CZ296125B6 - Výroba kyseliny askorbové za pouzití kvasinek - Google Patents

Abstract

Resení se týká produkce askorbové kyseliny (ASA) z kvasinek schopných produkování ASA z 2-keto-L-gulonové kyseliny (KLG), poskytuje metody pro produkci ASA, práve tak jako rekombinantní kvasinky schopné produkovat ASA z uhlíkového zdroje.

Description

CZ 296125 B6

Termín „izolovaný" nebo „vyčištěný" jak je zde používán, vztahuje se na nukleovou kyselinu nebo protein anebo peptid, který je vyjmut nejméně z jedné komponenty, ke které je přirozeně přidružen. V předkládaném vynálezu může izolovaná nukleová kyselina zahrnovat vektor obsahující nukleovou kyselinu. Vyčištěný jak je zde používán, aby se popsal uhlíkový zdroj pocháze-5 jící z fermentačního procesu, se vztahuje na vynětí tohoto uhlíkového zdroje nejméně z jedné komponenty, která je přirozeně přičleněna ve fermentační kultuře.

Podrobný popis vynálezu: 10

Produkce ASA v kvasinkách Předkládaný vynález se týká produkce ASA nebo stereoizomerů ASA, např. kyseliny erythor-bové, v kvasinkách, které jsou schopny využívat k produkci ASA KLG jako jediný uhlíkový zdroj. Překládaný vynález specificky vylučuje metodu produkce ASA v kvasinkách která produ-15 kuje ASA cestou prostřednictvím L-galaktolaktonoxidázy. Kvasinky jsou popsány vN.J. W. Kreger-Van Rij: „The Yeasts" Vol. 1 of Biology of Yeasts, kapitola 2, vydavatelé A. H. Rose & J. S. Harrison, 1987, Academie Press London. Kvasinky náležející rodům imperfektních kvasinek jsou charakterizovány obvykle jako netvořící ascospoiy a basidiospory. ASA je citlivá na kyslík, a proto se dává přednost tomu, že kvasinky jsou schopny anaerobního růstu, aby se snižovala 20 oxidace produkované ASA. Předkládaný vynález také obsahuje způsoby produkce ASA za použití kvasinek, které jsou kultivovány za aerobních podmínek pokud jsou v prostředí ASA přítomna redukční činidla jako dithioetrythritol, glutathion, chelátory kovů jako EDTA, stabilizátory jako kyselina metafosforečná, aminokyseliny, glukoly, cukry, kyselina šťavelová, kyselina trichloroctová, 8-hydroxychinolin [D. W. Bradley, G. Emery a J. E. Manyard: Clin. Chim. Acta 25 4,47-52(1973)].

Kvasinky, které mohou být použity v předkládaném vynálezu zahrnují ale neomezující se na ty, které jsou zde uvedeny a jsou doloženy příklady označení depozitu podle následujícího seznamu. Candida blankii CBS1898; ATCC 18735; C. curvata CBS570; C. humicola; C. incommunis 30 ATCC22971; C. salmanticensis ATCC 16042; C. sp. ATCC 28528, ATCC 20473; Cryptococcus albidus CBS4192; Cr dimennae CBS5770; Cr. heveanensis CBS 140; Cr. kuetzingii UCD68-196; Cr. luteolus CBS 953; Cr.skmneri UCD60-82 CBS5029; Cr.terreus CBS1895; CBS6293, CCA17-8-5; Cr. uiguttulatus CSB13E0; Cr. laurentii CCY17-3-2, CCY17-3-6, ATCC32044; Cr. neoformens ATCC32045; Cr. podzolicus CCY17-20-1; Trichosporon eutaneum UCD54-35 169 CCY30-5-4; T. beigelii NRRLY-1490; T. pullulans ATCC10677; Aureobasidium pullulans DBV A9, A10, A62, A77, A84; Hansenula capsulata DB V 3164, 1TCC24204; Lipomyces starkeyi UCD 51-55, CBS 1809; L. lipofer NRRL Y-1351, Phaffia rhodozyma ATCC24201, Rhodotorula mucilaginóza NRC 211003; Saccharomyces uvarum ATCC9373, ATCC 9080; Saccharomycopsis fibuligera ATCC2082; Schwanniomyces occidentalis NRC2782, NRC2783 a 40 Torulopsis emobii ATCC20000. Při preferovaném provedení jsou kvasinky členy skupiny imperfektních kvasinek. Preferovaným rodem imperfektních kvasinek pro použití při způsobech produkce ASA je čeleď Cryptoccoccaceae. Preferované rody Cryptococcaceae jsou voleny ze skupiny, kterou tvoří Dandida a Croptococcus. 45 Jak je ukázáno v příkladech provedení, Candida blankii a Cryptococcus dimennae jsou schopny produkovat ASA nad úrovně pozadí, když jsou pěstovány na KLG jako jediném uhlíkovém zdroji, zatímco Candida shehatae, když mohla být pěstována na KLG jako jediném uhlíkovém zdroji, byla neschopná produkovat ASA. Ilustrativní příklady uvádějí použití Candida shehatae ATCC přístupové číslo 34887, Candida blankii ATCC přístupové číslo 18735, Ciyptococcus 50 dimennae ATCC přístupové číslo 22024 a Cryptococcus dimennae ATCC přístupové číslo 32044. Předkládaný vynález zahrnuje mutanty, deriváty a progeny známých kvasinkových species a zejména mutanty a deriváty známých species záležejících rodu Cryptococcaceae, např. ty, co náleží ke Candida a Cryptococcus, pokud mutant, derivát nebo progen je schopen využít KLG jako jediný uhlíkový zdroj k produkci ASA. -3- CZ 296125 B6 Předkládaný vynález zahrnuje způsoby produkce AS A nebo stereoizomerů AS A kvasinkami, kde kvasinky jsou přirozeně se vyskytující, tj. nikoli geneticky konstruovány, právě tak jako kde je kvasinka rekombinantní a obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující oxidativní a/nebo reduktivní enzymy, které jsou v kvasinkách spojeny s konverzí uhlíkového zdroje na KLG. V předkládaném vynálezu může být uhlíkový zdroj jako je šestiuhlíková cukerná kyselina produktem separátního fermentačního procesu, který je zaveden do kvasinkové kultury, jako KLG získaná metodou, kterou publikoval Lazarus a spol. (J. Bact. 1991, 173, 6651-61) nebo metodou, kterou publikoval Saito a spol (1997, Applied end Enviromental Microbiology 63: 450-460). Uhlíkový zdroj pocházel ze separátního fermentačního procesu může být před použitím ve způsobu produkce ASA nebo stereoizomerů ASA vyčištěn nebo použit přímo z fermentačního procesu. Uhlíkový zdroj může být získán také chemickými prostředky. Při jiném provedení předkládaného vynálezu jsou kvasinky konstruovány geneticky, aby obsahovaly buď heterologický oxidativní enzym, nebo heterologický reduktivní enzym anebo oba, asociované ke konverzi uhlíkové zdroje na KLG v kvasinkách, poskytujíce tím samostatný organismus, který je schopen konvertovat uhlíkový zdroj jako je glukóza nebo jiný šestiuhlíkový cukr na askorbovou kyselinu via KGL jako intermediátu. Aby rekombinantní hostitelská kvasinka produkovala askorbovou kyselinu ze šestiuhlíkového cukru nebo ze šestiuhlíkové cukerné kyseliny může obsahovat rozmanité heterologické oxidativní enzymy a/nebo rozmanité heterologické reduktivní enzymy. Při jednom preferovaném provedení je uhlíkovým zdrojem glukóza a rekombinantní kvasinka obsahující heterologickou nukleovou kyselinu kódující nejméně jednu z (a) dehydrogenázy glukózy (GDH); (b) dehydrogenázy glukonové kyseliny (GADH); (c) dehydrogenázy 2-keto-D-glukonové kyseliny (2-DKGDH) a (d) reduktázy 2,5-diketo-D-glukonové kyseliny (2,5-diketo-D-glukonové kyseliny (2,5-DGKR) za předpokladu, že obsahuj e-li kvasinka heterologickou nukleovou kyselinu pro méně než všechny z (a) - (d), pak obsahuje kvasinka endogenní nukleovou kyselinu tak, že kvasinka obsahuje nukleovou kyselinu pro každé z (a) - (d) a je schopná konvertovat glukózu na ASA via intermediální KLG. Jak je snadno pochopitelné zkušeným odborníkům, oxidační a redukční reakce zúčastněné na konverzi uhlíkového substrátu na ASA, mohou vyžadovat, aby do kvasinkových kultur byly přidány kofaktoiy. Na příklad 2,5-DGKR popisovaná v patentu US 5 032 514 vydaného 16. července 1991 má nutnou potřebu NADPH. Jiné příklady kofaktorů nezbytných v enzymatických reakcích zahrnují, ale nejsou omezeny na ATP, Nad+, NADP+, NADH, NADPH a koenzym A. Kvasinky mohou také mít výpadky nebo mutace endogenních oxidativních a/nebo reduktivních enzymů, které interferují s požadovanou cestou oběhu uhlíku. Při jiném provedení předkládaného vynálezu je uhlíkovým zdrojem sorbitol a rekombinantní kvasinka obsahuje heterologickou nukleovou kyselinu kódující nejméně jednu z (a) dehydrogenázy D-sorbitolu (SLDH); (b) dehydrogenázy L-sorbózy a (c) dehydrogenázy L-sorbosomu za předpokladu, že obsahuje-li kvasinka heterologickou nukleovou kyselinu pro méně než všechny z (a) - (c), pak obsahuje kvasinka endogenní nukleovou kyselinu tak, že kvasinka obsahuje nukleovou kyselinu pro každé z (a) - (c) a je schopná konvertovat sorbitol na ASA via intermediátní SKLG.

Zdroje pro nukleovou kyselinu kódující oxidativní nebo reduktivní enzymy představují následující:

ENZYM: CITACE dehydrogenázy glukózy Smith a spol. Biochem J., 261:973

Neijssel a spol. 1989, Antonie Van Leuvenhoek 56(1)51-61 -4- CZ 296125 B6

Stanovení obsahů ASA v supernatantech celkové reakční směsi buněk a kontroly esejem oxidázy askorbátu

OBR. 3

Konec dokumentu -15-