CZ295997A3 - Způsob kultivace buněk - Google Patents
Způsob kultivace buněk Download PDFInfo
- Publication number
- CZ295997A3 CZ295997A3 CZ972959A CZ295997A CZ295997A3 CZ 295997 A3 CZ295997 A3 CZ 295997A3 CZ 972959 A CZ972959 A CZ 972959A CZ 295997 A CZ295997 A CZ 295997A CZ 295997 A3 CZ295997 A3 CZ 295997A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- cell
- tissue
- neurons
- neural
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 24
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 6
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims abstract description 27
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 103
- 210000003061 neural cell Anatomy 0.000 claims description 27
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 25
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 claims description 17
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 claims description 8
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 claims description 6
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 claims description 6
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 claims description 6
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 5
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 5
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- 102100029457 Adenine phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 108010024223 Adenine phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 claims description 4
- 102000004310 Ion Channels Human genes 0.000 claims description 4
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 claims description 4
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 claims description 4
- OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N acetylcholine Chemical compound CC(=O)OCC[N+](C)(C)C OIPILFWXSMYKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960004373 acetylcholine Drugs 0.000 claims description 4
- 230000003291 dopaminomimetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 4
- 210000001222 gaba-ergic neuron Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 claims description 4
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 claims description 4
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 4
- 108090000932 Calcitonin Gene-Related Peptide Proteins 0.000 claims description 3
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 claims description 3
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 3
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 claims description 3
- 230000002295 serotoninergic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000001685 thyroid gland Anatomy 0.000 claims description 3
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 claims description 2
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 2
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 claims description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims description 2
- 102100020941 Interleukin-4 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010025815 Kanamycin Kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 208000018737 Parkinson disease Diseases 0.000 claims description 2
- 208000027089 Parkinsonian disease Diseases 0.000 claims description 2
- 206010034010 Parkinsonism Diseases 0.000 claims description 2
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 claims description 2
- 108010034949 Thyroglobulin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000003911 Thyrotropin Receptors Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000253 Thyrotropin Receptors Proteins 0.000 claims description 2
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 claims description 2
- 230000000768 catecholaminergic effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001713 cholinergic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000002932 cholinergic neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000001653 corpus striatum Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 claims description 2
- 230000002124 endocrine Effects 0.000 claims description 2
- 230000003371 gabaergic effect Effects 0.000 claims description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 claims description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 claims description 2
- 210000000274 microglia Anatomy 0.000 claims description 2
- 201000006417 multiple sclerosis Diseases 0.000 claims description 2
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000002858 neurotransmitter agent Substances 0.000 claims description 2
- 108700025694 p53 Genes Proteins 0.000 claims description 2
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 claims description 2
- 210000002951 peptidergic neuron Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000004116 schwann cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 2
- 210000003523 substantia nigra Anatomy 0.000 claims description 2
- 229960002175 thyroglobulin Drugs 0.000 claims description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 2
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims 11
- 239000007943 implant Substances 0.000 claims 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 2
- 102000056834 5-HT2 Serotonin Receptors Human genes 0.000 claims 1
- 108091005479 5-HT2 receptors Proteins 0.000 claims 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 claims 1
- 102000004414 Calcitonin Gene-Related Peptide Human genes 0.000 claims 1
- 108010058699 Choline O-acetyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 102100023460 Choline O-acetyltransferase Human genes 0.000 claims 1
- 208000003098 Ganglion Cysts Diseases 0.000 claims 1
- 101000927562 Homo sapiens Dopamine beta-hydroxylase Proteins 0.000 claims 1
- 208000005400 Synovial Cyst Diseases 0.000 claims 1
- 102100033504 Thyroglobulin Human genes 0.000 claims 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 claims 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims 1
- 210000003372 endocrine gland Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 claims 1
- 230000000285 glutaminergic effect Effects 0.000 claims 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 claims 1
- 201000010901 lateral sclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims 1
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 claims 1
- 208000005264 motor neuron disease Diseases 0.000 claims 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 claims 1
- 210000000478 neocortex Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004738 parenchymal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 claims 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 claims 1
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 10
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 5
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 5
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 5
- 241001045988 Neogene Species 0.000 description 4
- 101150091879 neo gene Proteins 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 description 3
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 3
- IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N ganciclovir Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2COC(CO)CO IRSCQMHQWWYFCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229960002963 ganciclovir Drugs 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 3
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 3
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 3
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 3
- 102100038518 Calcitonin Human genes 0.000 description 2
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108010042681 Galactosylceramidase Proteins 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 230000002989 hypothyroidism Effects 0.000 description 2
- 208000003532 hypothyroidism Diseases 0.000 description 2
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000001259 mesencephalon Anatomy 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 210000003594 spinal ganglia Anatomy 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 1
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 1
- 102000000311 Cytosine Deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010080611 Cytosine Deaminase Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000003974 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 1
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100028496 Galactocerebrosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000008109 Mixed Function Oxygenases Human genes 0.000 description 1
- 108010074633 Mixed Function Oxygenases Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 101150003725 TK gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009843 Thyroglobulin Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- -1 acetyl- Chemical group 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004960 anterior grey column Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 1
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 1
- 210000004002 dopaminergic cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 206010015037 epilepsy Diseases 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N flucytosine Chemical compound NC1=NC(=O)NC=C1F XRECTZIEBJDKEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004413 flucytosine Drugs 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000000848 glutamatergic effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 1
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 description 1
- 230000001722 neurochemical effect Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 229940127073 nucleoside analogue Drugs 0.000 description 1
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001026 paleocortex Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 230000036266 weeks of gestation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Předložený vynález se týká způsobů kultivace buněk, zejména způsobů kultivace buněk pro přípravu v podstatě homogenní populace buněk (například neuronových buněk) in vitro. Vynález se dále týká neurálnich buněk (například lidských neurálních buněk), které mají zabudovány selekční markéry (například pozitivní a/nebo negativní selekční markéry).
Dosavadní stav techniky
Centrální nervová soustava je v současné době předmětem intenzivního zkoumání, ale její mimořádná složitost na buněčné úrovni působí proti úplnému pochopení její funkce. Zatímco se stále více rozvíjejí selektivní postupy označování specifických subpopulací neurálních buněk ex vivo (jako imunodetekce, histochemie hybridizací in šitu atd.), separace a purifikace těchto subpopulací jako živých buněk přináší vážné potíže.
S ohledem na tento problém jsou používány různé přístupy. Například se používají techniky, jako je diferenciální odstředbvání, pro obohacování specifických neurálních buněčných fenotypů. Další metody jsou založeny na použití specifických substrátů specifických pro fluorescenční buňky k označení subpopulací buněk, nebo na použití fluorescenčních stopovacích barviv vstřikovaných do specifické terminační oblasti daného souboru neuronů (Schaffner a kol. (1987), J. Neuroscience 7:3088). V každém případě probíhá oddělování označených buněk od neoznačených buněk tříděním fluorescencí aktivovaných buněk (fluorescence-activated cell sorting, FACS).
Další postup je založen na identifikaci na extracelulární membráně vázaných markérů specifických pro daný buněčný typ (Urakami & Chiu (1990), J. Neuroscience 10:620). V tomto případě je dosaženo oddělení nanesením populace smíšených buněk na adherentní vrstvu protilátky za vzniku komplexů buňka-protilátka, • « • · · · · · ·· · · • · · · Ω · · · · · ······ · z nichž mohou být buňky, o které je zájem, později disociovány pro další studium.
Podle dalšího známého postupu jsou originální buňky, z nichž vzniká specifická buněčná populace, imortalizovány transdukcí onkogenu nebo subkultivací samovolných buněčných výrůstků.
Pravděpodobně s výjimkou techniky imortalizace prekurzorových buněk, nenabyla většina těchto postupů všeobecného použiti. Castecne je to diky mimořádné heterogenitě fenotypů v centrálním nervovém systému, takové, že použité markéry a separativní techniky musí být maximálně specifické, aby se zabránilo křížovým reakcím s nežádoucími buněčnými typy.
Za druhé je stupeň purifikace, požadovaný pro získání homogenity, často v rozsahu dvou nebo více řádů; takové obohacení je příliš velké pro FACS nebo nanášení na vrstvu protilátky; výsledkem je určitý stupeň kontaminace.
Za třetí je dostupnost dostatečně hojných, avšak přitom ještě adekvátně specifických extracelulárních markérů, které jsou běžné také pro lépe charakterizované neurální buněčné skupiny (například dopaminergické buňky nebo glutamatergické buňky), omezená.
Dále vyžaduje většina z těchto známých obohacovacích technik relativně nezralé neurální buňky, aby se zabránilo jejich destrukci v průběhu postupu.
Konečně jsou tyto úvahy ještě mnohem více omezeny u lidských neurálních buněk vzhledem k potížím, které jsou při získávání potřebných množství čerstvé lidské mozkové tkáně.
Podstata vynálezu
Předložený vynález poskytuje způsob selektivní kultivace preselektované subpopulace buněk z heterogenní populace in vitro, obsahující kroky:
(a) vnesení selekčního markéru (například pozitivního a/nebo negativního selekčního markéru) do heterogenní buněčné populace, • · ···· přičemž markér podléhá v preselektované subpopulaci diferenciální expresi/aktivitě; a (b) selektivní kultivace preselektované subpopulace na bázi diferenciální exprese/aktivity selekčního markéru v ní.
Preselektovanou subpopulaci buněk může být v podstatě homogenní populace buněk konkrétního buněčného typu nebo buněčné třídy. Například může být preselektovanou subpopulaci konkrétní třída neurálních buněk. V případě neurálních buněk může být preselektované populace selektována na základě charakteristik transmiteru, například mohou být postupem podle tohoto vynálezu selektivně kultivovány neurony obsahující dopamin nebo acetylcholin.
Selekční markéry nemusí být vneseny do každé buňky tvořící heterogenní buněčnou populaci; pro většinu účelů je postačující, když selekční markéry přijme výrazná část buněk.
Výhodně se však selekční markér (markéry) zabudovávají do většího podílu (například v podstatě do celé) heterogenní buněčné populace.
Jak je zde doloženo, postup podle vynálezu nalezne konkrétní využití při selektivní kultivaci specifických tříd v podstatě normálních neurálních buněk. Postup podle předloženého vynálezu má ale i obecné použití a může být použit pro selektivní kultivaci jiných subpopulaci buněk.
Ze stavu techniky je známo, že neurální buňky savců mohou být transdukovány heterologním genetickým materiálem. Pro transdukci eukaryotických a jiných buněk existuje mnoho metod, ale charakteristiky neurálních buněk jsou takové, že přirozené postupy transfekce jsou v současnosti nejvýhodnější (Miller (1992), Nátuře 357:455). Například transdukce virově obaleným genetickým materiálem je nejen účinnější, ale rovněž má za následek nižší úmrtnost neurálních buněk během aktuálního postupu, než ke které dochází například při vysrážení fosforečnanem vápenatým, elektroporaci, ostřelování mikroprojektily nebo při mikroinjekci. Transdukce savčích neurálních buněk z centrální nervové soustavy in vivo (Culver a kol. (1992), Science 256:1550) i in vitro (Stringer & Foster (1994,) Brain Res 79:267) byly popsány.
• · · · · · ·· β ···«·· · ···· · · · ·· · · · · · · · · ··· · Η · · · · · · · ······ · · · · · ·· ·
Genetický materiál, který může být zaveden do žijících buněk, může zahrnovat jak pozitivní, tak negativní selekční markér. Pozitivní selekční markér je takový, který umožní transdukované buňce přežít za podmínek, které by usmrtily buňky neexprimující selekční fenotyp. Negativní selekční markér propůjčuje citlivost buňkám, které ho exprimují, takže jsou ničeny za podmínek, které jsou pro jiné buňky relativně neškodné.
Je dostupná široká řada selekčních markérů. Geny, které jsou široce aplikované jako pozitivní selekční markéry, zahrnují bakteriální fosfotransferázu neomycinu (neo; Colbere-Garapin a kol. (1981), J. Mol. Biol. 150:1), hygromycinfosfotransferázu (hph; Santerre a kol. (1984), Gene 30:147) a xanthinguaninfosforibosyltransferázu (gpt; Mulligan & Berg (1981), Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:2072).
Také se používají jako pozitivní selekční markéry thymidinkináza viru herpes simplex typu 1 (HSV-1 TK ; Wigler a kol. (1977), Cell 11:223), adeninfosforibosyltransferáza (APRT; Wigler a kol. (1979), Proč. Nati. Acad. Sci., USA 76:1373) a hypoxanthinfosforibosyltransferáza (HPRT; Jolly a kol. (1983), Proč. Nati. Acad. Sci., USA 80:477). Tyto posledně uvedené markéry musejí být použity v buňkách, které mají zvláštní mutantní genotyp (totiž takový, který vede k deficitu genového produktu, na němž je selekce založena).
Výhodné negativní selekční markéry zahrnují geny kódující produkty týkající se programové buněčné smrti (apoptózy), například gen pro p53. Tyto negativní selekční markéry mohou být aktivovány vyvoláním exprese dotyčného genu (například použitím promotoru citlivého na tetracyklin, jak je popsáno dále). Použití genů, kódujících produkty účastnící se apoptózy, má tu výhodu, že dočasná exprese (v mnoha případech 30 minut nebo méně) genu může být postačující k zániku buňky, a umožňuje tak spolehlivou a velice ostrou negativní selekci.
Některé z výše uvedených genů také dodávají negativní stejně jako pozitivní selekční fenotypy. Tyto geny zahrnují HSV-1, APRT, HPRT a gpt. Tyto geny kódují enzymy, které mohou katalyzovat konverzi jistých nukleosidových nebo purinových analogů na cytotoxické meziprodukty. Například nukleosidový analog ganciclovir (GCV) je dobrým substrátem pro HSV-1 thymidinkinázu, ale špatným substrátem pro přirozenou thymidinkinázu nacházející se v buňkách savců. V důsledku toho může být použit GCV pro účinnou negativní selekci proti buňkám exprimujícím gen HSV-1 TK (St. Clair a kol. (1987), Antimicrob. Agents Chemotherap. 31:844).
Xanthinguaninfosforibosyltransferáza může být použita pro pozitivní i negativní selekci v případě exprese ve standardních buňkách (Besnard a kol. (1987), Mol. Cell Biol. 7:4139). Cytosindeamináza může být rovněž použita jako negativní selekční markér, převádějící neškodný 5-fluorcytosin na cytotoxický 5fluorouracil (Polák & Scholer (1976), Chemotherapy (Basel) 21:113).
Selekční markéry se obvykle používají jak v prokaryotickém, tak v eukaryotickém genetickém inženýrství, aby umožnily ze směsné populace buněk izolaci těch, které prodělaly výjimečnou genetickou změnu. Například mohou být použity ve fyzikálním spojení s jiným genem, který kóduje produkt zájmu, aby se selektovaly buňky, které přibraly tento další gen spolu se selekčním markérem. Příkladně byl neo gen použit k monitorování geneticky modifikovaných buněk odebraných ze vzorku pacienta, který se podrobil genové terapii.
Rovněž bylo navrženo použít negativní selekční markéry jako bezpečnostní prostředky v genové terapii (Lupton a kol. (1991), Mol. Cell Biol. 11:3374). Mnoho genových terapií zahrnuje odebrání somatických buněk pacientovi, zavedení terapeutického genu do nich (jehož exprese vede k opravě opětovným přenesením buněk do biochemické leze), s následným pacienta. Jelikož se opětovně zavedené geneticky modifikované buňky mohou v konečném důsledku projevit jako škodlivé pro zdraví pacienta (například pokud se projeví jako imunologicky nekompatibilní nebo se stávají maligními), může být spolu s terapeutickým genem zaveden negativní selekční markér, aby se umožnila (pokud je to nezbytné) následná selektivní eliminace geneticky modifikovaných buněk.
Byla připravena řada vektorů negativní selekční markéry, a pro techniky jsou tyto snadno dostupné nesoucích pozitivní nebo odborníka v dané oblasti (viz např. Miller (1992), • · · · · ·
Nátuře 357:455). Ostatní mohou být snadno sestaveny použitím standardních postupů klonování genů.
Postup podle vynálezu může zahrnovat předchozí indukci nebo replikaci ve směsné populaci embryonálních neurálnich buněk, použití doplňku do kultivačního media, jako je epidermálni růstový faktor nebo fibroblastový růstový faktor, nebo předchozí transfekci imortalizačními onkogeny k vyvolání takové replikace. Alternativně lze použít neexpandující buněčné kultury.
Výhodně j sou buňky v časném stupni po očkování transdukovány pozitivním selekčním markérem a negativním selekčním markérem, oběma operabilně vázanými s prvkem exprese. Prvek exprese může být specifický pro danou oblast centrální nervové soustavy, daný typ neurálnich buněk nebo specifickou subpopulaci neuronů. Po dosažení požadované úrovně expanze kultivace mohou být buňky ponechány, alespoň částečně, aby se diferencovaly. Potom se aplikuje příslušné léčivo, takže se odstraní netransdukované buňky a buňky transdukované bez aktivního specifického prvku exprese, zatímco transdukované buňky s aktivním prvkem (který vede k expresi následujících selekčních markérů) budou rezistentní.
Prvky exprese pro použití podle vynálezu mohou být příkladně vybrány z: promotorů a/nebo zesilovačů transkripce, které jsou specificky účinné v:
(i) dopaminergických, serotoninergických, GABAergických, cholinergních nebo peptidergických neuronech nebo jejich subpopulacich; (ii) Schwannových buňkách, oligodendrocytech, astrocytech, mikrogliích a jejich subpopulacích; (iii) konkrétních stadiích embryogeneze a (iv) jiných specifických tkáních, jiných než neurálnich. Zvláště výhodné pro použití podle předloženého vynálezu jsou na tetracyklin citlivé promotory popsané například Furthem a kol., (1994), PNAS USA (sv. 91, str. 9302-9306). Tyto promotory mohou být použity jako prvek v regulačním systému citlivém na tetracyklin, k ovlivnění časové a/nebo prostorové regulace genové exprese in vivo.
Alternativně mohou být vybrány z promotorů a/nebo zesilovačů transkripce, které řídí transkripci genů pro: (i) receptory specifické pro neurotransmitery; (ii) iontové kanály; (iii) receptory účastnící se hradlování (gating) iontových kanálů;
• · • · · · · · (ív) cytokiny, růstové faktory a hormony a (v) jakoukoliv substanci, která je specificky produkována a vylučována parakrinním, autokrinním nebo endokrinním způsobem. Příklady jsou v tabulce 1.
Vynález poskytuje způsob kultivace lidských a jiných savčích buněk (například neurálních buněk) a produkce homogenních kultur jednotlivého buněčného typu selekcí na subpopulaci buněk na bázi genetického materiálu v nich obsaženého.
Tyto kultury mohou mít různá použití včetně základních elektrofyziologických, neurochemických a vývojových experimentů. Dále mohou být populace purifikovaných neurálních buněk užitečné v mnoha klinicky použitelných studiích, jako je stanoveni uskutečnitelnosti transplantace ke zmírnění symptomů degenerativních onemocnění centrální nervové soustavy, a mohou nacházet použití při různých formách léčení, prevence a diagnostiky.
Uvedená onemocnění zahrnují: (i) Parkinsonovu nemoc nebo parkinsonismus, přičemž preselektovanou subpopulaci buněk jsou dopaminergické neurony substantia nigra; (ii) Huntingtonovu nemoc, přičemž preselektovanou subpopulaci buněk jsou neurální buňky z corpus striatum; (iii) preselektovanými subpopulacemi acetylcholin, serotonin a/nebo paleokortexem; nebo (iv)
Alzhe imerovu buněk j sou noradrenalin, nemoc, neurony spojené sklerózu multiplex, pricemz obsahuj ící s neo- a
V I v v pricemz preselektovanou subpopulaci buněk jsou oligodendrocyty mozku.
flflfl fl fl
TABULKA 1 • ···· ·· β • flflfl • · 9 fl fl · • ·
| Promotor | Tkáň/typ buňky | Aplikace | Odkaz |
| Tyrosin | Katecholaminergické | Alzheimer.nemoc | Stachowick a kol.(1994) |
| hydroxyláza | neurony | Parkinson. nemoc | Mol Brain Res 22,309-19 |
| TSH receptor | Buňky štítné žlázy | Hypotyreóza | Ikuama & Nakata (1994) Jap J Clin Med 52,962-8 |
| BSF1 | GABAergické neurony | Epilepsie | Motejlek a kol. (1994) Biol Chem 269,15265-73 |
| Lidská dopamin | Neurony | Alzheimerova | Hoyle a kol. (1994) |
| β-hydroxy1á z a | noradrenalinu | nemoc | Nerosci 14,2455-63 |
| Tyreoglobulin | Buňky štítné žlázy | Hypotyreóza | Pichon a kol. (1994) Biochem J 298,537-41 |
| Serotonin 2- | Gliové buňky v šero- | Neurodegenera- | Ding a kol. (1994) Mol |
| receptor | toninergních projekčních oblastech | tivní choroby | Brain Res 20,181-91 |
| CD4 receptor | CD4 exprimující lymfocyty | AIDS | Nakayama a kol. (1963) Int Immunol 5,817-24 |
| Lidská cholin | Acetyloholinové | Alzheimer.nemoc | Li a kol. (1963) |
| acetyl- | neurony | Motoneuronová | Neurochem Res |
| transferáza | onemocnění | 18,271-5 |
·· ····
Φ · · • · · ··· · ···· • · ·
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava homogenní kultury lidských dopaminergických neuronů Gen thymidinkinázy (tk) viru Herpes simplex (HSV) a gen neo jsou operabilně vázány na promotor, který je aktivní pouze v neuronech obsahujících dopamin, například kontrolujících expresi tyrosinhydroxylázy (viz, např. Harrington a kol. (1987), Nucl. Acids Res. 15:2363). Konstrukt se potom klonuje do vhodného klonovacího místa retrovirálního vektoru a použije se k transfekci amfotropní retrovirové obalující buněčné linie (např. ψ-forma (crip) (přehled viz Molecular Virology: A Practical Approach (ed. AJ Davison & RM Elliott), IRL Press, 1993).
Tkáň se oddělí z ventrálního středního mozku lidského embrya (přibližně 5-8týdenního těhotenství) a pěstuje v disociované kultuře. Dopaminergické prekurzorové buňky se navodí k replikaci použitím fibroblastového růstového faktoru (Mayer a kol. (1993), Neuroscience 56:389), epidermálního růstového faktoru (Reynolds & Weiss (1992), Science 255:1707) nebo onkogenní transdukcí (Stringer a kol. (1994), Brain Res. 79:267), Krátce po očkování se kultivované buňky transdukují retrovirálně obalenými selekčními markéry a kultury se ponechají expandovat. Když je vyprodukován dostatečný počet buněk, inkubuji se kultury za podmínek vedoucích k zastavení dělení neuronů. Potom se kultury ošetří geneticinem, aby se eliminovaly netransdukované buňky a transdukované buňky neexprimující tyrosinhydroxylázu, ale ponechají se transdukované neurony obsahující tyrosinhydroxylázu.
Příklad 2
Příprava homogenní kultury lidských oligodendrocytů Gen thymidinkinázy (tk) viru Herpes simplex (HSV) a gen neo jsou operabilně vázány na promotor, který je aktivní pouze v oligodendrocytech, řídící expresi oligodendrocyticky specifického enzymu galaktocerebrosidázy. Konstrukt je virově obalen jako v příkladu 1. Alternativně lze použít virus, jako je adenovirus. Tkáň z embryonálního nebo dospělého mozku se oddělí a kultivuje v disociované kultuře. Pokud je nezbytné, indukuje se buněčná replikace (například použitím buněk z myší HS2ts6 (Noble a
9999 • · · · • · • · • ·
kol. (1991), WO 91/13150), a krátce po očkování se buňky transdukují geny kódujícími pozitivní selekční markér vázaný například na promotor galaktocerebrosidázy, a negativní selekční markér vázaný na přirozeně aktivní promotor, jako je cytomegalovirus. Buněčná selekce se provede jako v příkladu 1 a poskytne čisté populace oligodendrocytů.
Příklad 3
Příprava homogenní kultury v podstatě normálních lidských buněk ganglia dorzálního kořene exprimujících peptid příbuzný genu kalcitoninu
Neurony z ganglií dorzálního kořene (DRG) se mohou kultivovat in vivo při použití jako zdroje materiálu embryonální, neonatální nebo dospělé tkáně. Směsná buněčná populace se kultivuje například na podkladové vrstvě například předem připravených jiných než neuronálních buněk odolných proti neomycinu za vzniku trofického nosiče (Brenneman a kol. (1987), J. Cell Biol. 104:1603). DRG buňky se transfikují adenovirovou technologií genem neo vázaným operabilně na promotor exprese peptidu příbuzného genu kalcitoninu (CGRP). Po několika dnech pro umožnění aktivace promotoru a tím indukování exprese neo se DRG buňky, které aktivně neexprimuji neo, zničí použitím neomycinu. Výsledkem je čistá populace diferenciovaných CGRP-pozitivních neuronů z lidských DRG pro použití in vitro.
Příklad 4
Transdukce neurálních buněk
Primární buňky z fetální (z 8. týdnu těhotenství) lidské kůry, corpus striatum, hypothalamu, mezencefalonu, komplexního švu, prodloužené míchy a ventrálního rohu míchy byly odděleně očkovány do baněk potažených želatinou/poly-L-lyzinem. Prostředím byla směs DMEM/Harrks F12 (1:1) obsahující penicilin/streptomycin,
L-glutamin (2mM) a modifikovaný zásobní roztok (Bottenstein a Sáto, PNAS 76(1979)514-517; Romijn a kol., J. Neurophysiol. 40(1981)1132-1150), který obsahuje bazický fibroblastový růstový faktor (5 ng/ml).
Jakmile buňky přilnuly, byly do prostředí společně s 0,8 pg/ml polybrenu přidány retrovirální částice obsahující konstrukt ·· ·♦·· (tsA58) zahrnující vázaný na promotor nahrazeno čerstvým markér odolnosti proti geneticinu (GR18r) SV4OT. Po 1 hodině bylo kultivační medium mediem. Po 5 dnech byl do kultivačního prostředí přidáván po dalších 10 dní geneticin (0,4 mg/ml), aby se vymýtily buňky, které nemají zabudovaný retrovirový vektor.
Po 15 až 20 dnech bylo možno zjistit ve všech oblastech uvedených výše shluky lidských prekurzorových neurálních buněk, které byly schopné replikace v prostředí obsahujícím FGF a které byly rovněž odolné vůči geneticinu. Všechny vykazovaly neuronální fenotyp (byly například pozitivní na neuronově specifickou enolázu).
Takto je možné transdukovat stabilní lidské neurální buňky z různých oblastí centrální nervové soustavy retrovirově obalenými genovými konstrukty. Za druhé může konstrukt zahrnovat selekční znak, jako je odolnost vůči geneticinu.
Claims (16)
1. Step nebo tkáňový implantát obsahující buňky, které mají v sobě zabudovaný pozitivní selekční markér operabilně vázaný na tkáňově nebo buněčně specifický prvek exprese.
2. Způsob přípravy v podstatě čisté subpopulace buněk vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
(a) poskytnutí heterogenní buněčné populace in vitro;
(b) transfekce, infekce, například retrovirovým vektorem, nebo transdukce heterogenní buněčné populace pozitivním selekčním markérem operabilně vázaným na tkáňově nebo buněčně specifický prvek exprese za vzniku transfikované nebo transformované heterogenní buněčné populace;
(c) selektivní kultivace subpopulace buněk z heterogenní buněčné populace z kroku (b) na základě tkáňově nebo buněčně specifické exprese pozitivního selekčního markéru za vzniku v podstatě čisté subpopulace buněk.
3. Štěp nebo tkáňový implantát podle nároku 1 nebo způsob podle nároku 2, kde buňky dále obsahují negativní selekční markér, například produkt/produkty kódující gen účastnící se programované smrti buňky nebo apoptózy, například gen p53.
4. Vynález podle nároku 3, kde negativní selekční markér nepodléhá diferenciální expresi/aktivitě, například je exprimován přirozeně.
5. Vynález podle některého z předchozích nároků, kde buňky jsou neurální buňky, například neurony.
6. Vynález podle nároku 5, kde buňky jsou lidské neurální buňky, buňky štítné žlázy, CD4 exprimující T-lymfocyty nebo buňky ze specifické neneurální tkáně.
7. Vynález podle nároku 5 nebo 6, kde buňky jsou neurální buňky vybrané z dopaminergických, glutaminergických, katecholaminergických nebo GABAergických neuronů, neuronů noradrenalinu, gliových buněk ze serotoninergických projekčních •9 9999 * 9 9999 9 99
99 9 99 9 · * 999 9*·
9 9 9 9 9 9
9 9 *
9 9 9
9 999 9
9 9
99 9 oblastí, acetylcholinových neuronů nebo gangliových buněk lidského dorzálního kmene exprimujících peptid příbuzný genu kalcitoninu.
8. Vynález podle některého z předchozích nároků, kde tkáňově nebo buněčně specifický prvek exprese je vybrán z:
(A) promotorů a/nebo zesilovačů transkripce, které jsou specificky účinné v:
(i) dopaminergických, serotoninergických, GABAergických, cholinergních nebo peptidergických neuronech a jejich subpopulacích;
(ii) Schwannových buňkách, oligodendrocytech, astrocytech, mikrogliích a jejich subpopulacích;
(iii) konkrétních stadiích embryogeneze;
(iv) specifické neneurální tkáni;
(v) endokrinních žlázách, plicích, svalech, pohlavních žlázách, vnitřnostech, kosterní tkáni nebo jejich části nebo částech;
(vi) epiteliálních, fibroblastových, tukových, žírných, mezenchymálních nebo parenchymálních buňkách, (vii) složkách krevního systému, například T-lymfocytech,
B-lymfocytech a makrofágách; nebo (B) promotorů/zesilovačů transkripce, které řídí transkripci genů pro:
(i) neurotransmiterově specifické receptory;
(ii) iontové kanály;
(iii) receptory účastnící se hradlování iontových kanálů a (iv) cytokiny, růstové faktory a hormony;
(v) jakoukoliv látku, která je specificky produkována a vylučována parakrinním, autokrinním nebo endokrinním způsobem.
9. Vynález podle nároku 8 (B), kde je promotor vybrán z promotorů pro tyrosinhydroxylázu, TSH receptor, BSF1, β-hydroxylázu lidského dopaminu, thyreoglobulin, serotonin-2-receptor, CD4 receptor a acetyltransferázu lidského cholinu.
10. Vynález podle některého z předchozích nároků, kde je pozitivní selekční markér vybrán z neomycinfosfotransferázy, hygromycinfosfotransferázy, xanthinguanidinfosforibosyltransferázy, thymidinkinázy viru Herpes simplex typu I, ·· ···· • · · • · · 999 9
9 · · ·· · adeninfosforibosyltransferázy a hypoxanthinfosforibosyltransferázy.
11. Způsob podle některého z nároků 2 až 10, kde heterogenní buněčnou populací je primární buněčná kultura, například lidská jako je fetální - primární neurální buněčná kultura, například obsahující neurální kmenové/prekurzorové buňky.
12. Buňky získatelné postupem podle některého z nároků 2 až 11.
13. Štěp nebo tkáňový implantát podle některého z nároků 1 a 3 až 10 nebo buňky podle nároku 12 pro použití při léčení, prevenci nebo diagnostice.
14. Štěp nebo tkáňový implantát podle některého z nároků 1 a 3 až 10 nebo buňky podle nároku 12 pro výrobu léčiva pro použití při léčení, prevenci nebo diagnostice.
15. Vynález podle nároku 13 nebo nároku 14, kde léčením je transplantační terapie.
16. Vynález podle nároku 15, kde transplantační terapie je pro léčení:
(i) Parkinsonovy nemoci a/nebo parkinsonismu, přičemž buňkami jsou dopaminergické neurony substantia nigra;
(ii) Huntingtonovy chorey, přičemž buňkami jsou neurální buňky z corpus striatum;
(iii) Alzheimerovy nemoci, přičemž buňkami jsou neurony obsahující acetylcholin, serotonin a/nebo noradrenalin, spojené s paleo- a neokortexem;
(iv) amytropní laterální sklerózy, přičemž buňkami jsou motoneurony z míchy;
(v) sklerózy multiplex, přičemž buňkami jsou oligodendrocyty mozku.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9505663.6A GB9505663D0 (en) | 1995-03-21 | 1995-03-21 | Genetically modified neural cells |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ295997A3 true CZ295997A3 (cs) | 1998-01-14 |
Family
ID=10771558
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ972959A CZ295997A3 (cs) | 1995-03-21 | 1996-03-20 | Způsob kultivace buněk |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0815206A1 (cs) |
| JP (1) | JPH11502702A (cs) |
| KR (1) | KR19980703205A (cs) |
| AU (1) | AU5116596A (cs) |
| CA (1) | CA2214385A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ295997A3 (cs) |
| GB (1) | GB9505663D0 (cs) |
| HU (1) | HUP9802640A3 (cs) |
| NZ (1) | NZ304076A (cs) |
| WO (1) | WO1996029395A1 (cs) |
Families Citing this family (20)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9807935D0 (en) * | 1998-04-14 | 1998-06-10 | Univ Edinburgh | Lineage specific cells and progenitor cells |
| US6482937B1 (en) * | 1997-10-09 | 2002-11-19 | Biotransplant, Inc. | Porcine Oct-4 promoter |
| US6576464B2 (en) | 2000-11-27 | 2003-06-10 | Geron Corporation | Methods for providing differentiated stem cells |
| EP1740945B1 (en) | 2004-04-07 | 2018-09-19 | Ncardia AG | Non-invasive, in vitro functional tissue assay systems |
| US8318488B1 (en) | 2004-05-11 | 2012-11-27 | Axiogenesis Ag | Assay for drug discovery based on in vitro differentiated cells |
| CN105671027A (zh) * | 2008-09-30 | 2016-06-15 | 诺维信股份有限公司 | 在丝状真菌细胞中使用阳性和阴性选择性基因的方法 |
| WO2012048276A2 (en) | 2010-10-08 | 2012-04-12 | Caridianbct, Inc. | Customizable methods and systems of growing and harvesting cells in a hollow fiber bioreactor system |
| WO2015073913A1 (en) | 2013-11-16 | 2015-05-21 | Terumo Bct, Inc. | Expanding cells in a bioreactor |
| WO2015148704A1 (en) | 2014-03-25 | 2015-10-01 | Terumo Bct, Inc. | Passive replacement of media |
| EP3198006B1 (en) | 2014-09-26 | 2021-03-24 | Terumo BCT, Inc. | Scheduled feed |
| WO2017004592A1 (en) | 2015-07-02 | 2017-01-05 | Terumo Bct, Inc. | Cell growth with mechanical stimuli |
| US11965175B2 (en) | 2016-05-25 | 2024-04-23 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| US11104874B2 (en) | 2016-06-07 | 2021-08-31 | Terumo Bct, Inc. | Coating a bioreactor |
| US11685883B2 (en) | 2016-06-07 | 2023-06-27 | Terumo Bct, Inc. | Methods and systems for coating a cell growth surface |
| CN117247899A (zh) | 2017-03-31 | 2023-12-19 | 泰尔茂比司特公司 | 细胞扩增 |
| US11624046B2 (en) | 2017-03-31 | 2023-04-11 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| US12234441B2 (en) | 2017-03-31 | 2025-02-25 | Terumo Bct, Inc. | Cell expansion |
| EP4314244B1 (en) | 2021-03-23 | 2025-07-23 | Terumo BCT, Inc. | Cell capture and expansion |
| US12209689B2 (en) | 2022-02-28 | 2025-01-28 | Terumo Kabushiki Kaisha | Multiple-tube pinch valve assembly |
| USD1099116S1 (en) | 2022-09-01 | 2025-10-21 | Terumo Bct, Inc. | Display screen or portion thereof with a graphical user interface for displaying cell culture process steps and measurements of an associated bioreactor device |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4070243A (en) * | 1976-08-30 | 1978-01-24 | University Of Illinois Foundation | Method for distinguishing subpopulations in a population of morphologically indistinguishable cells |
| CA1228025A (en) * | 1983-05-20 | 1987-10-13 | Paul I. Terasaki | Method and composition for isolating white cell elements |
| AU4995193A (en) * | 1992-08-04 | 1994-03-03 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of enhancing differentiation and survival of neuronal precursor cells |
| GB9308271D0 (en) * | 1993-04-21 | 1993-06-02 | Univ Edinburgh | Method of isolating and/or enriching and/or selectively propagating pluripotential animal cells and animals for use in said method |
| US5514552A (en) * | 1993-04-30 | 1996-05-07 | Arch Development Corporation | Hybrid neuronal cell lines compositions and methods |
| GB9422236D0 (en) * | 1994-11-03 | 1994-12-21 | Stringer Bradley M J | Transgenic organisms and their uses |
| GB9422643D0 (en) * | 1994-11-08 | 1995-01-04 | Stringer Bradley M J | Neural cell lines |
-
1995
- 1995-03-21 GB GBGB9505663.6A patent/GB9505663D0/en active Pending
-
1996
- 1996-03-20 AU AU51165/96A patent/AU5116596A/en not_active Abandoned
- 1996-03-20 CA CA002214385A patent/CA2214385A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-20 EP EP96907597A patent/EP0815206A1/en not_active Withdrawn
- 1996-03-20 CZ CZ972959A patent/CZ295997A3/cs unknown
- 1996-03-20 WO PCT/GB1996/000671 patent/WO1996029395A1/en not_active Ceased
- 1996-03-20 HU HU9802640A patent/HUP9802640A3/hu unknown
- 1996-03-20 NZ NZ304076A patent/NZ304076A/xx unknown
- 1996-03-20 JP JP8528200A patent/JPH11502702A/ja not_active Ceased
- 1996-03-20 KR KR1019970706608A patent/KR19980703205A/ko not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0815206A1 (en) | 1998-01-07 |
| HUP9802640A2 (hu) | 1999-03-29 |
| GB9505663D0 (en) | 1995-05-10 |
| MX9707195A (es) | 1997-11-29 |
| JPH11502702A (ja) | 1999-03-09 |
| KR19980703205A (ko) | 1998-10-15 |
| WO1996029395A1 (en) | 1996-09-26 |
| NZ304076A (en) | 2001-01-26 |
| HUP9802640A3 (en) | 1999-04-28 |
| CA2214385A1 (en) | 1996-09-26 |
| AU5116596A (en) | 1996-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ295997A3 (cs) | Způsob kultivace buněk | |
| JP4012688B2 (ja) | 遺伝子修飾したｃｄ３４−陰性付着成長性幹細胞および遺伝子療法におけるそれらの使用 | |
| US6812027B2 (en) | Discovery, localization, harvest, and propagation of an FGF2 and BDNF-responsive population of neural and neuronal progenitor cells in the adult human forebrain | |
| Timmer et al. | Enhanced survival, reinnervation, and functional recovery of intrastriatal dopamine grafts co-transplanted with Schwann cells overexpressing high molecular weight FGF-2 isoforms | |
| Tornatore et al. | Expression of tyrosine hydroxylase in an immortalized human fetal astrocyte cell line: in vitro characterization and engraftment into the rodent striatum | |
| CN105316278A (zh) | 用于转染细胞的方法和产品 | |
| CN106574243A (zh) | 表达腺病毒e4orf1的神经细胞及其制备方法和应用 | |
| CN111484977B (zh) | 重编程产生功能性去甲肾上腺素能神经元的方法 | |
| Eves et al. | Conditional immortalization of neuronal cells from postmitotic cultures and adult CNS | |
| Galiana et al. | Establishment of permanent astroglial cell lines, able to differentiate in vitro, from transgenic mice carrying the polyoma virus large T gene: an alternative approach to brain cell immortalization | |
| MXPA00012078A (es) | Celulas ependimarias del tallo neural y metodo para su aislamiento. | |
| US20050214941A1 (en) | Expansion of neural stem cells with LIF | |
| AU2004261763B2 (en) | Reversibly immortalised olfactory ensheathing glia and their use to promote neuronal regeneration | |
| AU750828B2 (en) | Cell culture method | |
| Geller et al. | Applications of immortalized cells in basic and clinical neurology | |
| US7732206B2 (en) | Oligodendrocyte determination genes and uses thereof | |
| KR20110090810A (ko) | 노치 신호 활성 유전자를 이용한 줄기세포의 증식 방법 | |
| US20030109037A1 (en) | Methods for application of genetically-modified endogenous or exogenous stem/progenitor or their progeny for treatment of disease | |
| MXPA97007195A (en) | Celu culture method | |
| US20040265995A1 (en) | sFRP1 and uses thereof | |
| Derrington et al. | Dicistronic MLV-retroviral vectors transduce neural precursors in vivo and co-express two genes in their differentiated neuronal progeny | |
| WO2025117266A2 (en) | Method of producing self-renewing erythroid cells from human progenitor cells | |
| EP1231263A1 (en) | Multipotent O-2A progenitors from the neurohypophysis | |
| US20080206202A1 (en) | Methods for application of endogenous or exogenous stem/progenitor or their progeny for treatment of disease | |
| CA2409713A1 (en) | Generation of human neural crest cell line and its utilizaton in human transplantation |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |