CZ297873B6

CZ297873B6 - Lécivo pro osetrování nádoru

Info

Publication number: CZ297873B6
Application number: CZ0063397A
Authority: CZ
Inventors: K. Chu@Chung; Cheng@Yung-Chi
Original assignee: University Of Georgia Research Foundation, Inc.; Yale University
Priority date: 1994-09-06
Filing date: 1995-09-05
Publication date: 2007-04-18
Also published as: EP0781136B1; NZ335013A; FI970918A0; FI970918A7; OA10473A; KR970705393A; EP0781136A4; NO971015L; IS4434A; US6063787A; BR9508886A; CN1448142A; WO1996007413A1; CN1160351A; CA2199117C; IS2011B; SI0781136T1; JP3979662B2; ES2219666T3; PL188359B1

Abstract

Pouzití farmaceutické kompozice zahrnující úcinnémnozství slouceniny .beta.-L-nukleozidu obecného vzorce I, kde R.sup.1.n. a R.sup.2.n. znamenají substituenty zvolené z vodíku, acylu a C.sub.1.n. azC.sub.18.n. alkylu, nebo její farmaceuticky prijatelné soli, pro výrobu léciva pro osetrování nádoru u hostitelského zivocicha.

Description

Léčivo pro ošetřování nádorů

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti lékařské chemie a zejména (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu (označovaného také jako (-)-OddC) nebo jeho derivátu a jeho použití k léčení rakoviny u živočichů včetně lidí.

Dosavadní stav techniky

Nádor je neregulovaná desorganizovaná proliferace buněčného růstu. Nádor je maligní nebo rakovinný, má-li vlastnosti invazivity a metastázy. Invazivita označuje tendenci nádoru vstupovat do okolní tkáně prolomením spodinových desek, které definují hranice tkání, přičemž často dochází ke vstupu do oběhového systému organismu. Metastáza označuje tendenci nádoru migrovat do jiných oblastí organismu a tvořit oblasti proliferace vzdálené od místa původního výskytu.

Nyní je rakovina na druhém místě příčin úmrtí ve Spojených státech. Rakovina byla diagnostikována u více než 8 000 000 osob ve Spojených státech a očekává se 1 208 000 nových diagnóz v r. 1994. Ročně umírá v této zemi na rakovinu přes 500 000 lidí.

Rakovina není plně pochopena na molekulární úrovni. Je známo, že vystavení buňky působení karcinogenu, jako jsou určité viry, určité chemikálie nebo záření, vede ke změně DNA, která inaktivuje „supresorový“ gen nebo aktivuje „onkogen“. Supresorové geny jsou růstově regulační geny, které po mutaci již nemohou kontrolovat růst buněk. Onkogeny jsou zpočátku normální geny (nazývané proonkogeny), kterých se mutací nebo změněným kontextem exprese stanou transformační geny. Produkty transformovaných genů vyvolávají nesprávný růst buněk. Onkogeny mohou vzniknout genetickou změnou zvíce než dvaceti různých normálních buněčných genů. Transformované buňky se od normálních buněk liší v mnoha ohledech včetně buněčné morfologie, interakcí buňka-buňka, obsahu membrán, cytoskeletální struktury, sekrece bílkovin, genové exprese a mortality (transformované buňky mohou neomezeně růst).

Všechny různé buněčné typy v organismu mohou být transformovány na benigní nebo maligní nádorové buňky. Nejčastějšími místy nádorů jsou plíce, pak následuje kolorektum, prs, prostata, močový měchýř, pankreas a pak vaječník. Mezi další převládající typy rakoviny patří leukemie, rakoviny centrálního nervového systému včetně rakoviny mozku, melanom, lymfom, erythroleukemie, rakovina dělohy a rakovina hlavy a krku.

V současnosti se rakovina primárně lečí jedním z těchto tří typů terapie nebo jejich kombinací: chirurgie, ozařování a chemoterapie. Chirurgie spočívá v hrubém odstranění zasažené tkáně. Je sice někdy úspěšná při odstraňování nádorů umístěných v určitých místech, například v prsu, tlustém střevě a na kůži, avšak nelze ji použít k ošetření nádorů umístěných v jiných oblastech, jako je páteř, ani k ošetření rozptýlených neoplastických stavů, jako je leukemie.

Při chemoterapii dochází k přerušení replikace buněk nebo buněčného metabolismu. Používá se nejčastěji při léčbě leukemie, stejně jako rakoviny prsu, plic a varlat.

V současnosti se k léčbě rakoviny používá pět hlavních skupin chemoterapeutických prostředků: přírodní produkty a jejich deriváty, anthracykliny, alkylační prostředky, antiproliferativní prostředky (nazývané rovněž antimetabolity) a hormonální prostředky. Chemoterapeutické prostředky se často označují jako antineoplastické látky.

Má se za to, že působení alkylačních prostředků spočívá v alkylaci a síťování guaninu a popřípadě jiných bází v DNA a zastavení buněčného dělení. Mezi typické alkylační prostředky patří dusíkatý yperit ethyleniminové sloučeniny, alkylsulfáty, cisplatina a různé nitrosomočoviny.

-1 CZ 297873 B6

Nevýhodou těchto sloučenin je, že napadají nejen maligní buňky, ale i jiné buňky, které se dělí přirozeně, například buňky kostní dřeně, kůže, gastrointestinální sliznice a fetální tkáně.

Antimetabolity jsou typicky reversibilní nebo ireversibilní enzymové inhibitory nebo sloučeniny, které jinak interferují s replikací, translací nebo transkripcí nukleových kyselin.

Bylo identifikováno několik syntetických nukleosidů, které vykazují protirakovinnou účinnost. Známým nukleosidovým derivátem se silnou protirakovinnou účinností je 5-fluoruracil. 5-Fluoruracil je klinicky používán při léčení maligních nádorů včetně například karcinomů, sarkomů, rakoviny kůže, rakoviny zažívacích orgánů a rakoviny prsu. Vyvolává však vážné nepříznivé reakce, jako je nausea, alopecie, průjem, stomatitis, leukocytová trombocytopenie, anorexie, pigmentace a edem. Deriváty 5-fluoruracilu s protirakovinnou účinností jsou popsány v patentu US 4 336 381 a vjaponských patentových publikacích 50-50383, 50-50384, 50-64281, 51-146482 a 53-84981.

Patent US 4 000 137 uvádí, že produkt peroxidační oxidace inosinu, adenosinu nebo cytidinu methanolem nebo ethanolem má účinnost proti lymfocytické leukémii.

Cytosinarabinosid (označovaný také Cytarabin, araC a Cytosar) je nukleosidový analog deoxycytidinu, který byl poprvé syntetizován v r. 1950 a zaveden do klinické medicíny v r. 1963. V současnosti je významným léčivem v případě akutní myeloidní leukemie. Je účinný rovněž proti akutní lymfocytické leukémii a v menším měřítku je použitelný při chronické myelocytické leukémii a nehodgkinovském lymfomu. Primárním účinkem araC je inhibice syntézy jaderné DNA; Handschumacher, R. a Cheng, Y., „Purine and Pyrimidine Antimetabolites“, Cancer Medicine, kapitola XV-1,3. vyd., ed. J. Holland a d., vyd. Lea and Febigol.

5-Azacytidin je analog cytidinu, který se primárně používá při léčbě akutní myelocytické leukemie a myelodysplastického syndromu.

2-Fluoradenosin-5'-fosfát (Fludara, označovaný také FaraA) je jeden z nej účinnějších prostředků při léčbě chronické lymfocytické leukemie. Jeho působení spočívá v inhibici syntézy DNA. Působení F-araA na buňky je spojeno s hromaděním buněk na rozhraní fází Gl/S a ve fázi S: jedná se tedy o léčivo specifické pro S fázi buněčného cyklu. Zabudování aktivního metabolitu F-araATP zpožďuje prodlužování řetězce DNA. F-araA je rovněž účinným inhibitorem ribonukleotidreduktasy, klíčového enzymu odpovědného za tvorby dATP.

2-Chlordeoxyadenosin je použitelný při léčbě nižších stupňů neoplasmů B buněk, jako je chronická lymfocytická leukemie, nehodgkinovský lymfom a leukemie vlasatých buněk. Spektrum účinnosti je podobné jako u přípravku Fludara. Sloučenina inhibuje syntézu DNA v rostoucích buňkách a opravy DNA v klidových buňkách.

I když bylo identifikováno a je v současnosti používáno pro léčbu rakoviny mnoho chemoterapeutik, hledají se nové prostředky, které by byly efektivní a měly nízkou toxicitu vůči zdravých buňkám.

Cílem vynálezu je tedy nalézt sloučeniny, které vykazují protinádorovou a zejména protirakovinnou účinnost.

Dále je cílem vynálezu nalézt farmaceutické přípravky pro léčbu rakoviny.

Dále je cílem vynálezu nalézt způsob léčení rakoviny.

Podstata vynálezu

Podstatou vynálezu je použití farmaceutické kompozice zahrnující účinné množství sloučeniny β-L-nukleozidu vzorce I

-2CZ 297873 B6

NMR¹ kde

R¹ a R² znamenají substituenty zvolené z vodíku, acylu a Ci až Cig alkylu, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, ve farmaceuticky přijatelném nosiči, pro výrobu léčiva pro ošetřování nádorů u hostitelského živočicha.

R¹ a R² s výhodou představují vodík a alkylová skupina je s výhodou zvolena z methylu, ethylu, propylu, butylu, pentylu, hexylu, izopropylu, izobutylu, sek.butylu, terc.butylu a izopentylu. Acylová skupina je s výhodou -C(O)R, kde R je Ci až C₅ alkylová skupina, fenyl nebo benzyl.

Používá se účinné množství (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu (označovaného také (-)-OddC, L-OddC nebo (-)-L-OddC), jeho farmaceuticky přijatelného derivátu, včetně 5'- nebo N⁴-alkylovaného nebo acylovaného derivátu, nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, popřípadě ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

V alternativním provedení mohou být popisované sloučeniny používány pro ošetřování stavů, konkrétně jiných než nádory nebo rakovina, které zahrnují abnormální nebo nežádoucí proliferací buněk. Jako příklady je možno uvést kožní potíže, jako je hyperkeratóza (zahrnující ichtyózu, keratoderma, plochý lišej, psoriázu), bradavice, včetně genitálních, a puchýře, stejně jako jakékoli případy abnormální nebo nežádoucí buněčné proliferace, které je možno ošetřovat methotrexátem. Popisované účinné sloučeniny mohou být rovněž použity k vyvolání nebo usnadnění potratu.

Ve výhodném provedení má (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolanM-yl)cytosin formu uvedeného enantiomeru (L-enantiomeru) v podstatě bez přítomnosti odpovídajícího enantiomeru (tj. enantiomemě obohacenou formu, včetně enantioměmě čisté formy).

Má se za to, že (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin je prvním příkladem „L“ nukleosidu, který vykazuje protinádorovou účinnost. (-)-(2S,4S)-l-(2-Hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin má strukturu odpovídající vzorci Ia (Ia)Bylo zjištěno, že (-)-(2S,4R)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)-cytosin vykazuje v hostiteli významnou účinnost proti rakovinným buňkám a nízkou toxicitu vůči zdravým buňkám. Jako neomezující příklady rakoviny, kterou lze léčit pomocí této sloučeniny, je možno uvést rakovinu plic, kolorekta, prsu, prostaty, močového měchýře, nosohltanu, pankreatu, vaječníků, leukémii, lymfom, rakovinu hlavy a krku, rakovinu centrálního nervového systému (včetně rakoviny mozku), karcinom děložního čípku, melanom a hepatocelulámí rakovinu.

V alternativním provedení se použije kompozice obsahující účinné množství sloučeniny vzorce lb

-3CZ 297873 B6 kde R znamená H nebo F, a R¹ a R² znamenají substituenty vybrané ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, acyl, monofosfát, difosfát a trifosfát, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, popřípadě ve farmaceuticky přijatelném nosiči, pro výrobu léčiva pro ošetřování nádoru u hostitelského živočicha. Substituent R je s výhodou fluor a R¹ a R² představují vodík.

Přestože výhodným provedením vynálezu je použití účinných sloučenin nebo jejich derivátů nebo jejich solí v přirozeně se nevyskytující konfiguraci (konfiguraci L), mohou být popisované sloučeniny nebo jejich deriváty nebo soli alternativně podávány v přirozeně nebo jejich deriváty nebo soli alternativně podávány v přirozeně se vyskytující konfiguraci (konfiguraci D) nebo jako racemická směs.

Kterákoli ze zde popisovaných sloučenin pro použití pro léčení nádorů může být pro zvýšení účinnost terapie podávána v kombinaci s jinými protinádorovými farmaceutickými prostředky nebo alternativně k nim. Jako příklady je možno uvést přírodní produkty ajejich deriváty, anthracykliny, alkylační prostředky, antiproliferativní prostředky (nazývaní také antimetabolity) a hormonální prostředky. Konkrétně tyto prostředky zahrnují, aniž by se na ně omezovaly, dusíkaté yperity ethyleniminové sloučeniny, alkylsulfáty, cisplatinu, nitrosomočoviny, 5-fluoruracil, cytosinarabinosid, 5-azacytidin, 2-fluoradenosin-5 '-fosfát, 2-chlordeoxyadenosin, tamoxifen, aktinomycin, amsakrin, bleomycin, karboplatinu, karmustin, cyklofosfamid, cyklosporin, daunorubicin, doxirubisin, interleukin, vinblastin, růstové faktory včetně GCSF, GMCSF a faktorů růstu destiček; adriamycin, WP-16, hydroxymočovinu, etoposid; interferony α, β a ζ a vinkristin. Způsoby podávání účinných množství těchto prostředků je možno snadno stanovit neboje možno nalézt například v The Physician's Desk Reference, posl. vyd., publikováno Medical Economics Data Production Company, a Martindale, The Extra Pharmacopoeia, posl. vyd., publikováno The Pharmaceutical Press. Tyto metody je možno rutinně modifikovat pro optimalizaci účinnosti kombinací a altemační terapie.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1 uvádí hodnoty ID₅₀ (-)-OddC a kombinace (-)-OddC + THU (tetrahydrouridin, inhibitor cytidindeaminasy) na buňkách rakoviny tlustého střeva. V grafu je uvedena inhibice růstu jako procentický podíl kontroly růstu proti koncentraci (μΜ). Údaje pro (-)-OddC samotný představují plné kroužky a údaje pro (-)-OddC + THU představují trojúhelníčky.

Obr. 2 představuje závislost hmotnosti rostoucího nádoru pro myší karcinom (Colon 38), ošetřovaný dvakrát denně (-)-OddC v dávce 25 mg/kgbid. V grafu je vynesen růst nádoru jako procentický podíl původní hmotnosti nádoru proti dnům. Ošetření myší probíhalo v den 1, 2, 3, 4 a 5. Údaje pro kontrolu (bez podávání (-)-OddC představují plné kroužky a údaje pro (-)-OddC trojúhelníčky.

Obr. 3 ukazuje poměr přežití leukemických myší P388, které byly ošetřovány (-)-OddC. V grafu je vyneseno procento přežití proti dnům. Ošetření myší probíhalo v den 1, 2, 3, 4 a 5. Poměr přežití pro kontrolu (bez podávání (-)-OddC představují) plné kroužky, poměr přežití pro myši, jimž byl podáván (-)-OddC po 25 mg/kgbid dvakrát denně, trojúhelníčky a poměr přežití pro myši, jimž byl podáván (-)-OddC jednou denně po 50 mg/kgbid, prázdné kroužky.

Obr. 4 znázorňuje závislosti relativní citlivosti určitých rakovinných buněčných linií vůči (-)-OddC na základě GI50. Úsečky mířící doprava představují citlivost buněčné linie na (-)-OddC nad průměrnou citlivostí všech testovaných buněčných linií. Protože je měřítko úseček logaritmické, úsečka o velikosti 2 jednotek doprava znamená, že pro danou buněčnou linii dosáhla sloučenina GI50 při koncentraci stokrát menší než je průměrná koncentrace nutná pro všechny buněčné linie, a tato buněčná linie je tedy vůči (-)-OddC neobvykle citlivá. Úsečky mířící doleva představují odpovídajícím způsobem citlivost pod průměrem.

-4CZ 297873 B6

Obr. 5 je graf znázorňující inhibici růstu lidských nádorů pomocí (-)-OddC. Nahé myši NCr ve stáří 3 až 6 týdnů byly subkutánně inokulovány do každého boku 2.10⁶ buněk HepG2 nebo DU-145. Ošetření bylo zahájeno, když byly nádory v pokročilém stadiu růstu. Léčiva byla podávána dvakrát denně ve dny 0 až 4 a v označené dny byla měřena místa nádorů. Křivky A a B znázorňují účinek léčiva na nádory HepG2, resp. Du-145 (prázdné kroužky - kontrola, plné kroužky - AraC 25 mg/kg i.p., prázdné čtverečky (-)-OddC 25 mg/kg p.o., plné čtverečky (-)-OddC 25 mg/kg i.p.). Každý bod představuje průměr ± SD pro 10 nádorů v grafu A a 6 nádorů v grafu B.

Vynález představuje způsob a přípravek pro léčení nádorů a zejména rakoviny u lidí a jiných živočišných hostitelů, spočívající v podávání účinného množství (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu, dále definovaného derivátu této sloučeniny, zahrnujícího 5-substituovaný nebo 5'- nebo N⁴-alkylovaný nebo acylovaný derivát, nebo jejich fyziologicky přijatelné soli, popřípadě ve farmaceuticky přijatelném nosiči.

(-)-(2S,4S)-l-(2-Hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin se označuje jako „L“-nukleosid. Protože uhlíky 2 a 5 na dioxolanovém kruhu jsou chirální, mohou být jejich nevodíkové substituenty (CH2OH, resp. báze cytosinu) vůči dioxolanovému kruhovému systému buď cis (na stejné straně), nebo trans (na protilehlých stranách). Čtyři optické izomery tedy představují tyto konfigurace (je-li dioxolanová skupina orientována ve vodorovné rovině, takže kyslík v poloze 3 je vpředu): cis (s oběma skupinami „nahoře“, což odpovídá konfiguraci přirozeně se vyskytujících nukleosidů, označovaných jako ,,D“-nukleosid), cis (s oběma skupinami „dole“, což je přirozeně se nevyskytující konfigurace, označovaná jako ,,L“-nukleosid), trans (se substituentem C2 „nahoře“ a substituentem C5 „dole“) a trans (se substituentem C2 „dole“ a substituentem C5 „nahoře“). Má se za to, že (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin nebo jeho derivát je prvním příkladem „L“-nukleosidu, který vykazuje protinádorovou účinnost. Je to překvapující s ohledem na skutečnost, že tato konfigurace „L“-nukleosidu se nevyskytuje v přírodě.

Zde používaný výraz „enantioměmě obohacený“ se vztahuje na složení nukleosidu, které zahrnuje alespoň přibližně 95 a přednostně přibližně 97, 98, 99 nebo 100 % jediného enantiomerů tohoto nukleosidu. Ve výhodném provedení je (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4yl)cytosin nebo jeho derivát nebo sůl k dispozici v nukleosidovém přípravku, který je tvořen v podstatě jediným enantiomerem, tj. uvedeným enantiomerem (enantiomerem L), a je v podstatě prostý odpovídajícího enantiomerů D (tj. v enantioměmě obohacené formě včetně enantiomemě čisté formy).

Účinná sloučenina může být podávána jako jakýkoli derivát, který je při podávání příjemci schopný přímo nebo nepřímo poskytovat mateřskou sloučeninu (-)-L-OddC nebo zde na jiném místě definovaný 5-substituovaný derivát, nebo který vykazuje účinnost sám o sobě. Jako neomezující příklady je možno uvést farmaceuticky přijatelné soli (alternativně označované jako „fyziologicky přijatelné soli“) (-)-OddC, výše uvedené 5-deriváty a 5'- a N⁴-acylované nebo alkylované deriváty účinné sloučeniny (alternativně označované jako „fyziologicky aktivní deriváty“). V jednom provedení je acylová skupina ve formě esteru karboxylové kyseliny (-C(O)R), kde nekarboxylová část esterové skupiny je vybrána ze souboru zahrnujícího přímý, rozvětvený nebo cyklický alkyl (typicky C] až C₎₈, nejčastěji Ci až C₅), alkaryl, aralkyl, alkoxyalkyl, například methoxymethyl, aralkyl, například benzyl, alkyl nebo Cj až C₄ alkoxy; sulfonátové estery, jako je alkyl- nebo aralkylsulfonyl, například methansulfonyl, mono-, di- nebo trifosfátový ester, trityl nebo monomethoxytrityl, substituovaný benzyl, trialkylsilyl (například dimethyl-terc.butylsilyl) nebo difenylmethylsilyl. Arylové skupiny v esterech jsou optimálně tvořeny fenylovou skupinou.

Konkrétní příklady farmaceuticky přijatelných derivátů L-O-ddC zahrnují, avšak neomezují se na ně, sloučeniny vzorce

-5CZ 297873 B6

kde Rje F, Cl, -CH₃, -C(H)=CH₂, -C=CH nebo -C=N, -Br, -NO₂, a substituenty R| a R₂ jsou nezávisle voleny ze souboru zahrnujícího vodík, alkyl a acyl, konkrétně zahrnující, avšak neomezující se na ně, methyl, ethyl, propyl, butyl, pentyl, hexyl, izopropyl, izobutyl, sek.butyl, terc.butyl, izopentyl, amyl, terc-pentyl, 3-methylbutyryl, hydrogensukcinát, 3-chlorbenzoát, cyklopentyl, cyklohexyl, benzoyl, acetyl, pivaloyl, mesylát, propionyl, butyryl, valeryl, zbytek kyseliny kapronové, kaprylové, kaprinové, laurové, myristové palmitové, stearové, olejové a aminokyselin, zahrnující, avšak neomezující se na ně, alanyl, valinyl, leucinyl, izoleucinyl, prolinyl, fenylalaninyl, tryptofanyl, methioninyl, glycinyl, serinyl, threoninyl, cysteinyl, tyrosinyl, asparaginyl, glutaminyl, aspartoyl, glutaoyl, lysinyl, argininyl a histidinyl. Ve výhodném provedení je derivát ve formě L-enantiomeru a v podstatě prostý jeho odpovídajícího enantiomeru (tj. v enantiomemě obohacené, resp. enantioměmě čisté formě).

L-OddC nebo jeho derivát může mít formu farmaceuticky přijatelných solí. Zde používaný výraz farmaceuticky přijatelné soli nebo komplexy se vztahuje na soli nebo komplexy L-OddC nebo jeho derivátů, které si zachovávají požadovanou biologickou účinnost mateřské sloučeniny a vykazují nanejvýš minimální nežádoucí toxikologické účinky. Jako neomezující příklady takových solí je možno uvést (a) adiční soli s anorganickými kyselinami (například kyselinou chlorovodíkovou, bromovodíkovou, sírovou, fosforečnou, dusičnou apod.) a soli s organickými kyselinami, jako je kyselina octová, šťavelová, vinná, jantarová, jablečná, askorbová, benzoová, tanin, kyselina pamoová, alginová, polyglutamová, naftalensulfonová, nafitalendisulfonová a polygalakturonová, (b) adiční soli s bázemi, tvořené s kationty vícemocných kovů, jako je zinek, vápník, vizmut, baryum, hořčík, hliník, měď, kobalt, nikl, kadmium, sodík, draslík apod., nebo s organickým kationtem vytvořeným z Ν,Ν-dibenzylethylendiaminu, amonia nebo ethylendiaminu, nebo (c) kombinace (a) a (b), například zinktanátovou sůl apod.

Modifikace účinné sloučeniny, konkrétně v polohách N⁴ a 5'-O, mohou ovlivňovat rozpustnost, biodostupnost a rychlost metabolismu účinné látky, což umožňuje kontrolu uvolňování účinné látky. Dále mohou tyto modifikace ovlivnit protirakovinnou účinnost sloučeniny a v některých případech ji zvýšit oproti mateřské sloučenině. Je to možno snadno ověřit přípravou derivátu a testováním jeho protirakovinné účinnosti zde popsanými nebo jinými metodami, známými odborníkům.

Souhrnně zahrnuje vynález tyto znaky:

(a) (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin a jeho deriváty a soli, (b) (+)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l ,3-dioxolan-4-yl)cytosin a jeho deriváty a soli, (c) (-/+)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin a jeho deriváty a soli, (d) (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin a jeho deriváty a soli nebo jeho (+)-enantiomer nebo jejich racemickou směs a jejich farmaceuticky přijatelné deriváty a soli pro použití v medicínské terapii, například pro léčení nebo profylaxi nádoru, včetně rakovinného nádoru, (e) použití (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu a jeho farmaceuticky přijatelných derivátů a solí nebo jeho (+)-enantiomeru nebo jejich racemické směsi a jejich

-6CZ 297873 B6 farmaceuticky přijatelných derivátů a solí při výrobě léčiva pro ošetřování nádoru, včetně rakovinného nádoru, (f) farmaceutické formulace zahrnující (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosin a jeho farmaceuticky přijatelné deriváty a soli nebo jeho (+)-enantiomer nebo jejich racemickou směs nebo jejich farmaceuticky přijatelný derivát nebo sůl spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem, (g) způsob přípravy (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu, který zahrnuje (i) reakci popřípadě chráněného cytosinu s 1,3-dixolanem vzorce A

L

kde R]_a je vodík, nebo chránící skupina hydroxylu, včetně acylové skupiny, a L je snadno odštěpitelná skupina, a případné odstranění chránící skupiny hydroxylu, (ii) reakci sloučeniny vzorce B

(B) kde R_]a má výše uvedený význam, s prostředkem sloužícím k přeměně oxoskupiny v poloze 4 uracilového kruhu na aminoskupinu, a odstranění zbylých chránících skupin za vzniku požadovaného produktu, (h) způsob přípravy (-) nebo (+)-enantiomeru (2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4yl)cytosinu, který zahrnuje podrobení sloučeniny nebo jejího derivátu (například 5'-esteru) ve formě směsi (-) a (+)-enantiomeru působení podmínek nebo činidel (například příslušného enzymu), sloužících k oddělení enantiomerů, a je-li to nutné, převedení vzniklého derivátu na mateřskou sloučeninu. Alternativně je možno směs nechat procházet kolonou pro chirální kapalinovou chromatografii, která dělí enantiomery tohoto typu, (i) způsob přípravy (2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu, který zahrnuje reakci chráněného 1,3-dioxolanu vzorce

s chráněnou cytosinovou bází, která je popřípadě substituována v poloze 5, s použitím Lewisovy kyseliny, která neracemizuje produkt, jako je trimethylsilyltriflát.

S ohledem na způsob (g) (i) zahrnuje chránící skupina pro hydroxyl dále podrobněji popsané chránící skupiny, mezi něž patří acyl (například acetyl), arylacetyl (například benzoyl nebo substituovaný benzoyl), trityl nebo monomethoxytrityl, benzyl nebo substituovaný benzyl, trisubstituovaný silyl, včetně trialkylsilylu (například dimethyl-terc.butylsilyl) nebo difenylmethylsilyl. Cytosinová sloučenina může být popřípadě chráněna trisubstituovanými silylovými skupinami. Chránící skupiny je možno odstranit běžným způsobem. Snadno odštěpitelná skupina L je typická skupina tohoto typu, známá v oboru chemie nukleosidů, například halogen, jako je chlor, fluor, tosyl, mesyl, triflát nebo brom, alkoxy, jako je methoxy nebo ethoxy, nebo acyl, jako je acetyl nebo benzoyl.

Reakci způsobu (g) (i) je možno provádět v organickém rozpouštědle (například 1,2-dichlormethanu nebo acetonitrilu) v přítomnosti Lewisovy kyseliny, jako je SnCfl, chlorid titanu nebo trimethylsilyltriflát.

Sloučeniny vzorce A (kde L představuje acylovou skupinu, například acetylovou skupinu) je možno připravit reakcí sloučeniny vzorce C

kde R]_a má výše uvedený význam, s redukčním činidlem, například lithiumaluminiumhydridem, s následujícím působením vhodného běžného činidla pro požadovaný meziprodukt, například anhydridu karboxylové kyseliny, například acetanhydridu, pro acylaci, chloračních nebo bromačních činidel pro halogenaci nebo alkylačních činidel.

Sloučeninu vzorce C je možno připravit reakcí sloučeniny vzorce D

(E) /

s HOCH2CO2H při zvýšené teplotě.

Sloučeninu vzorce E je možno připravit ozonolýzou allyltheru nebo esteru vzorce CH2=CHCH₂-OR nebo dietheru nebo diesteru 2-buten-l,3-diolu vzorce ROCH₂-CH=CH-CH₂OR, kde Rje chránící skupina, jako je alkylová, silylová nebo acylová skupina.

S ohledem na způsob (g) (ii) je možno na sloučeninu vzorce C působit 1,2,4-triazolem spolu s 4-chlorfenyldíchlorfosfátem, za vzniku odpovídající 4-( 1,2,4-triazolyl)-sloučeniny, která se pak reakcí například s methanolem převede na požadovanou 4-amino(cytidinovou) sloučeninu.

Výchozí látky vzorců B a C je možno připravit například reakcí vhodné (popřípadě chráněné) báze se sloučeninou vzorce A analogickým způsobem jako u způsobu (g) (i). Uráčil a cytosin jsou komerčně dostupné u firmy Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI 53233, USA.

L-OddC nebo jeho derivát je možno převést na farmaceuticky přijatelný ester reakcí s vhodným esterifikačním činidlem, například acylhalogenidem nebo anhydridem. L-OddC nebo jeho farmaceuticky přijatelný derivát může být na farmaceuticky přijatelnou sůl převeden běžným způsobem, například působením vhodné báze. Ester nebo sůl je možno na mateřskou sloučeninu převést například hydrolýzou.

-8CZ 297873 B6

V alternativním provedení mohou být zde popisované sloučeniny používány k ošetřování stavů, zejména jiných než nádory nebo rakovina, které zahrnují abnormální nebo nežádoucí proliferaci buněk. Jako příklady je možno uvést kožní potíže, jako je hyperkeratóza (zahrnující ichtózu, keratoderma, plochý lišej a psoriázu), bradavice, včetně genitálních, a puchýře stejně jako jakékoli případy abnormální buněčné proliferace, které je možno ošetřovat methotrexátem. Popisované účinné sloučeniny mohou být rovněž použity k vyvolání nebo usnadnění potratu.

Vynález tak rovněž zahrnuje (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan^l-yl)cytosin a jeho deriváty a soli nebo jeho (+)-enantiomer nebo jejich racemickou směs a jejich farmaceuticky přijatelné deriváty a soli pro použití v medicínské terapii, například pro léčení nebo profylaxi abnormální nebo nežádoucí proliferace buněk, stejně jako použití (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan^l-yl)cytosinu a jeho farmaceuticky přijatelných derivátů a solí nebo jeho (+)-enantiomeru nebo jejich racemické směsi a jejich farmaceuticky přijatelných derivátů a soli při výrobě léčiva pro ošetřování abnormální nebo nežádoucí proliferace buněk.

Příklady provedení vynálezu

I. Příprava účinných sloučenin (-)-L-OddC a jeho deriváty je možno připravovat výše uvedeným způsobem, metodou podrobně popsanou v mezinárodní patentové přihlášce WO 92/18517, zveřejněné 29. 10. 1992, způsobem znázorněným na dále uvedeném schématu 1 a popsaným v dále uvedených příkladech provedení nebo jakoukoli jinou metodou, známou odborníkům. Tyto nebo jiné známé metody mohou být upraveny pro přípravu derivátů L-OddC, uvedených v příkladech.

Schéma 1: Syntéza (-)-OddC

0.J N HC1

100°C

1) Ni!O., MeOH HjO. O<

Pb(OAc)4 THF RT

2) ΝαΒΗ.

6CR-H)

SilyW«ulbíz<*·

TMSOTT

CíCHjCHja

0°C

(B ^c N«»cecykytosio

35*) tO (B N-Kjetyicytočo 33*)

ΝΗ,/MeOH RT

NH/MeOH RT

(B «cyUMÚi )

(B - cytaen )

-9CZ 297873 B6

Příklad 1

Příprava 6-anhydro-L-gulózy

6-Anhydro-L-gulóza byla připravena v jednom stupni zL-gulózy působením kyseliny, například 0,5N HC1, na gulózu, v 60% výtěžku (Evans, Μ. E., a d., Carbohydr. Res. (1973), 28, 359). Bez selektivního chránění, jak již bylo popsáno (Jeong, L. S. a d., Tetrahedron Lett. (1992), 33, 595, a Beach, J. W. a d., J. Org. Chem. (1992, v tisku) byl (2) převeden přímo oxidací NaIO₄na dioxolantriol (3), který byl po redukci NaBH₄ bez izolace převeden na izopropylidenový derivát (4). Benzoylací na (5), sejmutím ochranných skupin na (6) a oxidací diolu (6) byla získána kyselina (7). Oxidační dekarboxylací (7) pomocí Pb(OAc)₄ v suchém THF vznikl v dobrém výtěžku acetát (8) jako klíčový meziprodukt. Acetát byl kondenzován s požadovanými pyrimidiny (například silylovaným thyminem a N-acetylcytosinem) v přítomnosti TMSOTf za vzniku směsi α,β, která byla rozdělena na sloupci silikagelu za vzniku jednotlivých izomerů (9 a 10). Debenzoylací methanolickým amoniakem vznikl požadovaný (-)-OddC (11).

Příklad 2

Příprava (-)-1,6-anhydro-a,L-gulopyranózy (2)

Směs L-gulózy (1) (33 g, 0,127 mol) a 0,5N HC1 (330 ml, 0,165 mol) byla 20 h zahřívána k varu pod zpětným chladičem. Směs byla ochlazena a neutralizována na pH 6 s použitím pryskyřice (Dowex-2, HCO₃-forma) s probubláváním vzduchem. Pryskyřice byla recyklována promytím 10% HC1, vodou, methanolem, vodou a nasyceným roztokem NaHCO₃. Reakční směs byla přefiltrována a pryskyřice byla promyta vodou (500 ml). Spojený filtrát byl zkoncentrován do sucha a přes noc sušen za sníženého tlaku. Zbytek byl přečištěn na sloupci (hloubka 5 cm, silikagel, mesh, CHC1₃-CH₃OH 10:1) a poskytl světle žlutou pevnou látku, který překrystalováním z absolutního alkoholu poskytla bezbarvou pevnou látku (2) [R_f = 0,43 (CHC1₃-CH₃OH 5:1), 7,3 g 35,52 %]. Získaná L-gulóza (R_f = 0,07, 11 g) byla recyklována a byla získána látka (2) (5 g, celkový výtěžek 60 %): t.t. 142,5 až 145 °C, 'HNMR (DMSO-d₆) δ 3,22-3,68 (m, 4H, H-2, -3, —4 a -6a), 3,83 (d, J_6b>6a⁼ 7,25 Hz, IH, Hb-6), 4,22 (pseudo t, J5i6a = 4,61 a 4,18 Hz, H, H-5), 4,46 (d, J2-OH,2 = 6,59 Hz, IH, 2-OH, vyměnitelný s D2O), 4,62 (d, J3 oh,3 ⁼ 5,28 Hz, IH, 3-OH, vyměnitelný s D2O), 5,07 (d, J₄ oh,4 ⁼ 4,84 Hz, IH, 4-OH, vyměnitelný s D2O), 5,20 (d, J1>2 = 2,19 Hz, IH, H-l). [a]D²⁵ -50,011 (c’ 1,61, CH3OH).

Příklad 3

Příprava (-)-(1 'S,2S,4S)-4-(l, 2-dihydroxyethyl-l,2-O-izopropyliden)-2-hydroxymethyl)dioxolanu (4)

Roztok NaIO₄ (22,36 g, 0,1 mol) ve vodě (300 ml) byl po kapkách v průběhu 10 min přidáván k roztoku (2) (11,3 g, 0,07 mol) v methanolu (350 ml), chlazenému na 0 °C. Směs byla mechanicky míchána po dobu 15 min. K této směsi byl přidán NaBH₄ (7,91 g, 0,21 mol) a reakční směs byla míchána 10 min při 0 °C. Byla odfiltrována bílá pevná látka a tato látka byla promyta methanolem (300 ml). Spojený filtrát byl neutralizován 0,5N HC1 (~ 200 ml) a zkoncentrován do sucha. Zbytek byl sušen přes noc za sníženého tlaku. Sirupovitý zbytek byl s použitím mechanického míchadla (5 h) triturován se směsí methanol-aceton (1:5, 1200 ml) a byla odfiltrována bílá pevná látka (1. podíl). Filtrát byl zkoncentrován do sucha a zbytek byl rozpuštěn v acetonu (500 ml) a pak byla přidána kyselina p-toluensulfonová (6,63 g, 0,035 mol). Po 6 h míchání byla směs neutralizována triethylaminem, byla odfiltrována pevná látka (2. podíl) a filtrát byl zkoncentrován do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v ethylacetátu (350 ml) a promyt vodou (50 ml x 2), vysušen (MgSO₄), přefiltrován a odpařením byl získán surový (4) (3,6 g) jako nažloutlý sirup. Vodná vrstva byla zkoncentrována do sucha a vysušena za sníženého tlaku. Získaná pevná látka (1. a 2. podíl) byla spojena s vysušenou vodnou vrstvou a recyklována mícháním po dobu 1 h v

-10CZ 297873 B6

10% methanol-acetonu (900 ml) a kyselině p-toluensulfonové (5,6 g). Surová látka (4) byla přečištěna v suché koloně nad silikagelem (CHCI3-CH3OH l%-5%) na látku (4) [Rf = 0,82 (CHCI3-CH3OH 10:1), 8,8 g, 61,84 %] jako bezbarvý olej. ’HNMR (DMSO-d₆) δ 1,26 a 1,32 (2 x s, 2 x 3H, izopropyliden), 3,41 (dd, J_Ch2oh,oh = 6,04 Hz, J_Ch2oh,2 = 3,96 Hz, 2H, CH₂OH), 3,56 - 4,16 (m, 6H, H-4, -5, -1' a -2'), 4,82 (t, J_oh,ch2 = 6,0 Hz, 1H, CH₂OH, vyměnitelný sD₂O), 4,85 (t, J_2Oh,ch2oh= 3,96 Hz, 1H, H-2). [a]_D ²³-12,48° (o, 1,11, CHC1₃), analýza: pro C9H16O5 vypočteno C 52,93, H 7,90, nalezeno C 52,95, H 7,86.

Příklad 4

Příprava (+)-(1'S,2S,4S)-4-(l,2-dihydroxymethyl-l,2-O-izopropyliden)-2-(O-benzoyloxymethylj-dioxolanu (5)

Benzoylchlorid (6,5 ml, 0,056 mol) byl při 0 °C přikapáván k roztoku (4) (8,5 g, 0,042 mol) ve směsi pyridin-CH₂Cl₂ (1:2, 120 ml) a teplota byla zvýšena na teplotu místnosti. Po 2 h míchání byla reakce zchlazena methanolem (10 ml) a směs byla za sníženého tlaku zkoncentrována do sucha. Zbytek byl rozpuštěn v CH₂C1₂ (300 ml) a promyt vodou (100 ml x 2), solankou, vysušen (MgSO₄), přefiltrován, odpařen na nažloutlý sirup, který byl přečištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (EtOAc-hexan 4 % až 30 %), čímž byla získána látka (5) [Rf = 0,45 (hexan-EtOAc 3:1), 10,7 g, 83,4 %] jako bezbarvý olej. *H NM (CDC1₃) δ 1,35 a 1,44 (2 x s, 2 x 3H, izopropyliden), 3,3—4,35 (m, 6H, H-4, -5, -1' a -2'), 4,44 (d, J = 3,96 Hz, 2H, CH₂-OBz), 5,29 (t, J = 3,74 Hz, 1H, H-2), 7,3 - 7,64, 8,02 - 8,18 (m, 3H, 2H, -OBz). [cc]_D ²⁵ +10,73° (c, 1,75, CH3OH), analýza: pro C]₆H₂o0₆ vypočteno C 62,33, H 6,54, nalezeno C 62,39, H 6,54.

Příklad 5

Příprava (+)-(l'S,2S,4S)-4-(l ,2-dihydroxyethyl)-2-(O-benzoyloxymethyl)-dioxolanu (6)

Směs (5) (5,7 g, 0,018 mol) a kyseliny p-toluensulfonové (1,05 g, 0,0055 mol) v methanolu (70 ml) byla 2 h míchána při teplotě místnosti. Reakce nebyla dokončena, takže bylo rozpouštědlo odpařeno na polovinou původního objemu a byl přidán další methanol (50 ml) a kyselina p-toluensulfonová (0,7 g, 3,68 mmol). Po další 1 h míchání byla reakční směs neutralizována triethylaminem a rozpouštědlo bylo odpařeno do sucha.

Zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (hexan-EtOAc 10 % až 33 %) na látku (6) [R_f = 0,15 (hexan-EtOAc 1:1), 4,92 g, 99,2 %] jako bezbarvý sirup. ’H NMR (DMSO-dé) δ 3,43 (m, 2H, H-2'), 3,67 - 4,1 (m, 4H, H-4, -5 a -1'), 4,32 (d, J = 3,73 Hz, 2H, CH₂-OBz), 4,60 (t, J = 5,72 Hz, 2'-OH, vyměnitelný s D₂O), 5,23 (t, J = 3,96 Hz, 1H, H-2), 7,45- 7,7, 7,93- 8,04 (m, 3H, 2H, -OBz), [a]_D ²⁵+9,16° (c, 1,01, CHC1₃). Analýza: pro Ci₃Hi₆O₆ vypočteno C 58,20, H 6,01, nalezeno C 58,02, H 6,04.

Příklad 6

Příprava (—)—(2S,4S) a (2S,4R)-4-acetoxy-2-(O-benzoyloxymethyl)-dioxolanu (8)

K roztoku (6) (3,04 g, 0,011 mol) v CCI4-CH3CN (1:1, 160 ml) byl přidán roztok NaIO₄(10,18 g, 0,048 mol) ve vodě (120 ml) a pak hydrát RuO₂ (0,02 g). Po 5 h míchání reakční směsi byl filtrací přes celit odstraněn pevný podíl a filtrát byl odpařen na 1/3 objemu. Zbytek byl rozpuštěn v CH₂C1₂ (100 ml) a vodná vrstva byla extrahována CH₂C1₂ (100 ml x 2). Spojená organická vrstva byla promyta solankou (50 m), vysušena (MgSO₄), přefiltrována, odpařena do sucha a sušena ve vakuu 16 h, čímž byla získána surová látka (7) (2,6 g, 91 %).

K roztoku surové látky (7) (2,6 g, 0,01 mol) v suchém THF (60 ml) byl v atmosféře N₂ přidán Pb(OAc)₄ (5,48 g, 0,0124 mol) a pyridin (0,83 ml, 0,0103 mol). Směs byla míchána 45 min pod

-11 CZ 297873 B6

N₂ a pevný podíl byl odfiltrován. Pevný podíl byl promyt ethylacetátem (60 ml) a spojená organická vrstva byla odpařena do sucha. Zbytek byl přečištěn sloupcovou chromatografií na silikagelu (hexan-EtOAc 2:1) a poskytl látku (8) [R_f = 0,73 a 0,79 (hexan-EtOAc 2:1), 1,9 g, 69,34 %] jako bezbarvý olej. 'H NMR (CDC1₃) δ 1,998, 2,11 (2 x s, 3H, -OAc), 3,93 - 4,33 (m, 2H, H-5), 4,43, 4,48 (2 x d, J = 3,73 Hz, 3,74 Hz, 2H, CH₂OBz), 5,46, 5,55 (2 x t, J = 4,18, 3,63 Hz, 1H, H-2), 6,42 (m, 1H, H-4), 7,33- 7,59, 8,00- 8,15 (m, 3H, 2H, -OBz), [oc]_D ²⁵ -12,53° (c, 1,11, CHC1₃). Analýza: pro Ci₃Hi₄O₆ vypočteno C 58,64, H 5,30, nalezeno C 58,78, H 5,34.

Příklad 7

Příprava (-)-(2S,4S)-l-[2-(benzoyl)-l,3-dioxolan-4-yl]cytosinu (9) a (+)—(2S,4R)—1—[2— (benzyloxy)-l ,3-dioxolan-4-yl)cytosinu (10)

Směs N⁴-acetylcytosinu (1,24 g, 7,52 mmol) v suchém dichlormethanu (20 ml), hexamethyldisilazanu (15 ml) a síranu amonného (kat. množství) byla zahřívána 4 h v dusíkové atmosféře k varu pod zpětným chladičem. Vzniklý čirý roztok byl ochlazen na teplotu místnosti. K tomuto silylovanému acetylcytosinu byl přidán roztok (8) (1,0 g, 3,76 mmol) v suchém dichlorethanu (10 ml) a TMSOTf (1,46 ml, 7,55 mmol). Směs byla míchána 6 h. Byl přidán nasycený roztok NaHCO₃ (10 ml) a směs byla míchána dalších 15 min a přefiltrována přes vrstvu celitu. Filtrát byl odpařen a pevný podíl byl rozpuštěn v EtOAc a promyt vodou a solankou, vysušen, přefiltrován a odpařen na surový produkt. Tento surový produkt byl přečištěn na sloupci silikagelu (5% CH₃OH/CHC1₃) a poskytl čistou směs α,β (9) a (10) (0,40 g, 30 %) a směs α,β (13) a (14) (0,48 g, 40 %). Směs (14) byla pro rozdělení reacetylována, spojená směs α,β byla rozdělena dlouhým sloupcem silikagelu (3% CH₃OH/CHC1₃) za vzniku látek (9) (0,414 g, 30,7 %) a (10) (0,481 g, 35,6 %) ve formě pěn. Triturací těchto pěn s CH₃OH byly získány bílé pevné látky. 9: UV (CH₃OH) λ max 298 nm, anal. (C17H17N3O8) C, Η, N. 10: UV (CH₃OH) λ max 298 nm.

Příklad 8

Příprava (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu (11)

Roztok (9) (0,29 g, 0,827) v CH₃OH/NH₃ (50 ml, nasycený při 0 °C) byl 10 h míchán při teplotě místnosti. Bylo odpařeno rozpouštědlo a surová látka (11) byla čištěna na preparativních silikagelových deskách (20% CH3OH/CHCI3) za vzniku oleje. Ten byl překrystalován z CH₂Cl₂/hexanu a poskytl látku (11) (0,136 g, 77,7 %) jako bílou pevnou látku. UV λ max 278,0 nm (ε 11967) (pH 2), 270,0 nm (ε 774) (pH 7), 269,0 nm (ε 8379) (pH 11), anal. (C₈H_hN₃O₄) C, Η, N.

II. Farmaceutické přípravky

Lidé, koně, psi, krávy a jiná zvířata, zejména savci, trpící nádory, zejména rakovinou, mohou být ošetřováni podáváním účinného množství (-)-OddC nebo jeho derivátu nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, popřípadě ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidle, buď samotných, nebo v kombinaci s jinými známými protirakovinnými nebo farmaceutickými prostředky. Toto ošetření může být aplikováno rovněž ve spojení s jinými běžnými terapiemi rakoviny, jako je ozařování nebo chirurgie.

Tyto sloučeniny mohou být podávány jakoukoli vhodnou cestou, například orálně, parenterálně, intravenózně, intradermálně, subkutánně nebo topicky, v kapalné, krémové, gelové nebo pevné formě nebo ve formě aerosolu.

Účinná sloučenina je ve farmaceuticky přijatelném nosiči nebo ředidle zahrnuta v množství, dostačujícím k dodání terapeuticky účinného množství pro požadovanou indikaci pacientovi bez vyvolání vážných toxickým účinků u ošetřovaného pacienta. Výhodná dávka sloučeniny pro

- 12CZ 297873 B6 všechny zde uváděné stavy je v rozmezí asi 10 ng/kg až 300 mg/kg, přednostně 0,1 až 100 mg/kg za den, obecněji 0,5 až asi 25 mg na kilogram tělesné hmotnosti příjemce za den. Typické topické dávkování se pohybuje od 0,01 do 3 % hmotn./hmotn. ve vhodném nosiči.

Sloučenina se výhodně podává ve formě vhodných dávkových jednotek, například, ale nikoli výlučně, s obsahem 1 až 3000 mg, přednostně 5 až 500 mg účinné složky na dávkovou jednotku. Obvykle je vyhovující orální dávka 25 až 250 mg.

Účinná složka se přednostně podává tak, aby bylo možno dosáhnout píkových plasmových koncentrací účinné sloučeniny asi 0,00001 až 30 mM, přednostně asi 0,1 až 30 μΜ. Toho je možno dosáhnout například intravenózní injekcí roztoku nebo formulace aktivní složky, popřípadě v salinickém roztoku nebo ve vodném prostředí nebo při podávání jako bolus účinné složky.

Koncentrace účinné sloučeniny v léčivém přípravku závisí na rychlosti absorpce, distribuce, inaktivace a exkrece léčiva a na dalších faktorech, známých odborníkům. Je nutno uvést, že hodnoty dávkování se rovněž pohybují v závislosti na vážnosti stavu, který má být zmírňován. Dále je třeba uvést, že pro každý konkrétní subjekt je nutno v průběhu času upravit konkrétní režim dávkování podle individuální potřeby a odborného úsudku osoby podávající přípravky nebo na jejich podávání dohlížející, a že zde uváděná koncentrační rozmezí jsou pouze příkladná a nemají za účel omezovat rozsah nebo proveditelnost nárokovaných přípravků. Účinná složka může být podávána najednou nebo může být rozdělena do určitého počtu menších dávek, podávaných v různých časových intervalech.

Orální přípravky obecně obsahují inertní ředidlo nebo jedlý nosič. Mohou být uzavřeny v želatinových kapslích nebo lisovány do tablet. Pro účely orálního terapeutického podávání může být účinná sloučenina nebo její prekursorový (prodrug) zabudována do vehikula a používána ve formě tablet, pastilek nebo kapslí. Jako součást přípravku mohou být obsaženy farmaceuticky kompatibilní pojivá a/nebo pomocné látky.

Tablety, pilulky, kapsle, pastilky apod. mohou obsahovat kteroukoli z těchto přísad nebo sloučenin podobné povahy: pojivo, jako je mikrokrystalická celulóza, tragant nebo želatina, vehikulum, jako je škrob nebo laktóza, dispergační prostředek, jako je kyselina alginová, Primogel nebo kukuřičný škrob, mazivo, jako je stearát hořečnatý nebo Sterotes, kluzný prostředek, jako je koloidní oxid křemičitý, sladidlo, jako je sacharóza nebo sacharin, nebo ochucovadlo, jako je peprmint, methylsalicylát nebo pomerančové aroma. Je-li dávková jednotka ve formě kapsle, může kromě látek výše uvedeného typu obsahovat kapalný nosič, jako je mastný olej. Dávkové jednotky mohou dále obsahovat různé jiné látky, které modifikují fyzikální formu dávkové jednotky, například povlaky cukru, šelaku nebo enterosolventních prostředků.

Účinná sloučenina nebo její farmaceuticky přijatelná sůl může být podávána jako složka elixíru, suspenze, sirupu, oplatky, žvýkací gumy apod. Sirup může kromě účinných sloučenin obsahovat sacharózu jako sladidlo a určité konzervační, barvicí a aromatizační přísady.

Účinná sloučenina nebo její farmaceuticky přijatelné soli mohou být rovněž smíseny s dalšími účinnými látkami, které nezhoršují požadovaný účinek nebo které jej doplňují, jako jsou jiné protirakovinné prostředky, antibiotika, protiplísňové prostředky, protizánětlivé prostředky nebo protivirové sloučeniny.

Roztoky nebo suspenze používané pro parenterální, intradermální, subkutánní nebo topickou aplikaci mohou zahrnovat následující složky: sterilní ředidlo, jako je voda pro injekce, salinický roztok, fixní oleje, polyethylenglykoly, glycerin, propylenglykol nebo jiná syntetická rozpouštědla; antibakteriální prostředky, jako je benzylalkohol nebo methylparabeny; antioxidanty, jako je kyselina askorbová nebo hydrogensiřičitan sodný; chelatační prostředky, jako je kyselina ethylendiamintetraoctová; pufry, jako jsou acetáty, citráty nebo fosfáty, a prostředky pro úpravu tonicity, jako je chlorid sodný nebo dextróza. Parenterální přípravek může být uzavřen

- 13 CZ 297873 B6 v ampulích, jednorázových injekčních stříkačkách nebo vícerázových dávkových lékovkách ze skla nebo plastu.

Při intravenózní aplikaci jsou výhodnými nosiči fyziologický salinický roztok nebo fosfátem pufřovaný salinický roztok (PBS).

V jednom provedení se účinné sloučeniny připravují s nosiči, které chrání sloučeninu před rychlým odstraněním z těla, jako jsou formulace s kontrolovaným uvolňováním včetně implantátů a systémů na bázi mikrokapslí. Mohou být používány biodegradabilní, biokompatibilní polymery, jako je ethylenvinylacetát, polyanhydridy, kyselina polyglykolová, kolagen, polyorthoestery a kyselina polymléčná. Způsoby přípravy těchto formulací jsou odborníkovi zřejmé.

Farmaceuticky přijatelnými nosiči mohou být rovněž liposomální suspenze. Ty mohou být připravovány metodami známými odborníkům, například podle patentu US 4 522 811 (který je zde tímto zahrnut jako celek). Liposomové formulace je možno například připravovat rozpouštěním vhodných lipidů (jako je stearoylfosfatidylethanolamin, stearoylfosfatidylcholin, arachadoylfosfatidylcholin a cholesterol) v anorganickém rozpouštědle, které se pak odpaří a zanechá na povrchu nádoby tenký film vysušeného lipidu. Pak se do nádoby navede vodný roztok účinné sloučeniny. Nádoba se pak ručně rozvíří pro uvolnění lipidu z boků nádoby a rozptýlení lipidových agregátů, čímž vznikne liposomální suspenze.

III. Biologická účinnost

Pro hodnocení protirakovinné účinnosti sloučenin se používají a mezi odborníky přijímají různé biologické testy. Pro hodnocení sloučenin podle vynálezu je možno použít kteroukoli z těchto metod.

Jednou z obvyklých metod hodnocení účinnosti je použití testovacích panelů rakovinných buněčných linií podle National Cancer Institute („NCI“). Při těchto testech se hodnotí protirakovinná účinnost konkrétních sloučenin in vitro a získaná data umožňují předpovídat chování testovaných sloučenin s ohledem na použití in vivo. Při jiných testech se hodnotí účinek sloučeniny in vivo na lidské nebo myší nádorové buňky, implantované nebo transplantované nahé myši. (-)-OddC byl testován na protirakovinnou účinnost in vivo proti buněčné linii leukemie P388 a buněčné linii rakoviny tlustého střeva C38. Experimentální detaily a výsledky těchto testů jsou uvedeny v příkladech 9 a 10.

Příklad 9

Ošetřování buněk leukemie P388 in vivo pomocí (-)-OddC

10⁶ buněk leukemie P388 bylo i.p. implantováno myším BDF1, získaným ze Southem Research Institute, Alabama. Počínaje prvním dnem po implantaci nádorových buněk byl dvakrát denně po pět dní podáván (-)-OddC. Při tomto postupu se ukázalo, že dávka 75 mg/kg je pro myši toxická.

Výsledky těchto studií ukazuje obr. 3 a tabulka 1. Na obr. 3 znázorňují plné kroužky údaje pro kontrolu (neošetřená zvířata), prázdné trojúhelníčky ukazují poměr přežití u zvířat, jimž bylo podáváno dvakrát denně 25 mg/kgbid, a prázdné kroužky představují poměr přežití u myší, jimž bylo podáváno jednou denně 50 mg/kgbid. Ze šesti myší, ošetřovaných dávkou 25 mg/kg (-)-OddC, jedna dlouhodobě přežívala a délka života ostatních se zvýšila na 103 %.

- 14CZ 297873 B6

Tabulka 1 skupina kontrola-OddC dávka³ (mg/kg) — 25x2x5 cesta —ip střední doba přežití (dny) 13,327

ILS^b(%) —103 doba úhynu (den) 11,12,13,13,13,18 18,20,22,25,33,45 vyléčenf/celkem 0/61/6

Inokulum: každé myši bylo v den 0 i.p. inokulováno 10⁶ buněk P388 a: ošetření bylo prováděno ve dny 1 až 5 dvakrát denně b: procento zvýšení délky života oproti kontrole c: přežití rovné nebo delší než 45 dní délky života

Příklad 10

Ošetřování buněk nádoru tlustého střeva 38 in vivo pomocí (-)-OddC

Myším BDF1 byly s.c. implantovány buňky nádoru tlustého střeva 38. Dvakrát denně po dobu 5 dní byl myším podáván (-)-OddC v dávce 25 mg/kg/dávku. Jak je patrné z obr. 2, byl růst buněk nádoru tlustého střeva zpomalen. Na obr. 2 představují plné kroužky údaje pro kontrolní zvířata a plné trojúhelníčky údaje pro myši ošetřené (-)-OddC.

Příklad 11

Testování (-)-OddC in vitro (-)-OddC byl hodnocen screeningovým programem NCI. V testu se měří inhibice různých rakovinných buněčných linií při různých koncentracích (-)-OddC. Testované buněčné linie jsou uvedeny v tabulce 2.

Tabulka 2 uvádí rovněž koncentraci, při níž byly v testovaných buněčných liniích pozorovány GI50 a TGI. Hodnoty GI50, TGI a LC50 představují koncentrace, při nichž PG (dále definované procento inhibice růstu) činí +50, resp. 0, resp. -50. Tyto hodnoty se stanovují interpolací křivek závislosti reakce na dávce, sestavených pro každou buněčnou linii, vynesených jako závislost PG na logio koncentrace (-)-OddC.

PG představuje naměřený účinek (-)-OddC na buněčnou linii a vypočte se podle jednoho z těchto dvou výrazů:

Je-li (stř. OD_test- stř. OD^o) > 0, pak PG = 100 x (stř. OD_test - stř. OD_tzero)/(stř. OD_ctrl- stř. OD_tzero)

Je-li (stř. OD_test - stř. OD_tzero) < 0, pak PG = 100 x (stř. OD_test - stř. OD_tzero)/(stř. OD_tzero), kde stř. OD_tzero = průměr z měření optické hustoty zbarvení odvozeného od SRB těsně před vystavením buněk testované sloučenině stř. OD_test = průměr z měření optické hustoty zbarvení odvozeného od SRB po 48 h vystavení buněk testované sloučenině stř. OD_ctri - průměr z měření optické hustoty zbarvení odvozeného od SRB po 48 h vystavení buněk testované sloučenině

-15CZ 297873 B6

V tabulce 2 popisují první dva sloupce subpanel (například leukemie) a buněčnou linii (například CCRF-CEM), které byly ošetřeny (-)-OddC. Sloupec 3 uvádí logio, při němž se objevila hodnota GI50, a sloupec 4 uvádí logio, při němž se objevila hodnota TGI. Pokud nebyl možno 5 získat tyto parametry odpovědi interpolací, je hodnota, uvedená pro každý parametr odpovědi, nejvyšší testovanou koncentrací a předchází ji znaménko „>“. Například jestliže všechny PG při všech koncentracích (-)-OddC, dodávaného určité buněčné linii, překračují +50, nelze tento parametr získat interpolací.

o

Tabulka 2

panel	buněčná linie	logiaGISO	log₁₀TGI
leukemie	CCRF-CEM	-6, 64	> -4,00
	RL-60(TB)	-6,28	> -4,00
	K-562	-4,59	> -4,00
	BSOLT-4	-6, 66	-4,39
	RPMI-2,26	-4,03	> -4,00
	SR	-5,95	> -4, 00
nemalobuněčná rakovina plic	A54S/A.TCC	-6, 01	> -4,00
	BKVX	> -4,00	> -4,00
	HOP-62	-6,23	-4,71
	TI Z Jí	-4, 92	> -4,00
	\“CZ-H322M	> -4,00	> -4,00
	NC Z -r.4 c. „	-4,32	> -4,CO
	nc:-h+;.o	- 6,0 6	> - 4,:;
rakovina tlusté střeva		-4,03
	hct-i:i	-6,23	> - 4,::
	ΊΤCT-I5'.....'............	.....-fe, 39	> -4,00
	HT29	> -4,00	> -4,00
	K2112	> -4,00	> -4,00
rak: v— a CNS	SP-268	-5,18	> -4,00
	SP-295	-6,24	> -4,00
	SNB-19	-5,71	> -4,00
	U251	-4,91	> -4,00

-16CZ 297873 B6

melanom	LOX D6VI	-6,39	> -4,00
	MALME-3M	-4,51	> -4,00
	Ml 4	-6,27	-5, 07
	SK-MEL-28	-4,31	> -4,00
	SK-MEL-5	-4,91	> -4,00
	UACC-257	> -4,00	> -4,00
	UACC-62	-5,53	> -4,00
rakovina vaječníků	OŘOVI	-4, 03	> -4,00
	OVCAR-3	-4,44	> -4,00
	OVCAR-4	> -4,00	> -4,00
	OVCAR-5	-4,41	> -4,00
	OVCAR-8	-5,82	> -4,00
	SK-OV-3	-5,35	> -4,00
rakovina ledvin	785-4	-5,36	> -4,00
	ACHN	-6, 46	> -4,00
	CAKI-1	-6, 65	-4,87
	RXF-393	-6,17	> -4,00
	SN12C	-6,27	> -4,00
	TK-30	> -4,00	> -4,00
	UO-31	-5,60	> -4,00
rakovina prostaty	PC-3	-6,29	> -4,00
	DU-145	-6, 97	> -4,00
rskoVLf.ž _; v™~ __ ^f “ *
η:-~ adp-PjlS	-4 _ř > -4₁ ;;
	MEA-M3-231/ATCC	> -4,Cl	> -4,OC
	HS578T	> -4,00	> -4,00
	MDA-MB-435	-4, 62	> -4,00
	MDA-N	-4,33	> -4,00
	BT-549	-4,59	> -4,00
	T-47D	> -4,00	> -4,00

Obr. 4 představuje graf, který znázorňuje relativní selektivitu (-)-OddC pro konkrétní buněčnou linii. Úsečky směřující doprava znázorňují citlivost buněčné linie vůči (-)-OddC, přesahující 5 průměrnou citlivost všech testovaných linií. Protože měřítko úseček je logaritmické, znamená

-17 CZ 297873 B6 úsečka o velikosti 2 jednotek směrem doprava, že sloučenina vykázala pro buněčnou linii GI50 při koncentraci rovné jedné setině střední koncentrace, nutné pro všechny buněčné linie, a že tedy tato buněčná linie je vůči (-)-OddC neobvykle citlivá. Úsečky směřující doleva odpovídajícím způsobem zobrazují podprůměrnou citlivost. Tyto buněčné linie lze snadno zjistit z tabulky 2, protože před logio koncentrace předchozí symbol „>“.

Z obr. 4 je zřejmé, že alespoň jedna buněčná linie každého typu testovaných rakovinných buněk vykazovala citlivost vůči (-)-OddC. Určité buněčné linie rakoviny prostaty, leukemie a tlustého střeva vykazují extrémní citlivost vůči (-)-OddC.

Příklad 12

Porovnání (-)-OddC a AraC

Jak je uvedeno v popisu dosavadního stavu techniky, používá se při léčbě akutní myeloidní leukemie cytosinarabinosid (označovaný také jako Cytarabin, araC a Cytosar), což je nukleosidový analog deoxycytidinu. Je účinný také proti akutní lymfocytické leukémii a v menším rozsahu je použitelný při chronické myelocytické leukémii a nehodgkinovském syndromu. Primární působení araC spočívá v inhibici syntézy jaderné DNA. Bylo zajímavé porovnat toxicitu (-)-OddC a AraC vůči nádorovým buňkám.

Buňky v logaritmickém růstu byly naočkovány na 24jamkové plotny v hustotě 5000 buněk/ml/jamku. K buňkám byla v různých dávkách přidávána léčiva a kultury byly uchovávány po dobu tří generací. Po skončení této doby byly provedeny zkoušky methylenovou modří a/nebo byly přímo spočteny počty buněk. Methylenová modř je barvivo, které se stechiometricky váže na bílkoviny životaschopných buněk a může být použito k nepřímé kvantifikaci počtu buněk (Finlay, 1984). Hodnoty IC₅₀ byly stanoveny interpolací vynesených hodnot. Každá uvedená hodnota představuje průměr ± standardní odchylku z pěti experimentů, kde byl každý údaj získán duplicitně.

U všech testovaných nádorových buněčných linií byl (-)-OddC více cytotoxický než AraC. (-)-OddC byl významně účinnější než AraC v buněčné linii nasofaryngálního karcinomu KB a ve dvou buněčných liniích karcinomu prostaty, DU-145 a PC-3. Buňky HepG2 pocházejí z hepatocelulámího karcinomu a buněčná linie 2.2.15 je odvozena z buněk HepG2, které byly transfikovány kopií genomu viru hepatitidy B. Buňky CEM jsou odvozeny od akutní lymfoblastické leukemie. (-)-OddU, což je sloučenina, která by vznikla deaminací (-)-OddC, nebyla toxická v žádné z testovaných buněčných linií. Enzymatická studie naznačují, že na rozdíl od AraC, jehož klinická účinnost je silně snižována jeho náchylností k deaminací, (-)-OddC není substrátem pro deaminasu.

Bylo zjištěno, že (-)-OddC může být fosforylován in vivo na mono-, di- a trifosfátnukleosid. Zdá se, že (-)-OddC vykazuje svou buněčnou toxicitu ve fosforylované formě, protože buňky, které nejsou schopny tuto sloučeninu fosforylovat, jsou vůči ní mnohem méně citlivé. Prvním enzymem, odpovědným za její fosforylaci, je lidská deoxycytidinkinasa. Enzymatické studie in vitro naznačují, že (-)-OddC může být tímto enzymem fosforylován.

Na rozdíl od araC není (-)-OddC deaminován cytidindeaminasou. Přítomnost cytidindeaminasy v solidních nádorových tkáních může být klíčovým faktorem, odpovědným za neúčinnost araC v solidních nádorech. To může částečně vysvětlovat, proč je (-)-OddC vůči buňkám HepG2 u nahé myši účinný, zatímco araC je neúčinný. Vysvětluje to také, proč má (-)-OddC odlišné spektrum protinádorové účinnosti než araC. Přítomnost cytidindeaminasy v gastrointestinálním traktu může dále hrát významnou roli v důvodech, proč nemůže být araC brán orálně.

-18CZ 297873 B6

Biochemické studie (-)-OddC

Cytotoxicita	AraC, (-)	i-OddC a	(-)-OddU in vitro
				ID50	(μΜ)
buněčná linie	AraC			(-)-OddC	(	-)-OddU
KB	0,152	±	0, 010	0, 048 +	0, 021	>	30
DU-145	0,170	+	0, 035	0, 024 +	0,020	>	30
PC-3	0,200	+	0, 078	0,056 ±	0,039	>	30
HepG2	0, 125	+	0, 013	0,110 ±	0,050	>	30
2.2.15	0, 145	±	0, 007	0, 110 ±	0,011	>	30
CEM	0,030	i	0, 010	0,025 ±	0, 030	>	30

Příklad 12

Studie in vivo

Nahé myši NCr o stáří tří až šesti týdnů (Taconic Immunodefícient Mice and Rats) byly s.c. inokulovány do každého boku 2.10⁶ buněk HepG2 nebo DU-145 a nádory byly ponechány růst. Ošetření bylo zahájeno při velikosti nádorů 100 až 250 mg, stanoveno měřením kaliperem a výpočtem podle vzorce hmotnost nádoru (mg) = délka (mm) y šířka (mm²) 4- 2

Léčiva byla podávána v uvedených dávkách ve dny 0 až 4 a po každých několika dnech byla měřena velikost nádorů. Křivky růstu nádorů byly sestaveny způsobem popsaným v Bell ad., Cancer(phila.) 36:2437-2440 (1975) jsou znázorněny na obr. 5(a) a 5(b).

Toxicita byla hodnocena podle změn tělesné hmotnosti.

Přestože byla toxicita AaC in vitro podobná jako u (L)-OddC, byl AraC na tomto zvířecím modelu neúčinný. Enzymatická analýza nádorového extraktu ukázala, že to nebylo důsledkem zvýšené aktivity dCD nebo snížené aktivity dCK, ale že se může jednat o výsledek intenzivního metabolismu AraC v játrech, která měla vysokou hladinu dCD. Na rozdíl od AraC byl (L)-OddC účinný jak v xenoimplantátech HepG2, tak DU-145. Čisté usmrcení buněk (log 10), vypočtené pro nádoiy HepG2, činilo 0,67 pro ošetření i.p. a 0,87 pro orální ošetření. Velikost nádorů DU-145 se zmenšuje a polovina z nich do dne 15 zcela zaniká. Po asi 25 dnech od posledního ošetření se nádory začaly znovu objevovat, ale po dni 47 se růst opět zastavil. V den 60 byla zvířata usmrcena a byly odebrány nádory. Nádory měly nekrotickou morfologii a jen velmi málo buněk bylo schopno vylučovat tryptanovou modř. Kromě toho nemohly být v této tkáni detekovány žádné enzymatické aktivity. Podávané dávky AraC a (L)-OddC byly stejné toxické, což ukazuje ztráta hmotnosti zvířat, a předběžné testy toxicity naznačují, že 25 mg/kg dvakrát denně může být maximální tolerovaná dávka při pěti po sobě následujících dnech léčby. Preferován může být protokol, v němž se léčivo podává přerušovaně.

Zde uváděná data in vitro a in vivo demonstrují, že (L)-OddC má významnou protirakovinnou účinnost a může v mnoha ohledech předčit v současnosti dostupné analogy deoxycytidinu. Nejenže se jedná o vůbec první analog L-nukleosidu, který vykazuje protirakovinnou účinnost, ale je to i první skutečný terminátor řetězce, schopný inhibovat růst nádoru. Přestože jeho nepřirozená stereochemie nechrání (L)-OddC před aktivací metabolickými enzymy nebo před

-19CZ 297873 B6 zabudováním do DNA, může být faktorem, který tuto sloučeninu chrání před degradací dCD. (L)-OddC je dále jedinečný v tom, že je účinný v solidních nádorech, které obvykle nereagují na terapii pomocí analogů nukleosidů. Léčivo 2,2'-difluordeoxycytidin (gemcitibin), které je v současnosti podrobováno klinickému hodnocení pro léčbu solidních nádorů, je ještě náchylné k inaktivaci působením dCD(16). Protože zvýšení hladiny dCD je mechanismus, jímž se buňka stává rezistentní vůči analogům dCyd, jako je AraC(l 7), může být (L)-OddC použitelný při léčbě pacientů, kteří na toto léčivo přestali reagovat.

IV. Použití (-)-OddC v oligonukleotidech a v antimediátorové technologii

Antimediátorová technologie se obecně týká modulace genové exprese procesem, při němž je syntetický oligonukleotid hybridizován s komplementární sekvencí nukleové kyseliny za účelem inhibice transkripce nebo replikace (je-li cílovou sekvencí DNA), inhibice translace (je-li cílovou sekvencí RNA) nebo inhibice zpracování (je-li cílovou sekvencí pre-RNA). Touto metodou je možno modulovat různé buněčné aktivity. Jednoduchým příkladem je inhibice biosyntézy bílkovin antimediátorovým oligonukleotidem vázaným na mRNA. V jiném provedení je syntetický oligonukleotid hybridizován s konkrétní sekvencí genu v dvouvláknové DNA za vzniku trojvláknového komplexu (triplexu), který inhibuje expresi sekvence tohoto genu. Antimediátorové oligonukleotidy mohou být používány také k aktivaci genové exprese nepřímo potlačením biosyntézy přirozeného represoru nebo přímo redukcí terminace transkripce. Antimediátorová oligonukleotidová terapie (AOT) může být používána k inhibici exprese patogenních genů včetně těch, které se účastní nekontrolovaného růstu benigních nebo maligních nádorových buněk nebo replikace virů, včetně HIV a HPV.

Stabilita oligonukleotidů proti nukleasám je významným faktorem pro aplikace in vivo. Je známo, že 3'-exonukleasová aktivita je odpovědná za většinu degradace nemodifikovaných antimediátorových oligonukleotidů v séru; Vlassov, V. V., Yakubov, L. A., Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of Cancers and AIDS, 1991, 243-266, Wiley-Liss, lne., New York, Nucleic Acids Res., 1993, 21, 145.

Náhrada nukleotidu na 3'-konci oligonukleotidů (-)-OddC nebo jeho derivátem může stabilizovat oligonukleotid proti degradaci 3'-exonukleasou. Alternativně nebo navíc může být za účelem odolnosti proti degradaci oligonukleotidů endonukleasami nahrazen (-)-OddC nebo jeho derivátem interní nukleotid.

Na základě uvedeného popisu může běžný odborník používat (-)-OddC nebo jeho derivát ke stabilizaci různých oligonukleotidů proti degradaci jak exonukleasami, tak endonukleasami, včetně nukleosidů používaných v antimediátorové oligonukleotidové terapii. Všechna tato provedení spadají do rozsahu vynálezu. Příklad 13 je neomezujícím příkladem použití (-)-OddC pro odolnost proti působení 3'-exonukleasy.

Příklad 13

Odolnost proti aktivitě 3'-exonukleasy působením (-)-OddC

Aktivita lidské cytosolové exonukleasy z lidských H9 (lymfocytické leukemické buňky typu T) byla stanovena gelovým sekvenováním. Substrát se 3'-zakončením byl připraven z primeru DNA o délce 20 nebo 23 bází se sekvencí

3'-CAATTTTGAATTTCCTTAACTGCC-5'

1

-20CZ 297873 B6

Primery byly na 5'-konci značeny [Y-³²P]ATP, teplotně hybridizovány s komplementárními RNA templáty a zakončeny na 3'-konci dTTP (20mer), dCTP (23mer) nebo (-)-OdCTP (23mer) reakcí se stojícím startem katalyzovanou HIV-1 RT. Za těchto podmínek byl 20mer zakončen dTMP (A) a 23mer byl zakončen dCMP (B) nebo (-)-OddCMP(C). Tyto substráty jednovláknové DNA byly použity k testování jejich citlivosti vůči cytoplasmatické exonuklease. Testy byly prováděny v reakčních směsích 10 μΐ, obsahujících 50 mM Tris-HCl o pH 8,0, 1 mM MgCl₂, 1 mM dithiothreitolu, 0,1 mg/ml bovinního sérového albuminu, 0,18 pCi/ml 3'-zakončeného substrátu a 2 μΐ exonukleasy (0,03 jednotek). Reakce byly inkubovány po uvedenou dobu při 37 °C a ukončeny přídavkem 4 μΐ 98% formamidu, 10 mM EDTA a 0,025% bromfenolové modři. Vzorky byly denaturovány 5 min při 100 °C a pak rychle ochlazeny na ledu. Nezreagovaný materiál a reakční produkty byly odděleny na sekvencovacích gelech 16 % polyakrylamidu/močovina a visualizovány autoradiografií. Oligonukleotid s (-)-OddC na 3'-konci byl alespoň pětkrát odolnější vůči 3'-exonuklease než ostatní oligonukleotidy.

Z uvedeného podrobného popisu vynálezu jsou odborníkům zřejmé modifikace a obměny vynálezu při léčbě rakoviny, které rovněž spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití farmaceutické kompozice zahrnující účinné množství sloučeniny β-L-nukleozidu obecného vzorce I kde R¹ a R² znamenají substituenty zvolené z vodíku, acylu a C, až C_]8 alkylu, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, ve farmaceuticky přijatelném nosiči, pro výrobu léčiva pro ošetřování nádorů u hostitelského živočicha.
2. Použití kompozice podle nároku 1, kde substituenty R¹ a R² představují vodík.
3. Použití kompozice podle nároku 1, kde alkylová skupina je zvolena z methylu, ethylu, propylu, butylu, pentylu, hexylu, izopropylu, izobutylu, sek-butylu, terc-butylu a izopentylu.
4. Použití kompozice podle nároku 1, kde acylová skupina je -C(O)R, kde R je Cj až C₅alkylová skupina, fenyl nebo benzyl.
5. Použití kompozice podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde nádor je rakovinný.
6. Použití kompozice podle nároku 1, kde nosič je vhodný pro orální aplikaci.
7. Použití kompozice podle nároku 1, kde nosič je vhodný pro intravenózní aplikaci.
8. Použití kompozice podle nároku 1, kde nosič je vhodný pro topickou nebo transdermální aplikaci.
9. Použití kompozice obsahující účinné množství sloučeniny vzorce lb

-21 CZ 297873 B6 n’o-4-^ kde R znamená H nebo F, a R¹ a R² znamenají substituenty vybrané ze skupiny zahrnující vodík, alkyl, acyl, monofosfát, difosfát a trifosfát, nebo její farmaceuticky přijatelná sůl, popřípadě ve farmaceuticky přijatelném nosiči, pro výrobu léčiva pro ošetřování nádoru u hostitelského živočicha.
10. Kompozice podle nároku 9, kde R je fluor a R¹ a R² představují vodík.
11. Použití kompozice podle nároků 1, 9 nebo 10, kde hostitelským živočichem je člověk.
12. Použití kompozice podle nároků 1, 9, nebo 10, kde nádor je rakovinný.
13. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je leukemie.
14. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina tlustého střeva.
15. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina močového měchýře.
16. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina hepatocelulámí rakovina.
17. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina prsu.
18. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina plic.
19. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina nosohltanu.
20. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina pankreatu.
21. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina vaječniků.
22. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je lymfom.
23. Použití kompozice podle nároku 12, kde nádorem je rakovina prostaty.
24. Použití (-)-(2S,4S)-l-(2-hydroxymethyl-l,3-dioxolan-4-yl)cytosinu nebo jeho soli, nebo jeho (+)-enantiomeru, nebo jejich racemické směsi nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, pro výrobu léčiva pro léčení nebo profylaxi nádoru, včetně rakovinného nádoru.