čisté mRNA v každé jamce a 3-konce 32P- značené oligonukleotidové sondy. Autoradiogram byl vyvíjen po 7 dnech.
Obr. 5
Kryořezy adenohypofýzy obarvené antisérem proti rekombinantnímu proteinu GST-AF-2. A. Řezy inkubované s imunním sérem ukazující rozptýlené buňky s různým stupněm pozitivní imunoreaktivity (plné šipky). Mnoho buněk není obarveno (světlé šipky). B. Postupné řezy k A inkubované s imunním sérem preabsorbovaným v přebytku rekombinantního proteinu GST-AF2. Nedochází k žádnému specifickému obarvení buněk. C a D. Imunopozitivní buňky ve větším zvětšení ukazují obarvení cytoplazmy endokrinních buněk, kde n = jádro a c = cytoplazma.
Obr. 6
Biologická aktivita rAF-Ι testující inhibici CT-indukované sekrece tekutiny. Rostoucí dávky proteinu byly potkanům podány i.v.; 3 pg CT byly vstříknuty do střevní kličky, po 5 h byla měřena akumulace tekutiny (mg/cm střeva). Každá hodnota reprezentuje střední hodnotu ± směrodatnou odchylku u skupiny šesti zvířat.
Obr. 7
Biologická aktivita intravenózně injikovaného rAf-1; 0,5 pg rAF bylo podáno 20-30 s před nebo 90 min po provokaci 3 pg CT do střevní kličky potkana.
Obr. 8
Biologická aktivita intraluminárně injikovaného rAf-1; 3 pg rAF byly podány 20-30 s před nebo 90 min po provokaci 3 pg CT do střevní kličky potkana; rAF byl injikován 5 cm proximálně od místa, kam byl aplikován CT.
-5CZ 295444 B6
Obr. 9
A (x2,5) je kontrolní klička (PBS) ukazující buněčné zbytky v průsvitu (L) střeva, zbarvení na zbývající sliznici není patrné, což svědčí pro úplnou destrukci epiteliální výstelky. B (0,5 μΐ PÍ před CT provokací) ukazuje jasně ohraničenou epiteliální výstelku tvořící klky, což svědčí pro normální neporušenou sliznici. L = průsvit střeva. Čárka 500 pm. C (xlO) ukazuje destrukci sliznice v PBS-ošetřené kontrolní skupině a D znázorňuje sliznici střeva ve zkoumané skupině (podání Pl). Černá šipka směřuje k epiteliální výstelce, LP = lamina propria, mm = muscularis mucosa, světlá šipka směruje ke kryptickým buňkám. Čárka = 100 pm. E (x25) znázorňuje destrukci mukogy v kontrolní skupině (ošetřené/BS) a F ukazuje totéž v odpovídajícím zvětšení u potkana léčeného Plpřed CT provokací. Čárka = 50 pm.
Obr. 10
Fluorescence Evansovy modři (EB) ve vzorku jejunální kličky ze tří skupin potkanů ošetřených CT nebo kontrolním pufrem (PBS); předléčených antisekretorickým peptidem Pl nebo kontrolním pufrem (PBS). LP = lamina propria. Černá šipka směřuje k epiteliální výstelce; světlá šipka směřuje ke kryptickým buňkám. Čárka =100 pm.
Obr. 11
Fluorescence Evansovy modři (EB) ve vzorku plexus choroideus od stejného potkana jako na obr. 10. Čárka = 50 pm.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Protilátky proti AF připravenému pro klonování cDNA
Antisekreční faktor byl připraven z vepřové krve pomocí afínitní chromatografíe na agaróze a izoelektrickou fokusací. Do jednoho litru vepřové krve (obsahující antikoagulační látky) byl přidán 1 g thiosulfátu sodného a 1 mg fenylmethyl-sulfonylfluoridu. Krevní buňky byly separovány pomocí centrifugace a čistá plasma byla eluována přes kolonu se Sepharosou 6B (Pharmacia LKB Biotechnology Stockholm). Objem gelu odpovídal asi 10 % objemu roztoku. Po promytí pomocí trojnásobku objemu fosfátovým pufrem pufrovaného roztoku chloridu sodného (PBS = 0,15M NaCl, 0,05M fosfát sodný, pH 7,2) byla kolona eluována pomocí dvojnásobku objemu lože IM roztokem alfa-methyl D-glukosidu v PBS. Eluát byl koncentrován a dialyzován vůči vodě v průtokovém ultrafíltru Omega (Filtron technology Corp.).
Frakce byla poté frakcionována pomocí izoelektrické fokusace v amfolinu (Pharmacia). Gradient pH byl 4-6 ve 400 ml izoelektrofokusační koloně. Frakce mající izoelektrický bod mezi 4,7 a 4,9 byla sebrána a dialyzována proti PBS. Částečně čistý AF byl rozdělen na malé části a použit na produkci antisér u králíků výše popsanou metodou. Králíci byli imunizováni a kapacita séra byla otestována z hlediska schopnosti barvit intracelulámí materiál v řezech lidské hypofyzy (metoda je popsána v příkladu 6). Jen jedno ze sér bylo specifické a barevně rozlišilo intracelulámí části složky bez obarvení extracelulámích matrix proteinů. Toto antisérum bylo vybráno pro screening knihovny cDNA/lambda fág GT11 z lidské hypofyzy expresí proteinů v E. coli.
-6CZ 295444 B6
Příklad 2
Screening cDNA knihoven z lidské hypofýzy a mozku
5'-úsek cDNA knihovny izolovaný z normální lidské hypofýzy a pocházející z tkání získaných od devíti bělochů byl zakoupen od Clontech Laboratories. Pro screening knihovny byly naočkovány tágy v množství 3 χ 104 PFU na 150 mm misku s E. coli Y1090. Výše popsané králičí antisérum proti vepřovému AF bylo absorbováno v polovině objemu E. coli Y1090 lyzátu po 4 hodiny při 23 °C a rozředěno v poměru 1 : 400.
Screening probíhal podle Younga a Davise (Young, R.A. a Davis, R.W. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 80, 1 194-1 198.). S alkalickou fosfatázou konjugovaná kozí protikráličí protilátka byla použita jako druhá protilátka (Jackson). Byly vybrány pozitivní plaky, eluovány do fágového suspenzního média (20mM Tris-HCl (pH7,5), 100 mM NaCI, 10 mM MgS04, 2% želatina), přeočkovány a podrobeny dalšímu screeningu, dokud nebyly všechny plaky pozitivní.
cDNA- reklonování- Fág DNA z AF rekombinantů byl izolován pomocí Wizard Lambda Preps (Promega) a štěpen pomocí EcoRI. Inserty byly čištěny pomocí soupravy Sephaglas BandPrep Kits (Pharmacia), reklonovány do pGex-llambdaT vektoru (Pharmacia) tak, jak bylo popsáno výrobcem a transfekovány do buněk Epicurian Coli XL1- Blue, Top 1 nebo BL21 (všechny tři od firmy Stratagene. rAF nebo r peptidy byly připraveny v BL21 buňkách, pokud není uvedeno jinak.
Amplifikace cDNA pomocí PCR- Pro získání chybějící 5'-koncové cDNA bylo použito metody na bázi PCR zvané RACE (rapid amplification of cDNA ends). Modifikovaná RACE metoda, která generuje R-RACE-Ready cDNA s kotevními oligonukleotidy napojenými na 3-konce molekuly lidské mozkové cDNA byla zakoupena od Clontech Laboratories. 5'-Konec byl amplifikován z části 5'RACE-Ready cDNA ve dvou PCR amplifikačních krocích používajících 5'primery komplementární kotevnímu a dvěma genově specifickým (vnořené geny) 3/PCR primerům A a B (A = báze 429-411 a B = báze 376-359, obr. la). Různé menší části RACE fragmentu byly dále amplifikovány pro expresi odpovídajících peptidů a testování jejich biologických vlastností. Pozice báze a aminokyselin na počátku a na konci těchto oligonukleotidových fragmentů a jejich odpovídajících peptidů jsou ukázány v tabulce 1. Vepřový a hovězí cDNA (ClonTech Laboratories) byla použita jako templát pro amplifíkaci fragmentů odpovídajících N3 v tabulce 1. Obměna této sekvence byla také uměle vložena pomocí místně orientované mutageneze. Při této metodě byly syntetizovány různé oligonukleotidy korespondující polohám 168-193 za účelem jednotlivého nahrazení aminokyselin v pozicích 35—42 (pozice jak jsou znázorněny v SEQ ID NO: 1). Amplifikovaný DNA fragment byl klonován do pGex-llambdaT vektoru za použití místa EcoRI zabudovaného do kotevního a genově specifického primeru. K ověření sekvence získané RACE metodou byla amplifikována dvouřetězcová cDNA z lidské hypofýzy a mozku (Clontech) pomocí dvojice příměrů C/D obsahující navíc štěpné místo EcoRI (obr. lb). Primery byly vytvořeny tak, aby umožnily amplifíkaci celého otevřeného čtecího rámce (ORF). Produkty PCR z hypofyzy a mozku o očekávané velikosti byly štěpeny EcoRI izolovány a klonovány do plazmidového vektoru pGex-llambdaT.
DNA sekvenování a oligonukleotidy DNA z plazmidu pGexllambdaT byla použita jako templát pro sekvenování vložených segmentů metodou dideoxyterminace řetězců za použití kitu Sequenase verze 2.0 (U.S. Biochemichal Corp.). Počáteční dopředně a reverzní příměry kopírující oblasti pGex-llambdaT bezprostředně před a za vloženou DNA byly získány od Pharmacia. Další příměry byly syntetizovány (Scandinavian Gene Synthesis AB) na bázi sekvenční informace. Byly sekvenovány tři různé PCR4 klony tak, aby nedošlo k výměně bází Tág polymerázou při 5-RACE metodě.
Data nukleotidové sekvence a dedukované proteinové sekvence byla sestavena a analyzována pomocí programu MacVector 4.1 (Eastman Chemical Co.). K předpovědění odpovídajících
-7CZ 295444 B6 aminokyselinových sekvencí vložené cDNA bylo porovnáváno využití kodonů v různých čtecích rámcích. Tak byl získán jeden velký otevřený čtecí rámec. Vyšetřování sekvenčních dat DNA a proteinu bylo prováděno pomocí CD-ROM disku Entrez (National Center for Biotechnology Information, Bethesda, USA).
Molekulární klonování a sekvenční analýza cDNA- Polyvalentní antiséra proti AF proteinu z vepře se použijí pro screening cDNA z lidské hypofýzy.
Byly izolovány dva klony exprimující imunoreaktivní AF, odděleny z fágu lambda a reklonovány do EcoRl místa vektoru pGex-llambdaT, jak je to popsáno v kitu od firmy Pharmacia. Pomocí restrikční analýzy byly zjištěny velikosti inzertů 1100 a 900 bp. DNA sekvenování dvou klonů ukázalo úplnou homologii kromě jedné substituce (obr. 1, C nahrazující T v pozici 1011). Pomocí RACE metody byla získána sekvence předcházející 5' konci klonu Z. Fragment měl celkovou délku 376 bp (což nezahrnuje syntetické nukleotidové raménko u 5' konce). Úplná rekonstruovaná cDNA obsahovala 1309 párů bází následovaných póly A řetězcem, kterému předchází póly A signální řetězec (obr. 1, pozice 1289-1295). Otevřený čtecí rámec ORF 1146 bp byl nalezen v pozicích 63-1208.
Příklad 3
Exprese lidského AF proteinu z rekombinantních plazmidů
Konstrukce a čištění fúzních proteinů- Klony cDNA byly získány pomocí imunologického screeningu a pomocí PCR amplifikace úplné cDNA byly ligovány do pGex-llambdaT. Tento vektor umožnil expresi cizích proteinů v E. Coli jakožto fúzních produktů k C konci Schistosoma japonicum 26kDa gluthation S-transferázy (GST), která může být afinitně purifikována za nedenaturačních podmínek pomocí kitu získaného od firmy Pharmacia. V krátkosti, noční kultury E. coli transformované rekombinantními pGex-llambdaT plazmidy byly zředěny čerstvým médiem a kultivovány 3 h při 37 °C. Exprese proteinu byla indukována pomocí 0,1 mM IPTG (izopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosidu) a po 4 h růstu při 30 °C byly buňky peletizovány a resuspendovány v PBS. Buňky byly lyžovány ultrazvukem, ošetřeny 1 % Tritonem X 100-0 a centrifugovány při 12 000 x g po dobu 10 minut. Supematant obsahující exprimované fúzní proteiny byl čištěn pasáží lyzátů přes gluthationovou agarózu (Pharmacia). Fúzní proteiny byly buď eluovány konkurenčně vzhledem k volnému gluthationu nebo byly štěpeny přes noc pomocí 10 U hovězího trombinu pro odstranění AF proteinu z GST afinitního řetězce. Celá metoda používající pGex plazmidů a purifikace rekombinantních proteinů nebo peptidů byla prováděna za použití kitu dodaného od firmy Pharmacia.
Sekvence a velikost rekombinantních AF proteinů- Pro potvrzení kódující sekvence byl izolován transkript o celé délce za použití PCR- amplifikace hypofyzální a mozkové cDNA. Pomocí páru primerů C/D, bylo izolováno 1215 bp identických se sekvencí klonu-4 (obr. 1). ORF kódoval 382 aminokyselin s vypočtenou molekulární hmotností 41,14 kDa a vypočtenou hodnotou pI-4,9.
AF klony 1,2 a 3 a oligonukleotidy Nl-5 (obr. 1 a tabulka 1) byly ligovány do pGex-llambdaT plazmidového vektoru tak, že ORF byl v rámci s proteinem glutathion S-transferázou (GST). Konstrukty byly transformovány do E. coli a exprese fúzních proteinů byla indukována pomocí IPTG. Čištěné fúzní proteiny a trombinem rozštěpený AF protein nebo peptid byly podrobeny analýze SDS-PAGE a Western blotu za použití antiséra proti vepřovému antisekrečnímu faktoru (obr. 2). Obarvením proteinů pomocí modři Coomassie brilliant blue byly identifikovány diskrétní pásy každého proteinu kromě proteinu GST-AF-1, což ukázalo degradaci na menší komponenty.
Syntéza peptidů na pevné fázi- Menší peptidy (P7-P18 v tabulce 1) byly vytvořeny na pevné fázi (K.J. Ross- Petersen AS) v peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems. Čistota každého
-8CZ 295444 B6 peptidů byla 93-100 % podle hodnocení HPLC na reverzní fázi Deltapak C18, 300 a za použití lineárního gradientu 0,1 % trifluoroctové kyseliny ve směsi voda/acetonitril.
Sekvenování aminokyselin- Analýza proteinových sekvencí byla provedena za účelem ověření identifikace ORF. Čisté AF proteiny byly zpracovávány na 10 % gelu macro-slab SDS-PAGE a přeneseny na membránu Problot (Applied Biosystems) pomocí elektroblotování (Bio-Rad). Skvrny byly zviditelněny pomocí barvením Ponceau S, vyříznuty z blotu a prvních 20 aminokyselin proteinu bylo sekvenováno pomocí automatizované Edmanovy degradace na automatickém sekvenovači (Applied Biosystems).
Byly stanoveny N-terminální sekvence klonu-2 a 3 a ukázalo se, že aminokyseliny jsou v dobrém souhlasu s aminokyselinami 63-75 a 130-140 předpovězené sekvence (obr. 1).
Porovnání s jinými proteinovými sekvencemi dostupnými v GenBank ukázalo, že sekvence rAF je unikátní (obr. 1) ve všech svých částech a žádné podobné sekvence nebyly oznámeny.
Prvních deset zbytků proteinů se ukázalo jako relativně hydrofobních při analýze podle KyteDoolittla a může tvořit signální peptid, který je odštěpen ještě před exocytózou proteinu. Tato interpretace je podpořena analýzami Western blot (obr. 3), při nichž se zdá, že tento rekombinantní protein má o něco vyšší molekulární hmotnost než protein extrahovaný z hypofyzy.
Tento rozdíl může jít částečně na vrub 5 přídavných aminokyselin obsažených v rekombinantním proteinu, které vytvářejí trombinové rozštěpitelné místo fúzního proteinu.
Příklad 4
Produkce a testování antiséra rAF
Antiséra proti rekombinantnímu GST-AF fúznímu proteinu- V organismu králíka byly vytvořeny protilátky proti čištěným fúzním proteinům GST-AF-1, GST-AF-2 a trombinem štěpenému čistému AF1 proteinu (rAF) pro použití v ELISA, Western blotu a imunohistochemických studiích. Každému králíkovi bylo podáno 100 pg antigenu v 1 ml PBS smíšeného se stejným objemem Freundova kompletního adjuvans. Každá imunizace byla rozdělena do 8-10 dávek injikovaných do hřbetu intrakutánně. Dvě udržovací dávky o 50 pg antigenu byly injikovány ve třetím a pátém týdnu, přičemž ta poslední byla bez Freundova kompletního adjuvans.
Králíkům byla odebrána krev 6. den po poslední udržovací dávce a oddělené sérum bylo skladováno při -20 °C. Citlivost antiséra byla testována pomocí dot-blot zkoušky. Protein GST-AF-2 byl amplifíkován na ECL nitrocelulózové membráně při zředění 1:5a antisérum bylo zředěno v poměru 1 : 1000. Membrána byla blokována pomocí 1 % hovězího sérového albuminu (BSA) v PBS při 4 °C po dobu 16 hodin a potom inkubována po dobu 1,5 hodiny pomocí 1 : 800 ředěného králičího anti GST AF nebo vepřového antiséra. Blot byl vyvinut pomocí konjugátu alkalické fosfatázy a kozího a protikráličího imunoglobulinu a následně pomocí brom-4-chlor-3indolylfosfátu a p-nitro-modř tetrazolia (Boehringer Mannheim). V případě tohoto testu byl odhadovaný limit pro detekci antigenu okolo 1 ng.
Elektroforéza na SDS-polyakrylamidovém gelu a imiflunobloting- Elektroforéza na SDS-polyakryl-amidovém gelu (SDS-PAGE) extraktů z lidské a vepřové hypofýzy a čistých AF proteinů byla prováděna na 10 % akrylamidovém gelu minislab, v podstatě jak je to popsáno v Laemmii (Laemmli, U.K. (1970) Nátuře 227, 680-685) s modifikací, že bis-akrylamid jako síťovadlo byl nahrazen Ν,Ν'-diallyltartardiamidem v odpovídajícím molámím množství. Pyronin Y (Sigma) byl použit jako markér čela elektroforézy. Předem barevně označené etalony molekulové hmotnosti byly nakoupeny od BDH. Každý protein byl potom obarven pomocí Coomasie brilliantové modři nebo elektroforeticky přenesen na ECL nitrocelulózu s 0,45 mm velkými póry
-9CZ 295444 B6 (Amersham) pro imunoblotování. Následující inkubace pomocí BSA, konjugovaného anti-IgG a substrátu alkalické fosfatázy byly stejné jako pro dot-blot zkoušku popsanou výše.
Jak bylo výše zmíněno, obarvení Coomassie Brilliant modří nevytvořilo žádný oddělený pás GST-AF-1 proteinu, pravděpodobně v důsledku proteolytické degradace na menší složky. Při Western blot analýze poskytl protein o úplné délce mnohem silnější signál než degradované produkty (obr. 2b). Silná reakce s antisérem proti vepřovému AF ukázala, že rekombinantní proteiny měly opravdu stejnou imunoreaktivitu jako AF. Molekulová hmotnost proteinu o úplné délce byla asi 60 kiloDalton (kDa), což je hodnota vyšší než skutečná molekulová hmotnost 41139 Dalton (Da) odhadnutá na základě aminokyselinového složení.
Proteiny byly dále imunoblotovány a testovány s antisérem vyvinutým proti GST-AF-2, které váže trombinem rozštěpené proteiny (obr. 3).
Antisérum proti rekombinantnímu GST-AF-2 reagovalo s přírodním AF proteinem o zdánlivé molekulové hmotnosti 60 kDa a s některými menšími složkami, pravděpodobně produkty enzymatické degradace (obr. 3a).
ELISA pro určení koncentrace AF- Při testu ELISA bylo použito anti-AF-1 a anti-AF-2 podle výše popsané metody (Zachrisson, G., Largergard, T. a Lonnroth, I. (1986) Acta path. Microbiol. Immunol. Scand. C, 94,227-231). Jak je ukázáno na obr. 3b, citlivost tohoto testu se surovým antisérem byla mezi 1-10 pg proteinu, zatímco test s afinitně čištěnými protilátkami měl citlivost mezi 5-50 pg proteinu.
Příklad 5
Northern blot analýza RNA z hypofýzy
Northem blot analýza- Lidské hypofýzy byly získány postmortem z nemocnice Sahigrenska (se svolením komise Swedish Health and Welfare Board, paragraf 2 transplantationslagen, 1975 : 190). RNA byla z hypofýzy extrahována pomocí guanidinium thiokyanátu podle Chomczynskiho a Sacchiho (Chomoczynski, P., Sacchi, N. (1987), Analyt. Biochem. 162, 156-159) Polyadenylovaná RNA byla selektována pomocí komerčního kitu (Pharmacia) za použití kolon s oligodT-celulózou. Dále bylo použito směsné lidské hypofyzální mRNA od 107 dárců odkoupené od Clontech. Každý vzorek o 5 pg póly (A+)RNA byl ošetřen glyoxalem a podroben elektroforéze na 1,2% agarozovém gelu (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning a laboratory manuál, str. 7.40-7.42, Cold spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Po proběhnutí tříhodinového kapilárního alkalického přenosu v 0,05 M NaOH na Hybond N+ nylonové membrány (Amersham) proběhla prehybridizace a hybridizace během 24 h vždy při 42 °C. Hybridizační roztok obsahoval 50 % formamidu, 5xSSPE, lOxDenhardův roztok s250 pg/ml denaturované nízkomolekulámí DNA a 50 pg/ml polyadenylové kyseliny. Bloty byly testovány pomocí čtyř různých antisenze 28 bp oligonukleotidů obsahujících pozice 132-105 (přiměř E), 297-270 (primer F), 748-721 (přiměř G) a 833-806 (primer H) sekvence (obr. 1). Tyto sondy byly na 3'-konci označeny terminální transferázou (Boehringer Mannheim) plus (alfa32P) ddATP (Amersham) a čištěny na kolonách Nick (Pharmacia). Pět přídavných promývacích cyklů pomocí 5xSSPE/0,l % SDS0,5XSSPE/0,l % SDS bylo provedeno při 42 °C, každý 30 minut s opakováním posledního promývání. Filtry byly exponovány na Hyperfílm MP (Amersham) po dobu sedmi dnů.
Exprese v hypoíyze- Nothem blot analýzy byly provedeny se směsí čtyř oligonukleotidových sond, které hybridizovaly s různými sekvencemi podél klonované cDNA. Sondy hybridizovaly s jediným pásem mRNA, která byla separována z hypofýzy, o délce asi 1400 bp. Nejsilnější signály byly získány z humánního materiálu, ale vepřový materiál také vykazoval křížovou reakci.
-10CZ 295444 B6
Příklad 6
Distribuce AF v řezech hypofýzy
Druh a tkáně- Lidské hypofyzy byly získány postmortem v nemocnici Saigrenska (se svolením komise Swedish Health and Welfare Board, paragraf 2 Transplantationslagen, 1975 : 190). Žlázy byly zmrazený na -70 °C a tak uchovávány, kromě těch, které byly použity pro histologické zkoušky. Ty byly fixovány 24 h ve 4 % paraformaldehydu rozpuštěném ve fosfátem-pufrovaném roztoku chloridu sodného (PBS = 0,15M NaCl, 0,05 M fosfát sodný, pH = 7,2) a poté byly přemístěny do 7,5 % sacharózy v PBS. Hypofyzy z vepřů o stáří 5 až 7 měsíců získané na jatkách byly během transportu a až do doby použití umístěny na suchém ledu při -70 °C. Potkani Sprague-Dawiey pro biologické zkoušky, 2-3 měsíce staří, byli získáni od firmy B&K Universal AB, Sollentuna, Švédsko. Králíci (New Zéland White) pro imunizaci byli získáni od firmy Lidkoping Kaninfarm, Švédsko.
Immunohistochemie- Fixované hypofyzy byly zmrazený v tekutém dusíku a byly připraveny 7 pm tlusté kryo-řezy. Z každého vzorku bylo připraveno 5-10 řezů, které obsahovaly různé části žlázy. Řezy byly upevněny na mikroskopická sklíčka. Vzorky byly blokovány 5 % odtučněným sušeným mlékem a inkubovány s primárním králičím antisérem (anti-GST-AF-2 fúzní protein), zředěny 1 : 4000-1 : 8000 ve vlhké komoře přes noc při 4 °C. Po promytí v pufru byly vzorky inkubovány jednu hodinu při 23 °C s alkalickou fosfatázou konjugovanými vepřovými antikráličími immunoglobuliny a zředěnými v poměru 1 : 5 (Dako A/S). Imunoreakce byly vizualizovány pomocí fosfatázových substrátů jak byl popsáno jinde (Jennische, E., Matjka, G.L. (1992) Acta Physiol. Scand. 146,79-86) Kontrolní vzorky byly inkubovány s imunním sérem absorbovaným s přebytkem GST-AF-proteinu nebo s produkty všech inkubačních kroků kromě primárních protilátek.
Distribuce AF v řezech hypofyzy- Distribuce AF v řezech lidské hypofyzy byla studována pomocí imunohistochemických technik (obr. 5). Ve všech vyšetřovaných vzorcích bylo obarveno určité množství buněk adenohypofyzy. Imunohistochemický materiál byl lokalizován v granulích v cytoplazmě. Signál byl zrušen preabsorpcí imunního séra a přebytkem GST-AF-2 proteinu. Žádné zbarvení nebylo pozorováno v zadních částech žlázy (neurohypofyze).
Distribuce imunoreaktivního materiálu v hypofýze ukázala výhradně intracelulární distribuci AF v sekrečních buňkách předního laloku hypofyzy (adenohypofyzy). Mezi proteiny uvolňované z tohoto laloku patří růstový hormon, thyreotropin, kortikotropin, prolaktin a luteinizační hormon. Pasáž těchto hormonů z intracelulární lokalizace do vaskulámího systému je spouštěna uvolňovacími faktory, které jsou produkovány nueroendokrinními buňkami v hypothalamu.
Příklad 7
Biologická aktivita rAF
Antisekreční aktivita- Antisekreční aktivita byla měřena na modelu intestinální kličky potkana, popsaném již dříve (Lange, S. (1982) FEMS Microbiol. Lett. 15, 239-242). Jejunální klička byla intoxikována 3 pg cholera toxinu. Různé dávky čištěného AF-1- proteinu nebo BPS (kontrola) byly injikovány před nebo po provokaci cholera toxinem. Hmotnost akumulované tekutiny v intestinální kličce (ng/cm) byla měřena po pěti hodinách. Každý vzorek AF byl testován nejméně na šesti potkanech. Fisherův PLSD byl použit pro statistickou analýzu získaných dat.
Biologická aktivita rAF proteinu- Biologická aktivita čistého rAF proteinu klonu-1 produkovaného v E. coli byla testována na potkanu, jako modelu. Kapacita rAF inhibovat sekreci
-11 CZ 295444 B6 intestinální tekutiny po i.v. injekci podané 20-30 s před intestinální intoxikací cholera toxinem je zřejmá z obr. 6. U kontrolních zvířat, kterým byl podán pouze pufr, způsobil cholera toxin výraznou sekreci 412 ± 9 mg tekutiny na cm střeva. Čistý rAF způsobil na dávce závislou inhibici sekrece, která byla významně rozdílná od výsledků získaných po podání pouze pufru (p < 0,01, n = 6). Devět ng proteinu klonu-1 stačí k redukci odpovědi na 34 %, zatímco 44 ng (44-12 mol) a 220 ng redukuje odpověď na 46 % a 78 %. Biologická aktivita rekombinantního AF je větší než jakéhokoliv doposud známého enterotoxinu, a větší než aktivita jakéhokoliv neurohormonu nebo intestinálního hormonu nebo neuropeptidu regulujícího transport vody a elektrolytu. Kromě toho hodnota aktivity lidského rAF u potkana je překvapivě vysoká, což pravděpodobně odráží všudypřítomnost struktury konzervované v rAF molekulách z různých druhů. Tato hypotéza je podpořena skříženou reaktivitou mezi lidským a vepřovým vzorkem zjištěnou při analýze Western blot a Nothem blot.
Byla porovnávána kapacita 0,5 pg rAF inhibovat intestinální sekreci po i.v. injekci podané 20-30 s před a 90 minut po intoxikaci cholera toxinem (obr. 7). Oba způsoby podání měly značný inhibiční účinek oproti kontrolám (p < 0,01, n = 6).
Na rozdíl od přírodního AF, rekombinantní protein byl účinný i v tom případě, že byl podán po provokaci toxinem, což jej činí užitečným při léčení průjmu.
pg rAF byly indikovány do 8-10 cm dlouhé střevní kličky umíšené bezprostředně proximálně, vzhledem ke střevní kličce, která byla intoxikována toxinem cholery. rAF byl indukován 20-30 s před nebo 90 min po intoxikaci cholera toxinem. Na obr. 8 je ukázáno, že v obou zkoušených skupinách došlo ke značné redukci sekrece tekutiny (p<0,01, n = 6) a nebyl pozorován žádný rozdíl mezi nimi. Tento experiment ukazuje, že rAF je aktivní po perorálním podání a může být použit v krmivu jako aditivum a nemá žádné silnější vedlejší účinky.
V příkladech popsaných výše byl rAF produkován v buňkách Epicurian coli XL-1. V těchto buňkách byla velká část produkovaného rAF degradována na menší peptidy. Pokud byl rAF produkován v buňkách BL21, jen jeho malá část byla degradována a v buňkách Top 1 nedošlo vůbec k žádné degradaci. Překvapivě byla biologická aktivita úměrná rozsahu degradace. Tzn. vyšší degradace byla spojena s vyšší aktivitou. Z těchto důvodů byly i různé menší fragmenty, které vznikly, testovány na možnou biologickou aktivitu.
Jak je ukázáno v tabulce 1, byly tyto fragmenty testovány i v podáním před intoxikací cholera toxinem stejným způsobem, jak je to popsáno výše pro intaktní rAF. Peptidy exprimované klonem 2 a 3 byly testovány v množství 0,1, 1 a 10 pg a neměly žádný efekt na účinek toxinu. Naproti tomu 1 pg peptidů exprimovaného pomocí RACE fragmentu (klon 4) měl značný efekt. Z RACE fragmentu bylo vytvořeno mnoho kratších konstruktů a exprimováno v pGex-1 lambda. Aktivní místo bylo nalezeno v poloze mezi aminokyselinovými zbytky 35-51, jak je ukázáno v tabulce 1. Ve snaze určit přesněji aktivní místo byly vytvořeny tři malé peptidy pomocí metody syntézy na pevné fázi. Dva z nich byly aktivní -peptid 35—46 (P3) a peptid 35-42 (Pl). Posledně zmíněný oktapeptid IVCHSKTR (Pl) byl aktivní v dávce menší než 1 ng a byl ve stejném molárním množství téměř stejně účinný jako intaktní rAF. Naproti tomu kratší hexapeptid VCHSKT (P2) neměl žádný účinek, pokud byl podán v dávce mezi 1 ng a 10 pg.
Peptid X1VCX2X3KX4R odpovídající s určitými změnami a/nebo delecemi lidskému fragmentu Pl byl také vytvořen místně orientovanou mutagenezí a byla testována jeho biologická aktivita. Byly také srovnány sekvence z hovězí a vepřové cDNA. Tyto studie ukázaly následující změny a/nebo delece:
XI je I nebo není zastoupen,
X2 jeH, RneboK,
- 12CZ 295444 B6
X3 je S, L nebo jiná neutrální aminokyselina,
X4 je T nebo A.
Tabulka 1
| Kód | *Oligonukleotid | **Peptid | ***Inhibice CT sekrece pmol ED50 | ||
| NI | 63-301 | 1-80 | + | 4 | |
| N2 | 168-301 | 36-80 | + | 6 | |
| N3 | 168-215 | 36-51 | + | 3 | |
| N4 | 122-170 | 21-36 | — | ||
| N5 | 186-269 | 42-69 | - | ||
| P3 | g P £**** | 35M6 | + | 7 | |
| PÍ | S.P.S. | 35-42 | + | 5 | |
| P2 | S.P.S. | 36-41 | - |
Pozice párů bází v SEQ ID číslo 1, která byla exprimována v konstruktu vytvořeném z AF cDNA a pGex-l-lambda.
** Pozice aminokyselinových zbytků (SEQ ID č. 1) v AF na začátku a na konci syntetizovaného peptidu.
*** U aktivních peptidů byla zaznamenávána inhibice cholera toxinem indukované sekrece tekutiny v sešité střevní kličce potkana, u účinných peptidů je uvedeno jejich množství (pmol) inhibující polovinu maximální sekrece (ED50).
**** Tyfo peptidy byly produkovány syntézou na pevné fázi.
Vliv rAF na zánět střevní sliznice byl také testován na modelu střevní kličky potkana. Dvaceti potkanům bylo podáno 0,5 pg toxinu A z Glostridium diffícile (Torres, J.F., Jennische, E., Lange,
S. a Lonnroth, I. (1990) Gut 781-785.) a sekretovaná tekutina a zánět byl měřen po 2,5 a 5 h (10+10 potkanů). Polovina potkanů v každé skupině dostala 100 ng i.v. 30 s před podáním toxinu a druhá polovina dostala PBS pufr jako placebo. Po usmrcení potkanů byly střevní kličky rozříznuty a střední 2-3 cm část kličky byla zmrazená na suchém ledě. Zmrazené vzorky byly nařezány v Leica kryostatu na 8 pm řezy. Řezy byly obarveny pro demonstraci alkalických fosfatáz pomocí enzymatické histochemie. Alkalické fosfatázy jsou exprimovány v intestinálních epiteliálních buňkách a barvení umožňuje stanovit integritu střevního epitelu. Z výsledků je patrno (obr. 9), že u kontrolních potkanů došlo k velmi rozsáhlému poškození intestinální sliznice: po 2,5 hodinách byly epitelové buňky odděleny od základní membrány a byla pozorována nekrotická tkáň, dále bylo po 5 hodinách zjištěno rozsáhlé krvácení. Naproti tomu u zvířat, kterým byl podán rAF, nedošlo k žádnému oddělení epiteliálních buněk, nekróze nebo krvácení. Sekrece tekutiny indukovaná toxinem A byla inhibována ze 199 ± 4 na 137 ± 5 mg/cm po 2,5 h (p < 0,01) a z 421 ± 3 na 203 ± 6 mg/cm po 6 h (5 potkanů na skupinu, p < 0,01).
Stejný experiment byl proveden s 0,5 pg peptidů IVCHSKTR (=P 1) místo rAF proteinu. Tento oktapeptid měl stejný vliv na toxinem A indukovaný intestinální zánět a sekreci tekutiny, jak je ukázáno na obr. 9.
Toxicita- Pro test toxicity byl rAF injikován ve vysoké dávce 50 pg na potkana. Nebyly zjištěny žádné zřejmé toxické reakce během období jednoho týdne.
-13CZ 295444 B6
Příklad 8
Biologická aktivita rAF na intestinální permeabilitu
Pro vyhodnocení vlivu rAF na permeabilitu organické látky rozpuštěné v krvi byl proveden pokus s barvivém Evansova modř (EB) podle dříve popsané metody (Lange, S., Delbro DS, Jannische, E., Evans Blue permeation of intestinal mucosa in the rat. Scand. J. Gastroenterol 1994, 29 : 38-46.). Experiment byl zpočátku proveden tak, jak je popsáno v příkladu 7 a obr. 5 a to i.v. podáním rAF před intoxikací cholera toxinem (CT). Nebyla však měřena sekrece tekutiny, nýbrž po 90 min po provokaci toxinem bylo i.v. podáno barvivo EB, a to 1 ml 1,5% roztoku v PBS. Barvivo cirkulovalo po dobu 5 min v organismu. Po této době byli potkani transkardiálně perfundováni přes levou komoru a pravou síň (byla použita peristaltická pumpaCole Partner Instruments, Chicago, 111., USA) pomocí roztoku 200 ml PBS/Alsevierovo činidlo (1/1 poměr) o teplotě 4 °C po dobu 150 s. Vše probíhalo v etherové anestezii. Tak byla odstraněna všechna Evansova modř (EB) přítomná ve vaskulámím systému a ponechána byla pouze EB v intestinální tkáni pro detekci barviva extrakcí formamidem.
Výsledky v tabulce 2 ukazují, že CT- provokace signifikantně zvyšuje (p < 0,001) množství EB, které může být extrahováno z intestinální tkáně o asi 43 %, zatímco i.v. podání 1 BrT před CT-intoxikací zabraňuje tomuto nárůstu a množství EB extrahované z tkáně ve skupině 1 (kontrola) se nelišilo od skupiny 3 (IrAF + CT).
Tabulka 2
| Skupina | Provokace | ng | EB/g int. tkáň x 10 7 | % zvýšení EB-konc |
| 1 | PBS + PBS | 6 | 29,3 ± 1,0 | |
| 2 | PBS + CT | 6 | 51,8 ± 1,3 | 43 (p0,01) |
| 3 | IrAF + CT | 6 | 29,6 ± 1,5 | 0 NS |
Výsledky z obr. 10 a 11 ukazují extravazaci barviva EB v tenkém střevě a v odpovídajícím plexus choroideus z laterální komory mozku po CT-provokaci střeva s nebo bez předchozí terapie potkanů pomocí Pl (IVCHSKTR).
Experimenty byly prováděny následujícím způsobem: Samci potkana Sprague-Dawiey, o hmotnosti 350 g, byli ponecháni o hladu po 18 hodin před začátkem experimentu, ale měli volně přístupný zdroj vody. Potkani byli rozděleni do skupin po šesti. Peptid Pl, cholera toxin (CT) a PBS byly podávány podle tabulky 3.
Tabulka 3
| Skupina | i.v. ing. 1+ | p.o. inj. | I.v. inj. 2+ |
| A | Pl | CT | EB |
| B | PBS | CT | EB |
| C | PBS | PBS | EB |
+ Pl i.v. injekce 1 byly podány v objemu 2 ml PBS, p.o. injekce roztoku EB v objemu 5 ml;
i.v. injekce 2 se skládala z 1,5 ml 3% roztoku EB v PBS. Ether byl použit jako anestetikum během injekčních podávání.
I.v. injekce Pl (0,5 pg) nebo PBS byly podány 10-15 s před p.o. provokací 100 pg CT nebo PBS. 60 min po perorální provokaci byli potkani uvedeni do anestezie pomocí etheru a i.v. jim
-14CZ 295444 B6 bylo podáno barvivo EB. Barvivo bylo ponecháno ekvilibrovat dalších 30 min. Po této době bylo potkanům podáno znovu anestetikum (ether) a potkani byli perfundováni intrakardiálně přes levou komoru pomocí 250 ml roztoku Alseverova činidla v PBS=50/50 tak, aby bylo odstraněno všechno barvivo přítomné ve vaskulámím systému. Po této perfúzi, která proběhla během 2-3 min, bylo možno pomocí fluorescenční registrace detekovat jen barvivo navázané mimo vaskulámí systém.
Z mozku a části tenkého střeva byly odebrány vzorky a zmrazený na suchém ledu a v kryostatu byly nařezány 8 pm tlusté řezy. Tyto řezy byly vysušeny vzduchem, umístěny v médiu s xylenem a pozorovány v Zeissově fluorescenčním mikroskopu za použití kombinace filtrů, která je používána u fluorescence emitované rodaminem.
Výsledky na obr. 10 a 11 demonstrují, že intenzita fluorescence (bílá barva) je podobná v obou vzorcích - v tenkém střevě (obr. 10) i plexus choroideus (obr. 11) ve skupině A (PÍ i.v. + CT p.o.) a C (PBS i.v. + PBS p.o.). Ve srovnání s vysokou fluorescenční intenzitou v tenkém střevě a v plexus choroideus ve skupině B (PBS i.v. + CT p.o.), výsledky jasně demonstrují, že injekce oktapeptidu před provokací CT inhibuje CT-indukovanou extravaskulámí penetraci EB. Výsledky ukazují, že to platí nejenom pro vaskulámí systém tenkého střeva, ale i pro plexus choroideus v laterální komoře mozku.
Závěrem: Efekt i.v. podaného oktapeptidu TVCHSKTR inhibuje CT-indukovanou extravaskulární penetraci barviva EB v tenkém střevě stejně tak, jako v plexus choroideus v centrálním nervovém systému. Účinek rAF a jeho peptidových derivátů nenacházíme tedy pouze v tenkém střevě, ale ovlivňuje i permeabilitu cév v centrálním nervovém systému. Tato zjištění ukazují, že rAF a jeho deriváty mohou být použity i k odstranění patologického intrakraniálního tlaku, změny tlaku ve středním uchu a různých forem změn permeability.
Použitá literatura
1. Young, R.A. a Davis , R.W. (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 80, 1194-1198.
2. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: a laboratory manuál, str. 1.74-1.84, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
3. Frohman, M. A., Dush,M.K.a Martin, G.R. (1988) Proč. Nati. Acad. Sci,. USA 86, 8998-9002.
4. Laemmli, U.K. (1970) Nátuře 227, 680-685.
5. Zachrisson, G., Largergard, T. a Lonnroth, I. (1986) Acta path. Microbiol. Immunol. Scand. C, 94,227-231.
6. Chomoczynski, P., Sacchi, N.(1987), Anályt. Biochem. 162,156-159.
7. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. (1989) Molecular cloning laboratorymanual, str. 7.40-7.42, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.
8. Jennische, E., Matjka, G.L. (1992) Acta Physiol. Scand. 146,79-86.
9. Lange, S. (1982) FEMS Microbiol. Lett. 15, 239-242.
10. Torres, J.F., Jennische, E, Lange, S. a Lonnroth, I. (1990) Gut 781-785.
11. Lange, S., Delbro DS, Jannische, E., Evans Blue permeation of intestinal mucosa in the rat. Scand. J. Gastroenterol 1994, 29: 38 -46.
-15 CZ 295444 B6
Legenda k obrázkům
Obr. la a dále obr. lb.
Sekvence nukleových kyselin a odpovídající aminokyselinové sekvence nového lidského proteinu.
Obr. lc.
Horizontální mapa ukazující klonovanou cDNA a oligonukleotidové primery.
Obr. 2. Coomassie modře zbarvený SDS-polyakrylamid minigel (A) a imunoblotová proba s antiséry proti části AF (B). Linie s neprimerovými čísly obsahuje glutathion- agaróza-čištěnou GST-AF fúzi proteinů AF-1, AF-2 a AF-3, dále linii s příměrovými čísly obsahující fúzi proteinů rozštěpenou trombinem. Nalevo jsou uvedeny molekulové hmotnosti (R), (BDH). GST-AF-1 fúze proteinu je vysoce degradována, ale imunoblot ukazuje jen detekci celé délky proteinu a spontánních produktů trombinového štěpení. V GST-AF-3 je 26 kDa protein, pravděpodobně konec glutation S-transferázy, který je nezávisle exprimován.
Obr. 3a. Western blot používající antisérum proti rekombinantnímu proteinu AF-2. Byly použity tyto složky: nalevo porcin (P) a tři lidské hypofyzy (Hl, H2, H3) a napravo tři rekombinantní proteiny AF-1, AF-2 a AF-3 (Obr. 2). V centrální části standarta molekulární hmotnosti (R).
Obr. 3b. ELISA u rAF používající antisérum a afínitně čištěné protilátky vyrobené v těle králíka.
Obr. 4. Autoradiogram Northem blotu RNA z lidské a vepřové hypofyzy (p = pooled, i = individualit, materiál). Bylo použito 5 ug čisté mRNA v každé bázi, 3'-koncové oligonukleotidové próby značené 32P byly použity a autoradiografícky vyvíjeny po 7 dní.
Obr. 5. Kryořezy z adenohypofýzy značené s antisérem proti rekombinantnímu proteinu GST-AF-2. A. Řezy inkubované s imunním sérem ukazující buňky s různým stupněm imunoreaktivity (silné šipky). Mnoho buněk postrádá značení (světlé šipky). B. Různé řezy k A inkubované s imunním sérem preabsorbovaným s přebytkem rekombinantního GST-AF-2. Zde není žádné specifické značení buněk. C a D. Značná imunosenzitivita buněk je znázorněna znázorněním cytoplazmy endokrinních buněk, kde n = nukleus a c = cytoplazma.
Obr. 6. Biologická aktivita rAF-Ι testující inhibici CT-indukované sekrece tekutiny. Rostoucí dávky proteinu byly krysám podány i.v. 3 pg CT byly podány do střevní kličky, po 5 h byla měřena akumulace tekutiny (mg/cm střeva). Každá hladina reprezentuje hlavní S.A.E. +/skupiny šesti zvířat.
Obr. 7. Biologická aktivita intraluminámě injikovaného rAf-1; 0,5 pg rAF byl podán 20-30 sec před nebo 90 min po intoxikaci 3 pg CT do střevní kličky krysy.
Obr. 8. Biologická aktivita intraluminámě injikovaného rAf-1; 3 pg rAF byly podány 20-30 sec před nebo 90 min po intoxikaci 3 pg CT do střevní kličky krysy; rAF byl injikován 5 cm proximálně od místa, kam byl aplikován CT.
Obr. 9. A (x2.5) je kontrolní klička (PBS) ukazující celulámí zbytky uvnitř lumen (L), značení na zbývající sliznici není patrné, což svědčí pro úplnou destrukci epitelu. B (0,5 pl Pl před CT podáním) ukazuje jasně epitelie tvořící villi, což svědčí pro normální neporušenou sliznici. L=lumen střeva. Čárky 500 pm. C (xlO) ukazuje destrukci epitelu v PBS-ošetřené kontrolní skupině a D znázorňuje sliznici střeva ve zkoumané skupině (podání Pl). Černá tečka označená šipkou v epitelu, LP=lamina propria, mm=muscularis mucosae, světlá šipka na buňkách krypt.
-16CZ 295444 B6
Čárky =100 pm. E (x25) znázorňují destrukci mukózy v kontrolní skupině (ošetřené PBS) a F ukazuje odpovídající výsledky ze skupiny krys ošetřených Pl před CT podáním. Čárky =100 pm.
Obr. 10. Fluorescence Evans Blue ve vzorku jejunální kličky ze tří skupin krys ošetřených CT nebo kontrolním pufrem (PBS); prošetřených antisekretorickým peptidem Pl nebo kontrolním pufrem (PBS). LP=lamina propria. Černá šipka znázorňuje epitelie; světlá šipka ukazuje buňky krypt. Čárky =100 pm.
Obr. 11. Fluorescence Evans Blue ve vzorku plexus choroideus od krys znázorněných na obr. 10. Čárky = 50 pm.
Claims (16)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology, nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.
- 2. Fragment podle nároku 1, který je vybrán ze skupiny zahrnující: a) aminokyseliny č. 35 až 42, b) aminokyseliny č. 35 až 46, c) aminokyseliny č. 36 až 51, d) aminokyseliny č. 36 až 80 a e) aminokyseliny č. 1 až 80 aminokyselinové sekvence znázorněné v SEQ ID NO: 1.
- 3. Peptid X1VCX2X3KX4R odpovídající fragmentu, který obsahuje aminokyseliny č. 35 až 42 rekombinantního proteinu znázorněného v SEQ ID NO: 1, kde X] je I nebo není zastoupen, X2 je H, R nebo K, X3 je S, L nebo jiná neutrální aminokyselina a X4 je T nebo A.
- 4. Protilátka specifická vzhledem k proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homologům nebo fragmentům, které mají antisekreční aktivitu.
- 5. Kompozice pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u zvířat, včetně člověka, vyznačující se tím, že jako aktivní složku obsahuje účinné množství rekombinantního proteinu znázorněného v SEQ ID NO: 1 nebo jeho homologů nebo fragmentů, které mají antisekreční aktivitu.
- 6. Kompozice podle nároku 5,vyznačující se tím, že fragment je vybrán ze skupiny zahrnující a) aminokyseliny č. 35 až 42, b) aminokyseliny č. 35 až 46, c) aminokyseliny č. 36 až 51, d) aminokyseliny č. 36 až 80 a e) aminokyseliny č. 1 až 80 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO : 1.
- 7. Použití rekombinantního proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homologů nebo fragmentů, které mají antisekreční aktivitu, pro výrobu kompozice pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí u zvířat, včetně člověka.
- 8. Krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí uobratlovců, vyznačující se tí m , že obsahuje jako účinnou přísadu rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology, nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.
- 9. Krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí uobratlovců, vyznačující se tím, že obsahuje jako účinnou přísadu rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus schopný produkovat rekombinantní protein, kterýžto protein má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology, nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.-17CZ 295444 B6
- 10. Použití protilátky specifické vzhledem k rekombinantnímu proteinu, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homologům nebo fragmentům, které mají antisekreční aktivitu, při in vitro zkouškách pro detekci uvedeného proteinu nebo jeho homologů nebo fragmentů.
- 11. Nukleová kyselina kódující rekombinantní protein, který má sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology nebo fragmenty vykazující antisekreční aktivitu.
- 12. Nukleová kyselina podle nároku 11, kde kódované fragmenty jsou vybrány ze skupiny zahrnující: a) aminokyseliny č. 35 až 42, b) aminokyseliny č. 35 až 46, c) aminokyseliny č. 36 až 51, d) aminokyseliny č. 36 až 80 a e) aminokyseliny č. 1 až 80 aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 1.
- 13. Použití nukleové kyseliny, kódující rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu, pro výrobu odpovídajících proteinů nebo homologů nebo fragmentů.
- 14. Vektor obsahující nukleovou kyselinu kódující protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.
- 15. Rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus, který obsahuje vektor zahrnující nukleovou kyselinu kódující rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.
- 16. Rekombinantní bakteriální nebo nehumánní eukaryontní organismus schopný produkovat rekombinantní protein, který má aminokyselinovou sekvenci SEQ ID NO: 1, nebo jeho homology nebo fragmenty, které mají antisekreční aktivitu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SE9502936A SE508609C2 (sv) | 1995-08-24 | 1995-08-24 | Antisekretorisk faktor - dess aminosyrasekvens, nubleinsyrasekvens och användning |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ52098A3 CZ52098A3 (cs) | 1998-09-16 |
| CZ295444B6 true CZ295444B6 (cs) | 2005-08-17 |
Family
ID=20399269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ1998520A CZ295444B6 (cs) | 1995-08-24 | 1996-08-23 | Rekombinantní protein, protilátka, kompozice a krmivo pro normalizaci patologického transportu tekutin a/nebo zánětlivých reakcí, nukleová kyselina, vektor a rekombinantní organismus |
Country Status (28)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US6344440B1 (cs) |
| EP (1) | EP0851876B1 (cs) |
| JP (2) | JP4040679B2 (cs) |
| KR (1) | KR100552947B1 (cs) |
| CN (1) | CN1171902C (cs) |
| AT (1) | ATE270305T1 (cs) |
| AU (1) | AU702589B2 (cs) |
| BG (1) | BG63209B1 (cs) |
| BR (1) | BR9610308A (cs) |
| CA (1) | CA2230111C (cs) |
| CZ (1) | CZ295444B6 (cs) |
| DE (2) | DE69632828T2 (cs) |
| DK (1) | DK0851876T3 (cs) |
| EA (1) | EA001201B1 (cs) |
| EE (1) | EE04501B1 (cs) |
| ES (1) | ES2118683T3 (cs) |
| HU (1) | HU224971B1 (cs) |
| IL (1) | IL123404A (cs) |
| NO (1) | NO320560B1 (cs) |
| NZ (2) | NZ316647A (cs) |
| PL (1) | PL188530B1 (cs) |
| PT (1) | PT851876E (cs) |
| RO (1) | RO120197B1 (cs) |
| SE (1) | SE508609C2 (cs) |
| SI (1) | SI0851876T1 (cs) |
| SK (1) | SK23698A3 (cs) |
| TR (1) | TR199800304T1 (cs) |
| WO (1) | WO1997008202A1 (cs) |
Families Citing this family (18)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE508609C2 (sv) * | 1995-08-24 | 1998-10-19 | Rural Patent Svenska Ab | Antisekretorisk faktor - dess aminosyrasekvens, nubleinsyrasekvens och användning |
| SE9604251L (sv) * | 1996-11-20 | 1997-12-22 | Svenska Lantmaennen Riksfoerbu | Födoämne som vid förtäring inducerar antisekretoriska proteiner |
| SE513496C2 (sv) * | 1998-12-17 | 2000-09-18 | Rural Patent Svenska Ab | NASP-berikad äggula samt dess användning |
| AU5627000A (en) * | 1999-06-21 | 2001-02-05 | Inkine Pharmaceutical Company, Inc. | Angiocidin: a CYS-SER-VAL-THR-CYS-GLY specific tumor cell adhesion receptor |
| GB0322645D0 (en) * | 2003-09-26 | 2003-10-29 | Melacure Therapeutics Ab | Use of antisecretory factor peptides |
| KR20090037992A (ko) | 2006-04-27 | 2009-04-17 | 란트만넨 아스-팍토르 아베 | 항분비 단백질의 추가적 의학 용도 |
| SG171602A1 (en) * | 2006-04-27 | 2011-06-29 | Lantmaennen As Faktor Ab | Use of antisecretory factors for treating intraocular hypertension |
| PL2040734T3 (pl) * | 2006-04-27 | 2012-04-30 | Lantmaennen As Faktor Ab | Białko przeciwwydzielnicze do zastosowania w leczeniu zespołu przedziału |
| RU2341981C2 (ru) * | 2006-07-03 | 2008-12-27 | Государственное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК) | Комплексная пищевая добавка |
| US8901083B2 (en) | 2008-11-25 | 2014-12-02 | Temple University | Administration of angiocidin for the treatment of leukemia |
| JP5820277B2 (ja) * | 2009-02-11 | 2015-11-24 | ラントメネン・アーエス−ファクトール・アーベー | 細胞取込を最適化するための抗分泌性因子（ａｆ）の使用 |
| WO2017009004A1 (en) | 2015-07-10 | 2017-01-19 | Lantmännen As-Faktor Ab | Process for producing egg yolk with high content of af-16 |
| US11407796B2 (en) | 2016-07-18 | 2022-08-09 | Lantmännen As-Faktor Ab | Antisecretory factor 17 |
| WO2020002464A1 (en) | 2018-06-28 | 2020-01-02 | Lantmännen Medical Ab | Antisecretory factor for use in treatment and/or prevention of acute respiratory failure |
| CN112770643A (zh) * | 2018-09-28 | 2021-05-07 | 兰特门内保健食品公司 | 包含麦芽化脱壳燕麦的可消耗产品 |
| WO2020065091A1 (en) | 2018-09-28 | 2020-04-02 | Lantmännen Functional Foods Ab | A consumable product comprising malted wheat |
| EP4125984A1 (en) | 2020-03-26 | 2023-02-08 | Lantmännen Functional Foods AB | A consumable product comprising malted cereals for promoting recovery at physical activity |
| WO2026099453A1 (en) | 2024-11-07 | 2026-05-15 | Lantmännen Medical Ab | Af-16 or af-17 for acute treatment of brain oedema in patients with traumatic brain injury |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE508609C2 (sv) * | 1995-08-24 | 1998-10-19 | Rural Patent Svenska Ab | Antisekretorisk faktor - dess aminosyrasekvens, nubleinsyrasekvens och användning |
-
1995
- 1995-08-24 SE SE9502936A patent/SE508609C2/sv not_active IP Right Cessation
-
1996
- 1996-08-23 DE DE69632828T patent/DE69632828T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 CN CNB961973005A patent/CN1171902C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 AT AT96929619T patent/ATE270305T1/de active
- 1996-08-23 PT PT96929619T patent/PT851876E/pt unknown
- 1996-08-23 TR TR1998/00304T patent/TR199800304T1/xx unknown
- 1996-08-23 PL PL96325114A patent/PL188530B1/pl unknown
- 1996-08-23 EE EE9800055A patent/EE04501B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 DK DK96929619T patent/DK0851876T3/da active
- 1996-08-23 NZ NZ316647A patent/NZ316647A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 CZ CZ1998520A patent/CZ295444B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 US US09/029,333 patent/US6344440B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 KR KR1019980701343A patent/KR100552947B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 EP EP96929619A patent/EP0851876B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 RO RO98-00364A patent/RO120197B1/ro unknown
- 1996-08-23 BR BR9610308-6A patent/BR9610308A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 DE DE0851876T patent/DE851876T1/de active Pending
- 1996-08-23 HU HU9900137A patent/HU224971B1/hu unknown
- 1996-08-23 CA CA2230111A patent/CA2230111C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 WO PCT/SE1996/001049 patent/WO1997008202A1/en not_active Ceased
- 1996-08-23 ES ES96929619T patent/ES2118683T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 SK SK236-98A patent/SK23698A3/sk unknown
- 1996-08-23 IL IL12340496A patent/IL123404A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-23 JP JP51018597A patent/JP4040679B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-23 AU AU68932/96A patent/AU702589B2/en not_active Expired
- 1996-08-23 SI SI9630013T patent/SI0851876T1/xx unknown
- 1996-08-23 EA EA199800221A patent/EA001201B1/ru not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-02-23 NO NO19980743A patent/NO320560B1/no not_active IP Right Cessation
- 1998-02-24 BG BG102280A patent/BG63209B1/bg unknown
-
1999
- 1999-08-20 NZ NZ337380A patent/NZ337380A/en not_active IP Right Cessation
-
2001
- 2001-11-26 US US09/991,792 patent/US20020099016A1/en not_active Abandoned
-
2007
- 2007-07-25 JP JP2007193054A patent/JP2008043331A/ja not_active Withdrawn
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP2008043331A (ja) | 病理学的浸透性の変化を調節する抗分泌性因子ペプチド | |
| Saruta et al. | Expression and localization of chromogranin A gene and protein in human submandibular gland | |
| US7781188B1 (en) | Nucleotide and protein sequences of Nogo genes and methods based thereon | |
| US20050037955A1 (en) | Therapeutic protein and treatments | |
| US20030113867A1 (en) | Prokineticin polypeptides, related compositions and methods | |
| Eib et al. | A Novel Transmembrane Protein with Epidermal Growth Factor and Follistatin Domains Expressed in the Hypothalamo‐Hypophysial Axis of Xenopus laevis | |
| Aunis et al. | Chromogranins: current concepts: structural and functional aspects | |
| US20090081786A1 (en) | Peptide sequences for modulation of protein kinase C | |
| Allaeys et al. | Characterization of MCH‐gene‐overprinted‐polypeptide‐immunoreactive material in hypothalamus reveals an inhibitory role of pro‐somatostatin1− 64 on somatostatin secretion | |
| Lamers et al. | Comparative study of plasma pancreatic polypeptide responses to food, secretin, and bombesin in normal subjects and in patients with chronic pancreatitis | |
| Wu et al. | Comparative study of enterostatin sequence in five rat strains and enterostatin binding proteins in rat and chicken serum | |
| Nock | Development of an enzyme immunoassay and cellular function assays to probe the function of teneurin C-terminal associated peptide (TCAP) | |
| EP1506971A1 (en) | Prokineticin polypeptides, related compositions and methods | |
| Zesheng | Identification and functional analysis of new chromogranin-derived peptides | |
| HK1018468B (en) | Antisecretory factor peptides regulating pathological permeability changes | |
| von der Heide et al. | Interaction of guanosine 5′-triphosphate binding protein Gq from Sepia officinalis with illuminated rhodopsin bound to concanavalin A |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MK4A | Patent expired |
Effective date: 20160823 |