CZ299992B6 - Zpusob detekce patogenních organismu ve vzorcích stolice, slin, sekrekcního a bioptického materiálu - Google Patents

Zpusob detekce patogenních organismu ve vzorcích stolice, slin, sekrekcního a bioptického materiálu Download PDF

Info

Publication number
CZ299992B6
CZ299992B6 CZ20023063A CZ20023063A CZ299992B6 CZ 299992 B6 CZ299992 B6 CZ 299992B6 CZ 20023063 A CZ20023063 A CZ 20023063A CZ 20023063 A CZ20023063 A CZ 20023063A CZ 299992 B6 CZ299992 B6 CZ 299992B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
antibody
pylori
solid phase
binding
secondary antibody
Prior art date
Application number
CZ20023063A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ20023063A3 (cs
Inventor
Paul Armbruster@Franz
Crevar@Katarina
Ruppert@Jana
Original Assignee
Immundiagnostik Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Immundiagnostik Ag filed Critical Immundiagnostik Ag
Publication of CZ20023063A3 publication Critical patent/CZ20023063A3/cs
Publication of CZ299992B6 publication Critical patent/CZ299992B6/cs

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G01N33/56922—Campylobacter
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54306—Solid-phase reaction mechanisms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56911—Bacteria
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6854—Immunoglobulins

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

Detekce patogenních organismu, zejména Helicobacter pylori a H. heilamnii ve vzorcích stolice, slina sekrecních vzorcích zpusobem sendvicové analýzypomocí dvojí protilátky spocívá v rozpuštení nebodisperzi vzorku obsahujícího patogenní antigen v roztoku pufru a spojení roztoku pufru s pevnou fází, ke které se vážou alespon dve primární protilátky, z nichž jedna specificky váže patogenní antigen a druhá lidský imunoglobulin A. Dále zahrnuje promytí pevné fáze s nespecificky vázanými proteiny a kontakt pevné fáze se sekundární protilátkou, která specificky váže antigen patogenu, pricemž se kvantitativne stanoví specificky vázané sekundární protilátky.

Description

Způsob detekce patogenních organismů ve vzorcích stolice, slin, sekrečního a bioptického materiálu
Předmět vynálezu
Vynález se týká způsobu detekce antigenu Heticobacter ve vzorcích stolice a slin nebo bioptickém materiálu.
Dosavadní stav techniky
Lidská žaludeční sližnice je často osídlována bakterií rodu Heticobacter pylori a heilmanii nebo Campylobacter. Infekce těmito bakteriemi jsou pravděpodobně přenosné z člověka na člověka, ale zdrojem infekce může být i pitná voda a potraviny. Druh Heticobacter heilmanii přenosný z domácích zvířat, jako například koček, psů, králíků a též hospodářských zvířat, jako například krav. Z tohoto důvodu jsou infekcí ohroženi zejména .lidé obhospodařující tato zvířata. V Německu je H pylori infikováno přibližně 10 % dětí školou povinných, 30 % lidí kolem 30 let a přibližně 75 % starších, občanů. Ve světovém měřítku nese přibližně 50 % populace tuto infekci.
80 % výskytu gastritid, 95 % karcinomu dvanáctníku a 70 % ventrikulamího karcinomu je způsobeno H. pylori. Chronická gastritida způsobená Hpylori (gastritida typu B) je navíc považována za prekurzor gastro-adeno karcinomu a gastrického lymfomu. Podle WHO je H.pylori karcinogeri patřící do třídy s nej vyšším rizikem karcinomu. Pouze malý podíl H.pylori se po infekci projeví symptomy. Mnoho postižených, přestože trpí gastritidou, si výrazně nestěžují nebo přisu25 zují poněkud nespecifické symptomy jiným příčinám. Akutní gastritida vyvolaná H.pylori se projevuje neurčitou bolestí v horní a střední části žaludku, pocitem tlaku a plnosti, kyselými návaly, pálením žáhy, nevolností a zvedáním žaludku. Prakticky u všech pacientů s gastritidou typu B je možné nalézt infekci H.pylori. Navzdory obecně mohutné imunitní reakci infekce přechází u těchto pacientů v chronický stav. Zda se vyvine vřed, závisí na imunitním systému pacienta a na agresivitě bakterie nebo typu bakterie. Ke spontánnímu uzdravení dojde zřídka. Neléčená infekce Hpylori zpravidla přetrvává po celý život.
Infekce H.pylori může být diagnostikována kultivací patogenu z dutiny nebo biopsii tkáně nebo histologickým testováním tkáně. Další diagnostické metody zahrnují CLO test (test na organismy podobné Campy lobacteru) nebo test hydrolýzy močoviny (urease urea test), dechová zkouška na izotop 13C, detekci protilátek proti H.pylori v séru, detekci DNA Helicobacteru v žaludeční šťávě pomocí PCR nebo vzorku stolice a detekci antigeňů Hpylori ve vzorku stolice.
US 5 716 791 (Larka a kol.) a EP 0 806 667 (Meridian Diagnostics Inc.) popisují imunoanalýzu antigenu H.pylori ve stolící. Metoda je založená na dvou afínitních přečištěných polyklonálních protilátkách proti antigenu H.pylori. Firma Connex GmbH, Martinsried, Německo, nabízí rychlý test, založený na laterální průtokové chromatografií zlatém značených monokíonálních protilátek proti antigenům Hpylori ve stolici. Tyto tak zvané HpSA testy (Heticobacter pylori Stool Antigen) měly v různých klinických studiích dobrou shodu s případy diagnostikovanými jinými metodami, ale vysoké procento testů nevedlo k jednoznačný výsledkům. HpSA test je navíc nevhodný pro monitorování léčby, protože funguje pouze při velkých množstvích antigenu H.pylori ve stolici. Další diagnostické metody jsou částečně velmi komplikované, stresující pro pacienta nebo drahé pro rutinní testování. Šero logické metody jsou nevýhodné v tom, že neumožňují monitorování léčby, protože titr protilátky zůstává po vymýcení bakterie po dobu měsíců velice vysoký. Monitorování průběhu léčby je však nezbytné, protože může být přítomna rezistence proti použitým antibiotikům, jako například clarithromycinu, metronidazolu, amoxicilinu, omeprazolu nebo inhibitoru protonové pumpy. Léčba infekcí použitím antibiotik a alternativními přírodními prostředky proto vyžaduje jednoduchý, spolehlivý a citlivý způsob testování H.pylori.
-1 CZ 299992 B6
Podstata vynálezu
Podstatou způsobu detekce patogenních antigenů Helicobacter ve vzorkuje, že se vzorek odebe5 re pacientovi a vytvoří se suspenze vzorku v pracovním pufru pro testování patogenu; načež se vzorek obsahující antigen patogenu smíchá v pufru s pevnou fází, na kterou jsou navázány alespoň dvě různé primární protilátky, z nichž jedna je schopna vázat patogen antigenů a druhá je schopná vazby lidského imunoglobulinu; dále se promyje pevná fáze s nespecificky vázanými antigeny; smíchá se sekundární protilátkou, která specificky rozeznává antigeny patogenu, při10 čemž se provede kvantitativní stanovení navázaných sekundárních protilátek.
Kvantitu navázaných sekundárních protilátek k pevné fázi lze ve vzorku stanovit například pomocí značení protilátky. Značka může být radioaktivní, luminiscenční nebo fluorescenční. Skupina biotinu se může vázat s další molekulou, jako například streptavidinem nebo enzymem jako například peroxidázou, která katalyzuje detekci reakce. Kvantitu navázané sekundární protilátky je možné dále stanovit pomocí další protilátky, která specificky rozeznává typ sekundární protilátky a nese jednu nebo více uvedených značek.
Sekundární primární protilátkou proti lidskému imunoglobulinu, vážící se na pevnou fázi, je s výhodou protilátka, která váže lidský IgA a výhodněji váže sekundární lidský IgA, kterýje vylučován do slin a tlustého střeva. Navržení sekundární protilátky IgA zahrnuje IgA, případně též takzvané sekreční komponenty (MW: 70, kDa), které jsou. tvořeny epiteliálními transportními buňkami a ochranu IgA před proteolytickými enzymy. Zvláště výhodné jsou protilátky proti IgA2, protože Helicobacter a jiné mikroorganismy tvoří proteázy, které mohou štěpit slgAl.
Zvláště výhodná je směs dvou primárních protilátek které specificky vážou IgA 1 a IgA2.
Ve výhodném provedení podle vynálezu je první primární protilátkou, vážící se k pevné fázi, polyklonální králičí protilátka wati-Hpyroli. Druhou primární protilátkou, vážící se k pevné fázi, je polyklonální kozí protilátka anti-human-sIgA, testovaná na křížovou reaktivitu. Sekundární protilátkou je s biotinem konjugovaná králičí protilátka wúx-Hpylori, takže kvantitu navázané sekundární protilátky je možné stanovit podle vazby s peroxidázou konjugovaného streptavidinu a barevné reakce $ tetramethylbenzidinem.
V druhém výhodném provedení podle vynálezu je první primární protilátkou, vážící se k pevné fázi, králičí protilátka wtíš-Hpylori, druhou primární protilátkou je králičí protilátka anti-human -slgA a sekundární protilátkou je polyklonální kozí protilátka 'ánú-H.pylori konjugovaná s křenovou peroxidázou. Mohou být však použity i jiné imunoglobuliny, jako například koňské, kočičí, prasečí, ovčí, kozí, králičí, ž morčete, krysy, myši nebo jiných zvířat. Je důležité zjistit, zda se druhá primární protilátka proti lidskému imunoglobulinu neváže na sekundární protilátku proti antigenů patogenu ve vzorcích slin a stolice. Protilátky mohou být v principu monoklonální. Zejména druhá primární protilátka může být monoklonální protilátkou proti lidskému IgA2. Doporučuje se použít více monoklonálních protilátek, které rozeznávají různé epitopy patogenu lidského imunoglobulinu. U monoklonálních primárních protilátek se doporučuje použít směs většího množství monoklonálních protilátek pro zvýšení specificity stanovení.
Sekundární protilátky jsou s výhodou konjugovány s jednou nebo více značkami, jako například biotinem, fluoresceinem, rutheniem, europiem, částicemi zlata, alkalickou fosfatázou, galaktosidázou nebo křenovou peroxidázou. Mohou být však použity jiné vhodné značky nebo detekční systémy.
Princip stanovení uveden na příkladu ELIS A
ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) se podle vynálezu používá pro kvalitativní a kvantitativní stanovení antigenů H.pylori ve vzorcích slin, stolice a bioptickém materiálu. Anti55 gen H.pylori se v prvním kroku uvolní ze vzorku a s výhodou naváže pomocí polyklonální proti-2CZ 299992 B6 látky arti-H.pylori, která se běžně váže na mikrotitraění destičku nebo některou jinou pevnou fázi, K pevné fázi se dále naváže druhá primární protilátka, která rozeznává lidský imunoglobulin a s výhodou lidský sekreční IgA. Protože protilátky Hpylori ve vzorcích slin a stolice byly v kontaktu s pacientovým vlastním imunitním systémem, některé nebo všechny epitopy H.pylori jsou již navázány na imunogtobuliny a nejsou již schopné vazby na principu první primární protilátky s patogenem. Přesto jsou však patogenní antigeny ve vzorcích stolice, slin a bioptickém materiálu koncentrovány a vázou se na pevnou fázi druhou primární protilátkou proti lids' kému imunoglobulinu, ačkoli imunitní reakce oproti nim již existuje. Na jedné straně se tak antigeny H.pylori přímo vážou a na druhé straně nepřímo pomocí své vazby k sekrečnímu lidskému io imunoglobulinu ve slinách a zažívacím traktu. V druhém kroku je pak vazba antigenů H.pylori přímo detekována sekundární protilátkou antt-Zf.py/or/. Vhodným systémem se pak stanoví kvantitativně vazba sekundární protilátky.
Pro vysokou specificitu sekundární protilátky proti antigenů H.pylori jsou falešně pozitivní výs15 ledky vyloučeny. Celková specificita stanovení dvojitou protilátkou je zejména u substancí určena specificítou sekundární protilátky. Skutečností, že se v prvním kroku váže též lidská sekreční protilátka s antigeny patogenu, se v případě H.pylori zvyšuje nejen citlivost, ale též rozsah stanovení. Překvapující je zejména to, že ve významně velkém počtu případů jsou lidskou imunitní reakcí rozeznávány všechny imunogenní epitopy H.pylori. V případě organismu Helicobacter je množství imunogenních epitopu významně omezeno, to znamená, že epitopy patogenu rozeznávané lidským imunitním systémem a zvířecí primární a sekundární protilátkou u stanovení na základě dvojité protilátky, jsou často shodná. To má za následek zejména u Hpylori tvorbu kolonií v ústech a v pozdější fázi léčbu, kdy imunitní reakce zkresluje snížené množství epitopů H.pylori, které jsou stále přítomny ve vzorcích stolice a slin. Způsobem testu podle vynálezu je možné detekovat malá a dokonce maskovaná množství antigenů H.pylori.
Přítomnost Helicobacter pylori ve slinách byla dosud podrobena pouze akademickému zájmu z hlediska tohoto domnělého způsobu přenosu (Namavar F. a kol., Eur. J. Clin. Microbiol. ínfect. Dis., 1995, 14(3), str. 234-7; Shimada T. a kol., Lancet. 1994, 343(8913), str. 1636-7). Ve způ30 sobu podle vynálezu je hranice detekce H.pylori tak nízká, že lze infekci H.pylori stanovit i ve slinách. Stanovení antigenů Hpylori ve slinách je důležité především pro sledování léčby pacientů. Prováděné pokusy ukázaly, že v ústech - pravděpodobně při kovových plombách, zubních protézách a podobně je možné nalézt ložiska infekce H.pylori, která přežívají běžnou medikamentózní léčbu a po ukončení léčby se obnoví infekce v žaludeční slizniei. Léčbu je proto možné považovat za ukončenou pouze v případě, že nejsou nalezeny antigeny H.pylori ani ve vzorku stolice ani slin.
Použití Sendvičového principu Stanovení podle Vynálezu s druhou primární protilátkou proti lidskému imunoglobulinu, zejména proti lidskému sekrečnímu IgA, není omezeno pouze na mikrotit40 rační destičku. Může být uzpůsobeno na plně automatizovaný proces, který používá potažené kuličky nebo částice. Princip podle vynálezu, který používá druhou primární protilátku proti lidskému sekrečnímu IgA, je obecně vhodný pro diagnózu patogeneze vyskytující se v ústech nebo zažívacím traktu a způsobuje rozsáhlou imunitní reakci.
Obecně je výhodné, pokud je první primární protilátka současně polyklonální protilátkou proti různým typům H.pylori, Totéž platí i pro sekundární protilátku, protože se tím zvyšuje spolehlivost testu.
Vynález a jeho výhody jsou popsány pomocí výhodných provedení podle vynálezu a příkladů a pomocí doprovodných obrázků.
-3CZ 299992 Bó
Popis obrázků na výkresech
Obr. 1: Schéma principu imunoanalýzy antigenů Hpylori podle vynálezu.
Obr. 2: Další typ příkladu imunoanalýzy podle vynálezu.
Obr. 3: Grafické zobrazení rozložení koncentrace antigenů H.pylori ve slinách stanovené podle vynálezu před a po léčbě.
Příklady provedení vynálezu io
Příklad 1
Detekce antigenů Hpylori ve stolici a slinách
Příprava vzorku stolice: Navážilo se přibližně 100 mg stolice a za laboratorní teploty rozsuspendovalo v 5 ml promývacího pufru PBS obsahujícího 0,1% Triton X-100 (8 mM Na2HPO4, 15 mM K2H2PO4, 3 mM KC1, 12,5 mM NaCl, 0,1 % Triton X-100, 0,02% Thimerosal, pH 7,4). Dávkování a homogenizace vzorku stolice se prováděla výhodně pomocí systému na přípravu vzorků firmy Roche Diagnostik, Mannheim, Německo (objednávka číslo 745804). Homogenizát se centrifugoval na stolní centrifuze, 10 minut při otáčkách 3000 otáček za minutu, 1 ml produktu se přeneslo do Eppendorfovy zkumavky a centri fugová Io 5 minut při otáčkách 13000 za minutu v centrifuze Eppendorf. Produkt se pak přímo použil pro ELISA stanovení.
Příprava vzorku slin: Vzorek slin se naředil v pracovním pufru 1:4 nebo 1:5 v závislosti na viskozitě a přímo se použil pro stanovení vazby. V případě vzorků slin je výhodné, pokud pufr pro stanovení obsahuje inhibitor proteázy, jako například 5 mM PMSF. Je možné též použít komerční proteázové inhibitory, jako například Pefablock SC (Roche Diagnostics).
Potažení mikrotitrační destičky: Jamky mikrotitrační destičky se potáhly polyklonální protilátkou proti antigenů H.pylori a lidskému imunoglobulinu-A. Za tímto účelem se do každé jamky * nadávkovalo 100 pg komerčně dostupné protilátky králičí anti-ff/iy/on' (DAKO, Hamburg) rozpuštěné v 200 μΐ 60 mM NaCCU, pH 9,6 a destička se inkubovala přes noc při 4 °C. Roztok králičí protilátky <\x\\.\-H,pylori se z jamek odstranil a každá jamka se promyla 200 μI promývacího pufru (PBS, pH 7,4 0,1% Triton X-100). Do každé jamky se nadávkovalo 100 mg protilátky králičí anti-human-sIgA (DAKO, Hamburg) rozpuštěné v 200 μΐ 60 mM NaCO3, pH 9,6 a destička se inkubovala 1 hodinu při . laboratorní .teplotě. Roztok protilátky anti-human -IgA se z jamek odstranil a každá jamka se promyla pětkrát 125 μΐ promývacího pufru. Po posledním promývání se jamky destičky vyklepaly na savý papír.
Stanovení vazby: Všechna stanovení se prováděla dvojmo. *100μ1 standardu a vzorku se napipetovalo dvojmo do protilátkou pokrytých jamek mikrotitrační destičky a inkubovalo za třepání 1 hodinu při laboratorní teplotě. Roztok se odstranil a jamky destičky se promyly pětkrát, pokaždé 250 μΐ promývacího pufru. Po posledním promývání se jamky destičky vyklepaly na savý papír.
Detekce vazby: Do každé jamky se nadávkovalo 100 μΐ s biotinem konjugované polyklonální králičí protilátky anú-Hpylori (1:10000; DAKO, Hamburg) nebo s křenovou peroxidázou (HRP)-konjugované polyklonální kozí protilátky anti-íř/zy/on (KPL, Kirkehard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD; směs polyklonální protilátky proti H.pylori typu ATCC 43504,
43526, 43579) zředěná promývacím pufrem 1:1000 a destička se za třepáni inkubovala 1 hodinu za laboratorní teploty. Roztok se odstranil z jamek a každá jamka se promyla pětkrát 200 μΐ promývacího pufru.
-4CZ 299992 B6
Kvantitativní stanovení: Za účelem barevné reakce se do každé jamky nadávkovala s peroxidem konjugovaná kozí protilátka anti-HpyZon, 100 μΐ substrátového roztoku tetramethylbenzidinu (TMB) (ready-for-use, NOVUM Diagnostika GmbH, Dietzenbach, Německo) a po přibližně 20 minutách se barevná reakce zastavila přídavkem 50 μΐ 0,4 M H2SO4. V případě s biotinem kon5 jugované králičí protilátky anti-Jípy/on se použilo potažení 100 μΐ s křenovou peroxidázou konjugovaným streptavidinem (DAKO), zředěným promývacím pufrem 1:10000 a následovala inkubace destičky za třepání po dobu 1 hodiny za laboratorní teploty, promývání pětkrát promývacím pufrem a teprve pak se přidala chromogenní látka. Zbarvení se vždy stanovilo měřením absorbance (optické hustoty) při 450 nm. Následující tabulky 1 a 2 uvádí reprezentativní výsled10 ky kontrolní skupiny a pacientů infikovaných H.pylori, kdy se podle vynálezu stanovení opakovala v různé dny. Stanovení byla prováděna podle doporučení pomocí různých detekčních systémů a/nebo sekundárních protilátek.
Srovnávací příklad 2
Imunoanalýza bez sekundární protilátky proti lidskému imunoglobulinu A
Příprava vzorků stolice a slin a stanovení vazby se provádělo přesně podle příkladu 1, s tím roz20 dílem, že jamky mikrotitrační destičky se výjimečně pokryly afinitně přečištěným polyklonálním králičím imunoglobulinem proti Helicobacterpylori nebo protilátkou anti-human-sIgA. Všechna promývání, potahování, vazebné kroky a barevná reakce se prováděla paralelně na téže mikrotitrační destičce.
- s QZ 299992 B6
Tabulka 1
Absorbance (optická hustota-OD) při 450 nm1
< c £ 42 « > Φ C 5 g. E 6 Q. 2 < N £ Φ *p C Έ 5 □ I i u c <0 CO < c o V) > + § 5 i <: f c (5 m i ť c co 'w o AT 'CO e co g O) 3 Έ o jí OL X 25.01.00 0,181 σ> Z . 0,690 0,2.16 0,449 CN CO o' rt co Τ- Ο 0,398 r-·. CO τ- Ο
o q t- q tri CM o t- T“ o’ q . c o Y-, CN o’ iO CO co o CN d r— N· Ν' o’ CN O rt CO τ- ο“ Γ- ΙΟ τ- ο
o q O d CM co m CN o cň c d ÍN f-; d Λ rt CN d co rt m ,d O' 00 m d o> oo τ- Ο rt <0 τί* d O o CN O
= c £ ? š < 5 .« § w w o -= CL C - 1 C I « < 5 « p o> 28 = « w CD < < i o 9 X c Q. (0 ¥ 1 ϊ * OJ -X *3 + φ '2 ;ó jí = S jí 'CO c c O -* c > o o < CL O CL CQ < § Λ ΐ : ι c CO íg Έ jc 'CO C co g o> 'Č? o c o íd 0 q t— o d CN v-' o q c CO CO o γ- τ- ο •N- 00 CN o r- o v Ό 0) σ> d tf) rt CÍ Ν’ m ci
:o. q o d CN 8 Ν' Q q c o o c*> d o θ’ v·' M- νγ o 00 CO r- τ— rt (0 CN o T— co co d ΓΝ ď
O q -,- ο d CN δ o’ q c. d o uo o CN CO O s- Γ- ΟΟ o co O) r\ CN CN CN d rt CN T“ CO CN CN d
ό· q x— O co U> <· o’ m co CO in CO O O r- <N d ι 1 cn CN P
O q τ- Ο CN T- o O Tf o‘ o u> o CN ιό CN cn cí co u> CN d 1 o m o‘
Mikrotítrační destička potažená primární protilátkou E co '« £ Ό <0 £ 2 ω °· E □ π τ> .c Φ >tu. KD S l·- cS Q_ : Tř Φ CN m Ό W TO θ 4-1 CO 0. s 5 +» TO Dl k TO CL Vi co H es CL ro I TO CL S- O X CD QL O <0 <S£ Jí. 3 O „ CL <P co '3 -S Ή 8 8 S ® š Z ** w
Ad1: Všechny hodnoty absorbance jsou průměrnou hodnotou dvou měření.
-6CZ 299992 B6
Tabulka 2
Naměřené hodnoty (odečtena nespecifická vazba)
Srovnání pouze ánti-human-sIgA 5 o < s ΐ TO 'Ň O X *ro c TO š o> 3 ‘c O i: £L X X 25.01.00 s o Q •d c £?*¥*·. || 0,029 /7.-¾ R/ to/· :-:zí/ř· V a -0.005 V O O o l fe ©/ ϋ W;·
Srovnání b Anti-human o o p tn OJ CO τ- Ο O d C : Ol o- o o .1: /fe te «; o o> Ol o CO co o o 1 á ps
1 § & i 5 5 < 5 Έ S < + TO « O O o wS Ol a o o* d c Kř co o o íB w: aa. 8 SS fS B o .8 o „ τ- Ο o ςξΐϊ/ <0Í.
Srovnání pouze anti- human-sIgA < é O & i C TO io ‘S Jí '00 c TO š . 09 □ 'Č' O Jí 1 C O ώ o o v- p tf) Ol o o o 1 d c r- to o o 1 «1 St & r- v o o' 1 m v o o“ W & Saok Rf ϋ
Srovnání bez anti- human-sIgA o P P tfí Ol a o 09 C O o 1 o?, é l·- IO w *— io o o” ^Φ··Τ lb Íl
c .. . 1 E CL .3 Ϊ c c to to »č Ϊ2 Ί ' Έ jí jí ΊΞ Έ 'TO 'TO C £ CO o ° < JC i o m oj® ÍL < + Ol » o o o Iři Ol co to Ol o d c § .04; 11 o r- tn 8 o o B i
o O V*· p v co Ol o to 8 tn to to o r> Ol ©
o p p oi s Ol o s p v- tft F> rs o‘ oo o T- o t
mikrotitrační destička potažená primární protilátkou 1 * c *(0 ω ε w o. ε 2 TO 5 ίΞ >£ >09 £ H TO ÍL 3 OJ m <5 L. . TO O TO: 0. 1 co CL X TO £L w £ TO ÍL 75 I ro £L τ- Ο X ro ÍL
Z tabulky č. 1 a 2 je zřejmé, že někteří pacienti měli ve vzorku stolice antigeny Hpylori zcela maskovány vlastním imunitním systémem, a proto nemohly být navázány analytickou primární protilátkou proti patogenům. V případě tohoto maskování antigenů běžná imunoanalýza dvěma protilátkami vedla k falešně negativním výsledkům infekce Hpylori nebo odstraněné infekce. Naopak způsobem podle vynálezu se antigeny H.pylori již vázané nebo maskované lidským imunitním systémem vázaly na pevnou fázi (viz/tabulka 2, pole s šedým pozadím) druhou primární protilátkou anti-human-sIgA. Maskující účinek nebyl závislý ani na použité sekundární protilátce, ani na tom, zda se jednalo o vzorek slin nebo stolice. Z výsledků je zřejmé, že v mnoha io . případech je primární vazba H.pylori k pevné fázi pomocí protilátek anti-human-algA a protilátek anti-H.pylori vzájemně výjimečná, takže vzhledem k vazbě je výsledek jednoznačný. Možná primární vazba antigenů H.pylori k pevné fázi pomocí vazby k lidskému imunoglobulinu
A podle vynálezu je proto nezbytným nástrojem pro diagnostiku.
Příklad 3
Screening slin
Od 150 pacientů podezřelých na infekci H.pylori nebo po dokončení léčby se odebraly vzorky slin a testovaly se na přítomnost antigenů H.pylori. Analýza se prováděla podle příkladu 1 s tím rozdílem, že pracovní pufr navíc obsahoval proteázový inhibitor. Detekční limit antigenů Helicobacter leží u slin,v oblasti výše uvedeného testu (s HRP-konjugovanou kozí protilátkou antíH.pylori a tetramethylbenzidinem) přibližně při 2pg antigenů H.pylori na mililitr pracovního pufru. Po optimalizaci druhé protilátky proti antigenů patogenu a selekcí luminiscenčního detekčního systému by mělo být možné dosáhnout detekčního limitu 0,2 pg na mililitr a níže.
Výsledek screeningu vzorkuje zobrazen na obr. 3 pomocí sloupcového diagramu. Ze sloupcového diagramu je zřejmé, že pacienti s infekcí H.pylori ve slinách mají zpravidla antigeny v množ30 ství vyšším než 60 ng/ml H.pylori. Testování slin je proto vhodné pro detekci infekce H.pylori. Koncentrace H.pylori nižší než 25 ng na ml slin naopak ukazuje nespecifickou křížovou reakci s jinými patogeny.
Poprvé tak bylo dokázáno, že infekci H.pylori je možné detekovat imunologickým testováním slin, které je prakticky relativně jednoduché. Úspěch léčby je tak možné relativně jednoduše sledovat. Předchozí analýzy slin na H.pylori naopak nedovolují diagnózu infekce zažívacího traktu H.pylori, ale byly založeny na vědeckém výzkumu možné cesty přenosu.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    45 1. Způsob detekce patogenních organismů ve vzorcích stolice, slin, sekrečního a b i optického materiálu stanovením sendvičové vazby dvojí protilátky, vyznačující se t í m, že se odebere a/nebo disperguje vzorek obsahující antigen patogenu v roztoku pufru, načež se roztok pufru spojí s pevnou fází, ke které se vážou alespoň dvě primární protilátky, z nichž jedna se specificky váže k antigenu patogenu a druhá se specificky váže k lidskému imunoglobulinu A,
    50 dále se pevná fáze s nespecificky vázanými proteiny promyje a pevná fáze se spojí se sekundární protilátkou, která se specificky váže k antigenu patogenu, přičemž se stanoví množství specificky vázané sekundární protilátky.
  2. 2. Způsob podle nároku 1, vy značuj ící se tím, že druhá primární protilátka váže
    55 sekreění lidský IgA.
    -8CZ 299992 Bó
  3. 3. Způsob podle nároku 2, vyznačuj ící se tím, že druhá primární protilátka váže sekreční lidský lgA2.
  4. 5 4. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž 3, vyznačující se tím, že je sekundární protilátka konjugována s některou látkou ze skupiny zahrnující biotin, fluorescein, ruthenium, europium, částice zlata, alkalickou fosfatázu, glukosidázu a křenovou peroxidázu.
    5. Způsob podle kteréhokoli nároku 1 až 4, v y z n a č u j í c í se tím, že první primární io protilátka a druhá protilátka váže antigeny Helicobacterpylori.
  5. 6. Způsob podle kteréhokoli z nároků l až 5, vy zn ačuj ící se t í m , že první primární protilátka je směsí polyklonální a/nebo monoklonální protilátky proti různým typům Helicobacter pylori, 15
  6. 7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že je sekundární protilátka směsí polyklonální a/nebo monoklonální protilátky proti různým typům Helicobacter pylori.
  7. 8. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, v y z n a č u j í c í Campy lobacter.
    se tím, že patogenem je
  8. 9. Způsob podle kteréhokoli z nároků laž 4, vyznačující se Helicobacter heilmanii.
  9. 10. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až4, vyznačující se lává mohutnou imunitní reakci v těle pacienta.
  10. 11. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, vyznačuj ící se diagnózu patogenů přetrvávajících v ústech po medikamentózní léčbě.
CZ20023063A 2000-02-14 2001-02-14 Zpusob detekce patogenních organismu ve vzorcích stolice, slin, sekrekcního a bioptického materiálu CZ299992B6 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE10006432A DE10006432A1 (de) 2000-02-14 2000-02-14 Verfahren zum Nachweis von Helicobacter pylori in Stuhl- und Speichelproben

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20023063A3 CZ20023063A3 (cs) 2003-01-15
CZ299992B6 true CZ299992B6 (cs) 2009-01-14

Family

ID=7630808

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20023063A CZ299992B6 (cs) 2000-02-14 2001-02-14 Zpusob detekce patogenních organismu ve vzorcích stolice, slin, sekrekcního a bioptického materiálu

Country Status (10)

Country Link
US (2) US20030148411A1 (cs)
EP (1) EP1257823B1 (cs)
JP (1) JP4122419B2 (cs)
AT (1) ATE259065T1 (cs)
AU (2) AU2001246433B2 (cs)
CZ (1) CZ299992B6 (cs)
DE (3) DE10006432A1 (cs)
DK (1) DK1257823T3 (cs)
ES (1) ES2215126T3 (cs)
WO (1) WO2001063285A2 (cs)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0833756A (ja) * 1994-07-25 1996-02-06 Asama Seisakusho:Kk パチンコ機の弾球装置
DE60138981D1 (de) * 2000-05-18 2009-07-30 Meridian Bioscience Inc Immunoassay für H. pylori in Fäkalienproben mit Hilfe von gattungsspezifischen Antikörpern
DE10219741A1 (de) * 2002-05-02 2003-11-13 Georg S Wengler Verfahren zur Vorbehandlung von Stuhlproben
US8557531B2 (en) * 2006-04-18 2013-10-15 Wellstat Biologics Corporation Detection of circulating endothelial cells
CN102980884A (zh) * 2012-11-29 2013-03-20 江苏创生生物技术有限公司 胃黏膜样品中幽门螺旋杆菌的化学发光免疫测定法
CA2939366A1 (en) 2014-02-20 2015-08-27 Immundiagnostik Ag In vitro diagnostic and prognosis of contrast induced nephropathy (cin) in patients undergoing coronary angiography
JP6676387B2 (ja) * 2016-01-28 2020-04-08 旭化成株式会社 特定の細菌を検出するイムノクロマト方法及びそれに用いるキット
EP3499235A1 (en) 2017-12-13 2019-06-19 Immundiagnostik AG Method of measuring auto-antibodies in bodily fluids

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993022682A1 (en) * 1992-04-29 1993-11-11 Auspharm International Limited In vitro test for helicobacter pylori
WO1998027432A1 (en) * 1996-12-19 1998-06-25 Chiron Corporation Helicobacter pylori diagnostics
WO1999041611A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Consortia Laboratories S.R.L. Assaying of antibodies directed against one or more antigens of helicobacter pylori in biological liquids by a heterogeneous immunologic method of the reverse type

Family Cites Families (40)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0063810B1 (en) * 1981-04-29 1986-03-05 Ciba-Geigy Ag New devices and kits for immunological analysis
US5061237A (en) * 1985-07-02 1991-10-29 Cytomed Medizintechnik Gmbh Method of purifying whole blood
US5459041A (en) * 1988-02-18 1995-10-17 Enteric Research Laboratories, Inc. Campylobacter pylori antigens and uses thereof for detection of Campylobacter pylori infection
US5200051A (en) * 1988-11-14 1993-04-06 I-Stat Corporation Wholly microfabricated biosensors and process for the manufacture and use thereof
US4968604A (en) * 1989-07-20 1990-11-06 Neorx Corporation Method and test kit for detection of antibodies
US5075078A (en) * 1989-10-05 1991-12-24 Abbott Laboratories Self-performing immunochromatographic device
US5646001A (en) * 1991-03-25 1997-07-08 Immunivest Corporation Affinity-binding separation and release of one or more selected subset of biological entities from a mixed population thereof
US5248595A (en) * 1991-10-08 1993-09-28 Eastman Kodak Company Wash composition, test kit and method for determination of microorganisms associated with periodontal diseases
US5807752A (en) * 1992-09-11 1998-09-15 Boehringer Mannheim Corporation Assay using an unblocked solid phase with immobilized analyte binding partner
FI92882C (fi) * 1992-12-29 1995-01-10 Medix Biochemica Ab Oy Kertakäyttöinen testiliuska ja menetelmä sen valmistamiseksi
US6258359B1 (en) * 1993-05-19 2001-07-10 Institut Pasteur Immunogenic compositions against helicobacter infection, polypeptides for use in the compositions, and nucleic acid sequences encoding said polypeptides
US5561045A (en) * 1994-01-04 1996-10-01 Intracel Corporation Detection reagent, article, and immunoassay method
US7569341B2 (en) * 1994-01-31 2009-08-04 Trustees Of Boston University Nucleic acid directed immobilization arrays and methods of assembly
US5981203A (en) * 1994-04-26 1999-11-09 The Regents Of The University Of Michigan Unitary sandwich enzyme immunoassay cassette, device and method of use
US5498528A (en) * 1994-06-10 1996-03-12 King; Wing Detection of helicobacter pylori
DE4439452A1 (de) * 1994-11-04 1996-05-09 Boehringer Mannheim Gmbh Antikörperklassenspezifisches Entstörungsreagenz
US5837240A (en) * 1995-04-28 1998-11-17 Oravax-Merieux Co. Multimeric, recombinant urease vaccine
SE9503937D0 (sv) * 1995-11-07 1995-11-07 Anders Pettersson Förebyggande av plötslig spädbarnsdöd
US5932430A (en) * 1996-05-09 1999-08-03 Meridian Diagnostics, Inc. Immunoassay for H. pylori in fecal specimens
US5716791A (en) * 1996-05-09 1998-02-10 Meridian Diagnostics, Inc. Immunoassay for H. pylori in fecal specimens
US6514731B1 (en) * 1996-05-24 2003-02-04 Chiron Corporation Methods for the preparation of hepatitis C virus multiple copy epitope fusion antigens
US5876944A (en) * 1996-06-10 1999-03-02 Bayer Corporation Method for amplification of the response signal in a sandwich immunoassay
US5922845A (en) * 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
US6506384B1 (en) * 1997-12-31 2003-01-14 New York University Early detection of mycobacterial disease
AU9497998A (en) * 1997-09-22 1999-04-12 Chiron Corporation Method for detecting antibodies in a sample
EP0965044B1 (en) * 1997-11-18 2003-03-19 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplex flow immunoassays with magnetic particles as solid phase
AUPP103497A0 (en) * 1997-12-19 1998-01-15 Panbio Pty Ltd Assay apparatus
DE19758017C2 (de) * 1997-12-29 2000-03-02 Hanns Ludwig Verfahren zum Nachweis von Borna-Disease-Virus (BDV)-Infektionen über den Nachweis zirkulierender Immunkomplexe und hierfür verwendbarer diagnostischer Kit
US7297312B2 (en) * 1998-03-16 2007-11-20 University Of Cincinnati Simultaneous multianalyte electrochemical assay based on spatial resolution
US6303081B1 (en) * 1998-03-30 2001-10-16 Orasure Technologies, Inc. Device for collection and assay of oral fluids
US6221579B1 (en) * 1998-12-11 2001-04-24 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Patterned binding of functionalized microspheres for optical diffraction-based biosensors
AU4701200A (en) * 1999-05-07 2000-11-21 Quantum Dot Corporation A method of detecting an analyte using semiconductor nanocrystals
US6383740B2 (en) * 1999-07-30 2002-05-07 Bioergonomics, Inc. Methods for simultaneously detecting both members of a binding pair
US6727073B1 (en) * 1999-11-19 2004-04-27 Binax, Inc. Method for detecting enteric disease
TWI237695B (en) * 1999-12-14 2005-08-11 Joy Biomedical Corp Helicobacter pylori antigens in blood
US6316205B1 (en) * 2000-01-28 2001-11-13 Genelabs Diagnostics Pte Ltd. Assay devices and methods of analyte detection
US20020004246A1 (en) * 2000-02-07 2002-01-10 Daniels Robert H. Immunochromatographic methods for detecting an analyte in a sample which employ semiconductor nanocrystals as detectable labels
US20010051351A1 (en) * 2000-03-27 2001-12-13 Racis Stanley Paul Antigen-specific immune complex-based enzyme-linked immunosorbent assay
US6699722B2 (en) * 2000-04-14 2004-03-02 A-Fem Medical Corporation Positive detection lateral-flow apparatus and method for small and large analytes
US6528325B1 (en) * 2000-10-13 2003-03-04 Dexall Biomedical Labs, Inc. Method for the visual detection of specific antibodies in human serum by the use of lateral flow assays

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1993022682A1 (en) * 1992-04-29 1993-11-11 Auspharm International Limited In vitro test for helicobacter pylori
WO1998027432A1 (en) * 1996-12-19 1998-06-25 Chiron Corporation Helicobacter pylori diagnostics
WO1999041611A1 (en) * 1998-02-13 1999-08-19 Consortia Laboratories S.R.L. Assaying of antibodies directed against one or more antigens of helicobacter pylori in biological liquids by a heterogeneous immunologic method of the reverse type

Also Published As

Publication number Publication date
WO2001063285A3 (de) 2002-04-11
US20030148411A1 (en) 2003-08-07
DE10190630D2 (de) 2002-12-05
ES2215126T3 (es) 2004-10-01
AU4643301A (en) 2001-09-03
DE50101435D1 (de) 2004-03-11
CZ20023063A3 (cs) 2003-01-15
JP4122419B2 (ja) 2008-07-23
EP1257823A2 (de) 2002-11-20
EP1257823B1 (de) 2004-02-04
DK1257823T3 (da) 2004-05-24
DE10006432A1 (de) 2001-08-16
AU2001246433B2 (en) 2005-03-24
WO2001063285A2 (de) 2001-08-30
ATE259065T1 (de) 2004-02-15
US20070087395A1 (en) 2007-04-19
JP2003526779A (ja) 2003-09-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5591693B2 (ja) 回虫糞便抗原の検出
EP2164948B1 (en) Device, kit and method for hookworm antigen capture and detection
US20090030054A1 (en) Cytoplasmic antigens for detection of candida
CN101600965B (zh) 钩端螺旋体病诊断试剂盒
JP6867529B1 (ja) ヘリコバクター・ピロリ検出用抗体
WO2011074802A2 (ko) 전립선암 진단용 키트 및 진단방법
CZ299992B6 (cs) Zpusob detekce patogenních organismu ve vzorcích stolice, slin, sekrekcního a bioptického materiálu
CN101165491A (zh) 以金磁微粒为载体检测抗双链dna抗体的方法
EP1580557A1 (en) Method of examining staphylococcus aureus
US20210364515A1 (en) Optimizing diagnostics for galactofuranose containing antigens
US6235487B1 (en) Method of diagnosing Crohn&#39;s disease
KR101894489B1 (ko) Igm 반정량적 렙토스피라증 진단 키트
US20210349106A1 (en) Method for diagnosing sars-cov-2 infection
JP2004524522A (ja) 膵臓及び胃腸疾患の検出方法
WO2004048976A1 (ja) 黄色ブドウ球菌の検査方法
Renneker et al. Field validation of a competitive ELISA for detection of Theileria annulata infection
WO2020158811A1 (ja) ヘリコバクター・ピロリ菌株の同定方法、および同定用キット
Hendawy et al. Development of Rapid Home-Made Immunochromatographic Test for Diagnosis of Cryptosporidium Parvum
Wienecka et al. Detection of Giardia antigen in stool samples by a semi-quantitative enzyme immunoassay (EIA) test
CN117405887A (zh) 腺苷酸环化酶作为标志物在制备诊断和/或鉴别腹泻的病原体的产品中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140214