CZ297634B6

CZ297634B6 - Fúzní polypeptidy obsahující IgE a HSA, zpusob jejich prípravy, farmaceutický prípravek, který je obsahuje, a jejich použití

Info

Publication number: CZ297634B6
Application number: CZ0024699A
Authority: CZ
Inventors: Ellen Digan@Mary; Lake@Philip; Gram@Hermann
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1996-07-26
Filing date: 1997-07-25
Publication date: 2007-02-21
Also published as: EP0917581B1; JP2000516089A; CA2261562C; ES2300114T3; JP3681402B2; KR20000029563A; WO1998004718A1; PE99498A1; NO323611B1; CZ24699A3; KR100502879B1; PL189415B1; ZA976666B; CN1229439A; BR9710605A; IL128094A; CA2261562A1; TW565571B; NZ333908A; TR199900155T2

Abstract

Rešení poskytuje fúzní polypeptidy a jejich soli,které obsahují alespon jednu IgE-vazebnou doménu fúzovanou s alespon jednou složkou lidského sérového albuminu, volitelne prostrednictvím peptidovéhospojovacího clánku (linkeru), zvlášte pak dimernífúzní polypeptidy obsahující protein HSA spojený na karboxylovém i aminovém konci s extracelulární doménou .alfa.-retezce lidského receptoru pro IgE.sup.R.n. (Fc.epsilon.RI.alfa.) s vysokou afinitou.Dále se poskytuje zpusob prípravy takových polypeptidu nebo funkcne ekvivalentních polypeptidu, které jsou meziprodukty pri této príprave, a také polynukleotidy a oligonukleotidové meziprodukty a príslušné vektory. Fúzní polypeptidy jsou urceny pro použití v prevenci a lécení alergologických nemocízprostredkovaných IgE a príbuzných poruch, jako je napr. atopická dermatitida, atopické astma a chronická koprivka.

Description

Fúzní polypeptidy obsahující IgE a HSA, způsob jejich přípravy, farmaceutický přípravek, který je obsahuje, a jejich použití

Oblast techniky

Vynález se týká fúzních polypeptidů. Týká se fúzních polypeptidů obsahujících IgE-vazebnou doménu a lidský sérový albumin („human sérum albumin“ - HSA) nebo jejich solí. Týká se také polynukleotidů a fyziologicky funkčně rovnocenných polypeptidů, které jsou meziprodukty io v případě takových fúzních polypeptidů, jejich příslušných rekombinantních expresních vektorů, odpovídajících prokaryotických a eukaryotických expresních systémů a způsobů syntézy fúzních polypeptidů.

Dosavadní stav techniky

Interakce mezi imunoglobulinem E (IgE) a jeho receptory hraje roli v obraně proti parazitárním infekcím u člověka (M. Capron a A. Capron, Science, 264, 1876- 1877, 1994). Ale v průmyslových zemích, se zlepšenými hygienickými podmínkami, je setkání s parazity méně časté 20 než porucha systému IgE nadměrnou tvorbou IgE jako odpověď na alergeny životního prostředí, což má za následek alergie a jiné chorobné stavy zprostředkované IgE nebo IgE-receptorem.

IgE je primární protilátka zapojená do spuštění okamžité alergické odpovědi a je hlavní účastník udržování odpovědi pozdní fáze. IgE se syntetizuje v lymfocytech B a projevuje svůj účinek po 25 vazbě na vysoce afinitní receptor pro IgE, např. FceRI, který se nalézá na povrchu alergických efektorových buněk, jako jsou žímé buňky (mastocyty), basofily a eosinofily. IgE také uplatňuje induktorovou funkci vazbou ke svému receptoru nebo buňkám prezentujícím antigen, jako jsou Langerhansovy buňky, lymfocyty B a monocyty (G. C. Mudde et al., Allergy, 50, 193-199, 1995).

Alergická odpověď nebo stav se manifestuje, když se molekuly IgE vážou na povrch alergických efektorových buněk prostřednictvím receptoru IgE, FceRI, zesíťují se alergenem, a tím dávají signál ke spuštění degranulace cytoplazmatických granulí v buňkách, s doprovodným uvolněním mediátorů alergie, jako je histamin, serotonin, prostaglandiny a cytokiny, a následný místní edém 35 tkáně a vcestování zánětlivých buněk. Jako alternativní prostředek stimulace alergie a přidružených stavů je interakce receptoru IgE, FceRI, s cirkulujícími protilátkami proti FceRI.

FceRI typicky existuje jako tetramer obsahující řetězce α, β a dva řetězce γ (tj. podjednotky), ačkoliv na monocytech a Langerhansových buňkách je podjednotka β nepřítomná.

Ukázalo se, že IgE-vazebné místo FceRI je celé obsaženo v podjednotce a (nazýváno FceRIa) (J. Hakimi et al., J. Biol. Chem., 265, 22079-22081, 1990, U. Blank et al., J. Biol. Chem., 266, 2639-3646, 1991). Bylo zjištěno, že rekombinantní „knockout“ myši, u kterých byla geneticky odstraněna celá podjednotka a, jsou neschopné vytvořit alergickou odpověď na alergenový 45 podnět (D. Dombrowicz et al., Cell, 75, 969-976, 1993).

FceRI je značně glykosylovaný polypeptid o molekulové hmotnosti asi 60 kD, obsahující hydrofobní transmembránovou doménu, a také hydrofilní extracelulámí („ekto-“) a cytoplazmatické domény, které jsou exponovány na vnějším povrchu buňky. Vazebná schopnost IgE pro 50 FceRIa byla dále lokalizována do jeho extracelulámí části, (J. Hakimi et al„ 1990, supra, Leder et al., USP 4 962 035). Je možné tvořit rozpustnou, secemovatelnou molekulu excizí transmembránové části a sekvencí od ní po směru transkripce (C. Ra et al., Int. Immunol., 5, 47-54, 1993), a výsledný zkrácený fragment skládající se v podstatě z extracelulámí domény lidského FceRIa, má IgE-vazebnou aktivitu in vitro a in vivo (M. Haak-Frendscho et al., Immunol., 151,

- I CZ 297634 B6

351-358, 1993), aminokyselinové zbytky 1 až 204 z FcsRIa fúzovaného se zkrácenou C oblastí řetězce H IgG 1, (C. Ra et al., 1993, supra·, zbytky 1 až 172 z FceRIa v tomto textu odpovídají zbytkům 26 až 197 ze sekvence s identifikačním číslem 1 zde). Strukturální rysy tohoto fragmentu zahrnují dva potenciální disulfidové můstky a sedm potenciálních glykosylačních míst (M. Haak-Frendscho et al., 1993, supra).

Proto fragmenty FccRIa skládající se v podstatě z extracelulární domény mohou být teoreticky léčebně podávány savci, aby vázaly sérový IgE a aby zabránily vazbě na jeho vysoce afinitní receptor na alergických efektorových buňkách, a také pro supresi biosyntézy IgE de novo v lidských Iymfocytech (Y. Yanagihara et al., J. Clin. Invest., 94,2162-2165, 1994).

Avšak účinnému použití polypeptidu vázajícího IgE, jako je extracelulární doména FccRIa, pro systematickou léčbu IgE nebo IgE-receptorem zprostředkovaných alergických poruch u savců, brání jeho mimořádná nestálost in vivo způsobená rychlou clearencí z cirkulující plazmy. Vezmeli se do úvahy, že nemoci zprostředkované IgE nebo IgE-receptorem zodpovídají za 10 až 20 % kontaktu lékaře s pacientem, účinné léčení by tvořilo významný prospěch pro pacienty, kteří takovými stavy trpí, a důležitý pokrok v klinické léčbě poruch zprostředkovaných IgE nebo IgEreceptorem, jako je alergie a stavy spojené s alergií.

Bylo by proto prospěšné získat polypeptid vázající IgE, který má prodloužený účinný sérový poločas, a tedy vylepšený klinický užitek v léčbě alergie, a zejména v systémovém léčení atopické dermatitidy, atopického astmatu a chronické kopřivky, a také účinně a bez velkých nákladů vylepšenou aktivitu.

Podstata vynálezu

Doposud bylo objeveno, že fúzí IgE-vazebné domény s lidským sérovým albuminem (HSA) se mohou získat fúzní polypeptidy, které mají prodloužený sérový poločas ve vztahu k samotné IgE-vazebné doméně, beze ztráty IgE-vazebné aktivity, což vede k vytvoření IgE-vazebných polypeptidů indikovaných pro použití při systémové léčbě alergie a dalších poruch zprostředkovaných IgE. Systémově podávaný polypeptid vázající IgE se váže na sérově IgE, a také na cirkulující autoprotilátky proti receptorů IgE, FccRla, a zabraňuje jejich vazbě na buněčně navázaný FcsRIa, a také zabraňuje a/nebo inhibuje alergickou reakci a s ní spojené projevy.

Dále bylo zjištěno, že významná zlepšení v IgE-vazebné aktivitě mohou být dosažena použitím fúzních polypeptidů podle vynálezu obsahujících více než jednu IgE-vazebnou doménu na molekulu. Například se zjistilo, že dimer molekuly podle vynálezu má významně zvýšenou IgEvazebnou aktivitu ve srovnání s monomerem vynálezu.

Termín „dimer“ se zde týká fúzního polypeptidu podle vynálezu, která má dvě IgE-vazebné domény. Termín „monomer“ se týká fúzního polypeptidu vynálezu, který má jednou IgEvazebnou doménu. Monomer nebo dimer může být vytvořen z jedné nebo několika složek HSA. Například monomemí fúzní polypeptid podle vynálezu může obsahovat IgG-vazebnou doménu fúzovanou na jeho buď aminovém, nebo karboxylovém konci se složkou HSA. Alternativně může monomer obsahovat IgE-vazebnou doménu fúzovanou na jeho obou koncích se složkami HSA. Dimemí fúzní polypeptid podle vynálezu může obsahovat například dvě IgE-vazebné domény fúzované prostřednictvím karboxylového konce jedné a aminového konce druhé se složkou HSA nacházející se uprostřed. Jako alternativa může dimer obsahovat, kromě svých dvou IgE-vazebných domén, několikanásobné složky HSA.

Dále bylo objeveno, že molekula dimeru podle vynálezu má nečekaně uspokojivovou aktivitu.

-2CZ 297634 B6

Vynález se proto týká fúzních polypeptidů a jejich solí, které obsahují alespoň jednu IgEvazebnou doménu fúzovanou s alespoň jednou složkou HSA, výhodně s monomemími fúzními polypeptidy, kde jedna IgE-vazebná doména je fúzována s jednou nebo více složkami HSA, nebo s multimemími fúzními polypeptidy, kde jsou dvě nebo více IgE-vazebných domén fúzovány s alespoň jednou složkou HSA, výhodněji, s dimery, které mají dvě IgE-vazebné domény a alespoň jednu složkou HSA.

Vynález se dále týká jejich polynukleotidových meziproduktů.

Termíny „fúzní“ nebo „fúze“ se zde týkají polypeptidů, ve kterých

i) daná funkční doména (tj. IgE-vazebná doména) je vázána na svém karboxylovém konci kovalentní (výhodně peptidovou, tj. amidovou) vazbou buď k aminovému konci jiné funkční domény (tj. složky HSA), nebo ke spojovacímu peptidu, který sám je vázán kovalentní (výhodně peptidovou) vazbou k aminovému konci další funkční domény, a/nebo ii) daná funkční doména (tj. IgE-vazebná doména) je vázána na svém aminovém konci kovalentní (výhodně peptidovou, tj. amidovou) vazbou buď ke karboxylovému konci jiné funkční domény (tj. složky HSA), nebo ke spojovacímu peptidu, který sám je vázán kovalentní (výhodně peptidovou) vazbou ke karboxylovému konci další funkční domény.

Podobně také termín „fúzovaný“ znamená, je-li ho použito ve spojení s polynukleotidovými meziprodukty, že 3'-konec (nebo 5'-konec) nukleotidové sekvence kódující první funkční doménu je navázán k odpovídajícímu 5'-konci (nebo 3'-konci) nukleotidové sekvence kódující druhou funkční doménu, buď kovalentní vazbou, nebo nepřímo prostřednictvím nukleotidové spojky, která je sama kovalentně vázána nejlépe na svých koncích k polynukleotidu kódujícímu první funkční doménu a k polynukleotidu kódujícímu druhou funkční doménu.

Výhodně je fúzní polypeptid nebo jeho sůl monomer nebo dimer, když je to dimer, obsahuje dvě IgE-vazebné domény fúzované ke složce HSA, jako je první IgE-vazebná doména fúzovaná na svém karboxylovém konci k aminovému konci složky HSA, a druhá IgE-vazebná doména fúzovaná na svém aminovém konci ke karboxylovému konci složky HSA.

Fúzní polypeptidy vynálezu mohou také zahrnovat další funkční domény kromě IgE-vazebných domén a složek HSA, např. nezkrácenou nebo zkrácenou formu (např. rozpustné, extracelulámí fragmenty) lidských proteinů, jako jsou cytokiny nebo amino-koncové fragmenty urokinázy. Tyto přídatné funkční domény mohou samy sloužit jako spojovací peptidy například pro připojení IgE-vazebné domény kjiné IgE-vazebné doméně nebo ke složce HSA, alternativně mohou být lokalizovány někde jinde ve fúzní molekule, např. na jejím aminovém nebo karboxylovém konci.

Příklady fúzních polypeptidů podle předkládaného vynálezu mohou být reprezentovány následujícími obecnými vzorci:

I. R|-L-R₂

II. R₂-L-R,

III. R,-L-R₂-L-R₁

IV. Ri-L-R!-L-R₂

V. R₂-L-Ri-L-R, kde

Ri je aminokyselinová sekvence IgE-vazebné domény,

R₂ je aminokyselinová sekvence složky HSA,

- J “ každé L je nezávisle kovalentní (výhodně peptidová) vazba, neboje peptidový linker (spojka), který je vázán kovalentní (výhodně peptidovou) vazbou ke konci R1 a/nebo R2, přičemž výše uvedené molekulové fragmenty je třeba číst směrově, tj. s levou stranou odpovídající aminovému konci a pravou stranou karboxylovému konci molekuly.

Bylo zjištěno, že vazba IgE je silná, když je fúzní polypeptid veden IgE-vazebnou doménou, což je, když IgE-vazebná doména tvoří N-koncovou část zralého fůzního proteinu (jako ve sloučeninách vzorců I, 111 a IV, viz výše). Obzvláště výhodně provedení vynálezu zahrnuje dimer vzorce 111 uvedeného výše, tj. kde proteinová oblast, která vede expresi je IgE-vazebná doména, io fúzovaná na svém karboxylovém konci k aminovému konci složky HSA, která zase sama je fúzovaná na svém karboxylovém konci k aminovému konci druhé IgE-vazebné domény. Když je více než jedna skupina R_h nebo více než jedna skupina R₂, nebo více než jedna skupina L, mohou tyto skupiny být, ale ne nezbytně, totožné.

Výhodně fúzní polypeptidy vynálezu obsahují alespoň jedno rozpustnou secemovatelnou savčí IgE-vazebnou doménu fúzovanou k alespoň jedné složce HSA, a její farmaceuticky přijatelné soli.

Vynález se dále týká způsobu prevence a/nebo léčby IgE nebo receptorem IgE zprostředkovalo ných poruch, a obzvláště alergických reakcí, jako je atopická dermatitida, atopické astma a chronická kopřivka, přičemž tento způsob zahrnuje podávání fúzních polypeptidů podle vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí pacientovi, který takovou léčbu potřebuje. Dále se vynález týká farmaceutických přípravků obsahujících fúzní polypeptidy podle vynálezu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, spolu s alespoň jedním farmaceuticky přijatelným nosičem 25 nebo ředidlem.

Vynález se dále týká fyziologicky funkčních ekvivalentů fúzních polypeptidů podle vynálezu, které jsou meziprodukty syntézy polypeptidů, a také polynukleotidů, které jsou meziprodukty v přípravě fúzních polypeptidů nebo jejich fyziologicky funkčních ekvivalentů, jak je definováno 30 výše, a také oligonukleotidových meziproduktů, které jsou použity pro jejich tvorbu, peptidů kódovaných takovými oligonukleotidy, rekombinantních vektorů pro expresi fúzních molekul, prokaryotických nebo eukaryotických (zejména savčích) expresních systémů, a dále způsobů přípravy fúzních polypeptidů nebo jejich fyziologicky funkčních ekvivalentů použitím takových expresních systémů.

Popis sekvencí s identifikačními čísly a příbuzné definice

Sekvence identifikačního čísla 1: Aminokyselinová sekvence dominantní formy nezkráceného nativního lidského FcsRIa, včetně signální sekvence.

Termín „pre-IgE^R“ se vztahuje k aminokyselinovým zbytkům Meti až Leu204 ze sekvence identifikačního čísla 1. Termín „IgE^R“ se vztahuje ke zralé formě pre-IgE^R a tvoří zbytky Val26 až Leu₂₀4 ze sekvence identifikačního čísla 1 (tj. extracelulámí doménu FceRIa).

Sekvence identifikačního čísla 2: Aminokyselinová sekvence dominantní formy nativního prepro-HSA (nazývaná zde jako „prepro HSA I“), zahrnující zbytky Met; až Leu₆₀9.

Dominantní forma zralého nativního proteinu (nazývaná zde jako „HSA 1“) je představována zbytky Asp₂5 až Leu₆₀9 ze sekvence identifikačního čísla 2.

Termín „prepro HSA II“ představuje fragment nativní sekvence zkrácené o jednu aminokyselinu (Leu₆₀₉) na karboxylovém konci, a proto se týká zbytků Met| až Gly6os ze sekvence identifikačního čísla 2.

-4CZ 297634 B6

Zralá forma prepro HSA II, nazývaná zde jako „HSA II“ je představována zbytky Asp₂₅ až Leu₆o9 ze sekvence identifikačního čísla 2.

Sekvence identifikačního čísla 3: Aminokyselinová sekvence kódovaná fragmentem EcoRI plaz5 midu R-H-R/SK&50, připraveného z příkladu 5, obsahující sekvenci pre-IgE^R ve zbytcích 1 až

204, spojku AlaSer(Gly)₄Ser (dále nazývanou „Li“) ve zbytcích 205 až 211, sekvenci HSA II ve zbytcích 212 až 795, spojku (Gly)₃Ser (dále nazývanou „L₂“) ve zbytcích 796 až 799, a sekvenci „IgE^R“ ve zbytcích 800 až 978.

io Zralý dimemí fúzní polypeptid podle vynálezu, nazývaný zde jako „IgE^R - L| - HSA II — L2 — IgE^R“ nebo alternativně jako „IgE^R - HSA - IgE^R dimer“, exprimovaný buňkami CHO způsobem popsaným v příkladu 7, má aminokyselinovou sekvenci Val26 až Leu₉7₈ ze sekvence identifikačního čísla 3.

Sekvence identifikačního čísla 4: Nukleotidová sekvence fragmentu EcoRI plazmidu R-HR/SK#50 z příkladu 5, obsahující: polynukleotidovou sekvenci kódující „pre-IgE^R“ v pozicích 10 až 621, oligonukleotid kódující L! v pozicích 622 až 642, polynukleotid kódující HSAII v pozicích 643 až 2394, oligonukleotid kódující L₂ v pozicích 2395 až 2406, a polynukleotid kódující „IgE^R v pozicích 2407 až 2943, se 2 stopovacími kodony v pozicích 2944 až 2949.

Restrikční místa na koncích kódujících fragmentů a ve spojovací oblasti jsou v pozicích 1 až 6, 622 až 627, 637 až 642, 2387 až 2393, 2401 až 2406, a 2950 až 2955. Kozáková sekvence je v nukleotidové pozici 7 až 9.

Bodová mutace, které se liší od souhlasné nukleotidové sekvence HSA, jsou v pozicích 804, 1239, 1290, 1446, 1815 2064 a 2079. Protože bodové mutace jsou v kolísavé pozici, neovlivňují aminokyselinovou sekvenci.

Sekvence identifikačního čísla 5: Nukleotidová sekvence dominantní formy nativního prepro30 HSA odpovídající obr. 12 a aminokyselinové sekvenci identifikačního čísla 2.

Sekvence identifikačního čísla 6: Nukleotidová sekvence dominantní formy nezkráceného nativního lidského FceRIa včetně signální sekvence, odpovídající obr. 13 a aminokyselinové sekvenci identifikačního čísla 1.

Přehled obrázků na výkresech

V následujících obrázcích je třeba uvedené molekuly číst směrově, tj. levá strana odpovídá 40 aminovému (nebo 5'-) konci a pravá strana odpovídá karboxylovému (nebo 3'-) konci.

Obrázky 1A-C: Sérový poločas u myší: proteinová koncentrace in vivo (v pikomolech proteinu na ml séra) v průběhu času (10-800 minut po injekci):

A) volný protein HSA I, a

B) protein lgE^R (nazývaný jako „volný řetězec alfa“) a dimemí fůzní polypeptid IgE^R - Li - HSA II - L₂ - IgE^R (nazývaný jako „IgE^R - HSA - IgE^R“ dimer) připravený z buněk CHO, jak je popsáno v příkladu 7.

C) sérový poločas volného HSA I z A) porovnaný s poločasem dimemího fúzního polypeptidu („IgE^R - HSA - IgE^R) z B) normalizaci k 1 s ohledem na sérové koncentrace v 10 minutách po 50 injekci.

Obrázek 2: Extravazát vyplývající z pasivní kožní anafy taktické reakce u myší, kterým se podávala sériová ředění (10 pg/kg, 50 pg/kg nebo 500 pg/kg) polypeptidu IgE^R - L| - HSA II — L? —

- 5 CZ 297634 B6

IgE^R („IgE^R - HSA - IgE^R dimer“) připraveného jak popsáno v příkladu 7 (kontrolní skupina dostávala 0 pg/kg), oblast v mm², v intervalech 5, 15 nebo 30 minut před senzibilizací (alergizací) intradermální injekcí monoklonální myší IgE anti-dinitrofenylové (DNP) protilátky a následnou provokací s roztokem DNP-bovinního sérového albuminu obsahujícího 1% Evansovu modř.

Obrázek 3: Schematické znázornění tří fúzních polypeptidů podle vynálezu (dva monomery a jeden dimer), jsou také ukázány polypeptidové spojky:

I. Monomery:

1) základní monomer HSA-vedoucí obsahující HSA II (v obrázku nazývaný „HSA“) fúzovaný prostřednictvím L₂ („GGGS“) k IgE^R. Nukleotidy kódující pozice Leu₆o₇Hly₆o8 z HSA II obsahují jediné místo Mstil, jak je vyznačeno, a nukleotidy kódující GlySer z L₂ obsahují místo BamHl (kódované aminokyseliny podtrženy),

2) základní monomer IgE-vazebné domény obsahující IgE^R fúzovaný na svém karboxylovém konci prostřednictvím Li (tj. „ASGGGGS“) k HSA II (v obrázku nazývaný „HSA“). Oligonukleotid kódující L| obsahuje místo Nhel a místo BamHl (kódované aminokyseliny AlaSer a GlySer z L| jsou podtrženy).

II. Dimer:

Základní dimer IgE-vazebné domény obsahující první IgE^R fúzovaný na svém karboxylovém konci prostřednictvím L, k aminovému konci HSA II (v obrázku nazývaný „HSA“), jehož karboxylový konec je fúzován ke druhému IgE® prostřednictvím L₂ s restrikčními místy v kódujícím polynukleotidu, jakje popsáno výše pro monomer.

Obrázek 4: Primery PCR pro zkrácení úplné cDNA (nazývané zde „cDNA receptoru IgE“) lidského FceRIa, aby se získala DNA kódující:

i) IgE^R (místo BamHl přidané na 5' konec kódujícího vlákna pro FceRIa oligonukleotidem č. 18, a stopovací kodon a místa EcoRI a Sall přidaná na 3' konec nekódujícího vlákna oligonukleotidem č. 19), ii) pre-IgE^R (oligonukleotid č. 20 přidávající místa Sstl, EcoRI a Kozákovo na 5' konec kódujícího vlákna pro FceRIa, oligonukleotid č. 31 přidávající místa Notl a Nhel (a odstraňující druhé místo Nhel) v nekódujícím vláknu pro FceRIa), iii) pre-IgE^R (oligonukleotid č. 20 a č. 19 použité, jak popsáno výše)

A) „HSA-vedoucí“: subklonování i) výše do vektoru SK, poskytující klonovací vektor TA klonu pEKl použitý pro konstrukci základního monomeru HSA II,

B) „IgER-vedoucí“: subklonování ii) do vektoru SK, poskytující konstrukt IgER/ΤΑ č. 1 použitý pro přípravu základního monomeru IgE^R,

C) „samotný IgER“: subklonování iii) do vektoru SK, poskytující konstrukt IgER FL/TA č. 34 použitý pro expresi zralého IgE^R pro použití jako standard.

Dvojitá hvězdička představuje dva stopovací kodony.

Obrázek 5: Páry příměrů PCR pro zkrácení úplné cDNA lidského prepro-HSA pro získání cDNA kódující:

i) prepro-HSA II fúzovaný na karboxy konci k L₇ (oligonukleotid č. 24 přidávající místa Spěl, EcoRI a Kozákovu sekvenci na 5'-konec kódujícího vlákna, oligonukleotidy č. 28 a 29 přidávající spojku kódující místa Mstil a HindlII na 3'-konci HSA II)

-6CZ 297634 B6 ii) L| fúzovaný k 5' konci HSA II (oligonukleotid č. 26 přidávající místa Notl, Nhel, spojku a BamHl na kódující vlákno, oligonukleotid č. 27 obsahující místo Ncol v nekódujícím vláknu), iii) prepro-HSA I (oligonukleotid č. 24 použitý jako výše, a oligonukleotid č. 25 přidávající 5 stopovací místo a místa EcoRI a HindlIII na 3'-konec nekódujícího vlákna),

A) „HSA-vedoucí“: subklonování i) do vektoru SK, poskytující pEK7 použitý pro konstrukci základního monomeru HSA II,

B) „IgER-vedoucí“: subklonování ii) do vektoru SK, poskytující HSA/SK#5 použitý pro konstrukci základního monomeru IgE^R, ίο C) „samotný HSA“: subklonování iii) do vektoru SK, poskytující HSA/SK#17 kódující zralý nativní protein lidského sérového albuminu (tj. HSA I) pro použití jako standard.

Obrázek 6: Oligonukleotidy pro sekvencování lidského sérového albuminu (HSA) č. 1-10, 12, 16, 17, 22 a 30, použité pro sekvencování materiálu klonovaného do TA a po vazbě na IgE15 vazebné fragmenty.

Obrázek 7: Oligonukleotidy pro sekvencování receptoru IgE č. 11, 13 a 23, použité pro sekvencování fragmentů klonovaných do TA a po vazbě na složku HSA.

Obrázek 8:

A) mutagenní oligonukleotidy č. 14 a č. 15 pro lidský sérový albumin,

B) pro PCR a linkery (spojovací oligonukleotidy) č. 18-20, 24-29 a 31 pro konstrukci fúzních polypeptidů.

Obrázek 9: Konstrukce vektoru HSA-IgER/SK#49, obsahujícího polynukleotid kódující preproHSA II (nazývaný na obrázku „HSA“) fúzovaný na 3'-konci prostřednictvím oligonukleotidu kódujícího spojku L₂ (představovanou na obr. 9 „GGG“) k 5' konci polynukleotidu kódujícího lgE^R (nazývaný na obrázku „IgER“), ligaci fragmentu BamHl, Sáli zpEKl do pEK7 naštěpeného BamHl, Sall.

Obrázek 10: Konstrukce vektoru IgER-HSA/SK# 1, obsahujícího polynukleotid kódující prelgE^R (nazývaný na obrázku „IgER“), fúzovaný na 3'-konci prostřednictvím oligonukleotidu pro spojku Li (představovanou na obr. 9 „GGG“) k 5'-konci polynukleotidu kódujícího HSA II („HSA“), ligaci fragmentu Sstl, Nhel z IgER/TA#l do HSA/SK&5 naštěpeného Sstl, Nhel.

Obrázek 11: Konstrukce vektoru HSA-lgER Pst Sal/SK#37, obsahujícího polynukleotid kódující HSA II (označený „HSA3“), který je fúzovaný na 3'-konci prostřednictvím oligonukleotidu pro L₂ (nezobrazeno) k 5'-konci polynukleotidu kódujícího IgE^R (označen jako „IgER“), ligaci fragmentu Pstl, Sall z HSA-IgER/SK#49 do vektoru SK. Je také ukázána konstrukce vektoru R-H40 R/SK#50, obsahujícího polynukleotid kódující pre-lgE^R (nazvaný jako „IgER“), fúzovaný na svém 3'-konci prostřednictvím oligonukleotidu pro Li (nezobrazeno) k 5'-konci polynukleotidu kódujícího HSA II („HSA“), kteiý je po řadě fúzován prostřednictvím oligonukleotidu pro L₂(nezobrazeno) k polynukleotidu kódujícím IgE^R (IgER). Vektor je připraven ligaci fragmentu Pstl, KpnI z HSA-lgER Pst Sal/SK#37 do lgER-HSA/SK#l naštěpeného Pstl, KpnI.

Obrázek 12: Nukleotidová sekvence lidského sérového albuminu a aminokyselinová sekvence odpovídající sekvenci identifikačního čísla 2 a sekvenci identifikačního čísla 5.

Obrázek 13: Nukleotidová sekvence lgE^R a aminokyselinová sekvence odpovídající sekvenci 50 identifikačního čísla 1 a sekvenci identifikačního čísla 6.

Obrázek 14: Nukleotidová a aminokyselinová sekvence fragmentu EcoRI z R-H-R/SK#50 odpovídající sekvence identifikačního čísla 3 a sekvence identifikačního čísla 4, kódující dimemí fúzní protein R1 - HSA - Rl. Sekvence HSA je označena kurzívou. Sekvence spojky jsou vyznačeny malými písmeny. Bodové mutace lišící se od souhlasné sekvence nukleové kyseliny pro HSA jsou vyznačeny malými písmeny tučně. Protože bodové mutace jsou v kolísavé pozici, neovlivňují aminokyselinovou sekvenci. Restrikční místa na koncích fragmentů a v oblasti spojky jsou podtržena.

Obrázek 15: SDS-PAGE purifikovaného zralého fúzního polypeptidu z příkladu 7:

Celková množství nanesená na gel: 8 gg (dráha 1), 6 gg (dráha 2), 4 gg (dráha 3) a 2 gg (dráha 4), standard molekulové hmotnosti: 97,4, 66,2, 45, 31,21,5 a 14,4 kD (dráha 5).

Detailní popis vynálezu

Vynález se týká fúzních polypeptidů a jejich solí, obsahujících alespoň jednu vazebnou doménu fúzovanou alespoň s jednou složkou HSA.

Termín „IgE-vazebná doména“ se týká sekvence aminokyselin schopné se vázat nebo jiným způsobem asociovat se savčím, např. lidským IgE takovým způsobem, že brání vazbě IgE na jeho receptor FceRI.

Sekvence cDNA a z ní odvozená sekvence aminokyselin lidského FcsRIa jsou známy (J. Kochan et al., Nucleic Acid Research 16, 1988, 3584, Leder et al., patent USA 4 962 035). Lidský FceRIa kóduje signální peptid NH₂-konce (aminokyselinové zbytky, včetně prvního Met, Met, až Ala₂₄), dvě extracelulární domény podobné imunoglobulinu (zbytky Val₂₆ až Leu₂o₄), hydrofobní transmembránový úsek (Gln₂05 až Ile₂₂₄) a hydrofilní cytoplazmatický úsek (Ser₂₂₅ až Asn₂₅₇, viz sekvence id. č. 1). Signální peptid je během opracování v buňce odštěpen. Úplná aminokyselinová sekvence dominantní formy nativního lidského FcsRIa je zde uvedena jako sekvence id. č. 1.

Termín „IgE^R“ označuje sekvence aminokyselin Val26 až Leu2O4 sekvence id. č. 1 (kódující extracelulámí doménu) a termín „pre-IgE^R“ označuje aminokyselinové zbytky Met] až Leu2o₄sekvence id. č. 1 (kódující signální sekvenci lokalizovanou proti směru transkripce od extracelulární domény).

IgE-vazebná doména je např. aminokyselinová sekvence, která má alespoň 80%, výhodněji 85% nebo ještě výhodněji 95%, případně nejvýhodněji 99% homologii s IgE^R definovaným v předchozím textu (přičemž homologie se počítá jako % identity mezi nativní sekvencí a pozměněnou sekvencí jako funkce celkové délky sekvence nativní molekuly, po srovnání sekvencí včetně vložených mezer, pokud je to nutné pro dosažení maximální identity v %).

V podskupině fúzních polypeptidů podle předkládaného vynálezu složka IgE-vazebné domény je (Xa) kde (Xa) je

a) IgE^R, nebo

b) přirozeně se vyskytující alela IgE®, nebo

c) peptid uvedený v a) nebo b) zkrácený na karboxylovém konci o 1 až 12 aminokyselin (např. 1 až 10, 1 až 7 nebo I až 4), nebo

d) varianta peptidu uvedeného v a), b) nebo c).

-8CZ 297634 B6

Přičemž variantou se rozumí:

- sekvence uvedená v a), b) nebo c) modifikovaná jednou nebo několika delecemi (jinými než zkrácením karboxylové konce) až do 10 delecí (např. 1 až 7 nebo 1 až 5) aminokyselin,

- inzerce (vložení) až celkem 10 aminokyselin (např. I až 5) dovnitř aminokyselinové sekvence 5 nebo až 100 aminokyselin na kterýkoliv její konec, nebo

- konzervativní substituce celkem až 15 (např. 1 až 5) aminokyselin.

IgE-vazebná doména je výhodněji (Xb) ii) kde(Xb)je

a) IgE^R, nebo

b) lgE^R zkrácený na karboxylovém konci o 1 až 7 aminokyselin, nebo

c) varianta peptidu uvedeného v a) nebo b).

IgE-vazebná doména je ještě výhodněji (Xc) kde (Xc) je

a) IgE^R, nebo

b) IgE^R zkrácený na karboxylovém konci o l až 7 aminokyselin (tedy např. sekvence Val₂6 až 20 Alai97, viz sekvence id. č. 1).

Nejvýhodněji IgE-vazebná doména je IgE^R.

Výhodně, kterýkoliv homolog, zkrácený peptid nebo varianta jsou připraveny rekombinantním 25 způsobem jako secemovatelný polypeptid, zejména zralý peptid se sekvencí kódující IgEvazebnou doménu, může být secemován z hostitelské buňky, ve které je tento polypeptid (nebo jeho prekurzorová forma) syntetizován z polynukleotidu.

Další hlavní součástí rekombinantního fúzního polypeptidu podle předkládaného vynálezu je lid30 ský sérový albumin (HSA), který tvoří nejhojnější protein v plazmě, tj. 60 % hmotnostních z celkového proteinu plazmy. Molekula lidského sérového albuminu je tvořena jediným polypeptidovým řetězcem z 585 aminokyselin, který není glykosylován, jeho molekulová hmotnost je 66,5 kDa. Specifickým rysem albuminu je jeho vzorec disulfidových vazeb (F. F. Clerc et al., J. Chomatogr. 662, 1994, 245-259). Lidský sérový albumin se vyskytuje v celém těle, zvláště 35 v krevním a intestinálním kompartmentu, kde se podílí jako hlavní proteinová složka séra, udržování osmolarity a plazmatického objemu. Pomaluje odstraňován v játrech a u člověka je jeho in vivo poločas 14 až 20 dnů (T. A. Waldmann. „Albumin structure, Function and uses“. Pergamon Press, 1977, 255-275). Lidský sérový albumin nemá ani enzymatickou ani imunologickou funkci. Je to přirozený nosič, účastnící se endogenního transportu a přenosu různých přirozených 40 molekul a také léčiva (H. Lu et al., FEBS Lett. 356, 1994, 56-59, WO 93/15199, EP 648499,

P. Yeh etal„ PNAS USA 89, 1992, 1904-1908, EP 413622).

Lidské buňky syntetizují sérový albumin nejdříve ve formě prepro-polypeptidu. Signální sekvence tvořená 18 aminokyselinami (včetně prvního Met) je odstraněna při průchodu proteinu lume45 nem endoplazmatického retikula, přičemž stále ještě zůstává 6 aminokyselin na N-konci (v převládající formě jsou to: Ar-Gly-Val-Phe-Arg-Arg), které jsou potom proteolyticky odstraněny buď během, anebo bezprostředně po transportu sekretorickým aparátem. Lidský sérový albumin je polymorfní, jak je dobře známo (D. C. Carter aj. X. Ho, Adv. Prot. Chem. 45, 1994, 153-203).

-9CZ 297634 B6

Tak např. albumin Naskapi má Lys3₇₂ místo Glu3₇₂, proalbumin Christchurch má pozměněnou prosekvenci, kde je Glu₂4 místo Arg₂₄ (Latta et al., Patent USA 5 100 784).

Úplná aminokyselinová sekvence dominantní formy přirozeně se vyskytujícího proteinu, který je zde označován jako „prepro-HSA I“ je známa (A. Dugaiczyk et al., PNAS USA, 79, 1982, 7175) a je zde uvedena jako sekvence id. č. 2. Dominantní forma zralého proteinu („HSA I“) je představována Asp₂5 až Leu609 sekvence id. č. 2.

Nosičový HSA fúzního proteinu podle předkládaného vynálezu je aminokyselinová sekvence, která má alespoň 80%, výhodněji 85% nebo ještě výhodněji 95%, případně nejvýhodněji 99% homologii se sekvencí určenou zbytky 25 až 609 sekvence id. č. 2 (t. HSA I) (přičemž homologie se počítá jako % identity mezi nativní sekvencí a pozměněnou sekvencí jako funkce celkové délky sekvence nativní molekuly, po srovnání sekvencí včetně vložených mezer, pokud je to nutné pro dosažení maximální identity v %).

V podskupině fúzních polypeptidů podle předkládaného vynálezu je složka HSA (Ya) kde (Ya) je

a) HSA I, nebo

b) přirozeně se vyskytující alela peptidu uvedeného v a), nebo

c) peptid uvedený v a) nebo b) zkrácený na svém karboxylovém konci o 1 až 10 aminokyselin (tj. např. 1 až 5 nebo 1 až 2), nebo

d) peptid uvedený v a) zkrácený tak, že končí aminokyselinovým zbytkem a, kde aje 369 až 419, a zejména kde aje 383, 387, 388, 389, 390 a 407 (viz Patent USA 5 380 712), nebo

e) varianta peptidu uvedeného v a), b), c) nebo d).

Přičemž variantou se rozumí:

- sekvence uvedená v a), b), c) nebo d) modifikovaná jednou nebo několika delecemi (jinými než zkrácením karboxylové konce) až do 10 delecí (např. 1 až 7 nebo 1 až 5) aminokyselin,

- inzerce (vložení) až celkem 10 aminokyselin (např. 1 až 5) dovnitř aminokyselinové sekvence nebo až 100 aminokyselin na kterýkoliv její konec, nebo

- konzervativní substituce celkem až 15 (např. 1 až 5) aminokyselin.

Výhodněji je složka HSA (Yb) kde (Yb)je

a) HSA I, nebo

b) přirozeně se vyskytující alela peptidu uvedeného v a), nebo

d) varianta peptidu uvedeného v a), b) nebo c).

Ještě výhodněji složka HSA je (Yc) kde (Yc) je

a) HSA 1, nebo

- 10CZ 297634 B6

b) peptid uvedený v a) nebo b) zkrácený na svém karboxylovem konci o 1 až 10 (tj. např. o 1) aminokyselin (příkladem takového zkrácení je „HSA1I“, představovaný zbytky Asp?5 až Gly₆o8 sekvence id. č. 2).

Nej výhodnější subskupinou HSA složky je složka HSA1 nebo HSA11, zvláště pak HSA1I.

Zvláště výhodný je fúzní polypeptid podle příkladu 7, zvláště bez vedoucí sekvence, tj. polypeptid Val₂₆-Leu978 sekvence id. č. 3.

Výhodně kterýkoliv homolog, zkrácený peptid nebo varianta nativního HSA, které se použijí pro přípravu fúzního peptidu podle předkládaného vynálezu budou bez enzymatické funkce a nebudou bránit vazbě IgE-vazebné domény na sérový IgE nebo takovou vazbu inhibovat. Výhodně jakýkoliv takový homolog nebo varianta mají sérový poločas alespoň 14 dní.

Termín „konzervativní substituce“ se ve vztahu k IgE-vazebné doméně nebo složce HSA týká substituce jedné nebo několika aminokyselin jinými aminokyselinami, u kterých lze čekat, že mají podobné vlastnosti, a že alespoň sekundární struktura, a výhodně i terciární struktura poiypeptidu zůstanou v podstatě nezměněny. Tak např. takovou substitucí je náhrada glycinu aianinem nebo valinem, glutaminu asparaginem, threoninu serinem a lysinu argininem. Všechny tyto amino-kyseliny (kromě glycinu) jsou výhodně přirozeně se vyskytující L-aminokyseliny.

Výhodně je každá IgE-vazebná doména alespoň z 95 % homologická s IgE® a každá složka HSA je alespoň z 95 % homologická s HSA I.

V ostatních výhodných podskupinách:

- každá IgE-vazebná doména je výhodně (Xa) a každá složka HSA je (Ya), nebo výhodněji (Yb) nebo ještě výhodněji (Yc) podle definic uvedených výše,

- každá IgE-vazebná doména je výhodněji (Xb) a každá složka HSA je (Ya), nebo výhodněji (Yb) nebo ještě výhodněji (Yc) podle definic uvedených výše,

- každá IgE-vazebná doména je ještě výhodněji (Xc) a každá složka HSA je (Ya), nebo výhodněji (Yb) nebo ještě výhodněji (Yc) podle definic uvedených výše.

V dalším výhodném provedení IgE-vazebná doména je IgE^R a složka HSA je (Ya), nebo výhodněji (Yb) nebo ještě výhodněji (Yc) podle definic uvedených výše, nebo nejvýhodněji je HSA I nebo HSA II, zvláště pak HSA II.

Výhodnost zde popsaná se vztahuje také zvláště na polypeptidy podle každého ze vzorců I, II, III, IV a V zde uvedených.

Výhodné polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou takové, které obsahují jako první molekulu IgE^R fúzovanou prostřednictvím svého karboxylového konce k aminovému konci molekuly HSA 11, a tato molekula HSA II je fúzována svým karboxylovým koncem k aminovému konci druhé molekuly IgE^R (přičemž IgE^R obsahuje zbytky Val₂₆ až Leu₂₀4 sekvence id. č. 1 a HSA obsahuje zbytky Asp₂₅ až Gly₆o8 sekvence id. č. 2).

Zejména výhodné polypeptidy podle předpokládaného vynálezu obsahují dimery podle vzorce III, kde každá skupina R, je IgE^R a R₂ je HSA 11. Zvláště výhodné polypeptidy jsou dimery podle vzorce III, kde každá skupina L je 1 až 25 aminokyselin.

Jakýkoliv peptidový linker (spojovací článek), ve vzorcích I až V označený skupina L, výhodně umožňuje nezávislé uspořádání a aktivitu IgE-vazebné domény, a nemá sklon vytvářet sekundární strukturu, která by mohla nepříznivě reagovat s IgE-vazebnou doménou nebo způsobovat

-11CZ 297634 B6 imunitní reakci u pacienta, a má minimální hydrofobní a nábojové charakteristiky, které by mohly nějak reagovat s IgE-vazebnou doménou.

Peptidový linker je výhodně 1 až 500 aminokyselin, výhodněji 1 až 250 a ještě výhodněji 1 až 100 aminokyselin (tj. např. 1 až 25, 1 až 10, 1 až 7 nebo 1 až 4). Linker je výhodně lineární, tj. nerozvětvený. Obecně peptidové linkery obsahují Gly, Ala a Ser, u kterých lze čekat, že splní požadavky na linker. Tak např. k linkerům podle předkládaného vynálezu patří GlyGlyGlySer (zde označ. LJ a AlaSerGlyGlyGlyGlySer (zde označ. L₂). Lze také užít linkery jiného složení a různých jiných délek.

Předkládaný vynález se také týká oligonukleotidů kódujících peptidové linkery podle vynálezu. Takové oligonukleotidy musí být fúzovány v souladu se čtecím rámcem (fúzovány v rámci) s polynukleotidy kódujícími IgE-vazebnou doménu a složku HSA, a výhodně obsahují restrikční místa, která jsou jedinečná pro danou molekulu. Termínem „fúzovaný v rámci“ se tedy rozumí, že nedochází k posunu čtecího rámce IgE-vazebné domény ani složky HSA, který by způsobil oligonukleotid použitý jako linker, a že nedojde k terminaci translace mezi čtecími rámci pro IgE-vazebnou doménu a složku HSA.

Vynález se dále týká fyziologicky funkčních ekvivalentů nového fúzního polypeptidu podle předkládaného vynálezu, které jsou normálně meziprodukty při syntéze nového polypeptidu. Termín „fyziologicky funkční ekvivalent“ se výhodně týká větších molekul obsahujících fúzní polypeptid podle vynálezu, ke kterému byla přidána aminokyselinová sekvence, která je nutná nebo žádoucí pro dosažení účinné exprese a sekrece zralého rekombinantního fúzního polypeptidu podle vynálezu z určité hostitelské buňky. Taková dodatečná aminokyselinová sekvence je typicky na aminovém konci zralého polypeptidu a obvykle vytváří vedoucí (tj. signální) sekvenci, která slouží k tomu, aby polypeptid navedla do sekreční metabolické dráhy, a normálně je odštěpena buď během, nebo po sekreci polypeptidu z buňky. Signální sekvence může být odvozena z přirozeného úseku aminového konce příslušného polypeptidu nebojí lze získat z genu hostitele, který kóduje nějaký secemovaný protein, nebo ji lze odvodit zjakékoliv jiné sekvence, o které je známo, že zvyšuje sekreci požadovaného polypeptidu, včetně syntetických sekvencí a všech kombinací „pře“ a „pro“ úseků. Místo spojení mezi signální sekvencí a sekvencí kódující zralý polypeptid by mělo odpovídat místu štěpení v hostitelském organismu.

Ve fúzních polypeptidech, kde IgE-vazebná doména je vedoucí, „vede“ expresi, tj. je umístěna proti směru transkripce od další kódující sekvence na fúzní molekule, je výhodné využít vedoucí sekvenci nativního lidského FceRIa (tj. Met] + Ala₂-Ala₂5 sekvence id. č. 1), což bylo účinně aplikováno pro získání zralého polypeptidu v savčím expresním systému (např. CHO, COS) a také ve kvasinkách (Pichia pastoris).

Příkladem fyziologicky funkčních ekvivalentů zralého dimemího fúzního polypeptidu IgE^R-L]HSAlI-L2-IgE^R je: pre-IgE^R-Li-HSAII-L2-IgE^R. Avšak dodatečná vedoucí sekvence nemusí být nutně lidská FceRIa a lze ji získat z jakéhokoliv vhodného zdroje, jestliže je vhodná ktomu, aby ovlivnila expresi a/nebo sekreci zralého polypeptidu z určitých hostitelských buněk. Tak např. lze užít prepro-sekvence HSA pro přípravu dimemího fúzního polypeptid zmíněného výše, zvláště pro expresi v kvasinkách.

Ve fúzním polypeptidu podle předkládaného vynálezu, kde složka HSA „vede“ expresi, vhodná vedoucí sekvence může obsahovat nativní vedoucí sekvenci. Např. nativní prepro-úsek z HSA lze užít pro dosažení sekrece zralého heterologního polypeptidu v savčích buňkách (např. CHO, COS) nebo kvasinkách {Pichia pastoris).

Příkladem fyziologicky funkčního ekvivalentu zralého dimemího fúzního polypeptidu HSAIIL₂-lgE^R je: prepro-HSAII-L₂-IgE^R. Avšak i jiná vedoucí sekvence, nejen nativní sekvence z HSA nebo hostitelských buněk, může poskytnout účinnou expresi zralého fúzního proteinu v určitých hostitelích (patenty US 5 100 784 a US 5 330 901).

Vynález se dále týká polynukleotidů, které jsou meziprodukty při přípravě rekombinantních fúzních polypeptidů podle předkládaného vynálezu, včetně polynukleotidů kódujících fúzní polypeptidy nebo jejich fyziologicky funkční ekvivalenty a také oligonukleotidů kódujících linkerové peptidy, které jsou uvedeny např. na obr. 8.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu je způsob přípravy rekombinantního fúzního polypeptidu definovaného v předchozím textu nebo jeho soli, přičemž tento způsob spočívá v tom, že se: transformuje hostitelská buňka vektorem, který obsahuje DNA kódující fúzní polypeptid definovaný v předchozím textu nebo jeho fyziologicky funkční ekvivalent, fúzní polypeptid nebo jeho fyziologicky funkční ekvivalent se exprimuje v těchto buňkách, přičemž fyziologicky funkčně ekvivalentní polypeptid je modifikován (např. odštěpením signální sekvence) tak, aby vytvořil fúzní polypeptid definovaný v předchozím textu, výsledný polypeptid se získá z hostitelských buněk, výhodně jako secemovaný produkt, případně ve formě jeho soli.

Ještě dalším aspektem předkládaného vynálezu jsou vektory, výhodně plazmidy, pro použití při expresi fúzních polypeptidů. Tyto vektory obsahují DNA, která kóduje polynukleotidy definované v předchozím textu nebo jejich fyziologicky funkční ekvivalenty. Obecně k vhodným vektorům pro transformaci mikroorganismů schopných exprimovat fúzní polypeptidy patří expresní vektory obsahující nukleotidové sekvence kódující fúzní polypeptidy spojené s regulačními sekvencemi transkripce a translace, jako jsou promotory, které dohromady vytvářejí expresní kazetu. Promotory mohou pocházet z genů užitého hostitele, nebo lze takové kontrolní sekvence modifikovat, např. in vitro místně cílenou mutagenezí tak, že se vloží dodatečné kontrolní prvky nebo syntetické sekvence. Expresní kazeta použitá v předkládaném vynálezu obsahuje terminační úsek transkripce a translace, který je funkční v zamýšleném hostiteli a který leží na 3'-konci sekvence kódující hybridní makromolekulu. Kromě expresní kazety ještě vektor obsahuje jeden nebo několik markérů umožňujících selekci hostitele po transformaci. K takovým markérům patří např. geny poskytující rezistenci k antibiotikům jako je např. G418. Geny rezistence se umístí pod kontrolou vhodných transkripčních a translačních signálů dovolujících expresi v daném hostiteli.

Příprava rekombinantních fúzních polypeptidů podle předkládaného vynálezu může být provedena např. podle následujícího popisu.

A. Konstrukce expresního vektoru pro fúzní protein

Prvním krokem při konstrukci rekombinantních fúzních polypeptidů je subklonování částí fůzních polypeptidů do klonovacího vektoru. V této souvislosti termín „klonovací vektor“ znamená molekulu DNA, jako je plazmid, kosmid nebo bakteriofág, která se může autonomně replikovat v hostitelské prokaryotické buňce. Klonovací vektory typicky obsahují jedno nebo malý počet rozpoznávacích míst pro restrikční endonukleázy, do kterých lze vložit cizorodou DNA definovaným způsobem, aniž by se ztratila podstatná biologická funkce vektoru, a také markerový gen, který je užitečný pro identifikaci a selekci buněk transformovaných klonovacím vektorem. Markerové geny jsou typicky geny poskytující rezistenci k tetracyklinu nebo ampicilinu. Vhodné klonovací vektory jsou popsány v publikaci J. Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning“ A Laboratory Manual, 2^nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratoiy Press, 1989, a lze je získat z různých zdrojů.

Klon pGEM-3-110B-1, obsahující cDNA FcsRIa, popsali Shimizu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 1988, 1907-1911, a může být získán z Americké sbírky mikroorganizmů ATCC pod č. ATCC 67566. Jednořetězcová cDNA lidských jater se dá získat od firmy Clontech (PCR-ready Quick Cloně cDNA, katalog, č. D 7113-1). Sekvence HSA je dostupná v GenBank pod přístupovými čísly V00495, J00078, L00132, L00133. cDNA HSA je možné získat PCR amplifikací pomocí oligonukleotidů č. 24 a 25, jak se popisuje v příkladu 2.

- 13 CZ 297634 B6

Polynukleotid kódující vhodnou IgE-vazebnou doménu nebo složku HSA je možné připravit pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR). PCR využívá jednořetězcovou cDNA jako templát a směs oligonukleotidových primerů. Vlastní procedura PCR se provádí odborníkovi známým 5 postupem (viz např. C. R. M. Bangham, „The Polamerase Chain reaction: Getting Started“,

Protocol in Human Molecular genetics, Human Press, 1991, kapitola I, s. 1-8). Soupravy pro PCR a další materiál pro použití se soupravami je komerčně dostupný z různých zdrojů. Soupravy a způsoby jejich použití jsou popsány např. v Patentu US 5 487 993.

ίο Sekvence DNA kódující signální peptidy mohou být přidány pomocí PCR nebo prostřednictvím syntetických oligonukleotidů, které kódují známé sekvence signálních peptidů. Sekvence DNA kódující heterologní signální peptidy se subklonují v souladu se čtecím rámcem s DNA sekvencí kódující A-konec fúzního polypeptidu.

Fúze polypeptidu lze dosáhnout tím, že se subklonuje do přechodného vektoru. Alternativně, jeden gen se může klonovat přímo do vektoru obsahujícího druhý gen. Pro spojení sekvencí DNA lze využít linkery a adaptery.

Subklonování se provádí obvyklými technikami odborníkovi dobře známými, např. štěpením 20 pomocí restrikčních enzymů, Čímž se získají vhodné konce, použitím alkalické fosfatázy k zabránění nežádoucího spojování molekul DNA, a ligací pomocí vhodné ligázy. Techniky pro tyto genové manipulace jsou popsány v odborné literatuře a jsou odborníkovi dobře známy.

B. Expresní klonování fúzních polypeptidů

Klonovaný fúzní protein se pak vyštěpí z klonovacího vektoru a vloží se do expresního vektoru. Vhodné expresní vektory typicky obsahují:

1) prvky prokaryotické DNA, které kódují bakteriální replikační počátek a markér rezistence k antibiotiku, aby bylo možné pěstovat a selektovat expresní vektor v bakteriálním hostiteli,

2) prvky eukaryotické DNA, které řídí zahájení transkripce, jako je např. promotor, a

3) prvky DNA, které řídí opracování transkriptu, jako jsou např. sekvence pro terminaci transkripce nebo polyadenylaci.

Další aspekt předkládaného vynálezu se proto týká vektorů, výhodně plazmidových vektorů, pro 35 použití k expresi fúzních polypeptidů podle předkládaného vynálezu, které obsahují polynukleotidové sekvence zde popsané, které kódují polypeptidy podle vynálezu. Vhodné expresní vektory, které mohou transformovat prokaryotickou nebo eukaryotickou buňku, obsahují nukleotidové sekvence kódující fúzní molekuly spojené s regulačními sekvencemi transkripce a translace, které jsou vybrány podle použitých hostitelských buněk. Pro expresi v E. coli se mohou užít vektory, 40 které popsali M. W. Robertson et al., J. Biol. Chem. 268, 1993, 12736-12743. Očekává se, že takový produkt má pak navázané disulfidové vazby, ale není glykosylován. Pro expresi v kvasinkách je možné použít expresní vektor pHIL-D2 dodávaný firmou Invitrogen (San Diego, CA, USA) jako součást expresní soupravy pro Pichia pastoris (katalog, č. K1710-01). Proteinový expresní produkt je v tomto případě s navázanými disulfidovými vazbami a je glykosylován. 45 Dalšími vhodnými kvasinkovými expresními systémy jsou Saccharomyces cerevisiae a Kluveromyces lactis. Pro expresi pomocí bakulovirů jsou vhodné vektory např. pAC360, pVL1392 a pVL1393 (Invitrogen, San Diego, CA, USA) pro infekci hmyzích buněk, které secemují produkt s navázanými disulfidovými vazbami a glykosylovaný.

Fúzní polypeptid podle předkládaného vynálezu je normálně glykoprotein, zejména je-li exprimován v savčích buňkách, a vynález se týká polypeptidů v jakémkoliv stavu co se týče glykosylace nebo disulfidových můstků. Zvláště mutační analýzy ukázaly, že A-glykosylace v první, druhé nebo sedmé pozici A-glykosylačních míst α-řetězce IgE receptorů (A. Shimizu et al.,

- 14CZ 297634 B6

PNAS USA 85, 1988, 1907-1911, viz obr. 2, odpovídají aminokyselinovým zbytkům 46, 67 a 191 v sekvenci id. č. 1) zvyšují biologickou aktivitu molekuly lgE^R i jejích monomerů či dimerů. Nejvýhodnější expresní systém je takový, kde jakékoliv přidané cukry budou co nejpodobnější cukrům v nativní molekule, ze které je polypeptid odvozen. Kvasinky a hmyzí buňky jsou známy tím, že modifikují glykoproteiny odlišně ve srovnání se savčími buňkami, zatímco E. coli nepřidává při sekreci cukry vůbec. Takže zatímco exprese z jakéhokoliv expresního systému poskytne proteinový produkt vhodný pro diagnostické účely (např. pro detekci alergických podmínek), nejvýhodnější forma exprese produktu pro použití jako terapeutická molekula je exprese v savčích buňkách, případně exprese v mléce transgenních savců.

Pro expresi v savčím hostiteli se mohou transkripční a translační regulační signály použité v expresní kazetě odvodit z virových zdrojů, jako je např. adenovirus, hovězí papillomavirus nebo opičí viry, jejichž regulační signály jsou spojeny s určitými geny, které mají vysokou úroveň exprese. Vhodné transkripční a translační regulační sekvence je možné také získat ze savčích genů, jako je např. gen pro aktin, kolagen, myosin a metalothionin. Transkripční regulační sekvence obsahují promotorový úsek dostatečný ktomu, aby řídil zahájení syntézy RNA v savčí buňce.

Příkladem typických savčích buněk jsou buňky ovarií čínského křečka (CHO), opičí ledvinné buňky transformované SV40 (COS), a dále buňky HeLa, BHK, embryonální buňky švýcarské myši NIH, krysí, opičí nebo lidské fibroblasty nebo krysí hepatomové buňky.

Pro expresi v savčích buňkách je nej výhodnějším způsobem sekrece z buněk CHO. Ani buňky CHO ani lidské buňky nepřidávají al,3-vázané galaktózové zbytky, což je typické pro expresi v myších buňkách jako jsou buňky Cl27 nebo SP2/0. V lidském séru jsou přítomny protilátky proti těmto cukerným vazbám (C. F. Goochee et al., BioTechnol. 9, 1991, 1347-1355) a mohou tudíž ovlivnit poločas, dostupnost a clearance rekombinantních produktů získaných z myších buněk. Buňky CHO dhfr-jsou buňky mutantní v genu pro dihydrofolátreduktázu (DHFR) a proto nejsou schopny de novo syntetizovat puriny, thymidin a glycin. Počet kopií plazmidů integrovaného v chromosomu nesoucího kopie divokého typu genu DHFR se může zvýšit tak, že se buňky transformované takovým plazmidem vystaví zvýšené koncentraci metotrexátu, analogu folátu, který kompetuje o folátovou vazbu v aktivním místě enzymu. Vhodný vektor pro expresi v CHO dhfr- buňkách je pMT2 (R. J. Kaufman et al., EMBO J. 6, 1987, 187-193). Vektor pMT2 obsahuje kopii genu dhfr divokého typu, která je v rámci cizího genu transkribována do jednořetězcové mRNA. Po ošetření transformovaných buněk CHO dhfr- rostoucí koncentrací metotrexátu jak cizí gen, tak i dhfr jsou společně amplifikovány. Produkt secemovaný z těchto buněk má navázané disulfidové můstky a je glykosylovaný způsobem odpovídajícím savčím buňkám.

Expresní vektor může být zaveden do hostitelských buněk různými způsoby, např. kalciumfosfátovou transfekcí, transfekcí zprostředkovanou liposomy, elektroporací apod. Výhodně se transfekované buňky selektují a množí, když je expresní vektor stabilně integrován v genomu hostitelské buňky a vytváří stabilní transformanty. Buňky se pak mohou pěstovat např. v médiu DMEM. Polypeptid secemovaný do média lze pak získat standardním biochemickým způsobem po přechodné expresi probíhající 24 až 72 hodin po transfekcí buněk nebo vytvoření stálých buněčných linií selekcí např. na rezistenci k antibiotiku.

Obvyklým způsobem, jak získat exprimovaný polypeptid z kultury, je frakcionace části kultury obsahující polypeptid pomocí biochemických metod. Např. pro izolaci exprimovaného proteinu z kultury je možné použít gelovou filtraci, gelovou chromatografií, ultrafiltraci, elektroforézu, iontoměničovou nebo afinitní chromatografií, přičemž tyto metody jsou známy pro proteinovou frakcionaci. Také lze užít obvyklé imunochemické metody jako je imunoafinitní chromatografie nebo imunoabsorpce. Metody vhodné pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, screening a přípravu a purifikaci produktu jsou v oboru známy (viz. Např. J. Sambrook et al., 1989, supra, R. J. Kaufman, Genetic Engineering: Principles and Methods, Plenům Press, Vol. 9, 1987, 156-198).

- 15(/. 297634 B6

Fúzní polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou určeny pro léčebné použití pro léčení savců, a zvláště člověka, trpících alergiemi. IgE-vazebná doména fúzních polypeptidů kompetuje o IgE s receptory pro IgE přirozeně se vyskytujícími na mastocytech, basofílech a Langerhansových buňkách, takže IgE se váže na podávaný protein a není schopen vázat se na tyto efektorové 5 buňky, které zprostředkovávají alergickou odpověď. IgE-vazebná doména také kompetuje s IgE receptory. FceRIa tím, že se váže na protilátky k FceRIa.

Proto předkládaný vynález poskytuje farmaceutický přípravek pro kompetitivní vazbu IgE (a/nebo protilátek k FceRIa), a/nebo inhibici produkce IgE, a tedy pro supresivní a/nebo io preventivní léčení poruch zprostředkovaných IgE nebo receptorem IgE, a přesněji alergie a stavů spojených s alergií, jako je atopická dermatitida, atopické astma a chronická kopřivka.

Termínem „poruchy zprostředkované IgE nebo receptorem IgE“ jsou míněny poruchy spojené s vazbou buněčně navázaného receptoru IgE, FceRI, na IgE nebo na auto-protilátky k FceRI, 15 např. typ alergické reakce („syndrom hyper-lgE“), jako je bronchiální astma, atopické astma, senná rýma, pylová alergie, alergická rýma, atopická dermatitida, ekzém, anafylaxe, a také chronická kopřivka, a také nealergická Kimurova nemoc, a další plicní, dermatologické nebo autoimunitní nemoci. Zejména atopická dermatitida, jeden z nejdramatičtějších projevů atopie, je chronická zánětlivá kožní nemoc spojená s vysokými sérovými hladinami IgE a alergizací na 20 různé alergeny životního prostředí (M. A. Morren et al., J. Am. Acad. Dermatol., 31, 467-473, 1994). Současná léčba atopické dermatitidy se koncentruje na použití krémů obsahujících steroidy, a vážné případy atopické dermatitidy byly úspěšně léčeny cyklosporinem A (H. Granlund et al., Br. J. dermatol., 132, 106-112, 1995), ale vedlejší účinky omezují tuto léčbu pro menšinu pacientů. Přípravek, který inhibuje funkce IgE, jako je degranulace žímých buněk a 25 prezentace antigenu B lymfocyty a jinými buňkami prezentujícími antigen zprostředkovaná IgE, by byl lepší než jakékoliv současně známé léčení atopické dermatitidy a kromě toho by byl také použitelný pro další mírné formy alergie.

Kromě atopické dermatitidy a atopického astmatu mohou být polypeptidy vynálezu použity 30 k léčbě nebo prevenci chronické kopřivky („chronic urticaria“ - CLJ), ve které hraje roli degranulace žímých buněk prostřednictvím aktivace FceRIa. Fúzní polypeptidy vynálezu mohou odstranit cirkulující auto-protilátky proti FceRIa, na rozdíl od anti-IgE monoklonálních protilátek, které jsou navrhovány jako alternativa pro léčení této nemoci.

Polypeptidy mohou být podávány ve formě farmaceutického přípravku, který obsahuje polypeptid podle předkládaného vynálezu, výhodně nemodifikovaný polypeptid, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo rozpouštědle.

Termín „sůl“ se týká konkrétně farmaceuticky přijatelných solí připravených z farmaceuticky při40 jatelných netoxických kyselin tak, že se tvoří kyselé adiční soli např. aminoskupiny polypeptidového řetězce, nebo z farmaceuticky přijatelných netoxických bází tak, že se tvoří bazické soli, např. karboxylové skupiny polypeptidového řetězce. Takové soli se mohou vytvořit jako vnitřní soli a/nebo soli aminového nebo karboxylového konce polypeptidů podle předkládaného vynálezu.

Vhodné farmaceuticky přijatelné kyselé adiční soli jsou soli farmaceuticky přijatelných netoxických organických kyselin, polymemích kyselin nebo anorganických kyselin. K vhodným organickým kyselinám patří např. kyselina octová, askorbová, benzoová, benzensulfonová, citrónová, ethansulfonová, fumarová, glukonová, glutamová, bromovodíková, chlorovodíková, izothionová, 50 mléčná, maleinová, jablečná, mandlová, methansulfonová, slizová, dusičná, oxalová, pamoová (4,4'-methylenbis(3-hydroxy-2-naftoová), pantotenová, fosforečná, salicylová, jantarová, sírová, vinná a p-toluensulfonová, a také polymemí kyseliny jako např. kyselina tříslová nebo karboxymethylcelulóza. K vhodným anorganickým kyselinám patří minerální kyseliny jako chlorovodíková, bromovodíková, sírová, fosforečná a dusičná.

- 16CZ 297634 Β6

Κ příkladům vhodných anorganických bází pro vytváření solí karboxylové skupiny patří soli alkalických kovů jako jsou soli sodné, draselné a lithné, soli alkalických zemin jako jsou soli vápenaté, barnaté a hořečnaté, a také soli amonné, měďnaté, železnaté a železité, zinečnaté, manganaté, hlinité a manganisté. Výhodně jsou soli amonné, vápenaté, hořečnaté, draselné a sodné. K příkladům farmaceuticky přijatelných organických bází vhodných pro vytváření solí karboxylové skupiny patří organické aminy jako je např. trimethylamin, triethylamin, tri-n-propylamin, dicyklohexylamin, β-dimethylaminoethanol, tris-hydroxymethylaminomethan, triethanolamin, β-diethylaminoethanol, arginin, lysin, histidin, A-ethylpiperidin, hydrabamin, cholin, betain, ethylendiamin, glukosamin, methylglukamin, theobromin, puriny, piperaziny, piperidiny, kofein a prokain.

Kyselé adiční soli polypeptidů je možné připravit konvenčním způsobem tak, že se polypeptid přivede do kontaktu s jedním nebo několika ekvivalenty požadované anorganické nebo organické kyseliny jako např. kyseliny chlorovodíkové. Soli karboxylových skupin peptidu mohou být připraveny obvykle tak, že se peptid přivede do kontaktu s jedním nebo několika ekvivalenty požadované báze, jako je např. hydroxid kovu, např. hydroxid sodný, nebo uhličitan či hydrogenuhličitan kovu, jako je např. uhličitan sodný nebo hydrogenuhličitan sodný, nebo aminová báze, jako je např. triethylamin nebo triethanolamin.

Vynález se dále týká farmaceutických přípravků obsahujících nový fůzní polypeptid podle předkládaného vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem. Nosičem je výhodně sterilní, apyrogenní parenterálně přijatelná kapalina. Voda, fyziologický roztok, vodný roztok dextrózy a glykoly jsou výhodné kapalné nosiče nebo rozpouštědla, zvláště (pokud jsou izotonické) pro injikovatelné roztoky. Přípravky mohou být také v lyofilizované formě.

Přípravky lze podávat systémově, tj. parenterálně (např. intramuskulámě, intravenózně, subkutánně nebo intradermálně) nebo je lze podávat intraperitoneálně. Pro parenterální podávání je výhodné, když jsou fůzní polypeptidy nezbytně rozpustné v séru nebo plazmě, např. alespoň 1 mg polypeptidu je rozpustný v 1 ml séra nebo plazmy.

Přípravky mohou být podávány také známými způsoby pro topické podávání. Příkladem vhodné lékové formy je sprej, oftalmický roztok, nazální roztok a mast. Tak např. sprej se může připravit tak, že se peptid rozpustí ve vhodném rozpouštědle a umístí se do tlakové nádobky, kde slouží jako aerosol pro obecně užívanou inhalační terapii. Oftalmický nebo nazální roztok se připraví tak, že se rozpustí aktivní složka v destilované vodě, přidají se požadované pomocné látky, jako je pufr, izotonické činidlo, zahušťovadlo, prezervativ, stabilizátor, surfaktant a antiseptikum, a pH se nastaví na hodnotu 4 až 9. Masti se mohou získat tak, že se připraví sloučenina z polymerního roztoku, jako např. 2% vodného karboxyvinylového polymeru, a báze, jako např. 2% hydroxidu sodného, přičemž smícháním se získá gel, který se smíchá s určitým množstvím purifikovaného fúzního polypeptidu.

Přípravek se výhodně podává subkutánně nebo intravenózně, ale nejčastěji subkutánně.

Předkládaný vynález se dále týká způsobu léčení alergických stavů, který spočívá v tom, že se podává terapeuticky účinné množství fúzního polypeptidu podle vynálezu nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, pacientovi, který takové ošetření potřebuje. Tento způsob léčení se provádí v průběhu alergického stavu (pokud je požadováno zmírnění symptomů) nebo jako souvislé nebo proíylaktické ošetření (tj. před spuštěním očekávané poruchy zprostředkované IgE nebo receptorem IgE jako je např. alergická reakce).

Účinná dávka výše zmíněná je závislá na řadě faktorů, které je nutno brát v úvahu, jako je např. závažnost léčeného stavu, věk, pohlaví a stav subjektu, délka léčení a účinnost konkrétního fúzního polypeptidu, tedy faktorech, které lze stanovit obvyklými způsoby.

- 17CZ 297634 B6

Vzhledem k tomu, že jednotlivé subjekty se velmi liší co se týče množství jejich IgE (a také protilátek k FcsRI), terapeuticky účinná dávka se dá nejlépe vyjádřit jako dávka ležící v rozmezí 5xl0² až lxlO⁴ násobku celkového obsahu sérového IgE a protilátek k FcsRI, v molárním měřítku. Pacient může být léčen pomocí jedné dávky denně nebo několika dávkami denně. Přípravek může být také podáván měsíčně (nebo v týdenních intervalech, pokud je to vhodnější), a to také v jedné dávce nebo několika dávkách.

Pro průměrný subjekt (70 kg) vhodná měsíční dávka může ležet v rozmezí 0,5 mg za měsíc až 500 mg za měsíc, výhodně v rozmezí 1 mg až 300 mg za měsíc, nejvýhodněji přibližně 20 mg až 250 mg za měsíc fúzního polypeptidu podle vynálezu, jako je např. dimer uvedený v příkladu 7, vhodně podávaný v dělených dávkách jednou nebo dvakrát za měsíc. Vyšší dávky v rozmezí přibližně 500 mg za měsíc až 2 g za měsíc mohou být indikovány v případě pacientů s vysokou sérovou koncentrací IgE v časných fázích léčení.

Dávkování a čas podávání mohou být různé. Na počátku lze podávat přípravek ve vyšších dávkách v rozmezí uvedeném výše a také častěji, než v pozdější fázi léčení nemoci. Vhodné dávkování lze stanovit na základě měření obsahu IgE a protilátek k FceRI v séru pacienta, jak bylo zmíněno výše. Tak např. v časné fázi nemoci, fúzní polypeptid podle vynálezu, jako je např. dimer uvedený v příkladu 7, se může průměrnému pacientovi (70 kg) podávat v týdenních dávkách 200 až 500 mg. Po clearance sérového IgE a protilátek k FceRI se může léčebný režim změnit na ošetření jednou za týden nebo jednou za dva týdny s dávkami v rozmezí 50 μ až 100 mg polypeptidu při jednom ošetření.

Přípravky podle vynálezu mohou být podávány samotné nebo v kombinaci s jinými sloučeninami podle předkládaného vynálezu nebo s dalšími farmaceutickými agens jako jsou antihistaminika nebo kortikosteroidy.

Vynález se dále týká použití fúzních polypeptidů podle vynálezu v diagnostických testech in vitro v libovolném provedení, např. jako ELISA test, pro stanovení hladiny IgE nebo autoprotilátek proti FcsRI (např. u pacientů s chronickou kopřivkou) v biologických vzorcích získaných z lidských pacientů, jako jsou např. vzorky krve nebo tkání. Složka HSA výhodně umožňuje vazbu a detekci IgE nebo autoprotilátek proti FceRI v testu ELISA. Množství IgE a autoprotilátek přítomných ve vzorku může sloužit jako míra alergické odpovědi pacienta na látku, které byl pacient vystaven. Hladina IgE nebo autoprotilátek se také mohou měřit pro stanovení účinnosti antialergické terapie a také pro monitorování alergologického stavu pacienta v průběhu času.

Vynález se dále týká způsobu provádění genové terapie lidí pomocí polynukleotidu kódujícího fúzní polypeptid podle vynálezu pro léčení poruch zprostředkovaných IgE nebo receptory IgE. Způsoby genové terapie spočívají v tom, že se modifikuje buňka pacienta tím, že se do ní zavede polynukleotid kódující fúzní polypeptid podle vynálezu a pak se v takové buňce exprimuje tento polypeptid. Tak např. somatické buňky se nejdříve vyjmou z pacienta, pak se geneticky modifikují v kultuře tím, že se do nich vloží polynukleotid, a výsledné modifikované buňky se znovu vloží do pacienta, což vede k tomu, že polypeptid podle vynálezu je exprimován v buňkách pacienta. Alternativně buňky mohou být modifikovány in vivo přímým vložením vektoru DNA, který kóduje polypeptid.

Vhodnými buňkami pro modifikaci jsou endotelové buňky nebo leukocyty. Pro potřeby genové terapie je výhodně polynukleotid podle vynálezu řízen regulovatelným (např. indukovatelným) promotorem. Jestliže se použije známý regulovatelný promotorový systém, exprese polypeptidu je pak závislá na expozici pacienta exogennímu faktoru.

Vynález se také týká využití způsobů genové terapie pro přípravu somatických rekombinant (jiných než lidských) nebo transgenních zvířat, které exprimují fúzní polypeptid podle vynálezu,

- 18CZ 297634 B6 např. do mléka. Taková modifikovaná zvířata (kromě člověka) jsou také předmětem vynálezu. Příkladem vhodného zvířete je myš, krysa, králík, prase, ovce, koza a kráva, jejichž transgenní formy připravené standardním způsobem jsou známy (D. R. Hurwitz et al., Transgenic Research 3, 1994, 365-375). Zvířata lze využívat jako modely nebo pro skutečnou produkci proteinu. Vynález se zvláště týká transgenní myši, kozy, krávy nebo prasete, exprimujících fúzní polypeptid podle vynálezu. Způsoby, jak připravit taková transgenní zvířata, jsou známy. Polynukleotid kódující fúzní protein podle vynálezu může být vložen do somatických buněk zvířete, buďto in vitro, nebo in vivo, čímž se vytvoří somatické rekombinanty, které jsou geneticky modifikované, ale nemohou genetickou modifikaci předat na potomstvo. Alternativně se může polynukleotid vložit do buněk embrya a připravit tak transgenní zvířata, která předají schopnost exprimovat proteiny podle vynálezu na potomstvo.

Transfekce buněk pro genovou terapii se může provést obvyklým způsobem, např. elektroporací, kalciumfosfátovou precipitaci, metodou s pomocí Lipofectinu, intramuskulámí injekcí, mikroinjekcí nebo bombardováním mikročásticemi pomocí tzv. „gene gun“. Vektory založené na plazmidech výhodně obsahují markér, jako je např. neomycinový gen pro selekci stabilních transfektant pomocí cytotoxického aminoglykosidu G418 v eukaryotických buňkách.

Infekci lze provést vložením genové sekvence pro fúzní polypeptid do retrovirového vektoru. V oboru jsou pro takové vnesení genu známy různí způsoby. Velmi užívaným postupem je např. použití defektního myšího retroviru jako balicího (pakážovacího) retroviru a amfotropní pakážovací buněčnou linii pro přípravu infekčního amfotropního viru pro použití k infekci cílových donorových buněk.

Další charakterizaci lze provést následujícím způsobem.

Stanovení sérového poločasu in vivo

Obecný postup

Samice myší SKHl/hr/hr Charles River o hmotnosti přibližně 25 g byly injikovány intravenózně testovaným proteinem naředěným ve sterilním PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺. Myši pak byly rozděleny do následujících skupin:

-skupina (I) dostala 130 pg (1 nmol) fúzního polypeptidu, např. dimeru IgE^R-L|-HSAII-L₂IgE^R připraveného podle příkladu 7, nebo

-skupina (II) dostala 60 pg IgE^R (2 nmol), nebo

-skupina (III) dostala 65 pg HSA I (1 nmol).

Z každé myši se odebralo 100 pl séra 10 a 30 minut, 3, 6 a 12 hodin po injekci. Sérum bylo připraveno centrifugací. Koncentrace různých proteinů v séru byla stanovena a) ELISA testem s receptory IgE, b) inhibičním ELISA testem anebo c) sendvičovým ELISA testem.

a) ELISA test s IgE®

Sérová koncentrace IgE byla stanovena detekcí vazby IgE následujícím sendvičovým ELISA testem: 200 ng lidského IgE byla imobilizováno na 8 jamkových destičkách COSTAR Strip Plate (Cambridge, MA, USA) ve 100 pl pokrývacího pufru ve zvlhčované komůrce při 4 °C přes noc. Každá jamka pak byla vypláchnuta 300 pl PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ o pH 7,2. Pak byly destičky blokovány jednu hodinu při teplotě místnosti 200 pl PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺ obsahujícího 0,05% Tween 20 (PBST). Vzorky, naředěné ve 100 pl myšího séra naředeného 1:10 PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺, byly přidány a inkubovány po jednu hodinu při teplotě místnosti.

Pak byly jamky propláchnuty 300 pl PBS a inkubovány se 100 pl (1 ng) monoklonální protilátky proti lidskému IgE receptoru 5H5/F8 po 1 hodinu při teplotě místnosti. A opět byly jamky

- 19CZ 297634 B6 propláchnuty dvakrát 300 μΐ PBST a inkubovány se 100 μΐ kozí anti-myší IgG-HRP (Biorad, ředění 1:2000 v PBS bez Ca²⁺ a Mg²⁺) po 1 hodinu při teplotě místnosti. Destičky pak byly opláchnuty třikrát 300 μΐ PBST a konjugát křenové peroxidázy (HRP) byl detekován pomocí 100 μΐ ABTS (Biorad) substrátu. Reakce byla zastavena po 5 minutách 100 μΐ 3% kyseliny šťavelové. Intenzita zabarvení byla měřena fotometrem EASY READER při 405 nm.

b) Inhibiční ELISA test

100 ng FceRla bylo imobilizováno na imunodestičku Nunc s 96 jamkami (F96 Maxisorb) ve 100 μΙ pokrývacího pufru (0,lM NaHCO₃, 0,01% NaN₃, pH 9,6) ve zvlhčované komůrce při 4 °C přes noc. Každá jamka pak byla propláchnuta 4 x 300 μΐ PBS s 0,05% Tween 20 (promývací pufr). Dvě různé sady jamek, negativní kontrola (50 μΐ myšího séra naředěného 1:25 v PBS, 0,05 %Tween 20, 2% FCS) a ředicí řada standardu fúzního polypeptidu lgE^R-L|-HSAII-L₂-lgE^R(ředění od 400 ng/ml do 1,6 ng/ml) nebo ředicí řada testovaného vzorku byly přidány. Standardy a testovaný vzorek byly naředěny myším sérem naředěným 1:25 PBS, 0,05% Tween 20, 2% FCS. Bezprostředně poté bylo přidáno 50 μΐ konjugátu lidský IgE/biotin v koncentraci 400 ng/μΙ v ředicím pufru. Výsledné ředění myšího séra v inkubačním pufru bylo 1:50.

Po inkubaci 2 hodiny při 37 °C byly destičky propláchnuty 4x 300 μΐ proplachovacího pufru, bylo přidáno 50 μΐ konjugátu streptavidin-alkalická fosfatáza (Gibco) naředěného 1:1000 v ředicím pufru a pak se inkubovaly 1 hodinu při 37 °C. Pak byly destičky opět propláchnuty 4x 300 μΐ proplachovacího pufru a po přidání 100 μΐ substrátu (lmg/ml p-nitrofenylfosfát v diethanolaminovém pufru pH 9,8 (Biorad)) byla reakce po inkubaci 30 minut ve 37 °C zastavena 50 μΐ 2M NaOH. Optická denzita (OD) byla měřena fotometrickým zařízením B10MEK-1000 při 405 nm. Kvantitativní vyhodnocení ze standardní křivky (proložení 4 parametrové logistické funkce) bylo provedeno pomocí programu firmy Beckman pro vyhodnocování IMMUNOFIT ELISA. Výpočet byl proveden tak, že: % vazby= (OD vzorku nebo standardu/OD pufru) x 100.

c) Sendvičový ELISA test

500 ng monoklonální anti-myší HSA (HSA-9) bylo imobilizováno na imunodestičku Nunc s 96 jamkami (F96 Maxisorb) ve 100 μΐ pokrývacího pufru (0,lM NaHCO₃, 0,01% NaN₃, pH 9,6) ve zvlhčované komůrce při 4 °C přes noc. Každá jamka pak byla propláchnuta 4 x 300 μΐ promývacího pufru (PBS s 0,05% Tween 20). Bylo přidáno 100 ml myšího séra naředěného 1:100 (PBS, 0,05% Tween 20%, 2% FCS = ředicí pufr) jako negativní kontrola, nebo 100 μΐ standardu (1 pg/ml až 2 ng/ml) lidského sérového albuminu, KABI) nebo 100 μΐ testovaného vzorku naředěného myším sérem naředěným 1:100. Po inkubací 2 hodiny při 37 °C byly destičky propláchnuty 4x 300 μΐ proplachovacího pufru, bylo přidáno 100 μΐ konjugátu králičí anti-HSA-Biotin naředěného ředicím pufrem na koncentraci 1 ng/μΙ. Konjugát anti-HSA-Biotin byl purifikován imunoafinitní chromatografií s CH-Seph4B-HSA a křížová reaktivita s myším sérem byla odstraněna imunosorpcí na agaróze s myším sérem. Po inkubaci 2 hodiny při 37 °C byly destičky opět propláchnuty 4x 300 μΐ proplachovacího pufru a bylo přidáno 50 μΐ konjugátu streptavidinalkalická fosfatáza (Gibco) naředěného 1:1000 v ředicím pufru a pak se inkubovaly 1 hodinu při 37 °C. Pak byly destičky opět propláchnuty 4x 300 μΙ proplachovacího pufru a po přidání 100 μΐ substrátu (1 mg/ml p-nitrofenylfosfát v diethanolaminovém pufru pH 9,8 (Biorad)) byla reakce po inkubaci 15 minut ve 37 °C zastavena 50 μΐ 2M NaOH. Optická denzita (OD) byla měřena fotometrickým zařízením BIOMEK-1000 při 405 nm. Kvantitativní vyhodnocení ze standardní křivky (proložení 4parametrové logistické funkce) bylo provedeno pomocí programu firmy Beckman pro vyhodnocování IMMUNOFIT ELISA.

Výsledky:

Koncentrace dimemího fúzního polypeptidu IgE^R-L|-HSAlI-L₂-IgE^R, volného IgE^R(označovaného zde jako „volný alfa-řetězec“) nebo HSAI (zde označovaného HSA) v závislosti na uplynulém čase po injekci jsou uvedeny v jednotkách pmol/ml séra na obr. 1A a 1B.

-20CZ 297634 B6

Obr. 1B ukazuje, že volný receptor v myším séru je detekovatelný jen po 10 minut, zatímco dimerní fúzní polypeptid je stále ještě detekovatelný asi 12 hodin po podání.

Obr. 1C ukazuje kinetiku relativní clearance HSA a dimerního fúzního polypeptidu. Po ustálení distribuce v krvi a tkáních po prvních 10 minut projevují dimer a HSA téměř shodné křivky clearance. To potvrzuje, že sérový poločas IgE-vazebné domény může být podstatně prodloužen fúzí s HSA.

Inhibice pasivní kožní anafylaxe (PCA) u myši

Obecný postup

Podání polypeptidu

Fúzní polypeptid IgE^R-L|-HSAII-L₂-lgE^R ředěný na 10, 50 nebo 500 pg/kg, získaný z buněk COS v příkladu 7, byl intravenózně injikován do samic myší SKHl/hr/hr Charles River o hmotnosti přibližně 25 g v různých intervalech před alergizací.

Byly tak vytvořeny 3 skupiny myší v závislosti na tom, kolik bylo injikováno polypeptidu před alergizací (tj. 10, 50 nebo 500 pg/kg). Čtvrtou skupinu tvořily kontrolní myši, kterým bylo intravenózně injikováno 200 pg/kg PBS místo polypeptidu. Každá z těchto čtyř skupin byla rozdělena na 3 podskupiny, které se lišily intervaly mezi intravenózní injekcí sloučeniny a intrakutánní alergizaci pomocí IgE (tj. krok b) v následujícím popisu). Testované intervaly byly 5, 15 a 30 minut.

Intrakutánní alergizace

Anestezované myši byly alergizovány do kůže na zádech 4 intradermální injekcemi po 5 ng monoklonální protilátky anti-dinitrofenyl (DNP) IgE v 10 ml PBS (BioMarker, Rehovot, Israel). V kontrolní skupině byl injikován fyziologický roztok intradermálně do jednoho místa.

Alergenní provokace minut po alergizací byly myši opět podrobeny anestezi a pak jim byl injikován intravenózně roztok obsahující 50 pg dinitrofenyl-hovězi sérový albumin (DNP-BSA) (Calbiochem-Behring, San Diego, USA) obsahující 1% Evansovu modř. Odpověď PCA byla kvantifikována měřením průměru zabarvení testovacího místa díky extravasaci.

Výsledky:

Výsledky pro zralý fúzní polypeptid podle příkladu 7 jsou znázorněny sloupcovým grafem na obr. 2 (aminokyseliny Val₂₆ až Leu₉₇s sekvence id. č. 3). Při koncentraci 500 pg/kg dimerní fúzní polypeptid úplně blokuje PCA ve všech časech aplikace. Při 50 pg/kg aplikace 30 minut před výzvou vede ke statisticky významnému snížení o 36 %. Při 15 minutách před výzvou je vidět trend při podání jak 10 tak 50 pg/kg dimeru. Tudíž dimerní fúzní polypeptid je účinný v prevenci PCA.

Postupy a techniky k provedení předkládaného vynálezu jsou v oboru známé. Proto zde nejsou samostatně popsány, neboť sloučeniny, reagencie, vektory, buněčné linie atd., které je třeba použít, jsou snadno dostupné neboje lze získat obvyklým způsobem z dostupného materiálu nebo lze připravit obdobný materiál obvyklým způsobem ze známého a dostupného materiálu.

Následující neomezující příklady ilustrují vynález. Všechny teploty jsou uvedeny ve stupních Celsia.

-21 CZ 297634 B6

Příklady provedení vynálezu

Materiál a metody

Amplifikace PCR:

Chemická syntéza de novo primerů vynálezu může být provedena za použití jakékoliv vhodné metody, například fosfotriesterové nebo fosfodiesterové metody.

Metody a systémy pro amplifíkaci specifické sekvence nukleové kyseliny jsou popsány v US io 4 683 195 a US 4 683 202 a v Polymerase Chain Reaction, H. A. Erlich et al., Cold Spring

Harbor Laboratory Press (1989).

Po PCR jsou fragmenty DNA vyříznuty a purifikovány za použití laboratorního protokolu QiaEx (Qiagen, lne. Chatsworth, CA, USA), poté jsou subklonovány do vektoru TA (TA Cloning® Kit 15 (Invitrogen) (návod k použití produktu, verze 2.2). Primery použité pro tvorbu nukleových kyselin amplifikovaných metodou PCR jsou uveden v obr. 8. DNA je sekvencována za použití metody se Sequenase (USB, Cleveland, OH, USA).

Plazmidy a reagencie:

cDNA klon FceRIa, pGEM-3-11 OB—1 (A. Shimizu et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85, 19071911, 1988) byl získán z Američan Type Tissue Collection (ATTC šarže č. 67566). Jednovláknová cDNA z lidských jater je získána od Clontech (PCR-ready Quick Cloně cDNA, č. kat. D 7113-1). Sekvence HSA je dostupná pod přístupovými čísly v GEnBAnk V00495, J00078, L00132 a L00133. Restrikční enzymy byly získány od Boehringer-Mannheim nebo Gibco/BRl.

Taq DNA polymeráza je získána Perkin-Elmer Cetus (PECI) nebo od Boehringer-Mannheim. Vektor SK byl získán od Stratagene.

Plazmid pHIL-D2 je dostupný od Invitrogenu (San Diego, CA, USA, č. kat. K1710—01, 1994) (viz „Pichia Expression Kit - Protein Expression - A Manual of Methods for Expression of 30 Recombinant Proteins in Pichia pastoris - Version 3.0“ (prosinec 1994) (dále zmiňován jako „Invitrogen Manual“).

Vektor pXMT3 pochází z pMT2 (Sambrook et al., eds., 1989, výše) klonováním Pstl do klonovacího místa EcoRI z pUC8 (Pharmacia) do míst Pstl a EcoRI z pMT2 (R. J. Kaufman et al., 35 1987, výše).

A: Klonovací vektor TA

Plazmid pCR2 je odděleně ligován s každým z amplifikačních produktů PCR získaných v příkladech 1 a 2. Ligační reakce jsou provedeny za použití DNA ligázy T4 v následující reakční 40 směsi:

mM Tris-HCl (pH 7,8) mM MgCI₂ mM DTT mM ATP

50 ng vektorová DNA

100-200 ng PCR reakčních produktů (nepurifikovaných) jednotky DNA ligázy T4 (New England Biolabs)

Každá reakční směs se udržuje v 15 °C 18 hodin před transformací do kompetentních buněk.

-22CZ 297634 B6

Příklad 1

Amplifikace PCR a klonování cDNA FceRIoc cDNA FcsRIa je purifikována z pGEM-3-11 OB—1 za použití metody Qiagen.

A) pro přípravu základního konstruktu HSA se provedla amplifikace PCR cDNA FceRla s oligonukleotidy č. 19 a č. 19 (obr. 4,8) za použití následující reakční směsi:

μΐ (50 ng) cDNA FceRla pmol každého z oligonukleotidů č. 18 a 19 μ! 1 Οχ pufru PCR (PECI)

0,5 μΐ 20 mM zásobního roztoku = 200 μΜ konečná koncentrace dNTP

0,5 μΐ (2,5 U) Taq polymerázy (PECI) voda do 50μ1

Reakční směs byla převrstvena minerálním olejem pro zabránění odpaření a podrobena teplotním cyklům v termocykleru Perkin Elmer Cetus DNA model 480. Podmínky cyklování pro tuto reakci jsou: zahřát na 95° 5 minut, pak 30 cyklů 94° po 1,5 minutu, 53° po 2 minuty, 72° po 3 minuty, následováno tříminutovou extenzí v 72° a ve 4° přes noc.

Po elektroforéze byl amplifikovaný produkt o velikosti -500 potvrzen barvením ethidiumbromidem. Fragment byl subklonován do vektoru PCR2, čímž vznikl plazmid pEK.1 kódující IgE^R (obr. 4, 8B).

B) Pro přípravu konstruktu s vedoucím IgE se provedla amplifikace FceRIa cDNA stejně jako v A) kromě toho, že se užily oligonukleotidy č. 20 a č. 31 (obr. 8B). Po elektroforéze v 0,7% agarózovém gelu byl amplifikovaný produkt velikosti asi 600 bp potvrzen obarvením ethidiumbromidem. Fragment pak byl subklonován do vektoru PCR2, čímž vznikl IgER/TA#l kódující pre-lgE^R.

C) Pro přípravu konstruktu kódujícího pre-IgE^R, který by exprimoval zralý, zkrácený protein pro použití v kontrolních testech, byla opět provedena amplifikace PCR jako v A) s oligonukleotidy č. 20 ač. 19. (obr. 8B). Po elektroforéze v 0,7% agarózovém gelu byl amplifikovaný produkt velikosti asi 620 bp potvrzen obarvením ethidiumbromidem. Fragment byl pak vyříznut a subklonován do vektoru PCR II, čímž vznikl IgERFL/TA#34 kódující pre-lgE^R následovaný stopkodonem (obr. 4).

Příklad 2

Amplifikace PCR a klonování cDNA lidského sérového albuminu

Pro získání sekvence kódující prepro-HSA II byla provedena PCR s úplnou cDNA lidského sérového albuminu s oligonukleotidy č. 24 a 25 (obr. 8B) podle obecného postupu popsaného v příkladu 1 (A). Výsledný klon HSA/TA#1 měl sekvenci velmi blízkou sekvenci vGenBank. V tomto klonu bylo zjištěno 7 mutací v kolísavé poloze a jedna mutace, která vedla k záměně lysinu na kyselinu glutamovou v aminokyselinové poloze 1333. Mutace v kolísavých pozicích byly: báze 309 - změna A na T, báze 744 - změna A na G, báze 795 - změna G na A, báze 951 - změna G na A, báze 1320 - změna C na T, báze 1569. Změna A na C, báze 1584 změna G na A (podle HSA/TA#1). Mutace lysinu na kyselinu glutamovou byla uvedena do souladu se sekvencí GenBank tím, že byla opravena místně cílenou mutagenezí pomocí oligonukleotidů uvedených na obr. 8A a soupravy pro mutagenezi in vitro Mutagene Phagemid kit (Bio-Rad, katalog, č. 170-3581). Tato metoda spočívá v inkorporaci uracilového zbytku do parentálního řetězce a v jeho následném odstranění v mutovaném řetězci (T. A. Kunkel, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82, 1985, 488-492). Vzhledem ktomu, že bodové mutace v kolísavé poloze nemění nativní amino

-23CZ 297634 B6 kyselinovou sekvencí kódovaného proteinu, výše zmíněných sedm mutací nebylo opravováno. Po elektroforéze v 0,7% agarózovém gelu byl amplifikovaný produkt velikosti asi 1,8 kb potvrzen obarvením ethidiumbromidem.

Tento produkt velikosti 1,8 kb byl subklonován do vektoru pCR2, čímž vznikl HSA/TAmut#16, u něhož bylo ověřeno sekvencováním DNA, že obsahuje úplnou sekvenci prepro-HSA II. HSA/TAmut#l6 byl subklonován do plazmidu Bluescript SK jako Spěl, HindlI fragment, čímž byl vytvořen HSA/SK#17.

io A) Pro přípravu konstruktu s vedoucím HSA byl HSA/SK#17 naštěpen Msti a HindlII, aby se odstranily sekvence kódující 3'-koncovou aminokyselinu (Leu₆₀9), pak byl na 3'-konec linearizovaného HSA/SK#17 vložen oligonukleotidový linker L2 popsaný výše, tak, že se oligonukleotidy č. 28 a 29 (obr. 8B) ošetřily kinázou, přichytily a pak se tyto fragmenty ligovaly do míst Mstl/HindllI linearizovaného HSA/SK#17, čímž vznikl pEK7 kódující prepro-HSA II fúzovaný 15 s L2 (obr. 8B). DNA získaná minipreparaci byla kontrolována štěpením BamHI a sekvencováním.

B) Pro přípravu konstruktu s vedoucím IgE byl HSA/SK#17 kódující prepro-HSA II amplifikován PCR s oligonukleotidy č. 26 a 27 (obr. 5, 8). Oligonukleotid č. 26 odstraňuje prepro-sekven- ci z HSA a přidává sekvenci linkeru LI na 5'-konec HSA. Oligonukleotid č. 27 končí přirozeně se vyskytujícím místem Ncol v nukleotidové pozici 800 kódující sekvence HSA. Amplifikace PCR byla provedena postupem popsaným v příkladu 1(A). Fragment, který byl izolován elektroforézou a soupravou Qia, byl subklonován do vektoru pCR2, čímž vznikl klon HSA Nco/TA#13, jehož sekvence byla ověřena sekvencováním DNA. Ncol-Notl fragment z tohoto klonu byl 25 subklonován do HSA/SK&17 naštěpeného Ncol a Notl, čímž byl vytvořen plazmid HSA/SK&5 (obr. 5), který kóduje L| napojený na 5'-konec cDNA kódující HSA II.

C) Pro expresi samotného HSA byl použit konstrukt HSA/SKňl 7 popsaný v předchozím textu.

Příklad 3

Fúzní konstrukt HSA-IgER/SK#22 kódující prepro-HSA + linker + IgE^R

Plazmidy pEK7 (obsahující prepro-HSA II cDNA + oligonukleotid pro L₂) a pEKl (obsahující 35 ígE^R) byly naštěpeny BamHI a Sáli. Fragment velikosti 1,8 kb získaný zpEK7 byl ošetřen fosfatázou, a pak spojen s fragmentem velikosti 550 bp získaným zpEKl. DNA z jediné pozitivní minipreparace č. 23 byla kontaminována neznámým plazmidem, což zabránilo izolaci pásu HSA-IgE^R. Byl proto z minipreparace č. 23 izolován Spel-Sall fragment velikosti 2,4 kb obsahující spojené HSA-lgE^R a fragment velikosti 2,9 kb obsahující zbytek vektorové DNA, 40 které byly opět spojeny dohromady, a tak vznikl klon HSA-lgE/SK#49 (obr. 9) (Vektorová místa chyběla na obou koncích subklonovaného úseku, tudíž Spel-Sall fragment z HSA-IgE/SK#49 velikosti 2,4 kb byl subklonován do plazmidu Bluescript SK naštěpeného Spěl a Sáli, čímž vznikl HSA-IgE/SK#22 (není ukázán na obr.).

Sekvence spojení HSA a linkeru s DNA IgE receptoru a sekvence konců celého fúzovaného genu ve vektorové DNA byly v plazmidu HSA-IgE/SK#22 podle očekávání, jak bylo ověřeno sekvencováním DNA.

Příklad 4

Fúzní konstrukt IgE-HSA/SK#l kódující IgE® + prepro-HSA II

-24CZ 297634 B6

Plazmidy HSA/SK#5 a Ige^R/TA byly naštěpeny Sstl a Nhel. Fragment z lgE/TA#l velikosti 600 bp byl purifikován gelovou elektroforézou a ligován do naštěpeného a fosfatázou ošetřeného plazmidu HSA/SK#5, čímž vznikl klon lgE-HSA/SK#1 (obr. 10).

Příklad 5

Fúzní konstrukt R-H-R/SK#50 kódující pre-lgE^R-Li-HSAIl-L₂-lgE^R

Místo Pstl jedinečné pro úsek HSA v IgE-HSA/SK#l a HSA-IgE/SK#49 bylo využito ke spojení IgE^R a prepro-HSAII prostřednictvím oligonukleotidu pro L₂. Plazmidy HSAIgE^R/SK#49 a Bluescript byly štěpeny Pstl a Sáli. Fragment velikosti 1,2 kb obsahující 3'-úsek HSAI1, linker a sekvenci IgE^R byl ligován do plazmidu Bluescript naštěpeného Pstl a Sáli, což vedlo ke vzniku plazmidu HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37 (obr. 11), který byl naštěpen Pstl a KpnI a byl izolován fragment velikosti 1,2 kb.

DNA IgE^R-HSA/SK#l byla naštěpena Pstl a KpnI a fragment velikosti 4,8 kb obsahující vektor, lgE^R, linker a 5'-část HSA byl izolován, ošetřen fosfatázou a ligován s fragmentem velikosti 1,2 kb z plazmidu HSA-IgE^R Pst Sal/SK#37. Tak byl získán výsledný dimemí konstrukt R-HR/SK&50 (obr. 11).

Příklad 6

Monomemí fúzní polypeptidy HSAlI-L2-IgE^R připravené transfekci a kultivaci Pichiapastoris

Plazmid MB#2 kódující HSAII-L2-IgE^R byl připraven naštěpením plazmidu HSA/SK#49 EcoRI a izolací fragmentu velikosti 2,4 kb, který kóduje fúzní protein. Tento fragment byl ligován do jedinečného místa EcoRI expresního vektoru pHlL-D2 (Invitrogen) Pichiapastoris, poté co byl plazmid pHIL-D2 naštěpen EcoRI a ošetřen alkalickou fosfatázou. Výsledný plazmid MB#2 byl linearizován štěpením Notl a byl transformován do buněk his4GSI 15 podle návodu v již zmíněné příručce firmy Invitrogen. Transformanty His+ byly vybírány podle růstu na methanolu. Kmeny vykazující pomalý růst na methanolu byly pěstovány dále na minimálním glycerolovém médiu podle návodu v příručce Invitrogen až do stacionární fáze, pak byly centrifugo vány a přemístěny do úplného média s methanolem a ponechány růst po 4 dny. Supematant z kultury pak byl testován pomocí EL1SA na přítomnost HSA nebo na schopnost vázat IgE. IgE-vazebná schopnost produktu získaného sekrecí z P. pastoris byla shodná s koncentrací HSA (vyjádřeno na molární bázi) a produkt byl biologicky plně aktivní.

Příklad 7

Dimemí fúzní polypeptidy IgE^R-Li-HSAII-L₂-IgE^R připravené transfekci a kultivací Pichia pastoris

Plazmid pXMT3-RIa-HSA-RIa (obsahující polynukleotid sekvence id. č. 4 kódující IgE^R-L]HSAII-L₂-IgE^R) byl připraven naštěpením plazmidu R-H-R/SK#50 (viz příklad 5) EcoRI a izolací fragmentu velikosti 3 kb, který kóduje dimemí fúzní protein. Tento fragment byl ligován do jedinečného místa EcoRI plazmidu pXMT3, poté co byl plazmid pXMT3 naštěpen EcoRI a ošetřen alkalickou fosfatázou.

Výsledný plazmid byl transfekován do buněk CHO DUKX Bil. Tyto buňky postrádají funkční gen dhfr (dihydrofolát-reduktázu), nezbytný pro syntézu nukleosidů. Proto se buňky udržovaly na médiu Alfa+ (MEM Alfa+ médium s ribonukleosidy a deoxyribonukleosidy, Gibco) obsahujícím 10% fetální telecí sérum (FCS). Pro transfekci byly buňky dvakrát opláchnuty v PBS bez Ca⁺⁺ a Mg’^T (CMF-PBS) a koncentrace buněk byla nastavena na 2x10⁶ buněk/ml v CMF-PBS. 0,8 ml buněčné suspenze se přidalo k 15gg plazmidové DNA. Transfekce byla provedena

-25 CZ 297634 B6 elektroporací pomocí zařízení BioRad Gene Pulser (napětí 1000V, kapacita 25 pF). Po transfekci byly buňky pěstovány po 3 dny v 15 ml média Alfa+ s 10% FCS.

Gen dhfr lokalizovaný na plazmidu pXMT3 dovoluje selekci rekombinantních buněk v médiu 5 chudém na nukleosidy. 3 dni po transfekci byly buňky přemístěny do média Alfa'- (MEM Alfa médium bez ribonukleosidů a deoxyribonukleosidů, Gibco) obsahujícího 10% dialyzovaného fetálního telecího séra (FCSD). Po dvou týdnech kultivace byly viditelné rekombinantní buněčné kolonie. Buňky byly po další 4 pasáže udržovány v Alfa médiu obsahujícím 10% FCSD, než byla zahájena amplifikace genu.

V přítomnosti methotrexátu (MTX) se gen dhfr a geny s ním spojené amplifikují, což vede ke zvýšené expresi transgenu. Proto selekce rekombinantních buněk v médiu chudém na nukleosidy je následována kultivací v přítomnosti 20nM MTX v Alfa médiu obsahujícím 10% FCSD. Další amplifikace se dosáhne postupným zvyšováním methotrexátu na 100 a 500 nM MTX.

Protein se připravuje tak, že se vysejí buňky Tl/3-500nM do rolerových lahví s Alfa médiem obsahujícím 10% FCS (Gibco) v hustotě 9xl0³/cm³. První supematant se sebere 5 dní po zaočkování a pak se médium změní na Alfa-. Podruhé se sebere supematant o 3 dny později, což celkem představuje 1 1 supematantu pro purifikaci.

Druhá dávka je purifikována ze 2 1 supematantu sebraného z kultury Tl/3-500nM adaptované na růst bez přítomnosti séra. Buňky se vysejí v hustotě 5x10⁴ buněk/ml a supematant se sebere 6 dní po zaočkování.

Příklad 8

Purifikace fúzního proteinu

Supematant z kultury v příkladu 7 byl purifikován imunoafinitní chromatografií na imobilizova30 né monoklonální protilátce anti-FceRIa (např. 5H5-F8, myší IgGl), připravené a purifíkované standardním způsobem.

a) Příprava chromatografického nosiče

Monoklonální protilátka je navázána na sefarózu 4B aktivovanou CNBr (Pharmacia, Uppsala, 35 Švédsko) v hustotě 10 mg protilátky/1 ml gelu podle pokynů výrobce. Přebytečné reakční skupiny jsou poté blokovány atanolaminem a pryskyřice je před použitím uchovávána v PBS s 0,02% NaN₃.

b) Afinitní chromatografie

Čirý supematant z kultury se nanesl na 5ml sloupec s protilátkou ekvilibrovaný s PBS průtokem 0,5 ml/min. Absorbovaný materiál se eluoval roztokem: 50mM kyselina citrónová, 140 mM NaCl, pH 2,70. Frakce obsahující protein byla okamžitě upravena na pH 7,0 (pomocí NaOH) a pak sterilně filtrována.

c) Kvantifikace/charakterizace

Koncentrace dimemího fúzního polypeptidu byla určena absorpcí při 280 nm pro nativní konformaci v 30mM 3-N-morfolinopropansulfonové kyselině (MOPS) o pH 7,0 a pro denaturovanou formu v 6M guanidin-HCI. Odpovídající molámí absorpční koeficienty byly vypočteny na základě počtu tryptofanových, tyrosinových a cysteinových zbytků pomocí tabulkových hodnot 50 absorpčních koeficientů těchto aminokyselin v modelových sloučeninách a pak byly korigovány rozdíly v optické hustotě uspořádaného (složeného) a neuspořádaného proteinu. Fúzní protein obsahoval 17 zbytků tryptofanu, 40 tyrosinu a 21 cystinu, což vedlo k hodnotě teoretického extinkčního koeficientu 150840 M 'cm'¹. Kvalita purifíkovaného materiálu byla hodnocena

-26CZ 297634 B6 standardní elektroforézou na SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE), automatickým sekvencováním N-konce Edmanovou degradací v plynné fázi a hmotovou spektroskopií. Výsledky SDS-PAGE (obr. 15) ukazují podle migrace zjevnou molekulovou hmotnost polypeptidu 140 kDa, což představuje asi 28% glykosylaci (teoretická molekulová hmotnost bez glykosylace 5 je 108 863,61 Da).

Seznam sekvencí (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 257 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

-27CZ 297634 B6

Met 1

Ala

Pro

Ala

Met 5

Glu

Ser

Pro Thr

Leu Leu Cys 10

Val

Ala

Leu 15

Leu

Phe

Ala

Pro

Asp

Gly

Val

Leu

Ala

Val

Pro

Gin

Lys

Pro

Lys

Val

20

25

30

Ser

Leu

Asn

Pro

Trp

Asn

Arg

Ile

Phe

Lys

Gly

Glu

Asn

Val

Thr

35

40

45

Leu

Thr

Cys

Asn

Gly

Asn

Phe

Glu

Val

Ser

Thr

Lys

Trp

c n

60

Phe

His

Asn

Gly

Ser

Leu

Ser

Glu

Thr

Asn

Ser

Leu

Asn

Ile

6 5

70

75

80

Val

Asn

Ala

Lys

Phe

Glu

Asp

Ser

Gly

Glu

Tyr

Lys

Cys

Gin

His

Gin

85

90

95

* Π

Val

Asn

Glu

Ser

Glu

Pro

Val

Tyr

Leu

Glu

Val

Phe

Ser

Asp

Trp

100

105

110

Leu

Gin

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

Met

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

115

120

125

Phe

Leu

Arg

Cys

His

Gly

Trp

Arg

Asn

Trp

Asp

Val

Tyr

Lys

Val

Ile

130

135

140

Tyr

Lys

Asp

Gly

Glu

Ala

Leu

Lys

Tyr

Trp

Tyr

Glu

Asn

His

Asn

145

150

155

160

Zle

Ser

Σ Σ 2

Thr

Asn

Ai a

’Τ'λ V*

Val

Glu

Aso

Ser

Gly

Thr

Tyr

Tvr

Cys

165

170

175

-

Gly

Lys

Val

Trp

Gin

Leu

Asp

Tyr

Glu

Ser

Glu

Pro

Leu

Asn

Zle

18 0

185

190

Thr

V a 1

Zle

Lys

Aid

Pro

Arg

Glu

Lys

Tyr

Trp

Leu

Gin

Phe

Ile

195

200

205

Pro

Leu

Val

Zle

Leu

Phe

Ala

Val

Asp

Thr

Gly

Leu

Phe

Ile

210

215

220

Ser

T«*x*

Gin

Val

Thr

Phe

Leu

Lys

Ile

Lys

Arg

Thr

Arg

225

230

235

240

Lys

Gly

Phe

Arg

Leu

Asn

Pro

His

Pro

Lys

Pro

Asn

Pro

Lys

Asn

245

250

255

As η

257 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 609 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

-28CZ 297634 B6 (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

MeL 1

Lys

Trp

Val

Thr 5

Phe

Ile

Ser

Leu

Leu 10

Phe

Leu

Phe

Ser

Ser 15

Ala

Tyr

Ser

Arg

Gly

Val

Phe

Arg

Asp

Ala

His

Lys

Ser

Glu

Val

Ala

20

25

30

His

Arg

Phe

Lys

Asp

Leu

Gly

Glu

Asn

Phe

Lys

Al a

Leu

Val

Leu

35

40

45

Ile

Ala

Phe

Ala

Gin

Tyr

Leu

Gin

Cys

Pro

Phe

Glu

Asp

His

7 a 1

50

55

60

Lys

Leu

Val

Asn

Glu

Val

Thr

Glu

Phe

Ala

Lys

Thr

Cys

Val

Ala

Asp

65

7 0

75

80

Glu

Ser

Ala

Glu

Asn

Cys

Asp

Lys

Ser

Leu

His

TU

Leu

Phe

Glv

Asp

85

90

95*

Lys

Leu

cys

Thr

7a 1

Ala

Thr

Leu

Arg

Glu

Tyr

Gly

Glu

Met

Ala

100

105

110

Asp

Cys

Ala

Lys

Gin

Glu

Pro

Glu

Arg

Asn

Glu

Cys

Phe

Leu

Gin

115

120

125

His

Lys

Asp

Asn

Pro

Asn

Leu

Pro

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Glu

Val

130

135

140

Asp

Val

Met

cys

Thr

Ala

Phe

His

Asp

Asn

Glu

Thr

Phe

Leu

Lys

145

150

155

160

Lys

Tyr

Leu

Tyr

Glu

Ile

Ala

Arg

His

Pro

Tyr

Phe

Tyr

Al a

Pro

165

170

175

Glu

Leu

Phe

Ala

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Cys

130

185

190

Cys

Gin

Ala

Asp

Lys

Ala

Cys

Leu

Pro

Lys

Leu

Asp

Glu

195

200

205

Leu

Arg

Asp

Glu

Gly

Lys

Ala

Ser

Al a

Lys

Gin

Arg

Leu

Lys

Cys

220 215 220

-29CZ 297634 B6

Al 3

Ser

Leu

Gin

Lys

Phe

Gly

Glu

Arg

Ala

Phe

Lys

Ala

Trp

Ala

Val

225

230

235

240

Al a

Arg

Leu

Ser

Gin

Arg

Phe

Pro

Lys

Ala

Glu

Phe

Ala

Glu

Val

Ser

245

250

255

Lys

Leu

Val

Thr

Asp

Leu

Thr

Lys

Val

His

Thr

Glu

Cys

His

Gly

260

265

270

Asp

Leu

Glu

Cys

Ala

Asp

Arg

Ala

Asp

Leu

Ala

Lys

Tyr

Ile

275

280

285

Cys

Glu

Asn

Gin

Asp

Ser

Ile

Ser

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

cys

Glu

290

295

3ύΰ

Lys

Pro

Leu

Glu

Lys

Ser

His

Cys

Ile

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

305

310

315

320

Glu

Met

Pro

Ala

Asp

Leu

Pro

Ser

Leu

Ala

Asp

Phe

Val

Glu

Ser

325

330

335

Lys

Asp

Val

cys

Lys

Asn

Tyr

Ala

Glu

Ala

Lys

Asp

Val

Phe

Leu

Gly

340

345

350

Met

Phe

Leu

Tyr

Glu

Tyr

Ala

Arg

His

Pro

Asp

Tyr

Ser

Val

355

360

365

Leu

Arg

Leu

Ala

Lys

Thr

Tyr

Glu

Thr

Leu

Glu

Lys

Cys

370

37 5

380

Cvs

n.1 a

Ala

Asp

Pro

His

Glu

Cys

Tyr

Ala

Lys

Val

Phe

Asp

Glu

3 35

390

395

400

Phe

Lys

Pro

Leu

val

Glu

Pro

Gin

Asn

Leu

Ile

Lys

Gin

Asn

Cys

405

410

415

Glu

Leu

Phe

Lvs

Gin

Leu

Gly

Glu

Tvr

Lys

Phe

Glr.

Asn

Ala

Leu

420

425

430

Val

Arg

Tyr

Thr

Lys

Val

Pro

Gin

Val

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

435

440

445

Glu

Val

Ser

Arg

Asn

Leu

Gly

Lys

Val

Gly

Ser

Lys

Cys

Lys

His

450

455

460

Pro

Glu

Ala

Lys

Arg

Met

Pro

Cys

Ala

Glu

Asp

Tyr

Leu

Ser

Val

465

470

475

480

Leu

Asn

Gin

Leu

Cys

Val

Leu

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Val

Ser

Asp

Arg

485

490

495

Val

Thr

Lys

Cys

Thr

Glu

Ser

Leu

Val

Asn

Arg

Pro

Cys

Phe

500

505

510

Ser

Ala

Leu

Glu

Val

Asp

Glu

Thr

Tyr

Val

Pro

Lys

Glu

Phe

Asn

Ala

515

520

525

Glu

Thr

Phe

Thr

Phe

His

Ala

Asp

Ile

Cys

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Glu

530

535

540

Arg

Glr.

Ile

Lys’

Lys

Gin

Thr

Ala

Leu

Val

Glu

Leu

Val

Lys

His

Lys

545

550

555

560

-30CZ 297634 B6

Pro

Lys

Ala

Thr

Lys

Glu

Gin

Leu

Lys

Ala

Val

Met

Asp

Phe

Ala

565

570

575

Ala

Phe

Val

Glu

Lys

Cys

Lys

Ala

Asp

Lys

Glu

Thr

Cys

Phe

580

585

590

Ala

Glu

Gly

Lys

Leu

Val

Ala

Ser

Gin

Ala

Leu

Gly

595

600

605

Leu

609 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 978 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: protein (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

Mg ** 2

A 1 3

Pro

Ala

Met 5

Glu

Ser

Pro

'T''-» V

Leu 10

Leu

Cys

Val

Ala

Leu 15

Leu

Pne

Phe

Ala

Pro 20

Asp

Gly

Val

Leu

Al a 25

Val

Pro

Gin

Lys

Pro 30

Lys

Val

Ser

Leu

Asn 35

Pro

Trp

Asn

Arg 40

Ile

Phe

Lys

Gly

Glu 45

Asn

Val

Thr

Leu

Thr 50

Cys

Asn

Gly

Asn

Asn 55

Phe

Glu

Val

Ser 60

Ser

Thr

Lys

Trp

Phe 65

His

Asn

Gly

Ser

Leu 70

Ser

Glu

Thr

Asn 75

Ser

Leu

Asn

Ile 80

Val

Asn

Ala

Lys

Phe 85

Glu

Asp

Ser

Gly

Glu 90

Tyr

Lys

Cys

Gin

His 95

Gin

Val

Asn

Glu 100

Ser

Glu

Pro

Val

Tyr 105

Leu

Glu

Val

Phe

Ser 110

Asp

Trp

Leu

Leu 115

Gin

Ala

Ser

Ala

Glu 120

Val

Met

Glu

Gly 125

Gin

Pro

Leu

Phe

Leu 130

Arg

Cys

His

Gly

Trp 135

Arg

Asn

Trp

Asp

Val 140

Tyr

Lys

Val

Ile

Tyr 145

Tyr

Lys

Asp

Gly

Glu 150

Ala

Leu

Lys

Tyr

Trp 155

Tyr

Glu

Asn

His

Asn 160

-31 CL 297634 B6

Ile

Ser

Ile

Thr

Asn

Ala

Thr

Val

Glu

Asp

Ser

Gly

Thr

Tyr

Cys

165

170

175

Thr

Gly

Lys

Val

Trp

Gin

Leu

Asp

Tyr

Glu

Ser

Glu

Pro

Leu

Asn

Ile

180

185

190

Thr

Val

Ile

Lys

Ala

Pro

Arg

Glu

Lys

Tyr

Trp

Leu

Ala

Ser

Gly

195

200

205

Gly

Ser

Asp

Ala

His

Lys

Ser

Glu

Val

Ala

His

Arg

Phe

Lys

Asp

210

215

220

Leu

Gly

Glu

Phe

Lys

Ala

Leu

Val

Leu

Ile

Ala

Phe

Ala

Gin

225

230

235

240

Tyr

Leu

Gin

Cys

Pro

Phe

Glu

Asp

His

Val

Lys

Leu

Val

Asn

Glu

245

250

255

Val

Thr

Glu

Phe

Ala

Lys

Thr

Cys

Val

Ala

Asp

Glu

Ser

Ala

Glu

Asn

260

2ó5

270

Cys

Asp

Lys

Ser

Leu

His

Thr

Leu

Phe

Gly

Asp

Lys

Leu

Cys

Thr

Val

275

280

285

Aid

Thr

Leu

Arg

Glu

Thr

Tyr

Gly

Glu

Met

Ala

Asp

Cys

Ala

Lys

290

295

300

Gin

Glu

Pro

Glu

Arg

Asn

Glu

Cys

Phe

Leu

Gin

His

Lys

Asp

Asn

305

310

315

320

Pro

Asn

Leu

Pro

Arg

Leu

Val

Arg

Pro

Glu

Val

Asp

Val

Met

Cys

Thr

325

330

335

Ala

Phe

His

Aso

Asn

Glu

Thr

Phe

Leu

Lys

Tyr

Leu

Tvr

340

345

350

Zle

Ala

Arg

His

Pro

Tyr

Phe

Tyr

AI a

Pro

Glu

Leu

Phe

255

360

365

Ala

Lys

Arg

Tyr

Lys

Ala

Phe

Thr

Glu

Cys

Gin

Ala

Asp

370

375

380

Lys

Ala

Cys

Leu

Pro

Lys

Leu

Asp

Glu

Leu

Arg

Asp

Glu

Gly

385

390

395

400

Lys

Ala

Ser

Ala

Lys

Gin

Arg

Leu

Lys

Cys

Ala

Ser

Leu

Gin

Lys

405

410

415

Phe

Gly

Glu

Arg

Ala

Phe

Lys

Ala

Trp

Ala

Val

Ala

Arg

Leu

Ser

Gin

420

425

430

Arg

Phe

Pro

Lys

Ala

Glu

Phe

Ala

Glu

Val

Ser

Lys

Leu

Val

Thr

Asp

435

440

445

Leu

Thr

Lys

Val

His

Thr

Glu

Cys

His

Gly

Asp

Leu

Glu

Cys

450

455

460

Ala

Asp

Arg

Ala

Asp

Leu

Ala

Lys

Tyr

Ile

Cys

Glu

Asn

Gin

Asp

465

470

475

480

Ser

Ile

Ser

Lys

Leu

Lys

Glu

Cys

Glu

Lys

Pro

Leu

Glu

485

490

495

-32CZ 297634 B6

Lys

Ser

His

Cys

Ile

Ala

Glu

Val

Glu

Asn

Asp

Glu

Met

Pro

Ala

Asp

500

505

510

Leu

Pro

Ser

Leu

Ala

Asp

Phe

Val

Glu

Ser

Lys

Asp

Val

Cys

Lys

515

520

525

Asn

Tyr

Ala

Glu

Ala

Lys

Asp

Val

Phe

Leu

Gly

Met

Phe

Leu

Tyr

Glu

530

535

540

Tyr

Ala

Arg

His

Pro

Asp

Tyr

Ser

Val

Leu

Arg

Leu

545

550

555

560

Ala

Lys

- J

Glu

Thr

Lev

G1 υ

T.vs

Tys

Cys

Ala

Asp

565

570

575

Pro

His

Glu

Cys

Tyr

Ala

Lys

Val

Phe

Asp

Glu

Phe

Lys

Pro

Leu

Val

580

585

590

Glu

Pro

Gin

Asn

Leu

Ile

Lys

Gin

Asn.

Cys

Glu

Leu

Phe

Lys

Gin

595

600

605

Leu

Gly

Glu

Tyr

Lys

Phe

Gin

Asn

Ala

Leu

Val

Arg

Tyr

Thr

Lys

610

615

620

Lys

Val

Pro

Gin

Val

Ser

Thr

Pro

Thr

Leu

Val

Glu

Val

Ser

Arg

Asn

625

630

63 5

640

Leu

Gly

Lys

Val

Gly

Ser

Lys

Cys

Lys

His

Pro

Glu

Ala

Lys

Arg

645

650

655

Met

Pro

Cys

Ala

Glu

Asp

iyr

Leu

Ser

Val

Leu

Asn

Gin

Leu

Cys

660

665

670

Val

Leu

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Val

Ser

Asp

Arg

Val

Thr

Lys

Cys

675

680

685

Thr

Glu

Ser

Leu

Val

Asn

Arg

Pro

Cys

Phe

Ser

Ala

Leu

Glu

Val

690

695

700

Asp

Glu

Thr

Tyr

Val

Pro

Lys

Glu

Phe

Asn

Ala

Glu

Thr

Phe

Thr

Phe

705

710

715

720

His

Ala

Asp

Ile

Cys

Thr

Leu

Ser

Glu

Lys

Glu

Arg

Gin

Ile

Lvs

Lys

725

730

735

Gin

Thr

Ala

Leu

Val

Glu

Leu

Val

Lys

His

Lys

Pro

Lys

Ala

Thr

Lys

740

745

750

Glu

Gin

Leu

Lys

Ala

Val

Met

Aso

Asp

Phe

Ala

Phe

Val

Glu

Lys

755

760

765

Cys

Lys

Ala

Asp

Lys

Glu

Thr

Cys

Phe

Ala

Glu

Gly

Lys

770

775

780

Lys

Leu

Val

Ala

Ser

Gin

Ala

Leu

Gly

Ser

Val

785

790

795

800

Pro

Gin

Lys

Pro

Lys

Val

Ser

Leu

Asn

Pro

Trp

Asn

Arg

Ile

Phe

805

810

815

Lys

Gly

Glu

Asn

Val

Tnr

Leu

Thr

Cys

Asn

Gly

Asn

Phe

Glu

820

825

830

-33CZ 297634 B6

Val

Ser

Ser 835

Thr

Lys

Trp Phe His Asn 840

Gly

Ser

Leu

Ser 845

Glu

Thr

Asn

Ser

Leu

Asn

Ile

Val

Asn

Ala

Lys

Phe

Glu

Asp

Ser

Gly

Glu

850

855

860

Tyr

Lys

Cys

Gin

His

Gin

Val

Asn

Glu

Ser

Glu

Pro

Val

Tyr

Leu

865

870

875

880

Glu

Val

Phe

Ser

Asp

Trp

Leu

Gin

Ala

Ser

Ala

Glu

Val

885

890

895

MsC

Glu

Gly

Gin

Pro

Leu

Phe

Leu

Arg

Cys

Hi s

Gly

Trp

Ara

Asn

Trp

900

yoi

9XÓ

Asp

Val

Tyr

Lys

Val

Ile

Tyr

Lys

Asp

Gly

Glu

Ala

Leu

Lys

Tyr

915

920

925

Trp

Tyr

Glu

Asn

His

Asn

Ile

Ser

Ile

Thr

Asn

Ala

Thr

Val

Glu

Asp

930

935

940

Ser

Gly

Thr

Tyr

Cys

Thr

Gly

Lys

Val

Trp

Gin

Leu

Asp

Ty*

Glu

945

950

955

960

Ser

Glu

Pro

Leu

Asn

Ile

Thr

Val

Ile

Lys

Ala

Pro

Arg

Glu

Lvs

Tyr

965

970

975

Trp Leu

97S (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 2955 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

-34CZ 297634 B6

GAATTCACCA	TGGCTCCTGC	CATGGAATCC	CCTACTCTAC	TGTGTGTAGC	CTTACTGTTC	60
TTCGCTCCAG	ATGGCGTGTT	AGCAGTCCCT	CAGAAACCTA	AGGTCTCCTT	GAACCCTCCA	120
TGGAATAGAA	TATTTAAAGG	AGAGAATGTG	actcttacat	GTAATGGGAA	CAATTTCTTT	180
GAAGTCAGTT	CCACCAAATG	GTTCCACAAT	GGCAGCCTTT	CAGAAGAGAC	AAATTCAAGT	240
TTGAATATTG	TGAATGCCAA	ATTTGAAGAC	AGTGGAGAAT	ACAAATGTCA	GCACCAACAA	300
GTTAATGAGA	GTGAACCTGT	GTACCTGGAA	GTCTTCAGTG	ACTGGCTGCT	CCTTCAGGCC	360
TCTGCTGAGG	TGGTGATGGA	GGGCCAGCCC	CTCTTCCTCA	GGTGCCATGG	TTGGAGGAAC	420
TGGGATGTGT	ACAAGGTGAT	CTATTATAAG	GATGGTGAAG	CTCTCAAGTA	CTGGTATGAG	480
AACCACAACA	TCTCCATTAC	AAATGCCACA	GTTGAAGACA	GTGGAACCTA	CTACTGTACG	540
GGCAAAGTGT	GGCAGCTGGA	CTATGAGTCT	GAGCCCCTCA	ACATTACTGT	AATAAAJVGCT	600
CCGCGTGAGA	AGTACTGGCT	TGCTAGCGGT	GGAGGTGGAT	CCGATGCACA	CAAGAGTGAG	660
GTTGCTCATC	GGTTTAAAGA	TTTGGGAGAA	GAAAATTTCA	AAGCCTTGGT	GTTGATTGCC	720
TTTGCTCAGT	ATCTTCAGCA	GTGTCCATTT	GAAGATCATG	TAAAATTAGT	GAATGAAGTA	780
ACTGAATTTG	CAAAAACATG	TGTTGCTGAT	GAGTCAGCTG	AAAATTGTGA	CAAATCACTT	840
CATACCCTTT	TTGGAGACAA	ATTATGCACA	GTTGCAACTC	TTCGTGAAAC	CTATGGTGAA	900
ATGGCTGACT	GCTGTGCAAA	ACAAGAACCT	GAGAGAAATG	AATGCTTCTT	GCAACACAAA	960
GATGACAACC	CAAACCTCCC	CCGATTGGTG	AGACCAGAGG	TTGATGTGAT	GTGCACTGCT	1020
TTTCATGACA	ATGAAGAGAC	ATTTTTGAAA	AAATACTTAT	ATGAAATTGC	CAGAAGACAT	1080
CCTTACTTTT	ATGCCCCGGA	ACTCCTTTTC	TTTGCTAAAA	GGTATAAAGC	TGCTTTTACA	1140
GAATGTTGCC	AAGCTGCTGA	TAAAGCTGCC	TGCCTGTTGC	CAAAGCTCGA	TGAACTTCGG	1200
GATGAAGGGA	AGGCTTCGTC	TGCCAAACAG	AGACTCAAGT	GTGCCAGTCT	CCAAAAATTT	1260
GGAGAAAGAG	CTTTCAAAGC	ATGGGCAGTA	GCTCGCCTGA	GCCAGAGATT	TCCCAAAGCT	1320
GAGTTTGCAG	AAGTTTCCAA	GTTAGTGACA	GATCTTACCA	AAGTCCACAC	GGAATGCTGC	1380
CATGGAGATC	TGCTTGAATG	TGCTGATGAC	AGGGCGGACC	TTGCCAAGTA	TATCTGTGAA	1440
AATCAAGATT	CGATCTCCAG	TAAACTGAAG	GAATGCTGTG	AAAAACCTCT	GTTGGAAAAA	1500
TCCCACTGCA	TTGCCGAAGT	GGAAAATGAT	GAGATGCCTG	CTGACTTGCC	TTCATTAGCT	1560
GCTGATTTTG	TTGAAAGTAA	GGATGTTTGC	AAAAACTATG	CTGAGGCAAA	GGATGTCTTC	1620
CTGGGCATGT	TTTTGTATGA	ATATGCAAGA	AGGCATCCTG	ATTACTCTGT	CGTGCTGCTG	1680
CTGAGACTTG	CCAAGACATA	TGAAACCACT	CTAGAGAAGT	GCTGTGCCGC	TGCAGATCCT	1740
CATGAATGCT	ATGCCAAAGT	GTTCGATGAA	TTTAAACCTC	TTGTGGAAGA	GCCTCAGAAT	1800
TTAATCAAAC	AAAATTGTGA	GCTTTTTAAG	CAGCTTGGAG	AGTACAAATT	CCAGAATGCG	1860
CTATTAGTTC	GTTACACCAA	GAAAGTACCC	CAAGTGTCAA	CTCCAACTCT	TGTAGAGGTC	1920
TCAAGAAACC	TAGGAAAAGT	GGGCAGCAAA	TGTTGTAAAC	ATCCTGAAGC	AAAAAGAATG	1980
CCCTGTGCAG	AAGACTATCT	ATCCGTGGTC	CTGAACCAGT	TATGTGTGTT	GCATGAGAAA	2040
ACGCCAGTAA	GTGACAGAGT	CACCAAATGC	TGCACAGAAT	CCTTGGTGAA	CAGGCGACCA	2100
tgcttttcag	CTCTGGAAGT	CGATGAAACA	TACGTTCCCA	AAGAGTTTAA	TGCTGAAACA	2160
TTCACCTTCC	ATGCAGATAT	ATGCACACTT	TCTGAGAAGG	AGAGACAAAT	CAAGAAACAA	2220
ACTGCACTTG	TTGAGCTTGT	GAAACACAAG	CCCAAGGCAA	CAAAAGAGCA	ACTGAAAGCT	2280
GTTATGGATG	ATTTCGCAGC	TTTTGTAGAG	AAGTGCTGCA	AGGCTGACGA	TAAGGAGACC	2340
TGCTTTGCCG	AGGAGGGTAA	AAAACTTGTT	GCTGCAAGTC	AAGCTGCCTT	AGGTGGAGGT	2400
GGATCCGTCC	CTCAGAAACC	TAAGGTCTCC	TTGAACCCTC	CATGGAATAG	AATATTTAAA	2460
GGAGAGAATG	TGACTCTTAC	ATGTAATGGG	AACAATTTCT	TTGAAGTCAG	TTCCACCAAA	2520
TGGTTCCACA	ATGGCAGCCT	TTCAGAAGAG	ACAAATTCAA	GTTTGAATAT	TGTGAATGCC	2580
AAATTTGAAG	ACAGTGGAGA	ATACAAATGT	CAGCACCAAC	AAGTTAATGA	GAGTGAACCT	2640
GTGTACCTGG	AAGTCTTCAG	TGACTGGCTG	CTCCTTCAGG	CCTCTGCTGA	GGTGGTGATG	2700

-35CZ 297634 B6

GAGGGCCAGC CCCTCTTCCT CAGGTGCCAT GGTTGGAGGA ACTGGGATGT GTACAAGGTG 2760 ATCTATTATA AGGATGGTGA AGCTCTCAAG TACTGGTATG AGAACCACAA CATCTCCATT 2820 ACAAATGCCA CAGTTGAAGA CAGTGGAACC TACTACTGTA CGGGCAAAGT GTGGCAGCTG 2880 GACTATGAGT CTGAGCCCCT CAACATTACT GTAATAAAAG CTCCGCGTGA GAAGTACTGG 2940 CTATAGTAAG AATTC 2955 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 1827 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité io (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

ATGAAGTGGG	TAACCTTTAT	TTCCCTTCTT	TTTCTCTTTA	GCTCGGCTTA	TTCCAGGGGT	60
GTGTTTCGTC	GAGATGCACA	CAAGAGTGAG	GTTGCTCATC	GGTTTAAAGA	TTTGGGAGAA	120
GAAAATTTCA	AAGCCTTGGT	GTTGATTGCC	TTTGCTCAGT	ATCTTCAGCA	GTGTCCATTT	180
GAAGATCATG	TAAAATTAGT	GAATGAAGTA	ACTGAATTTG	CAAAAACATG	TGTAGCTGAT	240
GAGTCAGCTG	AAAATTGTGA	CAAATCACTT	CATACCCTTT	TTGGAGACAA	ATTATGCACA	300
GTTGCAACTC	TTCGTGAAAC	CTATGGTGAA	ATGGCTGACT	GCTGTGCAAA	ACAAGAACCT	360
GAGAGAAATG	AATGCTTCTT	GCAACACAAA	GATCACAACC	CAAACCTCCC	CCGATTGGTG	420
AGACCAGAGG	TTGATGTGAT	GTGCACTGCT	TTTCATGACA	ATGAAGAGAC	atttttgaaa	480
AAATACTTAT	ATGAAATTGC	CAGAAGACAT	CCTTACTTTT	ATGCCCCGGA	ACTCCTTTTC	540
TTTGCTAAAA	GGTATAAAGC	TGCTTTTACA	GAATGTTGCC	AAGCTGCTGA	TAAAGCTGCC	600
TGCCTGTTGC	CAAAGCTCGA	TGAACTTCGG	GATGAAGGGA	AGGCTTCGTC	TGCCAAACAG	660
AGACTCAAAT	GTGCCAGTCT	CCAAAAATTT	GGAGAAAGAG	CTTTCAAAGC	ATGGGCAGTG	720
GCTCGCCTGA	GCCAGAGATT	TCCCAAAGCT	GAGTTTGCAG	AAGTTTCCAA	GTTAGTGACA	780
GATCTTACCA	AAGTCCACAC	GGAATGCTGC	CATGGAGATC	TGCTTGAATG	TGCTGATGAC	840
AGGGCGGACC	TTGCCAAGTA	TATCTGTGAA	AATCAGGATT	CGATCTCCAG	TAAACTGAAG	900
GAATGCTGTG	AAAAACCTCT	GTTGGAAAAA	TCCCACTGCA	TTGCCGAAGT	GGAAAATGAT	960
GAGATGCCTG	CTGACTTGCC	TTCATTAGCT	GCTGATTTTG	TTGAAAGTAA	GGATGTTTGC	1020
AAAAACTATG	CTGAGGCAAA	GGATGTCTTC	CTGGGCATGT	TTTTGTATGA	ATATGCAAGA	1080
AGGCATCCTG	ATTACTCTGT	CGTGCTGCTG	CTGAGACTTG	CCAAGACATA	TGAAACCACT	1140
CTAGAGAAGT	GCTGTGCCGC	TGCAGATCCT	CATGAATGCT	ATGCCAAAGT	GTTCGATGAA	1200
TTTAAACCTC	TTGTGGAAGA	GCCTCAGAAT	TTAATCAAAC	AAAACTGTGA	gctttttaag	1260
CAGCTTGGAG	AGTACAAATT	CCAGAATGCG	CTATTAGTTC	GTTACACCAA	GAAAGTACCC	1320
CAAGTGTCAA	CTCCAACTCT	TGTAGAGGTC	TCAAGAAACC	TAGGAAAAGT	GGGCAGCAAA	1380
TGTTGTAAAC	ATCCTGAAGC	AAAAAGAATG	CCCTGTGCAG	AAGACTATCT	ATCCGTGGTC	1440

-36CZ 297634 B6

CTGAACCAGT

TGCACAGAGT

TACGTTCCCA

TCTGAGAAGG

CCCAAGGCAA

AAGTGCTGCA

GCTGCAAGTC

TATGTGTGTT

CCTTGGTGAA

AAGAGTTTAA

AGAGACAAAT

CAAAAGAGCA AGGCTGACGA AAGCTGCCTT

GCATGAGAAA

CAGGCGACCA

TGCTGAAACA

CAAGAAACAA

ACTGAAAGCT

TAAGGAGACC

AGGCTTA 1

ACGCCAGTAA

TGCTTTTCAG

TTCACCTTCC

ACTGCACTTG

GTTATGGATG

TGCTTTGCCG

GTGACAGAGT

CTCTGGAAGT

ATGCAGATAT

TTGAGCTTGT

ATTTCGCAGC

AGGAGGGTAA

CACAAAATGC

CGATGAAACA

ATGCACACTT

GAAACACAAG TTTTGTAGAG

AAAACTTGTT

1500

1560

1620

1680

1740

1800 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 773 párů bází (B) TYP: nukleová kyselina (C) TYP VLÁKNA: dvojité (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: DNA (iii) HYPOTETICKÁ: ne (iv) OPAČNÁ ORIENTACE: ne (v) TYP FRAGMENTU: vnitřní (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

ATGGCTCCTG CCATGGAATC CCCTACTCTA CTGTGTGTAG CCTTACTGTT CTTCGCTCCA GATGGCGTGT TAGCAGTCCC TCAGAAACCT AAGGTCTCCT TGAACCCTCC ATGGAATAGA ATATTTAAAG GAGAGAATGT GACTCTTACA TGTAATGGGA acaatttctt tgaagtcagt TCCACCAAAT GGTTCCACAA TGGCAGCCTT TCAGAAGAGA CAAATTCAAG TTTGAATATT GTGAATGCCA AATTTGAAGA CAGTGGAGAA TACAAATGTC AGCACCAACA AGTTAATGAG AGTGAACCTG TGTACCTGGA AGTCTTCAGT GACTGGCTGC TCCTTCAGGC CTCTGCTGAG GTGGTGATGG AGGGCCAGCC CCTCTTCCTC AGGTGCCATG GTTGGAGGAA CTGGGATGTG TACAAGGTGA TCTATTATAA GGATGGTGAA GCTCTCAAGT ACTGGTATGA GAACCACAAC ATCTCCATTA CAAATGCCAC AGTTGAAGAC AGTGGAACCT ACTACTGTAC GGGCAAAGTG TGGCAGCTGG ACTATGAGTC TGAGCCCCTC AACATTACTG TAATAAAAGC TCCGCGTGAG AAGTACTGGC TACAATTTTT TATCCCATTG TTGGTGGTGA TTCTGTTTGC TGTGGACACA GGATTATTTA TCTCAACTCA GCAGCAGGTC ACATTTCTCT TGAAGATTAA GAGAACCAGG AAAGGCTTCA GACTTCTGAA CCCACATCCT AAGCCAAACC CCAAAAACAA CTG 773

120

180

240

300

360

420

480

540

600

660

720

Claims

1. Fúzní polypeptid nebo jeho sůl, který obsahuje polypeptid mající sekvenci id. č. 3 nebo polypeptid sestávající ze zbytků Val₂₆-Leu9₇₈ ze sekvence id. č. 3 fúzovaný s alespoň jednou složkou humánního sérového albuminu (HSA).

2. Izolovaný polynukleotid, který je intermediátem v přípravě polypeptidu nebo jeho soli podle nároku 1, a který obsahuje úsek Val₂6-Leu₉7₈ ze sekvence id. č. 3.

3. Způsob přípravy polypeptidu nebo jeho soli podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se

a) transformuje hostitelská buňka vektorem, který obsahuje DNA kódující polypeptid podle nároku l,

b) exprimuje polypeptid podle nároku 1 v buňce,

c) získá výsledný polypeptid z hostitelské buňky, volitelně ve formě jeho soli.

4. Vektor, který obsahuje DNA kódující polynukleotid nebo jeho sůl podle nároku 1.

5. Polypeptid podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl pro použití jako léčivo.

6. Farmaceutická kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje polypeptid podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

7. Použití fúzního polypeptidu podle nároku 1 pro výrobu léčiva pro léčení nemocí zprostředkovaných IgE nebo receptorem IgE.