CZ299096B6 - Rekombinantní molekula DNA kódující nový IFNR1 receptor-vazebný protein, a zpusob modulace bunecné odpovedi na interferon - Google Patents

Abstract

Rekombinantní molekula DNA obsahující sekvenci kódující IFNAR1 receptor-vazebný protein, který mužebýt indukován IFN-.alfa. nebo IFN-.beta. a který ovlivnuje bunecnou odpoved na IFN podnet. Podáním DNA kódující zmínené proteiny v orientaci "sense" ci "anti-sense", nebo jen cásti zmínené DNA, muže být dosaženo zvýšení nebo naopak inhibice bunecné odpovedi na interferon. Protilátky proti zmíneným proteinum mohou být použity pro izolaci nových proteinu nebo jejich imunodetekci.

Description

Oblast techniky

Navrhovaný vynález se obecně zabývá molekulárními mechanizmy působení interferonů. Konkrétně se vynález zabývá novými proteiny vážícími se na IFN receptor typu I, rekombinantními DNA molekulami, které kódují zmíněné proteiny a dále způsoby modulace buněčné odpovědi na interferon.

Dosavadní stav techniky

Interferony typu I (podtypy IFN-α a IFN-β) ovlivňují buňky nejrůznějšími způsoby. Příkladem může být inhibice růstu virů (antivirové účinky), inhibice buněčné proliferace (protinádorové účinky) a ovlivnění imunitní odpovědi (imunoregulační účinky). Tyto účinky interferonů (IFN) jsou spojeny s biochemickou a morfologickou modifikací buněk (Revel, 1984).

Interferony, působí na buňky pomocí druhově specifických receptorů. Pro interferony typu I byly identifikovány dva transmembránové receptory: IFNAR1 (Uze a kol., 1990) a IFNAR2-2 (nebo IFNAR2-C Domanski a kol., 1995). Přenos signálu IFN-α, β nebo ω do buňky zahrnuje protein tyrozin kinázy z rodiny Janus kináz (Jak) a transkripční faktory z rodiny Stát (Damell a kol., 1994). Proteiny Jak-Stat biochemických drah jsou aktivovány vazbou k intracytoplazmatickým (IC) doménám IFNAR1 a IFNAR2 receptorů. Mezi proteiny, vážící se k IFNAR1 IC doméně patří tyk2 a Stat2 (Abramovich a kol., 1994). Stat2 poté umožní Stati vytvořit IFN-indukovaný ISGF3 transkripční komplex, který aktivuje IFN indukované geny (Leung a kol., 1995).

Transkripční komplexy obsahující Stat3 jsou také indukované IFN-β (Harroch a kol., 1994).

Byla popsána vazba Stat3 klFNARl IC, závislá na IFN (Yang a kol., 1996). Protein-tyrozin fosfatázy PTP1C a D po přidání IFN reverzibilně asociují s IFNAR1 IC (David a kol., 1995a). Navíc bylo zjištěno, že se dvě serin/threonin protein kinázy, 48 kDa ERK2 MAP kináza (David a kol., 1995b) a cAMP aktivovaná proteinkináza A (David a kol., 1996) váží k izolované membránové proximální části (50 aminokyselinových zbytků) IFNAR1 IC. Ze zmíněného vyplývá, že IC domény IFN receptorů I typu slouží jako zásahové místo mnohých proteinů, které zprostředkují a regulují biologické účinky IFN na buňky.

Two-hybrid systém na kvasničném modelu je účinnou metodou identifikace nových proteinů, které se váží na definovanou polypeptidovou sekvenci (Fields a Song, 1989). Zkráceně zahrnuje tato metoda transfekci kvasničných buněk a) plazmidovou DNA, kde je definovaný polypeptid („bait“, neboli návnada) fúzován s DNA-vazebnou doménou Gal4 transkripčního faktoru a b) cDNA knihovnou fúzovanou s aktivační doménou Gal4 v plazmidu pACT. Buňky kvasinek transfektované cDNA, kódující protein, který se váže k polypeptidové návnadě (bait) vykazují Gal4 aktivitu. Přítomnost takového polypeptidu, který váže polypeptidovou návnadu (bait), je prokázána expresí enzymatické aktivity, například β-galaktozidázy zGAL-l-lacZ konstruktu, který je s výhodou vložen do genomu kvasinky. Z těch klonů, které byly ve zmíněném testu pozitivní, je možné dále vyizolovat pACT plazmid, určit nukleotidovou sekvenci inzertu a identifikovat protein, který je tímto inzertem kódován. Tato metoda již umožnila identifikaci nových proteinů, které interagují s IC doménou receptorů pro cytokiny (Boldin a kol., 1995).

Citace kteréhokoliv dokumentu zde nemusí nutně znamenat, že takový dokument odpovídá dosavadnímu stavu techniky, nebo že je nutné uvažovat tento materiál ve vztahu k patentovatelnosti kteréhokoliv nároku navrhovaného vynálezu. Všechny údaje týkající se data nebo obsahu dokumentů jsou založeny na informacích, dostupných žadatelům v době podání patentové přihlášky a nejsou zárukou, že zmíněné údaje jsou správné.

- 1 CZ 299096 B6

Podstata vynálezu

Navrhovaný vynález se zabývá dvěma novými lidskými proteiny, označovanými zde jako IR1B1 a IR1B4, které byly identifikovány jako IFN receptor I (IFNAR1) vazebné proteiny. Dále se vynález zabývá DNA, kódující zmíněné dva proteiny. Oba zmíněné proteiny IR1B1 i IR1B4 interagují s intracytoplazmatickou (IC) doménou IFNAR1 a zprostředkují buněčnou odpověď na interferon.

Navrhovaný vynález se dále zabývá rekombinantní molekulou DNA, obsahující nukleotidovou sekvenci kódující jeden z proteinů IR1B1 nebo IR1B4, nebo jejich fragmenty, stejně jako proteiny, kódovanými zmíněnou DNA. V rekombinantních molekulách DNA je nukleotidová sekvence kódující jeden z proteinů IR1B1 nebo IR1B4, nebo jejich fragmenty, operativně spoje15 na s promotorem v orientaci „sense“ nebo „anti-sense“ (tj. promotor může být umístěn na kódujícími i na nekódujícím řetězci DNA).

Vnesením rekombinantní DNA molekuly, obsahující promotor, operativně spojený s nukleotidovou sekvencí, kódující nový IFNA1 vážící protein v orientaci „sense“, přímo do nádoru je odpověď na exogenní interferonovou terapii při léčbě nádoru zvýšena.

Dále se navrhovaný vynález týká způsobu prodloužení přežití tkáňových štěpů pomocí vnesení rekombinantní DNA molekuly, obsahující promotor, operativně spojený s nukleotidovou sekvencí, kódující nový IFNAR1 vážící protein nebo jeho fragment v orientaci „anti-sense“ do tkáňo25 vého štěpu ještě před transplantací štěpu pacientovi.

Navrhovaný vynález se tedy zabývá také farmaceutickými prostředky s obsahem takové DNA, RNA nebo proteinu a terapeutickými metodami jejich použití.

Navrhovaný vynález se konečně zabývá také protilátkami, specificky vážícími nové proteiny podle navrhovaného vynálezu.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Interakce IR1B1 s IFNAR1-IC doménou, stanovená pomocí „two-hybrid“ analýzy genetických interakcí v kvasinkách. V rámečku ve spodní části obrázku jsou popsány jednotlivé kombinace cDNA inzertu v pACT s různými návnadami (bait).

Obr. 2: Interakce IR1B4 s IFNAR-IC doménou, stanovená pomocí „two-hybrid“ analýzy genetických interakcí v kvasinkách. V rámečku ve spodní části obrázku jsou popsány jednotlivé kombinace cDNA inzertu v pACT s různými návnadami (bait).

Obr. 3: Nukleotidová (SEQ ID NO:1) a aminokyselinová (SEQ ID NO:2) sekvence IR1B1.

Obr. 4: Homologie a porovnání (alignment) aminokyselinové sekvence (SEQ IDNO:2) IR1B1 s aminokyselinovými sekvencemi dvou kalcium-vazebných proteinů, kalcineurinu B (zkracová45 no CALB, SEQ ID NO:3) a kalcitraktinu (zkracováno CATR, SEQ ID NO:4), Aminokyseliny, identické v sekvencích IR1B1 a CALB nebo CALB a CATR jsou označeny symbolem „|“ spojujícím zmíněné aminokyseliny. Identita mezi IR1B1 a CATR, ale nikoliv s CALB je označena symbolem Tučně jsou označeny kalcium-vazebné domény „helix-smyčka-helix EFhand“.

Obr. 5: Northern blot IR1B1 mRNA a 18S rNA (spodní řádek) v lidských myelomových U266S buňkách po hybridizaci s IR1B1 c DNA a rychlé a přechodné indukci IR1B1 po aplikaci IFN-a8 nebo IFN-β po dobu 2 hodin nebo 18 hodin. V první dráze je kontrolní vzorek bez aplikace IFN po 2 hodinách.

-2CZ 299096 B6

Obr. 6A a 6B: SDS-PAGE zobrazující in vitro interakce IR1B4 s izolovanou IFNAR1-IC doménou (Obr. 6A) a s extrakty z buněčných membrán lidských U266S a U266R buněčných linií.

Obr. 6A: [³⁵S]methíoninem značené translační produkty snebo bez flag-IRlBl in vitro trans5 kriptů byly buď imuniprecipitovány (10 μΐ) s anti-flag M2 kuličkami (dráhy 1 a 4), nebo reagovaly s glutathionovými kuličkami s navázaným GST fúzovaným se 100 aminokyselin dlouhou IFNAR1-IC doménou (dráhy 2 a 5), a nebo s navázaným samotným GST (dráhy 3 a 6). Po inkubaci při 4 °C přes noc (finální objem 100 μΐ) byly kuličky promyty, proteiny byly uvolněny SDS a před SDS-PAGE byly vzorky ještě za redukujících podmínek povařeny.

ío Obr. 6B: U266S (dráha 1) a U266R (dráha 2) byly extrahovány Brij pufrem s inhibitorem proteáz (Abramovich a kol., 1994) a 0,35 ml (10⁷) buněk bylo přes noc při 4 °C inkubováno se 75 μΐ [³⁵S]methioninem značených translačních produktů flag-IRlBl transkriptů.

Anti-IFNARl mAb R3, imobilizovaná na kuličkách potažených proteinem G (25 μΐ), byla přidána a směs byla inkubována po dobu 2,5 h. Dále byla směs promyta Brij pufrem, proteiny byly uvolněny pomocí SDS, povařeny v redukujícím prostředí a analyzovány SDS-PAGE. Kontrolní vzorek, ve kterém byly použity anti-flag M2 kuličky byla také analyzována (dráha 3). Vysušené gely byly zviditelněny pomocí přístroje Phosphor-Imager. V prvních třech drahách na obr. 6A nebyla k in vitro translační reakci přidána žádná 1R1B4 mRNA. Dráhy 4 až 6 obr. 6A zobrazují vzorky, kde byla kin vitro translační reakci přidána mRNA kódující IR1B4 fúzovaná s flag proteinem.

Obr. 7: Nukleotidová sekvence (SEQ ID NO:7) a odvozená aminokyselinová sekvence (SEQ ID NO:8) IR1B4.

Obr. 8: Porovnání aminokyselinových sekvencí IR1B4 (SEQ ID NO:8) a PRMT1 (SEQ ID NO:9) ajejich odlišnosti.

Obr. 9: Porovnání aminokyselinových sekvencí IR1B4 (SEQ ID NO:8) a HCP-1 (SEQ ID NO:10) ajejich odlišnosti.

Obr. 10: Methyltransferázový test. Extrakt z U266S buněk byl inkubován s kuličkami, potaženými proteinem A a anti-IFNARl protilátkou (dráha 1) nebo pouze proteinem A (dráha 2). Methyltransferázová aktivita byla stanovena pomocí značení histonů ¹⁴C(methyl)-S-adenosyl methio30 ninem a analýzou radioaktivity v pruhu, odpovídajícím histonu, na SDS-PAGE.

Obr. 11: Stanovení protein-arginin methyltransferázové aktivity u U266S buněk. Protein-arginin methyltransferázová aktivita u lidských U266S buněk byla stanovena pomocí methylace proteinu Rl, který má sekvenci SEQ ID NO:11 (dráha 1). V dráze 2 byl přidán anti-sense oligonukleotid se sekvencí SEQ ID NO: 12, komplementární k sekvenci nukleotidů 12-33 v blízkosti iniciačního kodonu IR1B4 cDNA. V dráze 3 byl přidán odpovídající sense oligonukleotid. Je zřejmé, že anti-sense oligonukleotid významně inhibuje protein-arginin methyltransferázovou aktivitu, zatímco kontrolní sense oligonukleotid vykazuje jen malý efekt.

Obr. 12: Graf zobrazující inhibici růstu lidských U266S buněk v odpověď na působení IFN-β v přítomnosti či v nepřítomnosti anti-sense oligonukleotidu, popsaného v legendě k obrázku 11 (AS-1), odpovídajícího sense oligonukleotidu (S—3) a dalšího anti-sense oligonukleotidu, komplementárního se střední částí sekvence IR1B4 cDNA (AS-2). Buněčný nárůst (denzita) byl kvantifikován za použití Almar Blue (viz. příklad 7) a pokles hustoty buněk byl přepočten na procenta kontrolního (neošetřeného) vzorku a vynesen do grafu jako stupeň inhibice růstu.

Navrhovaný vynález se zabývá nalezením dvou nových lidských proteinů, které interagují s intracytoplazmatickou doménou (IC) IFNAR1 řetězce receptorů pro interferiny I typu (IFN-a, β nebo ω). Zmíněné proteiny jsou zde popsány jako IFN receptor vazebný protein 1 (IR1B1) a IFN receptor vazebný protein 4 (IR1B4). Interakce zmíněných nových proteinů s IFN ARI byla prokázána pomocí genetického two-hybrid testu na kvasničném modelu. Transfekce kvasinek reportérového kmene SFY526 (Bartel a kol., 1993) IR1B1 nebo IR1B4 c DNA fúzovanou s Gal4

-3CZ 299096 B6 aktivační doménou měla za následek obnovení β-galaktozidázové aktivity je v případě, kdy byla jako návnada (bait) použita IFNAR1-IC doména (fúzovaná z Gal4 DNA-vazebnou doménou).

Sekvence IR1B1 cDNA kóduje 191 aminokyselin dlouhý polypeptid. Počítačová analýza sekven5 ee odhalila po porovnání s dostupnými databázemi sekvencí, že IR1B1 je nový protein, který vykazuje znatelnou homologii, tj. kalcium vazebná místa, s kalcium vazebnými proteiny kalcineurinem β a kalcitraktinem. Kalcineurin β (Guerini a kol., 1989) je 19 kDa podjednotka serin/threonin fosfatázy, která hraje klíčovou úlohu při aktivaci translokace transkripčního faktoru NFAT k jádru T-lymfocytů a kteráje inhibována imunosupresivními léčivy jako například ío cyklosporinem. Kalcitraktin (Lee a Huang, 1993), je 21 kDa protein asociovaný s cytoskeletem, nachází se v centrozómu a účastní se pohybu chromozómů v průběhu mitózy, ještě obecněji je součástí organizačního centra mikrotubulů. Nový IRB1 protein je tedy novým členem rodiny

Ca²⁺ regulovaných proteinů, do které patří i zmiňovaný kalcineurin a kalcitraktin.

Překvapivě bylo zjištěno, že gen pro IR1B1 je v lidských buňkách po ošetření IFN velmi rychle aktivován. Jedná se o první známý případ kalcium vazebného proteinu, který je indukován interferonem. Vzhledem ktomu, že vápenaté ionty regulují buněčnou morfologii, adhezi a buněčné dělení, mohla by modulace IR1B1 aktivity v buňkách ovlivnit odpověď normálních i maligních buněk na interferon. Mechanizmem funkce IR1B1 ve zprostředkování účinků inter20 feronu na buňky je interakce IR1B1 s IC doménou IFN receptoru.

Stejně jako IR1B1, i IR1B4 byl po porovnání sekvence s dostupnými databázemi shledán novým. Bylo také zjištěno, že IR1B4 vykazuje sekvenční homologii s enzymy, které využívají S-adenozylmethionin pro methylaci argininových zbytků u proteinů (protein arginin methyltransferázy, neboli PRMT1; Kagan a Clarke, 1994; Lin a kol., 1996). Bylo zjištěno, že IR1B4 se in vitro váže přímo na IC doménu IFN AR 1 a methylace histonů prokázala konstitutivní asociaci PRMT aktivity s IFNAR řetězcem IFN-α,β receptoru, izolovaného z lidských buněk. Po přidání antisense (tj. komplementárních s kódující sekvencí) oligodeoxynukleotidů z 1R1B4 cDNA ke kultuře lidských buněk dochází k poklesu PRMT aktivity v buňkách. Lidské myelomové buňky, které byly tímto způsobem ošetřeny, vykazovaly značně sníženou odpověď na interferon (měřeno jako inhibice růstu). Z toho vyplývá, že IR1B4/PRMT je součástí biochemické dráhy, pomocí které interferonový receptor působí na inhibici růstu nádorových buněk a která je i součástí dalších funkcí IFN receptoru. Mezi známé substráty PRMT patří celá řada RNA a DNA vazebných proteinů a především heterologní skupina jaderných ribonukleoproteinů (hnRNP). hnRNP se účastní transportu mRNA z jádra do cytoplazmy, alternativního sestřihu pre-mRNA a post-transkripční kontroly (Liu a Dreyfuss, 1995). V souladu s tím mohou být nová IR1B4/PRMT cDNA i protein, jež byly objeveny díky své schopnosti vázat IFN receptor, použity pro modifikaci odpovědi lidských nebo živočišných buněk na interferon.

Rekombinantní DNA molekula podle navrhovaného vynálezu obsahuje nukleotidovou sekvenci, která kóduje IR1B1 nebo IR1B4 protein, nebo fragment některého z nich, a může být použita buď pro zlepšení buněčné odpovědi na interferon, a to zvýšením exprese IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, nebo pro potlačení buněčné odpovědi na interferon snížením exprese IR1B1 nebo IR1B4 proteinů s použitím anti-sense RNA molekul.

Zvýšená in vitro exprese IR1B1 nebo IR1B4 cDNA by mohla být užitečná pro nádorovou terapii, kde by intenzivnější buněčná odpověď na IFN měla za následek zpomalení růstu maligních buněk a zvýšenou citlivost kexogenní protinádorové IFN terapii. Zvýšení exprese IR1B1 nebo IR1B4 in vivo v cílovém místě, a tím i zintenzivnění buněčné odpovědi na interferon lze dosáhnout injekcí expresního vektoru, který obsahuje IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, operativně spojenou v sense orientaci se silným konstitutivním promotorem, přímo do cílového místa, například do oblasti mozkového nádoru nebo do metastatických nádorových uzlin (například melanom nebo nádor prsu).

Naopak snížení exprese IR1B1 nebo IR1B4 proteinu in vivo lze využít pro prodloužení přežívání tkáňových štěpů, neboť odhojení zmíněných štěpů hostitelem je zprostředkováno histokompati-4CZ 299096 B6 bilitními antigeny (MHC I třídy), jejichž syntéza je závislá na IFN podnětech. Je-li cDNA IR1B1 nebo IR1B4, nebo jejich fragmentů, ve vhodném vektoru operativně spojena s odpovídajícím promotorem v anti-sense orientaci a takto vnesena do buněk tkáňového štěpu, vede exprese antisense RNA k degradaci mRNA IR1B1 nebo IR1B4 (nebo „sense“ RNA pro IR1B1/IR1B4) a následně k poklesu hladiny IR1B1 nebo IR1B4 proteinu v buňce.

Anti-sense RNA je transkribována z promotoru, umístěného proti směru transkripce, operativně spojeného škodující sekvencí v anti-sense orientaci, tj. v orientaci opačné k normální, neboli sense orientaci DNA a její transkribované sense RNA (mRNA). Exprese anti-sense RNA, ío komplementární k sense RNA, je účinným způsobem regulace biologické funkce RNA molekul.

Obě komplementární molekuly RNA (sense a anti-sense) vytvoří stabilní duplex a normální (sense) RNA transkript je takto inaktivován (tj. nemůže být translatován).

Rekombinantní DNA molekuly jako předměty navrhovaného vynálezu obsahují cDNA IR1B1 15 nebo IR1B4, nebo její fragmenty operativně spojené s promotorem v sense nebo anti-sense orientaci. Termínem „promotor“ je označována dvouřetězcová DNA nebo RNA sekvence, která je schopná vázat RNA polymerázu a započít tak transkripci „operativně připojené“ nukleotidové sekvence. DNA sekvence je tedy operativně spojena s promotorem, pokud je promotor schopen zajistit transkripci zmíněné DNA sekvence, nezávisle na její orientaci.

Pro kontrolu transkripce může být použit kterýkoliv promotor, který je funkční v hostitelské/cílové buňce. Mezi promotory, které jsou funkční v savčích buňkách, patří například SV40 časný promotor, hlavní pozdní promotor adenovirů, promotor thymidinkinázy z viru herpes simplex (HSV), RSV LTR promotor, okamžitý časný promotor lidského cytomegaloviru (CMV), LTR promotor myšího viru MMTV, promotor interferonu-β, promotor „heat shock“ proteinu 70 (hsp70), stejně jako mnoho dalších, odborníkům dobře známých promotorů.

Promotor, operativně spojený s IR1B1 nebo IR1B4 cDNA v orientaci „sense“, určený pro expresi

IR1B1 nebo IR1B4 proteinu, je nejraději silný konstitutivní promotor. Tak je zajištěna vysoká 30 hladina IR1B1 nebo IR1B4 nezávisle na přítomnosti endogenního buněčného mechanizmu, regulujícího expresi IR1B1 nebo IR1B4.

Podobně promotor operativně spojený sIRlBl nebo IR1B4 cDNA v orientaci „anti-sense“, je s výhodou silný promotor, například jako promotor z regulační oblasti viru Epstein-Barrové (EBV), který zajišťuje vysoké hladiny exprese anti-sense RNA (Deiss a Kimchi, 1991).

Anti-sense sekvence je s výhodou upravena tak, aby její exprese byla možná jen v hostitelské/cílové buňce, což je nejraději lidská buňka. Exprimovaná anti-sense RNA by měla být v hostitelské buňce stabilní (tj. neměla by podléhat rychlé degradaci). Anti-sense RNA by měla specificky hybridizovat pouze se sense mRNA, která je exprimována v hostitelské/cílové buňce, a spolu by potom obě molekuly měly tvořit stabilní dvoj řetězcovou molekulu RNA, která je v zásadě „nepřeložitelná“, tj. nemůže podle ní proběhnout translace. Jinými slovy, anti-sense RNA, exprimovaná v hostitelské/cílové buňce, zabraňuje translaci exprimované sense mRNA, tj. brání expresi IR1B1 nebo IR1B4 proteinů. Do odpovídajícího vektoru může být jako anti-sense sekvence vnesena buď úplná cDNA sekvence IR1B1 nebo IR1B4 nebo pouze některá její část, neboť i část komplementární sekvence může hybridizovat s kódující (sense) mRNA a může tak zabránit její translaci na IR1B1 nebo IR1B4 protein. V souladu stím označuje termín „antisense“ sekvence, tak jak je použit v popisu vynálezu a v patentových nárocích, celou anti-sense sekvenci, nebo takovou její část, která může být exprimována v transformovaných/transfektova50 ných buňkách a která je schopna specificky hybridizovat se sense IR1B1 nebo IR1B4 mRNA za vzniku dvojřetězcové RNA molekuly, která již nemůže být dále translatována.

Anti-sense sekvence nemusí hybridizovat s celou délkou IR1B1 nebo IR1B4 mRNA. Může hybridizovat pouze s vybranými oblastmi, jako jsou například 5'-nepřepisovaná nekódující sek55 vence, kódující sekvence, nebo 3'-nepřepisovaná sekvence sense mRNA. Nejraději je anti-sense

-5 CZ 299096 B6 sekvence zvolena tak, aby hybridizovala s 5'-kóduj ící sekvencí a/nebo s 5'-nekóduj ící oblastí například v místě čepičky nebo v oblasti iniciačního kodonu, neboť bylo na mnoha příkladech potvrzeno, že hybridizace v oblasti iniciačního kodonu je velmi účinná, zatímco hybridizace s interní sekvencí v kódující oblasti je neefektivní (Wickstorm, 1991). Účinnost anti-sense sek5 vence při prevenci translace z IR1B1 sense mRNA lze snadno testovat metodou stanovení protein-arginin methyltransferázové aktivity vU266S buňkách tak, jak je to popsáno v příkladu 7. Vzhledem k velikosti savčího genomu je s výhodou, je-li anti-sense IR1B1 nebo IR1B4 sekvence dlouhá nejméně 17, ještě raději pak nejméně 30 párů bází. Ovšem i kratší sekvence mohou být použity v případě, kdy nehybridizují s dalšími savčími sekvencemi nebo kdy taková „křížová ío hybridizace“ neinterferuje s buněčným metabolismem takovým způsobem a v takové míře, aby snižovala účinnost navrhovaného vynálezu.

Jak cílová sekvence pro hybridizaci, tak i vhodná délka hybridizující anti-sense sekvence, mohou být snadno experimentálně stanoveny. Pro systematické odstraňováni stále větších částí anti15 sense sekvence z vektoru mohou být použity standardní metody, jaké byly popsány například v Ausbel a kol., eds. Current Protocols in Molecular biology, Green Publishing Assoc., New York, N.Y., 1987-1996; a Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Kromě anti-sense sekvencí plné délky mohou být připraveny soubory postupných deleci a to nejraději na 5'-konci anti-sense sekvence. Tímto způsobem je vytvořen soubor zkrácených anti-sense sekvencí, které jsou komplementární nejraději k 5'-konci sense mRNA a dohromady vytvářejí RNA molekulu, která je na 5'-konci sense mRNA dvojřetězcová (komplementuje s 3'-koncem anti-sense RNA) a tudíž nemůže být připisována a je tak zabráněno vzniku odpovídajícího proteinu. Navíc tyto antisense oligonukleotidy, jako například oligonukleotid AS-1 (SEQ IDNO:12) mohou být snadno syntetizovány chemickou cestou a poté vneseny do vektoru tak, aby byly operativně spojeny s vhodným promotorem. Takto připravený vektor je vhodný pro použití pro snížení in vivo exprese 1R1B1 a IR1B4 proteinů v buňkách.

Vektorem pro použití podle vynálezu může být kterýkoliv vhodný eukaryotický nebo prokaryo30 tický vektor, používaný pro transfekci savčích buněk, jako například epizómové vektory, replikativní vektory nebo vektory integrující se do chromozómu, které jsou v oboru běžně známé. Zvláště vhodným vektorem pro expresi IR1B1 nebo IR1B4 anti-sense RNA je epizómový plazmid nesoucí EBV (virus Epstein-Barrové) regulační oblast (Deiss a Kimchi, 1991), sloužící jako promotor, operativně spojený sIRlBl nebo IR1B4 cDNA, která je vzhledem ke zmíněné regulační oblasti v orientaci anti-sense. Použití anti-sense vektorů a oligonukleotid fosforothioátů je popsáno v Annals of the New York of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, eds. Β. E. Hubber a J. S. Lazo, Vol. 716, 1994 (např. Milligan a kol., str. 228-241).

Podle navrhovaného vynálezu může být přežívání tkání a orgánů, transplantovaných pacientu, v případě nutnosti prodlouženo potlačením buněčné odpovědi na IFN. Odhojení tkáňového štěpu je zprostředkováno histokompatibilitními antigeny, přičemž syntéza MHC antigenů I třídy je závislá podnětech, zprostředkovaných IFN. Potlačením buněčné odpovědi na IFN lze tedy dosáhnout prodloužení přežívání tkáňových štěpů. Způsob prodloužení přežívání tkáňových štěpů podle navrhovaného vynálezu zahrnuje vnesení rekombinantní DNA molekuly, obsahující 1R1B1 nebo IR1B4 cDNA sekvenci nebo její část, operativně spojenou s promotorem v orientaci antisense, do buněk tkáně nebo orgánu, určeného pro transplantaci pacientovi a tedy zajištění exprese anti-sense IR1B1 nebo IR1B4 RNA v takto transfekovaných/transformovaných buňkách.

Rekombinantní DNA může být do buněk tkáně nebo orgánu vnesena kterýmkoliv v oboru známým způsobem, vhodným pro tento účel. Poté co byla rekombinantní DNA molekula vnesena do buněk tkáně nebo orgánu může následovat transplantace zmíněné tkáně nebo orgánu pacientu, kteiý takovou transplantaci potřebuje.

Farmaceutický prostředek s obsahem rekombinantní DNA molekuly, která je expresním vekto55 rem a která obsahuje IR1B1 nebo IR1B4 cDNA operativně spojenou s promotorem v sense

-6CZ 299096 B6 orientaci, může být injikován přímo do tkáně nádoru, tj. do mozkového nádoru a metastazujících nádorových uzlin. Buňky takto ošetřeného nádoru se tak stávají citlivějšími k IFN a lépe odpovídají na exogenní IFN terapii, která je součástí léčby rakoviny. Zvýšená odpověď buněk na exogenní IFN terapii vede k inhibici růstu maligních buněk.

Přenos genů in vivo nebo ex vivo je dobře popsán například v Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, vol. 716, 1994; viz. například G. E. Plautz, „Direct Gene Transfer for the Understanding and Treatment of Human Disease“ na str. 144-153 a Roemer a kol., Mechanisms of Action of the p53 Tumor supressor and Prospects for Cancer io Gene Therapy by Reconstitution of p53 function“ na str. 265-282. Rekombinantní DNA molekuly jsou vkládány do buněk tkání nebo orgánů, určených pro transplantaci nebo do nádorové tkáně pomocí adenovirových vektorů, retrovirových vektorů, vektorů na bázi adenovirus-asociovaného viru (AAV), stejně jako pomocí přímých DNA injekcí nebo oligonukleotid-lipozómových injekcí. Jsou známy klinické pokusy, kdy byly vektory na bázi retrovirů injikovány do mozkových nádorů nebo kdy byly adenoviry použity pro infekci buněk horních cest dýchacích.

Farmaceutické prostředky podle navrhovaného vynálezu obsahují rekombinantní DNA molekuly, nesoucí IR1B1 nebo IR1B4 cDNA, nebo její fragment, operativně spojený s promotorem v sense nebo anti-sense orientaci vzhledem ke zmíněnému promotoru, v množství dostatečném pro dosažení požadovaných účinků. Navíc mohou farmaceutické prostředky obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče nebo pomocné látky, které rekombinantní DNA molekulu stabilizují nebo usnadňují její podávání.

Další z provedení navrhovaného vynálezu se týká molekul, obsahujících antigen-vazebné místo protilátky, specifické pro IFNAR1 vazebné proteiny IR1B1 nebo IR1B4 nebo jejich fragmenty. Takové molekuly jsou určeny pro použití v diagnostice. Příkladem mohou být imunodetekční metody pro stanovení hladin IR1B1 nebo IR1B4 proteinů v nádorové tkáni získané biopsií, nebo pro použití pro purifikaci proteinů pomocí afinitní chromatografíe.

Termínem „protilátka“ jsou zde označeny polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), chimémí protilátky, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky, protilátky sjedním řetězcem a rekombinantní cestou získané lidské protilátky, stejně jako aktivní frakce zmíněných protilátek, získaná kteroukoliv známou metodou, jako například (ale nikoliv pouze) enzymatickým štěpením, syntézou peptidů nebo rekombinantními technikami.

Polyklonální protilátky jsou heterogenní populací protilátkových molekul, získanou ze séra živočichů, imunizovaných antigenem. Monoklonální protilátka je v zásadě homogenní populace protilátkových molekul, specifických k danému antigenu, která obsahuje v podstatě podobná epitopvazebná místa. Způsoby přípravy monoklonálních protilátek (mAb) jsou v oboru dobře známé.

Viz. například Kohler a Milstein, Nátuře 256: 495297 (1975); patent US 4 376 110; Ausubel a kol., eds., supra, Harlow and lané ANTIBODIES: A Faboratory Manual, Cold Spring Harbor Faboratory (1988); a Colligan a kol., eds. CURRENT PROTOCOFS IN IMMUNOFOGY, Green Publishing Association and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993). Obsah zmíněných publikací je zde zahrnut odkazem. Zmíněné protilátky mohou být protilátkami kterékoliv imunoglobu45 línové třídy včetně IgM, IgG, IgA, IgE a GIFD a kterékoliv jejich podtřídy. Hybridomy produkující protilátky podle vynálezu mohou být kultivovány in vitro, in šitu nebo in vivo. Metody in šitu nebo in vivo jsou díky produkci vyšších titrů mAb používány nejčastěji.

Chimémí protilátky jsou takové molekuly, jejichž různé části pocházejí z různých živočišných druhů, například variabilní oblast je myšího původu a konstantní oblast je z lidského imunoglobulinu. Chimémí protilátky jsou používány především pro snížení imunogenicity při aplikaci a pro zvýšení výtěžků při jejich produkci. Pokud mají například myší protilátky vyšší výtěžky při produkci v hybridomech, ale zároveň vyšší imunogenicitu při použití u lidí, používají se chimémí lidské/myší monoklonální protilátky. Chimémí protilátky i způsoby jejich přípravy jsou již v oboru známé (Cabilly a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison a

-7CZ 299096 B6 kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855 (1984); Boulianne a kol., Nátuře 321: 643-646 (1984); Cabilly a kol., Evropská patentová přihláška 125023 (publikována 14. listopadu 1984); Neuberger a kol., Nátuře 314:268-270 (1985); Taniguchi a kol., Evropská patentová přihláška 171496 (publikována 19. února 1985); Morrison a kol., Evropská patentová přihláška 17394 (publikována 5. března 1986), Neuberger a kol., PTC přihláška WO 86/01533 (publikována 13. března 1986); Kudo a kol., Evropská patentová přihláška 184187 (publikována 11. června 1986); Morrison a kol., Evropská patentová přihláška 173494 (publikována 5. března 1986); Sahagan a kol., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson a kol., PCT přihláška, WO 97/02671 (publikována 7. května 1987); Liu a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443 (1987); Sun a io kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 214-218 (1987); Better a kol., Science 240: 1041-1043 (1988); a Harlow a Lané, ANTIBODIES : A LABORATORY MANUAL, supra.

Anti-idiotypová (anti-Id) protilátka je protilátka, rozeznávající unikátní determinanty, obecně asociované s antigen-vazebným místem protilátky. Anti-Id protilátka může být připravena imunizací živočicha stejného druhu a genetického typu (například myší kmen), jaký byl zdrojem protilátky, proti které je anti-Id protilátka připravována. Imunizovaný živočich rozeznává idiotypové determinanty imunizující protilátky a odpovídá na ně produkcí protilátek, namířených proti těmto idiotypovým determinantem (anti-Id, Ab). Viz. například patent US 4 699 880.

Anti-Id protilátky mohou být použity také jako „imunogen“ pro indukci imunitní odpovědi u ještě dalšího živočicha, který poté produkuje tzv. anti-anti-Id protilátky. Anti-anti-Id protilátky mohou být specifické vůči stejnému epitopů, jako původní mAb, která indukovala tvorbu anti-Id protilátek. S použitím protilátek proti idiotypovým determinantem mAb lze identifikovat další klony, které exprimují protilátky identické specifity.

Protilátkou podle navrhovaného vynálezu může být intaktní protilátka jako například mAb, aleje to jen epitop-vazebné místo protilátky, které má požadovanou funkci. Proto mohou být namísto intaktní protilátky použity proteolytické fragmenty protilátek jako Fab nebo F(ab')₂ fragmenty.

Navíc DNA, kódující variabilní oblast protilátky, může být vložena do genu pro jinou protilátku a tak mohou být produkovány chimémí protilátky (viz. například patent US 4 816 567), nebo do genu pro receptory T buněk, čímž vznikají klony T buněk se stejnou specifitou (viz. Eshhar Z. a kol., Br. J. Cancer Suppl., 10:27-29, 1990; Gross G. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:10024-10028, 1989). Stejně tak mohou být připraveny a použity i protilátky s jediným řetěz35 cem. Jednořetězcové protilátky mohou být složené jednořetězcové polypeptidy s antigen-vazebnými schopnostmi, obsahující pár aminokyselinových sekvencí, homologických nebo analogických s variabilními oblastmi lehkého a těžkého řetězce imunoglobulinu (spojení Vh-V_l nebo jediný řetězec F_v). Oba řetězce, Vh i V_L, mohou kopírovat sekvence přirozených monoklonálních protilátek, nebo jeden z řetězců nebo i oba mohou obsahovat CDR-FR konstrukt takového typu, jaký byl popsán v patentu US 5 091 513. Jednotlivé polypeptidy, analogické variabilním oblastem lehkého a těžkého řetězce, jsou navzájem spojeny polypeptidovou spojkou. Příprava takových protilátek, především v případě, kdy je DNA kódující polypepetidové struktury V_H a V_L řetězců známá, může probíhat v souladu se způsoby, popsanými například v patentech US 4 946 778; US 5 091 513 a US 5 096 815.

Termín „molekula, která obsahuje antigen-vazebné místo protilátky“ tedy zahrnuje nejen intaktní molekulu imunoglobulinu kteréhokoliv izotypu a produkovanou kteroukoliv živočišnou buněčnou linií nebo mikroorganismem, ale také jen relativní frakci zmíněné molekuly včetně (ale nikoliv výhradně) Fab fragmentu, Fab' fragmentu, F(ab')₂ fragmentu, variabilní oblasti těžkého a/nebo lehkého řetězce zmíněné protilátky a chimémí nebo jednořetězcové protilátky obsahující zmíněnou reaktivní frakci, stejně jako i další typy molekul nebo buněk, do nichž byla zmíněná reaktivní frakce protilátky fyzicky vložena. Příkladem mohou být chimémí receptory T-buněk nebo T-buňky, nesoucí na svém povrchu zmíněný receptor, nebo molekuly, vyvinuté jako transportéry terapeutických jednotek, tedy tak, že část molekuly obsahuje zmíněnou reaktivní frakci.

-8CZ 299096 B6

Přestože byl vynález nyní úplně popsán, budou jeho jednotlivé aspekty snáze pochopitelné, budou-li vysvětleny na příkladech. Následující příklady jsou uvedeny pro ilustraci a v žádném případě nejsou limitující ve smyslu omezení rozsahu navrhovaného vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Dva lidské proteiny, 1R1B1 a IR1B4, se váží na receptor pro IFN. io

Do vektoru BluesScript (BS-SK+, Stratagene) byl klonován cDNA fragment kódující celou IFNAR1-IC doménu, amplifikovaný pomocí PCR s použitím BamHI-sense primerů (5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (SEQ ID NO:5)) a EcoRI-anti-sense primerů (5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (SEQ ID NO:6)). BamHI-SalI fragment tohoto BS-IFNAR1-IC konstruktu byl vnesen do pGBTio vektoru (CloneTech) a fúzován ve fázi za Gal 4 DNAvazebnou doménu (pGBIj₀-IFNARl-IC) za účelem testování pomocí two-hybrid systému. Two-hybrid testovací metoda (Fields a Song, 1989) byla použita v modifikované podobě podle Durfee a kol. (1993) s použitím pACT plazmidové cDNA knihovny z lidských B-buněk, transformovaných virem Epstein Barrové (EBV) pro kotransformaci kvasinkového reportérového kmene Y153 spolu s pGBTio-IFNARl-IC. Kvasinkový kmen Y153 nese má reportérové geny pod kontrolou GAL1 upstream aktivační sekvence (UAS), které mohou být transkribovány pouze pokud je obnovena aktivita Gal 4 transkripčního faktoru. K tomu dojde, pokud má fúzní protein, kódovaný pACT plazmidem, který byl vnesen do tohoto konkrétního kvasinkového klonu, afinitu klFNARl-IC doméně zpGBTio plazmidu. Jedním z reportérových genů je GAL1 His3, který umožňuje růst na médiu postrádajícím histidin; druhý reportérový gen je GAL-LacZ, který zajišťuje β-galaktosidázovou aktivitu. Navíc nesou pACT plazmidy gen Leu2, umožňující růst na médiu postrádajícím leucin a pGBTio plazmidy nesou gen TRPÍ, který umožňuje růst na médiu bez tryptofanu. Kolonie byly selektovány na syntetickém médiu SC bez Trp, Leu a His v přítomnosti 25 mM 3-aminotriazolu (který umožňuje selekci na His prototrofii). Rostoucí kolonie byly dále testovány na β-galaktosidázovou aktivitu pomocí testu s X-gal filtrem (Breeden a Naysmith, 1985).

Bylo získáno 9 pozitivních klonů kvasinek a pACT plazmidy byly z těchto klonů získány transfekcí do E. coli HB101 buněk a selekcí leu+ transformantů. Pro každou kvasinkovou DNA byly izolovány dva E. coli HB101 klony. Částečné sekvenování DNA pACT plazmidů z těchto klonů prokázalo, že patří do dvou skupin cDNA sekvencí, které byly popsány jako IR1B1 a IR1B4. pACT plazmidy zIRlBl a IR1B4 skupin byly podrobeny testům specificity kontransformací kvasinkového reportérového kmene sFY-526 (Bartel a kol., 1993) s pAS plazmidy, nesoucími lamin, cdk2 a p53, nebo jiné kontrolní inzerty (CloneTech). Kolonie, které rostly na SC -trp, -leu médiu, byly testovány na expresi β-galaktosidázy. Ze specificky pozitivních pACT plazmidů byly inzerty vystřiženy Xhol, klonovány do BS KS (Stratagene) a sekvenovány zT7 a T3 promotorů s použitím DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit na přístroji 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems). Na obrázku 1 jsou vidět výsledky kontransfekce kvasinek kmene SFY526 plazmidem pATC nesoucím IR1B1 a různými pAS nebo pGBT|₀ návnadami („bait“). Kvasinky byly pěstovány na selektivním SC médiu -trp, -leu na filtru v proužcích 1 až

9. Barvení činidlem X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl^-D-galaktopyranosid) bylo pozitivní jen u proužků 2 a 4. Jak je vidět z obrázku 1, proužek 4 je kontrolní vzorek kvasinky nesoucí aktivní lacZ gen. V kvasinkách proužku 2 byly spojeny IR1B1 a IFNAR1-IC fúzní protein. IR1B1 samotný (proužek 9) ani jakákoliv jiná kombinace, kromě zmíněné IR1B1 a IFNAR1-IC, nevykazovaly β-galaktosidázovou aktivitu. Proto je možné říci, že IR1B1 protein je schopen specificky vázat IC doménu IFNAR1 řetězce IFN receptoru. Obrázek 2 podobně ukazuje výsledky kontransfekce kvasinek kmene SFY526 plazmidem pATC nesoucím IR1B4 a různými pAS nebo pGBTio návnadami („bait“). Kvasinky byly pěstovány na selektivním SC médiu, -trp, -leu na filtru v proužcích 1 až 8. Barvení činidlem X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl^-D-9CZ 299096 B6 galaktopyranosid) bylo pozitivní jen u proužků 3 a 7. Jakje vidět z popisu v rámečku pod obrázkem, proužek 7 je kontrolní vzorek kvasinky nesoucí aktivní lacZ gen. V kvasinkách proužku 3 byly spojeny IR1B4 a IFNAR1-IC fúzní protein. Stejně jako v předchozím případě se samotným IR1B1 ani IR1B4, ani jakákoliv jiná kombinace, kromě zmíněné IR1B4 a 1FNAR1-IC, nevyka5 zovaly β-galaktosidázovou aktivitu. Proto je možné říci, že i IR1B4 protein je schopen specificky vázat IC doménu IFNAR1 řetězce IFN receptoru.

Příklad 2: Sekvence IR1B1 proteinu vykazuje kalcium-vazebná „EF Hand“ místa.

Inzerty cDNA byl z plazmidů pACT-IRlBl vystřiženy restrikčním enzymem Xhol, nakloňovány do vektoru Bluescript BS-KS a sekvenovány zT7 a T3 promotorů s použitím DyeDeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kit na přístroji 373A DNA Sequencer (Applied Biosystems). Nejdelší plazmid měl sekvenci 830 nukleotidů (obr. 3), následovanou Gal4 aktivační doménou a spojovací sekvencí pACT plazmidu a byl zde nalezen ORF (otevřený čtecí rámec) o délce 191 aminokyselin (obr. 3). Byl proveden on-line průzkum proteinových databází s pomocí algoritmu BlastP (Altschul a kol., 1990) a Bioaccelerator alignment (Heinkoff a Heinkoff, 1992). Nejvyšší podobnost byla nalezena pro kalcitraktin (CATRHUMAN, accession Swiss Protein SW New P41208) a to 62,1% podobnost a 32,4% identita aminokyselin 52 až 173. Druhým nalezeným velmi podobným proteinem byl kalcineum B (CALB_NAEGR, Accession Swiss Protein P42322; CALB HUMAN, accession P06705) vykazující 59,8% podobnost a 32,5% identitu aminokyselin 50 až 171.

Na obrázku 4 je znázorněno porovnání sekvence IR1B1 se sekvencemi lidského kalcineurinu B (CALB) a kalciteaktinu (CATR). Kalcium vazebné helix-smyčka-helix „EF-hand“ domény jsou vyznačeny tučně a podtržené. IR1B1 má dvě EF-hand místa, ale první dvě EF-hand domény nejsou konzervativní. IR1B1 vykazuje homologii s oběma proteiny; s kalcineurinem B (na obr. 4 znázorněno vertikálními linkami) i s kalcitraktinem (na obr. 4 vyznačeno dvojtečkami). Ovšem IR1B1 je zcela zřejmě nový, odlišný lidský protein, který dosud nebyl popsán.

Příklad 3: IR1B1 je interferonem indukovaný genový produkt.

Buňky lidské myelomové linie U266S (suspenze asi 3 x 10⁶ buněk v 5 ml kultury) byly ošetřeny rekombinantním IFN-a8 (2 x 10⁸ IU/mg z bakterií) nebo rekombinantním IFN-β (3 x 10⁸ IU/mg z CHO buněk) v množství 750 IU/ml po dobu 2 nebo 18 hodin. Poté byly buňky sklizeny a extrahovány Tri reagencií (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio), což je produkt, obsahující guanidium thiokyanát a fenol. Extrahovaná RNA byla přesrážena ethanolem, denaturována formaldehydem a analyzována na elektroforéze ve formaldehyd-agarózových gelech (10 pg

RNA/dráhu) a přenesena na GeneScreen Plus (Dupont, New England Nuclear, Billerica, MA). Northern blot byl dále zpracován reakcí s 10⁶ cpm IR1B1 cDNA značené pomocí soupravy Rediprime kit (Ammersham UK) za použití ³²P-dCTP a náhodných primerů.

Na obrázku 5 je vidět že IR1B1 cDNA hybridizovala s 1,1 kb fragmentem RNA. Množství

IR1B1 mRNA se znatelně zvýšilo 2 hodiny po aplikaci IFN-β na kulturu U266S buněk. Ovšem 18 hodin po aplikaci IFN IR1B1 mRNA z buněk vymizela, z čehož vyplývá, že indukce IFN je rychlá a přechodná. Mnoho IFN indukovaných mRNA se v buňce akumuluje i více než 24 hodin po aplikaci IFN (Revel a Chebath, 1986).

Bylo ověřeno, že se stejné množství RNA nachází ve všech dráhách. Jakje vidět ve spodní části obrázku 5, hybridizace U266S (bohaté na IFN receptory) RNA s 18S ribozomální cDNA sondou ukazuje stejné množství 18S rRNA v každé dráze (zobrazena je pouze ta část blotu, obsahující 18S rRNA). V dalším experimentu, kde bylo pro indukci použito 1200 U/ml IFN, byla IR1B1 mRNA pozorována 2 hodiny po indukci IFN-a8, ale nikoliv 30 minut po indukci (není zobrazeno).

-10CZ 299096 B6

Bylo zjištěno, že IR1B1 mRNA má stejnou velikost 1,1 kb v různých lidských buněčných liniích (U266S, Daudi a THP-1 buňky). Tato velikost je blízká velikosti mRNA lidského kalcitraktinu, ale liší se výrazně od velikosti mRNA lidského kalcineurinu B (2,5 kb). Malá velikost mRNA je v dobré shodě s malou velikostí proteinu IR1B1 (20 kDa).

Příklad 4: IR1B4 protein váže IFNAR1 in vitro.

Byla testována vazba IR1B4 klC-doméně IFNAR1. IR1B4 protein byl syntetizován i s krátkou proteinovou značkou („tag“, „flag“ sekvence) pomocí in vitro translace v lyzátech retikulocytů a takto připravený protein byl zreagován s rekombinantním IFNAR1 IC fúzním proteinem v E. coli. pACT IR1B4 DNA z příkladu 1, vystřižená Xhol a doplněná na tupé konce Klenowovým fragmentem byla klonována do PECE-flag expresního vektoru (Ellis a kol., 1986), rozštěpeného EcoRI a doplněného na tupé konce. Notl-BamHI fragment obsahující ve správném čtecím rámci flag-IRlB4 fúzní sekvenci byl znovu nakloňován do plazmidu Bluescript BS-SK, rozštěpeného Notl-BamHI, a to po směru transkripce od T3 promotoru. Fúzovaná sekvence byla ověřena sekvenací z T3 promotoru. S pomocí T3 polymerázy a 1 pg BamHI linearizované BSflag-IRlB4 DNA byla provedena in vitro transkripce (Promega kit). Translace in vitro byla provedena v lyzátu králičích retikulocytů (Promega kit) s [³⁵S]methioninem (Amersham) a 5 pg

RNA transkriptů (1 hodina, 30 °C). Produkty byly před použitím ošetřeny RNázou. GSTIFNAR1-IC fúzní protein byl připraven klonováním BamHI-EcoRI inzertu BS-IFNAR1-1C (viz výše) do stejného místa pGEX2 (Pharmacia Biotech). GST a GST-IFNAR1-1C byly exprimovány v E. coli a vyčištěny vazbou na glutathion-agarózu (Sigma).

Anti-flag M2 agarózové kuličky pocházely od Kodak Scíentific Imaging Systems. Monoklonální protilátky IFNAR3 proti α-složce IFN receptoru (IFNAR1) byly laskavě poskytnuty Dr. O. Colamonici (Colamonici a kol., 1990) a byly použity v ředění 1:100. Králičí protilátky proti C-terminálnímu peptidu IFNAR1-IC (Ab 631) byly připraveny a použity pro imunoprecipitaci IFNAR1 zBrij extraktů (0,75 ml) z 2 x 10⁷ lidských myelomových U266S a U266R buněk s inhibitory proteáz (detailní popis viz výše) (Ambrovich a kol., 1994) s tím rozdílem, že kuličky s navázaným proteinem G (Pharmacia) byly použity smAb IFNaR3. SDS-PAGE a analýza na přístroji FUJIX BAS1000 Phosphor-Imager byly provedeny stejně, jako již bylo popsáno (Harroch a kol., 1994),

Nejprve bylo ověřeno, že je imunoprecipitaci translačních produktů pomocí anti-flag protilátek získán proteinový produkt o velikosti asi 32 kDa (Obrázky 6A a 6B). Použití anti-flag protilátek je na obrázcích 6A a 6B znázorněno značkou + a znamená to, že radioaktivní translační produkt IRlB4-flag fúzní mRNA (in vitro transkribované zodpovídajícího DNA konstruktu) reagoval s anti-flag M2 protilátkou navázanou na agarózové kuličky (produkt Kodak Scientific Imaging

Systems). Translatovaný protein, obsahující 1R1B4 sekvenci fúzovanou s flag aminokyselinovou sekvencí, byl navázán na zmíněnou anti-flag protilátku na povrchu agarózových kuliček, a po oddělení kuliček centrifugací byl protein eluován pufrem s obsahem SDS a nanesen na SDSPAGE. Zmíněná reakce slouží jako kontrola, že je očekávaný fúzní protein opravdu přítomen.

Kuličky Glutathion-Sepharose (Sigma) s navázaným fúzním proteinem GST (glutathion S-transferáza) s IFNAR1-IC byly přidány k lyzátu retikulocytů, ve kterém probíhala translační reakce. Kuličky byly zcentrifugovány promyty a navázané proteiny byly uvolněny 1% SDS a analyzovány na SDS polyakiylamidové gelové elektroforéze (PAGE). Bylo zjištěno, že se 32 kDa protein, značený ³⁵S-methioninem váže pouze ke GST-IFNAR-IC, ale nikoliv ke GST samotnému (obr.

6A). To je důkazem, že se IR1B4 váže přímo na izolovaný IFNAR1-IC peptid.

V dalším experimentu byla ověřena interakce IR1B4 s IFNAR1 proteinem tak, jak je přítomen v membránách lidských buněk. Detergentové extrakty lidských myelomových buněk U266 byly smíchány stranslačním produktem IR1B4 mRNA, značeným ³⁵S-methioninem, získaným trans55 lácí v lyzátech retikulocytů. IFNAR1 protein byl imunoprecipitován pomocí monoklonální

-11 CZ 299096 B6 protilátky IFNaR3, specificky reagující s vnější doménou IFNAR1 (od Colamonici a kol., 1990). Analýza na SDS-PAGE prokázala přítomnost 32 kDa pruhu odpovídajícího IRlB4-flag fúznímu proteinu (obr. 6B) tam, kde buněčné extrakty pocházely z U266S buněk (bohatých na IFN receptory), ale nikoliv u extraktů z U266S buněk, které jsou mutantní ΙΕΝ-α,β-rezistentni linií

U266, která na svém povrchu postrádá IFN receptory (Abramovich a kol., 1994). Stejný pruh, odpovídající proteinu o velikosti 32 kDa byl pozorován po reakci U266S extraktu s Ab 631, která specificky reaguje s C-terminální doménou IFNAR1 a IFNAR1 protein byl precipitován pomocí anti-flag Ab, když byly Cos-7 buňky transfektovány flag-IRlB4 a lidskou IFNAR1 cDNA. Tyto výsledky prokázaly, že IR1B4 specificky váže intaktní IFNAR1 z lidských buněk.

Příklad 5: IR1B4 cDNA a proteinové sekvence.

Nukleotidová sekvence IR1B4 cDNA obsahuje otevřený čtecí rámec, kódující 361 aminokyselin dlouhý protein (obr. 7). Tato lidská cDNA kóduje 1,5 kb dlouhou konstitutivně exprimovanou poly-A+ mRNA v nejrůznějších lidských buňkách včetně U266 myelomových buněk. Pomocí počítačových programů BlastP (Altschul a kol., 1990) a Bioaccelerator Alignment (Heinkoff a Heinkoff, 1992) byly prohledány on-line proteinové databáze a bylo zjištěno, že IR1B4 je jedinečným členem rodiny protein-arginin methyltransferáz. Při porovnávání programem AFIGN bylo zjištěno, že krysí PRMT1 cDNA, popsaná Lin a kol. (1996 GenBank sequence I.D. 1390024: Accession U6082) je jedinou homologickou sekvencí (81,4 %). Na úrovni aminokyselinové sekvence (obr. 8) se IR1B4/PRMT od PRMT1 na N-konci výrazně liší; prvních 19 aminokyselin je zcela odlišných. N-terminální sekvenování IR1B4 by bylo nebylo poskytlo žádný náznak homologie IR1B4 sPRMTl. Byla zjištěna homologie i dalšího již popsaného lidského proteinu HCP-1 (Nikawa a kol., 1996; GenBank accession D66904) s IR1B4. Ovšem HCP-1 se liší v aminokyselinové sekvenci aminokyselin v polohách 147-175 (obr. 9). HCP-1 byl původně popsán na základě své schopnosti komplementovat mutaci irel5 u kvasinek ajeho enzymatická funkce nebyla dříve popsána (Nikawa a kol., 1996). Proto je IR1B4 považován za nový lidský protein.

Příklad 6: IR1B4 protein vykazuje po vazbě na IFNAR1-IC methyltransferázovou aktivitu.

Methyltetransferázová aktivita může být koimunoprecipitována z lidských buněčných extraktů spolu s IFNAR1 receptorem. Extrakty, získané pomocí činidla Brij z lidských U266S buněk reagovaly přes noc při teplotě 4 °C s a nebo bez anti-IFNARl Ab 631 (Abramovich a kol., 1994). Po dobu 1 hodiny byla poté směs inkubována s kuličkami potaženými proteinem A (40 μΐ 50% IPA 400 fast flow, Repligen). Kuličky byly poté promyty a inkubovány po dobu 30 min. při teplotě 30 °C v 0,1 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 μΜ (0,25 μϋί) ¹⁴C-(methyl)-S-adenosyl methioninu (Ammersham) a 100 μg histonů (typ IIA z telecího thymu, Sigma). In vitro methylace histonů byla provedena v podmínkách popsaných Fin a kol. (1996). Radioaktivita histonového pruhu byla analyzována po SDS-PAGE (15% akrylamid) na přístroji Phosphor-imager. Histony značené ^l4C-methylem byly zjištěny ve vzorku, kde byly kuličky potaženy anti-IFNARl Ab, ale nikoliv v případě kontrolní reakce (obr. 10). Proto lze říci, že protein methyl-transferázová aktivita je konstitutivně asociována s IFN receptorovým řetězcem zmíněných lidských buněk. Podobná enzymová aktivita byla prokázána po imunoprecipitací IFNAR1 pět minut po přidání IFN-β k U266S buňkám.

Příklad 7: Účast IR1B4/PRMT1 na působení IFN.

Chemickou cestou byl syntetizován anti-sense oligodeoxynukleotid fosforothionát (Stein a kol., 1989), komplementární k sekvenci nukleotidů v poloze 12-33 v blízkosti iniciačního kodonu IR1B4 cDNA (AS-1; anti-sense sekvence 5'-GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3', SEQ ID

- 12CZ 299096 B6

NO: 12). Oligonukleotidy byly v den 0 přidány k U266S buňkám, rozpipetovaným v 96 jamkové mikrotitrační destičce (8000 buněk/jamku/0,2 ml RPMI 10% FCS), a to ve finální koncentraci 10 μΜ. V den 2 byly oligonukleotidy přidány ještě jednou, a to ve finální koncentraci 5 μΜ. V den 0 byl přidán ještě IFN-β v koncentracích 64 nebo 125 IU/ml. Po 3 dnech kultivace bylo přidáno do každé jamky 20 μΐ Almar Blue, kolorimetrického indikátoru hustoty buněk, jehož funkce je založena oxidačně redukční reakci (Biosource, Camarillo, CA) a buňky byly s barvivém inkubovány dalších 6 až 7 hodin. Intenzita barevné reakce byla měřena spektrofotometricky (microplate, ELISA reader) s použitím testovacího filtru 530 nm a referenčního filtru 630 nm. Měření bylo provedeno opakovaně a v paralelách. Byla ověřena korelace růstové křivky s počtem živých buněk a optickou denzitou (OD). Methyltransferázová aktivita byla měřena následujícím způsobem. Buňky z odpovídajících jamek byly lyžovány několikanásobným zmražením a opětovným rozmražením v 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 (25 μΐ/jamku), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 40 pg/ml leupeptinu a aprotoninu, 20 pg/ml pepstatinu a 1 μΜ PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid). Reakce probíhala v 50 μΐ s 25 μΐ buněčného extraktu, 100 μΜ peptidu Rl (Najbauer a kol., 1993, získaný zGenosis, Cambridge, UK), 3 pCi [³H]-methyl-S-adenosylmethioninu (Ammersham, 73 Ci/mmol) po dobu 30 min. při teplotě 30 °C. Po elektroforéze v 16% SDS poylakrylamidovém gelu, fixaci v 50% methanolu a 10% kyselině octové a po opracování Amplify® (Ammersham) byla provedena autoradiografie (8 dnů). Měřením inkorporace triciem značených methylových skupin do Rl peptidového substrátu bylo zjištěno, že zmíněná AS-1 anti-sense DNA je schopna velmi silně snížit protein-arginin methyltransferázovou aktivitu v U266S buňkách (obr. 11). Výsledky tohoto pokusu byly použity pro další studium úlohy, kterou zmíněný enzym zastává při působení IFN. Působení interferonu jako inhibitoru růstu bylo vybráno, neboť v tomto případě je nej snazší přímá kvantifikace v buňkách a také proto, že již byla popsána interakce krysího PRMT1 s genovým produktem ovlivňujícím růst (Fin a kol.,

1 996). Přidání anti-sense oligonukleotidů 1 (AS-1), který je komplementární k sekvenci poblíž iniciačního kodonu IR1B4/PRMT cDNA, snížilo inhibiční efekt IFN-β na růst lidských myelomových buněk U266S (obr. 12). To znamená, že v přítomnosti anti-sense AS-1 vykazovaly interferonem ošetřené buňky intenzivnější růst (což vylučuje jakýkoliv toxický efekt fosforothionátů). Růst v nepřítomnosti IFN nebyl nijak znatelně ovlivněn. Sense oligonukleotid S-3, odpovídající stejné cDNA oblasti, měl ve srovnání s AS-1 jen malý vliv (S-3, obr. 12). Sense S-3 oligonukleotid měl také jen malý efekt na úrovni inhibice enzymové aktivity (obr. 11). Další anti-sense fosfotothioát oligonukleotid AS-2 (SEQ ID NO: 13) směrovaný proti střední části cDNA sekvence a komplementární k nukleotidům 572-592 sekvence SEQ ID NO:7 neměl téměř žádný účinek (obr. 12). Až pětinásobná redukce inhibičního účinku IFN-β na myelomové buňky, částečně deficientní v PRMT aktivitě, anti-sense 1 oligonukleotidem je důkazem že asociace IR1B4/PRMT enzymu s IC doménou IFNAR1 receptoru má funkční význam pro působení interferonu na buňky.

Zmíněné experimenty také prokázaly, že IR1B4 protein methyluje peptidové substráty enzymů třídy PRMT, jakým je například Rl peptid Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NO:11; Najbauer a kol., 1993), který byl použit v pokusu, jehož výsledky jsou zobrazeny na obr. 11. Methylace proteinů na argininových skupinách v sousedství glycinových zbytků (tj. jako u výše uvedeného peptidu) by mohla být takovým typem modifikace proteinů, jaká, stejně jako fosforylace, slouží k přenosu signálu do buňky. Skupina hnRNP proteinů je cílem působení PRMT enzymů a protože tyto enzymy ovlivňují úpravu RNA, sestřih, transport a stabilitu RNA (Liu a Dreyfuss, 1995), může jejich methylace sehrát roli v post-transkřípění kontrole genové exprese. IR1B4/PRMT protein, vážící řetězec IFN receptoru, jak zde bylo prokázáno, může zprostředkovat změny v expresi genů v závislosti na IFN signálu. Prostřednictvím IFN receptoru mohou být methylovány další proteinové substráty včetně dalších složek komplexu IFN receptoru a transkripčních faktorů. Lin a kol. (1996) prokázal, že vazba krysího PRMT1 na růstovým faktorem indukované proteiny aktivuje PRMT1 a modifikuje jeho substrátovou specifitu, dost možná odstraněním některých inhibujících proteinů asociovaných s PRMT1 v buněčné cytoplazmě. Lze očekávat podobnou aktivaci, způsobenou vazbou IR1B4 na IFNAR1 řetězec IFN receptoru.

- 13CZ 299096 B6

Závěr

Byl popsán nový IRB1 protein, který interaguje s intracytoplazmatickou doménou IFNAR1 řetězce IFN receptoru I typu. Exprese tohoto proteinu je indukována velmi rychle a zároveň jen na přechodnou dobu působením IFN na lidské buňky. Pro IR1B1 je typická přítomnost helixsmyčka-helix EF-hand míst, která jsou společným znakem kalcium-vazebných proteinů. Tok Ca²⁺ iontů je součástí mechanizmu působení interferonů, především prvotní buněčné odpovědi a změn v buněčné morfologii a v organizaci cytoskeletu (Tamm a kol., 1987). Ca²⁺ aktivované ío enzymy mohou v odpověď na IFN produkovat tzv. druhé posly („second messenger“), jako například diacylglycerol. Dále, kalmodulinu podobné proteiny regulují množství proteinkináz a aktivita zmíněných drah byla pozorována v buňkách ošetřených IFN (Tamm a kol., 1987). Je pravděpodobné, žeje IFN receptor vazebný protein IR1B1 součástí podobných Ca²⁺ dependentních účinků IFN na buňku.

Pomocí metody two-hybrid systém byl nalezen a identifikován další protein, reagující sIFNARlIC doménou, IR1B4. Ukázalo se, že je IR1B4 protein členem enzymové rodiny protein-arginin methyltransferáz (PRMT1; Lín a kol. 1996). Je známo, že tento protein methyluje celou řadu RNA a DNA vazebných proteinů, především heterologní jaderné ribonukleoproteiny (hnRNP). hnRNP se účastní transportu mRNA z jádra do cytoplazmy, alternativního sestřihu pre-mRNA a post-transkripční kontroly (Liu a Dreyfuss, 1995). IR1B1 a IR1B4/PRMT1 proteiny, které se váží na IFNAR1-IC doménu, představují nový signální mechanizmus interferonů, který existuje vedle již známé Jak-Stat dráhy, popsané Damell a kol. (1994).

Poté co byl vynález takto detailně popsán je jistě odborníkům zřejmé, že podobných výsledků lze dosáhnout v širokém rozmezí ekvivalentních parametrů, koncentrací a podmínek, aniž bychom se odchýlili od původní myšlenky a rozsahu vynálezu.

Přestože byl navrhovaný vynález popsán ve spojitosti s konkrétními způsoby provedení, je nutné podotknout, že vynález může být dále modifikován. Tato patentová přihláška by měla pokrýt všechny variace, způsoby použití a adaptace vynálezu, které obecně splňují principy navrhovaného vynálezu, a to včetně odchylek od navrhovaného znění vynálezu, které jsou v souladu s běžnou praxí v oboru, kterého se vynález týká a které se mohou týkat základních vlastností vynálezu tak, jak zde byly popsány a tak, jak jsou vymezeny dále v patentových nárocích.

Všechny citované odkazy, včetně článků v časopisech a abstraktů, publikovaných nebo podaných US nebo jiných zahraničních patentových přihlášek, udělených US nebo zahraničních patentů a jakýchkoliv dalších referencí jsou zde uvedeny výhradně jako literární odkazy včetně veškerých dat, tabulek, obrázků a textů, uvedených v citovaných odkazech. Navíc i celkový obsah odkazů, citovaných v odkazech, citovaných zde je součástí navrhovaného patentu výhradně ve smyslu literárního odkazu.

Odkazy na známé metodologické postupy, běžné metodologické postupy, známé způsoby nebo běžné způsoby v žádném případě neznamenají, že by byl některý z aspektů, vysvětlení nebo způsobů provedení navrhovaného vynálezu byl obsažen, navržen nebo alespoň předpokládán při současném stavu techniky. Předchozí popis specifických způsobů provedení vynálezu natolik podrobně odhaluje obecnou povahu vynálezu, že může kdokoliv na základě aplikace běžných znalostí z oboru (včetně obsahu literárních odkazů, citovaných zde) snadno modifikovat a/nebo přizpůsobit jednotlivá konkrétní provedení vynálezu pro nejrůznější aplikace bez zbytečného experimentování a aniž by se odchýlil od základního konceptu navrhovaného vynálezu. Z toho důvodu jsou zmíněné adaptace a modifikace také považovány za předmět navrhovaného vynálezu. Je nutné zde uvést, že terminologie a frazeologie, použitá zde, byla zvolena pro účely popisu vynálezu, nikoliv z důvodu jeho vymezení, a tudíž by měla být použitá technologie a frazeologie interpretována odborníky ve světle popisu a vysvětlení, prezentovaných zde v kombi55 naci se znalostmi dosavadního stavu techniky.

-14CZ 299096 B6

Literární odkazy:

Abramovich, C., Shulman L. M., Ratovitski E., Harroch S., Tony M., Eid P. and Revel M. (1994)

Differential tyrosine phosphorylation of the IFNAR chain of the type I Interferon receptor and of an associated surface protein in response to IFN-α and IFN-β EMBO J. 13: 5871-5877.

Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W. and Lipman D. J. (1990) Basic local alignment research tool. J. Mol, Biol., 215: 403210.

BarterP. L., Chien C. T., Stemglanz R. and Fields S. (1993) Elimination of falše positives ío thartarise in using the two-hybrid systém. BioTechniques, 14: 920-924.

Boldin Μ. P., Vorfolomeev Ε. E., Pancéř Z., Mett I. L., Camonis J. H. and Wallach D. (1995) A novel protein that interacts with the death domain of Fas/APOl contains a sequence motif related to the death domain. J, Biol. Chem,, 270: 7795-7798.

Breeden L. and Naysmith K., (1995) Regulation of the yeast HO gene. Cold Spring Harbor

Symp. Quant Biol. 50: 643-650.

Colamonici O. R., D'Alessandro F., Diaz M. O., Gregory S. A., Necker L. M. and Nordan R. (1990) Characterization of three monoclonal antibodies thar recognize the Interferon-cc2 receptor. Proč. Nati. Acad. Sci USA 87: 7230-7234.

Damell J. E., Kerr I. M. and Stark G. R. (1994) Jak-Stat pathways and transcriptional activation in response to IFNs and other extracellular signaling proteins. Science 15: 1721-1723.

David M., Chen Η. E., Goelz S., Laner A. C. and Neel F. G. (1995a) Differential regulation of the alpha/beta Interferon stimulated Jak-Stat pathway by the SH2 domain-containing tyrosine phosphataseSHTPTl. Mol. Cell. Biol., 15: 7050-7058.

David M., Petricoin Ε. III, Benjamin C., Pine R., Weber M. J. and Lamer A. C. (1995b)

Requirement for MAP kinase (ERK.2) activity in Interferon-a-and Interferon^-stimulated gene expression through Stát proteins. Science, 269: 1721-1723.

David M., Petricoin Ε III and Lamer A. C. (1996) Activation of protein kinase A inhibits interferon induction of the Jak/Stat pathway in U266 cells. J. Biol, Chem,, 271:45852588.

Deiss L. P. and Kimchi A. (199) A genetic tool ušed to identify thioredoxin as a mediator of a growth inhibitory signál. Science, 252: 117-120.

Domanski P., White M., Kellum M., Rubinstein M., Heckett R., Pitha P. and Colaminici O. R. (1995) Cloning and expression of a long form of the beta subunit of the Interferon alpha beta receptor, that is required for signaling. J, Biol. Chem,, 270: 21606-21611.

Durfee T., Becherer K., Chen P. L., Yeh S. H., Yang Y., Kalbum A. E., Lee W. H. and Elledge S.

(1993) The retinoblastoma protein associates with the protein phosphatase type I catalytic subunit. Genes & Devpt,, 7: 555-569.

Ellis L., Clauser E., Morgan D. O., Edery M., Roth R. A. and Rutter W. J. (1986) Replacement of insulin receptor tyrosine residues 1162 and 1163 compromises insulin-stimulated kinase activity and uptake of 22eoxyglucose, Cell, 45: 721-731.

Fields S. and Song O. (1989). A novel genetic systém to detect protein-protein interactions. Nátuře 340: 245-246.

Guerini D. et al (1989). DNA 8: 675-682.

Harroch S., Revel M. and Chebath J. (1994). Interleukin-6 signaling via four transcription factors binding palindromic enhancers of different genes. J, Biol, Chem., 269: 26191-26195.

Henikoff S. and Henikoff J. G. (1992) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919.

- 15CZ 299096 B6

Kagan R. M. and Clarke S. (1994) Widespread occurrence of three sequence motifs in diverse Sadenosyl-methionine-dependent methyltransferases suggests a common structure for these enzymes. Arch. Biochem. Biophys., 310: 417—427.

Lee V. D. and Huang B. (1993) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90:11039-11043.

Leung S., Quershi S. A., Kerr I. M., Damell J. E. and Stark G. R. (1995) Role of Stat2 in the alpha Interferon signaling pathway. Mol. Cell, Biol. 15:1312-1317.

Lin W. J., Gary J. D., Yang M. C., Clarke S. and Herschman H. R. (1996). The mammalian immediate-early TIS21 protein and the leukemia-associated BTG1 protein interact with the protoein-arginin methyltransferase. J. Biol. Chem., 271: 15034-15044.

ío Liu Q. and Dreyfuss G. (1995), in vivo and in vitro arginin methylation of RNA binding proteins. Mol. Cell Biol., 15:2800-2808.

Najbauer J., Johnson B. A., Young A. L. and Asward D. W. (1993). Peptides with sequences similar to glycine arginine rich motifs in proteins interacting with RNA are efficientyl recognized by methyltransferases modifying arginin in numerous proteins. J. Biol. Chem., 268: 10501—

10509.

Nikawa J. I., Nakano H. and Ohi N. (1996) Structural and functional conservation of human yeast HCPI genes which can supress the groxth defect of the sacharomyces cerevisiae irel 5 mutant. Gene, 171: 107-111.

Revel M. (1984). The interferon systém in man: nátuře of the interferon molecules and mode of 20 action. In Becker I. (ed.), Antiviral Drugs avd Interferon. The Molecular Basis of their Activity,

Martinus Nijhoff Publ., Bostoon, pp. 357-433.

Revel M. and Chebath J. (1986). Interferon Activated Genes. Trends Biochem Sci., 11: 166-170.

Stein C. A., Subasinghi C., Shinozuka K. and Cohen J. S. (1989). Physicochemical properties of phosphorothionate oligodeoxynucleotides. Nucleic Acids Res., 16: 3209-3221.

Tamm I., Lin S. L., Pfeffer L. M. and Sehgal P. B. (1987). Interferons alpha nad beta as cellular regulátory molecules. In Gresser, I. (ed.), Interferon 9, Acad. Press, London, pp. 14-74.

Uze G., Lutfalla G. a Gresser I. (1990). Genetic transfer of a functional human Interferon a receptor into mouše cells: cloning and expression of its cDNA. Cell, 60: 225-234.

Wickstorm E. (1991). In: Prospects for Antisense Nucleic Acid Therapy of cancer and AIDS, pp. 30 7-24, Wiley-Liss, New York.

Yang C. H., Shi W., Basu L., Murti A., Constantinescu S. N., Blatt L., Croze E., Mullersman J. E. and Pfeffer L. M. (1996). Direct association of Stat3 with the TFNAR-1 chain of the human type I Interferon receptor J. Biol, Chem., 271:8057-8061.

SEZNAM SEKVENCÍ (1) Obecné informace:

(i) Žadatel: Revel, Michael

Chebath, Judith Abramovich, Carolina (ii) Název vynálezu: Nové proteiny vážící IFN receptor I, DNA kódující zmíněné proteiny a způsob modulace buněčné odpovědi na interferony.

(iii) Počet sekvencí: 13 (iv) Adresa pro korespondenci:

(A) Adresa: Browdy and Neimark

- 16CZ 299096 B6 (B) Ulice: 419 Seventh Street, N. W., Suitě 300 (C) Město: Washington (D) Stát: D. C.

(E) Země. USA (F) Zip: 20004 (v) Počítačově zpracovatelná forma:

(A) Typ média: disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS ío (D) Software: Patentln Release #1.0, verze #1.30 (vi) Data o současné žádosti:

(A) Číslo žádosti: US (B) Datum podání: Klasifikace:

(vii) Data o předchozí žádosti:

(A) Číslo žádosti: 08/667184 (B) Datum podání: 20. ledna 1996 (vii) Data o předchozí žádosti:

(A) Číslo žádosti: US 60/035,636 (B) Datum podání: 15. ledna 1997 (viii) Údaje o právním zastoupení:

(A) Jméno: Browdy, Roger L.

(B) Číslo registrace: 25,618 (C) Reference/Číslo spisu: Revel-14 PCT (ix) Telekomunikační informace:

(A) Telefon: 202-628-5197 (B) Telefax: 202-737-3528 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 830 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (ix) Vlastnosti:

(A) Název/klíčové slovo: CDS (B) Lokalizace: 43 ... 615 (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

COTCTCOAOO CGAGTTGGCG GAGCTGTGCG CGCGGCGGGG CG ATG GGG GGC TCG

102

M»t Gly Gly Str

GGC

AGT

CGC

CTG

TCC

AAG

GAG

CTG

CTG

GCC

GAG

TAC

cag

GAC

TTG

ACG

Oly 5

Ser Jug

X«u

Ser

Xy· 10

Glu

Leu

Leu

Ale

Glu 15

Tyr

Gin

Αβρ

Leu

Thr 20

TTC

cre

ACG

AAG

CAG

GAG

ATC

CTC

CTA

GCC

CAC

AGG

CGG

TTT

TGT

GAG

Phe

Leu

Thr

Lye

Gin 25

Glu

Ile

Leu

Leu

Ala 30

BÍb

Arg Arg

Phe

cya 35

Glu

CTG

CTT

CCC

CAG

GAG

CAG

CGG

AGC

GTG

GAG

TCG

TCA

CTT

CGG

GCA

CAA

Leu

Leu

Pí O

Gin 40

Glu

Gin

ATg

Ser

Vel 45

Glu

Ser

Ser

Leu

Arg 50

Ala

Gin

GTG

CCC

TTC

GAG

CAG

ATT

CTC

AGC

CTT

CCA

GAG

CTC

AAG

GCC

AAC

CCC

Vel

pro

Phe 55

Glu

Gin

Xle

Leu

Ser 60

Leu

Glu

Leu

Lye 65

Ala

Asn

pro

ISO

198

246

- 17CZ 299096 B6

TTC AAG GAG	CGA ATC	TGC AGG	GTC TTC	TCC ACA TCC Ser Thr Ser 80	CCA GCC AAA GAC	29«
Phe	Lye Glu 70	Arg	ile	Cye	Arg 75	val	Phe	Pro	Ala Lys Aep
AGC	CTT AGC	TTT	GAG	GAC	TTC	CTG	GAT	CTC CTC AGT	GTG	TTC AGT GAC	342
Sex 85	Leu S«r	Phe	Glu	ASp 90	Phe	Leu.	Asp	Leu Leu Ser 95	Val	•Phe Sor Asp xOo
ACA	GCC ACG	CCA	GAC	ATC	AAG	TCC	CAT	TAT CCC TTC	CGC	ATC TTT GAC	390
Thr	Ala Thr	Pro	Asp 105	Xle	lys	Ser	HlS	Tyr Ala Phe 110	Arg	ile Phe Asp 115
TTT	GAT GAT	GAC	GGA	ACC	TTG	AAC	AGA	GAA GAC CTG	AGC	CGG CTG CTG	438
Phe	Asp Asp	Asp 120	Gly	Thr	Leu	Asn	Arg 125	Glu Aop heu	Ser	Arg X<eu Val 130
AAC	TGC CTC	ACG	GGA	GAG	GGC	GAG	GAC	ACA CGG CTT	AGT	GCG TCT GAG	486
Asn	Cye Leu 13 5	Thr	Gly	Glu	Gly	Glu l«o	Asp	Thr Arg Leu	Ker 145	Ala Ser Glu
ATG	AAG CAS	CTC	ATC	GAC	TAC	ATC	CTG	GAA GAG TCT	GAC	ATT GAC AGG	S34
Mac	Lya Ola 150	Leu	ne	Asp	Tyr 155	Zle	Leu	Glu Glu Ser 160	Asp	Ile Aep Arg
GAT	GGA AC3	ATC	AAC	CTC	TCT	GAG	TTC	CAG CAC GTC	ATC	TCC CGT TCT	S82
Asp 165	Gly The	Ile	Asn	LeU 170	Ser	Glu	Phe	Gin Hia Val 175	Xle	Ser Arg Ser 180
CCA Pro	GAC TTT Asp Phi	GCC Ala	AGC Ser 185	TCC Ser	TTT Phe	AAG lys	ATT Zle	GTC CTG TGACAGCAGC CCCAGCGTGT Val Leu 190	635

CTCCT0GCAC CCTCTCGAAG AACCTTTCTA CTGCTGAGCT GTGGCCAAGG TCAAGCCTGT 695 GTTGCCAGTG CGGGCCAAGC TSGCCCASCC TGGAOCTGGC GCTQTGCAGC CTCACCCCGG 755 GCAGGGGCGO CCCTCGTTOT CAGGGCCTCT CCTCACTGCT GTTGTCATTG CTCCGTTTGT 815 GGGCCTTCGT GGCCA 830 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 191 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:

Met: 1

Gly Gly

Ser

Gly 5

Ser

Arg

Leu

Ser

Lye 10

Glu

Leu

Leu

Ala

Glu 15

Tyr

Gin

Asp

LOU

Thr 20

Phe

Leu

Thr

Lye

Gin 25

Glu

Ile

Leu

Leu

Ala 30

His

Arg

Arg

Phe

Cye 5 5

Glu

Leu

Leu

Pro

Gin 40

Glu

Gin

Arg

Ser

Val 45

Glu

Ser

Ser

Leu

Arg 50

Ala

Gin

Val

Pro

Phe SS

Glu

Gin

Ile

Leu

Ser 60

Leu

Pro

Glu

Leu

Lye 65

Ala

Atm

Pro

Phe

Lys 70

Glu

Arg

Ile

Cye

Arg 75

val

Phe

Ser

Thr

Ser 80

Pro

Ala

Lye

Asp

Ser 85

Leu

Ser

Phe

Glu

Aep 90

Phe

Leu

Aep

Leu

Leu 95

Ser

Val

Phe

Sor

Aep 100

Thr

Ala

Thr

Pro

Asp 105

Ile

Lys

Ser

His

Tyr 110

Ala

Phe

Arg

Ile

Phe 115

Asp

Phe

Aep

Aep

Aep 120

Gly

Thr

Leu

Asn

Arg 125

Glu

Aep

Leu

Ser

Arg 130

Lťiu

Val

Asn

cys

Leu Thr 135

Gly

Glu

Gly

Glu 140’

Asp

Thr

Arg

Leu

Ser 145

Ala

Sor

Glu

Mefc

Lys 150

Gin

Leu

Xle

Asp

Tyr 155

Zle

Leu

Glu

Glu

Ser 160

Aep

Ile

Anp

Arg

Asp 165

Gly

Thr

Ile

Asn

Leu 170

ser

GlU

Phe

Gin

His 175

Val

ile

ser

Aig

Ser 180

Pro

Aep

Phe

Ala

Ser 185

Ser

Phe

Lye

Ile

Val 190

Leu

-18CZ 299096 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:3:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 170 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová

(D) Topologie: lineární

(ii) Typ molekuly: peptid

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:3:

Met Oly Αβη Glu Ale Ser Tyr pro Leu Glu Met Cys Ser Hi· Phe Aep

1 S 10 is

Ala Asp Glu Ile Lys Arg Leu Gly Lye Arg Phe Lye Lye Leu Asp Leu

20 25 30

Αερ Αβη ser Gly Ser Leu Ser Val Glu Glu Phe Met Ser Leu Pro Glu

35 40 45

Leu Gin Gin Aan Pro Leu Vel Gin Arg Val Ile Aep Ile Phe Asp Thr

Π0 55 6o

Aep Gly Αβη Gly Glu Val Asp Phe Lys Glu Phe Ile Glu-Gly Val Ser

65 70 75 80

Gin :?he Ser Val Lye Gly Aep Lys Glu Gin Lye Leu -Arg,Phe Ala Phe

83 90 95

Arg Ile Tyr Aep Met Aep Lye Aep Gly Tyr Ile Ser Aen Gly Glu Leu

100 105 110

Phe Gin Val Leu Lye Met Met Val Gly Aen Asn Leu Ly* Aep Thr Gin

lis 120 125

Leu 3ln Gin Ile Val Aep Lye Thr Ile Ile Aen Ala Aep Lye Aep Gly

130 135 140

Asp 31y Arg Ile Ser Phe Glu Glu Phe Cye Ala Val Val Gly Gly Leu

145 ISO 155 160

Aep Ile Hie Lye Lye Met Val Val Aep Val

165 170 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:4: (i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 172 aminokyselin

	(B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární
(ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:
Met 1	Ala Ser Aen Phe Lye Lys 5	Ala	Asn	Met 10	Ala	Ser	Ser	Ser	Gin 15	Arg
Lye	Arg Met Ser pro Lye Pro 20	Glu	Leu 25	Thr	Glu	Glu	Gin	I/ys 30	Gin	Glu
Ile	.Arg Glu Ala Phe Aap Leu 35	Phe 40	Aep	Ala	Asp	Gly	Thr 45	Gly	Thr	Ile
Aep	Val Lye Glu Leu Lys Val HO 55	Ala	Met	Arg	Ala	Leu 60	Gly	Phe	Glu	Pro
Lye 65	Lye Glu Glu ile Lye Lye 70	Met	Zle	Ser	Glu 75	Zle	Aap	Lys	Glu	Gly 80
Thr	Gly Lye Met Aen Phe Gly 85	Asp	Phe	Leu 90	Thr	Val	Met	Thr	Gin 95	Lys
Met	Her Glu Lys Aep Thr Lye 100	Glu	Glu 105	Ile	Leu	Lya	Ala	Phe 110	Lys	Leu

-19CZ 299096 B6

Phe

Asp Aep 115

Asp

Glu

Thr Gly Lya 120

Ile

Ser

Phe

Lys

Asn 125

Leu

Lys

Arg

Val

tkla H30

Lya

Glu

Leu

Oly Glu Aen 13 S

Leu

Thr

Asp

Glu 140

Glu

Leu

Gin

Glu

Met 145

Ule

Aep

Glu

Ala

Aep Arg Aep 150

Gly Aep

Gly 155

Glu

Vel

Ser

Glu

Gin ISO

Glu

Phe

Leu

Arg

Ile 155

Met Lya Lya

Thr

Ser 170

Leu

Tyr

(2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 31 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA io (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:

CTGAGGATCC AAAGTCTTCT TGAGATGCAT A (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 25 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

TGACGAATTC CTATCATACA AAGTC (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:7:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 1308 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:7:

OCCGCGAACT GCATC ATG GAS AAT TTT GTA GCC ACC TTG GCT AAT GGG ATG Met Glu Aan Phe Vet Ale Thr Leu Ala Aen Gly Met

195 200

AGC

CTC

CAG

CCG

CCT

CTT

GAA

GAA

GTG

TCC

TGT

GGC

CAG

GCG

GAA

AGC

Ser

Leu 205

Oln

Pro

Pro

Leu

Glu 2x0

Glu

val

Ser

Cye

Gly 215

Gin

Ala

Glu

Ser

AGT

GAG

AAG

CCC

AAC

GCT

GAG

GAC

ATG

ACA

TCC

AAA

GAT

TAC

TAC

TTT

Ser 220

Glu

Xys

Pro

Aen

Ala 225

Glu

Asp

Met

Thr

ser 230

Lys

Aep

Tyr

Tyr

Phe 235

GAC

TCC

1AC

GCA

CAC

TTT

GGC

ATC

CAC

GAG

GAG

ATG

CTG

AAG

GAC

GAG

Aep

Ser

lyr

Ala

Hle 2<0

Phe

Gly

Ile

His

GlU 245

Glu

Met

Leu

Lys

Aep 250

Glu

GTG

CGC

ICC

ctc

ACT

TAC

CGC

AAC

TCC

ATG

TTT

CAT

AAC

CGG

CAC

CTC

Val

Arg

Thr

Leu 255

Thr

Tyr Arg

Aen

Ser 26Q

Met

Phe

Hle

A&n

Arg 255

His

t»eu

Sl

147

195

243

-20CZ 299096 B6

TTC AAG CAC AAG GTG GTG CTG GAC GTC GGC TCG GGC ACC GGC ATC CTC 291

Phe Lys .top Lys val Val Leu Asp val Gly Ser Gly Thr Gly Ile Leu

270 275 260

TGC ATG 3TT GCT GCC AAG GCC GGG GCC CGC AAG GTC ATC GGG ATC GAG 339

Cys Met Phe Ala Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lys Val Ile Gly He Glu

265 290 295

TGT TCC AGT ATC	TCTftGAT TAT GCG GTG AAG ATC GTC AAA GCC AAC AAG	387
Cys Ser Jier 300	ne	Ser	ABp 305	Tyr	Ala	Val Lys Ile 310	Val	Lys	Ala Asn Lys 315
TTA GAC CAC	GTG	στο	ACC	ATC	ATC	AAG GGG AAG	GTG	GAG	GAG GTG GAG	435
Leu Asp H:.s	Val	val 320	Thr	Ile	Ile	Lys Gly Lys 325	Val	Glu	Glu Val Glu 330
CTC CCA GTG	GAG	AAG	GTG	GAC	ATC	ATC ATC AGC	GAG	TGG	ATG GGC TAC	483
Leu Pro Val	Glu 335	Lys	Val	Asp	Ile	Ile Ile Ser 340	Glu	Trp	Met Gly Tyr 345
TGC CTC TTC	TAC	GAG	TCC	ATG	CTC	AAC ACC GTG	CTC	TAT	GCC CGG GAC	531
Cye Leu Phe 3LO	Tyr	Glu	Ser	Met	Leu 355	Asn Thr Val	Leu	Tyr 360	Ala Arg Asp
AAG TGG CTG	GCG	CCC	GAT	GGC	CTC	ATC TTC CCA	GAC	CGG	GCC ACG CTG	579
Lys Trp Leu 365	Ala	Pro	Asp Gly 370	Leu	Ile Phe Pro	Asp 37S	Arg	Ala Thr Leu
TAT GTG ACG	GCC	ATC	GAG	GAC	CGC	CAG TAC AAA	GAC	TAC	AAG ATC CAC	627
Tyr Val Thr 380	Ala	ile	Glu 385	Asp	Arg	Gin Tyr Lye 390	Asp	Tyr	Lys Ile His 395
TGG TGG GtG	AAC	GTG	TAT	GGC	TTC	GAC ATG TCT	TGC	ATC	AAA GAT GTG	675
Trp Trp G3u	Asn	val 4 00	Tyr	Oly	Phe	Asp Met Ser 405	Cys	Ile	Lys Asp Val 410
GCC ATT AÍ.G	GAG	CCC	CTA	GTG	GAT	GTC GTG GAC	CCC	AAA	CAG CTG GTC	723
Ala Ile Lja	Glu 415	Pro	Leu	Val	Aep	Val Val Aep 420	Pro	Lys	Gin Leu Val 425
ACC AAC GCC	TGC	CTC	ATA	AAG	GAG	GTG GAC ATC	TAT	ACC	GTC AAS GTG	771
Thr Asn Ala 430	Cys	Leu	ile	Lys	Glu 435	Val Asp Ile	Tyr	Thr 440	Val Lys Val
GAA GAC CTG	ACC	TTC	ACC	TCC	CCG	TTC TGC CTG	CAA	GTG	AAG CGG AAT	819
Glu Asp Leu 44S	Thr	Phe	Thr	Ser 450	Pro	Phe cys Leu	Gin 455	Val	Lys Arg Asn
GAC TAC GTG	CAC	GCC	CTG	GTG	GCC	TAC TTC AAC	ATC	GAG	TTC ACA CGC	867
Asp Tyr Val 460	HiS	Ala	Leu 465	Val	Ala	Tyr Phe Asn 470	Xle	Glu	Phe Thr Arg 475
TGC CAC AJOG	AGO	ACC	GGC	TTC	TCC	ACC AGC CCC	GAG	TCC	CCG TAC J&a	915
Cye His lys	Arg	Thr 460	Gly	Phe	Ser	Thr Ser Pro 465	Glu	Ser	Pro Tyr Thr 490
CAC TGG AAG	CAG	ACG	GTG	TTC	TAC	ATG GAG GAC	TAC	CTG	ACC GTG AAG	963
His Trp lys	Gin 495	Thr	Val	Phe	Tyr	Met Glu Asp soo	Tyr	Leu	Thr Val Lys SOS
ACG GGC GAG	GAG	ATC	TTC	GGC	ACC	ATC GGC ATG	CGG	CCC	AAC GCC AAG	1011
Thr Gly Glu 510	Glu	Ile	Phe	Gly	Thr SIS	Ile Gly Met	Arg	Pro 520	Asn Ala Lys
AAC AAC CCG	GAC	CTG	GAC	TTC	ACC	ATC GAC CTG	GAC	TTC	AAG GGC CAG	1059
Asn Asn Arg 52S	Asp	Leu	Asp	Phe 530	Thr	Ile Asp Leu	Aep 535	Phe	Lys Gly Gin
CTG TOC GAG Leu Cye Glu	CTG Leu	TCC Ser	TGC Cys	TCC Ser	ACC Thr	GAC TAC CGG Aep Tyr Arg	ATG Met	CGC Arg	TGAGGCCCGG	1108

540 545 550

CTCTCCCGCC CTGCACGAGC CCAGGGGCTG AGCGTTCCTA GGCGGTTTCG GGGCTCCCCC 1168 TTCCTCTCCC TCCCTCCCGC AGAAGGGGGT TTTAGGGGCC TGGGCTGGGG GGATGGGGAG 1226 GGCACATTGG GACTGTGTTT TTCATAAATT ATGTTTTTAT ATGGTTGCAT TTAATGCCAA 1286 TAAATCCTCfl GCTGGGGAAA 1308

-21 CZ 299096 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:8:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 361 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein

(xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:8:
Met Olu Asn Phe Val Ala Thr Leu Ala Asn Gly Met Ser Leu 15 10	om 15	Pro
Pro Leu Glu Glu Val Ser Cys Gly Gin Ala Glu Ser Ser Glu	Lys	Pro
20 25 30
Asii Ala Glu Asp Met Thr Ser Lys Asp Tyr Tyr Phe Asp Ser	Tyr	Ala
J5 «0 <5
His Phe Gly Xle His Glu Glu Met- Leu Lys Asp Glu Val Arg	Thr	Leu
50 55 60
Thr Tyr Acg Asn Ser Mst Phe Kie Asn Arg Hle Leu Phe Lys 65 70 75	Asp	•Lys 80
val val Lsu Asp Val Gly Ser Giy Tnr oiy ne ueu Cys Met SS 90	Phe 95	Ala
Ala Lys Ala Gly Ala Arg Lye val Xle Gly Xle Glu Cys Ser	Ser	Xle
100 105 110
Ser Asp Tyr Ala val Lve Xle Val Lys Ala Aen Lys Leu Aap	His	Val
115 120 125
Val Thr Xle Xle Lys Gly Lys Val Glu Glu Val Glu Leu Pro	Val	Glu
130 135 HO
Lys Val Aep Xle Ile Ile Ser Glu Trp Met Gly Tyr úys Leu US 150 155	Phe	Tyr 160
Glu Ser Met Leu Asn Thr Val Leu Tyr Ala Arg Asp Lys Trp 165 170	Leu 175	Ala
Pro Asp Gly Leu Xle Phe Pro Asp Arg Ala Thr Leu Tyr Val	Thr	Ala
ISO 185 190
Xle Glu Asp Arg Gin Tyr Lys Asp Tyr Lys Xle His Trp Trp	Glu	Asn
195 200 205
Val Tyr Cly Phe Asp Mat Ser Cys Xle Lva Asp Val Ala Xle	Lys	Glu
310 215 220
Pro Leu Val Asp Val val Aap Pro Lys Gin Leu Val Thr Asn ”5 330 235	Ala	Cys 240
Leu xle lys Glu Val Aep Xle Tyr Thr Val lys Val Glu Asp 245 250	Leu 255	Thr
Phe Thr far Pro Phe Cye Leu Gin Val Lys Arg Asn Aep Tyr Val	Híg
260 265 370
Ala Leu Val Ala Tyr Phe Asn Ile Glu Phe Thr Arg Cye His	Lye	Arg
375 280 265
Thr Gly Phe Ser Thr Ser Pro Glu Ser Pro Tyr Thr His Trp	Lye	Gin
290 295 300
Thr Val We Tyr Mat Glu Asp Tyr Leu Thr Val Lye Thr Gly 305 310 315	Glu	Glu 320
Ile Phe Gly Thr xle Gly Met Arg Pro Asn Ala Lye Aen Aen 325 330	Arg Aep 335
Leu Aec Phe Thr Xle Asp Leu Asp Phe Lys Gly Glu Leu Cys	Glu Leu
340 345 350

Ser Cys Ser Thr Asp Tyr Arg Met Arg 355 350

-22CZ 299096 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:9:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 353 aminokyselin 5 (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:9:

Met Ala 1	Ala	Ala	Glu Ala Ala Asn Cya Xle Met Glu Val Ser Cys Gly
s	10	15
Gin Ala	Glu	Ser 20	Ser Glu	Lys Pro Asn Ala 25	Glu Aap Met Thr Ser Lye 30
Aap Tyr	Tyr 35	Phe	Asp Ser	Tyr Ala His Phe 40	Gly Ile His Glu G\u Met 45
Leu Lys 53	Asp	Glu	Val Arg	Thr Leu Thr Tyr 55	Arg Asn ser Met Phe His 60
Asn Arg 65	HiS	Leu	Phe Lys 70	Asp Lys Val Val	Leu Asp Val Gly Ser Gly 75 80
Thr Gly	Ile	Leu	Cys Met 65	Phe Ala Ala Lys 90	Ala Gly Ale Arg Lys Val 95
Ile Gly	Xle	Glu 100	Cys Ser	Ser Ile Ser Asp 105	Tyr Ala Val Lye Zla Val 110
Lys Ala	Asn 115	Lys	Leu Asp	His Val Val Thr 120	Xle Ile Lys Gly Lye Val 125
Glu Glu 1)0	val	Glu	Leu Pro	Val Glu Lys Val 135	Asp Ile Ile Zle Ser Glu 140
Trp M>st 145	Gly Tyr	Cys Leu 150	Phe Tyr Glu Ser	Met Leu Asn Thr Val Leu 156 160
Kle Ala	Arg	Asp	Lys Trp 165	Leu Ala Pro Asp 170	Gly Leu Ile Phe Pro Asp 175
Arg Ala	Thr	Leu'Tyr Val ISO	Thr Ala Zle Glu 185	Asp Arg Gin Tyr Lye Asp 190
Tyr irf*	Ile X9S	Hle	Tip Trp	Glu Asn val Tyr 200	Gly Phe Aep Met Ser Cys 305
Ile Lyt: aic>	Aep	Val	Ala Zle	Lya Glu Pro Leu 215	Val Asp Val Val Asp Pro 220
Lys Gin 225	Leu	Val	Thr Aen 230	Ala cys Leu Xle	Lye Glu Val Asp Ile Tyr 235 240
Thr Val.	Lye	Val	Glu Aap 245	Leu Thr Phe Thr 250	Ser Pro Phe Cys Leu Gin 255
Val Lyii	Arg	Asn 260	Asp Tyr	Val His Ala Leu 365	Val Ala Tyr Phe Aen Xle 270
Glu Ph.»	Thr 275	Arg	Cys Hie	Lys Arg Thr Gly 280	Phe Ser Thr Ser Pro Glu 285
ser pro 290	Tyr	Thr	His Tip	Lys Gin Thr Val 295	Phe Tyr Met Glu Asp Tyr 300
Leu The 305	Val	Ly0	Thr Gly 310	Glu Glu Zle Phe	Gly Thr Ile Gly Met Arg 315 320
Pro Ae.i	Ala	Lys	Asn Asn 32S	Arg Aep Leu Aap 330	Phe Thr-Ile Aap Leu Aap 335
Phe Lys	Gly	Gin 340	Leu Cys	Glu Leu Ser Cys 345	Ser Thr Asp Tyr Arg Met 350

Arg

-23 CZ 299096 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 10:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 360 aminokyselin 5 (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 10:

Met: 1

Glu

Asn

Phe

Val 5

Ala

Thr

Leu

Ala

Asn 10

Gly

Met

Ser

Leu

Gin 15

Pro

Pro

XrfiU

Glu

Glu 20

Val

Ser

Cys

Gly

Gin 25

Ala·

Glu

Ser

Ser

Glu 30

lys

Pro

Asn

ACa

Glu 35

Asp

Bet

Thr

Ser

Lys 40

Asp

Tyr

Tyr

Phe

Aap 45

Ser

Tyr

Ala

His

Phe 50

Gly

xle

His

Glu

Glu 55

Met

Leu

Lys

Asp

Glu 60

Val

Arg

Thr

Leu

Thr 65

Tyr

Arg

Asn

Ser

Met 70

Phe

His

Asn

Arg

Hle 75

Leu

Phe

Lye

ASP

lys 80

Val

Val

Leu

Asp

val 85

Gly

Ser

Gly

Thr

Gly 90

Xle

Leu

Cye

Met

Phe 95

Ala

Ala

Lye

Al*

Gly 100

Ala

Arg

Lys

Val

xle 105

Gly

Xle

Val

Cys

Ser 110

Ser

Ile

Ser-

A«p

Tyr 11S

Ala

Val

Lye

Xle

Val 120

Lye

Ala Asn lye

Leu Asp 125

Hla

Val

val

Thr 130

xle

Xle

Lys

Gly

Lya 135

Val

Glu

Glu

Val

Glu 140

Leu

Pro

val

Glu

Lys 145

Val

Ala

Ser

Ser

ser ISO

Ala

Ser

Gly

Trp

Ala 155

Thr

Ala

Ser

Ser

Thr 160

Ser

Pro

Cya

Ser

Thr 165

Pro

cy«

Ser

Bet

Pro 170

Gly

Thr

Ser

Val

Ala 175

Pro

Aep Gly

Leu

Xle 180

Phe

Pro

Aep Arg

Ala 185

Thr

Leu

Tyi

Val

Thr 190

Ala

Xle

Glu Aep

Arg 195

Gin

Tyr

Lys Aep

Tyr 200

Lye

Xle

Kle

Trp

Trp 20$

Glu

Asn

Val

Tyr Gly 310

Phe

Asp

Met

Ser

Cys 215

xle

Lye

Aep

Val

Ala 220

Xle

Lys

Glu

Pro

Leu 225

Val

Asp

Val

Val

Aap 230

Pro

Lye

Gin

Leu

Val 235

Thr

Asn

Ala

Cys

Leu 240

Xle

Lye

Glu

Val

Asp 245

Xle

Typ

Thr

val

Lys 250

Val

Glu

Asp

Leu

Thr 255

Phe

Thr

Ber

pro

Phe 260

Cys

Leu

Gin

Val

Lye Arg 265

Asn

Asp

Tyr

V*1 270

His

Ala

Leu

Val

Ala 275

Tyr

Phe

Asn

Xle

Glu 280

Phe

Thr

Arg

Cys

Kle 285

Lye

Arg

Thr

Gly

Phs 29 3

ser

Thr

Ser

Pro

Glu 295

Ser

Pro

Tyr

Thr

His 300

Trp

Lye

Gin

Thr

Val 305

Phs

Tyr

Met

Glu

Aep 310

Tyr

Leu

Thr

val

Lye 31S

Thr

Gly

Glu

Glu

Xle 320

Phe

Gly

Thr

XI©

Gly 325

Met

Arg

Pro

Asn

Ala 330

lys

Asn

Asn

Arg

Asp 335

leu

Asp

Phe

Thr

xie 340

Aep

X<eu

Aep

Phe

Lys 345

Gly

Gin

Leu

Cys

Glu 350

Leu

Ser

Cys

Se;r

Thr 355

Asp

Tyr

Arg

Met

Arg 360

-24CZ 299096 B6 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 11:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 10 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: peptid (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 11:

ío Gly Gly Phe Gly Gly Arg Gly Gly Phe Gly 1 5 10 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 12:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 22 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 12:

GGCTACAAAA TTCTCCATGA TG (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO: 13:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 21 párů bází (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet řetězců: jednořetězcová (D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: cDNA (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 13:

TGGCCGTCAC ATACAGCGTG G

Claims (18)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Rekombinantní molekula DNA, obsahující sekvenci kódující IFNAR1 receptor—vazebný 40 protein, který může být indukován IFN—a, nebo IFN—β a který má aminokyselinovou sekvenci

   SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:8.
2. 2. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1 dále obsahující promotor, operativně spojený se zmíněnou sekvencí kódující IFN AR 1 receptor-vazebný protein v „sense“ orientaci tak, že po

   45 vnesení rekombinantní molekuly do vhodného hostitele zmíněný promotor zajistí expresi zmíněné sekvence.
3. 3. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 2, kde zmíněný promotor je silným konstitutivním promotorem v lidských buňkách.

   -25 CZ 299096 B6
4. 4. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 1, kde zmíněná sekvence je nukleotidová sekvence SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO:7.
5. 5. Rekombinantní DNA molekula obsahující DNA molekulu obsahující nukleotidovou sekven5 ci SEQ ID NO:1 nebo SEQ ID NO:7 v orientaci buď „sense“ nebo „anti-sense“, nebo její fragment schopný hybridizovat s mRNA kódující interferonem indukovaný IFNAR1 receptorvazebný protein, a tak zabraňující jeho expresi.
6. 6. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 5.
7. 7. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 5, kde zmíněná sekvence je v orientaci „sense“.
8. 8. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 5, kde zmíněná sekvence je v orientaci „anti15 sense“.
9. 9. Rekombinantní DNA molekula podle nároku 8 obsahující rekombinantní DNA molekulu, která dále obsahuje promotor, operativně spojený se zmíněnou sekvencí v orientaci „anti-sense“ tak, že zmíněný promotor zajistí expresi „anti-sense“ RNA, komplementární k celé nebo k části

   20 „sense“ RNA kódující interferonem indukovaný IFNAR1 receptor-vazebný protein.
10. 10. Rekombinantní molekula DNA podle nároku 9, kde zmíněná nukleotidová sekvence je část z 5'- konce sekvence SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO:7.

    25
11. 11. Rekombinantní molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 2, 9 a 10, kde zmíněný promotor je interferonem indukovatelný promotor.
12. 12. Rekombinantní molekula DNA podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a 7 až 10, která je expresním vektorem.
13. 13. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 12, kteráje schopná exprese „anti-sense“ RNA komplementární k „sense“ RNA kódující interferonem indukovatelný IFNAR1 receptorvazebný protein.

    35
14. 14. Způsob prodloužení přežívání tkáňového štěpu, vyznačující se tím, že se vnese expresní vektor s obsahem rekombinantní DNA molekuly podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10 do buněk tkáně nebo orgánu, určeného pro transplantaci pacientu, jehož stav takovou transplantaci vyžaduje.

    40
15. 15. IFNAR1 vazebný protein, který má sekvenci SEQ ID NO:2 nebo SEQ ID NO:8.
16. 16. Molekula schopná vazby na IFNAR1 vazebný protein obsahující antigen-vazebnou část protilátky, specifické proti IFNAR1 vazebnému proteinu podle nároku 15.

    45
17. 17. Molekula podle nároku 16, která je monoklonální protilátkou.
18. 18. Způsob přípravy IFNAR1 vazebného proteinu, vyznačující se t í m , že zahrnuje vnesení DNA podle nároku 1 do odpovídajícího expresního hostitele tak, aby bylo možné při kultivaci zmíněného hostitele dosáhnout exprese zmíněného proteinu, a dále kultivaci zmíněného

    50 hostitele tak, aby bylo dosaženo exprese zmíněného proteinu..