CZ299698A3 - Izolovaná dimerická molekula fibroblastového aktivačního proteinu alfa a jeho použití - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynáie:

se vztanuje κ ur;

:itym moiexinaíÍi, xtere se se :encu s houbným bujením a reakčními nádorovým buňkám stroma tu. Vynález zvláště popisuje molekuly fibroblastcvého aktivačního proteinu alfa (FAPOC) . Monomencká forma molekuly se dříve identifikovala imunochemicky, ale molekuly nukleové kyseliny kódující tyto molekuly se neizolovaly ani nekiónovaly, ani když se identifikovaly diméry. Molekulová hmotnost monomerického proteinu je přibližně od 88 COO do 95 000, jak se určilo testem SDS-PAGE povážených vzorků. Molekulová hmotnost diméru je okolo 170 000, jak se určilo testem SDS-PAGE vzorků, které se nevařily. FAPCt se charakterizovaly řadou rysů a vlastností, které jsou společné a charakteristické pro enzymy vázající se na membránu, což ve<mi striktně naznačuje, že joe o enzym vázající se na membránu. Molekuly nukleové kyseliny, které tvoří klíčovou část vynálezu, se mohou použít jako sondy v případě buněk, které exprimují FAPa a jako počáteční materiál při rekombinantní produkci proteinu. Protein FAPa se pak může použít při produkcí monoklonálních protilátek, které jsou specifické pro tento protein a stávají se použitelným diagnostickým činidlem. Uvedené proteiny mají vbzhledem ke svým enzymatickým funkcím i další využiti.

Dosavadní stav techniky

Invazivní šíření zhoubného bujení epitelu se spojuje s buněčnými a molekulovými změnami v podpůrném stromatu. Například zhoubné bujení epitelu indukuje tvorbu nádoru krevních cév, vyvolává reakční nádor fibroblastů stromatu, « ·

4 4

4 44 · * lymfoidní a fagocytové infiltráty, uvolnění peptidových meziproduktů a prcteolytických enzymů a produkci pozměněné

extrabuněčné matrice	(ECM)	. Což	se popisuje například v
publikacích Folkman ,	Adv.	Cancer	Res. 43: 175-203 (1985);
Basset et al. , Nátuře	348 :	699-704	( 1990); Denekamp et al. ,
Cancer Metastasis Rev	. 9 :	267-282	(1990) ; Cullen et al. ,
Cancer Res. 51: 4978-4985 (1991); Dvorak et al., Cancer Cells

3: 77 - 85 (1991 ); Liotta et al. , Cancer Res. 51: 5054s-5059s (1991); Garin-Chesa et al., J. Histochem. Cytochem. 37: 17671776 (1989). Vysoce konzistentním molekulovým rysem stromatu v několika běžných histclogických typech zhoubného bujení epitelu je indukce fibroblastového aktivačního proteinu (FAPa), což je buněčný povrchový giykoprotein s molekulovou hmotností 95 000, který byl původně určen monoklonáiními protilátkami mAbF19, jenž se vytvořily proti proliferujícím kultivovaným fibrobiastům. Tento problém se popisuje v publikacích Rettig et al., Cancer Res. 46: 6406-6412 (1986);

Rettig et al.	, Proč. Nati.	Acad. Sci.	USA	85:	: 3110-3114
(1988)	; Garin	-Chesa et al. ,	Proč. Nati.	Acad	. USA 87: 7235-
7239	( 1990 );	Retting et al	Cancer	Res .	53 :	3327-3335
(1993)	Každá	z těchto čtyř	publi kácí	se	zde	uvádí jako

citace.

Imunohistochemické studie, jako jsou ty shora citované, naznačují, že FAPa je přechodně exprimován v určitých normálních fetálnich mezenchymálních tkáních, ale že normální dospělé tkáně obecně protein FAPa neprodukují, jsou tedy FAPa Podobně maligní epiteiiální, neuráíní a hematopoietické buňky jsou obecně FAPa’. Avšak většina obecných typů zhoubného bujení epitelu, což zahrnuje více jak 90% karcinomů prsu, plic, kůže, pankreasu a střev, obsahuje abundantní FAPa’ reakční fibrobiasty stromatu (Garin-Chesa et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 7235-7239 (1990)). FAPa’ nádorové • * * ♦ · - w - • · · · · · · · • · * · ···· ·♦· * · • * · « · · · «· ·· · · · · •Λ i

fibroblasty stromatu pravidelně doprovázejí nádor krevních cév, tvořící zřejmý buněčný útvar uložený mezinádorovým kapilárním endoteliem a bazální vrstvou malignatních eciteliálních buněk. Zatímco FAPa' fibroblasty stromatu se nacházejí primárních a metastázovaných karcinomech, benigní a premalignantní epiteliální leze, jako jsou ťibroadenomv prsu a kolorektální adencmy, pouze zřídka obsahují buňky stromatu, které jsou FAPa'. Narozdíl od stroma-specifické lokalizace FAPa v epiteliální neoplazmě, FAPa se exprimuje v malignatních buňkách velké části sarkomu kostí a měkkých tkání (Rettig et al. , Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 31103114 (1988)). Fibroblasty FAPa* se nakonec detekovaly v granulačr.i tkáni hojících se ran (Garin-Chesa et al,, J. Kistochem. Cytochem. 37: 1767-1776 (1989). Na základě omezeného distribučního paternu FAPa v normálních tkáních a jeho uniformní exprese v podpůrném stromatu řady zhoubného bujení epítelu se iniciovaly klinické studie s protilátkami mAb F19 značenými *^jlI u pacientů s metastázovým zhoubným bujením tlustého střeva (Welt et al·., Proč. Am. Assoc. Cancer Res. 33: 319 ( 1992); Welt et al, , J. Clin. Oncol. 12: 15611571 (1994)), za účelem vyjasnění cílení do nádorů stromatu při imunodetekci a imunoterapii epitellálních buněk.

Rettig et al., Int. J. Cancer 58; 385-392 (1994), diskutuje molekulu FAPa a její rysy. Rettig et al., udává, že molekula FAPa se vyskytuje ve vysokomolekulárních komplexech s molekulovou hmotností 400 000, ale nezmiňuje možnost výskytu dimerických molekul, ani neuvádí specifické enzymatické vlastnosti molekuly.

Indukce fibroblastů FAPa* v čase a v místě remodeiování tkáně během fetálního vývoje, hojení tkáně a karcinogeneze je konzistentí se základní rolí molekuly při normální fyziologii • · « · fibroblastú. Pak izolace a klonování molekul nukleové kyseliny, které kódují tuto molekulu proteinu, je zajímavá a hodnotná. Toto je jeden s předmětů vynálezu, který se detailně popisuje dále v textu. Dalším předmětem vynálezu jsou dimerícké molekuly FAPa a zxoumání vlastnosti těchto molekul.

Přehleo obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1 se porovnává dedukovaná aminokyselinová sekvence FAPa a známá sekvence CD26. Ootimalízovaio se usporaoani.. Obrazkv zobrazuji imunohistochemickci :D26 v různých tkáních. Na obrázku 2A se studuje zhoubné bujení prsu v souvislosti s FAPa (obrázek č. 2A; a CD26 (obr. č. 2B! . Na obrázku 2C až 2D se studuje maiignatní fibrózní histiocytom v souvislosti s FAPa 2C) a CD26 (obr. č. 2D) . Dermální zjizvená tkáň na obrázcích 2E (FAPa) a 2F (CD26). Renální e studuje na obrázku 20 (FAPa) a 2H

'.obrázek c se testuj buněčný karcinom (CD26) .

Obrázek č. experimentech, kt ukazuje některá data získaná v ukazují, že protein FAPa vykazuje aktivitu degradace proteinu extrabuněčné matrice (ECM;. Při zymografické detekci želatinových degradujících extraktů 293— FAP se zjistilo testem SDS-PAGE za použití nevařených vzorků, aby se uchovala enzymatická aktivita vzorků, že aktivní látka má molekulovou hmotnost 170 000.

Příklady provedení vynálezu íkiad 1 • · · • · • « · · · • ··* · ««·« « • · · · · • « ·· · · «fl

Sledovala se reakce buněčné linie fibrobiastů WI-38 s protilátkami mAb F19 (Rettig et al., Canc. Res. 46: 6406 - 6412 (1986); Rettig et al. , Proč (1988); Garein-Chesa et al.,

Nati. Acad. USA 85: 3110-3114

Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:

7235-7239 (1990 ); Rettig et al. , Canc, Res

3327-3335 (1993);. Tato linie se použila v následujících experimentech.

Knihovna cDNA se připravila z buněčné .linie WI-38, za použiti známých metod a komerčně dostupných materiálu.

Knihovna se konstruovala expresivním vektoru pCDNAI za použiti izolačního kotu Kast Track mRNA systému cDNA Libranan. ?o té, co se přip vektorv se zavedlo do buněčné líni a tagemioove.nc tavila knihovna, coli MC 1061/P3 elektroDorací

Expresivní vektor pCDNAI obsahuje gen rezistence na antioiotika, což umožňuje, že E. coli se izolovaly na základě rezistence na antibiotika. Kolonie, které bvlv aaisicn rezistentní se pak použily v experimentech. Plazmidová DNA z kolonií se získala alkalickou lyží a čištěním pomocí CsCl; gradientu podle publikace Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold

Spring Harbor Lab, Cold Spring Harbor, N.Y Tyto metody izolace jsou v oberu dobře známy.

2d Ed, 1989).

Po izolaci se plazmidová DNA použila pro trar.sřekci buněk COS-1, které se pak kultivovaly po dobu 49 hodin, a pak se testovaly na miskách potažených protílázkama. Použití mAb, které zahrnují F19 se popisuje v publikací Rettig et al. , Cancer Res. 46: 6406-6412 (1986). Protože buňky COS-1 jsou normálně FAPa, jakékoli pozitivní výsledky naznačují přítomnost kódující sekvence. Imunoselekce se provedla podle publikace Aruffo et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 84: 33653369 (1987).

Piazmidová DNA z pozitivních klónů se získala podle protokolu v publikaci Hirt, J. Mol. Biol. 26: 365-369 (1967) ·« · · · t ♦ · · · incvu se zavedla do buněk E. coli MC 1061/P3 a selekce procenta v buňkách TOS-1.

Zde uvedený protokol se provedl pro čtyři cykly. Po té se plazmidové DNA 50'ti izolovaných bakteriálních kolonií a použití plazrcidového kitu Qiager.. Σ kolonií se

O ± S .___d i i získalo 27 klánu, velikosti 2,8 kb, restrikčníhe enzymu ktere oosanuji jak se určilo identické matováním .ožerty o i ooužití .jistilo se, několik tec.nt·;

klonů obsahuje ΕΆΡα-specifickou cDNA, jak se stanovilo transientni expresí v buňkách COS-1 - a přímým inuncfiuorescenčním barvením pomocí mAb F19. Jeden z těchto klónú, to je pFAP.38, se vybral pro další studií.

Příklad 2

Po té,

CO se identifikoval· pFAP.38, testoval se dohromady

DC s vektorem kódujícím známý buněčný 22 6) , stejně jako s kontrolním ve.<

povrchový markér ořem pCDNA 1.

V těchto experimentech buňky COS-1 se transfekovaly jedním z pFAp.38, pCD26 nebo pCDNAI. Po 48 hodinách se transiektanti testovaly za použití oobře známého MHA rozetového testu pro expresi buněčných povrchových antigenů. V těchto experimentech se použily protilátky mAb F19, které jsou specifické pro FAPa, dohromady s protilátkami mAb EF-1, které jsou specifické pro CD26. Také se použily čtyři další protilátky mAb specifické pro FAPa, jsou to FB23, FB52, FB58 a C48. Také se testovaly dvě další rakovinové buněčné linie, o kterých je známo, že reagují s protilátkami mAb F19 (SW872 iiposarkom) nebo EF-l (SK-0V6 zhouoné bujeni vaječníků). Výsledky těchto testů se uvádějí v tabulce č. 1.

Tabulka č

Buněčná povrchová exprese více

FAPa epitopů a

CD26 v lidských buňkách a v buněčných transfektantech COS-1.

»«<

• · ·· *· · · ·

Sxprese povrchového buněčného antigenů
cílové buňxy	F19	FB23	FB52	FB58	C48	EF-1
lidské ouhkv
SW872 líposarkom	>95%	>95%	>95%	>95%	>95%	-
SK-OV6 zhob. buj . Vaječníku						>95%
transfektanti
kontrol, COS.pCDNAI	-	-	-		'
COS,pFA P38	40%	30%	40%	20%	20%	-
COS.pCD26	-		-	-	-	40%

Přiklad 3

Imunoprecioitační studie se provedly 2a účelem určeni antigenů, ke kterému isou směrovány orotilatky.

Buňky se matabolickv značily s Trans ^3SS (ICN), extrahovaly se s lyzačním pufrem (0,01 M Tris-HCl/0,15 M NaCl/0,01 M MgCl₃/0,5% Nonidet P-40/aprotínin (20 ug/ml)/2 mM fenylmetyi-sulřonyl fluorid) a a pak se imunoprecipitovaly. Zde používané protokoly jsou v oboru dobře známy, popisují se v publikacích Rettig et al., Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993); a Fellinger et al., Canc. Res. 51: 336 - 340 ( 1991 ). Jako pecipitační protilátky se použily myší Ig jako negativní kontrola, mAb F19 nebo EF-1. Kontrolní testy se provedly se slepě transfokovanými buňkami COS-1. Pak následovala imunoprecipitace, kdy imunoprecipitáty se vařily v extrakčnim pufru a separovaly se NaDOdSCg/PAGF 2a redukčních podmínek. V některých experimentechproběhly další testy za účelem stanovení, zda imunoprecipitovaný materiál byl glykozylován. V těchto experimentech byly před imunoprecípitací buněčné r· · , , · · · · ,,, ., .· ·» ·· ·· extrakty rozděleny na Con A-3EPHAROSE. Následuje imunoprecipitace, ale před dělením na NaDodS0₄/PAGE se tyto precipitáty štěpily N-glykanázou.

Výsledky ukazují, že v buňkách COS-1 pFAP.38 řídí expresi proteinu o velikosti 88 000 (jak se určilo pomocí SDS-PAGE;, který je o málo menší, než protein FA Pa o molekulové hmotnosti 95 0C0, který je produkován buňkami SW872 nebe kultivovanými fibroblasty. Při štěpeni Nglvkanázou vzniká peptid srovnatelné velikosti (to je 74 000 proti 75 000/, což naznačuje, že giykosylace proteinu FAPa v buňkách COS-1 se liší ve srovnáni s lidskými buněčnými liniemi.

příklad 4

Pak proběhla klasická analýza northernovým přenosem za použití mRNA z FAPa* fibroblastových buněčných linii Wi-38 a GM 05389 a FAPa’ linie rakovinových buněk vaječníků SK-OV6, Za použití postupu pocie Sambroock et al., (citace uvecena shora)se testovalo 5 ug mRNA z xaždé buněčné linie. Použité sondy se značily ^j4P a připravily se z ECO I fragmentu pFAP.38 o velikosti 2,3kb, Hind III fragmentu CD26 o velikosti 2,4kb a BamHI fragmentu cDNA γ-aktinu o velikostí 1,8 kb. Tyto fragmenty se izolovaly z 1¾ agarózových gelů.

Extrakty FAPa’ zibroblastových kmenů vykazují 2,8kb FAP mRNA, ale v extraktech z SK-OV6 se nevyskytují. mRNA γ-aktinu (1,8kb) se objevuje ve všech druzích.

Příklad 5

Podrobněji se analyzovala cDNA, která kóduje protein FAPa, začalo se sekvenováním. Pro sekvenací obou řetězců cDNA se použila klasická Sangerova metoda popsaná v publikaci • I * • · • * · *

Proč. Nati. Acad, Sci. USA 74: 5463-5467 (1977). Ze sekvence cDNA se dedukovala aminokyselinová sekvence. Tato informace je uvedena v SEQ ID NO: 1. Sekvence se pak porovnala se známou aminokyselinovou sekvencí CD26 (Morimoto et al., J. immunol. 143: 3430-3437 (1989)). Obr. č. i zobrazuje srovnáni těchto sekvencí, přičemž je použito optimalizované uspořádání sekvencí. Odlišnosti jsou označeny hvězdičkou, zatímco identické aminokyseliny jsou v sekvenci CD26 znázorněny čárkované. Hydrofóbní putativni transmembránová sekvence je dvojitě podtržená, zatímco potenciální místo glyjcozylace je podtrženo jednoouše.

Sekvenční analýza ukazuje, že inzert o velikosti 2312 párů baží tvoří otevřený čtecí rámec. Uvedený ORF vede s počátečního kočenu ATG v pozici 209 do stop kodonu TAA v pozici 2486.

Dedukovaný polypetid je 760 aminokyselin dlouhý a jeho molekulová hmotnost je 87 832. Naopak FAPa štěpený Na čištěnv ímunoprecioitací g 1 y k a n á z o u molekulovou hmotnost

M_r

000, co:

ma se

NaDodS0₄/PAGE (Retting et al., Canc. Res, 53 odhadovanou určilo na

3327-3335 (1993

Provedl se průzkum bází v datové bance Ge.nBank.

Nejpodobnější geny jsou ty, co kódují dipeptidyi peptidázové IV homology (DPPIV; EC 3.4.14.5), lidský DPPIV (který je také znám jako T-buněčný aktivační antigen CD26), které vykazují identitu nukleotidových sekvencí z 61% a identitu aminokyselinových sekvencí ze 48%.

Do druhé skupiny příbuzných genů patří lidské, krysí a boviní homology DPPX, což je gen, jehož funkce není známa, ale je exprimován v mozku a v jiných normáních tkáních. Předpovídaný produkt genu lidského DPPX vykazuje přibližně 30% identitu aminokyselinové sekvence s FAPa a CD26. Molekula FAPa vykazuje strukturní rysy, které jsou typické pro integrální membránové proteiny typu II, zahrnující velkou

I * · * • · · · * · I • · · * * · · * · ·

COOH-terminální extracelulární doménu, hydrofobní transmembránový segment a krátký cytoplazmatický ocas. Putativni extrabuněčr.á doména obsahuje pět potencionálních Nglykosyiačních míst, 11 cysteinových zbytků (z nichž 8 jsou v FAPa a 0026 konzervativní) a tři segmenty, které odpovídají vysoce konzervativním katalytickým doménám, které charakterizují serinové proteázy, jako je DPPIV. Tyto konzervativní sekvence jsou uvedeny v tabulce č. 2. Srovnání sekvencí DPPIV a DPPX se provedlo prostřednictvím sekvencí uvedených v publikacích Morimoto et al·., cita.ce uvedena shora; Wada et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 89. 197 - 201 ( 1992); Yokotani. et al·., Human Mol. Genet. 2; 1037- 1039 ( 1993 ) .

Příklad 6

Další sada experimentů se provedla za účelem stanovení, zda sekvence příbuzná FAPa je přítomna ve zvířecích speciích. Pro tento účel· se genomová DNA izolovaná z člověka, myši a z čínského křečka štěpila restrikčními enzymy a testovala se Soutehernovým přenosem, kdy se použil fragment značený ³²P o velikosti 2,3kb, který je popsán shora v textu. Hybridizace proběhla za přísných promývacích podmínek tu, lx SSC, 0,1% NaDodSCg, při teplotě 63°C). Ke křížově hybridizace došlo v případě DNA izolované z myší a křečků, což naznačuje existenci vysoce konzervativních homologů proteinu FAPa. Při kontrolních experimentech za použití fragmentu cDNA '3326, který se popi suje shora v textu, nebyl pozorován žádný cukáz křížové hybridizace.

Příklad 7

Molekula CD26 má řadu biochemických a serologických vlastností stejných s FAPp, který již cyl dříve pccsá.n, «· 4 « * ** · · · · » _{β β} « · · · ·« · 4 4· · · «••44 · · · «···· · · »· · ♦ * doprovodná molekula FAPa má molekulovou hmotnost 105 000 a nachází se v kultivovaných fibroblastech a melanocytech (Rettig et al., Canc. Res . 53: 3327-3335 (1393) } . Za účelem stanovení, zda ΓΑΡβ je produkt genu CD26 proběnly kctransfekční experimenty. Pro testování této skutečnosti se použily stejné protokoly, jako pro transfekci s pFAP.38 nebo pCD26, jak se popisuje shora v textu, al použily se dva vektory. Shora uvedené vbýsledkv vykazují, že účinnost kotransfe.kce byla přibližně 40% pro každý vektor, což znamená, že přibližně 10 až 20% buněk bylo kctransfekovaných.

Následuje kotransfekce, buňky COS-1 se značily Trans ^I3S, jak se popisuje shora, pak se lyžovaly, jak se také popisuje shora v textu.

Výsledné buněčné extrakty se odoělily na Con A SEPHAROSE a antigen (FAPa a/nebo CD26) se získaly ve frakci navázané na Con A. Navázaná frakce se eluovala 0,25 M a-Dmanopyranosidem. Imunoprecipitace pak proběhla způsobem, který se popisuje shora v textu,a precipitáty se separovaly na NaDodSCg/PAGE, což se také popisuje shora v textu.

Tyto buňky transfekované pouze s pEAP.38 produkovaly FAPa, ale ne FAPp (což se stanovilo z imunopúrecipitátů mAb F19) . Neprodukují také CD26 antigen (což se testovalo s FF1). Tyto buňky transfekované samotným pCD2ú produkuji CD26, ale neprodukují FAPa. Kotransfektanty produkují CD26 a FAPa/ ΓΑΡβ heteroméry, které se stanovily v precipitátech s mAb

F19. Tento výsledek poskytuje přímý důkaz, že FAP3 je produkt genu CD26.

Příklad 8 « ·

Dříve se Dozorovala, že některé kultivované typy lidských buněk společně exprimují FA?a a CD26 a vykazují FAPa/CD26 h.eteromérní formaci. Distribuční psterny in vivo FAPa a CD26 se však, jak se ukázalo v imunohistochemických studiích, nepřekrývají (Retig et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 3110-3114 (1988); Garin-Chesa et al., Proč. Nati.

Acad. Sou. USA 87: 7235-7329 (1990); Rettig et al. , Canc. Res. 53: 3327 - 3335 ( 1993 ); Stein et al., in Knapp et al. , eds, Leukocyte typing IV-white cell differebtiation antigens, pp 412-415 (Oxford University Press, N.Y. 1989), pp. 412-415; Mobious et al . , J. Exp. Immunol . 74: 43 1-437 ( 1988 )). 2a účelem zjištěni, zda potencionální koasociace EAPCí/CD26 je podstatná, znovu se testovala tkáňová distribuce imunohistochemickým barvením normálních tkání a tkání lézí, které jsou známy, že obsahují EAPcb fibroblasty nebo FAPa mangni cunxy.

Za účelem testování se vzorkypřidaiy do sloučeniny OCT, zmrazily se v izopentanu, který byl předchlazen v kapalném dusíku a uchovávaly se v př teplotě -70°C až do doby použití.

sklíčka potažená fixovaly se v Sekce se pak za použití dobře metody, jak se . , J. Histochem. et al. , Proč. Rettig et al. , et al. , Am. J.

Karcinomy prsu, silnou expresi Cestovalo se pět

Nařezaly se 5 μπι silné sekce, uložily se na poly-L-lyzinem, vysušily se na vzduchu a chlazeném acetonu (4°C, po dobu 10 min), testovaly s protilátkami mAb (10 až 20gg/ml) známého avidin-biotinové imunoperoxidázové popisuje např. v publikaci Garin-Chesa et al. Cytochem. 37; 1767-1776 (1989); Garin-Chesa

Nati. Acad. Sci. USA 37: 7235-7239 (1990);

Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993); Garin-Chesa

Pathol. 142: 557-567.

Výsladky jsou uvedeny na obrázku č. 2. tlustého střeva, pankreasu a plic vykazují

FAPa a neexoirmují CD26 (obr. č. 2A a

9 9 »* · · • ·· • · · ♦ · * • · · · 9 sarkomů :ΑΡα zahrnující maligní fibrózní histiocytom (obr. č. 2C a 2D) a žádný z nich nevyt kazu je expresi CD26. Testování reaktivních fibroblastů při hojení dermálních poškození (obrázky č. 2Ξ, 2F) vykazují abundatní expresi

FAPa a CD26. Tři testované renélní karcinomy (obrázky č. 2G, 2H) vykazují expresi CD26 v maligním epítelu. V maligních epiteiiáiních buňkách není FA Pct přítomen a ~e slabě exprimován v podpůrné tkáni těchto karcinomů.

Připravila se savčí buněčná linie transfekovaná cDNA kódující FAPa.

Dobře známá buněčná linie 293 z ledvin lidského embrya je běžně dostupná např. n American Type Culiure Ccllection.

Vzorky linie 293 se udržovaly v inkubátoru při teplotě 37°C v atmosféře 5% C0_:. Buňky se kultivovaly ve směsi 50:50 Dulbeccově modifikovaném minimálním esenciálním médiu a Hamově F12 médiu s 10% fetálním boviním sérem, penicilinem a szreptomycinem. Buňky 293 se transfekovaly cDNA FAPa (SEQ ID NO: 1) způsobem, který se popisuje v publikaci Ustar et al., Eur. Mol. Biol. J. 1991, a/nebo Park et al. , J. Bíol . Chem. 169: 26646-25654 (1994). Detailní popis vektoru cDNA je uveden výše v textu (pFAP.38). Transfektanti se vybraly na základě rezistence na antibiotika (200 μς/ml geneticinu) a udržovaly se v selekčním médiu, které obsahuje geneticin.

Izolovaly se jednotlivé kolonie rezistentních buněk a kultivovaly se do stádia konfluentnosti na kultivačních plotnách se šesti prohlubněmi a testovala se u nich exprese FAPa pomocí imunofluorescenčního testu (IFA) za použití FAPa specifických monoklonálních protilátrk F19, jak se popisuje výše v textu.

« 4 4 4

4 ·4·

4 4 ·* 44 • 4

V * « «

414 *4 · « • 4·

4 ·

4 · • 44 I#

Tyto kolonie, které exprímují FAPa, se rozrostly a sledovaly se za použiti nepřímé 1FA analýzy a cytofluorometrické analýzy, jak se také popisuje výše v textu.

Test IFA byl pozitivní v případě transtektantů, které se zde označují jako buněčná linie 293-FAP, ale v případě bunékrodičovských buněk linie 29.3 byl negativní.

Příklad 10

Za účelem potrvze.ní, ze se připravil rekcmirinant FAPa. se provedla řada ircunoprecipitačních experimentů. Tyto experimenty se uskutečni.

podle způsobu popsaného v publikacích Park et al·., J. Bíol. Chem. 169: 26646-25654 (1994) a Rettig et al., Canc. Res. 53: 3327-3335 (1993).

Buněčný extrakt máčeny ’[S] metioninem se kombinoval s monoklonálními protilátkami F19 způsobem, který se popisuje shora v textu. Sraženina se pak vařila v extrakčním pufru a nanesly se do SOS-PAGE gelu, přičemž jako negativní kontrola se použily myšší IgGl. Testovaly se obě buněčné line 293-FAP a netransfekovaná linie 293. Výsledky jasně ukazují, že rekombmantní FAPa produkují transfektovar.á buněčná linie 293-FAP. To se stanovilo imunoprecipítační analýzou za použití FAPa specifických monoklonálních protilátek F19.

Příklad 11

Schopnost produkce rekombinantního FAPa umožnila studium vlastnosti molekuly tohoto proteinu, zvláště danné strukturní rysy uvedené v předchozích příkladech. Byly navrženy pokusy pro stanovení enzymatické aktivity proteinu FAPa. Experimenty mají stanovit, zda FAPa má degradující aktivitu extracelu-árního matricového proteinu (ECM;. Připravily se «· * · * · » « · · · · · « · · · * « * · · · » « • « · »« · · 4 • « 4 « · · ·

		15
buněčné extr	akty 293-FAP	za použití	extrakčního pufru (0	’ c.M r - -
NaCl, 0.05M	Tris-HCl, pH	7,4	, lOmM	MgCl;, 1% Triton X-	14) ,
čistily se	centri fugací	'4	OOOxg,	pc dobu 10 minut	při

teplotě 4°C} a dělily se na jednotlivé fáze při teplotě 37°po dobu 10 až 20 minut. Pak následuje další centrifugace (4 OOOxg, po dobu 20 minut při teplotě 20 až 25°C). Detergentní fáze se ředily pufrem (0,15 M NaCl, O,05M Tris-HCl pH 7,4, 5 mM CaCl₂, 5 mM MgCl;, 0,75% Empigen BB) a separovaly se konkanavalinové A-sefaróze podle Rettig et al., citace uvedena výše v textu. Frakce vázané na konkavalinu A se eluovaly 0,25 M metyl-a-D-mancpyranosidem v elučním pufru (0,15 M NaCl, 0,05 M tris-HCl, pH 7,4, 5mM CaCl₂, 5mM MgCl₂, 0,1% Triton X-100) smíšeným s vzorkovým pufrem pro zymografii

(0,25 M Tris	-HC1, pH	6,8, 8%	SDS,	40% glycerol,	0,01%
bromofenolová	modř) v	poměru 3	:1 a	použijí se pro	další
analýzu.
Ai ikvóty	vzorků se nanesly	na	o o 1 v a k r v 1 a m i d o v é £ .	gely,
které ocsairu^í	0,1% buď	želatinu	nebo	kasem. Pak se orovedla

elektorforéza na Biorad Mini-Protein IL systému za konstantního proudu 20 mA po dobu 1,5 až 2 hodin, až bromofenolová modř pohybující se před vzorky dosáhla spodního konce gelu. Gel se vyňal a inkuboval se po dobu jedné hodiny při teplotě 20 až 25°C v 2,5% vodném roztoku Tritonu X-100 na rotační míchačce. Roztok tritonu X-100 se slil a nahradil se enzymatickým pufrem (0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 0,2M NaCl, 5mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,02% Brij 35). Gel se pak inkuboval při teplotě 37°c nebo 41°C, pak se obarvil nebo odbarvil přo teplotě místnosti. Gely se barvily 0,5% Coomassieovou briliantovou modří G-250 ve vodném roztoku 30% metanolu a 10% kyseiůiny octové po dobu 15, 30 a 60 minut. Následovně se gely inkubovaly po dobu 15 minut ve vodném roztoku 30% CH₃OH a 5% glycerolu, pak následovalo sušení mezi listy celofánu.

Želatinázová aktivita se hodnotila podle publikace Kleiner et al., Anal. Biochem. 218: 325-329 (1994). Jde o rutinní test, který se používá pro· stanovení, zda proteáza je schopna štěpit přítomnou želatinu. Značený standard molekulové hmotnosti se nanesl na stejné gely za redukčních podmínek a použil se pro stanovení molekulové vány.

Testovala se proteoiytická aktivita motivů aminokyselinových sekvencí (Smith et al., Histochem. J. 24 ( 9): 637- 647 (1992) ) . Substráty byly Ala-Pro-7 - ammo - 4trifluorometylkumarin, Gly-Pro-7-amino-4 trifluorometyikumarin a Lys-Pro-7-amino-4triťluorometylkumarin.

Výsledky těchto experimentů jsou částečně znázorněny na obrázku č. 3. Tento obrázek ukazuje zymografickou detekci že degradačni aktivitu želatiny v buněčných extraktech (Kleiner et al·., Anal·. Biochem. 218: 325-329 (1994)). Na SDS-PAGE se stanovil protein o molekulové hmotnosti 170 000 a zjistilo se, že vykazuje degradačni aktivitu želatiny. Tento protein, který se nachází v buněčné linii 293-FAP, ale neexistuje v netransfekovaných buňkách 293, se identifikoval jako FAPa. Molekulová hmotnost je konzistentní s dimérem, to znamená s dimerickou molekulou FAPa.

Zde popsaná proteolytická aktivita v přítomnosti želatiny jako substrátu, nebyla pozorována, jstliže se jako substrát ooužii kasem.

Přiklad 12

Za účelem další charakterizace diméru FAPa o molekulové hmotnosti 170 000 proběhly další studie. Zvláště se opakovaly pokusy popsané v přikladu li, s výjimkou, že se před SDS-PAGE k extraktům přidal 5¾ 2-merkaptoetanol nebo 5 μιη jodoacetamid nebo že se do inkubačního pufru používaného při želatinové v * · · · · * · · · • · « ♦ ··· · ·»·· • · · · · · • # ·· · · · · · · zymograr i kyselina aktivitu.

zahřívání i přidala etylendiamin-N, N, N', N'-tetraoctová ÍlOmM). Žádná z těchto látek neporušila enzymatickou

Naopak želatinu degradující aktivita zanikla při při teplotě 100³C po dobu 5 minut před SDSelektroforézou na polyakrvlamidovém gelu.

Další prače za použití testu membránové overlay popsaná v publikaci Smith et ai., Histochem J. 24(9): 643-647 (1992) ukazuje, že diméry FAPajsou schopny štěpí všechny testované dipeptidy Ala-Pro, Gly-Pro a Lys-Pro.

V dalších experimentech se produkuje ťúzaí. protein, který obsahuje extracelulární domény obou proteinů FAPa a mušího CD8. Tento chimérický protein se produkoval v bakulovirovém systému ve hmyzích buňkách. Chimérický protein vykazuje stejnou enzymatickou aktivitu jako FAPa, za použití modelu, který se popisuje shora v textu.

Příklad 13

Vyvynuly se

FAPa, kdy se testy pro kvantifikaci jako suostrát pouši :vrr.atické aktivity

Ala-Pro-7-amino-4tri í luorometyl kumann (Ala-Pro-AFC) . Při prvním testu se membránové extrakty buněk expnmuj ícícň FAPa mísily s 5 až 10 násobným objemem reakčniho pufru (100 mM NaCl, 100 mM Trís pH 7,3) a přidaly se ke stejnému objemu 0,5 mM Ala-Pro-AFC v reakčním pufru, pak následovala jejich inkubace po dobu jedné hodiny při teplotě 37°C. Uvolněný volný AFC se měřil na fluorimetru za použiti sady filtrů 395 nm excitace/530 nm emise.Membránové extrakty, které se analyzovaly tímto testem se odvodily buď z buněk 293-FAPa (buňky 293 stabilně transfekované vektorem FAP.38 popsané shora v textu) nebo z HT1080-FAPa (buňky HT1080 stabilně transfekované vektorem FAP.38). Negativní kontrolní experimenty vykazující FAPa • · • « • · ♦ « · • *· • · · • · · « · * · ·

specifickou aktivitu se provedly na membránových extraktech připravených rodičovské buněčné linie 293 nebo HT1080. Při druhém, experimentu se z membránových extraktů 293- FAPa nebo HT1080- FAPa pomocí FAPa specifických protilátek izoloval FAPa. Destičky pro ELZSA test s 96 prohlubněmi se potáhly přes noc při teplotě 4°C 1 μη/ml monoklonálních protilátek

F19 ve fyziologickém roztoku cifrovaném fosforečnanem

V případě CD8-FAPa se destičky potáhly protilátkama F19 nebo přes noc při teploré 4°C 1 ug/ml krysího anti-mvš-ší CD8. Pak se prohlubně promyiy pufrem ÍPBS, 0,1% Tween 20'. Vazebné místo se zablokovalo blokačním pufrem (5% boviní sérum albumin v PBS) po dobu 1 hod. při teplotě místnosti. Blokační pufr se odstranil; přidaly se membránové extrakty buněk 293 exprimujících FAPa nebo se přidaly se přidaly kontrolní buňko e vše se inkubovalo oři teolotš místnosti co dobu 1 hodiny. Odstranil se nenavázaný materiál, prohlubně se promyiy promývacím pufrem a aktivita FAPa se testovala za použití 100 μΐ Ala-Pro-AFC í 0, 5 mM Ala-Pro-AFC v reakčním pufru) po dobu 1 hodiny při teplotě 37°C. Uvolněný volný AFC se měřil, jak se uvádí shora v textu. Navázání monoklonálních protilátek F19 na FAPa neovlivňuje měřitelně enzymatickou aktivitu.

Příklad 14

Za použiti testů pro enzymatickou aktivitu FAPa, které se popisují shora v textu, se stanovil inhibitor enzymatické aktivity FAPa. Tímto inhibitorem je (Ξ)-valylpyrrolidin2(R)-bórová kyselina (Snow et al., J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 10860-10869), zde se uvádí jako ValboroPro. ValboroPro inhibuje štěpení Ala-Pro-AFC proteinem FAPa, přičemž IC50 je

I 4 · » • 4 · 4 · • · · · · · • * 4 · 4 ► · « · « «

0,11 μΜ. ValboroPro také inhibuje želatinclytickou aktivitu FAPa v koncentrací 100 μΜ. Specifita ValboroPro v případě FAPa se demonstruje v testech se sermovou proteázou, trypsinem. Při testu, kde se jako substrát použil karbobenzoxy-L-valinyl-glycinyl-L-arginyl- 4 nitranilidacetátem, se nepozorovala žádná inhibice boviního trypsinu pomoci ValboroPro (až oo koncentrace 100 μΜ) .

Příklad 15

2a účelem určení spécifických, strurturních požadavků pro enzymatické aktivity FAPa vedlo k vývoji molekul, které se mohou vázat a/nebo inhibovat FAPa. Za účelem zjištění, zda serinovy zbytek v poloze 624 přecpovězené aminokyselinové sekvence polypeptidu FAPa je nutný pro enzymatickou funkci, se provedla místně řízena mutageneze podle publikace Soiler et al., DNA 3: 479-488 (1984) za použiti standardní polymerázové řetězové reakce. ICC kodón kočujíoí serir. 624 v cDNA FAPa se nahradila GCG, což vede k výskytu alaninu v této pozici. Pozměněná DNA se znovu zavedla co vektoru FAP.38 a transfekovaiy se jím buňky 293, jak se popisuje shora v textu. Izolovaly se kolonie rezistentní na geneticin a testovala se u nich exprese proteinu FAPa nepřímou IFA analýzou za použití monoklonálních protilátek F19, stejně jako dalších FAPa specifických protilátek, které popisuje Rettig et al·., J. Cancer 58: 385 - 392 (1994), jak se uvádí shora v textu. Pří srovnání s FAPa transfekovanými buňkami divokého typu se nepozorovaly žádné rozdíly při vázání antiFAPa protilátek k mutovaným buňkám exprimujícím FAPa. Přítomnost mutací se potvrdila amplifikaci genomové DNA a restrikční analýzou několika klonů transferovaných buněk. Pro »»· · • · · « · ·

stanovení enzymatické aktivity mutovaného FAPa se provedly následující testy. Připravily se membránové extrakty te tří nezávislých pozitivních klónů a ze stejného množství proteinu FAPa (jak se stanovilo v testu EL1SA za použiti anti- FAPa protilátek, které rozeznávají odlišné epitopv FAPa). Tyto extrakty se analyzovaly v žeiatinciytickém testu a v Aia-ProAFC zachytovém testu, óelatinolytícká aktivita a aktivita v záchytovém testu u mutovaného FAPa byla ve srovnaní s FAPa divokého typu redukovaná na nedetekovatelnou úroveň, což

potvrzuje, že kanonický serin má určitou roli v	katalytické
triádě obou pozorovaných enzymatických aktivit.
? rik x ad 16
Za účelem získání sekretovaného, ve vodě	rozpustného
enzymu FAPa se vytvořil fúzní protein. V tomto fúzním

proteinu extracelulární doména CD8, která obsahuje prvních 189 aminokyselin myšího CD8, se navázala na extracelulární doménu FAPa (aminokyseliny 27 az 760), jak se popisuje v

publikaci Lané et	al. ,	J. Exp.	Med. 177:	1209	(1993)	) , za
použití protokolu	pro	standardní polymer	ázovou	řetězcovou
reakci a umístila	se	do běžně	dostupného	vektoru pVL	1393.

Transřekce buněk Sf9 tímto vektorem a amplifikace výsledného rekombmantního bakuloviru se uskutečnila podle popisu v publikaci Baculovirus Expression Vectors, 0'Reilly, Miller a Luckow, Oxford University Press, 1994). Fúzní protein CD8-FAP se izoloval ve dvou krocích z vyčerpaného média buněk High Five™, které jsou infikovány CD8- FAPa bakulovirem po dobu čtyř dnů. Buňky a virus se odstranil ultracentri fugaci, supernatant prošel kolonou obsahující Heparin-sefarózu (Pharmacia) a postupně se elucval s 0,6, 1,0 a 2,0 NaCl v 10 mM fosforečnanu pH 7. Aktivní frakce z 1 a 2 M eluátů se slily a koncentrovaly se za použiti YM-10 filtru a 26/60 • * · ··« *

• · gelcvé filtrační kolony Superdex-2C0 Aktivita se pozorovala u píku s vysokou molekulovou hmotností, který odpovídá CD8FAPCt, což se určilo sekvenováním N-konce v plynné fázi. Při želatinclytických testech se v případě čištěného CD8- FAPa detekovala aktivita vyšší než 2C0 000, což je konzistentní s vyšší předpovězenou molekulovou vanou fúzního proteinu.

Příklad 17

U nelidských druhů se zkoumala přítomnost strukturních a funkčních homologú. Klonovala se a zkoumala se např. cDNA v připaciě myšího FAPa. Testováni předpovězené aminokyselinové sekvence homologní myšší sekvence cDNA FAPa (EMEL číslo uložení Y10007) ukazuje vysoký stupeň konzervativnosti FAPa u různých druhů. Dva proteiny jsou z 39% identické a aktalytická triáda je konzervativní mezi lidským a myšším FAPa, Vysoký stupeň konzervativnosti a podobná exprese tkáně naznačce, že FAPa z nelidských zdrojů může být funkčně ekvivalentní lidskému FAPa. Tento závěr je potvrzen zjištěním, že různí protein CD3-myšši FAPa je podobný CD8lidský FAPa a také demonstruje očekávanou dipeptidvlpeptidázovou enzymatickou aktivitu za použití AlaPro-AFC substrátu.

Následující příklady nukleové kvseliny, která popisují izolovanou moletulu kóduje fibroblastovy aktivační protein alfa {FAPa), stejně jako dimerické formy molekuly a jejich použiti. Exprese produktu sekvence v COS-1 je protein, který vykazuje v testu SDS-PAGE vařených vzorků, molekulovou hmotnost okolo 88 000. Dedukovaná aminokyselinová sekvence, která je popsaná SEQ ID NO: 1, v jedné formě molekuly má molekulovou hmotnost okolo 88 000.

• « * ·* · - 4 « · · · » » · I . · · » « »*· ·· · ··

Je nutné poznamenat, že je zde patrný rozpor v molekulové hmotnosti, protože izoiát COS-1 je glykozyiovený, zatímco molekulová hmotnost dedukovaných aminokyselinových s glykosylaci. Membránové proteiny jsou vykazuji odchylnou migraci v geiových e vysvětlit zce pozorované rozdíly, o jsou chimérické a fúzní proteiny, které l?cí, která obsahuje katalytickou doménu

sekvencí	nepočítá
známy t	ím, že
systémec!	a, což muž·
čás:	:í vanález
obsahuj. í	část r ?.
molekuly	a navíc
FAPa je	také část
Rozumí se, že
množství	glykosiia
která exprimuje
popisuj e	. Co také
která je
popsana ]
hmotnost	170 000
v z o r < ů .

vvna-ez taxa že být glykosyiovaná, přičemž typ a různé v závislosti na typu buňky, popisuj <

p r o a u ji o exuresivnich vextoru

DOuziteinvcn při produkci molekuly FAPCt. Tyo vektory obsahují celou FAPa kódující sekvenci nebo její část, operabilně spojenou s promotorem. Přídavné elementy mohou být částí expresivního vektoru, jako jsou proteinové domény fúzované s FAPa proteinem nebo proteinové části protein) genů, které způsobují ampiifikovatelné ceny a podobně.

Kódující sekvence a vektor různí antibiotikovou rezistenci, se mohou také využít pro použije kódující sekvence nebo expresivní vektor pro transfekci nebo transformaci recipientního hostitele. Používaný typ buněk může být prokaryontní, jako je E.coli nebo ukaryontní, jako jsou kvasinky, CHO, COS nebo jiný typ buněk.

příparavu buněčné linie, kde

4 • 4 ·

Identifikace molekul nukleové kyseliny, jako jsou ty uvedené v SEQ ID N0:l umožňuje odborníkovi stanovit a izolovat tyto molekuly nukleové kyseliny, které hvbridizují za přísných podmínek. Přísné podmínky⁷' znamenají ty parametry, které se uvádějí shora v textu a při ketrých se také identifikovaly myšší a křečí sekvence. Odborník je schopný rozeznat tyto podmínky a určit stupeň přísnosti, kterého může být dosaženo za použiti parametrů, které se lisí od zde uvedených. Taková variace znamená přísné podmínky.

Schopnost molekul nukleové kyseliny hybridizovat s komplementárními molekulami také umožňuje odborníkovi identifikovat buňxy, které exprimuji FAPa za použití testu hybridizace. Odborník muže použít sekvence popsané ve vynálezu pro hybridizaci s komplementárními sekvencemi a tak je může identifikovat. Tímto způsobem může cílit mRNA, např.

tu, je ořítomna v libovolné buňce excnmující molekulu

FAPa.

Samozřejmě se rozumí, že molekuly nukleové kyseliny podle vynálezu jsou také použitelné při produkci rekombinantního FAPa jak v monomérní tak dimérní formě. Příklady jasně naznačuji, že hostitelské buňky jsou schopny sestavovat dimerické formy. Rekombinantní protein se může použít např. jako zdroj ímunocenu pro přípravu protilátek příouzných k monoklonáiním protilátkám F19 se stejným použitím. Podobné rekombinatní protein a/nebo buňky, které exprimuji! molekulu na svém povrchu, se mohou použít při testech pro určeni antagonisty, agonisty nebo jiných molekul, které mají aktivitu FAPa. Takovými látkami mohou být například substráty, inhibiční molekuly, protilátky a podobně. Molekulami, které vykazuji innibiční aktivitu, mohou byt například monomérní a dimérní formy FAPa, deriváty obsahující katalytickou doménu a podobně. Molekula mající • · · · · v • * ··· φ φ · · · φ · · · φ φ • ΦΦ φ · φ φ · ·

Φ· · φ φ φ φ ♦ φ φ r · aktivitu FAPa muže být čistá nebo ve formě buněčného extraktu, jako je transformovaná nebo transfekovaná buňka, do které byl zaveden aktivní gen FAPa. Mohou se použít jak prokaryonty tak eukaryontv. Tento poslední rys vynálezu se musí zvažovat z pohledu pozorovaného strukturálního znovu sestavení enzymů vázaných na membránu. Tento typ molekuly je spojen s určitými vlastnostmi, které zde není třeba detailně popisovat. Je dostatečné poznamenat, že inhibice nebo zesílení těchto vlastností je spojeno s FAPa, jako rys tohoto vynálezu. Například odborník může identifikovat substrát pro molekulu FAPa za použiti rekombinantních buněk nebo rekombinantního FAPa. Substráty se mohou modifikovat za účelem zlepšení jejich účinku, oslabeni jejich účinku nebo jednoduše je možné je označit detekovatelným signálem tak, že se mohou použít např. při identifikaci buněk, které exprimují FAPa. Studium interakce substrátu a FAPa stejně jako interakce mezi FAPa a libovolnou molekulou se může použít při vývoji a/nebo stanovení agor.istů a antagonistú molekuly FAPa .

Dalším předmětem vynálezu je izolovaná dimencká forma FAPa, která má molekulovou hmotnost okolo 170 000, jak se stanovilo testem SDS-PAGF, dále použití této molekuly jako enzymatické štěpící činidlo a pro jiné účely, jak se popisuje v tomto dokumentu. Mohou také produkovat enzymaticky aktivní formy FAPa jako rekombinantní fúzní proteiny, jako jsou rozpustné fúzní proteiny, které obsahují katalytickou doménu FAPa a jiné proteinové domény s vhodnými biochemickými vlastnostmi, mezi něž patří sekreční signály, proteázové štěpící místa, cíle čištění a jiné odborníkovi známé elementy. Jako příklad slouží peptidové sekvence CD8, které se popisují výše v textu. Skutečnost, že FAPa má určité * « • · ··· « · « « • » * « *» ·· · vlastnosti, jak se zde popisuje, dovoluje identifikovat molekulu na buňkách, které ji exprimují. Naopak protože molekula FAPa souvisí s nádory a nádorovými podpůrnými ounkami₍ lílení FAPa s léčebným činidlem slouží jako isoc ;ov rcinogeních a prekarcinogeních stavů pomocí aplikace něho léčebného činidla za účelem zmírnění znouoného bujení

Experimenty vede k dalším proteázy, které proteiny ECM ukazují proteolytické vlastnosti FAPa, což subjektům vynalezu. Je dobře známo, že degradují extracelulární matrici nebo mají důležitou úlohu při růstu nádoru, ovlivňují invazi nádorových buněk, tvoření nádoru krevních cév (to je neoangiogeneze) a metastázi nádoru. Kolagen je zajímavý z důvodu, že je substrátem proteáz, kolageny jsou důležitou součásti ECM. Skutečnost, že FAPa štěpí ECM naznačujeterapeutickou úlohu inhibitorů molekuly. Termín ''inhibitor znamená molekuly, které interferují s enzymatickou funkcí FAPa. 2 takových inhibitorů jsou specificky vyloučeny monoklonální protilátky F19. Tyto monoklonální protilátky jsou známy, že váži, ale nemhibují enzymatickou funkci FAPa a z toho důvodu nejsou inhibitor. Odborník zná monoklonální protilátky, které jak váží na enzymy, tak je také inhibují. Další příklady takových inhibitorů zahrnují např. substrátové deriváty, jako modifikované molekuly kolagenu, které interferují s aktivním místem nebo s místy na molekule FAPa. Jiné vhodné inhibitory jsou pro odborníka zřejmé a není nutné je zde jmenovat. Rekombinantní proteiny FAPa a buněčné linie transfekované

FAPa, které se popisují shora v textu, se mohou použít při enzymatickém skreeningovém testu, jestliže se použije shora popsaný substrát nebo jiný vhodný substrát, pro identifikací

4 • 44 · • · 4 · · • · 4 4 • · * 4 ·

4 · »44 · inhibitorů z řady látek. Stanovení látek, které interagují s aktivními molekulami FAPa vede k terapeutickému ošetření stavů, kde předmět vykazuje abnormální aktivitu FAPa. Zvláště se může aplikovat subjektu dostatečné množství vhodné substance, která je inhibitorem, (např. derivát kolagenu, Svalyl-pyrolidin-2(R)-borové kyseliny), agonistou nebo antagonistou, aby normalizovala aktivitu FAPa.

Další subjekty vynálezu jsou pro· odborníka zřejmé a není nutné je zde uvádět.

»· * * ’ » - --_B «» ·*·· · · »« _fl a · · · · *»»· · ·» · « ·»·♦« · ♦·· • · · · · ·· ·· »· ·· sekvence:

PROTOKOL (2) Údaje k SEQ ID NO: 1 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 2815 párů bázi (3) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: dvouřetězcová (D) topologie: lineární řxi) Popis sekvence: SEQ ID NO:1

AAGAACGCCC	CCAAAATdG	TTTCTAATTT	TACAGAAATC	ιTiT GAAACT	TGGCACGGTA	60
TTCAAAAGTC	CG7GGAAAGA	AAAAAACCTT	GTCCTGGCTT	CAGCTTCCAA	CTACAAAGAC	120
AGACTTGGTC	C7TT7CAAGG	GTTTTCACAG	ATCCAGTGAC	CCACGCiCiG	AAGACAGAAT	180
TAGCiAACTi	TCAAAAACAT	CTGGAAAAAT	GAAGACTTGG	GTAAAAATCG	TATTTGGAGT	240
TGCCACC7CT	GCTG7GCT7G	CCTTATTGGT	GATGTGCATT	GTCTTACGCC	CTTCAAGAGT	300
TCATAACTCT	GAAGAAAATA	CAATGAGAGC	ACTCACACTG	AAGGATATTT	TAAATGGAAC	360
ATTHCTTAT	AAAAGATiι1	TTCCAAACTG	GATTTCAGGA	CAAGAATATC	TTCATCAATC	420
TGCAGATAAC	AATATAGTAC	TTTATAATAT	TGAAACAGGA	CAATCATATA	CCATTTTGAG	480
TAATAGAACC	ATGAAAAGTG	TGAATGCTTC	AAATTACGGC	TTATCACCTG	ATCGGCAATT	640
TGTATATCTA	GAAAGTGATi	ATTCAAAGCT	TTGGAGATAC	TCTTACACAG	CAACATATTA	600
CA1CTATGAC	CTTAGCAATG	GAGAATT7G7	AAGAGGAAAT	GAGCTTCCTC	GTCCAATTCA	660
GTATTTATGC	TGGTCGCCTG	TTGGGAGTAA	ATTAGCATAT	GTCTATCAAA	ACAATATCTA	720
TTTGAAACAA	AGACCAGGAG	ATCCACCTTT	TCAAATAACA	TTTAATGGAA	GAGAAAATAA	780
AATATTTAAT	GGAATCCCAG	ACTGGGTTTA	TGAAGAGGAA	ATGCTTCCTA	CAAAATATGC	840
:CiC i GG TGu	7C7CC7AATG	GAAAATTTTT	GGCATATGCG	GAATTTAATG	ATAAGGATAT	900
ACCAGTTATT	GCCTA77CC7	ATTATGGCGA	TGAACAATAT	CCTAGAACAA	TAAATATTCC	960
ATACCCAAAG	GCTGGAGCTA	AGAATCCCGT	TGTTCGGATA	TTTATTATCG	ATACCACTTA	1020
CCCTGCGTAT	GTAGGTCCCC	AGGAAGTGCC	TGTTCCAGCA	ATGATAGCCT	CAAGTGATTA	1080
TTAT7TCAGT	TGGCTCACG7	GGGTTACTGA	TGAACGAGTA	TGTTTGCAGT	GGCTAAAAAG	1140
AGTCCAGAAT	GTT7CGGTCC	TGTCTATATG	TGACTTCAGG	GAAGAClGul	AGACATGGGA	1200
TTGTCCAAAG	ACCCAGGAGC	ATATAGAAGA	AAGCAGAACT	GGAiGGGCTG	GTGGATTCTT	1260
TGTTTCAAGA	CCAGTTTTCA	GCTATGATGC	CATTTCGTAC	TACAAAATAT	TTAGTGACAA	1320
GGA7GGC7AC	AAACATATTC	ACTATATGAA	AGACACTGTG	GAAAATGGTA	TTCAAATTAC	1380
AAGTGGCAAG	7GGGAGGCCA	TAAATATATT	CAGAGTAACA	CAGGATTCAC	TGTTTTATTC	1440
TAGCAATGAA	TTTGAAGAAT	ACCCTG6AAG	AAGAAACATC	TACAGAATTA	GCATTGGAAG	1500
CTATCCTCCA	AGCAAGAAGT	GTGTTACTTG	CCATCTAAGG	AAAGAAAGGT	GCCAATATTA	1550
CACAGCAAGT	TTCAGCGAC7	ACGCCAAGTA	CTATGGACTT	GTCTGCTACG	GCCCAGGCAT	1620
CCCCA777CC	ACCC77CA7G	ATGGACGCAG	TGATCAAGAA	ATTAAAATCC	TGGAAGAAAA	1580

« « · » * · * » • i ··· » · · · · · · » ·>·»»» · · · · •« · «· «· · * * · ·«

CAAGGAATÍG GAAAATGCTT TGAAAAATAT CCAGCTGCCT AAAGAGGAAA TTAAGAAACT 1740 TGAAC-TAGAT GAAATTACTT TATGS7ACAA GATGATTCTT CCTCCTCAA7 TTGACAGATC 1300 AAAGAAGTAT CCCTTGCTAA 77CAAGTGTA TGGTGGTCCC TGCAGTCAGA GTG7AAGG7C 1860 TGTATTTGCT GTTAATTGGA TATCTTATCT TGCAAGTAAG GAAGGGA7GG TCATTGCCTÍ i 920 GGTGGATGGT CGAGGAACAG CTTTCCAAGG TGACAAAC7C CTCTATGCAG TGTATCGAAA 1980 GC7GGGTG77 TATGAAGT7G AAGACCAGAT 7ACAGGTG7C AGAAAATTCA TAGAAATGGG 2040 TTTCATTGAT GAAAAAAGAA TAGCCATATG GGGCTGGTCC TATGGAGGAT ACG7TTCATC 2100 ACTGGCCCTT GGATCTGGAA CTGGTCTTTT CAAATGTGGT ATAGCAGTGG CTCCAGTCTC 2150 CAGCTGGGAA 7ATTACGCGT CTGTCTACAC AGAGAGATTC ATGGGTCTCC CAACAAAGGA 2220 TGATAATCTT GAGCACTATA AGAATTCAAC TGTGATGGCA AGAGCAGAAT ATíTCAGAAA 2230 7G7AGACTAT CTTCTCATCC ACGGAACAC-C AGATGA7AA7 GTGCACTTTC AAAACTCAGG 2340 ACAGATTGC7 AAAGCTCTGG TTAATGGACA AG7GGAT77C CAGGCAATGT GGTAC7CTGA 2400 CCAGAACCAC GGCTTATCCG GCCTGTCCAC GAACCACTTA TACACCCACA TGACCCAC77 2460 CCÍAAAGCAG TGTTTCTCTT TGTCAGACTA AAAACGATGC AGATGCAAGC C7GTA7CAGA 2520 ATCTGAAAAC CTTATATAAA CCCCTCAGAC AGTTTGCTTA TTTTATTTTT TATC-TTGTAA 2530 AATGCTAGTA TAAACAAACA AATTAATGTT GTTCTAAAGG CTGTTAAAAA AAAGATGAGG 2640 ACTCAGAAGT TCAAGCTAAA TATTGTTTAC A777TC7GGÍ ACTCTGTGAA AGAAGAGAAA 2700 AGGGAGTCAT GCAT7TTGC7 TTGGACACAG TG7T77A7CA CCTGTTCATT TGAAGAAAAA 2760 TAATAAAGTC AGAAG77CAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAGCGGCCG CTCGA 2815 (2) Údaje k SEQ ID NO: 2 (i) Charakteristika sekvence:

(A) délka: 760 aminokyselin (B) typ: nukleová kyselina (C) druh řetězce: aminokyselina (D) topologie: lineární (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2

Mel

Lys

Thr

Trp

Val

Lys

Ile

Va 1

Phe

Gly

Va 1

Ala

Thr

Ser

Ala

Val

5

10

15

Leu

Ala

Leu

Leu

Val

Met

Cys

Ile

Val

Leu

Arg

Pro

Ser

Arg

Val

His

20

25

30

Asn

Se’·'

Glu

Glu

Asn

Thr

Met

Arg

Ala

Leu

Thr

Leu

Lys

Aso

I le

Leu

35

40

45

Asn

Gly

Thr

Phe

Ser

Tyr

Lys

Thr

Phe

Pne

Pro

Asn

Trp

Ile

Ser

Gly

• · · · • · *

50

55

60

Gin

Glu

Tyr

Leu

His

Gin

Ser

Ala

Asp

Asn

Asn

Ile

Val

Leu

Tyr

Asn

65

70

75

80

ile

a i u

Thr

Gly

Gin

Ser

Tyr

Thr

Ile

Leu

Ser

Asn

Arg

Thr

Met

Lys

85

90

95

Ser

Val

Asn

Ala

Ser

Asn

Tyr

Gly

Leu

Ser

Pro

Asp

Arg

Gin

Phe

Val

100

105

110

Tyr

Leu

Glu

Ser

Asp

Tyr

Ser

Lys

Leu

Trp

Arg

Tyr

Ser

Tyr

Thr

Ala

115

120

125

Thr

Tyr

Tyr

Ile

Tyr

Asp

Leu

Ser

Asn

Gly

Glu

Phe

Val

Arg

Gly

Asn

130

135

140

Glu

Leu

Pro

Arg

Pro

Ile

Gin

Tyr

Leu

Cys

Tro

Ser

Pro

Val

Gly

Ser

145

150

155

150

Lys

Leu

Ala

Tyr

Val

Tyr

Gin

Asn

Asn

Ile

Tyr

Leu

Lys

G 1 n

Arg

Pro

165

170

175

Gly

Asp

Pro

Pro

Phe

Gin

I le

Thr

Phe

Asn

Gly

Arg

Glu

Asn

Lys

I le

180

185

190

Phe

Asn

Gly

i le

Pro

Asp

Trp

Va I

Tyr

Glu

Glu

Glu

Met

Leu

Pro

Thr

195

200

205

Lys

τv r

Ala

Leu

7 rn ' r

Trp

Ser

Pro

Asn

Gly

Lys

Phe

Leu

Ala

Tyr

Ala

210

215

220

Glu

Phe

Asn

Asp

Lys

Asp

Ile

Pro

Val

Ile

Ala

Tyr

Ser

Tyr

Tyr

Gly

225

230

225

240

Asp

Glu

Gin

Tyr

Pro

Arg

Thr

Ile

Asn

Ile

Pro

Tyr

Pro

Lys

Ala

Gly

245

250

255

Ala

Lys

Asn

Pro

Val

Val

Arg

Ile

Phe

Ile

Ile

Asp

Thr

Thr

Tyr

Pro

260

265

270

Ala

Tyr

Va 1

Gly

Pro

Gin

Glu

Va 1

Pro

Val

Pro

Ala

Met

Ile

Ala

Ser

275

280

285

Ser

Asp

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Trp

Leu

Thr

Trp

val

Thr

Asp

G lu

Arg

Va 1

290

295

300

Cys

Leu

Gin

Trp

Leu

Lys

Arg

Val

Gin

Asn

Val

Ser

Val

Leu

Ser

Ile

305

310

315

320

Cys

Asp

Phe

Arg

Glu

Asp

Trp

Gin

Thr

Trp

Asp

Cys

Pro

Lys

Thr

Gin

325

330

335

Glu

His

Ile

Glu

Glu

Ser

Arg

Thr

Gly

Trp

Ala

Gly

Gly

Phe

Phe

Val

340

345

350

«« · · * · · · • ·«· · · · · · · · · · <

• 4 · · * · · « « · « · · «4 · 4«

Ser

Arg

Pro

Val

Phe

Ser

i yr

Asp

Ala

Ile

Ser

Tyr

Tyr

Lys

I le

Phe

355

360

365

Ser

Aso

Lys

Asp

Gly

Tyr

Lys

His

Ile

His

Tyr

Ile

Lys

Asp

Thr

Val

370

375

380

Glu

Asn

Ala

Ile

Gin

i Ie

Thr

Ser

Gly

Lys

Trp

Glu

Ala

I le

Asn

Ile

335

390

395

400

Phe

Arg

Val

Thr

Gin

Asp

Ser

Leu

Phe

Tyr

Ser

Ser

Asn

G lu

Phe

G In

405

410

415

Glu

Tyr

Pro

Gly Arq

Arg

Asn

I le

Tyr Arg

Ile

Ser

I ie

Gly

Ser

Tyr

420

425

430

Pro

Pro

Ser

Lys

Lys

Cys

Val

Thr

Cys

His

Leu

Arg

Lys

Glu

Arg'

Cys

435

440

445

Gin

Tyr

Tyr

Thr

Ala

Ser

Phe

Ser

Asp

Tyr

Ala

Lys

Tyr

Tyr

Ala

Leu

450

455

460

Val

Cys

Tyr Gly

Pro

Gly

Ile

Pro

Ile

Ser

Thr

Leu

His

Aso

Gly Arg

465

470

475

480

Thr

Asp

Gin

Glu

Ile

Lys

Ile

Leu

Glu

Glu

Asn

Lys

Glu

Leu

Glu

Asn

485

490

495

A1 a

Leu

Lys

Asn

Ile

Gin

Leu

Pro

Lys

Glu

Glu

Ile

Lys

Lys

Leu

Glu

500

505

510

Val

Asp

Glu

i le

Thr

Leu

Trp

Tyr

Lys

Met

Ile

Leu

Pro

Pro

Gin

Phe

515

520

525

Asp

Arg

Ser

Lys

Lys

Tyr

Pro

Leu

Leu

Ile

Gin

Val

Tyr Gly Gly

Pro

530

535

540

Cys

Ser

Gin

Ser

Val

Arg

Ser

Val

Phe

Ala

Val

Asn

Trp

Ile

Ser

Tyr

545

550

555

560

Leu

Ala

Ser

Lys

Glu

Gly

Met

Val

Ile

Ala

Leu

Val

Asp

Gly Arg

Gly

565

570

575

Thr

Ala

Phe

Gin

Gly

Asp

Lys

Leu

Leu

Tyr

Ala

Val

Tyr

Arg

Lys

Leu

580

585

590

G ly

Val

Tyr

Glu

Val

Glu

Asp

Gin

Ile

Thr

Ala

Val

Arg

Lys

Phe

Ile

595

600

605

Glu

Met

Gly

Phe

Ile

Aso

Glu

Lys

Arg

[le

Ala

Ile

Trp

Gly

Trp

Ser

610

615

620

Tyr

Gly

Gly

Tyr

Va 1

Ser

Ser

Leu

Ala

Leu

Ala

Ser

Gly

Thr

Gly

Leu

625

530

635

640

Phe

Lys

Cys

Gly

Ile

Ala

Val

Ala

Pro

Val

Ser

Ser

Trp

Glu

Tyr

Tyr

• * * * • · · · « * 4 · · ··*·· ·· ·« ·· ··

645 650 655

Ala Ser Val

Tyr 660

Thr Glu Arg Phe Met Gly Leu Pro Thr Lys Asp Asp

665

670

Asn

Leu

Glu

His

Tyr

Lys

Asn

Ser

Thr

Val

Met

Ala

Arq

Ala

Glu

Tyr

675

680

685

Phe

Arg

Asn

Val

Asp

Tyr

Leu

Leu

í Ie

His

Gly

Thr

Ala

Asp

Asp

Asn

690

695

700

Va 1

His

Phe

Gin

Asn

Ser

Ala

Gin

Ile

Ala

Lys

Ala

Leu

Val

Asn

Ala

705

710

715

720

Gin

Val

Asp

Phe

Gin

Ala

Met

Trp

Tyr

Ser

Asp

Gin

Asn

His

Gly

Leu

725

730

735

Ser

Gly

Leu

Ser

Thr

Asn

His

Leu

Tyr

Thr

His

Met

Thr

His

Phe

Leu

740

745

750

Lys

Gin

Cys

Phe

Ser

Leu

Sfi r

Asp

755

760

• « • · · · * • · · • · ··

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Izolovaná dimerická molekula FAPa, jejíž molekulová hmotnost je přibližně 170 000, což se stanovilo SDS-PAGE, a která je schopna degradovat extracelulární matricové proteiny.

   2. Dimerická molekula FAPa pode r iaroku 1,, kde Každý monomér zahrnuje aminokyselinovou sekvenc i SEQ ID NO: 2. 3 . Dimerická produkuje rekombm molekula antně. FAPa podle nároku 1, která se 4, Dimerická molekula FAPa podle nároku 3, kterou

   produkují eukaryontní buňky.

   5. Izolovaný protein, který obsahuje:

   (i) katalytickou doménu FAPa a (ii) nejméně jednu část, která nepochází z proteinu

   FAPa.

   6. Způsob štěpení terminál.ního dipeptidu vzorce Xaa-Pro z molekuly, vyznačující se tím, že dochází ke kontaktu uvedené molekuly s druhou molekulou, uvedená druhá molekula má enzymatickou aktivitu FAPa.

   7. Způsob podle nároku 6, vyznačuj í c í se tím, že uvedená druhá molekula je izolovaný dimerický FAPa.

   • «·

   I · * · 1 « · <

   I» »« • · · «

   8. Způsob podle nároku 6, vyznačuj ící se tím, že uvedená druhá molekula obsahuje katalytickou doménu FAPa.

   9. Způsob identifikace látky, která interaguje s molekulou, která má aktivitu FAPa, v y z n a č u j ící se tím, že dochází ke kombinaci uvedené molekuly s testovaným vzorkem a ke stanovení uvedené molekuly jako indikace molekuly, která interacuje s molekulou, jenž má aktivitu FAPa.

   1C. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že uvedená molekula FAPa je dimérová.

   11. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že uvedená molekula obsahuje katalytickou doménu FAPa.

   12. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že uvedená látka je antagonista aktivity FAPa.

   13. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že uvedená látka je agonista aktivity FAPa.

   14. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že uvedená látka je inhibitor aktivity FAPa.

   15. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že dochází ke kombinací uvedené látky s buněčným extraktem, který má aktivitu FAPa.

   • · » ♦ ·♦ • · « · · » · « • *· v · « · « · * · ·

   16. Způsob podle nároku 15, vyznačuj lei se tím, že uvedený buněčný extrakt je extraktem buňky, která se transformovala nebo transfekovala molekulou nukleové kyseliny, jenž kóduje molekulu s aktivitou FAPa.

   1~, Zoůsob podle nároxu 16, v y z n a č u j í c í se tím, že uvedená buňka je prokaryor.t.

   1S. Způsob podle nároku 16, vyznačuj í c í se tím, že uvedená buňka je eukaryont.

   19. Způsob léčby subjektu v patologickém stavu, který je charakterizován abnormální aktivitou FAPa, vyznačující se tím, že se subjektu aplikuje, jestliže je třeba, množství látky, která interaguje s molekulami, jenž mají aktivitu FAPa, dostatečné pro normalizaci úrovně aktivity FAPa v uvedeném subjektu.

   20. Způsob podle nároku 19, vyznačuj í c í se tím, ž e se aplikuje inhibitor aktivity FAPa.

   21. Způsob podle nároku 20, vyznačuj í c í se tím, že uvedený inhibitor je derivát kolagenu.

   22. Způsob podle nároku 20, vyznačuj í c í se tím, že uvedený inhibitor je (S)-valvl-pyrolidin2(R)-bórová kyselina.

   23. Způsob podle nároku 19, vyznačuj í c í se tím, že uvedená látka je agonista aktivity FAPa.

   β · 4

   4 » · ·

   44 *

   4 ·

   4 · 4«

   24. Způsob podle nároku 19, vyznačuj ící se tím, ze uvedená látka je antagonista aktivity FAPa

   25. Způsob stanovení, jestliže lanka interaguje s molekulou, která má aktivitu FAPa, vyznačující se tím, ž e se kombinuje uvedená látka a uvedená molekula s Ala-Pro-AFC, stanovuje se interakce uvedené molekuly s Ala-Pro-AFC a porovnává se uvedená interakce s interakcí uvedené molekuly s Ala-Pro-AFC za nepřítomnosti uvedené látky, kde rozčil mezi nimi ukazuje, že uvedená látk interaguje s uvedenou molekulou.

   26. Fúzní protein, který obsahuje část molekuly FAPa, jenž je dostatečná pro uchování aktivity FAPa, a aminokyselinovou sekvenci, která není z FAPa, je rozpustný ve vodě.

   27. Fúzní protein podle nároku 26, kde uvedená aminokyselinová sekvence, která není z FAPa, je aminokyselinová sekvence, která se nachází v proteinu CD8.

   28. Fúzní protein podle nároku 27, kde uvedeny protein CD8 je myší protein.

   29. Fúzní protein podle nároku 27, kde uvedený protein CD8 je lidský protein.

   30. Fúzní protein podle nároku 27, který obsahuje aminokyselinu i až 189 myšího CD8 spojenou s aminokyselinami FAPQ 27 až 760.

   ti, U »·* ·
2. 2/3

   FIG. 2

   kare i nom MFH hojení ran karcinom prsu ledvin FA Pa Θ O 0 A O c £ G CD25 Θ Θ Θ Θ B D Γ H

   Imunohistochemie « « «·· · «··

   WO 97/34927
3. 3/3

   F1G. 3 • *» • · * · • · · *·» ··

   PCTZUS97/04215