CZ297603B6 - Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment PAF-AH, zpusob jeho produkce a pouzití, farmaceutická kompozice, izolovaný polynukleotid, DNA vektor a hostitelská bunka - Google Patents

Abstract

Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment lidské plazmové acetylhydrolázy desticky-aktivujícího faktoru (PAF-AH), který postrádá az prvních dvanáct N-koncových aminokyselin zralé aminokyselinové sekvence lidské PAF-AH od polohy 42 do polohy 441 SEQ ID NO:8 a jeho varianta nebo variantní fragment. Izolovaný polynukleotid kódující PAF-AH, jakoje DNA; DNA vektor odvozený od této DNA; hostitelská bunka stabilne transformovaná nebo transfekovaná touto DNA; zpusob produkce PAF-AH pestováním hostitelské bunky; a farmaceutická kompozice obsahující PAF-AH. PAF-AH a farmaceutická kompozice s jeho obsahem se hodí pro lécení pleurisie, asthma, rhinitis, nekrotizacní enterocolitis, syndromu akutního respiracního distresu, akutní pankreatitis, reperfusního poskození, septicemie, predcasného porodu nebo neurologické choroby spojené s infekcí HIV.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně PAF acetylhydrolázy (AH) (hydrolázy hydrolyzující faktor aktivující destičky) a specifičtěji nově purifikovaných a izolovaných polynukleotidů kódujících lidskou plazmovou PAF acetylhydrolázu a produktů PAF-AH kódovaných polynukleotidy. Dále materiály a metod produkce produktů rekombinantní APF-AH a protilátek proti PAF-AH.

Dosavadní stav techniky

PAF je biologicky aktivní fosfolipid syntetizovaný různými typy buněk. In vivo a při normálních koncentracích 10¹⁰ až ΙΟ'⁹ M PAF aktivuje cílové buňky (jako například krevní destičky a neutrofily) vazbou na specifické povrchové receptory spojené s G proteiny (Venable et al., J. Lipid Res., 34: 691-701 (1993)). PAF má strukturu 1 A)-alkyl-2-acetyl-sn-glycero-3-fosfocholin. K optimální biologické aktivitě musí být na sn-1 pozici glycerolové páteře PAF navázán éterovou vazbu mastný alkohol a na sn-3 pozici musí být fosfocholinová vedoucí skupina.

PAF pracuje za normálních fyziologických procesů (např. zánětech, zástavě krvácení a porodů) a jeho role je předpokládána u patologických zánětlivých procesů (např. astma, anafylaxe, septický šok a arthitida) (Venable et al., viz předchozí citace, Lindsberg et al, Ann. Neurol., 30: 117-129 (1991). Pravděpodobnost role PAF v patologických odpovědích vedla k pokusům modulovat aktivitu PAF. Nejvíce těchto pokusů bylo zaměřeno na vývoj antagonistů aktivity PAF, které by interferovaly s vazbou PAF na buněčné povrchové receptoru. Viz např. Heuer et al., Clin. Exp. Allergy, 22:980-983 (1992).

Syntéza a sekrece PAF, jeho degradace a vyčištění je zřejmě vysoce kontrolováno, a to do té míry, že patologické působení PAF může být výsledkem zhroucení regulačních mechanismů PAF. To vede kjeho nadměrné produkci, nepatřičné produkci nebo neschopnosti degradace. Alternativní zdroj modulace aktivity PAF by zahrnovalo napodobování nebo zvětšování přírodních procesů, kterými dochází k rozlišení zánětu. Makrofágy (Stafforini et al, J. Biol. Chem., 265 (17): 9682-9687 (1990), hepatocyty a lidské hepatomové buněčné linie HepG2 (Saton et al., J. Clin. Invest., 87:476-481 (1991), a Tarbet et al., J. Biol. Chem., 266 (25): 16667-16673 (1991) popsali uvolňování enzymatické aktivity, APF acetylhydrolázy (PAF-AH), která inaktivuje PAF. Kromě toho, že inaktivuje PAF, PAF-AH také inaktivuje oxidativně fragmentované fosfolipidy jako jsou např. produkty arachidonové kaskády, které přenášejí zánět (viz Stremler et al, J. Biol. Chem., 266(17): 11095-11103 (1991). Inaktivace PAF PAF-AH je způsobeno především hydrolýzou PAF na sn-2 acetylované skupině a PAF-AH metabolizuje oxidativně fragmentované fosfolipidy tak, že odnímá sn-2 acyl skupinu. Dva typy APF-AH byly identifikovány: cytoplazmatická forma nalezená v různých typech buněk a tkání jako jsou endoteliální a erytrocyty a extracelulámí forma nalezená v plazmě a séru. Plazmová PAF-AH nehydrolyzuje intaktní fosfolipidy s výjimkou PAF a tato substrátová specificita dovoluje enzymu cirkulovat in vivo v plně aktivním stavu bez nepříznivých vlivů. Plazmová PAF-AH se zdá být zodpovědná za všechny degradace PAF v lidské krvi ex vivo (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 162(9): 4223-4230 (1987))

Zdá se že zatímco cytoplazmická a plazmová forma PAF-AH mají identickou substrátovou specificitu, má plazmová PAF-AH biologické vlastnosti, které jí odlišují od cytoplazmatické PAFAH a od jiných lipáz. Konkrétně je plazmová APF-AH asociována s lipoproteinovými částicemi, je inhibována disopropyl fluorofosfátem, není ovlivněna vápenatými ionty, je relativně intenzivní vůči proteolýze a má molekulovou váhu 43 000 Da (viz Stafforini et al., (1987), viz výše). Stejný Stafforiniho článek popisuje postup částečné purifikace PAF-AH z lidské plazmy a dále aminokyselinové složení materiálu získaného s použitím tohoto postupu. Cytoplazmatická PAF-AH

-1 CZ 297603 B6 byla purifíkována z erytrocytů (Stafforini et al., J. Biol. Chem., 268(6): 3857-3865 (1992) a deset aminokyselinových zbytků z amino-konce cytoplazmatické PAF-AH bylo v článku také popsáno. Hattori et al., J. Biol. Chem., 268(25): 18748-18753 popsal purifikaci cytoplazmatického PAF-AH z hovězího mozku. Poté, co byl k tomuto dokumentu podán patentový návrh, byla publikována nukleotidová sekvence cytoplazmatického PAF-AH z hovězího mozku v článku Hattori et. al., J. Biol. Chem., 269(237): 23150-23155 (1994). 5. ledna 1995, tři měsíce po podání patentového návrhu k tomuto dokumentu byla publikována nukleotidová sekvence lipoprotein asociované fosfolipázy A₂ (Lp-PLA₂) v Smithkline Beecham PLC Patent Cooperation Treaty (PTC) intemational Publication No. W095/00649. Nukleotidová sekvence Lp-PLA₂ se liší v jedné pozici v porovnání s nukleotidovou sekvencí PAF-AH předcházejícího vynálezu. Rozdíl v nukleotidu (odpovídající pozici 1297 SEQ ID NO:7) vedl k rozdílu v aminokyselině mezi enzymy, které byly těmito polynukleotidy kódovány. Aminokyselina v pozici 379 SEQ ID NO: 8 je valin, zatímco aminokyselina na odpovídající pozici Lp-PLA₂ je alanin. Kromě toho zahrnuje nukleotidová sekvence PAF-AH předkládaného vynálezu 124 bází na 5' konci a 20 bází na 3' konci není přítomno v sekvenci LP-PLA₂. Po třech měsících 10. dubna 1995 byla do GenBank po Accession No. U24577 uložena sekvence Lp-PLA₂, která se liší po 11 pozicích v porovnání s nukleotidovou sekvencí PAF-AH předkládaného vynálezu. Rozdíly v nukleotidech (odpovídající pozicím 79, 81, 84, 85, 86, 121, 122, 904, 905, 911, 983 a 1327 SEQ ID NO:7) vedly k rozdílům ve čtyřech aminokyselinách u enzymů kódovaných těmito polynukleotidy. Aminokyseliny na pozicích 249, 250, 274 a 389 SEQ ID NO: 8 jsou lysin, kyselina asparagová, fenylalanin a leucin, zatímco příslušné aminokyseliny na odpovídajících pozicích v genové bance (GenGank) jsou izoleucin, arginin, leucin a serin.

Rekombinantní produkce PAF-AH byl umožnila použití exogenního PAF-AH k napodobení či rozšíření normálních procesů rozeznání zánětu in vivo. Podávání PAF-AH by poskytlo fyziologickou výhodu před podáváním antagonistů receptorů PAF, protože PAF-AH je látka normálně se vyskytující v plazmě. Antagonisté receptorů PAF, které jsou strukturně příbuzné k PAF také inhibují nativní aktivitu PAF-AH. Podávání PAF-AH by tak chránilo žádoucí metabolismus PAF a metabolismus oxidativně fragmentovaných fosfolipidů. Inhibice aktivity PAF-AH pomocí antagonistů receptorů PAF tak vlastně maří kompetitivní blokádu receptorů PAF antagonisty (viz Stremler et al., viz výše). Kromě toho v místě akutního zánětu se například uvolňují oxidanty, které vedou k inaktivaci nativního enzymu PAF-AH a to ústí následně do zvýšené lokální hladiny PAF a látek příbuzných PAF (PAF-like). Tyto látky mohou dále soutěžit s kterýmkoliv exogenně podaným antagonistou PAF receptorů o vazbu na PAF receptor. Naproti tomu byl ošetření rekombinantních PAF-AH zvýšilo endogenní aktivitu PAF-AH, čímž by se kompenzovala jakákoli inaktivita endogenního enzymu. Existuje tedy v tomto oboru potřeba identifikace a izolace polynukleotidové sekvence kódující lidský plazmový PAF-AH a dále potřeba vyvinout materiál a metody použitelné k rekombinantní produkci PAF-AH a k výrobě látek pro detekci PAF-AH v plazmě.

Podstata vynálezu

První aspektem předmětu vynálezu je purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment lidské plazmové acetylhydrolázy destičky-aktivujícího faktoru (PAF-AH), který postrádá až prvních dvanáct N-koncových aminokyselin zralé aminokyselinové sekvence lidské PAF-AH od polohy 42 do polohy 441 SEQ ID NO: 8.

Ve výhodném provedení tento polypeptidový fragment PAF-AH

-je vybrán ze skupiny skládající se z

a) polypeptidu, který má Met46 SEQ ID NO:8 jako počáteční N-koncovou aminokyselinu,

b) polypeptidu, který má Ala47 SEQ ID NO:8 jako počáteční N-koncovou aminokyselinu,

c) polypeptidu, který má Ala48 SEQ ID NO:8 jako počáteční N-koncovou aminokyselinu a/nebo

- postrádá až 30 C-koncových aminokyselin aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:8 a/nebo

- má jako svůj C-koncový zbytek, zbytek vybraný ze skupiny skládající se z:

-2CZ 297603 B6

a) 11^429

b) Leu₄₃| a

c) Asn₄₄|.

Předmětem vynálezu je dále také humánní polypeptidový fragment PAF-AH obsahující Met₄6 SEQ ID NO:8 jako N-koncový zbytek a Ile₄₂9 nebo Asn₄₄i jako C-koncový zbytek.

Předmětem vynálezu je dále také variantní polypeptidový fragment PAF-AH podle základního provedení prvního aspektu vynálezu, který vykazuje v sekvenci SEQ ID NO:8 náhradu aminokyseliny, vybranou ze skupiny skládající se z

a) S 108 A

b) S 273 A

c) D286A

d) D 286 N

e) D 296 A

f) D 304 A

g) D 338 A

h) H 351 A

i) H 395 A

j) H399A

k) C 67 A

l) C E67 S

l) C 229 S

m) C291 S

n) C 334 Sa

o) C 407 A;

a dále též variantní lidský polypeptid PAF-AH, který vykazuje v sekvenci SEQ ID NO:8 náhradou aminokyseliny, vybranou ze skupiny skládající se z

a) D 286 A

b) D286Na

c) D 304 A.

Předmětem vynálezu je dále také izolovaný polynukleotid kódující kterýkoliv z výše uvedených polypeptidových fragmentů PAF-AH, jako variant nebo variantních fragmentů, zejména pak izolovaný polynukleotid kódující lidský fragment PAF-AH nebo variantní fragment vykazující Met₄₆ v SEQ ID NO:8, jako N-koncový zbytek, a Ile₄₂9 nebo Asn₄₄i, jako C-koncový zbytek. Tímto polynukleotidem může být DNA.

Předmětem vynálezu je dále také DNA vektor obsahující výše uvedenou DNA a hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná touto DNA způsobem, který umožní v této hostitelské buňce expresi PAF-AH polypeptidového fragmentu, jeho varianty nebo variantního fragmentu.

Předmětem vynálezu je dále také způsob produkce polypeptidového fragmentu PAF-AH , jeho varianty nebo variantního fragmentu plazmového PAF-AH kultivací výše uvedené hostitelské buňky ve vhodném živném médiu, po níž se izoluje PAF-AH fragment, jeho varianta nebo variantní fragment z buněk nebo jejich růstového média. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho varianta nebo variantní fragment produkovaný tímto způsobem rovněž spadá do rozsahu vynálezu.

Předmětem vynálezu je dále také farmaceutická kompozice obsahující výše uvedený fragment PAF-AH, jeho variantu nebo variantní fragment a farmaceuticky přijatelné ředidlo, adjuvans nebo nosič.

-3 CZ 297603 B6

Předmětem vynálezu je dále také výše popsaný polypeptidový fragment PAF-AH, jeho varianta nebo variantní fragment a od něho odvozená farmaceutická kompozice pro použití k léčení savce susceptibilního k PAFmediovanému patologickému stavu nebo postiženého tímto stavem, přičemž množství PAF-AH produktu nebo farmaceutické kompozice postačuje pro doplnění PAFAH aktivity a inaktivaci patologických účinků PAF u savce. Uvedeným patologickým stavem je pleurisie, asthma, rhinitis, nekrotizační enterocolitis, syndrom akutního respiračního distresu, akutní pankreatitis, reperfusní poškození, septicemie, předčasný porod nebo neurologická choroba spojená s infekcí HIV.

Předmětem vynálezu je dále také použití výše uvedeného polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho varianty nebo variantního fragmentu nebo výše uvedené farmaceutické kompozice pro výrobu léčiva sloužícího k výše uvedeným účelům.

Předkládaný vynález poskytuje nově purifikované a izolované polynukleotidy (např. DNA a RNA - obě vlákna) kódující lidskou plazmovou PAF-AH nebo její enzymatické aktivní fragmenty. Preferované sekvence DNA vynálezu zahrnují genomické a cDNA sekvence a také částečně nebo celkově chemicky syntetizované sekvence DNA. Ve vynálezu jsou uvažovány sekvence DNA kódující PAF-AH, které jsou popsané v SEQ ID NO:7 a sekvence DNA, které hybridizují za stringentních podmínek s nekódujícím vláknem této sekvence nebo, které by pro redundanci genetického kódu hybridizovaly. Ve vynálezu jsou také uvažovány biologické repliky (např. kopie izolovaných sekvencí DNA vytvořených in vivo nebo in vitró) sekvencí DNA vynálezu. Zajištěny jsou také autonomně se replikující rekombinantní konstrukty jako jsou plazmidové a virální vektory s inkorporovanými sekvencemi PAF-AH a zvláště poté vektory kde je DNA kódující PAF-AH operativně svázána s endogenními nebo exogenními expresními kontrolními DNA sekvencemi a transkripčními terminátory.

Podle další stránky vynálezu jsou prokaryotické a eukaryotické hostitelské buňky stabilně transformovány sekvencemi DNA vynálezu způsobem dovolujícím požadovanou expresi PAF-AH uvnitř těchto buněk. Hostitelské buňky exprimující PAF-AH produkty mohou sloužit k rozličným užitečným úkolům. Takovéto buňky vytvářejí hodnotný zdroj imunogenů pro vývoj protilátkových substancí specificky imunoreagující s PAF-AH. Hostitelské buňky dle vynálezu jsou jasně použitelné při metodách produkce PAF-AH ve velkých objemech, při kterých jsou buňky pěstovány ve vhodných kultivačních mediích a požadované polypeptidové produkty jsou izolovány z těchto buněk nebo z média, ve kterém byly buňky pěstovány například imunoafmitní purifikací.

Neimunologické metody uvažované vynálezem purifikace PAF-AH z plazmy zahrnují následující kroky: a) izolaci nízkohustotních lipoproteinových částic; b) solubilizace výše uvedených nízkohustotních lipoproteinových částic v pufru obsahujících lOmM CHAPS. Takto je vytvořen první roztok PAF-AH enzymu; c) nanesení výše uvedeného prvního roztoku enzymu PAF-AH na DEAE anion-iontoměničovou kolonu; d) promytí výše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony pufrem o pH přibližně 7,5 obsahující ImM CHAPS e) eluci enzymu PAF-AH zvýše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony do frakcí pufrem o pH přibližně 7,5 obsahujícím gradient NaCI 0 až 0,5M; f) spojení frakcí majících enzymatickou aktivitu PAF-AH eluovaných zvýše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony; g) převedení výše uvedených spojených aktivní frakcí zvýše uvedené DEAE anion-iontoměničové kolony do lOmM CHAPS. Tak byl vytvořen druhý roztok PAF-AH enzymu; h) nanesení výše uvedeného druhého roztoku enzymu na afinitní kolonu s blue dye ligandem i) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a chaotropické soli; j) nanesení eluátu z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem na afinitní kolonu s Cu ligandem; k) eluce enzymu PAF-AH zvýše uvedené afinitní kolony sCu ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a imidazol; I) nanesení eluátu z výše uvedené afinitní kolony s Cu ligandem na SDSPAGE a m) izolace přibližně 44kDa enzymu PAF-AH z SDS polyakrylamidového gelu. Přednostně je pufr v kroku b) 25mM Tris-HCI, lOmM CHAPS, pH 7,5; pufr v kroku d) je 25mM Tris-HCI, ImM CHAPS; kolona kroku h) je kolona s Blue Sepharose Fast Flow; pufr kroku i) je 25mM Tris-HCI, lOmM CHAPS, 0,5M K.SCN, pH 7,5; kolona v kroku j) je Cu Chelating

-4CZ 297603 B6

Sepharose kolona a pufr kroku k) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, 50mM imidazol při pH v rozmezí okolo 7,5-8,0.

Metoda uvažovaná ve vynálezu pro purifikaci enzymaticky aktivního PAF-AH z E. coli produkující PAF-AH zahrnuje tyto kroky b) nanesení výše uvedeného centrifugačního supematantu na afmitní kolony s blue dye ligandem; c) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a chaotropické soli; d) nanesení eluátu zvýše uvedené afinitní kolony sblue dye ligandem na afmitní kolonu s Cu ligandem; e) eluce enzymu PAF-AH zvýše uvedené afinitní kolony sCu ligandem pufrem obsahujícím lOmM CHAPS a imidazol. Přednostně je kolona kroku b) kolona s Blue Sepharose Fast Flow; pufr kroku c) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M KSCN, pH 7,5; kolona v kroku d) je Cu Chelating Sepharose kolona a pufr kroku e) je 25mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, 50mM imidazol, pH 7,5.

Ještě jiná metoda pro purifikaci enzymaticky aktivního PAF-AH z E. coli produkující PAF-AH je uvažována ve vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a) příprava centrifugačního supematantu z lízovaných £ coli produkující enzym PAF-AH; b) zředění výše uvedeného centrifugačního supematantu v pufru o nízké pH obsahujícím lOmM CHAPS; c) nanesení výše uvedeného zředěného centrifugačního supematantu na kation-iontoměničovou kolonu ekvilibrovanou na pH okolo 7,5; d) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené kation-iontoměničové kolony 1M solí; e) zvýšení pH výše uvedeného eluátu zvýše uvedené kation-iontoměničové kolony a upravení koncentrace solí výše uvedeného eluátu na koncentraci solí okolo 0,5M; f) nanesení výše uvedeného eluátu z výše uvedené kationiontoměničové kolony na afinitní kolonu s blue dye ligandem; g) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené afinitní kolony s blue dye ligandem pufrem obsahujícím soli o koncentraci okolo 2m až 3M; h) dialýza výše uvedeného eluátu zvýše uvedené afinitní kolony sblue dye ligandem spoužitím pufru obsahujícím asi 0,1% Tween. Přednostně je pufr v kroku b) 25mM MES, lOmM CHAPS, lmM EDTA, pH 4,9; kolona v kroku c) je S sepharose kolona ekvilibrovaná v 25mM MES, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 50mM NaCl, pH 5,5; PAF-AH je v kroku d) eluován lmM NaCl; pH eluátu v kroku e) je upravena na pH 7,5 s použitím 2mM Tris-báze; kolona v kroku f) je kolona sepharosy; pufr v kroku g) je 25mM Tris, lOmM CHAPS, 3M NaCl, lmM EDTA, pH 7,5 a pufr v kroku h) je 25mM Tris, 0,5 M NaCl, 0,1% Tween 80, pH 7,5.

Ještě jedna metoda purifikace enzymaticky aktivního PAF-AH z£. coli je uvažována na vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a) příprava extraktu £. coli, která vede po lyži v pufru obsahujícím CHAPS k supematantu obsahujícímu solubilizovaný PAF-AH; b) ředění výše zmíněného spematantu obsahujícímu solubilizovaný PAF-AH; b) ředění výše zmíněného supematantu a jeho aplikace na aniontoměničovou kolonu ekvilibrovanou na pH okolo 8,0; e) eluce enzymu PAF-AH z výše uvedené anion-iontoměničové kolony; d) nanesení výše uvedeného adjustovaného eluátu z výše uvedené anioniontoměničové kolony na afinitní kolonu obsahující „blue day ligand“; e) eluce výše uvedené kolony obsahující „blue day ligand“ pufrem obsahujícím 3,0M sůl; f) zředění eluátu z kolony obsahující „blue day ligand“ do pufru vhodného pro provedení hydroxypalatitové chromatografie g) provedení hydroxylapatitové chromatografie kde je promytá a eluce uskutečněna s pomocí pufrů (s obsahem či bez obsahu CHAPS); h) naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentraci solí vhodnou pro kation-intoměničovou; i) nanesení výše uvedeného naředěného hydroxylapatitového eluátu na kationiontoměničovou kolonu při pH pohybující se v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0; j) eluce PAF-AH z výše uvedené kation-iontoměničové kolony vhodným pufrem vhodného složení; k) provedení kationiontoměničové chromatografie za chladu a I) složení kapalné nebo zmražené formy PAF-AH v nepřítomnosti CHAPSu.

Nejlépe je ve výše uvedeném kroku použít a) lyzovací pufr má sloužení: 25mM Tris, lOOmM NaCl, lmM EDTA, 20mM CHAPS, pH 8,0; v kroku b) ředění supematantu pro anion-iontoměničovou chromatografii je 3-4 krát do 25mM Tris, lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0 a kolona je Q-Sepharosová kolona ekvilibrovaná 25mM Tris, 1 mM EDTA, 50mM NaCl, lOmM

-5CZ 297603 B6

CHAPS, pH 8,0; v kroku c) je anioniontoměničová kolona vymývána s použitím 25mM Tris, lmM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikován přímo na afinitní kolonu s „blue dye ligandem“; v kroku e) je kolona eluována pufrem obsahujícím 3M NaCl, lOmM CHAPS, 25mM Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zředěn pro hydroxylapatitovou chromatografii. Eluát je zředěn lOmM fosforečnanem sodným, lOmM NaCl, 1 OmM CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografíe doprovázena použitím hydroxylapatitové kolony ekvilibrované lOmM fosforečnanem sodným, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS. Eluce je prováděna s použitím 50mM fosforečnanu sodného, lOOmM NaCl (s či bez lOmM CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je provedeno naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu pro kation-iontoměničovou chromatografii pomocí pufru o pH v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0 a obsahujícím fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolona s S-sepharosou ekvilibrována 50mM fosforečnanem sodným (s či bez lOmM CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je eluce provedena pufrem vhodného složení jako například 50mM fosforečnanen draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCl, pH 7,5 a obsahujícího 0,01% Tween 80; v kroku k) je provedena kation-iontoměničová chromatografíe při 2 až 8 °C. Příkladem pro vhodné složení pufru použitelného v kroku 1), který stabilizuje PAF-AH je 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCl, pH přibližně 7,4 (s či bez přídavku Tween 80 a/nebo Plurinicu F68) nebo 25mM fosfátový (K⁺) pufr obsahující (přinejmenším) 125mM NaCl, 25mM arginin a 0,01% Tween-80 (s či bez Pluronicku F68 v koncentraci přibližně 0,1 až 0,5%).

Ještě jedna metoda purifikace enzymaticky aktivního rPAF-AH produktu E. coli je uvažována ve vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a) příprava extraktu E. coli, která po lyži v pufru obsahujícím Triton X-100 vede k solubilizovanému supematantu produktu rPAF-AH; naředění výše uvedeného supematantu a jeho nanesení na afinitní „exchange“ kolonu s imobilizovaným kovem ekvilibrovanou na pH okolo 8,0; c) eluce produktu rPAF-AH zvýše uvedené afinitní „exchange“ kolony s imobilizovaným kovem pufru obsahujícím imidazol; d) úprava koncentrace solí a nanesení výše uvedeného eluátu z afinitní „exchange“ kolony s imobilizovaným kovem na hydrofobní kolonu (hydrophobic interaction column (HIC#1); e) eluce výše uvedené HIC#1 snížením koncentrace solí a/nebo zvýšením koncentrace detergentů; f) titrace výše uvedeného eluátu z HIC# 1 na pH okolo 6,4; g) nanesení výše uvedeného upraveného eluátu zHIC#l na kation-iontoměničovou kolonu (CEX#1) ekvilibrovanou na pH cca 6,4; h) eluce výše uvedené CEX#1 s použitím koncentrace chloridu sodného; i) úprava výše uvedeného eluátu zCEX#l pomocí chloridu sodného na koncentraci okolo 2,0 M; j) nanesení výše uvedeného eluátu z CEX#1 na hydrofobní kolonu (hydrophobic interaction column (HIC#2) ekvilibrovanou na pH okolo 8,0 a koncentraci chloridu sodného okolo 2,0 M; k) eluce výše uvedené HIC#2 snížením koncentrace solí a/nebo zvýšení koncentrace detergentů; 1) naředění výše uvedeného eluátu z HIC#2 a úprava pH na hodnotu okolo 6,0; m) nanesení výše uvedeného upraveného eluátu z HIC#2 na kationiontoměničovou kolonu (CEX#2) ekvilibrovanou na pH okolo 6,0; n) eluce produktu rPAF-AH z výše uvedené CEX#2 pufrem o vhodném složení.

Nejlépe je použít ve výše uvedeném kroku a) lyzovací pufr 90mM TRIS, 0,125% Triton X-100, 0,6M NaCl, pH 8,0. Lyže je provedena ve vysokotlakém homogenizátoru; v kroku b) je supematant naředěn ekvilibračním pufrem (20mM TRIS, 0,5 M NaCl, 0,1% Triton X-100, pH 8,0), zinková chelátová kolona (Chelating Sepharose Fast Flow, Pharmacia, uppsala, Švédsko) je nabitá a ekvilibrovaná ekvilibračním pufrem. Na kolonu je nanesen naředěný supematant a kolona je promyta pufrem o složení 20mM TRISA, 0,5M NaCl, 4M močovina, 0,1% Triton X-100, pH 8,0 a dále promyta 20mM TRIS, 0,5M NaCl, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; v kroku c) je eluce dokonalá pomocí roztoku o složení 20mM Tris, 50mM imidazol, 0,02% TritonX-100, pH 8,0; v kroku

d) je eluát upraven na lmM EDTA a 2M NaCl, kolona Phenyl Sepharose 6 Fast Flow (Pharmacia) je ekvilibrována ekvilibračním pufrem (2,0M NaCl, 25mM Tris, 0,02% Triton X100, pH 8,0) a je na ní nanesen eluát z kroku c) při pokojové teplotě. Kolona je promyta ekvilibračním pufrem a dále promyta roztokem o složení 25mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, PH 6,5 rychlostí 30cm/h; v kroku e) je eluce dokonalá pomocí roztoku 25mM NaPO₄, 3% Triton X-100, pH 6,5; v kroku g) je kolona Macro-prep High S Column (Bio-Rad Labs, Richmond, CA, USA) ekvilibrována ekvilibračním pufrem (20mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, pH 6,4). Upravený

- 6 CZ 297603 B6 eluát z kroku f) je nanesen na kolonu, promyt ekvilibračním pufrem a dále promyt pufrem o sloužení 25mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, pH 8,0; v kroku h) je eluce dokonalá pomocí roztoku o sloužení 25mM NaPO₄, 0,02% Triton X-100, 1,3M NaCl, pH 8,0; v kroku j) je Bakerbond Wide Póre Hi-Propyl C₃ (Baker, Phillipsburg, NJ) ekvilibrována ekvilibračním pufrem (0,02% Triton X-100, 2M NaCl, 25mM Tris, pH 8,0). Upravený eluát z kroku i) je nanesen při pokojové teplotě na tuto kolonu, kolona je promyta ekvilibračním pufrem a dále promyta roztokem o složení 0,02% Triton X-100, 25mM Tris, pH 8,0 rychlostí 30cm/h; v kroku k) je eluce dokonalá za použití roztoku o složení lOmM Tris, 3,0% Triton X-100, pH 8,0; v kroku 1) je naředění do ekvilibračního pufru (20mM sukcinát, 0,1% PLURONIC F68m pH 6,0); v kroku m) je kolona SP Sepharose Fast Flow (Pharmacia) ekvilibrována ekvilibračním pufrem kroku 1) a na ni dále nanesen eluát z kroku 1) a kolona je promyta ekvilibračním pufrem; a v kroku n) je eluce dokonalá s pomocí roztoku o sloužení 50mM NaPO₄, 0,7M NaCl, 0,1% PLURONIC F68, 0,02% TWEEN 80, pH 7,5.

PAF-AH produkty mohou být získány jako izoláty z přírodních buněčných zdrojů nebo mohou být chemicky syntetizovány. Přednostně jsou ale produkovány rekombinantní postupy zahrnujícími hostitelské eukaryotické a prokaryotické buňky tohoto vynálezu. PAF-AH produkty, které mají část nebo celou aminokyselinovou sekvenci popsanou v SEQ ID NO: 8 jsou uvažovány v tomto vynálezu. Zvláště jsou uvažovány fragmenty postrádající až prvních dvanáct N-koncových aminokyselin lidské aminokyselinové sekvence PAF-AH popsané v SEQ ID NO:8. Zvláště ty, které mají jako iniciační N-koncovou aminokyselinu Met₄6, Ala₄₇ nebo Ala₄g SEQ ID NO: 8: Uvažovány jsou také fragmenty tohoto postrádající až třicet C-koncových aminokyselin aminokyselinové sekvence SEQ ID NO:8, zvláště pak ty, které mají lle₄₂9 a Leu₄₃i jako C-koncový zbytek. Uvažovány jsou dále obměny PAF-AH nebo PAF-AH nebo ty, které mají v sekvenci SEQ ID NO:8 nahrazenu aminoskupinu a které jsou vybrány ze skupiny skládající se z S 108 A, S, 273 A, D 286 A, D 286 N, D 296 A, D 304 A, D 338 A, H 351 A, H 395 A, H 399 A, C 67 S, C 229 S, C 291 S, C 334 S, C 407 D, D 286 A, D 286 N a D 304 A. Jak je poznamenáno výše, jsou polynukleotidy (včetně DNA) kódující takovéto fragmenty nebo obměny fragmentů zajištěny vynálezem. Vynálezem jsou zajištěny také způsoby rekombinantní produkce těchto fragmentů nebo obměn pěstováním hostitelských buněk obsahujících takovéto DNA. Současně upřednostňované PAF-AH produkty zahrnují prokaryotické polypeptidové expresní produkty DNA kódující aminokyselinové zbytky Met₄₆ až Asn₄₄₁ SEQ ID NO:8 označované jako rPH.2 a prokaryotické polypeptidové expresní produkty DNA kódující aminokyselinové zbytky Met₄₆ až Ile₄29 SEQ ID NO:8 označované jako rPH.9. Oba produkty (rPH.2 a rPH.9) vykazují nižší aminokoncovou heterogennost než, například, odpovídající prokaryotické polypeptidové expresní produkty DNA kódující celou sekvenci PAF-AH s předcházejícím translačním iniciačním kodonem. Kromě toho rPH.9. vykazuje vyšší karboxy koncovou homogenitu (konzistenci). Použití savčích hostitelských buněk je předpokládáno k zajištění takovýchto posttranslačních modifikací (např. myristolace, glykosilace, zkrácení lipidace a tyrosin, serin a treonin fosforylace), které mohou být potřebné k udělení optimální biologické aktivity rekombinantních expresních produktů vynálezu. PAF-AH produkty popsané ve vynálezu mohou mít plnou délku, mohou to být fragmenty nebo obměny. Obměny mohou obsahovat PAF-AH analoga, kde je jedna nebo více specifikovaných (např. přirozeně kódovaných) aminokyselin vyjmuto nebo nahrazeno nebo kde je jedna nebo více nespecifikovaných aminokyselin přidáno 1) bez ztráty jedné nebo více enzymatických aktivit nebo imunologických charakteristik specifických pro PAF-AH nebo 2) se specifickou neschopností konkrétní biologické aktivity PAF-AH. Proteiny nebo další molekuly, které se váží na PAF-AH mohou být použity k modulaci její aktivity.

V předkládaném vynálezu jsou také uvažovány „protilátkové“ substance (např. monoklonální a polyklonální protilátky, jednořetězcové protilátky, chimérické protilátky, CDR roubované protilátky apod.) a další vazebné proteiny specifické pro PAF-AH. Konkrétně demonstrativní vazebný proteiny vynálezu jsou monoklonální protilátky produkované hybridomy 90G11D a 90F2D, které byly uloženy v Američan Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852 30. září 1994 a byly jim přiděleny Accession Nos. HB 11724 a HB 11725. Další demonstrativní vazebný protein vynálezu je monoklonální protilátky produkovaná hybri

-7CZ 297603 B6 domem 143A, který byl uložen v ATCC 1. června 1995 a jemu přidělené Accesion N. Je HB 1190. Proteiny nebo jiné molekuly (např. lipidy nebo malé molekuly), které se specificky váží na PAF-AH mohou být identifikovány s použitím PAF-AH izolované z plazmy, rekombinantního PAF-AH, obměn PAF-AH nebo buněk exprimujících takovéto produkty. Vazebné proteiny jsou použitelné následovně ve směsích pro imunizaci a také pro purifikaci PAF-AH. Jsou také použitelné k detekci nebo kvantifikaci PAF-AH v tekutinách a tkáňových vzorcích pomocí známých imunologických postupů. Uvažovány jsou také antiidiotypické protilátky specifické pro PAF-AH specifické protilátkové substance.

Vědecká hodnota informací poskytnutých skrze odhalení DNA a aminokyselinové sekvence předkládaným vynálezem je zřejmá. Jedna ze série příkladů: znalost sekvence cDNA pro PAFAH umožňuje za použití hybridizací DNA/DNA izolaci genomických DNA sekvencí kódujících PAF-AH a specifikaci PAF-AH expresních kontrolních regulačních sekvencí jako jsou promotory, operátory apod. Postupy DNA/DNA hybridizací prováděných se sekvencemi DNA vynálezu při standardních podmínkách stringence taktéž zřejmé dovolí izolaci DNA kódujících alelické varianty PAF-AH, dalších strukturně příbuzných proteinů sdílejících jednu nebo více biologických a/nebo imunologických vlastností PAF-AH a také proteinových homologů PAF-AH z jiných (než lidských) zdrojů. DNA sekvenční informace poskytované předkládaným vynálezem dovolují také pomocí homologních rekombinací nebo „knockout“ strategií (viz např. Kapecchi, Science, 244: 1288-1292 (1989)), vývoj hlodavců, kteří neumí exprimovat funkční enzym PAFAH nebo exprimovat obměnu PAF-AH enzymu. Vhodně označené polynukleotidy popsané ve vynálezu jsou použitelné při hybridizačních testech k detekci kapacity buněk syntetizovat PAFAH. Polynukleotidy popsané ve vynálezu mohou být také základem diagnostických metod užitečných k identifikaci a genetickým úpravám v PAF-AH centru, které vyzdvihuje stav nebo stavy nemoci. Dostupné dělá vynález také antisence polynukleotidy, významné při regulaci exprese PAF-AH těmi buňkami, které zpravidla exprimují to samé.

Je uvažováno podávání preparátů PAF-AH vynálezu savčím subjektům, zvláště lidem s cílem ameliorace patologických zánětlivých stavů. Na základě důkazů o zapojení PAF v patologických zánětlivých stavech je podávána PAF-AH indikováno např. při ošetření astma (Miwa et al., J. Clin. Invest. 82: 1983-1991 (1988); Hsieh et al., J. Allergy Clin. Immunol., 91: 650-657 (1993); a Yamashida et al., Allergy, 49: 60-63 (1994)), anafylaxe (Venable et al., viz výše), šoku (Venable et al., viz výše), reperfúzní poranění a ischemie centrálního nervového systému (Lindsberg et al., (1991), viz výše), antigeny vyvolané artritidy (Zarco et al., Clin Exp. Immunol., 88: 318-323 (1992)), aterogenese (Handley et al., Drug Dev. Res., 7: 361-375 (1986)) Crohnovy nemoci (Denizot et al., Digestive Diseases and Sciences, 37(3): 432 437 (1992)), ischemické nekrózy střeva/ nekrotizující enterokolitidy (Denizol et al., viz výše a Caplan et al., Acta Peadiatr., Suppl. 396, 11-17 (1994)), ulcerózní kolitidy (Denizol et al., viz výše), ischemické mozkové příhody (Saton et al,l Stroke 23: 1090-1092 (1992), ischemického poranění mozku (Lindberg et al., Stroke, 21: 1452-1457 (1990), a Lindsberg et al, (1991), viz výše), systémové lupusl erythematotus (Matsizaki et al., Clinica Chimica Acta, 210: 139-144 (1992)), akutní pankreatitidy (Kald et al,. Pancreas, 8(4): 440-442 (1993)), otravy krve (Kald et al., viz výše) akutní poststreptokokové glomerulonefritidy (Mezzano et al., J. Am. Soc. Nephrol., 4: 235-242 (1993), plicního otoku jako reakce na léčení IL-2 (Rabinovici et al., J. Clin. Invest., 89: 1669-1673 (1992)), alergického zánětu (Watanabe et all., Br. J. Pharmacol., 111. 123-130 (1994)), ischemického selhání ledvin (Grino et al, Annals of Internal Medicine, 121(5): 345-347 (1994)); předčasného porodu (Hoffman et al., Am. J. Obstet. Gynecol., 162 (2):525-528 (1990) a Maki et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85: 728-732 (1988)); syndromu respirační nedostatečnosti dospělých (Rabinovici et al., J. Appl. Physiol., 74(4): 1791-1802 (1993); Matsumoto et al., Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., 19 509-515 (1992) a Rodriguez-Roisin et al., J. Clin. Invest., 93: 188-194 (1994)). Použití PAF-AH přípravků k ošetření HIV infekce centrálního nervového systému je také ve vynálezu uvažováno. „Ošetření“, jak je zde používáno, zahrnuje tak profylaktické, tak i terapeutické ošetření.

-8CZ 297603 B6

Pro mnoho z dříve zmíněných patologických stavů byl popsán pokusný zvířecí model. Například myšší model pro astma a rinitidu je popsán v příkladu 16 tohoto dokumentu; králičí model pro artritidu je popsán v Zorco et al.., viz výše; krysí modely pro ischemickou nekrózu střev/ nekrotizující enterokolitidu jsou popsány v Furukawa et all., Red. Res., 34(2): 237-241 (1993) a Caplan 5 et al., viz výše; králičí model pro mrtvici je popsán u Lindsberga et al., (1990), viz výše; myšší model pro lupus je popsán v Metsuzaki et all, viz výše; krysí model pro akutní pankreatitidu je popsán u Kald et all, viz výše; krysí model pro otok plic jako výsledek terapie 1L-2 je popsán u Rabinovici et al, viz výše krysí model alergického zánětu je popsán u Watanabe et al., viz výše; psí model pro ledvinový aloimplantát je popsán u Watson et al., Transplantation, 56(4): 1047— i o 1049 (1993) a krysí a morčecí modely syndromu respirační nedostatečnosti dospělých jsou samostatně popsány v Rabinovici et al., Viz výše a Lellouch-Tubiana, Am. Rev. Respir. Dis., 137:948-954(1988).

Zvláště uvažované jsou ve vynálezu směsi PAF-AH použitelné při metodě ošetření savců snadno 15 podléhajících nebo trpících patologickými stavy způsobenými PAF. Takovéto ošetření zahrnuje podávání PAF-AH savcům v množstvích dostatečných k doplnění endogenní aktivity PAF-AH a k inaktivaci patologických množství PAF u těchto savců.

Terapeuticko-farmakologická směs uvažovaná ve vynálezu zahrnuje PAF-AH produkty a 20 fyziologicky akceptovatelné ředidlo nebo nosiče. Může také zahrnovat další látky mající protizánětlivé účinky. Indikované množství dávky by bylo dostatečné k doplnění endogenní aktivity PAF-AH a k inaktivaci patologických množství PAF. Pro obecnou úvahu o dávkách viz Remmingtoďs Pharmaceutical Sciences 18* Edition, Mack Publishing Co., Easto, PA (1990). Dávky se budou pohybovat mezi 0,1 až asi 1000 pg PAF-AH/kg tělesné hmotnosti. Terapeutické 25 směsi vynálezu mohou být podávány různými cestami v závislosti na patologických stavech, které mají být léčeny. Podávání může být například intravenózní, subkutánní, orální, ve formě čípků a/nebo plicními cestami.

U patologických stavů plic je podávání PAF-AH plicními cestami zvláště indikovány. Pro pou30 žití při pulmonárním podávání je zvažováno široké spektrum „doporučovacích“ zařízení běžné pro tyto účely, např. nebulizéry, inhalátory s měřením a práškové inhalátory. „Doručení“ různých proteinů do plic a oběhového systému inhalací aerosolových směsí bylo popsáno v Adjei et al., Pharm. Res., 7(6): 565-569 (1990) (leuprolide acetat); Braquet et al., J. Cardio. Pharm., 13(Suppl 5): s. 143-146 (1989) (endothelin-1); Hubbard et al, Annals of Intemal Medicine, 111 (3), 20635 2 1 3 (1989) (αΐ-antitrypsin); Smith et all, J. Clin. Invest., 84: 1145-1146 (1989) (α-1-proteinase inhibitor); Debs et all, J. Immunol., 140: 3482-3488 (1933) (rekombinantní gamma interferon a tumorový nekrotický faktor alfa); Patent Cooperation Treaty (PCT) International Publication No. WO 94/20069 publikovaný 15. září 1994 (rekombinant pegylated granulocyte colony stimulating factor.

Přehled obrázků na výkresech

Množství dalších stránek a výhod předkládaného vynálezu bude zřejmé po zvážení následujících 45 detailních vysvětleních, ve kterých bude odkazováno na obrázky kde je:

Obr. 1: Fotografie PVDF membrány obsahující PAF-AH pufirikovaný z lidské plazmy.

Obr. 2: Graf ukazující enzymatickou aktivitu rekombinantní lidské plazmové PAF-AH.

Obr. 3: Schématický nákres znázorňující rekombinantní fragmenty PAF-AH a jejich katalytické aktivity.

Obr. 4: Hmotová spektroskopie rPH.2 - rekombinantního produktu PAF-AH.

Obr. 5: Hmotová spektroskopie rPH.9 - rekombinantního produktu PAF-AH.

Obr. 6: Sloupcový graf ilustrující blokádu edému nohy krys vyvolaného PAF lokálně podaným rekombinantním PAF-AH tohoto vynálezu.

-9CZ 297603 B6

Obr. 7: Sloupcový graf ilustrující blokádu edému nohy krys vyvolaného PAF intravenózně podaným rekombinantním PAF-AH.

Obr. 8: Sloupcový graf znázorňující, že PAF-AH blokuje edém vyvolaný PAF, ale ne edém vyvolaný zymosanem A.

Obr. 9A a 9B: Antizánetlivá aktivita PAF-AH u edému nohy krys - závislost na velikosti dávky. Obr. 10A a 10B: Časová závislost in vivo účinnosti jedné dávky PAF-AH.

Obr. 11: Časový graf znázorňující farmakokineticky PAF-AH v krevním oběhu krysy.

Obr. 12: Sloupcový graf znázorňující protizánětlivé účinky PAF-AH v porovnání s nižším účinkem antagonistů PAF u edému nohy krys.

Obr. 13. Znázornění výsledků indikujících, že PAF-AH neutralizuje apoptické účinky média z HIV-1 infikovaných a aktivovaných monocytů.

Příklady provedení vynálezu

Následující uvedené příklady sloužící k ilustraci vynálezu. Příklad 1 uvádí novou metodu purifikace PAF-AH z lidské plazmy. Příklad 2 popisuje mikrosekvenování aminokyselinových zbytků PAF-AH purifikovaného z lidské plazmy. V Příkladu 3 je popsáno klonování cDNA celého genu (full lenth cDNA) kódujících lidský plazmatický PAF-AH. V příkladu 4 jsou popsány různé varianty sloužení genu kódujících lidský plazmatický PAF-AH. Klonování genových sekvencí kódujících lidský plazmatický PAF-AH je popsáno v Příkladu 5. Příklad 6 popisuje klonování homologů cDNA pro lidský plazmatický PAF-AH pro psí, myší, hovězí, kuřecí, hlodavčí cDNA a cDNA z makaka. V Příkladu 7 jsou popsány výsledky testu prokazujícího enzymatickou aktivitu rekombinatního PAF-AH transiestně exprimovaného v buňkách COS 7. Příklad 8 popisuje expresi DNA reprezentující klon o plné délce DNA, zkrácenou DNA a chimérické DNA pro lidský PAF-AH v E. coli. S. cerevisiae a savčích buňkách. Příklad 9 uvádí protokol pro purifikaci rekombinantního PAF-AH zE. coli a testy potvrzující jeho enzymatickou aktivitu. Příklad 10 popisuje různé rekombinantní produkty pro PAF-AH včetně analogů vzniklých substitucí aminokyselinových zbytků a produktů vzniklých zkrácením na amino a karboxy koncích. Dále je zde popsán pokus dokazující, že nativní PAF-AH izolovaný z plazmy je glykosylovaný. Výsledky analýz provedených pomocí Northem blotu pro důkaz exprese lidské plazmatické PAF-AH RNA v různých tkáních a buněčných liniích jsou prezentovány v Příklad 11, zatímco výsledky hybridizace in šitu jsou uvedeny v Příkladu 12. Příklad 13 popisuje vývoj monoklonálních a polyklonálních protilátek specifických pro lidský plazmatický PAF-AH. Příklady 14, 15, 16, 17, 18 a 19 popisují na zvířecích modelech in vivo terapeutické vlivy podávání rekombinantních produktů PAF-AH dle vynálezu na akutní záněty; zánět pohrudnice, astma, nekrotizující enterokolitidu (střevní katar), syndrom dechové nedostatečnosti dospělých a pankreatitidu. Příklad 20 popisuje in vitro vliv rekombinantního produktu PAF-AH na neurotoxicitu spojenou s infekcí HIV. Příklad 21 ukazuje výsledky imunologického vyšetření séra lidských pacientů vykazujících defícienci v aktivitě PAF-AH a popisuje identifikaci genetických poruch u pacientů, které jsou zjevně zodpovědné za tuto nedostatečnost.

Příklad 1

Za účelem získání materiálu pro aminokyselinovou sekvenci lidského plazmatického PAF-AH byla provedena jeho purifikace.

A. Optimalizace purifikačních podmínek

Nejprve se z plazmy odstranily lipoproteinové částice o nízké hustotě (low density lipoproteinLDL), a to pomocí precipitace fosowolframanem z plazmy a následnou solubilizací v 0,1% Tween 20. Dále následovala chromatografie na sloupci DEAE (Pharmacia, Uppsala, Sweden)

- 10CZ 297603 B6 postupem popsaným Stafforinim a dalšími (1987), viz výše, ale nekonsistentní eluce aktivity PAF-AH ze sloupce DEAE si vyžádala přehodnocení solubilizace a následných podmínek purifikace.

Tween 20, CHAPS (Pierce Chemical CO., Rockford, IL) a oktylglukosid byly hodnoceny v použitých centrifugačních metodách a gelové filtrační chromatografií na svou schopnost solubilizovat částice LDL. CHAPS vykázal o 25 % větší návratnost aktivity v rozpustné frakci než Tween 20 až o 300 % větší výtěžek aktivity než oktylglukosid. Precipitát LDL solubilizovaný 10 mM CHAPS se potom dělil na sloupci DEAE Sepharosy Fast Flow (je to sloupec aniontového měniče; Pharmacia) pomocí pufru obsahujícího 1 mM CHAPS. Tak bylo získáno velké množství částečně načistěného PAF-AH („DEAE pool“), které sloužilo k hodnocení dalších sloupců.

DEAE pool byl použit jako startovní materiál k testování dalších různých chromatograflckých sloupců, které byly použity pro další čistění aktivity PAF-AH. Mezi testovanými sloupci byly: Blue Sepharose Fast Flow (Pharmacia), sloupec pro afinitní chromatografii s barevnými ligamdem; S-Sepharose Fast Flow (Pharmacia), kationtový měnič; Cu Chelating Sepharose (Pharmacia), sloupec pro afinitní chromatografii využívající kovových ligandů; Fractogel S (EM Separations, Gibbstown, NJ), kationtový měnič a Sephacryl - 200 (Pharmacia), sloupec pro gelovou filtraci. Všechny tyto chromatografické postupy však přinesly pouze nízký stupeň načištění, jestliže se použil 1 mM CHAPS. Následná gelová chromatografie na Sephacrylu S-200 v 1 mM CHAPS poskytla enzymaticky aktivní frakci, která se však vymývala ze sloupce ve větším rozsahu velikostí, než byla předpokládaná velikost odpovídající přibližně 44 kDa. Z tohoto zjištění vyplývá závěr, že LDL proteiny jsou v roztoku agregovány.

Různé vzorky LDL se proto hodnotily pomocí analytické gelové filtrace, kdy se hodnotil stupeň agregace a jeho vliv na aktivitu PAF-AH. Vzorky z DEAE poolu a čerstvě rozpuštěné LDL precipitáty se analyzovaly na sloupci Superose 12 (Pharmacia) ekvilibrovaném pufrem s 1 mM CHAPS. Oba vzorky se eluovaly ze sloupce v širokém rozmezí molekulových hmotností, nejvyšší aktivita byla nalezena ve frakci o molekulové hmotnosti vyšší než 150 kDa. Jestliže se vzorky analyzovaly na sloupci Superose 12 ekvilibrovaném 10 mM CHAPS, největší množství aktivity se nacházelo ve frakci o molekulové hmotnosti přibližně 44 kDa, což je oblast kde byla aktivita předpokládána. Vzorky, které obsahovaly aktivitu ve frakcích o vyšší molekulové hmotnosti, odpovídaly agregátům.

Aktivita ostatních vzorků se po následujícím testování pomocí gelové filtrace naléhala výhradně v rozsahu molekulové hmotnost odpovídající 44 kDa. Tyto vzorky byly precipitovány LDL rozpuštěné v 10 mM CHAPS za přítomnosti 0,5 m NaCl a dále vzorky z DEAE poolu, které byly upraveny po eluci ze sloupce pomocí 10 mM CHAPS. Získané výsledky potvrzují, že k zamezení agregace vzorků PAF-AH je nutné použít minimální 10 mM CHAPS. Zvýšení koncentrace CHAPS z 1 mM Na 10 mM po chromatografii na sloupci DEAE celulózy, ale před dalšími kroky purifikačního postupu, navodilo dramatické změny v purifikačním postupu. Například, stupeň načištění PAF-AH na sloupci S-Sehapharosy Fast Flow se zvýšilo z dvojnásobku na desetinásobek. Aktivita PAF-AH se váže v 1 mM CHAPS na sloupec Blue Sepharosy Fast Flow ireversibilně, ale použije-li se 10 mM CHAPS, vymyje se ze sloupce velmi vysoká hladina aktivity. Chromatografie na sloupci DEAE se však přidáním 10 mM CHAPS oproti předcházejícím chromatografiím nezlepšilo.

Chromatografie na sloupci Cu Chelating Sepharosy, která následovala po chromatografii na Blue Sepharose Fast Flow, zvýšilo aktivitu PAF-AH patnáctkrát. Také se zjistilo, že aktivita PAF-AH se může obnovit po elektroforéze na redukujícím SDS polyakrylamidovém gelu, Vzorek se však před elektroforézou nesmí vařit. Aktivita materiálu získaného elucí ze sloupce Cu Chelating Sepharose, se po elektroforéze na SDS polyakrylamidovém gelu a následném barvení stříbrem, vykytovala v hlavním proužku proteinu.

B. Protokol pro purifikaci PAF-AH

Nový protokol pro purifikaci PAF-AH pro účely aminokyselinového sekvencování obsahuje následující kroky, které jsou prováděny při 4 °C. Lidská plazma se rozdělila po 900 ml alikvotech po 1 litrových lahví firmy Nalgene a upravila se hodnota pH na 8.6. LDL částice se potom precipitovaly přidáním 90 ml 3.85% fosfowolframanu sodného a potom následným přidáním 2M MgCL. Plazma se poté centrifugovala 15 minut při 3600 g. Pelet byl resuspendován v 800 ml 0,2% citrátu sodného. LDL částice se znovu vysrážely pomocí přidání 10 g NaCl a 24 ml 2M MgCl₂. LDL částice získané z 5 1 lidské plazmy se rozpustily v 5 I pufru A (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, pH 7.5) a nechaly se míchat přes noc. Rozpuštěné LDL částice se centrifugovaly při 3600 g po dobu 1.5 hodiny. Supematant se schraňoval, poté se pře filtroval přes filtrační papír Whatman 113, čímž se odstranily zbylé pevné částice. Solubilizované LDL částice se nasadily na sloupec DEAE Sepharosy Fast Flow (11 x 10 cm; objem pryskyřice 1 1; 80 ml/min), který byl ekvilibrován pufrem B (25 mM Tris-HCl, lmM CHAPS, pH 7.5). Sloupec se promýval 8 1 gradientu 0-0.5 M NaCl a jímaly se 480 ml frakce. Tento k rok byl nezbytný pro navázání látky na sloupec Blue Sepharosy Fast Flow, tak jak je popsáno dále. Frakce byly testovány na aktivitu acetylhydrolázy, a to metodou, která je popsána v Příkladu 4.

Frakce vykazující aktivitu se slily a přidalo se takové množství CHAPS, aby v celém objemu frakcí jeho koncentrace dosáhla 10 mM. Všechny frakce získané po chromatografií na DEAE se nanášely přes noc rychlostí 4ml/minutu na sloupec Blue Sepharosy Fast Flow (5 cm x 10 cm, mrtvý objem 200 ml) ekvilibrovaný pufrem obsahujícím 0,5 M NaCl. Sloupec se promýval ekvilibračním pufrem rychlostí 16ml/minutu, a to až do té doby, než se absorbance vrátila na hodnotu pro absorbance naměřené před aplikací vzorku. Aktivita PAF-AH se vymývala ze sloupce pomocí krokové eluce pufrem A obsahujícím 0.5 M K.SCN (chaotropní sůl), a to rychlostí 16ml/min. Sbíraly se 50 ml frakce. Tento krok vedl kviče než tisícinásobnému načištění enzymového preparátu. Sbíraly se aktivní frakce, po té se v celém jejich nasbíraném objemu upravilo pH na hodnotu 8.0, a to pomocí 1M Tris-HCl, pH 8.0. Aktivní frakce získaná po chromatografii na sloupci Blue Sepharosy Fast Flow se nanesla na sloupec Cu Chelating Sepharosy (2,5 x 2 cm, mrtvý objem 10 ml; průtoková rychlost 4 ml/min), který byl ekvilibrovaný pufrem C (25 mM Tris-HCl, 10 mM CHAPS, 0.5 M NaCl, pH 8.0, lze použít i pufr s pH 7.5). Sloupec byl vymýván objemem 50 ml pufru C. Aktivita PAF-AH se vymývala ze sloupce 100 ml 50mM imidazolu v pufru C a sbíraly se 10 ml frakce. Eluent s aktivním PAF-AH se shromáždil a nechal se dialyzovat proti pufru A. Kromě toho, že se tímto krokem 15 krát zvýšila aktivita daného enzymového preparátu PAF-AH, chromatografie na sloupci Cu Chelating Sepharose dala jen velmi malé načištění. Aktivní eluent ze sloupce Cu Chelating Sepharose byl redukován v 50 mM DTT po dobu 15 minut při 37 °C a po té byl nanesen na 0.75 mm 7.5% polyakrylamidový gel. Gelové plotny byly nakrájeny na proužky o šířce 0.5 cm a vloženy do centrifutační mikrokyvety najedno použití obsahující 20 μΙ 25 mM Tris-Cl, lOmM CHAPS, 150 mM NaCl. Proužky byly po té rozetřeny a ponechány inkubovat v kyvetě přes noc při 4 °C. Supematant vzniklý centrifúgací těchto rozdrcených gelových proužku se poté testoval na aktivitu PAF-AH, tím se určilo, který proužek na gelu SDS-PAGE obsahuje PAF-AH. Aktivita PAF-AH byla nalezena v proužku odpovídající molekulové hmotnosti přibližně 44 kDa. Proteiny z duplicitního gelu bylo přeneseno elektricky na PVDF membránu (Immobilon-P, Millipore) a obarveny Comassie Blue. Fotografie PVDF membrány je na obrázku 1.

Tak, jak je ukázáno v Tabulce č. 1 dále v textu, z 5 1 lidské plazmy se získalo přibližně 200 pg PAF-AH načištěného 2 x 10⁶. Pro srovnání, Stafforini a další (1987), viz výše, popsal ve svém postupu načištění aktivity 3 x 10⁴.

- 12CZ 297603 B6

Tabulka 1

Vzorek	Objem (ml)	Aktivita (cpmxlO6)	Celková aktivita (cpmxlO6)	Konc. proteinů (mg/ml)	Specifická aktivita (cpmxlO6)	% návratnosti aktivity (cpmxlO6)	Násobek nečištění
						krok.	celk.	krok	celk.
plazma	5000	23	116	62	0,37	100	100	1	1
l.DL	4500	22	97	1.76	12	84	84	33	33
DEAE	4200	49	207	1.08	46	212	178	3,7	124
Blue	165	881	14	0.02	54 200	70	126	1190	1,5x10*
Cu	12	12 700	152	0.15	82 200	104	131	1,5	2,2x105
SDSPAGE	-	-	-	—	—	—	—	-10	2,2x105

Souhrnně můžeme konstatovat, že po úspěšnou purifikaci PAF-AH z plazmy za účelem mikrosekvenování jsou unikátní a kritické následující kroky: (1) rozpuštění a chromatografie na v 10 mM CHAPS, (2) afinitní chromatografie na sloupci s modrým ligandem jako je Blue Sepharose fast Flow, (3) chromatografie na CU ligandovém afinitním nosiči, jako je Cu Chelant Sepharose a za (4) eluce PAF-AH z gelu po SDS-PAGE.

Příklad 2

Proužek s proteiny o velikosti asi 44 kDa byl vystřižen z PVDS membrány obsahující PAF-AH (popsáno v Příklad 1), sekvence přítomných bílkovin bylo stanoveno pomocí proteinového sekvenátoru Applie Biosystems 473A. Analýza sekvencí N-koncové oblasti proteinů migrujících v oblasti asi 44 kDa, která vykazuje PAF-AH aktivitu, naznačila přítomnost dvou majoritních a dvou minoritních sekvencí. Poměr obou majoritních sekvencí byl 1:1, proto bylo obtížné interpretovat sekvenční data.

Aby bylo možno odlišit sekvence obou majoritních proteinů rozdělených na SDS gelu, byl duplikát PVDF membrány s proužkem kolem 44 kDa rozpůlen a horní i dolní část byla sekvenována odděleně.

Sekvence N-konce získaná z dolní poloviny membrány je následující:

SEQ ID NO: 1

FKDLGEEAFKALVLIAF

Po prohledání databází proteinů byla tato sekvence ztotožněna s fragmentem lidského serumalbuminu. N-koncová sekvence stanovená u materiálu z horní poloviny téže PVDF membrány je následující:

SEQ ID NO: 2

IQVLMAAASFGQTK1P

Tato sekvence neměla protějšek v žádném proteinu ze zkoumaných databází a lišila se od Nkoncové sekvence aminokyselin:

SEQ ID NO: 3

MKPLVVFVLGG popsané u erytrocytového cytoplazmatického PAF-AH ve Stafforini et al. (1993), viz výše. Nová sekvence (SEQ ID NO: 2) byla využita při klonování cDNA lidské plazmatické PAF-AH, jak je popsáno dále v Příkladu 3.

- 13 CZ 297603 B6

Příklad 3

Klon kódující úplnou lidskou plazmatickou PAF-AH byl izolován zmakrofágové cDNA knihovny.

A. Konstrukce makrofágové cDNA knihovny.

Z makrofágů periferní krve odvozených od monocytů byla izolována póly A+ RNA. Dvouřetězcová, tupě zakončená cDNA byla získána pomocí soupravy Invitrogen Copy Kit (San Diego, CA), k ní byly ligací připojeny adaptory BstXI a pak byla vložena do savčího expresního vektoru pRc/CMV (Invitrogen). Vzniklý plazmid byl vnesen elektroporací do E. coli XL-1 Blue. Transformované bakterie byly vysety na 978 ploten v hustotě asi 3000 kolonií na plotnu. Plazmidová DNA připravená odděleně z každé plotny byla uložena v jednotlivých souborech, byla též spojena do větších souborů, reprezentujících 300 000 klonů.

B. Testování knihovny pomocí PCR

Makrofágová knihovna byla testována pomocí polymerázové řetězové reakce s využitím degenerovaných „antisense“ primerů navržených na základě nové N-koncové aminokyselinové sekvence popsané v Příkladu 2. Sekvence primeru je uvedena v souladu s nomenklaturou IUPAC, „1“ znamení inozin.

SEQ ID NO: 4

5' ACATGAATTCGGIATCYTTIGTYTGICCRAA 3'

Tabulka výběru kodonů (Wadaet al. Nuc. Acids Res., 19S. 19811986 (1991)) byla užita k určení nukleotidu na třetí pozici každého kodonu tohoto primeru. K testování souborů makrofágové knihovny o 300 000 klonech byl užit tento primer v kombinaci s primerem specifickým pro bud’ SP6, anebo T7 promotorovou sekvenci, nalézající se po obou stranách klonovacího místa vektoru pRc/CMV. Každá PCR reakční směs se skládala ze 100 ng templátové dCNA, lpg každého ze dvou primerů, 0,125 mM každého ze čtyř dNTP, 10 mM Tris-Hcl pH 8,4, 50 mM MgCb a 2,5 jednotky Taq polymerázy. Počáteční denaturační krok trvající 4 minuty při 94 °C byl následován 30 cykly amplifikace skládajícími se z 1 minuty při 94 °C, I minuty při 60 °C a 2 minut při 72 °C. Výsledný PCR produkt byl nakloňován do vektoru bBluescript SK- (Stratagene, La Jolla, CA) a jeho nukleotidová sekvence stanovena pomocí dideoxy metody. Tento PCR produkt obsahoval sekvenci odvoditelnou od nové peptidové sekvence a odpovídající nukleotidům 1 až 331 (SEQ ID NO: 7).

Dále jsou uvedeny PCR primery, specifické pro výše popsaný klonovaný PCR fragment a určené k nalezení klonu o úplné délce.

„Sense“ primer (SEQ ID NO: 5)

5' TATTTCTAGAAGTGTGGTGGAACTCGCTGG 3' „Antisense“ primer (SEQ ID NO: 6)

5' CGATGAATTCAGCTTGCAGCAGCCATCAGTAC 3'

PCR reakce s využitím těchto primerů byly provedeny jak bylo popsáno výše a posloužily k prvnímu testování souborů cDNA o 300 000 klonech a poté k testování příslušných menších souborů o 3000 klonech. Tři soubory o 3000 klonech, které dávaly PCR produkt očekávané velikosti byly použity k transformaci bakterií.

C. Testování knihovny pomocí hydridizace

DNA z těchto bakterií byla testována pomocí hybridizace s využitím původního nakloňovaného PCR fragmentu jako sondy. Kolonie byly přeneseny na nitrocelulózu, prehybridizovány a hybridizovány v 50% formamidu, 0,75M chloridu sodném, 0,075M citrátu sodném, 0,05M fosfátu

- 14CZ 297603 B6 sodné, pH 6,5, 1% polyvinylpyrolidonu, 1% fikolu, 1% hovězího sérum albuminu a 50 ng/ml sonikované DNA z lososího mléči. Hybridizační sonda byla značena postupem „random priming“ s hexamey. Hybridizace byla provedena při 42 °C přes noc, membrány byly intenzivně omyty 0,03M chloridem sodným, 3mM citrátem sodným, 0,1% SDS při 42 °C. Byla stanovena sekvence nukleotidů u 10 klonů dávajících pozitivní signál. Jeden z těchto klonů, sAH 406-3, obsahoval sekvenci odvoditelnou na základě původní peptidové sekvence proteinu s PAF-AH aktivitou purifikované z lidské plazmy. Sekvence DNA a aminokyselinová sekvence zní odvozená jsou uvedeny v SEQ ID NO: 7 (DNA) a SEQ ID NO: 8 (aminokyseliny).

Klon sAH 406-3 obsahuje 1,52 kb dlouhý inzert s otevřeným čtecím rámcem, který kóduje předpokládaný protein skládající se ze 441 aminokyselin. Na N-konci se nachází relativně hydrofobní úsek o délce 41 aminokyselin před N-koncovou aminokyselinovou stanovenou mikrosekvenací proteinu (izoleucin v pozici 42 v SEQ ID NO: 8). Kódovaný protein může mít buď dlouhou signální sekvenci, anebo signální sekvenci plus další peptid, který je odštěpen při vniku zralého funkčního enzymu. Přítomnosti signální sekvence je jedním ze znaků sekretovaných proteinů. Kromě toho se nalézá v proteinu kódovaném klonem sAH 406-3 konsensus motiv GxSxG (aminokyseliny 271-275 v SEQ ID NO: 8), o kterém se předpokládá, že obsahuje serin aktivního místa u všech známých savčích a mikrobiálních lipáz a serinproteáz, viz Chapus et al., Biochemie, 70: 1223-1224 (1988) a Brenner, Nátuře, 334: 528-530 (1988).

Tabulka 2, níže, předkládá srovnání aminokyselinového složení lidské plazmatické PAF-AH, která je předmětem tohoto patentu, založeného na sekvenci SEQ ID NO: 8 s aminokyselinovým složením purifikovaného materiálu popsaném Stafforinim et al., (1987), viz výše.

Tabulka 2

	Klon sAH 406-3	Stafforini etal.
Ala	26	24
Asp & Asn	48	37
Cys	5	14
Glu & Gin	36	42
Phe	22	12
Gly	29	58
His	13	24
He	31	17
Lys	26	50
Leu	40	26
Met	10	7
Pro	15	11
Arg	18	16
Ser	27	36
Thr	20	15
Val	13	14
Trp	7	Nestanoveno
Tyr	14	13

Aminokyselinové složení zralé formy lidské plazmatické PAF-AH, která je předmětem tohoto patentu, a aminokyselinové složení dříve purifikovaného materiálu, který byl označen jako lidská plazmatická PAF-AH, je zřetelně odlišné.

Srovnání nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence hovězího mozkové plazmatické PAF-AH (Hattori et all, viz výše) s nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí lidské plazma

- 15CZ 297603 B6 tické PAF-AH, který je předmětem tohoto patentu, neodhalilo žádnou významnou strukturní podobnost těchto sekvencí.

Příklad 4

PCR provedená s cDNA z makrofátů a stimulovaných PBCM s využitím primerů hybridizujících s 5' nepředkládanou oblastí (nukleotidy 31 až 52 v SEQ ID NO: 7) a oblastí obsahující translační terminační kodon na 3' konci PAF-AH cDNA (nukleotidy 1465 až 1487 v SEQ ID NO: 7) nalezla předpokládaná střihovou variantu (splice variant) lidského PAF-AH genu. Výsledkem této PCR reakce byly dva proužky na gelu, jeden z nich odpovídající očekávané velikosti PAFAH cDNA z Příkladu 3 a druhý kratší asi o 100 bp. Větší proužek byl identifikován na základě sekvenování s PAF-AH cDNA z Příkladu 3, zatímco kratší proužek postrádal exon 2 (viz Příklad 5 níže) PAF-AH sekvence, který kóduje předpokládanou signální a propeptidovou sekvenci plazmatického PAF-AH.

V kraším klonu je přítomna předpokládaná katalytická triáda a všechny cysteinové zbytky, proto je biochemická aktivita proteinu kódovaného tímto klonem pravděpodobně shodná s aktivitou plazmatického enzymu.

Aby se stanovil biologický význam této střihové varianty PAF-AH, o které se předpokládá, že kóduje cytoplazmaticky aktivní enzym, bylo zkoumáno relativní množství obou forem v krevních makrofágách odvozených od monocytů pomocí metody „RNase protection“. Ani jedna z obou mRNA nebyla přítomna v čerstvě izolovaných monocytech, avšak obě mRNA byly nalezeny v den 2 během in vitro diferenciace monocytů v makrofágy a přetrvávaly 6 dnů kultivace. Množství obou mRNA bylo přibližně stejné během celého obcodí diferenciace. Naopak podobná analýza nervové tkáně detegovala pouze expresi mRNA úplné délky kódující extracelulámí úplnou formu PAF-AH.

Příklad 5

Rovněž byly izolovány genomické sekvence lidské plazmatické PAF-AH. Struktura PAF-AH genu byla stanovena izolací fágových klonů lambda a Pl, obsahujících lidskou genomickou DNA, pomocí DNA hybridizace v podmínkách vysoké stringence. Fragmenty fágových klonů byly dále klonovány a sekvenovány pomocí primerů přisedajících v pravidelných intervalech kcDNA klonu sAH 406-3. Navíc byly připraveny nové sekvenační primery homologní k oblastem intronů hraničících s exony a využity k protisměrnému sekvenování přes hranice exon-intron za účelem potvrzení sekvence. Hranice exon/intron byly definovány jako body, kde se genomická sekvence a cDNA začínají odlišovat. Tato analýza zjistila složení lidského PAFAH genu z 12 exonů.

Exony 1, 2, 3, 4, 5, 6 a část exonu 7 byly izolovány z mužské fetální placentální knihovny konstruované v lambda FIX (Stratagene). Fágové plaky byly přeneseny na nitrocelulózu, prehybridizovány a hybridizovány v 50% formamidu, 0,75M chloridu sodném, 75mM citrátu sodném, 50 mM fosfátu sodném (pH 6,5), 1% polyvinylpyrrolidonu, 1% fikolu, 1% hovězím sérum albuminu a 50 ng/ml sonikované DNA z lososího mlíčí. Úplný cDNA klon sAH 406-3 byl užit jako hybridizační sonda k identifikaci fágových klonů obsahujících exony 2-6 a část exonu 7. Klon obsahující exon 1 byl identifikován pomocí fragmentu odvozeného z 5' konce tohoto cDNA klonu (nukleotidy 1 až 312 v SEQ ID NO: 7). Obě sondy byly značeny pomocí ³² P metodou „random priming“ s hexametry. Hybridizace byla provedena při 42 °C přes noc, membrány byly intenzivně omyty 30 mM chloridem sodným, 3mM citrátem sodným, 0,1% SDS při 42 °C. DNA sekvence exonů 1, 2, 3, 4, 5 a 6 spolu s částečnými sekvencemi sousedících iontronů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 9, 10, 11, 12, 13 a 14.

- 16CZ 297603 B6

Zbytek exonu Ί a exony 8, 9, 10, 11 a 12 byly nakloňovány z PÍ klonu izolovaného z lidské PÍ genomické knihovny. Plaky PÍ fágů byly přeneseny na nitrocelulózu, prehybridizovány a hybridizovány v 0,75M chloridu sodném, 50 mM fosfátu sodném (pH 7,4), 5 mM EDTA, 1% polyvinylpyrolidonu, 1% fikolu, 1% hovězím sérum albuminu, 0,5% SDS a 0,1 mg/ml celkové lidské DNA. 2,6 kb EcoRI fragment genomické DNA odvozená do 3' konce klonu lambda izolovaného dříve byl užit jako sonda a označen pomocí³² P metodou „random priming“ s hexamery. Tento fragment obsahoval exon 6 až část exonu 7, přítomného ve fágovém klonu. Po hybridizaci přes noc při 65 °C byly membrány omyty jak bylo popsáno výše. DNA sekvence exonů 7, 8, 9, 10, 11 a 12 spolu s částečnými sekvencemi sousedících intronů jsou uvedeny v SEQ ID NO: 15, 16, 17, 18, 19 a 20.

Příklad 6

Úplné klony cDNA plazmatické PAF-AH byly izolovány z cDNA knihovny z myší, psí, hovězí a slepičí sleziny, neúplný hlodavčí klon byl izolován z cDNA knihovny z krysího brzlíku. Tyto klony byly identifikovány pomocí hybridizace o nízké stringenci s lidskou cDNA (hybridizační podmínky byly stejné, jak bylo popsáno výše v případě exonů 1 až 6 v Příkladu 5, jen namísto 50% fosmamidu byl užit formamid 20%). Jako sonda byl použit 1 kb Hind III fragment lidského PAF-AH cDNA klonu sAH 406-3 (nukleotidy 309 až 1322 v SEQ ID NO: 7). Kromě toho byl izolován neúplný opičí klon z cDNA z mozku makaka pomocí PCR a primerů navržených podle sekvence nukleotidů 285 až 303 a 851 až 867 ze SEQ ID NO: 7: Nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence cDNA klonů z myši, psa, krávy, slepice, krysy a makaka jsou uvedeny v tomto pořadí v SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24 a 25 a 26.

Srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí cDNA klonů s lidským cDNA klonem poskytlo údaje o podílu identických aminokyselin v procentech, které jsou uvedeny v tab. 3 níže.

Tabulka 3

	Člověk	Pes	Myš	Kráva	Slepice
Pes	80	100	64	82	50
Myš	66	64	100	64	47
Opice	92	82	69	80	52
Krysa	74	69	82	69	55
Kráva	82	82	64	100	50
Slepice	50	50	47	50	100

Asi 38 % aminokyselinových zbytků je kompletně konzervováno ve všech sekvencích. Nejproměnlivější oblasti se nacházejí na N-konci (obsahují signální sekvenci) a na C-konci a nejsou významné pro enzymovou aktivitu, jak je ukázáno v Příkladu 10. Motiv Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly (SEQ ID NO: 27) nalezený v neutrálních lipázách a jiných esterázách je konzervován v hovězí, psí, myší, krysí a slepičí PAF-AH. Serin, nacházející se uprostřed tohoto motivu, slouží těmto enzymům jako aktivní nukleofilní místo. Předpokládané aspartátová a histidinové složky aktivního místa (Příklad 10A) jsou rovně konzervovány. Lidská plazmatická PAF-AH, která je předmětem tohoto patentu, tedy pravděpodobně využívá katalytickou triádu a může zaujmout □ O..hydrolázovou konformaci typickou pro neutrální lipázy, i když jinak nevykazuje sekvenční homologii s lipázami.

Lidská plazmatická PAF-AH by měla obsahovat oblast, která specificky interaguje s lipoproteinovými částicemi (low density a high density) v plazmě. N-koncová část molekuly obsahující dlouhém úseky vysoce mezidruhově konzervovaných aminokyselin, ale nikoliv katalytické triády enzymu, by mohla zprostředkovat tyto interakce.

- 17CZ 297603 B6

Příklad 7

Expresní konstrukt PRC/CMV byl krtkodobě exprimován v buňkách COS 7 za účelem stanovení PAF-AH aktivity proteinu, kódované sAH 406-3 klonem cDNA lidského plazmatického PAFAH (Příklad 3). PAF-AH aktivita v médiu z COS buněk byla zjišťována tři dny po transfekcí těchto buněk pomocí DEAE dextranu.

ίο Buňky byly zaočkovány v hustotě 300 000 buněk na jednu kultivační misku o průměru 60 mm. Následující den byly buňky inkubovány 2 hodiny v DMEM obsahujícím 0,5 mg/ml DEAE dextranu, 0,1 mM chloroquine a 5 až 10 pg plazmidové DNA. Poté byly buňky opracovány 10% DMSO po dobu 1 minuty, omyty médiem a inkubovány v DMEM obsahujícím 10% fetální telecí sérum, ve kterém byla předtím inaktivována endogenní PAF-AH aktivita pomocí diizopropyl15 fluorofosfátu (DFP). Po třech dnech inkubace byla v médiích z transformovaných buněk zjišťována PAF-AH aktivita. Měření této aktivity byla prováděna v přítomnosti a nepřítomnosti buď 10 mM EDTA, nebo 1 mM DFP, aby se zjistilo, zda rekombinantní enzym vyžaduje vápník a zda je inhibován DFP, který je inhibitorem serin esteráz, jak bylo popsáno u PAF-AH Stafforinin et al. (1987), viz výše. Negativní kontroly zahrnovaly buňky transformované pRc/CMF bez inzertu, 20 anebo s inzertem sAH 406-3 s opačné orientaci.

PAF-AH aktivita v supernatantech z transformovaných buněk byla zjišťována metodou Stafforiniho et al.( 1990), viz výše, s následujícími modifikacemi. Stručně shrnuto, PAF-AH aktivita byla stanovována měřením hydrolýzy ³H acetátu z [acetyl-³H] PAF (New England Nuclar, 25 Boston, MA). Volný ³H acetát ve vodní fázi byl oddělen od značeného substrátu pomocí chromatografie v reverzní fázi na oktadecylsilikagelu (Baker Research Products, Phillipsburg, PA). Stanovení byla prováděna s 10 μΐ supematantu z transformovaných buněk v 0,lM Hepes pufru, pH 7,2, v reakčním objemu 50 μΐ. V jedné reakci bylo užito celkem 50 pmol substrátu s poměrem značený : neznačený PAF 1:5. Reakční směsi byly inkubovány 30 minut při 37 °C a zastaveny 30 přidáním 40 μΐ 10M kyseliny octové. Roztok byl pak promyt na koloně s oktadecylsilikagelem, propláchnuté poté 0,lM acetátem sodným. Eluát každého vzorku byl odebrán a měřen na scintilačním počítači po dobu jedné minuty.

Jak je ukázáno na obr. 2, média z buněk, transformovaných s sAH 406-3, obsahovala PAF-AH 35 aktivitu o hodnotách čtyřikrát vyšších než pozadí. Tato aktivita nebyla ovlivněna přítomností

EDTA, avšak byla inhibována 1 mM DFP. Tato pozorování dokazují, že klon sAH 406-3 kóduje enzym, jehož aktivita je v souladu s lidským plazmatickým enzymem PAF-AH.

Příklad 8

DNA kódující lidskou plazmaticko PAF-AH v úplné délce, její různé zkrácené formy a dále chimérickou myší-lidskou PAF-AH byla pomocí rekombinantních metod exprimována v E. coli a kvasinkách a trvale exprimována v savčích buňkách.

A. Exprese v E. coli

Pomocí PCR byl vytvořen protein kódující fragment dDNA klonu sAH 406-3 pro lidskou plazmatickou PAF-AH, vhodný k okamžitému dalšímu klonování v expresním vektoru v E. coli. 50 Tento segment začíná na 5' konci lidského genu kodonem pro Ile42 (SEQ ID NO: 8), N-koncový aminokyselinový zbytek enzymu purifikováného z lidské plazmy. V konstruktu byl zahrnut zbytek genu včetně původního terminačního kodonu. Byl použit následující 5' „sense“ primer:

- 18CZ 297603 B6

SEQ ID NO: 28

5'TATTCTAGAATTATGATACAAGTATTAATGGCTGCTGCAAG 3', který obsahoval Xbal klonovací místo translační iniciační kodon (podtržený). Byl použit násle5 dující 3' „antisense“ primer:

SEQ ID NO: 29

5'ATTGATATCCTAATTGTATTTCTCTATTCCTG 3' io Tento primer zahrnoval terminační kodon sAH 406-3 a obsahoval EcoRVklonovací místo. PCR reakce byly provedeny tak, jak bylo popsáno v Příkladu 3. Výsledný PCR produkt byl štěpen enzym Xbal\ ExoRV a dále klonován ve vektoru pBR322 obsahujícím promotor Trp (deBoer et al., PNAS, 80:21-25 (1983)) těsně před klonovacím místem. Kmen E. coli XL-1 Blue byl transformován expresním konstruktem a kultivován vL půdě obsahující karbenicilin v koncentraci 15 100pg/ml. Transformanty rostly přes noc, byly centrifugovány a resuspendovány v lytickém pufru skládajícím se z 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 50 mM NaCl, 10 mM CHAPS, 1 mM EDTA, 100 pg/nil lysozymy a 0,05 trypsin inhibujících jednotek (TIU)/ml Aprotininu. Po jednohodinové inkubaci na ledu a dvouminutové sonikaci byla v lyzátech stanovena aktivita PAF-AH metodou popsanou v Příkladu 4. E. coli transformovaná expresním konstruktem (označeným trp AH) 20 vytvářela protein s PAF-AH aktivitou. Viz tab. 6 v příkladu 9.

Byly použity i konstrukty obsahující jiné promotory, řídící expresi lidského PAF-AH v E. coli tacll promotor (deBoer, viz výše), arabinózový (ara B) promotor ze Salmonella typhimurium [Horwitz et al.. Gene, 14: 309-319 (1981)]) a promotor bakteriofága T7. Konstrukty obsahující 25 Trp promotor (pUC trp AH), tacll promotor (pUC tac AH) a araB promotor (pUC ara AH) byly sestrojeny na základě plazmidu pUC19 (Neq England Biolabs, MA), zatímco konstrukt sT7 promotorem (,pET AH) byl utvořen z plazmidu pET15B (Novagen, Medison, Wl). Konstrukt s hybridním promotorem (pHAB/PH), tvořený araB promotorem připojeným k ribozomovému vazebnému místu zT7 promotorové oblasti byl rovněž vytvořen z plazmidu pET15B. Všechny 30 konstrukty produkovaly v E. coli proteiny s PAF-AH aktivitou v rozsahu 20 až 50 U/ml/OD₆₀o·

Tato aktivita odpovídá celkovému množství rekombinantního proteinu >1% všech buněčných proteinů.

Bylo rovněž zhodnoceno několik expresních konstruktů, které produkují v E. coli PAF-AH 35 s prodlouženými N-konci. N-konec přírodní lidské PAF-AH bytů na základě sekvenování aminokyselin stanoven jako Ile₄₂ (Příklad 2). Avšak sekvence bezprostředně před Ile₄₂ neodpovídá aminokyselinám tvořícím cílové místo pro odštěpení signálního peptidu [tj. pravidlo „-3-1“ není splněno, jelikož, v pozici -l není přítomen lyzin, [viz von Heine, Nuc. Acids Res., 14: 4683—4690 (1986)]. Je možné, že je sekrečním systémem buňky rozpoznávána klasičtější signální sekvence 40 (M,-A|₇ nebo Mi-P₂₁) a poté následuje další endoproteolytické štěpení (příklad 2). Celá PAFAH kódující sekvence, začínající metioninem (nukleotidy 162 až 1487 ze sekvence SEQ ID NO: 7) byla upravena pro expresi v E. coli pomocí trp promotoru. Tento konstrukt tvořil aktivní PAFAH, avšak jak je uvedeno v tab. 4, jeho exprese dosahovala asi jedné padesátiny úrovně exprese původního konstruktu, začínajícího Ile₄₂. Tyto výsledky naznačují, že prodloužení proteinu na 45 jeho N-konci není kritické ani nutné pro aktivitu rekombinantního PAF-AH v E. coli.

Tabulka 4

	Aktivita PAF-AH (U/ml/OD600)
Konstrukt	Lyzát	Médium
pUC trp AH (Ile42 na N-konci)	177,7	0,030
pUC trp AH Met,	3,1	0,003
pUC trp AH Val ,8	54,6	0,033

- 19CZ 297603 B6

V E. coli mohou být rovněž připraveny zkrácené rekombinantní formy lidské PAF-AH pomocí plazmidu o malém počtu kopií na buňku a promotoru, který je indukován přidáním arabinózy do kultivačního média. Jednou z takových forem PAF-AH, zkrácených na N-konci, je produkt rekombinantní exprese DNA kódující aminokyselinové zbytky Met_4ň až Asn₄₄i polypeptidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEQ ID NO: 8). Je označen jako rPH.2. Pro produkci rPH.2 v bakteriálních buňkách byl užit plazmid pBAR2/PH.2 odvozený od pBR322, který obsahuje (1) nukleotidy 297 až 1487 ze sekvence SEQ ID NO: 7, která kóduje lidský PAF-AH začínající kodonem pro metionin v pozici 46, (2) araB-C promotory a araC gen z arabinózového operonu Salmonella typhimurium, (3) transkripčně terminační sekvenci z bakteriofága T7 a (4) replikační počátek fága fl.

Konkrétně zahrnuje pBAR/PH.2 následující úseky DNA: (1) oblast od zrušeného AatH místa v pozici 1994 k EcoRI místu v pozici 6274, tj. sekvence vektoru obsahující replikační počátek a geny odpovědné za rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu odvozené od bakteriálního plazmidu pBR322; (2) oblast od EcoRI místa v pozici 6274 k Xbal místu v pozici 131, tj. DNA arabinózového operonu ze Salmonella typhimurium (Benbank accession number: Ml 1046, Ml 1046, Ml 1047, JO 1797); (3) oblast od Xbal místa v pozici 131 kNCOl místu v pozici 170, tj. DNA obsahující vazebné místo pro ribozom zpET-21b (Novagen, Madison, Wl); (4) oblast od Ncol místa v pozici 170 k Xhol místu v pozici 1363, tj. sekvence lidské PAF-AH cDNA a (5) oblast od Xhol místa v pozici 1363 ke zrušenému Aatll místu v pozici 1993, tj. DNA fragment z pET21b (Novagen), obsahující transkripě terminační sekvenci bakteriofága T7 a replikační počátek bakteriofága fl.

Jiná forma PAF-AH, označená jako rPH.9, je produktem rekombinantní exprese DNA kódující aminokyselinové zbytky Met₄6 až Ilen₄29 polypeptidu kódovaného úplnou PAF-AH cDNA (SEQ ID NO: 8). DNA kódující pRH.9 byla vložena do téhož vektoru, který byl užit k produkci rPH.2 a skládá se z následujících úseků DNA: (1) oblast od zrušeného Aatll míst v pozici 1958 k EcoRI místo v pozici 6239, tj. sekvence vektoru obsahující replikační počátek a geny odpovědné za rezistenci k ampicilinu nebo tetracyklinu odvozené od bakteriálního plazmidu pBR322; (2) oblast od EcoRI místa v pozici 6239 kXbal místu v pozici 131, tj. DNA arabinózového operonu ze Salmonella typhimurium (Benbank accession number: Μ11045, Μ11046, Μ11047, JO 1797);); (3) oblast od Xbal místa v pozici 131 kNeol místu v pozici 170, tj. DNA obsahující vazebné místo pro ribozom z pET-21b (Novagen, Madison WI); (4) oblast od Ncol místa v pozici 170 k Xhol místu v pozici 1328, tj. sekvence lidské PAF-AH cDNA a (5) oblast od Xhol místa v pozici 1328 ke zrušenému Aatll místu v pozici 1958, tj. DNA fragment z pET-21 b (Novagen, Madison, WI), obsahující transkripčně terminační sekvenci bakteriofága T7 a replikační počátek bakteriofága fl.

Exprese PAF-AH proteinů v pBAR/PH.2 a v pBAR/PH.9 je řízena promotorem araB, který je v přítomnosti glukózy a nepřítomnosti arabinózy dokonale reprimován, ale funguje jako silný promotor pro přidání L-arabinózy do média s vyčerpanou glukózou. Selekce buněk s plazmidem je dosaženo přidáním ampicilinu (nebo příbuzného antibiotika) nebo tetracyklinu do média. Pro expresi rekombinantního PAF-AH může být použita řada kmenů E. coli včetně (ale ne výhradně) kmenů prototrofních v metabolismu arabinózy jako např. W3110, DH5D, BL21, C600, JMI01 a jejich derivátů, kmenů nesoucích mutace snižující proteolýzu jako např. CAG629, KY1429 a kmenů neschopných rozkládat arabinózu jako např. SB7219 a MC1061. Výhoda použití kmene, který nedokáže rozkládat arabinózu, spočívá v tom, že induktor (arabinóza) exprese PAF-AH není odčerpáván z média během indukční periody, což vede k vyšším hladinám PAF-AH ve srovnání s hladinami, dosaženými u kmenů schopných metabolizovat arabinózu. Aktivní PAFAH formy jsou exprimovány v různých kmenech E. coli v jakémkoliv vhodném médiu a za jakýchkoliv vhodných podmínek. Bohatá média LB, EDM295d (minimální médium M9 doplněné kvasničným extraktem a kyselým hydrolyzátem kaseinu), stejně jako „definovaná“ média (A675, tj. minimální médium A nastavené na pH 6,75, s glycerolem jako zdrojem uhlíku, doplněné stopovými prvky a vitamíny) dovolují značnou produkci rPAF-AH forem. Do médií je přidáván tetracyklin, který zajišťuje díky selekčnímu tlaku přítomnost plazmidu v kultuře.

-20CZ 297603 B6

Kmen E. coli MC1061 (ATCC 53338), nesoucí deleci arabinózového operonu a tudíž neschopný metabolizovat arabinózu, byl transformován plazmidem pBAR2/PH.2. Kmen MC1061 je autotrofní na leucin, byl kultivován za stálého doplňování médii obsahujícími kaseinový extrakt a komplementujícími tak leucinovou mutaci. Buňky E. coli transformované pBAR2/PH.2 byly pěstovány při 30 °C v růstových médiích obsahujících 2g/L glukózy. Glukóza má dvojí význam slouží jako zdroj uhlíku pro růst buněk a jako represor arabinózového promotoru. Když poklesla hladina glukózy na <50 mg/L, započalo doplňování živin pomocí koncentrátu (glukóza v koncentraci 300 g/L). Doplňování glukózy se po dobu 16 hodin lineárně zvyšovalo rychlostí, která omezovala tvorbu kyselých vedlejších produktů. V tomto okamžiku bylo doplňování glukózy nahraženo přidáváním glycerolu. Současně byla přidávána L-arabinóza (500g/L) do výsledné koncentrace 5 g/L. Doplňování glycerolu bylo udržováno ve stálé výši po dobu 22 hodin. Buňky byly sklizeny pomocí filtrace na dutý vláknech, přitom se suspenze buněk asi 1 Okřát zahustila. Buněčný sediment byl uložen při -70 °C. Celková buněčná hmota dosahovala asi 80g/L (OD₆oo = 50 - 60) s PAF-AH aktivitou 65 až 70 jednotek/OD/ml, což představuje asi 10 % všech buněčných proteinů. Bakteriální kultura o konečném objemu asi 75 litrů obsahovala 50 až 60 g PAF-AH.

Vysoké úrovně produkce rPAF-AH forem může být docíleno expresí pBAR2/PH.2 nebo PH.9 ve kmenech SB7219 a MC1061. Jiné kmeny neschopné odbourávat arabinózu jsou rovněž vhodné k dosažení vysoké hustoty bakteriální kultury. Doporučují se následující podmínky kultivace bakterií. Fermentační tanky obsahující kultivační médium se 2g/L glukózy jsou zaočkovány exponenciálně rostoucími kmeny SB7210; pBAR2/Ph.2 a SB7219; pBAR2/PH.9. P spotřebování glukózy jsou fermentační tanky zásobovány roztokem glycerolu obsahujícím stopové prvky, vitamíny, hořčík a amonné soli tak, aby byl udržen dravý exponenciální růst. Teplota fermentoru je udržována na 30 °C, tanky jsou provzdušňovány a potřepávány tak, že je hladina rozpuštěného kyslíku nad 15 % saturace. Když je hustota bakteriální kultury vyšší než 110 g/L (mokrá váha), jsou živiny doplňovány konstantní rychlostí, ke kultuře je přidána L-arabinóza (konečná koncentrace asi 0,5%). Tvorba produktu je sledována po dobu 16 až 22 hodin. Výtěžek dosahuje zpravidla hodnot 40 a 50 g/L (suchá váha buněk). Buňky jsou sklizeny centrifugací, uloženy při 70 °C a rPAF-AH je vyčištěn pro další analýzy. Specifické výtěžky vyšší než 150 jednotek/ml/OD₆oo jsou dosahovány běžně

B. Exprese v kvasinkách

Lidská rekombinantní PAF-AH byla rovněž exprimována v Saccharomyces cerevisiae. K řízení exprese rPAF-AH byl užit kvasničný promotor ADH2, produkce dosáhla hodnot 7 jednotek/ml/OD₆oo (Tab. 5).

Tabulka 5

Konstrukt	Promotor	Kmen	Aktivita enzymu (U/ml/OD)
pUC tac AH	tac	E. coli W3110	30
pUC trp AH	trp	E. coli W3110	40
pUC ara AH	araft	E. coliWWQ	20
pET AH	T7	E. coli BL21 (DE3) (Novagen)	50
pHAB/PB	araB/T7	E. coli XL-1	34
pBAR2/PH.2	araB	MC1061	90
pYep ADH2 AH	ADH2	Yeast BJ2.28	7

-21 CZ 297603 B6

C. Exprese PAF-AH v savčích buňkách

1. Exprese lidského PAF-AH cDNA konstruktu Plazmidy konstruované k expresi PAF-AH využívají s výjimkou pSFN/PAFAH.l silný virový promotor původem z cytomegaloviru, polyadenylační místo z genu pro kravský růstový hormon a replikační počátek viru SV40 k zajištění vysokého po počtu kopií plazmidu v COS buňkách. Plazmidy byly vneseny do buněk pomocí elektroporace. Nejprve byla připravena sada plazmidu, ve kterých byla buď 5' hraniční sekvence (pDCl/PAFAH.l), anebo jak 5', tak 3' hraniční sekvence lidské PAF-AH cDNA (PDC1/PAFAH.2), nahraženy hraničními oblastmi jiných genů, které se vyznačují vysokou úrovní exprese v savčích buňkách. Transfekce těchto plazmidů do COS, CHO či 293 buněk vedla k produkci PAF-AH ve stejné výši (0,01 jednotek/ml tedy 2-4krát výšce nad úrovní pozadí), jaké bylo dosaženo s klonem sAH-406 po transientní expresi COS buněk (Příklad 7). Byl konstruován další plazmid obsahující promotor Friendova slezinného viru namísto promotoru cytomegaloviru. cDNA pro lidskou PAF-AH byla vložena do plazmidu pmH-neo (Hahn et al., Gene, 127: 267 (1993)) pod kontrolu promotoru Friendova slezinného viru. Po transfekci buněk myelomové linie NS0 plazmidem pSFN/PAFAH.l a testování několika set klonů byly nalezeny dvě transfektanty (4BI1 a 1C11), které dávaly 0,15 - 0,5 jednotek/ml aktivity PAF-AH. Produktivita těchto dvou NS0 transfektant odpovídá asi 0,1 mg/litr, předpokládáme-li specifickou aktivitu asi 5000 jednotek/mg.

2. Exprese PAF-AH chimérických konstruktů tvořených myším a lidským genem

Konstrukt pRC/MS9 obsahující cDNA pro myší PAF-AH v savčím expresním vektoru pRc/CMV vedl po transfekci do COS buněk k produkci sekretorové formy PAF-AH ve výši 5 až 10 jednotek/ml (lOOOkrát výše nad úrovní pozadí). Předpokládáme-li že je specifická aktivita myší PAF-AH přibližně stejná jako u lidského enzymu, je myší cDNA exprimována asi 500krát až 1 OOOkrát více než lidská cDNA pro PAF-AH.

Aby mohl být prozkoumán rozdíl mezi úrovní exprese lidské a myší PAF-AH v COS buňkách, byly sestrojeny dva chimérické lidské-myší geny a sledovány z hlediska exprese v COS buňkách. První konstrukt, pRc/PH.MHCl, obsahuje kódující sekvence pro 97N-koncový aminokyselin myšího PAF-AH polypeptidu (SEQ ID NO: 21) připojených k 343 C-koncovým aminokyselinám lidské PAF-AH v expresním vektoru pRc/CMV (Invitrogen, San Diego, CA). Druhý chimérický gen v plazmidu pRc/PH.MHC2 obsahuje kódující sekvenci pro 40 N-koncových aminokyselin myšího PAF-AH polypeptidu připojených ke 400 C-koncovým zbytkům lidské PAF-AH v pRc/CMV. Po transfekci COS buněk plazmidem pRc/PH.MHCl došlo k akumulaci 1 až 2 jednotek/ml PAF-AH aktivity v médiu. V kondiciovaných médiích z buněčné kultury transformované plazmidem pRc/PhMHC2 byla zjištěna jen 0,01 jednotek/ml PAF-AH aktivity. Z těchto pokusů plyne, že rozdíl v úrovni exprese myšího a lidského PAF-AH genu je alespoň částečně způsoben vlastnostmi polypeptidového segmentu vymezeného aminokyselinovými zbytky 40 až 97, anebo příslušným úseku RNA či DNA, kódujícím tuto oblast PAF-AH proteinu.

3. Překódování prvních 290 bp kódujících sekvence PAF-AH

Jedna z hypotéz vysvětlujících nízkou úroveň syntézy lidské PAF-AH v transformovaných savčích buňkách předpokládá, že užití kodonů v přirozeném genu není optimální pro účinnou expresi. Nezdá se však pravděpodobné, že by typ užitých kodonů mohl být zodpovědný za 500lOOOnásobný rozdíl v úrovni exprese mezi lidským a myším genem, protože optimalizace užití kodonů vede jen 1 Onásobnému zvýšení exprese. Druhá hypotéza vysvětluje rozdílnou úroveň exprese myšího a lidského PAF-AH genu přítomností sekundární struktury v 5' kódující oblastí lidské PAF-AH mRNA, která vede k relativně rychlé degradaci mRNA, anebo způsobuje neúčinnou iniciaci či elongaci translace.

Za účelem ověření těchto hypotéz byl sestrojen syntetický fragment kódující původní lidský PAF-AH protein od N-konce až k aminokyselinovému zbytku 96, ve kterém byla většina

- 22 CZ 297603 B6 kodonů nahrazena („překódována“) kodony pro tutéž aminokyselinu, avšak majícími odlišnou sekvenci. Změna z GTG na GTA ve druhém kodonu vedla k vytvoření Asp718 místa, které je na jednom konci syntetického fragmentu a které je rovněž přítomno v myší cDNA. Druhý konec fragmentu obsahoval BamHI místo vyskytující se v kodonu 97 lidského genu. Asp718/BamHI fragmentu dlouhý asi 290 bp byl odvozen z PCR fragmentu připraveného pomocí duální asymetrické PCR; postupu pro konstrukci syntetických genů popsaného v Sandhu et al., BioTechniques, 72.Ί4-16 (1992). Syntetický Asp718/BamHl fragment byl ligován s DNA fragmenty, kódujícími zbytek molekuly lidské PAF-AH, začínajícími nukleotidem 453 ze SEQ ID NO: 7. Poté byla sekvence kódující původní lidský PAF-AH enzym vložena do savčího expresního vektoru pRc/CMF (Invitrogen, San Dieg), čímž byl vytvořen plazmid pRc/HPH.4. Úplná sekvence překódovaného genu je uvedena v SEQ ID NO: 30. Oblast v pRC/HPH.4 přiléhající k 5' konci sekvence kódující lidskou PAF-AH pochází z myší cNDA pro PAF-AH v pRC/MS9 (nukleotidy 1 až 116 ze SEQ ID NO: 21).

COS buňky byly tranzientně transformovány plazmidy pRc/HPH.4 (překódovaný lidský gen), pRc/MS9 (myší PAF-AH) a pRc/pH.MHCl (hybridní sekvence myš-člověk č. 1) za účelem stanovení exprese lidského PAF-AH z pRc/HPH.4. V kondiciovaných médiích z transformovaných buněčných kultur byla zjišťována PAF-AH aktivita, která nabývala hodnot 5,7 jednotek/ml (myší gen), 0,9 jednotek/ml (hybridní sekvence myš-člověk č. 1), a 2,6 jednotek/ml (překódovaný lidský gen). Překódování prvních 290 bp kódující sekvence pro lidsko PAF-AH se ukázalo být úspěšnou strategií a zvedlo hladinu exprese lidské PAF-AH z několika nanogramů/ml na asi 0,5 mikrogramu/ml během tranzientní transformace COS buněk. Překódovaný gen pro PAF-AH z plazmidu pRc/HPH.4 bude vložen do savčího expresního vektoru obsahujícího gen pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) a tímto vektorem bude transformována DHFR negativní buněčná linie ovaria čínského křečka. Transformované buňky budou podrobeny selekci methotrexátem, tak budou získány klony, které tvoří velké množství lidské PAF-Ah díky genové amplifikaci.

Příklad 9

Lidská rekombinantní plazmatická PAF-AH (počínající Ile₄₂), exprimovaná v E. coli, byla přečištěna na úroveň jediného Coomassie modří obarveného proužku na SDS-PAGE pomocí různých metod. Rovněž byly stanovovány aktivity vykazované nativním enzymem PAF-AH.

A. Purifikace rekombinantní PAF-AH

První použitý purifikační postup je podobný tomu, který byl popsán v Příkladu 1 pro nativní PAF-AH. Následující kroky byly prováděny při 4 °C. Pellet z 50 ml kultury E. coli produkující PAF-AH (transformované expresním konstruktem trp AH) byl lyžován tak, jak je popsáno v Příkladu 8. Pevné částečky byly odstraněny centrifugací při 10 000 g po dobu 20 minut. Supernatant byl nanesen rychlostí 0,8 ml/min na kolonu Blue sepharose Fast Flow (2,5 cm x 4 cm; objem náplně 20 ml), která byla ekvilibrována pufrem D (25 mM Tris-HCl, lOmM CHAPS, 0,5M NaCl, pH 7,5). Kolona byla promyta 100 ml pufru D a eluována rychlostí 3,2 ml/min 100 ml pufru A obsahujícího 0,5M KSCN. 15 ml aktivní frakce bylo naneseno na 1 ml kolonu Cu chelating Sepharose, ekvilibrovanou pufrem D. Tato kolona byla promyta 5 ml pufru D, dále následovala eluce 5 ml pufru D obsahujícího lOOmM imidazol gravitačním tokem. Frakce s PAF-AH aktivitou byly analyzovány pomocí SDS-PAGE.

Výsledky purifikace jsou znázorněny v Tab. 6, ve které se jednotka rovná hydrolýze pmol PAF za hodinu. Produkt purifikace získaný při 4 °C se objevil na SDS-PAGE jako jediný intenzivně zbarvený proužek pod polohou markéru 43 kDa, s náznakem difúzního zbarvení těsně pod a nad sebou. Rekombinantní materiál je výrazně čistší a vykazuje vyšší specifickou aktivitu ve srovnání s PAF-AH preparátem z plazmy, popsaným v Příkladu 1.

-23 CZ 297603 B6

Tabulka 6

Vzorek	Objem (ml)	Aktivita (jednotka/ ml)	Celková aktivita (jednotka x 10)	Konc. proteinů (mg/ml)	Specifická aktivita (jednotka/mg)	% návratnosti aktivity	Násobek načištění
						krok.	celk.	krok	celk.
Lyzát	4,5	989	4451	15,6	63	100	100	1	1
Blue	15	64	960	0,07	914	22	22	14.4	14,4
Cu	1	2128	2128	0,55	3869	220	48	4,2	61

Když byla totožná purifikační procedura provedena při laboratorní teplotě, objevila se kromě proužku pod markérem 43 kDa skupina proužků migrujících pod polohou markéru 29 kDa, která korelovala s PAF-AH aktivitou změřenou v plátcích gelu. Tyto proužky s nižší molekulovou váhou mohou být proteolytické fragmenty PAF-AH, které si uchovaly enzymatickou aktivitu.

Při laboratorní teplotě byl použit také další purifikační postup. Pelet (lOOg) E. coli produkujících PAF-AH (transformovaných expresním konstruktem pHC trp AH) byl resupendován ve 200ml lysovacího pufru (25mM Tris, 20mM CHAPS, 50mM NaCl, ImM EDTA, 5(^g/ml benzamidin, pH 7,5) a lysován trojnásobným protlačením přes mikrofluidizér při 15000 psi. Pevné částice byly odstraněny centrifugací při 14300 x g po dobu jedné hodiny. Supematant byl lOx zředěn vzřeďovacím pufru (25mM MES (2-[N-morpholinoJ ethanesulfonic acid), lOmM CHAPS, ImM EDTA, pH 4,9) a nanesen rychlostí 25ml za minutu na kolonu Sepharosy Fost Flow (200ml) (kation-iontoměničová kolona) ekvilibrované v pufru E (25mM MES, lOmM CHAPS, ImM EDTA, 50mM NaCl, pH 5,5). Kolona byla promyta jedním litrem pufru E a eluována 1M NaCl. Eluát byl sbírán do 50ml frakcí, a pH bylo upraveno na 7,5 pomocí 0,5ml 2M Trisu (báze). Frakce obsahující aktivitu PAF-AH byly spojeny a upraveny tak, aby obsahovaly 0,5M NaCl. Takto spojené frakce byly naneseny rychlostí 1 ml/min na kolonu Blue Sepharosy Fast Flow (2,5cm x 4cm; 20ml) ekvi libro vanou v pufru F (25mM Tris, 10 mM CHAPS, 0,05M NaCl, ImM EDTA, pH 7,5). Kolona byla promyta 100 ml pufru F a eluována pufrem F obsahující 3M NaCl rychlostí 4 ml/min. Tento Blue Sepharosový Fast Flow chromatografický krok byl opakován za účelem snížená hladiny endotoxinů ve vzorku. Frakce obsahující aktivitu PAF-AH byly spojeny a dialyzovány proti pufru G (25 mM Tris, pH 7,5, 0,5M NaCl, 0,1% Tween 80, ImM EDTA).

Výsledky purifikace jsou ukázány v tabulce 7, ve které se jednotka rovná μπιοί hydrolýzy PAF za hodinu.

Tabulka 7

Vzorek	Objem (ml)	Aktivita (jednotka/ ml)	Celková aktivita (jednotka xlO3)	Konc. proteinů (mg/ml)	Specifická aktivita (jednotka/mg)	% návratnosti aktivity	Násobek načištění
						krok.	celk.	krok	celk.
Lyzát	200	5640	1128	57.46	98	100	100	1	1
S	111	5742	637	3,69	1557	57	56	16	16
Blue	100	3944	394	0,84	4676	35	62	3	48

Získaný produkt purifikace vypadal na SDS-PAGE jako jediný intenzivní proužek pod značkou 43 kDa s troškou difuzního zbarvení přímo pod a nad proužkem. Rekombinantní materiál je podstatně čistší a vykazuje větší specifickou aktivitu v porovnání s přípravou PAF-AH z plazmy jak je popsáno v Příkladu 1.

Ještě jeden purifikační protokol je uvažován tímto předkládaným vynálezem. Ten zahrnuje lyži buněk, pročištění a první kolonový krok. Buňky byly zředěny 1:1 v lyzovacím pufru (25mM Tris pH 7,5, 150mM NaCl, 1% Tween 80, 2mM EDTA). lyže byla provedena v chlazeném mikrofluidizéru při 15000 až 20000 psi. Bylo použito trojnásobného protlačení materiálu přes mikrofluidizér s cílem dosáhnout >99% rozbití buněk. Lyzát byl zředěn 1:20 v ředicím pufru (25mM

-24CZ 297603 B6

Tris pH 8,5, lmM EDTA) a aplikován na kolonu naplněnou chromatografickým médiem QSepharosa Big Bead (Pharmacia). Kolona byla ekvilibrována v roztoku 25mM Tris pH 8,5, lmM EDTA, 0,015% Tween 80. Eluát byl zředěn 1:10 v 25mM MES pH5,5, 1,2M síran amonný, lmM EDTA a nanesen na chromatografické médium Butyl Sepharose (Pharmacia) ekvilibrované stejným pufrem. Aktivita PAF-AH byla eluována roztokem 25mM MES pH 5,5, 0,1% Tween 80, lmM EDTA.

Ještě další metoda purifikace enzymaticky aktivního PAF-AH z E-coli je uvažována v tomto vynálezu. Tato metoda zahrnuje následující kroky: a) příprava extraktu E. coli, která vede po lyži v pufru obsahujícím CHAPS k supentantantu obsahujícímu solubilizovaný PAF-AH; b) ředění výše zmíněného supematantu a jeho aplikace na anion-iontoměničovou kolonu ekvilibrovanou na pH okolo 8,0; c) eluce enzymu PAF-AH zvýše uvedené anion-iontoměnočové kolony; d) nanesení výše uvedeného adjustovaného eluátu z výše uvedené aniont-iontoměniěové kolony na afinitní kolonu obsahující „blue day ligand“; e) eluce výše uvedené kolony obsahující „blue day ligand“ pufrem obsahujícím 3,0M sůl; f) zředění eluátu z kolony obsahující „blue day ligand“ do pufru vhodného pro provedení hydroxylapatitové chromatografíe g) provedení hydroxylapatitové chromatografie kde je promytí a eluce uskutečněna s pomocí pufrů (s obsahem či bez obsahu CHAPS); h) naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu na koncentraci solí vhodnou pro kation-iontoměničovou; i) nanesení výše uvedeného naředěného hydroxylapatitového elátu na kationiontoměničovou kolonu při pH pohybující se v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0; j) eluce PAF-AH z výše uvedené kation-iontoměničové kolony vhodným pufrem vhodného složení; k) provedení kationtoměničové chromatografíe za chladu a 1) složení kapalné nebo zmražené formy PAF-AH v nepřítomnosti CHAPSu. ejlépe je ve výše uvedeném kroku použít a) lyzovací pufr má složení: 25mM Tris, lOOmM NaCI, lmM EDTA, 20mM CHAPS, pH 8,0; v kroku b) ředění supematantu pro anion-iontoměničovou chromatografíí je 3 až 4 krát do 25mM Tris, lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8,0 a kolona je Q-Sepharosová kolona ekvilibrovaná 25mM TRis, lmM EDTA, 50mM NaCI, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku c) je aniontoměničová kolona vymývána s použitím 25mM Tris, 1 mM EDTA, 350mM NaCI, lOmM CHAPS, pH 8,0; v kroku d) je eluát z kroku c) aplikován přímo na afinitní kolonu s „blue dye ligandem“; v kroku e) je kolona eluována pufrem obsahujícím 3M NaCI, lOmM CHAPS, 25mM Tris, pH 8,0; v kroku f) je eluát z Blue dye zředěn pro hydroxylapatitovou chromatografii. Eluát je zředěn lOmM fosforečnanem sodným, lOOmM NaCI, lOmM CHAPS, pH 6,2; v kroku g) je hydroxylapatitová chromatografie doprovázena použitím hydroxalapatitové kolony ekvilibrované lOmM fosforečnanem sodným, lOOmM NaCI, lOmM CHAPS. Eluce je prováděna spoužitím 50mM fosforečnanu sodného, lOOmM NaCI (s či bez lOmM CHAPS), pH 7,5; v kroku h) je provedeno naředění výše uvedeného hydroxylapatitového eluátu pro kation-iontoměničovou chromatografii pomocí pufru o pH v rozmezí přibližně 6,0 až 7,0 a obsahujícím fosforečnan sodný (s či bez CHAPS); v kroku i) je kolona s S-Sepharosou ekvilibrována 50mM fosforečnanem sodným (s či bez 1 OmM CHAPS), pH 6,8; v kroku j) je eluce provedena pufrem vhodného složení jako například 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCI, pH 7,5 a obsahujícího 0,01% Tween 80; v kroku k) je provedena kation-iontoměničová chromatografie při 2 až 8 °C. Příkladem pro vhodné složení pufru použitelného v kroku 1), který stabilizuje PAF-AH je 50mM fosforečnan draselný, 12,5mM kys. aspartová, 125mM NaCI, pH přibližně 7,4 (s či bez přídavku Tween 80 a/nebo Plurinicu F68) nebo 25mM fosfátový (K⁺) pufr obsahující (přinejmenším) 125mM NaCI, 25mM arginin a 0,01% Tewwn-80 (s či bez Pluronicku F68 v koncentraci přibližně 0,1 a 0,5%).

Aktivita rekombinantního PAF-AH

Nejvýraznější vlastností PAF acetylhydrolázy je výrazná specifická pro substráty s krátkými zbytky na sn-2 pozici substrátu. Tato přísná specifícita odlišuje PAF acetylhydrolázu od ostatních forem PLA₂. Ke zjištění, zdali rekombinantní PAF-AH degraduje fosfolipidy s dlouhým řetězcem mastných kyselin na ns-2 pozici byla tedy testována hydrolýza l-palmitoyl-2arachidonyl-sw-glycero-3-fosfocholinu (arachidonylPC). Tato látka je totiž upřednostňovaným substrátem dobře charakterizované formy PLA₂. Jak předpověděly již předchozí studie s nativním

-25CZ 297603 Β6

PAF-AH, tento fosfolipid nebyl v případě, že byl inkubován s rekombinantním PAF-AH hydrolyzován. V dalších experimentech byl do roztoku standardního hydrolyzačního testu přidán arachidonylPC v koncentraci 0 až 125 μΜ. Cílem tohoto bylo zjištění, zdali toto přidání inhibuje hydrolýzu PAF rekombinantním PAF-AH. Dokonce ani při nejvyšší koncentraci PAF-AH (což byla koncentrace 5x vyšší než koncentrace PAF) nebyla zjištěna inhibice hydrolýzy PAF. Rekombinantní PAF-AH tedy vykazuje stejnou substrátovou specificitu jako nativní enzym substráty s dlouhými řetězci nejsou rozeznávány. Kromě toho rekombinantní enzym PAF-AH rychle degraduje oxidovaný fosfolipid (gluraroylPC), který prošel oxidativním štěpením sn-2 mastných kyselin. Nativní plazmová PAF-AH má několik dalších vlastností, které ji odlišují od ostatních fosfolipáz včetně na vápenatých iontech nezávislých fosfolipázach a fosfolipázach odolných k látkám, které modifikují SH skupiny nebo štěpí disulfidy.

Nativní a rekombinantní plazmové enzymy PAF-AH jsou senzitivní k DFP, což naznačuje, že serin tvoří část jejich aktivního místa. Neobvyklou vlastností nativní plazmové PAF acetylhydrolázy je její tělesná asociace s lipoproteiny v krevním oběhu a skutečnost, že její katalytická efektivita je ovlivněna lipoproteinovým prostředím. Jestliže je rekombinantní PAF-AH, jak je popsána ve vynálezu, inkubována s lidskou plazmou (a předtím ošetřena DFP za účelem odstranění endogenní enzymatické aktivity) asociuje se s nízko- a vysokohustotními lipoproteiny stejným způsobem jako nativní aktivita. Tento výsledek je důležitý, protože existuje solidní důkazy o tom, že modifikace nízkohustotních lipoproteinů je nezbytná k ukládání cholesterolu pozorovanému při atheromě a že oxidace lipidů je iniciačním faktorem v tomto procesu. PAF-AH chrání nízkohustotní lipoproteiny před modifikací za oxidačních podmínek in vitro a mohou hrát tuto roli i in vivo. Podávání PAF-AH je proto doporučováno pro snížení oxidace lipoproteinů u atherosklerotických pláků a stejně tak při léčbě zánětů. Všechny tyto výsledky potvrzují, že klon cDNA sAH 406-3 kóduje protein s aktivitami lidské plazmové PAF acetylhydrolázy.

Příklad 10

V E. coli byly exprimovány i další různé rekombinantní PAF-AH produkty. Tyto produkty zahrnovaly analogy PAF-AH mající mutaci v jedné aminokyselině a fragmenty PAF-AH.

A. PAF-AH- produkty vzniklé substitucí aminokyselin

PAF-AH je lipáza, protože hydrolyzuje fosfolipid PAF. Ačkoli neexistuje žádná povšechná podobnost mezi PAF-AH a ostatními charakterizovanými lipázami, ve srovnání se strukturálně charakterizovanými lipázami byly nalezeny konzervované zbytky. V aktivním centru byl identifikován serin. Serin společně se zbytkem aspartátu a histidinu tvoří katalytickou trojici, která reprezentuje aktivní místo lipáz. Tyto tři zbytky spolu nesousedí v primární aminokyselinové sekvenci, ale ze strukturních studií víme, že spolu tato tři rezidua sousedí v trojrozměrném prostoru. Ze srovnávání struktur savčích lipáz víme, že aspartátový zbytek je obvykle 24 aminokyselinovým zbytkem od C konce, směrem k aktivnímu místu se serinem.

Pomocí místně cílené mutegeneze a PCR byly modifikovány jednotlivé kodóny lidské PAF-AH, které kódovaly sekvence pro alaninový zbytek. Tyto mutanty byly exprimovány v E. coli. Tak, jak je ukázáno v tabulce 8, kde například zkratka „S108A“ značí, že serinový zbytek v pozici 108 byl zaměněn za alanin, bodové mutace Ser₂₇₃, Asp_29f) nebo His₃₅i kompletně sničily PAF-AH aktivitu. Vzdálenosti mezi jednotlivými aminokyselinovými zbytky v aktivním centru jsou pro PAF-AH a ostatní lipázy podobné (od Ser k Asp je to 23 aminokyselin; od Ser k His je to 78 aminokyselin). Tyto pokusy také prokázaly, že Ser₂₇₃, Asp₂₉₆ nebo His₃₅₁ jsou zbytky klíčové pro aktivitu a proto také jsou kandidáty pro triádu katalytických zbytků. Cysteinové zbytky jsou svou vlastností možnosti tvorby disulfídových můstků velmi často kritické pro zachování funkční integrity proteinu. Plazmatický PAF-AH enzym obsahuje pět cysteinových zbytků. K určení, který z cysteinových zbytků je kritický pro udržení enzymové aktivity, byly cysteiny jednotlivě nahrazeny mutací ze serin a výsledné mutanty se exprimovaly v E. coli. Předběžné výsledky

-26CZ 297603 B6 měření aktivity s částečně načištěnými preparáty těchto rekombinantních mutantních forem enzymu je ukázáno v druhém sloupci tabulky číslo 8, zatímco výsledky získané s více načištěnými enzymovými preparáty jsou shrnuty ve třetím sloupci tabulky 8. Data ukazují, že všechny mutantní formy vykazovaly skoro stejnou aktivitu, z tohoto usuzujeme, že pro aktivitu PAF-AH není nutný žádný cysteinový zbytek. Další mutanty měly také malý, nebo žádný vliv na katalytickou aktivitu PAF-AH. V tabulce 8, ++++ reprezentují aktivitu přirozeně se vyskytujícího typu PAF-AH rovnající se 40 až 60 U/ml/OD₆₀₀, + 1 až 10 U/ml/OD₆₀o a znaménko - indikuje aktivitu menší než 1 U/ml/OD6oo

Tabulka 8

Mutace	Aktivita PAF-AH	Specifická akt. puriflkantů PAF-AH
Divoký (přirozeně se vyskytující typ	++++	6,9 mmol/mg/h
S108A	++++
S273A	-
D286A	-
D286a	++
D296
D304A	++++
D338A	++++
H351A	-
H395A, H399A	++++
S67A		5,7 mmol/mg/h
S229S	+	6,5 mmol/mg/h
S291S	+	5,9 mmol/mg/h
S334S	++++	6,8 mmol/mg/h
S407S	+++	6,4 mmol/mg/h
S67S, S334, C407S		6,8 mmol/mg/h

B. Fragmentální PAF-AH produkty

Pomocí štěpení exonukleázou III na 3' konci PAF-AH kódující sekvence po různě dlouhou dobu byly připraveny delece na C konci. Tyto zkrácené kódující sekvence byly potom ligovány do plazmidové DNA kódující stopy kodóny ve všech třech čtecích rámcích. Pomocí DNA sekvenční analýzy, exprese proteinu a měření aktivity PAF-AH bylo charakterizováno deset DNA delečních konstruktů. Odstranění 21 až 30 aminokyselinových zbytků zC konce silně redukovalo katalytickou aktivitu a odstranění 52 aminokyselinových zbytků vedlo ke kompletnímu zničení aktivity. To je znázorněno na obrázku 3.

Podobné delece byly provedeny na amino konci PAF-AH. V E. coli byly připraveny fúzní proteiny PAF-AH s thioredoxinem naN-konci. Tím se docílila konsistentní vysoká hladina exprese aktivity PAF-AH (LaVallie a další, Biotechnology, 11: strana 187 až 193, 1993). Odstranění devatenácti aminokyselinových zbytků z přirozeně se vyskytujícího N-konce proteinu (Ile4₂) redukovalo aktivitu až o 99 %. Zatímco odstranění 26 aminokyselinových zbytků kompletně zničilo enzymatickou aktivitu fúzního proteinu (viz obrázek 3). Delece 12 aminokyselinových zbytků zvýšila enzymovou aktivitu čtyřikrát.

V následujících purifikačních procesech pro PAF-AH vycházejících z čerstvé lidské plazmy pomocí metod podobných těm, co byly popsány v Příkladu 1 (k zakončentrování eluátu z Blue Sepharosy byl použit místo Cu sloupce filtr Microcon 30 firmy Amicon), byly identifikovány další dvě N-koncové aminokyseliny vedle stavu enzymu v plazmě, či může být výsledkem purifikačního postupu.

-27CZ 297603 B6

Purifikovaný materiál popsaný výše byl také podroben analýze na glykosylaci. Purifikovaný nativní PAF-AH se inkuboval v přítomnosti nebo nepřítomnosti N-glykanázy, což jest enzym odstraňující karbohydráty vázané na N-konce glykoproteinů. Takto ošetřené vzorky PAF-AH byly potom podrobeny elektroforéze v 12 % SDS polyakrylamidovém gelu a poté označeny pomocí králičího polyklonálního antiséra ve Western blottu. Bílkovina, která nebyla inkubována s N-glykanázou putovala v gelu jako difuzní proužek o molekulové hmotnosti 45 až 50 kDa, zatímco protein ošetřený glykanázou putoval jako ostře ohraničený kruh odpovídající molekulové hmotnosti 44 kDa. Tím je demonstrována skutečnost, že nativní PAF-AH je glykosylovaný.

Heterogenita na N-konci byla také pozorována v purifikováných preparátech rekombinančního PAF-AH (Ile₄₂ N-konec). Tyto enzymové preparáty byly směsí polypeptidů s N-konci začínajícími Ala₄₇, Ile₄₂, nebo umělým iniciačním zbytkem Met ) sousedícím s Ile₄₂.

1. Předběžné srovnání fragmentů PAF-AH s PAF-AH

Z důvodu pozorované heterogenity rekombinantně připravených PAF-AH, byly připraveny další rekombinantní produkty, které byly také testovány na pozorovanou heteronitu po expresi a následné purifikaci. Složení rekombinantních exprimovaných produktů pBAR2/PH.2 a pBAR2/PH.9 v kmenu MC1061 E. coli bylo analyzováno v různých časových intervalech během produkční fáze buněčného cyklu. Částečně načištěné vzorky rekombinantního PH.2 a PH.9 odebrané v různých časových intervalech mezi 5 až 22 hodinami po indukci exprese proteinu byly analyzovány pomocí laserové desorpční ionizační hmotové spektrometrie (MALDI-MS).

Byl-li použit PH.2 expresní vektor, byly pozorovány dva píky ve spektru částečně purifikovaného proteinu, které odpovídaly hmotové hodnotě předpokládané pro rPAF-AH protein. Tyto dva píky byly pozorovány ve všech časových intervalech, větší heterogenita byla pozorována jen v časovém intervalu odpovídajícímu stresovému působení způsobenému nahromaděním acetátu nebo vyčerpáním kyslíku v médiu během fermentace buněk. Přesnost měření MALDI-MS techniky je přibližně v rozsahu + 0.3 % hmotnosti jedné aminokyseliny. Pozorovaný produkt s vyšší hmotností odpovídá svým hmotnostním sloužením očekávanému celému produktu translace vektoru PH.2, mínus hmotnost methioninu, jako iniciátoru translace, o kterém se předpokládá, že byl posttranslačně odstraněn. Pík s nižší hmotností měl přibližně o 1200 atomových hmotnostních jednotek méně.

Byl-li použit expresní vektor PH.9, byl získán ve spektru částečně purifikovaného proteinu přednostně protein, který odpovídal svou očekávanou hmotností proteinu r PAF-AH. Tento jediný pík byl pozorován ve všech časových okamžicích, v průběhu času se nezvyšovala ani heterogenita proteinu. Pozorovaná hmotnost tohoto proteinu byla v souladu s přítomností očekávaného translačního produktu pro vektor PH.9 o plné délce, opět mínus iniciační methionin.

2. Purifikace fragmentů PAF-AH

Rekombinantně exprimované produkty rPH.2 (expresní produkt DNA kódující Met₄₆ až Asn_44l) a rPH.9 (expresní produkt DNA kódující Met₄₆ až lle₄₂9) byly purifíkovány pro další srovnávací studie s produktem rPAF-AH (expresní produkt DNA kódující Ile₄₂ až Asn₄₄i). RPH.9 byl produkován pomocí kmenu E. coli SB7219 a purifikovaný většinou pomocí chelátového purifikačního procesu využívajícího Zn, tak jak bylo popsáno výše. rPH.2 byl produkován v kmenu MC1061 v E. coli, tak, jak bylo popsáno v předchozím textu a byl purifikován tak, jak je popsáno dále. Transformované buňky byly lyžovány naředěním buněk lyzačním pufrem (lOOmM sukcinát, lOOmM NaCl, 20mM CHAPS, pH 6.0). Vzniklá hmota se mixovala a lyžovala se popraskáním buněk vysokým tlakem. Lyžované buňky se stočily a supernatant obsahujících rPH.2 se ponechal k dalšímu zpracování. Vyčeřený supernatant se naředil 5 krát 25mM fosfátovým pufrem obsahujícím lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 7.0. Naředěný supernatant se poté aplikoval na sloupec Sepharosy Q. Sloupec se promyl nejprve trojnásobkem objemu sloupce 25 mM Na

-28CZ 297603 Β6 fosfátovým pufrem obsahujícím lmM EDTA, 50mM NaCl, lOmM CHAPS, pH 7.0 (Promytí 1), potom následovalo promytí desetinásobným objemem sloupce 25mM Tris pufrem obsahující lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8.0. (Promytí 2) a následně deseti objemy sloupce 25mM Tris pufrem obsahujícím lmM EDTA, lOOmM NaCl, lOmM CHAPS, pH 8.0 (promytí 3). Eluce byla zakončena pomocí 25mM Tris pufru obsahujícího 1 mM EDTA, 350mM NaCl, lOmM CELAPS, pH 8.0. Eluát ze sloupce Q Sepharosy se potom naředil trojnásobkem svého objemu 25mM Trisem, obsahujícím lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8.0 a byl navrstven na sloupec Blue Sepharosy. Sloupec byl promyt nejprve deseti objemy sloupce 25mM Trisem, obsahujícím lmM EDTA, lOmM CHAPS, pH 8.0. Po té následovalo promytí třemi objemy sloupce 25mM Trisem obsahujícím 0,5M NaCl, lOmM CHAPS, pH 8.0. Eluce byla zakončena pomocí promytí 25mM Trisem obsahujícím 3.0M NaCl, lOmM CHAPS, pH 8.0. Eluát ze sloupce Blue Sepharosy byl naředěn pětinásobkem lOmM Na- fosfátového pufru obsahujícího lOmM CHAPS, pH 6.2 a byl poté aplikován na chromatografický sloupec. Sloupec byl promyt desetinásobkem objemu sloupce lOmM Na- fosfátovým pufrem obsahujícím lOOmM NaCl, 0.1 % Pluronic F68, pH 6.2. rPH.2 se eluoval ze sloupce 120mM Na-fosfátovým pufrem obsahujícím lOOmM NaCl a 0,1 % Pluronic F-6á, pH 7.5. U naředěného eluátu ze sloupce hydroxylapatitu bylo upraveno pH na pH 6.8 pomocí 0.5N- sukcinylové kyseliny. Potom následovala chromatografie na sloupci Sepharosy SP. Sloupec SP Sepharosy byl promyt desetinásobkem svého objemu 50mM fosfátem sodným obsahujícím 125mM NaCl, 0.1 % Pluronic F68, pH 6.8. Eluce se prováděla 50mM fosfátem sodným s 125mM NaCl a 0.1 % Pluronic F68, pH 7.5. Eluovaný rPH.2 se nakonec upravil ředěním na konečnou koncentraci 4 mg/ml pomocí 50mM fosfátu sodného obsahujícího 125mM NaCl, 0,15% Pluronic F68, pH 7.5. Dále byl přidán Tween 80 do konečné koncentraci 0.02 %. Vytvořený produkt se přefiltroval přes 0.2 pm membránu a uschoval pro další využití.

3. Porovnání PAF-AH fragmentů s PAF-AH pomocí sekvence

Purifikované preparáty rPH.2 a rPH.9 byly porovnány s purifikovanými sloučeninami rPAF-AH pomocí N-terminálního sekvenování použitím sekvenátoru Applied Biosystems Model 473 Protein Sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA) a pomocí C koncového sekvenování provedeného pomocí přístroje Hewlett-Packard Model G1009A C-terminal Protein Sequencer. Připravený rPH.2 vykazoval ve srovnání s rPAF-AH menší heterogenitu N-konce. N-koncová analýza připraveného rPH.9 byla velmi podobná téže analýze u rPH.2, ale ve srovnání s rPH.2. byla pozorována u rPH.9 nižší heterogenita na C-konci.

Purifikovaný protein rPH.2 vykazoval většinu sekvencí obsahující koncový Ala4₇ (okolo 86 až 89 %) a menší podíl sekvencí majících na N-konci Ala₄₈ (mezi 11 až 14%), tento poměr byl celkem stabilní i za různých podmínek fermentace buněk. Purifikovaný protein rPH.9 také obsahoval ve většině sekvencí N-koncový Ala4₇ (mezi 83 až 90 %) a menší podíl s N-koncovou aminokyselinovou Ala₄₈ (okolo 10 až 17 %). Naproti tomu, snahy o přípravu polypeptidu v bakteriích začínajícího Ι1β₄2 (rPAF-AH) vyústily ve směs různých polypeptidů sN-koncovými aminokyselinami začínajícími Ala₄₇ (20 až 53%), Ile₄2 (8 až 10 %) nebo uměle dodaným iniciátorem methioninem Met-1 (37 až 72 %) v sousedství Ile₄2- U rPH.2 a rPH.9 byl iniciační methionin účinně odstraněn pomocí aminoterminalpeptidázy po bakteriální syntéze peptidu, kdy zůstal Ala v pozici 47 (nebo alanin v pozici 48) jako koncový zbytek.

Sekvenování C-konce se provádělo velmi často na rPH.2, kde na C-konci byla objevena jako hlavní vyskytující se sekvence HOOC-Asn-Tyr (okolo 80 %), což je v dobré shodě s předpokládanou sekvencí C-konce translačního produktu, které je HOOC-Asn₄₄₁-Tyr₄₄₀, zatímco sekvence HOOC-Leu se objevila jen ve 20 %. Po frakcionaci rPH.2 na SDS - PAGE, se provedlo další sekvenování primárního a sekundárního proužku. Sekvenování určilo jako C-terminální sekvenci HOOC-Leu-Met z nižšího sekundárního proužku (AHL popsaný dále k sekci

B.5), který odpovídá translačnímu produktu zkrácenému o 10 aminokyselinových zbytků. Tento produkt vykazuje také nízkou hladinu HOOC-His. Další mapování peptidů ukázalo, že u některých produktů rPH.2 se vyskytují ještě další C-koncové sekvence. Přímým sekvenováním byl Ckonec u rPH.9 primárně určen jako HOOC-Ile-His (okolo 78 až 91 %, což záleželo na šarži).

-29CZ 297603 B6

Tento výsledek je v dobré shodě s předpokládaným C koncem translačního produktu HOOCIle429—HÍS428. Zdá se však, že tato technika má určité pozadí (šum), čímž by nebyly podchyceny nízké hladiny koncentrací jiných sekvencí.

4. Porovnání PAF-AH fragmentů s PAF-AH metodou MALDI-MS

MALDI-MS metoda byla aplikována na purifíkované produkty rPH.2 a rPH.9. Spektrum naměřené pro rPH.2 vykázalo dva píky, které svou hmotností odpovídaly hodnotě očekávané pro rPH.AH produkty (viz obrázek 4). Toto spektrum je podobné spektru získanému od částečně purifíkovaného proteinu popsanému v sekci B.l výše v textu. Druhý pík, odpovídající nižší molekulové hmotnosti, byl ve většině měření přítomen asi ve 20 až 30 % zastoupení. Spektrum rPH.9 ukázalo, že dominantní pík odpovídá předpokládané hmotnosti pro úplný translační produkt vektoru PH.9, od kterého se odečte hmotnost iniciačního methioninu (viz obrázek 5). U rPH.9 byl také pozorován vedlejší pík odpovídající nižší molekulové hmotnosti. Byl zastoupen asi u 5 % celkového množství vzorků.

5. Porovnání PAF-AH fragmentů s PAF-AH pomocí SDS-PAGE

Elektroforéza v polyakrylamidovém gelu za přítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS-PAGE) byla aplikována na purifíkované šarže rPAF-AH, rPH.9. U rPH.2 byl získán na elektroforeogramu velmi složitý obraz proužků, rozmístěných kolem místem odpovídajícího migračnímu rozsahu očekávanému pro rPAF-AH produkt. Toto místo bylo určeno pomocí odpovídajících molekulových standardů. Na jednom, či několika gelech byly pozorovány dva dominantní proužky, které měly v těsném sousedství každý svoje dva sekundární proužky, které byly umístěny nad a pod primárním proužkem. Tyto horní sekundární proužky, střední primární a spodní sekundární proužky byly označeny jako AHU, AHM a AHL. Všechny tyto proužky reagovaly s monoklonální protilátkou připravenou proti rPAF-AH ve Western blotu, a tak bylo identifikovány jako produkty příbuzné rPAF-AH. Vrchní sekundární proužek AHU zvyšoval svoji intenzitu v závislosti na době skladování proteinu a pravděpodobně representoval modifikovanou formu produktu rPAF-AH. Výsledky získané z SDS-PAGE pro rPAF-AH produkty jsou podobné výsledkům získaným touž metodou pro rPH.2. Jsou zde dva větší pruhy, které migrují v blízkosti předpokládané molekulové hmotnosti pro rPAF-AH, dále dva minoritní pruhy nad a stín pod majoritními pruhy. Na rozdíl od těchto, rPH.9 poskytuje na SDS-PAGE jeden dominantní pruh bez zjevného štěpení. Dále byly také pozorovány slabě znatelné proužky odpovídající nižší molekulové hmotnosti a další proužek v pozici odpovídající hmotnosti dimeru. Nebyl patrný však žádný proužek odpovídající AHU pozici.

Složení purifikovaných preparátů rPH.2 a rPH.9 bylo dále analyzováno pomocí 2D gelů a izoelektrické fokusace (IEF) v močovině, která následovala za SDS-PAGE ve druhém rozměru. Pro rPH.9 je na dvojrozměrné elektroforéze pět hlavních skvrn rozdělených ve směru IEF. Heterogenita v počtu nábojů se v rámci jednotlivých šarží rPH.9 jevila jako konzistentní. Na rozdíl od výše zmíněných výsledků. 2D gel pro rPH.2. se jevil daleko komplikovanější, protože obsahoval asi 15 skvrn rozdělených v IEF a SDS-PAGE.

6. Porovnání aktivity rPAF-AH s aktivitou fragmentů rPAF-AH

Purifíkované produkty rPH.2 a rPH.9 vykazovaly oba enzymatickou aktivitu, která byla stejná jako u endogenního rPAF-AH purifíkovaného ze séra, oba produkty také vážou lipoprotein stejným způsobem jako purifikovaný endogenní rPAF-AH.

Příklad 11

Předběžná analýza exprese lidských plazmatických mRNA pro rPAF-AH byla ve vzorcích lidských pletiv stanovována pomocí hybridizace v Northem blotu.

-30CZ 297603 B6

RNA byly připraveny ze vzorků lidské mozkové kůry, srdce ledvin, placenty, thymu a mandlí pomocí RNA Stát 60 (tel-Test „B“, Friendswood, TX). Dále byla RNA připravena také z buněk podobných prekurzorům lidských hematopoietických buněk linie THP-1 (ATCC TIB 202), u které byla vyvolána diferenciace do fenotypu podobného makrofágu, a to užitím phorbolesteru phorbolmyristylacetátu (PMA). RNA získaná z pletiv a RNA připravená z premylocytické buněčné linie THP-1 před a jeden až tři dny po indukci, byly rozděleny pomocí elektroforázy v 1.2 % agarosovém formaldehydovém gelu a následně přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Klon o úplné délce PAF-AH cDNA, sAH406-3, připravený z lidské plazmy, byl označen metodou náhodného párování primerů (random priming) a byl hybridizován na membránu, za podmínek identických podmínkám popsaným v příkladu 3 pro prohlížení knihovny. Získané výsledky indikovaly, že sonda PAF-AH hybridizuje s pruhem odpovídajícím 1.8 kb ve vzorcích zbrzlíku, mandlí a v malém rozsahu také s placentámí RNA.

PAF se syntetizuje v mozku jak za normálních, ta patofyziologických podmínek. Vzhledem ke známým, zánět vyvolávajícím a potencionálně neurotoxickým vlastnostem této molekuly, se předpokládá jako kritický pro udržení zdraví nervového pletiva mechanismus lokalizace PAF syntézy nebo jeho rychlý katabolismus. Přítomnost PAF acetylhydrolázy v nervových tkáních ukazuje na její ochrannou roli v těchto pletivech. Je zajímavé, že obě PAF-AH, to znamená bovinní (hovězí) heterotrimemí intracelulámí PAF-AH (její klonování je popsáno v práci Hatteri a další. J. Biol., Chem., 269(37): strana 23150 až 23155 (1994) i PAF-AH podle předkládaného vynálezu, byly nalezeny v mozku.

K určení, zda jsou oba enzymy exprimovány ve stejných nebo jiných částech mozku, byl nakloňován lidský homolog bovinní cDNA pro intracelulámí PAF-AH a pomocí Northem blotu byly porovnány vzorce této v mozku exprimované mRNA s exprimovanou mRNA pro PAF-AH dle vynálezu sejnou metodou, jako byla popsána v předchozích paragrafech. V mozku byly metodou Northem blotu prozkoumány následující oblasti: malý mozek, dřeň, mícha, bazální jádro mozku, amygdala, podvěsek mozkový, talamus a týlní pól, čelní lalok a spánkový lalok mozkové kůry. Stopa přítomnosti dvou enzymů byla detekována v každém z uvedených pletiv. Ve vyšším množství byla však spíše detekována heterotrimemí intracelulámí forma enzymu, než forma sekretovaná. Analýza provedená pomocí Northem blotu potvrdila i pro další pletiva a buňky, že heterotrimemí forma intracelulámího enzymu se vyskytovala v těchto pletivech velmi hojně. Pletiva, kde byl enzym detekován jsou následující: tymus, prostata, varlata, vaječníky, tenké střevo, tračník, periferní krevní leukocyty, makrofágy, mozek, játra, kosterní svaly, ledviny, slinivka a žlázy nadledvinek. Tato všudypřítomná exprese této formy enzymu napovídá, že heterotrimemí intracelulámí PAF-AH má v buňkách všeobecnou udržovací funkci.

Dále byla v kultuře zkoumána exprese RNA pro PAF-AH v monocytech izolovaných z lidské krve a během jejich spontánní diferenciace v makrofágy. V čerstvých monocytech bylo detekováno jen malé, nebo vůbec žádné množství RNA, ale exprese byla indukována a zesílila během diferenciace v makrofágy. Průvodním jevem bylo i zvýšení aktivity PAF-AH v médiu kultury diferencujících se buněk. Exprese transkriptu lidské plazmatické RNA pro PAF-AH byla také pozorována v buňkách THP-1, a to první den, ale už ne třetí den následující po indukci. Buňky THP-1 v bazálním stadiu neexprimovaly mRNA pro PAF-AH.

Příklad 12

Exprese PAF-AH v lidských a myších pletivech byla zkoumána pomocí hybridizace in silu.

Lidská pletiva byla získána National Disease Research Interchange and Cooperative Human Tissue Network. Normální myší mozek a mícha, dále EAE mícha byly získány z S/JLJ myší. Normální myši embrya byla získána od jedenácti do osmnácti dnů po oplodnění.

-31 CZ 297603 B6

Části pletiv byly umístěny do Tissue Tek II kryoformy (Miles Laboratories, lne., Naperville, IL) s malým množstvím OCT sloučeniny (Miles, lne. Elkhart, IN). Ve formě byly vzorky vycentrovány, forma naplněna OCT sloučeninou, potom umístěna do nádoby s 2-methylbutanem (CjHsCHÍCHsh, Aldrich Chemical Company, lne., Milwaukee, WI) a nádobka byla umístěna do 5 kapalného dusíku. Jakmile pletivo a OCT sloučenina v kryoformě zmrznou, jsou uchovávány v 80 °C až do rozřezání bločku. Bločky s pletivy byly rozděleny na řezy o tloušťce 6 pm a připevněny k Vectabondem (Vector Laboratories, lne., Burlingame do teploty 50 °C na dobu přibližně 5 minut k odstranění kondenzace a potom jsou vzorky fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 20 minut při 4 °C, dehydrovány (70%, 95%, 100% etanol) po dobu jedné minuty pro každý io stupeň, nakonec jsou ponechány na vzduchu schnout po dobu 30 minut při pokojové teplotě.

Pletiva jsou hybridizována in šitu s radioaktivně značenou jednovláknovou mRNA generovanou z DNA odvozené z interního 1 Kb HindlII fragmentu genu pro PAF-AH (nukleotidy 308 až 1323 ze Sekvence ID číslo: 7) pomocí in vitro RNA transkripce inkorporací ³⁵S-UTP (Amersham) nebo z DNA odvozené od heterotrimerní intracelulámí cDNA pro PAF-AH identifikované 15 Hattorim a dalšími. Sondy se používaly v různých délkách od 250 do 500bp. Hybridizace se prováděla přes noc (12 až 16 hodin) při 50 °C; ³⁵S-značená sonda (6x10⁵ cpm/řez), tRNA (0.5 pg/řez), dále byla přidána dietylpyrokarbonátem ošetřená voda (depo) do hybridizačního pufru, čímž se upravily koncentrace jeho složek na 50% formamidu, 0.3M NaCl, 20 mM Tris pH 7.5, 10% síran destranu, lx Denhardtův roztok, lOOmM dithiotreitol (DTT) a 5mM EDTA. Po 20 hybridizaci se řezy promývaly 1 hodinu při pokojové teplotě v 4x SSC/10 mM DTT, potom 40 minut při 60 °C v 50% formamidu/lxSSC/lOmM DDT, 30 minut při pokojové teplotě v 2 x SSC, 30 minut při pokojové teplotě v 0.1 x SSC. Řezy se potom dehydrovaly, sušily 2 hodiny na vzduchu a poté byly vyvolány (po skladování při 4 °C v úplné tmě) a obarveny kontrastní barvivém hematoxylin/eosin.

A. Mozek

Mozeček. Jak v lidském, tak myším mozku byl pozorován silný signál ve vrstvě Purkyňových buněk malého mozku, dále v košíčkových buňkách a ve středních částech jednotlivých neuronů u 30 nucleus dentate (jedno ze čtyř hlubokých jader v malém mozku). V těchto buňkách byla dále pozorována i heterotrimerní forma PAF-AH. Dále byl nalezen signál i pro plazmatickou PAFAH v granulátech a molekulárních vrstvách šedé hmoty mozkové.

Hippocampus. Silný signál byl zaznamenán v hippocampu, hlavně v jednotlivých buňkách, které 35 se jevily jako buňky neuronové, tyto buňky byly identifikovány jako polymorfní části střední části neuronů a granulámích buněk. Také v hippocampu byl nalezen signál pro heterotrimerní intracelulámí formu PAF-AH.

Mozkový kmen·. Jak v lidském, tak myším mozkovém kmenu byl v jednotlivých buňkách šedé 40 hmoty zaznamenán silný signál.

Kůra'. V částech lidské mozkové kůry, která byla získána z hlavní mozkové, týlní a spánkové kůry a také v celých částech myších mozků byl pozorován u jednotlivých buněk silní signál. Tyto buňky byly identifikovány jako pyramidální, hvězdicové a polymorfní buňky, nebyly zpozoro45 vány žádné rozdíly ve výsledcích získaných z různých vrstvy kůry. Výsledky získané metodou hybridizace in šitu se lišily od výsledků získaných zkoumáním mozkové kůry metodou Northem blotu. Rozdíly pravděpodobně vyplývají z vyšší citlivosti metody hybridizace in šitu ve srovnání s metodou Northem blotu. Jak v malém mozku, tak v hypoccampu byly získány obdobné výsledky potvrzující expresi heterotrimerní formy intracelulámího PAF-AH.

Hypofýza: O něco sladší signál byl zaznamenán na jednotlivých roztroušených buňkách distální části těchto lidských pletiv.

-32CZ 297603 B6

B. Lidský tračník

Jak u normálních, tak u tračníku pacientů s Crohnovou nemocí, se objevil signál u lymfatických agregátů přítomných v části sliznice, signál byl slabě vyšší u pacientů s Crohnovou nemocí. Vzorky z tračníku pacientů s Crhnovou nemocí vykazovaly tak silný signál v lamina propria. Podobně, vyšší hladina signálu byla pozorována ve vzorcích z nemocného slepého střeva, i když zdravé střevo vykazovalo nízký, ale stále ještě detekovatelný signál. Vzorky od pacientů trpících ulcerózní kolitidou nevykazovaly žádný signál, a to ani v lymfatických agregátech, ani ve střevní sliznici.

C. Lidské mandle a brzlík

Byl zaznamenán silný signál u roztroušených skupin buněk v zárodečných centrech mandlí a brzlíku.

D. Lidské lymfatické uzliny (J vzorků pocházejících z lymfatických uzlin normálního dárce byl pozorován silný signál, zatímco ve vzorcích odebraných z lymfatických uzlin pacienta v septickém šoku byl zaznamenán signál velmi slabý.

E. Lidské tenké střevo

Jak vzorky tenkého střeva od zdravého dárce, tak vzorky střeva od pacientů trpících Crohnovou nemocí, poskytovaly pouze slabý signál v Peyerových plácích a střevní sliznici. Signál byl ve vzorcích nemocných dárců trochu vyšší.

F. Lidská sliznice a plíce

Jak ve vzorcích pocházejících ze zdravé sleziny a plic, tak ve vzorcích ze slezin pacientů trpících abscesem sleziny a plic pacientů s rozedmou plic, nebyl nalezen žádný signál.

G. Myší mícha

U obou typů míchy, to znamená normální a AEE stadium 3 míchy, byl zaznamenán silný signál v šedé hmotě míchy. Exprese byla v míše v EAE stadiu 3 slabě vyšší. U míchy pocházející z EAE stádia 3 byly buňky v bílé hmotě mozkové a v perivaskulámím pojivu, pravděpodobně infiltrované makrofágy nebo leukocyty a vykazovaly signál, který nebyl patrný v normální míše.

H. Myší embrya

V jedenáctidenním embryu je signál zřetelný v centrálním nervovém systému ve čtvrté srdeční komoře, která zůstává konstantní v průběhu vývoje malého mozku a mozkového kmene embrya.

V průběhu dozrávání embrya se signál stává zřetelný v centrálním nervovém systému v míše (1 den), primární kůře a Gasseriho uzlině (14 den) a v hypoíyze (16 den). V periferním nervovém systému se signál stává zřetelný (počínaje dnem 14 a 15) v nervech odbočujících z míchy a 17 den se objevuje silný signál v okolí základů čichových orgánů embrya. Exprese je také patrná od 14 dne v játrech a plicích, ve střevu od 15 a v posteriální části úst/hrdla ode dne 16. Od 18 dne lze signál určit diferencovaně jako signál v kůře, zadním mozku (malém mozku a mozkovém kmeni), v nervech odbočujících z bederní oblasti míchy, jako signál v zadní části úst/hrdla, játrech, ledvinách, dále jako možný slabý signál v plicích a střevě.

-33CZ 297603 B6

Souhrn

Exprese mRNA pro PAF-AH v mandlích, brzlíku, lymfatických uzlinách, Peyerových plácích, slepém střevu a v lymfatických agregátech tračníku je v dobrém souladu se závěry, že pravdě5 podobný převládají zdroj PAF-AH in vivo je v makrofágu, protože ve všech těchto uvedených pletivech jsou makrofágy silně zastoupeny, slouží zde jako fagocytózní a antigen prezentující buňky.

Exprese PAF-AH v zánětlivých pletivech se dá vysvětlit hypotézou, že hlavní roli v zánětlivém ίο procesu hrají monocyty odvozené zmakrofágů. Předpokládá se, že PAF-AH inaktivuje PAF a fosfolipidy podporující zánět a tím reguluje směrem dolů kaskádu zánětlivých procesů iniciovaných pomocí těchto mediátorů.

PAF je u krys detekován ve všech mozkových tkáních a je sekrentován v kultuře granulámích 15 buněk malého mozku. In vitro a in vivo pokusy ukázaly, že se PAF váže na specifické receptory v nervových tkáních a indukuje funkční a fenotypické změny, jako je mobilizace kalcia, regulace transkripce aktivující geny a diferenciaci nervových buněčných linií prekursoru, PC12. Tato pozorování objasňují roli PAF v mozku a v souladu s tím se uskutečnily pokusy využívající kultury tkání hyppocampu a analogů PAF a jeho antagonistů, které využívaly PAF jako důležitého 20 zpětného mesenžeru pro dlouhotrvající hippocampalní zesílení. Proto vedle patologické role PAF v zánětlivém procesu se zdá, že se PAF podílí i na rutinním nervovém signálním procesu. Exprese extracelulámí PAF-AH v mozku může tedy sloužit k regulaci trvání a velikosti signalizace zprostředkové PAF.

Příklad 13

Za použití PAF-AH jako antigenu produkovaného v E. coli byly připraveny monoklonální protilátky specifické pro lidský specifický plazmatický PAF-AH.

Myš linie 1342 byla imunizována 0, 19 a 40 den rekombinantním PAF-AH. Jako dávka těsně před fúzí byla použita k imunizaci myši dávka imunogenu v PBS. O čtyři dny déle byla myš usmrcena a sterilně vyňata její slezina. Ta byla potom vložena do misky s lOml bezsérového média RPMI 1640. Suspenze buněk byla připravena třením slezin mezi dvěma konci zmrazených 35 mikroskopických sklíček ponořených do bezsérového média RPMI 1640 s dodaným 2 mM Lglutaminem, 1 mM pyruvátem sodným, 100 jednotek/ml penicilínu a 100pg/ml sterptomycinu (RPMI) (G1BCO, Canada). Suspenze buněk byla filtrována přes sterilní buněčný filtr (70- mesh Nitex (Becton Dickinson, Parsippany, New Jersey) a poté byly buňky dvakrát promyty centrifugám při 200g po pět minut a pelety byly znovu resuspendovány ve 20 ml bezsérového média 40 RPMI. Slezinné buňky ze třech nativních Balb/c myší byly připraveny podobným způsobem.

NS-1 myelomové buňky, byly udržované v logaritmické fázi v RPMI s 11 % fetálního bovinního séra (FBS) (Hyclone Laboratories, lne., Logan, Utah) po tři dny před fúzí, byly centrifugovány při 200 g po 5 minut a peleta byla dvakrát promyta stejným způsobem, jak je to popsáno výše.

Jedenkrát 10⁸ slezinných buněk bylo kombinováno s 2.0 x 10⁷ NS-1 buněk, centrifugováno a supernatant byl odsát. Sediment v kyvetě byl poklepáván dna kyvety rozdělen a po té byl přidáván po dobu jedné minuty 1 ml 37 °C teplého PEGu 1500 (50% v 75 mM Hepes, pH 8.0) (Boehringer Manheim) za stálého míchání, následovalo přidání 7 ml bezsérového média po dobu 7 minut. Následovalo přidání 8 ml RPMI a buňky se centrifugovaly při 200 g po dobu 10 minut.

Po odstranění supematantu byl pelet resuspendován ve 200 ml RPMI obsahujícím 15 % FBS, 100 μΜ hypoxantinu sodného, 0,4 μΜ aminopterinu, 16 μΜ thymidin (HAT) (Gibco), 25 jednotek/ml IL-6 (Boehringer Mannheim) a 1.5 x 10⁶ tymocytů/ml a buňky byly vysety na deset desek Coming s plochým dnem s 96 jamkami (Corning, Coming New York).

-34CZ 297603 B6

Druhý, čtvrtý a šestý den následující po fúzi bylo vyměněno 100 μΐ média v jamce za čerstvé. Osmý den byla fúze testována pomocí ELIS A, testovala se na přítomnost myšího IgG vázajícího rekombinantní PAF-AH. Mikrotitrační desky Immulon 4 (Dynatech, Cambridge, MA) byly potaženy rekombinantním PAF-AH v koncentraci lOOng/desku naředěným v 25 mM TRIS, pH 7.5. Inkubace se konala při 37 °C po dobu dvou hodin. Poté byl potahovací roztok odsát a do jamek bylo nakapáno po 200 μΐ blokovacího roztoku (0.5% želatiny z rybí kůže (Sigma) zředěné pomocí CMF-PBS a tento blokovací roztok se inkuboval 30 minut při 37 °C. Po té byly desky třikrát promyty PBS obsahující 0.05% Tween 20 (PBST) a do každé jamky bylo přidáno 50 μΐ supematantu z kultury. Po další 30 minutové inkubaci při 37 °C a následném trojnásobné promytí, byl do jamek na desce přidán konjugát kozích anti myších IgG (fc) s křenovou peroxidázou (Jackson ImmunoResearch, West Grove, pensylvania) naředěný v PBS 1: 3500. Desky se inkubovaly stejným způsobem jak bylo popsáno výše, čtyřikrát promyty PBST a potom následovala inkubace se substrátem pro peroxidázu (100 μΐ/jamka) rozpuštěným v substrátovém pufru. Roztok měl následující složení: 1 mg/ml o-fenylendiamin (Sigma) a 0.1 μΙ/ml 30% H2O2 v 100 mM citrátu pH 4.5. Po pěti minutách byla barevná reakce zastavena přidáním 50 μί 15% H₂SO₄. Na fotometru odečítajícím hodnoty absorbance v roztoku (Dynatech reader) se odečetly absorbance při vlnové délce 490 nm - A490.

Vybrané jamky z fúze byly dvakrát překlonovány metodou limitního ředění do 96 jamkové destičky. Po pěti dnech inkubace se vizuálně hodnotil počet kolonií v jamce. Hybridomy, které se klonovaly, byly následující 90D1E, 90E3A, 90E6C, 90G11D (ATCC HB 11724) a 90F2D (ATCC HB 11725).

Isotypy monoklonálních protilátek, produkovaných hybridomy, byly určeny pomocí systému Isostrip (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN). Výsledky ukázaly, že monoklonální protilátky produkované hybridomy fúze 90 byly typu IgGi.

Všechny monoklonální protikláty produkované hybridomy z fúze 90 bylo možno použít v ELISA textech, ale nevázaly se k PAF-AH ve Western blotech. K přípravě protilátek, které by mohly rozpoznávat PAF-AH ve Western blotu, se myši imunizovaly rekombinantním enzymem. Hybridomy byly připraveny metodou popsanou pro fúzi 90, ale testování probíhalo pomocí Western blotu a nikoli pomocí ELISA. Tak byly vybrány klony, které bylo možno použít k detekci pomocí této metody.

Pro Western analýzy se rekombinantní PAF-AH míchal se stejným objemem vzorkového pufru obsahujícího 125 mM Tris, pH 6.8, 4% SDS, lOOmM dithiothreitol a 0.05% brofenolovou modř, před nanesením na elektroforézu se vzorek vařil po dobu 5 minut. Byl používán 12% SDS polyakrylamidový gel (Novex). Elektroforéza se prováděla při 40 mM, potom následoval elektrotransfer bílkoviny na polyvinylidenfluorioridovou membránu (Pierce). Transfer trval 1 hodinu při 125 V v roztoku 192 mM glycinu, 25 mM Tris báze, 20 % metanol a 0.01% SDS. Membrána se nechala inkubovat přes noc v roztoku : 20 mM Tris, lOOmM NaCl (TBS) obsahujícím 5% hovězí sérum albumin (BSA, Sigma). Blot se dále inkuboval 1 hodinu při pokojové teplotě s králičím polyklonálním antisérem naředěným 1: 8000 pomocí TBS pufru obsahujícího 5% BSA, potom následovalo s promytí v TBS a inkubace s konjugátem kozích anti myších IgG konjugovaných s alkalickou fosfatázou rozpouštěných v TBS obsahujícím 5% BSA po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Bylo byl opět promyt TBS a následovala inkubace se substrátem pro alkalickou fosfatázu, to je 5-bromo-4-chloro-3-indolyI fosfátem v koncentraci 0,02% a 0,03% tetrazoliovou modří v Tris-HcL, pH 9.5, 100 mM NaCl a 5 mM MgCL. Reakce byla zastavena pomocí opakovaného promývání vodou.

Vybrané jamky fúze, jejichž supematanty byly pozitivní ve Westernové analýze, byly zpracovány tak, jak bylo po psáno výše. Hybridom 143A reagující s PAF-AH ve Western blotech byl klonován (ATCC HB 11900).

-35CZ 297603 B6

Polyklonální antiséra specifická pro lidský plazmatický PAF-AH byla připravena během tříměsíční imunizace králíků 100pg purifikovaného rekombinantního enzymu ve Freundově adjuvants.

Příklad 14

K ohodnocení in vivo terapeutického vlivu rekombinantního PAF-AH připraveného podle vynálezu byly provedeny experimentální studie na modelu akutního zánětu u otoku krysího chodidla Henrique a další, Br. J. Pharmacol., 106: 579-589 (1992). Výsledky těchto studií prokázaly, že rPAF-AH blokuje vznik PAF- indukovaného edemu. Dále byly provedeny paralelní studie sloužící ke srovnání účinnosti PAF-AH se dvěma komerčně dostupnými PAF antagonisty.

A. Příprava PAF-AH

E. coli transformované PAF-AH expresním vektorem puc trp AH byly lysovány v mikrogluidizéru, pevné části byly odcentrifugovány a buněčné supematanty byly naneseny na sloupec S-Sepharosy (Pharmacia). Sloupec byl extenzivně promýván pufrem obsahujícím 50 mM Naci, 10 mM CHAPS, 25 mM MES a 1 mM EDTA, pH 5.5. PAF-A byl vymyt stoupající koncentrací NaCl, až do hodnoty 1M. Jako další krok purifikačního procesu byla použita afinitní chromatografie na sloupci Blue Sepharosy (Pharmacia). Před nanesením PAF-AH na sloupec Blue Sepharosy byl vzorek naředěn 1 : 2, tím došlo ke snížení koncentrace soli na 0.5 M a upravilo se pH na 7.5. Po extensivním promývání sloupce Blue Sepharosy pufrem obsahujícím 0.5M NaCl, 25 mM Tris, 10 mM CHAPS a 1 mM EDTA, pH 7.5. PAF-AH byl ze sloupce vymýván zvyšující se koncentrací NaCl až na 3.0 M.

Čistota tímto způsobem izolovaného PAF-AH byla obvykle 95%, tak jak bylo určeno pomocí SDS-PAGE s aktivitou v rozsahu 5 00 až 10000 LJ/ml. Jako další kvalitativní kontroly provedené s PAF-AH preparáty zahrnovaly určení hladiny endotoxinu a hemolytické aktivity s čerstvě připravenými krysími erytrocyty. Jak pufr sloužící zároveň k uchování i jako nosič k administraci preparátu byl použit pufr obsahující 25 mM Tris, 10 mM CHAPS, 0.5 M NaCl, pH 7.5. Dávkování použití v pokusech bylo založeno na určení enzymové aktivity v testech přímo předcházejících pokusům.

B. Indukce otoku (edemu)

Ve všech pokusech byly použity krysí samice Long Evans (Charles River, Wilmington, MA) stáří mezi 6 a osmi týdny, které vážily mezi 180 a 200 g. Před provedením pokusu byla zvířata podrobena anestezi směsí anestetických přípravků Ketaset (Fořt Dodge Laboratories, Fořt Dodge, IA), Rompun (Miles, Shawnee Mission, KS) a AePromazin (Aveco, Fost Dodge, IA). Všechny anestetika byla podána podkožně v dávkách přibližně 2.5 mg Ketasetu, 1.6 mg Rompunu, 0.2 mg Ace promazinu na jednu dávku podanou jednou zvířeti. Otoky byly indukovány v chodidlech podáním buď PAF, nebo zymosanu tak, jak je popsáno dále. PAF (Sigma -1402) byl čerstvě připraven pro provedení každého pokusu ze zásobního roztoku 19.1 mM uchovávaného ve směsi chloroform/metanol (9:1) při -20 °C. Požadované objemy byly vysušeny pod dusíkovou atmosférou, naředěny 1:1000 v pufru obsahujícím 150 mM NaCl, 10 mM Tris p 7.5 a 0.25% BSA a sonikovány po dobu pěti minut. Zvířatům bylo aplikováno podkožně mezi bříška na zadním chodidle 50 μΐ PAF (konečná dávka 0,96 nmolů). Otok se objevil za hodinu, v některých případech po dvou hodinách. Zymosan A (Sigma A-8800) se připravoval čerstvý pro každý pokus, a to jako suspenze 10 mg/ml v PS. Zvířatům bylo aplikováno podkožně mezi bříška na zadním chodidle 50 μΐ zymosanu (konečná dávka 500 pg) a otok se objevil po dvou hodinách.

Otok se kvantifikoval pomocí měření objemu chodidla bezprostředně před administrací PAF nebo zymosanu a potom v uvedeném čase po podání PAF a zymosanu. Otok se kvantifikoval zvýšením objemu chodidla v mililitrech. Měření objemu bylo prováděno na plethysmometru

- 36 CZ 297603 B6 (UGO Basile, model 7150), kterým se dá změřit objem vody vytlačené ponořeným chodidlem. Z důvodu, aby byla srovnatelná velikost ponořené části chodidla v obou vymezených časových intervalech, zadní část nohy byla označena nesmývatelným inkoustem v místě, kde končí osrstění na patě. Opakovaná měření stejného chodidla za použití této techniky indikovala přesnost měření s chybou do 5 %.

C. Způsoby podávání a dávkování PAF-AH

PAF-AH byl podáván injekčně lokálně mezi bříška na chodidle, nebo systémově pomocí intravenózní injekce do ocasní žíly. Při lokálním podávání dostaly krysy 100 μΐ AF-AH (4000 600 U/ml podkožně mezi bříška pravé zadní nohy. Levá noha sloužila jako kontrola, byla do ní injikována dávka 100 μΐ nosiče (pufrovaný fyziologický roztok). Pro systémové podání PAF-AH bylo krysám podáváno uvedené množství jednotek PAF-AH ve 300 μΐ nosiče injekcí do ocasní žíly. Kontrolní zvířata dostala intravenózně do ocasní žíly stejný objem nosiče.

D. Lokální podání PAF-AH

Krysám (N= 4) byla podána subkutánně mezi bříška na pravém chodidle injekční dávka

100 μΐ PAF-AH (4000-6000U/ml). Do levého chodidla byl injekčně vpraven jen nosič (100 μΐ pufrovaného fyziologického roztoku). Čtyřem dalším krysám byla podána pouze dávka nosiče. Všechny krysy byly ihned podrobeny podání PAF cestou subkutánních injekcí a jednu hodinu po podání byl měřen objem. Obrázek 6, kde je velikost otoku vyjádřena zvýšením objemu chodidla (ml) + SEM pro každou sledovanou skupinu, ukazuje, že vznik otoku indukovaného pomocí PAF je blokován lokálním podáním. PAF-AH. U skupiny zvířat, kterým byl podán PAF-AH před podáním PAF, se projevilo v porovnání s kontrolní skupinou zvířat zmenšení otoku. Ve skupině myší ošetřených PAF-AH bylo pozorováno zvýšení objemu chodidla jen o 0.08 ml + 0.008 (SEM), zatímco ve skupině ošetřené pouze nosičem vzrostl objem o 0.63 + 0.14 (SEM). Zvýšení objemu chodidla bylo způsobeno injekcí PAF do chodidla, toto zvětšení objemu nebylo pozorováno v chodidlech, do kterých byl injekčně aplikován pouze nosič.

E. Intravenózní podávání PAF-AH

Krysy (N= 4 ve skupině) byly ošetřeny intravenózní injekcí PAF-AH (2000 U ve 300 μΐ nosiče) 15 minut před podáním PAF. Otok se objevil 1 až 2 hodiny po podání PAF. Obrázek 7, na kterém je velikost otoku vyjádřena vzrůstem objemu v (ml) + SEM pro každou zkoumanou skupinu, ukazuje, že intravenózní aplikace PAF-AH blokuje vznik otoku zapříčiněný podáním PAF, a to jednu až dvě hodiny po jeho podání. Skupina, která byla ošetřena 2000U PAF-AH intravenózní cestou, vykázala v průběhu dvou hodin snížení zánětu. Průměrné zvýšení hodnoty objemu u skupiny léčené PAF-AH bylo 0.10 ml + 0.08 (SEM), oproti zvýšení 0.56 ml + 0.11 naměřeném u kontrolní skupiny ošetřené jen nosičem.

F. Srovnání účinku PAF-AH v zabránění vzniku otoku indukovaného PAF nebo Zymosanem

Krysy (N= 4 ve skupině) byly ošetřeny intravenózní injekcí PAF-AH (2000 U ve 300 μΐ nosiče) nebo nosičem samotným. 15 minut před touto injekcí obdržela zvířata PAF nebo zymosan A a po jedné nebo dvou hodinách byl změřen objem chodidel. Na obrázku 8 je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny sledované skupiny. Z obrázku je zřejmé, že podání PAF-AH (2000 U) bylo účinné v redukci otoku chodidla vyvolané PAF, avšak je neúčinné v blokování vzniku otoku v případě podávání zymosanu. Průměrné zvýšené hodnoty objemu u skupiny léčené PAF-AH bylo 0.08 ml + 0.02 (SEM), oproti zvýšení 0.49 ml + 0.03 naměřeném u kontrolní skupiny.

-37CZ 297603 B6

G. Účinné dávkování určené titrace PAF-AH vyvolávající ochranu

Ve dvou samostatných pokusech byl krysám (N= 3 až 4 ve skupině) podáván intravenózně PAFAH v sérii ředění nebo pouze nosič v 300 μΐ objemech, a to 15 minut před podáváním dávky PAF. Obě chodidla zvířat byla ošetřena PAF stejným způsobem, jako je popsán výše, otok se hodnotil po jedné hodině. Na obrázku 9 je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny sledované skupiny. Z obrázku je zřejmé, že podávání stoupajících dávek PAF-AH zabraňuje také se stoupající tendencí tvorbě otoku vyvoláného injekcí PAF krysám. V pokuse byla nalezena ID₅₀ pro PAF-AH podávaný injekční cestou mezi 40 a 80 U na krysu.

H. Účinnost PAF-AH in vivo jako funkce času po podání

Ve dvou samostatných pokusech byl krysám (N= 3 až 4 ve skupině) podáván intravenózně PAFAH (200 U v 300 μΙ nosiče) nebo pouze nosič. Po podání PAF-AH dostaly krysy dávku PAF, a to v časových intervalech počínajících 15 minut po podání PAF-AH až po 47 hodin po podání PAF-AH. Otok byl potom hodnocen jednu hodinu po podání PAF. Na obrázku 10 je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všechny sledované skupiny. Z obrázku je zřejmé, že podání 200U PAF-AH ochrání krysy před vznikem otoku indukovaného PAF po dobu nejméně 24 hodin.

I. Farmakokinetika PAF-AH

Čtyři krysy dostaly dávku 2000 PAF-AH intravenózní injekcí v 300 μΐ objemu. V různých časových bodech byla odebírána plazma a uchovávána při 4 °C. Koncentrace PAF-AH v plazmě se určovala pomocí ELISA, používal se typ testu využívající dvojité vazby pomocí mAb. Ve zkratce se dá tento postup popsat následovně: monoklonální protilátka 90G1 ID (Příklad 13) se naředí v 500 ml uhličitanovém pufru pH 9.6 na koncentraci 100 ng/ml a nechá se navázat na mikrotitrační desku Immulon 4 přes noc při + 4 °C. Po extensivním promytí pomocí PBS obsahujícího 0.05% Tween 20, se desky blokovaly 1 hodinu při pokojové teplot 0.05 iybí kožní želatinou (Sigma) ředěnou v BS. Vzorky séra ředěné v PBS obsahujícího 15 mM CHAPS byly na promytou desku naneseny v duplikátorech a inkubovaly se po dobu 1 hodiny v pokojové teplotě. Po promytí byl přidán do každé jamky konjugát monoklonální protilátky 90F2D s biotinem (Příklad 13) v koncentraci 5 pg/ml naředěný v PBS. Konjugát se nechal inkubovat jednu hodinu při pokojové teplotě. Po promytí se přidalo do každé jamky 50 μΐ Extra avidinu (Sigma) v ředění 1 : 1000. Avidin se inkuboval jednu hodinu při pokojové teplotě. Po promytí se přidal substrát OPD a nechalo se vyvinout zbarvení, které se změřilo na fotometru. Z kalibrační křivky se potom podle naměřených hodnot odečetla aktivita enzymu. Z obrázku 11, kde body reprezentují průměr + SEM, je patrné, že v plazmě odebrané hodinu po podání, hladiny koncentrace PAF-AH dosahují předpokládanou koncentraci ve vzorcích o objemu plazmy 5 až 6 ml u krys vážících 180 až 200gramů, průměrně 374 U/ml + 58.2. Po jedné hodině hladiny koncentrace stabilně klesají, až dosáhnou po 24 hodinách průměrnou hodnotu 19.3 U/ml + 3.4, která je však stále znatelně vyšší, než koncentrace endogenní PAF-AH, která dosahovala v enzymatických testech přibližných hodnot kolem 4U/ml.

J. Účinnost PAF-AH ve srovnání s antagonisty PAF

Krysy (N= 4 ve skupině) byly ošetřeny jedním ze tří potenciálních přípravků zamezujícího zánětu: antagonistou PAF CV3988 (Biomol L—103) podávaný IP (2mg e 200 μΙ EtOH), anagonistou PAF Alprazolam (Sigma A - 8800) podávaným IP (2 mg v 200 μΐ EtOH) nebo PAF-AH (2000 U) podávaným IV. Kontrolní skupina krys obdržela 300 μΐ nosiče IV. Antagonisté PAF byly administrovány IP, protože jsou rozpustné v ethanolu. Krysám ošetřeným buď CV3988, nebo Alprazolamem byl podán PAF po 30 minutách po podání těchto antagonistů, to proto, aby antagonisté PEF se dostaly do oběhu, zatímco PAF-AH a krysám ošetřeným nosičem bylo podá

-38CZ 297603 B6 vání uskutečněno po 15 minutách po administraci enzymu. Krysy ošetřené PAF-AH vykazovaly redukci v otocích indukovaných PAF, teprve za nimi se umístily další antagonisté CV3988 a Aprazolam. Toto je znázorněno na obrázku 12, kde je znázorněna velikost otoku jako průměrné zvýšení objemu v (ml) + SEM, a to pro všech zkoumané skupiny.

Shrneme-li dosažené výsledky, je patrné, že rPAF-AH účinně blokuje otoky vyvolané in vivo PAF. Podávání produktů PAF-AH se může dít buď lokálně, nebo systémově pomocí IV injekcí. Ve studiích dávkování se pohybovaly dávky IV injekcí v rozsahu 160 až 2000 U/krysu. tyto dávky dramaticky snížily zánět vyvolaný PAF, zatímco dávka 1D_5O se pohybovala v rozmezí 40 až 80 U/krysu. Výpočty založené na objemu plazmy pro krysu vážící 180 až 200 gramů dávají dobrý předpoklad k tomu, že koncentrace v plazmě rovnající se 25 až 40 U/ml účinně brání vniku otoku vyvolanému pAF. Tyto předpoklady byly podpořeny předběžnými farmakokinetickými studiemi. Dávka 2000U PAF-AH byla shledána jako účinná při blokování edému vyvolanému APF po dobu nejméně 24 hodin. Za 24 hodin po podávání byly v plazmě nalezeny koncentrace enzymu PAF-AH přibližně 25 U/ml. PAF-AH blokoval vznik otoku vyvolaného PAF daleko účinněji, než oba testovaní zmínění další antagonisti PAF. Souhrnně lze říci, že tyto výsledky potvrzují, že PAF-AH účinně blokují záněty indukované PAF a mohl by mít terapeutický význam při léčení nemocí, kde je PAF primární metiátor.

Příklad 15

Rekombinatní PAF-AH dle vynálezu byl testován in vivo na druhém modelu,zánětu pohrudnice (pleuritidě) vyvolaném PAF. Jak bylo prokázáno již dříve, PAF, je-li aplikován do pohrudničního prostoru, indukuje vaskulámí prosakování. (Hebriques a další, viz výše.) Samice krys (Charles River, 180 až 200 g) byly injikovány do ocasní žíly 200 μΐ 1% Evansovy modři rozpouštěné ve 300 μΐ rekombinantního enzymu PAF-AH (1500 μΙ/ml/hodina, připraveného tak, jak je popsáno v Příkladu 14) nebo pouze stejným objemem kontrolního pufru. Po patnácti minutách obdržely krysy 100μ1 injekci PAF (2nmol) do pohrudničního prostoru. Po jedné hodině působení PAF byly krysy zabity a odsáta kapalina, která vznikla promýváním pohrudniční dutiny 3 ml heparinizovanéh PBS. Prosakování cév bylo měřeno množstvím Evansovy modři v pohrudničním prostoru proměřením absorbance při 620 nm. U krys, kterým byl nejprve podán PAF-AH, bylo prosakování cév daleko menší, než u kontrolní skupiny zvířat (reprezentovalo to více než 80% redukci zánětu).

Předcházející výsledky podporují možnost využití rekombinantního PAF-AH dle vynálezu jako léku při zánětu pohrudnice.

Příklad 16

Účinnost rembinantního enzymu PAF-AH dle vynálezu byla také testována na modelu antigenem indukované tvorby eozinofilů. Akumulace eozinofilů v dýchacích cestách je charakteristickou vlastností pozdní fáze imunitní odpovědi, která se vyskytuje při astmatu, rinitidě a ekzémech. Myši BALB/c (Charles River) byly zcitlivěny dvěma intraperitoneálními injekcemi obsahujícími 1 pg ovalbuminu (OVA) ve 4 mg hydroxidu hlinitého (Imject alum, Pierce Laboratories, Rockford, IL) podávaný ve dvoutýdenním intervalu. Čtrnáctý den následující druhou imunizaci byly zcitlivěné myši podrobeny imunologickému testu s aerosolizovaným OVA nebo fyziologickým roztokem jako kontrolou.

Před samotným testem byly myši náhodně rozděleny do čtyř skupin po čtyřech myších. Myši ve skupině 1 a 3 byly ošetřeny 140 μΙ kontrolního pufru obsahujícího 25mM tris, 0,5M NaCl, lmM EDTA a 0,1% Tween 80 podaného intravenózní injekcí. Myši ve skupině 2 až 4 byly ošetřeny 750 jednotkami PAF-AH (aktivita 5500U/ml podanými ve 140 μΐ PAF-AH pufru). Třicet minut

-39CZ 297603 B6 po podání PAF-AH nebo pufru byly myši ve skupině l a 2 vystaveny aerosolizovanému PBS jak je popsáno dále, zatímco myši ve skupině 3 a 4 byly vystaveny aerolizovanému OVA. 24 hodin poté byly myši opět ošetřeny podruhé buď 140 μΙ pufru (skupina 1 a 3) nebo 750 jednotkami PAF-AH ve 140 μΐ pufru (skupina 2 a 4). Látky byly podané intravenózní injekcí.

Eozifilová infiltrace trachei byla indukována u zcitlivěných myší vystavením zvířat aerolizovanému OVA. Zcitlivěné myši byly umístěny do 50ml konických centrifugačních zkumavek (Corming) a nuceny dýchat aerolizovaný OVA (50 mg/ml) rozpuštěný v 0,9% fyziologickém roztoku po 20 minut s použitím rozprašovače (Model 464, DeVilbiss Corp., Somerset, PA). Kontrolní myši byly ošetřeny stejným způsobem s tou výjimkou, že byl v rozprašovači použit jen 0,9% fyziologický roztok. Osmačtyřicet hodin po expozici aerolizovaným OVA nebo fyziologickým roztokem byly myši usmrceny a trachei byly vyjmuty, trachei z každé skupiny byly pevně zachyceny v OCT a skladovány při -70 °C do doby nařezání preparátů.

K vyhodnocení eozinofilové infiltraci trachei byly tkáňové řezy ze čtyř skupin myši obarveny buď roztokem Luna a hematoxylin-eozinovým roztokem, nebo peroxidázou. Dvanáct šestimikrometrových řezů bylo nařezáno z každé skupiny myší a podle toho očíslováno. Řezy očíslované lichými čísly byly barveny barvou Luna dle následujícího postupu. Řezy byly fixovány 5 minut v alkoholu při laboratorní teplotě, opláchnuty tekoucí vodou třikrát vždy po 2 minutách při laboratorní teplotě a poté opláchnuty ve dvou výměnách destilované vody (dH₂O) po jedné minutě při laboratorní teplotě. Tkáňové řezy byly barveny barvou Luna 5 minut při laboratorní teplotě (barva Luna se skládá z 90 ml Weigertova železnatého hematoxylinu (Weigerťs Iron hematoxylin) a 10 ml 1% Biebrich Scarlet). Obarvené řezy byly ponořeny do 1% kyselého alkoholu 6x. opláchnuty v tekoucí vodě po 1 minutě při laboratorní teplotě, ponořeny do 0,5% roztoku uhličitanu lithného pětkrát opláchnuty tekoucí vodou po dobu 2 min při pokojové teplotě. Řezy byly dehydrovány etaholem o koncentracích 70 % - 95 % - 100 %, v každé koncentraci byly ponechány 1 minutu při pokojové teplotě, dále přečištěny dvakrát xylenem po dobu 1 minuty při pokojové teplotě a připevněny do Cytoseal 60.

Pro barvení peroxidáz byly segmenty fixovány acetonem o teplotě 4 °C po dobu 10 minut a usušeny na vzduchu. Ke každé části bylo přidáno 200 μΐ roztok DAB a ponecháno 5 minut pří pokojové teplotě. Řezy byly 5 min oplachovány vodovodní vodou při pokojové teplotě a dále byly na každý segment aplikovány 2 kapky 1 % kyseliny osmičelé po dobu 3 až 5 s. Řezy byly opláchnuty vodovodní vodou po dobu 5 min při pokojové teplotě a kontrastně obarveny Mayerovým hematoxylinem při 25 °C při pokojové teplotě. Poté byly řezy 5 minut oplachovány tekoucí vodou a dehydrovány etanolovou řadou 70 % - 95 % - 100 %, 1 minutu v každé koncentraci, při pokojové teplotě. Řezy byly dále pročištěny dvakrát xylanem po dobu 1 minuty při pokojové teplotě a upevněny v Cytosealu 60.

Byl hodnocen počet eosinofilů v submukosální tracheální tkáni. Trache myší první a druhé skupiny obsahovala velmi málo samotných eosinofilů v submukosální tkáni. Podle předpokladu byla tracheje myší třetí skupiny, které byly předem ošetřeny pufrem a vystaveny poprachu OVA, velký počet eosinofilů v submukosální tkáni. Naproti tomu tracheje myší čtvrté skupiny, které byly předběžně ošetřeny PAF-AH a vystaveny poprášení OVA, obsahovaly pouze několik eosinofilů v submucosální tkáni ve srovnání s kontrolní skupinou a skupinami 1 a 2.

Terapeutické ošetření PAF-AH proto může být indikováno v případech pozdní imunitní odezvy, při které dochází k akumulaci eosinofilů, tak, jak je tomu u astmatu a rinitidy.

Příklad 17

PAF-AH produkt, který je předmětem patentu, byl testován u dvou odlišných krysích modelů při ošetření nekrotických enterokolitid (NEC), akutních hemoragických nekróz střeva, ke kterým dochází u plodů s nízkou porodní váhou a způsobuje významnou chorobnost a mortalitu.

-40CZ 297603 B6

V předchozích experimentech se ukázalo, že ošetření glukokortikoidy snížilo výskyt NEC u zvířat a nedonošených dětí a předpokládá se, že k aktivitě glukokortikoidů dochází prostřednictvím zvýšeně aktivity PAF-AH v plazmě.

A. Aktivita u krys s NEC indukovaným působením PAF

1. Prevence NEC

Rekombinantní PAF-AH produkt, rPH.2 (25.500 jednotek v 0,3 ml, skupiny 2 a 4) nebo samotný pufr (25 mM tris, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA a 0,1% Tween 80) (skupiny 1 a 3), byly podány do ocasní žíly samičích krys Wistar (n=3) o váze 180 až 200 g. 15 minut po aplikaci rPH.2 nebo samotného pufru byl zvířatům injikován, tak, jak popsal Furukawa, et al. (J. Pediatr. Res. 34: 237-241 (1993)), do abdominální aorty na úrovni superior mesanterické arterie buď samotný BSA (0,25 %) - fyziologický roztok (skupiny 1 a 2), nebo PAF (0,2 pg/100 gm) suspendovaný ve fyziologickém roztoku obsahujícím BSA (skupiny 3 a 4). Tenká střeva byla po dvou hodinách odstraněno od slepé střevo přerušením trietzova vazu, důkladně opláchnuta chladným fyziologickým roztokem a hodnocena. Pro mikroskopickém pozorování bylo získání vzorky z horní, střední a dolní části tenkého střeva. Tkáně byly fixovány v pufrované formalínu a vzorky připravené pro mikroskopické hodnocení obarvením hamatoxylinem a eosinem. Experiment byl třikrát opakován.

Při zevrubné prohlídce střev byl zjištěn normální nález ve skupinách ošetřených BSA ve fyziologickém roztoku. Podobně také injikovaný rPH.2 za nepřítomnosti PAF neměl žádný efekt na vynález ve střevech (gross findings). Naopak injekce PAF do descendující aorty měla za následek rychlé a těžké diskolorace a hemoragii serózního povrchu střeva. Podobná hemoragie byla zaznamenána, jestliže byly segmenty tenkého střeva sledovány na straně sliznice a tenké střevo segmenty tenkého střeva sledovány na straně sliznice a tenké střevo bylo zcela nekrotické. Pokud byl rPH.2 injikován do ocasní žíly 15 min před podáním PAF do aorty, byl nález na střevech normální.

Při mikroskopickém pozorování střev u skupin 1,2 a 4 byla zjištěna normální vilosní architektura a normální populace buněk v lamina propria. Naopak u skupiny ošetřené samotným PAF byly zjištěny silní nekrózy a hemoragie v celé sliznici. Aktivity PAF-AH v plazmě byly stanoveny u stejných krys jako v předchozím experimentu. Aktivita PAF-AH byla stanovena jak je níže popsáno. Před injekcí do ocasní žíly byly nejprve odebrány vzorky krve. Dále byly vzorky odebrány z véna cava bezprostředně před injekcí PAF a v době usmrcení. Krev byla sbírána v množství asi 50 μΐ do heparinizovaných kapilárních trubiček. Plazma byla získána centrifugací (980x g po dobu 5 minut). Enzym byl stanoven podle Yasuda a Johnston, Endocrinology, 130: 708-716(1992).

Aktivita PAF-AH v plazmě byly u všech krys před injekcí 75 ± 2,5 jednotky (1 jednotka je rovna nmol x min'¹ x ml’¹ plazmy). Aktivity PAF-AH naměřené v plazmě byly po 15 minutách po injekci samotného pufru 75,2 ± 2,6 jednotky u skupiny 1 a 76,7 ± 3,5 jednotek u skupiny 3. Po 15 minutách byla zjištěna aktivita PAF-AH v plazmě zvířat, kterým bylo injikováno 25 000 jednotek rPH.2, 2249 ± 341 jednotek u skupiny 2 a 2494 ± 623 jednotek u skupiny 4. Aktivita u skupin a 4 zůstala zvýšená (1855 ± 257 jednotek) až do doby usmrcení (2 1/4 hodiny po injekci rPH.2) (skupina 2 = 1771 ± 308; skupina 4 = 1939 ± 478). Z těchto výsledků vyplývá, že aktivita PAFAH v plazmě krys, kterým byla injikována samotná přenosná látka (skupina 1 a 3), se neměnila v průběhu experimentu. U zvířat, kterým byl injikován samotný PAF, se vyvinul NADC, zatímco všechny krysy, kterým byl podán rPH.2 a poté injekce PAF, byly zcela ochráněny.

-41 CZ 297603 B6

2. Závislost prevence NEC na dávkování

Aby bylo možno zjistit u krys závislost ochranné aktivity proti NEC na dávkování, byla zvířata ošetřena zvyšujícími se dávkami rPH.2 15 min před podáním PAF. Dávky rPH.2 se pohybovaly v rozmezí 25,5 až 25.500 jednotek, které byly podány do ocasní žíly krys. Následně byl injikován PAF (0,4 pg v 0,2 ml fyziologického roztoku s BSA) 15 min po podání rPH.2 do abdominální aorty. 2 hodiny po podání PAF bylo tenké střevo odstraněno a byl hodnocen vznik NEC. Aktivita PAF-AH v plazmě byla stanovena před exogenním podáním enzymu a 15 minut a 2 1/2 hodiny po podání rPH.2. Výsledky jsou průměrnou hodnotou ze 2 až 5 zvířat v každé skupině. U všech krys, které dostávaly méně než 2000 jednotek enzymu, se rozvinul NEC. Aktivita PAF-AH v plazmě zvířat, kterým byly podávány nejnižší ochranné dávky enzymu (2040 jednotek), dosahovala po 15 minutách 363 jednotek na ml plazmy, což představovalo pětinásobné zvýšení oproti výchozí hodnotě. Pokud byla rPH.2 podán v dávce nižší než 1 020 celkových jednotek, byla průměrná aktivita enzymu v plazmě kolem 160 a nižší a u všech zvířat zjištěn vznik NEC.

3. Trvání ochrany proti NEC

Pro stanovení délky exogenního působení produktu PAF-AH potřebného k ochraně proti vzniku NEC, bylo krysám do ocasní žíly jednorázově injikováno fixní množství enzymu a následně aplikován PAF v různých časových intervalech. rPH.2 (8 500 jednotek v 0,3 ml) nebo samotný roztok bez účinné látky byl krysám podán od ocasní žíly a PAF (0,36 pg v 0,2 ml BSA ve fyziologickém roztoku) injikován do abdominální aorty v různých časových intervalech po podání enzymu. Tenká střeva byla vyjmuta 2 hodiny po injekci PAF a podrobena vyšetření a histologickému pozorování vzniku NEC: Aktivita PAF-AH v plazmě byla stanovena v různých intervalech po podání enzymu a dvě hodiny po aplikaci PAF. V každé skupině byly stanoveny průměrné hodnoty enzymatické aktivity ± standardní odchylka.

Z výsledků vyplývá, že u žádné z krys nedošlo ke vzniku NEC během prvních 8 hodin po injekci rPH.2, zatímco u 100 % zvířat, kterým byl následně aplikován PAF 24 a 48 hodin po injekci enzymu, došlo k rozvoji NEC.

4. Zvrat NEC

Aby bylo možné stanovit, zda může podávat PAF-AH zvrátit rozvoj NEC vyvolaný injekcí PAF, bylo zvířatům injikováno 25 000 jednotek enzymu do véna cava dvě minuty po podání PAF (0,4 pg). U žádného zvířete se NAD nevytvořil. Avšak byl-li rPH.2 podán tímto způsobem 15 minut po injekci PAF, u všech zvířat se NEC vytvořil, což odpovídá rychlému průběhu rozvoje NEC indukovanému podáním PAF, jak již bylo popsáno dříve Furukava et al. (viz výše). Ze souhrnu těchto výsledků vyplývá, že relativně malé zvýšení aktivity (pětinásobné) PAF-AH v plazmě je schopno zabránit vzniku NEC. Tato pozorování spolu s předchozími zprávami o tom, že aktivita PAF-AH v plazmě králičích plodů [Maki, et. al., Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 85: 728-732 (1988)] a nedonošených dětí [Caplan, et al., J. Pediatr. 116: 908-964 (1990)] byla relativně nízká, svědčí o tom, že profylaktivní podání přípravků obsahujících lidský rekombinantní PAF-AH produkt dětem s nízkou porodní váhou může být použita při ošetření NEC.

B. Aktivita v neonatálním modelu NEC

Účinnost produktu PAF-AH, rPH.2, byla hodnocena u NEC modelu u nově narozených stresových krys dále popsaným postupem, a to podáním krmné směsi a asfyxií, což jsou dva rizikové faktory pro vznik choroby u lidí. V tomto modelovém systému došlo u 70 až 80 % zvířat do třetího dne života ke zjevnému a mikroskopickému poškození střeva podobně jako u neonatálního NEC. Krysí novorozenci byli získáni z březích krys Sprague-Dawley (Harley Sprague-Dawley, Indianapolis, IN), při anesterzii CO₂ a porozeny abdominální incisí. Novorozená zvířata byla shromážděna, osušena a po celou dobu experimentu umístěna v inkubátoru pro novorozence.

-42 CZ 297603 B6

Nejprve bylo u jednotlivých skupin zvířat stanoveno dávkování a absorpční charakteristiky rPH.2. Normálním novorozeným krysím mláďatům byla v čase 0 podána enterálně nebo intraperitoneálně jedna ze tří dávek rPH.2 (3λ, 15λ nebo 75λ) a poté byla odebírána krev pro stano5 vení aktivity PAF-AH v plazmě po 1 h, 6 h nebo 24 h. aktivita PAF-AH byla měřena metodou inkubace se substrátem [Gray et al., Nátuře, 374: 549 (1995)] a EL1SA s použitím anti-lidských rPAF-AH monoklonálních protilátek pro každý vzorek (90F2D a 90G11D, jak je popsáno v Příkladu 13). Imunohistochemický rozbor byl proveden standardními technikami pomocí protilátek ředěných 1:100 a inkubovaných přes noc.

U normálně narozených mláďat krys nebyly po aplikaci rPH.2 do střev, zjištěna zvýšená aktivita PAF-AH v plazmě v žádnou dobu experimentu, jak pomocí metody inkubace se substrátem, tak metodo ELISA. Při intraperitoneální aplikaci rPH.2 byla do jedné hodiny po aplikaci měřitelná cirkulující aktivita PAF-AH oběma metodami a tato aktivita vrcholila 6 h po podání látky. Vyšší 15 dávky rPH.2 (od 3 do 75 λ, 10 až 250 U) vyvolaly vyšší aktivitu PAF-AH v plazmě. Po enterálním podání byla při imunohistochemické analýze zjištěna přítomnost rPAF-AH produktu v epitelových buňkách střevní sliznice. Aktivita byla soustředěna převážně v střevních virech s minimální přítomností barviva v kryptických buňkách. Intenzivněji bylo obarveno ileum než jejunum a určité množství rPAF-AH produktu bylo imunochemicky detekováno v částech trač20 niku. Žádné pozorovatelné barvení nebylo zjištěno u kontrolních vzorků a vzorků získaných ze zvířat, kterým byla látka podána intraperitoneálně. Enterální aplikace produktu rPAF-AH měla tedy za následek lokální akumulaci v epitelu sliznice, zatímco intraperitoneální podání produktu rPAF-AH zvýšilo hladinu cirkulujících enzymu ale ne jeho lokální akumulaci ve sliznici.

U NEC modelu byl u novorozených krys indukován NEC podle Caplan et al., Pediatr. Pathol., 14: 1017-1028 (1994). Při tomto postupu byla zvířata každé tři hodiny krmena trubičkou rozpustnou krmnou směsí pro mláďata (Esbiliac, Borden lne). Počáteční krmná dávka 0,1 ml/krmení byla později podle tolerance zvýšena na 0,4 ml/krmení až do čtvrtého dne. U všech zvířat byla dvakrát denně vyvolána asfyxie vdechováním 100 % dusíku po dobu 50 sekund v uzavřené plas30 tikové komoře a zvířata byla vystavena chladu (4 °C) po dobu 10 min. Funkce střev a močového měchýře byla stimulována jednou manipulací po každém krmení. Zvířata byla vyživována po dobu 96 hodin nebo dokud nevykazovala znaky úzkosti. Chorobná zvířata měla bdominální distenzi, krvavou stolici, dýchací potíže, cyanózu, latergii a byla usmrcena dekapitací. Po usmrcení byla střeva všech krys hodnocena na přítomnost nekróz a fixována ve formalínu pro pozdější 35 histologickou analýzu. Vzorky byly uchyceny v parafínu, nařezány mikrotomem, obarveny mehatoxylinem a eosinem a hodnoceny dvěma nezávislými pozorovateli. Poškození střev bylo označeno jako 1+ při odchlípnutých nebo oddělených epitelových buňkách, 2+ při odlupujících se epitelových buňkách do střední vilózní vrstvy, 3+ pro nekrózu celého vilu a 4+ pro transmurální nekrózu.

Pro stanovení účinnosti rPH.2 byla třem skupinám krys podána látka enterálně, intraperitoneálně nebo oběma způsoby. Preparát rPH.2 obsahoval 0,8 mg/ml proteinu a přibližně 4000 jednotek/mg PAF-AH s poměrem endotoxin/protein <0,5 EU/mg. Při enterálním užití rPH.2 bylo zvířatům podáno 25 (80U) látky zředěné v krmné dávce oragostrickou trubicí (každé tři hodiny). Při intra45 peritoneálním užití bylo zvířatům podáno 75λ intraperitoneální injekcí dvakrát denně. Kontrolní zvířatům byl aplikován odpovídající objem pufru (20 mM NaPO₄, pH 7,4) bez rPH.2 a byly sledovány současně s každou experimentální skupinou. Mortalita a příznaky NEC u každé skupiny ošetření a rozdíly byly analyzovány pomocí Fischerova exaktního testu. Za významné byly považovány hodnoty při p < 0,05. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 9.

-43 CZ 297603 B6

Tabulka 9

	NEC	mrtvé
kontrola (i.p. podání)	7/10	8/10
rPH.2 (240 U i.p., dvakrát denně)	6/11	8/11
kontrola (enterální podání)	19/26	21/26
rPH.2 (80 U enterálně, po 3 h)	6/26	7/26
kontrola (i.p. + enterální podání)	10/17	12/17
rPH.2 (240 U i.p. dvakrát denně a 80 U enterálně po 3 hodinách)	3/14	7/14

Údaje reprezentují souhrnné výsledky čtyř nezávislých experimentů při i.p. aplikaci, čtyř experimentů při enterálním podání a tří experimentů při i.p. + enterálním podání.

Enterální aplikace rPH.2 v porovnání s kontrolou významně snižovala jak výskyt NEC tak úhyn zvířat. Výsledky čtyř různých experimentů ukázaly, že předchozí ošetření zvířat rPH.2 snížilo NEC ze 19/26 (kontrola) na 6/26 (p<0,001). Intestinální poškození ošetření ošetřených a kontrolních zvířat bylo různé, ale ve většině případů se jednalo o midvillous nekrózy u několika segmentů, úplné nekrózy vilu v jiných částech, případně též místa s transmurálními nekrózami, zbývající části měly normální histologický nález. Nejtěžší stupen NEC u ošetřených i kontrolních zvířat s intestinálním poškozením byl podobný (střední hodnota 2,8 a kontrolní a 2,4 u krys předem ošetřených rPH.2, p>0,05).

Intraperitoneální podání rPH.2 nemělo, v tomto modelovém systému, na tvorbu NEC a úhyn zvířat významný vliv. Nástup symptomů u této skupiny a kontroly byl podobný (40 ± 5 hodin u kontroly, 36 ± 7 hodin u skupiny krys ošetřené rPH.2) a stupeň NEC byl u obou skupin také podobný (střední hodnota 2,6 u kontroly a 2,5 u skupiny krys ošetřené rPH.2).

Byly provedeny další experimenty, při kterých byl krysám podán rPH.2 jak enterálně, tak intraperitoneálně, a to ve stejných dávkách jak při aplikaci jedním z těchto způsobů (25λ rPH.2 při každém krmení po třech hodinách a 75λ intraperitoneální injekcí dvakrát denně). Výsledky ukazuje tabulka 9. Přestože nebyl mezi ošetřenou a kontrolní skupinou zjištěn významný rozdíl v počtu uhynulých zvířat, ošetření rPH.2 významně snížilo výskyt NEC (10/17 u kontrol a 3/14 u kiys ošetřených rPH.2, p = 0,04). U šesti ze sedmi uhynulých zvířat ze skupiny ošetřené rPH.2 byl zjištěn pozitivní nález E. coli v krvi těsně před smrtí.

Tyto výsledky potvrzují ochrannou roli PAF-AH produktů v neonatálním modelu NEC, který není indukován PAF. Enterální ošetření rPAF-AH produktem bránilo vzniku NEC, zatímco intraperitoneální ošetření v těchto dávkách nemělo tážný zjevný účinek. Tyto výsledky svědčí o tom že PAF-AH produkt doplněný do směsi pro umělou výživu novorozenců ohrožených vznikem NEC by mohl snížit výskyt tohoto onemocnění.

Příklad 18

Účinnost PAF-AH produktu při syndromu akutní respirační nedostatečnosti (ARDS - acute respirátory distress syndrome) byla sledována u morčat.

Intravenózně injikovaný PAF vyvolával u morčat těžký zápal plic připomínající počáteční ARDS u lidí. V průběhu několika minut po intravenózní aplikaci PAF, byl parenchym plic zaplněný zúženými bronchi a bronchiolami (Lellouch-Tubiana et al., viz výše). Krevní destičky a polymorfonukleámí neutrofily počaly marginalizovat a buněčné agregáty byly snadno detekovatelné podél plicních arteriol [Lellouch-Tubiana Br. J. Exp Path., 66: 345-355 (1985)]. Infuze PAF také poškozovaly bronchiální epitelové buňky, které se odlučovaly ze stěn a akumulovaly v dýchacích

-44CZ 297603 B6 cestách. Takové poškození epitelových buněk v dýchacích drahách je ve shodě s tvorbou hyalinních membrán, ke kterému dochází u lidí v průběhu rozvoje ARDS. Marginalizace neurofilů a destiček je rychle následována diapedezí těchto buněk do alveolámích sept a alveolámích prostorů plic. Buněčné infiltráty vyvolané PAF jsou provázeny významným vaskulámím prosakováním a vznikem edému v dýchacích cestách [Kirsch, Exp. Lung Res., 18: 447^459 (1992)]. Vznik edému byl také potvrzen při in vitro studiích, kdy PAF indukoval extravazaci fibrinogenu značeného ^l25I v závislosti na podané dávce (10-1000 ng/ml) u promytých plic morčat [Basran, Br. J. Pharmacol., 77: 437 (1982)].

Na základě výše uvedených pozorování byl vytvořen ARDS model u morčat. Kanyla je pod anestezií umístěna do krční žíly morčat Hartly samčího pohlaví (přibližně 300 až 400 g) a PAF zředěný v transportní látce, kterou bylo 500 μΐ PBS s 0,25 % hovězího sérum albuminu (PBSBSA), aplikován infuzí po dobu 15 minut v celkové dávce 100 až 400 ng/kg. V různých intervalech po infuzi PAF byla zvířata usmrcena a odebrána plicní tkáň. U morčat, kterým byl infuzí podán PAF, bylo již během 15 minut jasně patrné časově závislé poškození plic a zánět, který trval až 60 minut. V alveolámích prostorách morčat, kterým byl podán PAF, jsou přítomny neutrofily a červené krvinky, zatímco u kontrolních zvířat jejich přítomnost nebyla zjištěna. Bylo také prokázáno poškození epitelových buněk připomínající tvorbu hyalinních membrán u lidských pacientů s ARDS. Ve vzorcích bronchoalveolámí laváže (BAL) odebraných z morčat, kterým byl infúzně podán PAF, byla zjištěna silná akumulace proteinů v zanícených plicích a prokázáno vaskulární prosakování.

V tomto modelovém systému ARDS u morčat bylo zjištěno, že rPH.2 zcela zabránil poškození plic vyvolávanému PAF. Skupiny morčat byly předem ošetřeny buď rPH.2 (2000 jednotek v 500 μΐ), nebo jen samotným PAF-AH pufrem (500 μΐ). Po 15 minutách byl morčatům podán infúzně PAF (400ng/kg v 500 μΐ) a aplikován po dobu 15 minut. Kontrolní skupině morčat bylo infúzně podáno 500 μΐ PBS-BSA. Po ukončení infúzí PAF byla zvířata usmrcena a odebrána BAL tekutina laváží plic X s 10 ml fyziologickému roztoku obsahujícím 2 μΐ/ml heparinu, aby se předešlo srážení. Pro stanovení obsahu proteinů v BAL byly vzorky zředěny 1:10 fyziologickým roztokem a stanovena OD 280. V BAL tekutině morčat, kterým byl aplikován samotný pufr, byla zjištěna koncentrace proteinů 2,10 ± 1,3 mg/ml. Naproti tomu BAL tekutina ze zvířat, kterým byl infúzně podán PAF, obsahovala 12,55 ± 1,65 mg/ml proteinů. U morčat předem ošetřených rPH.2 byl v BAL tekutině zjištěný obsah proteinů 1,13 ± 0,25 mg/ml, což je srovnatelné s kontrolou a dovoluje, že PAF-AH produkt zcela brání vzniku plicního edému indukovaného PAF.

Příklad 19

Účinnost produktu PAF-AH, rPH.2, byla hodnocena u dvou modelových systémů akutní pankreatitidy.

A. Aktivita u modelu pankreatitidy u krys

Samci krys Wistar (200-250 g) byly zakoupeny od Charles River Laboratories (Wilmington, MA). Krysy byly chovány v místnosti s řízeným klimatem 23 ± 2 °C, 12 hodinovým cyklem světlo/tma a krmeny standardním laboratorním krmivém a vodou ad libitum. Zvířata byla náhodně rozdělena do kontrolní a experimentální skupiny. Krysy byly anestezovány 50 mg/kg pentobarbitalem sodným aplikovaným intraperitoneálně a poté jim byl zaveden polyvinylový katétr (velikost V3, Biolab products, Lake Havasu, AZ) do krční žíly. Katétr byl tažen subkutánně a ústil v dorsální cervikální oblasti. Zvířata byla ponechána aby se probrala s anestézie. Krysy měly volný přístup k vodě ale byly přes noc ponechány bez potravy. Experimenty byly provedeny následující den na zvířatech, která byla již při vědomí. Do zahájení experimentu byl katétr plněn konstantní infuzí fyziologického roztoku (0,2 ml/h). V den experimentu byl zvířatům

-45CZ 297603 B6 intravenózně injikován rPH.2 nebo samotná přenosná kontrolní látka a následně podána infuze buď (1)5 pg/kg caeruleinu po hodině po dobu 5 hodin. (Research Plus, Bayonne, NJ). Ihned po ukončení infuzí byla zvířata anestezována pentobarbitalem sodným, otevřeny břišní dutiny a odsáto 5 ml krve z vnitřní vény cavy pro další stanovení. Zvířata byla poté usmrcena vykrvácením. Byly měřeny sérum amyláza sérum lipáza a sérum bilirubin a odebrán pankreas. Části pankreatu byly buď fixovány v 4% roztoku fosfátového formaldehydového pufru pro histologická pozorování nebo ihned zmraženy na -80 °C po měření myeloperoxidázové aktivity. Další části pankreatu byly použity pro stanovení obsahu vody v pankreatu, pankreatické amylázy a trypsiny, jak je popsáno níže. Myeloperoxidázová aktivita, která ukazuje míru zabarvení neutrofilů byla stanovena v pankreatu a plicích, jak je dále popsáno. Data byla statisticky hodnocena pomocí nepárového Studentova t-testu. Uvedené hodnoty představují průměr + S.E.M. přinejmenším tří různých experimentů. Za významné jsou považovány výsledky při p < 0,05.

1. Obsah vody v pankreatu

Segmenty pankreatu byly osušeny a zváženy (čerstvá váha) a poté sušeny 34 hodin při 120 °C a opět zváženy (suchá váha). Voda pankreatu byla vypočítána jako rozdíl mezi čerstvou a suchou váhou a vyjádřena jako procento čerstvé váhy. Zvýšený obsah vody v pankreatu indikoval vznik edému.

2. Sérum a pankreatická amyláza

Aktivita amylázy v séru byla měřena pomocí substrátu 4,6-ethylin (G₇)-p- nitrofenyl (Gij-oiiDmaltoplastit (ET-G7PNP) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) podle Pierre et al., Clin. Chem., 22: 1219 (1976). Aktivita amylázy v tkáních pankreatu byla měřena stejnou metodou po homogenizaci tkání v lOmM fosfátovém pufru, pH 7,4.

3. Pankreatický trypsin

Aktivita trypsinu byla měřena fluorimetricky pomocí substrátu Boc-Gin-Ala-Arg-MCA. V kyvetě bylo smícháno 200 μΐ vzorku a 2,7 ml 50 mM Tris pufru (pH 8,0) obsahujícího 150 mM NaCl, 1 mM CaCI₂ a 0,1 % hovězí sérum albumin. Ke vzorku bylo přidáno 100 μΐ substrátu a po 20 sekundách preinkubace byla zahájena reakce. Fluorescence byla měřena při excitaci 380 nm a emisi 440 nm a vyjádřena směrnicí přímky. Aby bylo možné vyhodnotit společně různé experimenty, byla aktivita trypsinu ve frakcích vyjádřena jako procento celkové aktivity trypsinu.

Histologie a morfometrie

Pro světelnou mikroskopii byly náhodně vybrány řezy z přední, střední a zadní části pankreatu a fixovány v 10% neutrálním fosfátovém formalínovém pufru. V parafínu uchycené segmenty o velikosti 5 μιη byly obarveny hematoxylinem-eosinem (Η & E) a hodnoceny zkušeným morfologem. Poškození nebo nekrózy acinámích buněk bylo stanoveno buď jako (a) přítomnost neostrostí u acinámích buněk, nebo (b) vakuolizace a otok acinámích buněk a destrukce histo-architektury celého acinu nebo jen části, oba jevy musely souviset se zánětlivou reakcí. Množství poraněných nebo nekrotických buněk a celková plocha tvořená acinámími buňkami bylo kvantifikováno morfometricky pomocí videa a počítačové planimetrické analýzy obrazu (model CCD72, Dage-MTl, Michigan city, IN) vybaveným softwarem pro analýzu obrazu NlH-1200. U každého vzorku bylo hodnoceno deset náhodně zvolených polí mikroskopu. Rozsah poškozených nebo nekrotických buněk byl stanoven jak procento celkové plochy acinámích buněk s oblastmi splňujícími kritérie pro poškození nebo nekrózu.

-46CZ 297603 B6

5. Měření myeloperoxidázivé aktivity (MPO) v pakreatu a plicích

Zabarvení netrofilů v pankreatu a plicích bylo stanoveno na základě myeloperoxidázové aktivity v tkáních. Vzorky tkání odebrané v době usmrcení byly uloženy při -70 °C až do doby analýzy. Vzorky (50mg) byly rozmraženy a homogenizovány v 1 ml 20 mM fosfátového pufru (ph 7,4) a centrifugovány (10.000 x g, 10 min, 4 °C). Získaný pelet byl resuspendován v 50mM fosfátovém pufru (pH 6,0) obsahujícím 0,5 % hexadecyltrimethylamonium bromid (Sigma, St. Louis, MO) a čtyřikrát za sebou zmraženy a rozmražen. Suspense byly pak rozrušeny sonikací po dobu 40 sekund a centrifugována (10.000 x g, 5 min, 4 °C). Reakční směs obsahující extrahovaný enzym, 1,6 mM twetrametylbenzidin (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO), 80mM fosfátový pufru (pH 5,4) a 0,3 mM peroxid vodíku, byla inkubována při 37 °C 110 sekund a měřena absorbance při 655 nm automatickým analyzátorem CobasBio. Tato absorbance pak byla přepočítána podle obsahu sušiny ve vzorku tkáně.

Měření pulmonální vaskulární permeability

Ucpání společného biliopankreatického kanálu má obvykle za následek těžkou pankreatitidu související s poškozením plic, které lze kvantifikovat podle vaskulární permeability plic a histologických hodnocením.

Zvířatům bylo dvě hodiny před usmrcením intravenózně aplikováno 5 mg/kg fluorescein isothiokyanát albuminu (FITC-albumin, Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Pulmonální mikrovaskulární permeabilita byla hodnocena na základě prosakování FITC-albuminu z vaskulárních kompartmentů do bronchoalveolámích prostor. Stručný popis metody: ihned po usmrcení byl pravý bronchus blokován svorkou a trachea otevřena. Poté byla pravá plíce vymyta pomocí kanyly vložená do tracheji. Tři laváže fyziologickém roztokem (60 ml na laváž) byly spojeny a byly měřeny fluorescence FITC v séru a laváži při excitaci 494 nm a emisi 520 nm. Vypočtený poměr fluorescence laváže ke krvi pak vyjadřoval míru mikrovaskulámí permeability plic. Plíce byl také obarveny pomocí Η & E a histologicky hodnoceny.

7. Účinek podání Caerulei a rPH.2

Infúze samotného cearuleinu 5 pg/kg/h po dobu 3,5 hodiny vyvolala u krys typickou mírnou indukovanou pankreatitidu, charakterizovanou hyperamylázií, pankreatickým edémem měřeným podle obsahu vody v pakreatu a histologickými změnami zahrnujícími výraznou vakuolizaci a pankreatický edém. Infúze fyziologického roztoku nevyvolávala u kontrolních zvířat žádné z těchto biochemických ani histologických změn. Intravenózní podání rPH.2 v dávkách 5, 10 nebo 20 mg/kg 30 min před začátkem infúze cearuleinu neovlivnila významně závažnost změn pankreatického edému (obsah vody) a histologický nález indukovaný infúzí samotného caeruleinu. Podání rPH.2 neovlivnilo také caeruleinem indukovanou aktivaci pakreatického trypsinogenu nebo obsah amylázy.

Infúze vyšších dávek cearulinu, 10 pg/kg/ha po dobu 5 hodin, vyvolala u krys těžší pankreatitidu s charakteristickým výrazným zvýšením amylázové aktivity v séru, vznikem pankreatického edému, silným zvýšením pankreatické aktivity MPO a významným zvýšením aktivace trypsinogenu a amylázové aktivity pankreatu. Histologie pankreatu odhalila nejen edém pankreatua vakuolizaci alcinárních buněk, ale také několik nekrotických skvrn a několik infiltrovaných buněk.

Podání rPH.2 (5 nebo 10 mg/kg intravenózně) 30 min před počátkem infúze caeruleinu (10 pg/kg/h) zlepšilo většinu pankreatických změn, které vyvolala samotná infúze cearuleinu. Výsledky prezentuje Tabulka 10, viz dále. Ošetření rPH.2 v dávce 5 mg/kg mělo za následek pokles aktivity sérum amylázy (z 10984±1412 na 6763± 1256). Vyšší dávky 10 mg/kg rPH.2 již nevyvolávaly zlepšení hyperamylázie. Ošetření rPH.2 v dávce 5 nebo 10 mg/kg mělo také za následek snížení výskytu pankreatického edému indukovaného caeruleinem měřeného podle obsahu vody (90,61 ± 0,27 při samotném cearuleinu a 88,21 ± 0,61 pro cearulei s 5 mg/kg

-47CZ 297603 B6 rPH.2). a rPH.2 v dávce 5 mg/kg vyvolal silné zlepšení pankreatické aktivity NPO (2,92 + 0,32 krát při samotném cearuleinu a 1,19 + 0,21 při cearuleinu spolu s rPH.2, p < 0,05). Vyšší dávky rPH.2 nevyvolávaly již další zlepšení MPO aktivity. Dávka rPH.2 také neměnila významně rozsah aktivace typsinogenu nebo obsah amylázy v pankreatu. Po předběžném ošetření rPH.2 5 bylo při histologické analýze zjištěno zlepšení v případě mikroskopických nekróz pakreatu a infiltrace.

Poškození plic související s pankreatitidou bylo pozorováno jak klinicky, tak u několik modelů pankreatitidy. Infuze caerulinu v dávce 5 pg/kg/h po dobu 3,5 h, která vyvolává mírnou formu io pankreatitidy, neměla za následek významné zasažení plic. Avšak infúze cearulinu v dávce pg/kg/h po dobu 5 h, která vyvolávala těžší pankreatitidu, způsobila poškození plic kvantifikovatelné zvýšenou vaskulámí permeabilitou plic (0,31 ± 0,04 až 0,79 ± 0,09), aktivitou MPO v plicích (odpovídající zabarvení neutrofílů) a infiltraci neutrofilů.

Podání rPH.2 v dávce 5 mg/kg 30 min před infúzí cearuleinu významně zlepšovala růst MPO aktivita v plících, indukovaný infúzí samotného cearuleinu (3,55 ± 0,93 u samotného cearuleinu a 1,51 ± 0,26 u cearuleinu s rPH.2). Ošetření rPH.2 významně snížilo závažnost mikroskopických měn pozorovaných v plicní tkáni po infůzi cearuleinu. Zvýšená vaskulámí permeabilita vyvolaná infúzí cearuleinu. Zvýšená vaskulámí permeabilita vyvolaná infúzí cearuleinu byla podáváním rPH.2 snížena, ale rozdíl nebyl statisticky významný. Vyšší dávka rPH.2 (10 mg/kg) nesnížila více poškození plic vyvolaná cearuleinem, než nižší dávky.

Tabulka 10

	Kontrola (žádný CER)	Caerulein (CER) 10 pg/kg/h	CER + 5 mg/kg rPH.2	CER + 10 mg/kg rPH.2
sérum amyláza (U/l)	961± 174	10 984 ± 1412	6763 ± 1256	8576± 1024
obsah vody v pankreatu (% vlhké váhy)	72,71 ±0,64	90,61 ±0,27	88,21 ±0,61	89,00 ± 0,94
pankreatický MPO (násobky kontroly)	1,0	2,92 ± 0,32	1,19 ± 0,21	1,42 ±0,19
aktivita pankreatického trypsinu (1000xsklon/pg DNA)	0,12 ±0,06	9,70 ± 2,50	8,33 ± 1,75	9,15+1,28
obsah pankreatické amylázy (U/pg DNA)	0,28 + 0,06	0,42 ± 0,07	0,45 ± 0,04	0,46 ± 0,044
vaskulámí permeabilita plic (laváž/sérum %)	0,31+0,04	0,79 ± 0,09	0,70 + 0,09	0,70 + 0,07
MPO plic (násobky kontroly)	1,0	3,55 + 0,93	1,51 ±0,26	1,64 ±0,22

B. Aktivita u modelu pankreatitidy u vačice

Zdravé, náhodně odchycené americké vačice (Didelphid virginiana) obou pohlaví (2,0 kg až

4,0 kg) byly získány ze Scott-Haas a chovány v místnostech s řízenou atmosférou 23 ± 2 °C, 12 hodinovým cyklem světlo/tma a krmeny standardním laboratorním krmivém a vodou ad libitum. Po nočním půstu byla zvířata anestezována 50 mg/kg fenobarbitalu sodného i.p. (Veterinary Laboratories lne., Lenesa, KS). Celiotomie byla prováděna prostřednictvím středové incize za sterilních podmínek a kanál společný pro žluč a pankreas byl podvázán za účelem vyvolání nekrotické pankreatitidy. Navíc byl cystický kanál podvázán tak, aby žlučník nemohl fungovat jako zásobárna žluče. Zvířata byla náhodně rozdělena do kontrolních a experimentálních skupin. Počínaje druhým dnem po podvázání pankreatického kanálu, bylo experimentální skupině podáno rPH.2 v dávce 5 mg/kg tělesné váhy a den (aplikovány 4 mg/ml roztoku) intravenózně do

-48CZ 297603 B6 ocasní žíly, zatímco kontrolní skupině bylo intravenózně podáno placebo ve stejném objemu. Po 1 a 2 dnech ošetření (3. a 4. den po ligaci pankreatického kanálu) byla zvířata usmrcena předávkováním fenobarbitalu sodného. Byly odebrány vzorky krve ze srdce pro stanovení obsahu sérum amylázy, sérum lipázy a sérum bilirubinu a odebrán pankreas. Části pankreatu byly jednak fixovány ve 4% fosfátovém formaldehydovém pufru pro histologická pozorování nebo okamžitě zmraženy na -80 °C pro stanovení myeloperoxidázové aktivity. Další části pankreatu sloužily pro stanovení obsahu vody a obsahu pankreatické amylázy, tak, jak bylo popsáno výše v sekci A tohoto příkladu. Myeloperoxidázová aktivita, měřítko zabarvení neutrofilů, byla stanovena v pankreatu tak, jak je výše popsáno. Pulmonámí vaskulámí permeabilita byla také stanovena výše uvedenou metodou.

Uvedené výsledky představují průměr ± střední chyba průměru (SEM) získaný ze tří a více nezávislých experimentů. Významnost změn byla hodnocena Studentovým t-testem, pokud šlo o data uspořádaná ve dvou skupinách a analýzou variace (ANOVA) pokud byly porovnávány tři skupiny a více. Pokud anova indikovala významný rozdíl, byla data analyzována metodou Turkey jako post hoc test rozdílů mezi skupinami. Rozdíl byl považován za významný, pokud hodnota p<0,05.

Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 11. Ucpání společného biliopankreatického kanálu mělo za následek těžkou nekrotickou pankreatitidu, charakterizovanou hyperamylázií, hyperlipázemie a rozsáhlými nekrózami pankreatu. Navíc mělo ucpání společného biliopankreatického kanálku za následek silné zvýšení hodnot bilirubinu v séru. Intravenózní podání rPH.2 (5 mg/kg/den) počínaje druhým dnem po ligaci pankreatického kanálku, zlepšilo většinu pankreatických změn indikovaných ucpáním kanálku a ve srovnání se zvířaty, kterým bylo podáno placebo. Jednodenní ošetření rPH.2 snížilo hladinu sérum amylázy ve srovnání s kontrolními zvířaty, přestože rozdíl nebyl statisticky významný a dvoudenní aplikace rPH.2 (4. den po ligaci pankreatického kanálku) významně snížil hladiny amylázy ve srovnání s palcebo skupinou. Jednodenní a dvoudenní ošetření rPH.2 snížilo hladinu sérum lipázy na úroveň kontroly, avšak rozdíl nebyl statisticky významný. Dvoudenní aplikace rPH.2 snížila obsah pankreatické amylázy na úroveň kontrol, avšak při jednodenní aplikaci došlo ke zvýšení pankreatické amylázy. Ošetření rPH.2 neovlivnilo hladinu bilirubinu v séru, pankreatickou myeloperoxidázovou aktivitu ani obsah vody v pankreatu.

K hlavním charakteristickým změnám indukovaným obstrukcí biliopankreatického kanálku patřily nekrózy, infiltrace zanícených buněk, vakuolizace acinámích buněk a výrazné roztažení acinámích lumenů. Morfometrické sledování poškozených acinámích buněk pankreatu ukázalo silný ochranný účinek rPH.2 při ošetření den nebo dva předem. Při ošetření rPH.2 den předem bylo poškození acinámích buněk sníženo na 23 % celkové acinámí tkáně, ve srovnání se 48 % poškozené tkáně zvířat, kterým bylo podáno placebo. Tento pokles poraněných buněk byl ještě více patrný po dvoudenní aplikaci rPH.2, kdy došlo ke snížení poškozených buněk na 35 % v porovnání se 60 % u zvířat, kterým bylo podáno placebo.

Vaskulární permeabilita plic, kvantifikovaná injekcí FITC, u skupiny, které byl aplikován rPH.2 se výrazně odlišovala od placebo skupiny při jednodenní a dvoudenní aplikaci. Histologická pozorování ukázala těžká poškození plic u všech skupin ošetřených placebem. Poškození plic bylo charakterizováno rozsáhlou zánětlivou reakcí s intersticiální a intraalvaolární infiltrací především makrofágy, lymfocytů a neutrofilů a nepravidelným ale výrazným intersticiálním edémem a zesílením alveolámích membrán. Podání rPH.2 výrazně snížilo infiltraci zanícených buněk a zmenšilo intersticiální edém při obou délkách aplikace.

Souhrn těchto výsledků jasně ukazuje, že intravenózní podání rPH.2 v dávce 5 mg/kg/den počínaje 48 hodin po ligaci pankreatického kanálku mělo za následek významné snížení zvýšených hladin amylázy a lipázy a poškození acinámích buněk kvantifikované morfometrickou analýzou sekcí obarvených Η & E a k významnému poklesu závažnosti pankreatitidou indukovanému poškození plic. Na tomto, z klinického hlediska vhodném modelu pankreatitidy, prokázal rPAFAH produkt přínosný vliv na snížení závažnosti pankreatitidy.

-49CZ 297603 B6

Tabulka 11

	Po jednodenním ošetření (usmrcení 3. den)	Po dvoudenním ošetření (usmrcení 4. den)
	placebo	rPH.2 5 mg/kg	placebo	rPH.2 5 mg/kg
sérum bilirubin (mg/dl)	5,4910,96	7,1010,60	6,5410,55	4,9110,79
sérum amyláza (U/I)	56181899	42881675	6538+1355	31061467*
sérum lipáza (U/I)	22261554	12411263	14241257	10231295
obsah vody v pankreatu (%)	81,1010,56	81,5210,79	80,0511,07	79,3210,49
pankreatický MPO (OD/frakce sušina)	13451286	1142183	11491232	10331130
pankreatická amyláza (U/pg DNA)	706192	11011105	950185	7121131
vaskulámí permeabilita plic (FITC laváž/sérum %)	0,7610,09	0,2110,04**	0,5710,13	0,2310,04*
poškozené acinámí buňky (% z celkové acinámí tkáně)	48	23	60	35

*p = 0,02 versus placebo **p < 0,001 versus placebo

Příklad 20

Byla provedena studie hodnotící účinek PAF-AH produktu, rPH.2, na neurotoxicitu spojenou io s infekcí HIV. Infekce centrálního nervového systému HIV-1 (human immunodeficiency virus, typ 1) působí neuronální ztráty apoptosou. Jsou-li monocyty infikované HIV-1 aktivovány různými antigenními stimuly včetně kontaktu s nervovými buňkami, vylučují vysoké hladiny neurotoxických cytokinů, včetně PAF, vyvolávajících zánět. Byl studován vliv rPH.2 na neurotoxicitu upraveného média z monocytů infikovaných HIV.

Monocyty byly infikovány HIV a aktivovány jak je dále popsáno. Monocyty byly získány z periferálních buněk kostní dřeně (peripheral bone marrow celíš - PBMC) HIV a hepatitis B seronegativních dárců po leukoforéze a purifikovány (> 98%) centrifugačním vyčištěním (countercurrent centrifugal elutriation) tak jak popsali Genis etal., J. Exp. Med., 176: 1703-1718 20 (1992). Buňky byly kultivovány (Ix 10⁴ buněk/ml v kultivačních lahvích T-75) v DMEM/Sigma,

St. Louis, MO) s lidským rekombinantním faktorem stimulujícím kolonie makrofágů (MSCF rekombinant human macrophage colony stimulatory factor) (Genetic Institute, lne. Cambridge, MA). Za těchto podmínek se monocyty diferencovaly v makrofágy. Po 7 až 10 dnech kultivace byly makrofágy vystaveny HIV-1 _Ada (pod číslem M60472) v přebytku infekčního agens (multi25 plicity of infection - MOI) v přebytku infekčního agens (multiplicity of infection - MOI)0,01 infekčních virionů/cílovou buňku. Za těchto podmínek bylo 20 až 50 % monocytů infikováno 7 dní po inokulaci HIV-1, což bylo potvrzeno imunofluorescenčními metodami a hybridizací in šitu [Kalter et al., J. Imunol., 146: 298-306 (1991)]. Kulturám bylo doplňováno čerstvé živné médium každý 2 až 3 den. Pět až sedm dní po infekci HIV, v době kulminace aktivity reverzní 30 transkriptasy (10⁷ cpm/ml) stanovené podle Kalter et al., viz výše, byly kultury monocytů, a to jak infikovaných HIV-1 tak paralelní kultury neinfikovaných monocytů, stimulovány LPS (10 ng/ml) nebo samotnou přenosovou látkou po dobu 30 min, při 37 °C a poté rychle zmraženy na -80 °C a uchovány až do doby testování neutotoxicity.

Kultury lidských cerebrálních kortikálních neuronových buněk byly odvozeny podle následujícího postupu. Lidská fetální mozková tkáň byla získána z telencefalonu ve druhém trimestru (13

-50CZ 297603 B6 až 16 týdnů těhotenství) modifikovaným postupem podle Bankera a Cowana, Brain Res., 126: 397-425 (1977). Stručný popis metody: mozková tkáň byla odebrána, omyta 30 ml chladného Hankova média BSS (obsahujícím Ca^2í a Mg²⁺ + 25 mM HEPES a 5X gentamicinu), separovány od adherent meminges a krve a nařezány na kousky o velikosti 2 mm³. Tkáň byla protlačena přes 230μΜ sáček Nitex a 10 až 15 krát jemně protažena přes Pasteurovu pipetu opálenou nad plamenem. Dále byla tkáň centrifugována při 550 rpm, 5 min, 4 °C a pelet resuspendován v 5 až 10 ml MEM-hipp (D-glukosa, 5 g/1; L-glutamin, 2mM; HEPES, 10 mM; Na pyruvát, 1 mM; KC1, 20 mM) obsahující NI komponenty (insulin, 5 mg/1; transferin, 5 mg/1; selenit, 5 pg/l, progesteron, 20nM; putrescin, 100 μΜ), stejně jako 10% fetální sérum (FCS), PSN směs antibiotik (penicilín, 50mg/l; streptomycin 50 mg/1; neomycin 100mg/l) a fungizon (2.5 g/1) Počet buněk a jejich životnost byly určeny pomocí naředění Hanksovým BSS obsahujícím 0,4% tryptofanovovou modř (1:1 v/v) a buňky byly počítány pomocí hemocytometru. Buňky byly pětkrát promyty 10 ml pipetou a vysety v ředění odpovídajícím hustotě 105 buněk/12 mm sklíčko krycí sklíčko, která byla předem potažena poly-L-lysinem (70K-150K MW, Sigma, St. louis, MO) a po nanesení buněk umístěna do 24 jamkových kultivačních desek. Do každé kultivační jamky byl potom přidán 1 ml média. Buňky se inkubovaly a kultivovaly po dobu 10 až 28 dnů při 370 C v inkubátoru s vlhkou atmosférou skládající se z 5 % CO2/95 % vzduchu. Média se měnilo každé tři dny. Za těchto podmínek byly kultury > z 60 až 70 % homogenní pro neurony, dále kultura obsahovala 20 až 30 % homogenní pro neurony, dále kultura obsahovala 20 až 30 % hvězdicových buněk, < 1% mikroglií a přibližně 10 % makrofágů a barvitelných mikroglií. Po 14 až 28 dnech kultivace, kultura neuronů exprimovala dostatečné množství N-metys-D-aspartátu (NMDA) nebo non-NMDA receptory byly usmrceny po podání excitotoxických dávek NMDA nebo alfaamino-3-hydroxy-5-metyl 4-isoxazol propionové kyseliny (AMPA).

Test na neurotoxicitu byl prováděn následujícím způsobem. Testované vzorky, mezi něž patřila (a) kondiciovaná média z LPS-stimulovaných HIV-1 infikovaných monocytů, (b) kontrolní metoda, (c) kondiciované médium s přidaným rPH.2 v koncentraci 51 pg/ml nebo (d) kondiciované médium s přidaným nosičem při rPH.2, byly aplikovány na buňkách kultury neuronů v koncentraci 1 : 10 v/v na dobu 24 hodin. Neurotoxicita se měřila pomocí identifikace apoptických jade in šitu na neuronech rostoucích na krycích sklíčkách, které byly fixovány 4% formaldehydem. K tomuto testu byl užíván komerční kit (Apop Tag; ONCOR, Gaithersburg, MD), který používal terminální deoxynukleotidyltransferázu (TdT) v vazbě digoxigenin-dUPT k 3'OH konci nově štěpení DNA (TUNEL barvení). Digitální zpracování obrazů neuronů barvených TUNEL technikou ve více než 15 náhodně vybraných mikroskopických polích se analyzovalo na počet technikou TUNEL barvených jader/celkovému počtu neuronů zjištěných na 50 mikroskopických polích pomocí počítačové morfometrie (MCID, Imaging Research, St. Catherine, Ontario, Kanada).

Data byla vyjádřena v % jader neuronů pozitivních v barvení TUNEL + SEM ajsou ukázána na obrázku 13. Testy statistické průkaznosti mezi kontrolou a experimentálním léčením byly provedeny metodou ANOVA nebo párovými t-testy, s průkaznosti p<0,05. Kvantifikace těchto kultur potvrdila, že kondiciované medium z HlV-infikovaných a aktivovaných monocytů indukovalo smrt buněk neuronů v rozsahu 25 % z celkové populace cerebrálních korových neuronů, rPH.2 byl schopen redukován tuto toxicitu na méně než 5 % z celkového počtu neuronů. rPH.2 sám o sobě nebyl neurotoxický, protože v koncentraci 50 pg/ml rPH.2 neměl ve srovnání s kulturou ošetřenou pomocí kontrolního média žádný vliv na smrt neuronových buněk. Tyto výsledky jasně prokázaly, že hlavní složkou vyvolávající neurotoxicitu při aplikaci kondiciovaného média z buněk HIV-I a infikovaných aktivovaných monocytů, musí být PAF, protože neurotoxicita může být téměř zcela potlačena společnou inkubací s produktem PAF-AH, což je enzym zodpovědný za metabolismus PAF v centrálním nervovém systému. Tato zjištění nastiňují možné terapeutické použití při léčení neurologických onemocnění CNS, která jsou spojena s infekcí HIV-1.

-51 CZ 297603 B6

Příklad 21

Téměř 4 procenta japonské populace má nízkou či až nedekovatelnou hladinu aktivity PAF-AH v plazmě. Tato deficience je v korelaci s těžkým respiračními symptomy u dětí trpících astmatem Miwa a další (J. Clin. Invest. 82:1983-1991 (1988)), poukázali na to, že tyto stavy mohou být způsobeny deficiencí děděnou autosomálním recesivním způsobem.

K určení skutečnosti, zda tato deficience pochází z inaktivního, ale přítomného enzymu, či je způsobena nemožností syntézy PAF-AH, byla shromažďována plazma od mnoha pacientů deficientních na aktivitu PAF-AH (pomocí metody popsané v Příkladu 10 pro transfektanty) a dále byla testována přítomnost PAF-AH pomocí monoklonálních protilátek 90G11D (Příklad 13) pomocí EL1SA metody popsané dále: Mikrotitrační desky Immunolon 4 s plochým dnem (Dynatech, Chantilly, VA) byly potaženy monoklonální protilátkou 90G11D v koncentraci 1 OOng/jamku a ponechány inkubovat do rána. Potom byly jamky blokovány 1 hodinu při pokojové teplotě 0,5% želatinou z rybí kůže (Sigma) naředěné v CMF-PBS. Dále byly jamky čtyřikrát promyty. Plazma získaná od pacientů byla naředěna v PBS obsahujícím 15 mM CHAPS a byla přidána do každé jamky na destičce (50 μΙ/jamka). Destičky se inkubovaly 1 hodinu při pokojové teplotě a potom byly čtyřikrát promyty. Následovalo přidání 50μ1 monoklonální protilátky 90F2D v koncentraci 5pg/ml, která byla biotinylovaná standardní metodou a naředěna v PBST do každé jamky. Deska se inkubovala 1 hodinu při pokojové teplotě a poté byla třikrát promyta. Následovalo přidání 50 μΐ Extraktu Avidinu (Sigma) naředěného 1 : 1000 v CMT-PBST do každé jamky a deska se opět nechala inkubovat 1 hodinu při pokojové teplotě. Potom následovalo vyvolání aktivity.

Byly nalezeny přímé korelace mezi PAF-AH aktivitou a koncentrací enzymu. Nebyla-li v séru pacienta naměřena aktivita, bylo to vždy doprovázeno nemožností detekovat přítomnost enzymu. Podobně, vzorky plazmy vykazující poloviční hodnotu normální aktivity, obsahovaly polovinu normální hladiny PAF-AH. Tato zjištění potvrzují, že deficience aktivity PAF-AH je způsobena nemožností syntetizovat enzym nebo je způsobena tím, že monoklonální protilátky nerozpoznávají inaktivní formu enzymu.

Byly navrženy další pokusy, které měly umožnit rozhodnutí, zda deficience je způsobena genetickou poruchou v genu pro lidský plazmatický PAF-AH. Bylo izolována genomová DNA z PAFAH deficientních jedinců a použita jako templát pro PCR reakce s primery specifickými pro PAF-AH gen. Každá z kódujících sekvencí exonů byla nejprve amplifíkována a sekvenována z jednoho jedince. V exonu 9 byla nalezena záměna jednoho nukleotidu (a to G a za T v pozici 996 podle Sekvenc id. č. 7). Nukleotidová záměna vyústila v aminokyselinovou substituci fenylalaninu za valin v pozici 279 sekvence PAF-AH (V279F). Exon 9 byl amplifikován z genomové DNA ještě dalších 11 PAF-AH deficientních pacientů, u kterých byla nalezena stejná bodová mutace.

K určení, zda tato mutace pozmění enzym, byl v E. coli exprimován konstrukt s touto mutací nevykazující žádnou PAF-AH aktivitu, zatímco kontrolní konstrukt, který neobsahoval mutaci, byl plně aktivní. Záměna této aminokyseliny vede pravděpodobně ke strukturální modifikaci, která způsobuje pozorovanou deficienci aktivity a také neschopnost imunoreaktivity s PAF-AH protilátkami generovanými dle vynálezu.

PAF-AH specifické protilátky podle vynálezu tak mohou být použity v diagnostických metodách k detekci abnormálních hladin PAF-AH v séru (normální koncentrace jsou mezi 1 až 5 U/ml) a ke sledování patologických podmínek spojených s PAF-AH. Co více, určení genetického poškození v PAF-AH genu umožňuje genetický výzkum zabývající se deficienci PAF-AH u japonských pacientů. Mutace způsobuje zisk restrikčního endonukleázového místa (Maell) a tak umožňuje aplikace jednoduché metody, analýzy - Restrition Fragment Length Polymorphism (RFLP), která je schopná rozlišit mezi normálními a mutantními alelami. (informaci o této aplikace lze

-52CZ 297603 B6 získat: Lewin, strana 136 až 141 v Genes V, Oxford University Press, New York, New York (1994)).

Pomocí metody štěpení DNA enzymem Mae II, byl proveden výzkum genomové DNA od 12 pacientů deficientních v PAF-AH, následoval Southem blot a hybridizace se sondou komplementární s exonem 9 (nukleotidy 1 až 396, podle Sekvence id.č. 17). U všech pacientů bylo nalezeno, že mají RFLP shodné s mutantními alelami. Ačkoli je vynález popsán pomocí termínů specifických pro dané provedení, samozřejmě se však rozumí, že se mohou vyskytnout různé varianty a modifikace, které jsou jasné odborníkům v daném oboru. Proto tedy, na vynálezu mohou být kladeny jen taková omezení, která se objevují v připojených patentových nárocích.

Claims (19)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaný a izolovaný polypeptidový fragment lidské plazmové acetylhydrolázy destičky-aktivujícího faktoru (PAF-AH), který postrádá až prvních dvanáct N-koncových aminokyselin zralé aminokyselinové sekvence lidské PAF-AH od polohy 42 do polohy 441 SEQ ID NO: 8.
2. 2. Polypeptidový fragment PAF-AH podle nároku 1 vybraný ze skupiny skládající se z

   a) polypeptidu, který má Met₄₆ SEQ ID NO: 8 jako počáteční N-koncovou aminokyselinu,

   b) polypeptidu, který má Ala₄₇ SEQ ID NO: 8 jako počáteční N-koncovou aminokyselinu,

   c) polypeptidu, který má Ala₄₈ SEQ ID NO: 8 jako počáteční N-koncovou aminokyselinu.
3. 3. Polypeptidový fragment PAF-AH podle nároku 1 nebo 2, který postrádá až 30 C-koncových aminokyselin aminokyselinové sekvence SEQ ID NO: 8.
4. 4. Polypeptidový fragment PAF-AH podle nároku 1 nebo 2, který má jako svůj C-koncový zbytek, zbytek SEQ ID NO: 8 vybraný ze skupiny skládající se z:

   a) Ile₄₂₉

   b) Leu₄₇i a

   c) Asn₄₄|.
5. 5. Polypeptidový fragment PAF-AH podle nároku 1, kterým je humánní polypeptidový fragment PAF-AH, který má Met^ SEQ ID NO: 8, jako N-koncový zbytek a Ile₄₂9 nebo Asn₄₄j, jako C-koncový zbytek.
6. 6. Variantní polypeptidový fragment PAF-AH podle nároku 1, který vykazuje v sekvenci SEQ ID NO: 8 náhradou aminokyseliny, vybranou ze skupiny skládající se z

   a) S 108 A

   b) S 273 A

   c) D 286 A

   d) D286N

   e) D 296 A

   f) D 304 A

   g) D 338 A

   h) H 351 A

   i) H 395 A

   j) H 399 A

   k) C 67 S

   l) C 229 S

   m) C291 S

   n) C 334 S a

   o) C 407 S.

   -53 CZ 297603 B6
7. 7. Variantní lidský polypeptid PAF-AH, který vykazuje v sekvenci SEQ ID NO: 8 náhradu aminokyseliny, vybranou ze skupiny skládající se z

   a) D 286 A

   b) D 286 N a

   5 c) D 304 A.
8. 8. Izolovaný polynukleoptid kódující polypeptidový fragment PAF-AH, jeho variantu nebo variantní fragment podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, 6 nebo 7.
9. 9. Izolovaný polynukleotid kódující lidský fragment PAF-AH nebo variantní fragment vykazující Met_4Ř v SEQ ID NO: 8, jako N-koncový zbytek, a Ile429 nebo Asn_44l, jako C-koncový

   K) zbytek.
10. 10. Polynukleotid podle nároku 8 nebo 9, kterým je DNA.
11. 11. DNA vektor obsahující DNA podle nároku 10.
12. 12. Hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo trasfekovaná DNA podle nároku 10 způsobem, který umožní v této hostitelské buňce expresi PAF-AH polypeptidového fragmentu, jeho

    15 varianty nebo variantního fragmentu.
13. 13. Způsob produkce polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho varianty nebo variantního fragmentu plazmového PAF-AH, podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že se pěstuje hostitelská buňka podle nároku 12 ve vhodném živném médiu a izoluje se PAF-AH fragment, jeho varianta nebo variantní fragment z buněk nebo jejich růstového média.

    20
14. 14. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho varianta nebo variantní fragment podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7, produkovaný způsobem podle nároku 13.
15. 15. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tí m , že obsahuje fragment PAF-AH, jeho variantu nebo variantní fragment podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo 14 a farmaceuticky přijatelné ředidlo, adjuvans nebo nosič.

    25
16. 16. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho varianta nebo variantní fragment podle některého z nároků 1 až 7 nebo 14 nebo farmaceutická kompozice podle nároku 15 pro použití k léčení savce susceptibilního k PAF-mediovanému patologickému stavu nebo postiženého tímto stavem, přičemž množství PAF-AH produktu nebo farmaceutické kompozice postačuje pro doplnění PAF-AH aktivity a inaktívaci patologických účinků PAF u savce.

    30
17. 17. Polypeptidový fragment PAF-AH, jeho varianta nebo variantní fragment nebo farmaceutická kompozice podle nároku 16, kde patologickým stavem je pleurisie, asthma, rhinitis, nekrotizační enterocolitis, syndrom akutního respiračního distresu, akutní pankreatitis, reperfusní poškození, septicemie, předčasný porod nebo neurologická choroba spojená s infekcí HIV.
18. 18. Použití polypeptidového fragmentu PAF-AH, jeho varianty nebo variantního fragmentu

    35 podle některého z nároků 1 až 7 nebo 14 nebo farmaceutické kompozice podle nároku 15 pro výrobu léčiva pro léčení savce susceptibilního k PAF-mediovanému patologickému stavu nebo postiženého tímto stavem, přičemž množství léčiva postačuje pro doplnění PAF-AH aktivity a inaktivaci patologických účinků PAF u savce.
19. 19. Použití podle nároku 18, kde léčivo je určeno pro léčení savce susceptibilního kpleurisii,

    40 asthma, rhinitis, nekrotizační enterocolitis, syndromu akutního respiračního distresu, akutní pankreatitis, reperfusnímu poškození, septicemii, předčasnému porodu nebo neurologické chorobě spojené s infekcí HIV nebo postiženého některým z těchto stavů.