CZ302092B6 - Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, jeho cástice, inokulum a zpusob indukce protilátek - Google Patents

Abstract

Popisuje se upravený jaderný protein hepatitidy B, který zahrnuje inzert prednostne v imunodominantní oblasti nukleokapsidového proteinu, který obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Upravený jaderný protein hepatitidy B nebo agregované cástice nukleokapsidového proteinu mohou být previsle vázány na hapten za vzniku upraveného nukleokapsidového konjugátu. Takový konjugát je možné použít pri príprave vakcíny nebo protilátek. Upravený jaderný protein hepatitidy B se muže také upravit, aby zahrnoval epitop T bunky.

Description

Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, jeho Částice, inokulum a způsob indukce protilátek

Oblast techniky

Vynález se týká oblasti, kde se protínají dva obory imunologie a proteinové inženýrství. Zvláště se pak popisují nosičové proteiny a zvláště pak nukleokapsidový protein hepadnaviru, který se strategicky upravil začleněním chemicky reaktivního aminokyselinového zbytku, a převisle vázaný haptenový konjugát nukleokapsidového proteinu hepadnaviru a imunogenní částice, které obsahují uvedené konjugáty.

Dosavadní stav techniky

Je známo, že protilátky tvoří malé molekuly a jako nosič se používají velké imunogenní molekuly proteinu. Malá molekula, která způsobuje zvýšenou imunogenicitu tím, že je spojena s nosičem, se nazývá hapten. Jev, že relativně velká molekula zvyšuje imunogenicitu malé molekulové entity, se kterou je spojena, se nazývá „účinek nosiče“.

Část imunogenu, kterou rozeznávají pomocné buňkyT (buňka T_h) je determinantou nebo epitopem. Část imunogenu, která je vázaná na protilátku je determinanta nebo epitop buňky B. Účinky nosiče se mohou definovat jako imunita vůči jedné determinantě, zvláště pak determinantě „pomocných“ buněk a T buněk (T_h), dále pak vůči multideterminantnímu imunogenu zvyšujícímu imunitní odezvu vůči jiné determinantě, determinantě vůči B buňky.

Nyní je velmi dobře prokázáno, že většina imunogenů vyžaduje pomoc T buněk při vyvolání produkce protilátek u buněk B. Pak buňky T_h tím, že rozeznávají pomocné determinanty na imunogenních pomocných buňkách B, tvoří protilátky proti imunogenu.

Antigenní determinanty rozeznávané pomocnými buňkami T (TJ a buňkami B jsou spojovány s tvorbou jediné molekulové entity, ale nemusí být kovalentně spojeny (popisuje se v publikaci Russel et al., Nátuře, 280: 147 (1979), Lamb et al., J. ImmunoL, 129: 1 465 (1982), Scherle et al., J. Exp. Med., 164: 1 114 (1986) and Lake et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 41: 589 (1976). Některé imunogeny nevyžadují k vytvoření protilátek pomoc T buněk. To jsou T-nezávislé antigeny.

Protein příbuzný s patogenem může být imunologicky napodoben produkcí syntetického polypeptidu, jehož sekvence odpovídá sekvenci determinanty patogenu. Takové polypeptidové imunogeny se popisují v publikaci Sutcliffe et al., Nátuře, 287: 801 (1980) a Lemer et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 78: 3 403 (1981).

V publikaci Gerin etal., Proč. Nati. Acad, Sci. USA, 80: 2 365 (1983) ukazuje omezenou ochranu Šimpanzů před virem hepatitidy B po imunizaci syntetickými polypeptidy vázanými na nosič, které mají sekvence aminokyselinových zbytků, která odpovídá v sekvenci oblasti determinanty HBsAg, zvláště pak zbytkům 110 až 137 povrchové oblasti „S“. Avšak nosičový protein používaný v těchto studiích je hemocyanin přílipkovitých plžů (KHL), což je nosič závislý na T buňkách, který není vhodný používat v medicíně v případě lidí, protože působí jako zdroj dráždění, které vede k těžkému zánětu.

Nosičové proteiny stimulující T buňky, které jsou schopny zesílit imunogenicitu haptenů a nevykazují nežádoucí vedlejší účinky u lidí, jsou to často imunogenní přirozené proteiny. Například toxoid tetanu (TT) se často používá v případě, kdy je nutný nosič vhodný pro aplikaci na lidech. Použití toxoidu tetanu jako nosiče se omezilo, protože dochází k problémům s nutným omezením

- 1 CZ 302092 B6 dávky a nebezpečím citlivosti na samotný toxoid. Navíc u jednotlivců, kteří jsou už imunizováni proti tetanu, se může 'objevit potlačení odezvy na hapten, který je specifický pro epitop.

Jako nosič v případě heterologních epitopů se navrhuje povrchový protein hepatitidy B.

V publikaci Delpeyroux etak, Science, 233: 472 až 475 (1986) se popisuje použití HBV povrchového proteinu (S protein), jako nosiče vhodného pro polypeptidový heptan polioviru. Zkonstruoval se nástroj pro expresi proteinu z rekombinantní deoxyribonukleové kyseliny (DNA), která produkuje fúzní protein označený HBsPolioAg, který je schopný tvořit částice podobající se autentickým částicím HBsAg o velikosti 22 nanometrů. HBsPolioAg obsahují protein HBV, který zahrnuje sekvenci 11 aminokyselinových zbytků, začleněnou do odpovídajících aminokyselin 93 až 103 kapsidového proteinu VP1 polioviru typu 1 (kmen Mahoney).

Nukleokapsidové proteiny hepadnaviru se používají jako haptenové nosiče. Heterologní imunogennt peptidové sekvence začleněné dovnitř jádra hepatitidy, které se exprimují jako fúzní částice, vyvolali za nepřítomnosti adjuvans u imunizovaných zvířat velmi silné imunní odezvy.

V publikaci Β. E. Clark etak, accines 91: 313 až 318 (1991), F. Schode etak, J. Virok 66 (1): 106 až 114 (1992) a v dokumentech US patent US 4 818 527, US 4 882 145 a US 5 143 726 se popisuje použití účinku nosiče s nukleokapsidovým proteinem viru hepatitidy B, aby se zesílela imunogen ici ta operativně spojeného póly peptidového hapten u. Tyto patenty popisují spojení póly peptidového haptenu s nukleokapsidovým proteinem viru hepatitidy B prostřednictvím postranního řetězce aminokyselinových zbytků, ke kterému dochází v sekvenci nukleokapsidového proteinu hepatitidy B.

Nukleokapsidové proteiny hepadnaviru jsou docela dobře prostudované. SEQ ID NO: 1 a 2 jsou sekvence DNA a aminokyselinové sekvence jaderného proteinu lidské hepatitidy B (Hbc), subtyp ayw, jak se popisuje v dokumentu US patent US 4 818 527, US 4 882 145 a US 5 143 726, Jiné sekvence nukleokapsidového proteinu hepadnaviru jsou také dobře známy v oboru. Uvádějí se například v SEQ ID NO: 3 až 13.

Existují důvody k selekci nukleokapsidových proteinů hepadnaviru vhodných pro použití jako nosiče. Jsou to hemocyanin prílipkovitých mlžů (KLH), BCG. Toxoid tetanu a toxoid difterie netvoří částice, zatímco nukleokapsidové proteiny mají tendenci tvořit částice. Částice HBc mají tendence vykazovat vyšší imunogenicítu ve srovnání s částicemi obsahujícími povrchový antigen hepatitidy B (HBsAg) (popisuje se v publikaci D, R. Milich etal., Science, 234: 1 398 až 1 401 (1986). HBc je imunogen, který je jak na T buňkách nezávislý nebo závislý. HBc je jeden z nejvíce imunogenních známých proteinů. Skoro u všech lidí infikovaných hepatitidou B se vyvinula silná imunitní odezva na jádro (popisuje se v publikaci J. H. Hoofnagle, Semin. Liver Dis., 1(1): 7 až 14 (1981)). HBc může poskytovat univerzální odpověď bez ohledu na genetické pozadí. HBc přímo aktivuje T buňky. HBc vyvolává silnou odezvu T_h buněk. HBc se účinně zpracovává a prezentují ho antigen prezentující buňky. Vzhledem k inherentně vysoké imunogen i cite HBc, nejsou nutná komplexní adjuvans. Například běžné a finančně nenáročné alum je dostatečné.

Čeleď hepadnaviridae je čeleď zvířecích virů s obaly, jejichž jádro tvoří DNA a tyto viry způsobují u lidí hepatitidu B. Čeleď hepadnaviridae nejsou odpovědní za lidskou hepatitidu A (enterovirus s jed no řetězcovou RNA), lidskou hepatitidu C (čeleď Flaviridae s jednořetězcovou RNA) nebo lidskou hepatitidu D (satelitní virus s uzavřenou cirkulámí RNA s negativním smyslem, „virus delta“, který je nutný pro replikaci viru hepatitidy B). Čeleď hepadnaviridae zahrnuje vedle viru lidské a opičí hepatitidy viry hepatitidy různých druhů, například virus kachen, zemních veverek, volavek.

Monomery jaderného proteinu hepatitidy B samy tvoří stabilní agregáty, které jsou známy jako částice jaderného proteinu hepatitidy B (částice HBc). Například lidské částice HBc jsou velké 27 nanometrů. V publikaci Conway et al., Nátuře, 386: 91 až 94 (1997) se popisuje struktura lidských částic HBc při rozlišení 9 Amstrongů, jak se stanovilo z kryo-elektronových mikrografů.

-2 CZ 302092 Β6

V publikaci Bottcher etak, Nátuře, 386: 88 až 91 (1997) se popisuje polypeptid složený do lidských monomerů HBc a poskytuje přibližné číselné schéma aminokyselinových zbytků, jak se tvoří alfa- helikální oblasti a jejich oblasti spojené do smyčky. V publikaci Bottcher et al., Nátuře,

386: 88 až 91 (1997) se předpokládá smyčka vytvořená z přibližně 78 až 82 zbytků jaderného proteinu hepatitidy B.

Za použití syntetických peptidů a monoklonálních protilátek se mapovala imunodominantní oblast smyčky HBc, což jsou aminokyselinové zbytky v poloze 75 až 83 (popisuje se v publikaci G. Coluccí et al., J. Immunok, 141: 4 376 až 4 380 (1988)). V publikaci Salfeld etak, J. Virok 63: 798 (1989) se popisují další dva imunodominantní lineární epitopy s aminokyselinami 75 až 85 a 130 až 140.

Mutanti s inzertem v jaderném proteinu hepatitidy B jsou stále schopni tvořit jaderné Částice i když se do imunodominantní oblasti smyčky HBc nakloňují cizorodé epitopy (popisuje se v publikaci P. Pumpens et ak, Intervirology, 38: 63 až 74 (1995)). Fůzní proteiny HBc tvoří částice v prokaryontních a eukaryontních expresívních systémech.

Schopnost použití proteinu jako nosiče pro navázaný hapten závisí na několika faktorech, které se studují s ohledem na HBc. Chemicky reaktivní aminokyselinové postranní řetězce, jako jsou lyzin (K), kyselina aspartová (D), kyselina glutamová (E) a redukované cysteínové zbytky (C) poskytují funkční skupiny, které se mohou použít pri úpravě polypeptidů. Sekvence jaderného proteinu hepatitidy B vykazuje v přirozené sekvenci několik chemicky reaktivních aminokyselinových postranních řetězců. Jádro má tři primární aminoskupiny, jednu na N-konci a dva lyzinové zbytky (K5 a K96) spolu se čtyřmi cysteinovými zbytky (C48, C61, Cl07 a Cl83). Existuje několik skupin karboxylových kyselin, D (2, 4, 22, 29, 32, 78, 83) a E (8, 14, 40, 43, 46, 64, 77, 113, 117, 145, 179) a C-konec.

Přirozená částice neupravovaného proteinu hepatitidy B nevykazuje výraznou chemickou reaktivitu aminokyselinových postranních řetězců v přirozené sekvenci. Chemická reaktivita aminokyselinového postranního řetězce v proteinu závisí na podstatě aminokyselinového postranního řetězce zabaleného proteinu a na jeho okolí.

Zjistilo se, že problém slabé reaktivity aminokyselinových postranních řetězců v přirozeném nukleokapsidovém proteinu se může obejít začleněním chemicky reaktivního aminokyselinového postranního řetězce do proteinové sekvence HBc. Strategicky upravená částice jaderného proteinu hepadnaviru podle vynálezu vykazuje podstatně zvýšenou reaktivitu směřující k derivitizaci částic HBc s chemicky spojenými hapteny a poskytuje zvýšenou imunogenicitu vůči tomuto spojenému haptenu.

Tyto upravené proteiny HBc a jejich závěsně navázané haptenové konjugační deriváty se diskutují dále v textu.

Podstata vynálezu

Vynález se zabývá konjugátem upraveného jaderného proteinu hepatitidy B obsahujícího upravený jaderný protein hepatitidy B převisle vázaný na hapten, kde upravený jaderný protein hepatitidy B obsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci jaderného proteinu hepatitidy B SEQ ID NO: 2, která zahrnuje aminokyselinové zbytky číslované 10 až 140, a dále obsahuje inzert aminokyselinové sekvence v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným přibližně 50 až 100, přičemž uvedený inzert (i) obsahuje 1 až 40 aminokyselinových zbytků a (ii) obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek na kterém je převisle vázaný hapten. V dalším provedení se vynález zabývá konjugátem částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, který obsahuje shluklou podjednotku upraveného jaderného pro-3CZ 302092 Β6 teinu hepatitidy B, kde velké množství podjednotek jsou již zmíněné konjugáty upraveného jaderného proteinu hepatitidy.

Dále se vynález zabývá inokulem, které obsahuje imunogenní množství konjugátu upraveného jaderného proteinu hepatitidy B nebo konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B rozpuštěný nebo dispergovaný ve farmaceuticky přijatelném ředidle.

Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B nebo konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B lze použít pro výrobu léčiva pro podání zvířeti pro indukci jeho protilátek. Dále bude vynález popsán podrobněji v širších souvislostech.

Vynález popisuje strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B (HBc), který je spojen s vyčnívajícím haptenem pomocí chemicky reaktivního aminokyselinového zbytku začleněného do sekvence HBc. Uvažovaná strategická úprava HBc je mutace vznikající začleněním do HBc proteinu. Uvažovaný inzert tvoří 1 až přibližně 40 aminokyselinových zbytků, upřednostňuje se 1 až 10 aminokyselinových zbytků a zahrnuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek.

Inzert poskytuje oblast odpovídající aminokyselinovým zbytkům v poloze 50 až 100 sekvence jaderného proteinu hepatitidy B, který se uvádí v sekvenci SEQ ID NO: 2, Preferovaná oblast inzerce odpovídá imunodominantní oblasti smyčky jaderného proteinu hepatitidy B, která obsahuje aminokyselinové zbytky přibližně v poloze 70 až 90. Více se upřednostňuje, když obsahuje aminokyselinové zbytky v poloze přibližně 78 až 82 oblasti špičky smyčky a nejvíce se preferuje aminokyselinové zbytky v poloze 78 až 80.

Takto zavedený chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek se charakterizuje tím, že vykazuje chemicky reaktivní postranní řetězec, který poskytuje chemickou skupinu pro závěsné navázání strategicky upraveného HBc na hapten. V typickém případě chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek je lyzinový, cysteinový nebo histidinový zbytek nebo zbytek obsahující karboxyl, jako je kyselina aspartová nebo glutamová. Upřednostňuje se lyzin nebo zbytek obsahující karboxy 1 a nejvíce se preferuje lyzin.

Hapten navázaný na chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek je libovolná látka generující imunitní odezvu a je v typickém případě determinantou B buňky. Upřednostňuje se, aby hapten byl polypeptidový hapten, sacharidový hapten nebo hapten, který není peptidový ani sacharidový (chemický). V jednom provedení vynálezu se popisuje hapten, který je příbuzný patogenu, jako je determinanta B buňky patogenu.

V jiném provedení konjugátu strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, tento protein také obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků stimulující T buňky operativně spojenou s C-koncem jaderné aminokyselinové sekvence hepatitidy B. Upřednostňuje se, aby hapten a T buňky stimulující sekvence aminokyselinových zbytků byly příbuzné zpatogenem. Více se upřednostňuje, aby hapten a T buňky stimulující sekvence aminokyselinových zbytků byly příbuzné se stejným patogenem.

Ve shora popsaném provedení vynálezu odezva na epitop B buňky je zesílena tím, že se také poskytne determinanta T pomocných buněk (T_h). V tomto preferovaném provedení vynálezu taková determinanta buňky T_t, pochází ze stejného patogenu jako determinantový hapten B buňky, který je převisle spojen se strategicky upraveným jaderným proteinem hepatitidy B za účelem poskytnout vedle T buněčné paměti jaderného proteinu hepatitidy B paměť T buňky specifickou pro patogen.

Konjugát strategicky upraveného jaderného proteinu obsahuje hapten, který je zavěšením spojen se strategicky upraveným jaderným proteinem hepatitidy B. Předpokládá se, že dříve popsaný strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B obsahuje tři domény spojené s peptidem. Jsou to domény I, 11 a 111 (číslují se od N-konce). Doména 1 obsahuje sekvenci, která odpovídá zbyt-4 CZ 302092 B6 kům od přibližné polohy 10 až 50 aminokyselinové sekvence jaderného proteinu hepatitidy B sekvence SEQ ID NO: 2 a přednostně odpovídá zbytkům číslovaným od 1 do 50 této sekvence. Doména 11 se váže na zbytek C-konce domény I. Doména II odpovídá zbytkům aminokyselinové sekvence jaderného proteinu hepatitidy B SEQ ID NO: 2 číslovaným od 50 do 100. Doména III obsahuje sekvenci, která se váže na C-terminální zbytek domény II. Doména III odpovídá zbytkům číslovaným od 100 do přibližně 140 aminokyselinové sekvence jaderného proteinu hepatitidy B a přednostně odpovídá zbytkům číslovaným od 100 do přibližně 149 uvedené sekvence,

V uvedeném provedení vynálezu strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B obsahuje navíc doménu IV, kteráje exogenní vůči HBc, který se váže peptidem na zbytek C-konce domény III, čímž vzniká fúzní protein. Doména IV je epitop buňky T.

Částice strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle vynálezu se připravuje uspořádáním jaderného proteinu hepatitidy B, kde velké množství podjednotek tvoří strategicky upravené podjednotky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B. Také se zvažuje částice obsahující směs podjednotek strategicky upravených jaderných proteinů hepatitidy B a podjednotky jiných jaderných proteinů hepatitidy B.

Předpokládaný konjugát částic upraveného jaderného proteinu hepatitidy B obsahuje uspořádané podjednotky jaderného proteinu hepatitidy B, kde velké množství podjednotek jsou podjednotky strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy Β. V tomto provedení je hapten závěsně spojen s podjednotkou jaderného proteinu hepatitidy B. Upřednostňuje se, aby hapten byl příbuzný patogenu. Stejně jako se uvádí shora v textu, sekvence aminokyselinových zbytků stimulující T buňky se může vázat prostřednictvím peptidu na zbytek C-konce sekvence odpovídající jadernému proteinu hepatitidy B. Upřednostňuje se, aby determinanta T buňky příbuzná patogenu byla příbuzná se stejným patogenem jako hapten.

Konjugát částic strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle vynálezu obsahuje převisle navázaný hapten. V uvažovaném provedení částicového konjugátu podle vynálezu se částice připravují ze směsi podjednotek strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, která obsahuje převisle navázané hapteny nebo jiné podjednotky jaderného proteinu hepatitidy B.

V jednom provedení podle vynálezu se na hapten převisle naváže přibližně 0,1 až 0,5 podjednotek strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B. Také se zvažuje částicový konjugát, který se připravuje ze směsi podjednotek strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B a podjednotek jiných jaderných proteinů hepatitidy B.

Dříve popsaný strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B podle vynálezu zahrnuje peptidový inzert obsahující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Takový inzert může být, ale v typickém případě sám není oddělenou antigenní determinantou B buňky, ačkoli část imunogenosti B buňky inzertu se může vykazovat pouze proto, že došlo k umístění inzertu do HBc proteinu nebo částice. Takový inzert může být a v některých provedeních podle vynálezu je epitop T buňky. Umístění inzertu do oblasti smyčky HBc redukuje HBc imunogenost a antigenost výsledné molekuly.

Inokulum podle vynálezu obsahuje imunogenní množství konjugátu strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle vynálezu. V případě, že převisle spojený hapten je hapten příbuzný s patogenem, inokulum se může použít jako vakcína pro ochranu savců ošetřených inokulem z uvedeného patogenu. Pak v jednom provedení vynálezu konjugát strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B se použije jako vakcína, aby vznikla ochrana proti patogenu, ze kterého se získal hapten. Více se preferuje, aby inokulum obsahovalo jako imunogen konjugát částic strategicky upraveného jaderného proteinu. Vynález poskytuje řadu výhod.

Jednou z výhod uvažovaného upraveného proteinu HBc je, že se může derivatizovat v agregované formě částic HBc.

-5CZ 302092 B6

Výhoda vynálezu je, že upravený protein HBc vykazuje přijatelné zesílení chemické reaktivity směřující k derivatizaci například ve srovnání s použitím N-terminálního primárního aminu.

Jinou výhodou uvažovaného upraveného proteinu HBc je, že chemie derivatizace takových postranních řetězců je velmi dobře studována, je zřejmá a relativně předpověditelná.

Další výhoda uvažovaného upraveného proteinu HBc je, že zvyšuje imunologickou odezvu vůči konjugovanému haptenu, se kterým je derivatizován.

io Existuje ještě další výhoda uvažovaného upraveného proteinu HBc. Je nepravděpodobné, že produkuje nežádoucí imunologické vedlejší účinky u lidí.

A. Definice

Termín „protilátka“ znamená molekulu, která je členem rodiny gly kosy lovaných proteinů, které se nazývají imunoglobuliny a mohou se specificky kombinovat s antigenem.

Termín „antigen“ se používá k označení entity, kterou váže protilátka a také k označení entity, která vyvolává produkci protilátky. Použití limituje pojetí antigenu, na který se protilátkou entita

2o váže, zatímco termín „imunogen“ se používá pro entitu, která vyvolává produkci protilátek. V případě, že entita je imunogenní a anti gen ní nazývá se buď antigen nebo imunogen podle použití.

Termín „hapten“ popisuje molekuly, které jsou schopné stimulovat imunitní odezvu (například produkci protilátek), když jsou chemicky spojené s proteinovým nosičem. Tento termín se často používá v případě malých neantigenních molekul v uvedeném oboru, ale také může znamenat molekulu, která je převisle spojena s nosičovým proteinem, do konce jestliže je tato molekula anti gen ní nebo není malá.

5o Termín „antigenní determinanta“ znamená aktuální strukturální část antigenu, která je imunogenně vázaná místem kombinujícím protilátky nebo receptorem T buňky. Tento termín se také může zaměnit s termínem „epitop“.

Termín „konjugát“ znamená molekulu tvořenou z haptenu převisle spojeným s postranním řetěz35 cem aminokyselinového zbytku a nosiče.

Termín „konzervativní substituce“ znamená, že jeden aminokyselinový zbytek se nahradí jiným biologicky podobným zbytkem. Příklady konzervativních substitucí zahrnují substituci jednoho hydrofobního zbytku, jako je izoleucin, valin, leucin nebo methionin jiným, nebo substituci jedlo noho polárního zbytku jiným, například se mohou zavést mezi arginin a lyzin, mezi kyselinu glutamovou a aspartovou nebo mezi glutamin a aspargin a podobně. Termín „konzervativní substituce“ také zahrnuje použití substituované aminokyseliny na místo nesubstituované mateřské aminokyseliny, a tak dochází ke vzniku protilátek. Takový polypeptid je také imunoreaktivní s odpovídajícím aminokyselinu.

Termín „odpovídá“ v různých gramatických formách se vztahuje póly peptidem, který má nesubstituovanou k peptidovým sekvencím a znamená peptidovou sekvenci popsanou plus nebo mínus až třemi aminokyselinovými zbytky buď na N-konci nebo na C-konci nebo na obou koncích a obsahující pouze konzervativní substituce v určitých aminokyselinových zbytcích podél poly50 peptidové sekvence.

Termín „epítop“ znamená, že část molekuly, která se specificky váže na receptorem antigenu T buňky nebo na místo kombinující protilátky. Termín „epitop“ je možné zaměnit za termín „determinanta“.

-6CZ 302092 B6

Termín „fúzní protein“ označuje alespoň dvě sekvence s aminokyselinovými zbytky, které nejsou v normálním případě spojeny dohromady, operativně spojené dohromady konci (začátek ke konci) peptidovou vazbou mezi jejich terminálními aminokyselinovými zbytky.

Termín „hepatitida B“ znamená v nej širším kontextu libovolného člena čeledi hepadnaviridae, což je čeleď obalených zvířecích virů, které obsahují DNA, které mohou způsobit u lidí hepatitidu B.

Termín HBc znamená proteiny stimulující T buňku vykazující sekvenci aminokyselinových zbytků, která odpovídá sekvenci aminokyselinových zbytků kódovanou genem nukleokapsidového proteinu viru hepatitidy B (HBV). Příkladem velmi dobře známého přirozeně se vyskytujícího proteinu kódovaného nukleokapsidovým genem lidského HBV je ,jaderný“ protein subtyp ayw, který má biologické sekvence SEQ ID NO: 1 a 2 (popisuje se v publikaci Galibet, et al.. Nátuře 281: 646 (1979). Protein HBeAg, což je prekurzor HBc, zahrnuje sekvenci jaderného proteinu hepatitidy B a „pre-jaderné“ sekvence jeho N-konce, jak se uvádí v SEQ ID NO: 8 a 9 v případě pozemních veverek, nukleokapsidového genu hepatitidy B. Sekvence jaderného proteinu začíná aminokyselinou v poloze 31, tak odpovídá aminokyselinovému zbytku číslo 1 sekvence SEQ ID NO: 2. Sekvence jiných jaderných proteinů hepatitidy B jsou známy v oboru. Jaderný protein subtyp adr viru lidské hepatitidy Bse uvádí v sekvencích SEQ ID NO: 3 a 4 a subtyp adw se uvádí v SEQ ID NO: 5 a 6 (popisuje se v publikaci Ono etal., Nucl, Acids Res. 11:1 747 (1983). Sekvence se také uvádějí pro jaderný protein hepatitidy B sviště amerického v sekvenci SEQ ID NO: 7 (popisuje se v publikaci Schode! etal., Adv. Viral Oncol, 8: 73-102 (1989)), pozemní veverky v sekvenci SEQ ID NO: 8 a 9, volavky v sekvenci SEQ ID NO: 10 a 11 a kachny v sekvenci SEQ ID NO: 12 a 13. Za účelem jednoduchosti se systém číslování aminokyselin zobrazený v SEQ ID NO: 1 a 2 s ohledem na jaderný protein lidské hepatitidy B subtyp ayw používá jako standard. Jiné sekvence HBc se mohou uspořádat s touto sekvencí za použití standardních programů a protokolů pro uspořádání sekvencí, za účelem stanovení aminokyselinových zbytků, které odpovídají sekvenci jaderného proteinu hepatitidy B SEQ ID NO: 2 (popisuje se v publikaci Schodel et al., Adv. Viral Oncol. 8: 73-102 (1989).

Jestliže existuje odkaz na část polypeptidu libovolného shora popsaného přirozeně se vyskytujících proteinů kódovaných nukleokapsidovým genem HBV, pak tento odkaz je explicitní například uvedením, že zmiňuje část určitého proteinu stimulující T buňku nebo explicitním označením určité části sekvence stejně jako označením zahrnutých poloh aminokyselinových zbytků.

Termín „imunoreaktivní“ v různých formách znamená specifické navázání mezi antigenem jako ligandem a molekulou, která obsahuje místo slučující protilátky, jako je část Fab celých protilátek.

Termín „operativně spojený“ znamená, že vazba neinterferuje se schopností navázaných skupin, aby fungovali jak se popisuje. Fungují například jako determinanty T nebo B buněk.

Termín „převisle spojený“ znamená jednoduchou vazbu buď přímou nebo prostřednictvím mostu z proteinu HBc na jinou molekulu na jiném než na N- nebo C-konci. Termín zde popisuje vazbu mezi haptenem a chemicky reaktivním aminokyselinovým postranním řetězcem strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B.

„Makromolekulámí uspořádání“ znamená nekovalentně vázaný agregát proteinových podjednotek. V typickém případě tohoto vynálezu proteinovou podjednotkou je strategicky upravený monomer jaderného proteinu hepatitidy B. Jak se popisuje detailněji dále v textu, tyto monomery jaderného proteinu se obvykle samy uspořádaly do prostorových Jaderných částic“, které mají buď 90 nebo 120 dimerů jaderných proteinů (celkem 180 nebo 240 podjednotek jaderného proteinu). Prostorová jaderná částice je příklad makromolekulámího uspořádání.

-7 CZ 302092 B6

Termín „příbuzný patogenu“ označuje imunogen B a T buňky, který je schopný vyvolat produkci protilátek, které imunologicky reagují s patogenem v jeho přirozené formě. Příklady imunogenu

B buňky a T buňky příbuzných patogenu se uvádějí dále v textu.

Termíny „polypeptid“ a „peptid“, které jsou v tomto případě zaměnitelné, specifikují a označují lineární série aminokyselinových zbytků vzájemně spojených peptidovými vazbami mezi alfaaminoskupinou a karboxylovou skupinou sousedících aminokyselin. Polypeptidy se mohou lišit délkou buď ve své neutrální formě (bez náboje) nebo ve formách solí a buď bez úprav, jako je glykosylace, oxidace postranních řetězců nebo fosfory láce, nebo s těmi to úpravami. V oboru je io dobře známo, že sekvence aminokyselinových zbytků obsahují kyselé a bazické skupiny a že určité stádium ionizace vykazované peptidem závisí na pH okolního média, kdy protein je v roztoku nebo ze kterého se protein získal v případě, že protein je v pevné formě. V definici jsou také zahrnuty proteiny upravené dalšími substituenty, které jsou připojeny na postranní řetězce aminokyselin, jako jsou glykosylové jednotky, lipidy nebo anorganické ionty, jako jsou fosfáty, stejně jako definice zahrnuje úpravy vztahující se k chemickým konverzím řetězců, jako je oxidace sulfhydrylových skupin. Tak termín „polypeptid“ nebo ekvivalentní termíny zahrnuje vhodnou sekvenci aminokyselinových zbytků, kterčjsou vystaveny uvedeným probíhajícím úpravám, které neporušují jejich funkčnost. Peptid nebo polypeptid užívaný jako hapten v typickém případě obsahuje méně než 70 aminokyselinových zbytků a ve více typickém případě obsahuje lineár20 ní řetězec s přibližně 5 až 40 aminokyselinovými zbytky a více se preferuje přibližně 10 až 25 zbytků. Je nutné poznamenat, že uvažovaný polypeptidový hapten může být delší než 70 zbytků, ale takový polypeptid je kratší než přirozeně se vyskytující protein, který sdílí jeho sekvenci.

Termín „protein“ označuje polypeptid, který vykazuje přibližně 70 nebo více aminokyselinových zbytků aje přirozeně se vyskytující entita.

Termín „vylučuje“ nebo „produkuje“ jsou často zaměnitelné v oboru a týkají se buněk, ze kterých se získávají molekuly protilátek. Buňky, které produkují protilátky nemusí však vylučovat tyto molekuly do svého okolí. Molekuly protilátek se vylučují do krevního řečiště a z něho se také získávají (humorální protilátky). Ve vztahu k protilátkám se v obecném případě používá termín „produkovat“.

Všechny zde identifikované aminokyselinové zbytky jsou v přirozené konfiguraci nebo v L-konfiguraci. Aby se zachovalo standardní názvosloví polypeptidů (J. Biol. Chem., 243, 3 557-59 (1969)), zkratky aminokyselinových zbytků jsou uvedeny v následující tabulce č. 1.

Tabulka č. 1; Odpovídající symboly

Jednopísmenná	Třípísmenná	aminokyselina
v	Tyr	L-tyrozin
G	Gly	Glycin
F	Phe	L-fenylalanin
M	Met	L-methionin
A	Ala	L-alanin
S	Ser	L-serin
I	Ile	L-izoleucin

-8CZ 302092 B6

L	Leu	L-leucin
T	Thr	L-threonin
V	Val	L-valin
P	Pro	L-prolin
K	Lys	L-lyzin
H	His	L-histidin
Q	Gin	L-glutamin
E	Glu	L-glutamová kyselina
Z	Glx	L-glutamová kyselina nebo L-glutamin
W	Trp	L-tryptofan
R	Arg	L-arginin
D	Asp	L-aspartová kyselina
A	Asn	L-asparagin
B	Asx	L-aspartová kyselina nebo L-asparagin
C	Cys	L-cystein

B. Strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B

Vynález upravený jaderný protein popisuje strategicky hepadnaviridae („HBc“), který má začleněný chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek pro převislou vazbu s hapteny, jako jsou polypeptidy a sacharidy. Strategická úprava podle vynálezu je začlenění přibližně I až 40 aminokyselinových zbytků zahrnující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek do sekvence jaderného proteinu hepatitidy B v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům v poloze 50 io až 100 sekvence HBc SEQ ID NO: 2. Takový zavedený chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek vykazuje postranní řetězec, který poskytuje funkční skupinu pro převislou vazbu haptenu se strategicky upraveným nosičem.

Hepadnaviridae mají nukleokapsid nebo jádro obklopené lipidovým obalem, který obsahuje povrchové proteiny. Nukleokapsid je v obecném případě prostorový agregát dimerů jaderných proteinů (jaderný antigen, HbcAG). In vitro se sám jaderný protein uspořádává do částic, prostorových konstrukcí dvacetistěnu vystavěného z 90 nebo 120 dimerů jaderného proteinu hepatitidy B, což je 180 až 240 proteinových podjednotek. Částice jsou přibližně 280 nebo 310 angstromů velké (popisuje se v publikaci B. Bottcher et al., Nátuře, 386: 88-91 (1997), J. F. Conway et al., Nátuře 386: 91-94 (1997)).

Uvažovaný strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B také tvoří makromolekulám! uspořádání. Taková částice může být přítomna ve formě 180 nebo 240 proteinových podjednotek, ačkoli nemusí obsahovat 90 nebo 120 dimerů.

Hybridní jaderné proteiny s exogenními aminokyselinovými zbytky začleněné do oblasti blízko aminokyselinového zbytku 80 jsou schopny se uspořádat do pravidelných konstrukcí do konce i když obsahuje inzerty o velikosti 46 aminokyselin (popisuje se v publikaci A.I. Brown etal., Vaccine, 9: 595 až 601, (1991), F. Schodel et al, J. Virol., 66: 106 až 114 (1992)).

-9CZ 302092 B6

Sekvence jaderného proteinu hepadnaviridae užívaná jako standardní sekvence jaderného proteinu lidské hepatitidy B, subtyp ayw, je zobrazena v SEQ ID NO: 1 a 2. Jsou známy i jiné subtypy viru lidské hepatitidy B. SEQ ID NO: 3 a 4 jsou lidské HBc, subtyp adra SEQ ID NO: 5 a 6 jsou HBc subtyp adw. Také se publikují sekvence různých jaderných proteinů zvířecí hepatitidy.

Biologická sekvence jaderného proteinu hepatitidy kachny se popisuje v sekvenci SEQ ID NO: 12 a 13. Část nukleokapsidového genu hepatitidy pozemní veverky je uvedena v sekvenci SEQ ID NO: 8 a 9. Jádro hepatitidy sviště amerického je uvedeno v sekvenci SEQ ID NO: 7 a jádro hepatitidy volavky je uvedeno v SEQ IDNO: 10 a 11. Příklady jaderných proteinů zvířecí hepatitidy B jsou porovnávány s jaderným proteinem lidské hepatitidy B v publikaci F. Schodel io et al., Adv. Viral Oncology 8: 73 až 102 (1989). i. Strategická úprava jaderného proteinu

Vynález popisuje konjugát strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, který obsa15 huje hapten, který je převisle spojen se strategicky upraveným jaderným proteinem hepatitidy B (HBc). Samotný strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B obsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci jaderného proteinu hepatitidy B SEQ ID NO: 2 zahrnující aminokyselinové zbytky číslované přibližně od 10 do 140. Sekvence aminokyselinových zbytků HBc navíc obsahuje exogenní inzert aminokyselinových zbytků v oblasti odpovída2o jící aminokyselinovým zbytkům číslovaným od 50 přibližně do 100 od N-konce HBc, kde exogenní inzert (i) tvoří přibližně 1 až 40 aminokyselinových zbytků a (ii) obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Hapten je převisle spojen se strategicky upraveným proteinem HBc způsobem chemicky reaktivního aminokyselinového zbytku přítomného jako inzert.

Preferuje se, že zbytky I až 10 SEQ ID NO: 2 jsou přítomny ve strategicky upravené molekule proteinu HBc. Dále se preferuje, když v poloze 1 až 10 není přítomen libovolný zbytek neboje z této polohy de letován, což znamená, že tyto zbytky jsou v sekvenci deletovány a že zbývající zbytky jsou v sekvenci přítomny. Tak jestliže se uvažuje delece pěti zbytků, deletované zbytky se číslují 1 až 5, zbývající zbytky 6 až do požadovaného přítomného C-konce HBc plus inzert.

Podobně se preferuje, když zbytky číslované od polohy 140 přes 149 SEQ ID NO: 2 jsou přítomny ve strategicky upravené molekule proteinu HBc. Jak je zde uvedeno oblast HBc číslováno od 150 do C-konce obsahuje velké množství argininových zbytků. Tyto zbytky váží po expresi nukleové kyseliny při čištění částic HBc a sekvence obsahující tyto zbytky se přednostně vyne35 chá ve strategicky upravené molekule proteinu HBc. Stejně jako v případě zbytků v polohách 1 až 10 se preferuje, aby byly přítomny zbytky mezi polohou 140 a 149. Když zbytek C—konce odpovídá zbytku 3 poloze 146, pak jsou také přítomny zbytky v polohách 141 až 145 a zbytky v polohách 147 až 149 chybí. Nejvíce se upřednostňuje, když uvažovaná sekvence HBc je zobrazena v SEQ ID NO: 2 z polohy 1 do polohy 149 plus sekvence inzertu.

Inzert se může umístit do sekvence HBc do oblasti poloh číslovaných od přibližně 50 do 100, jak se uvádí dříve v textu. Upřednostňuje se, aby inzert byl přítomen v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným od 70 do přibližně 90. Více se upřednostňuje, když je inzert přítomen v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným od 78 do 82. Nejvíce se upřednostňuje, aby se inzert se nacházel v oblasti odpovídající zbytkům číslovaným 78 až 80.

Strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B podle vynálezu obsahuje začleněných 1 až přibližně 40 aminokyselinových zbytků. Upřednostňuje se, aby inzert obsahoval 1 až 10 aminokyselinových zbytků. Inzert obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Uvažuje se také začlenění více jak jednoho chemicky reaktivního chemického zbytku.

Také se popisuje, že genové konstrukce kódující strategicky upravený protein hepatitidy B obsahují blízko požadované oblasti inzertu místa, která rozeznávají restrikční endonukleázy. Nukleotidy míst, která rozeznávají restrikční endonukleázy, se budou překládat při expresi do amino55 kyselin a účinek závisí na volbě endonukleázy. Běžně dostupných je několik restrikčních endo-10CZ 302092 B6 nukleáz (například od firmy promega Corp., Madison, Wisconsin) a sekvence místa, které rozeznávají, a místa štěpení je dobře známo v oboru. Příklad 1 popisuje takovou konstrukci pro strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B.

V jednom preferovaném provedení vynálezu je inzert tvořen jediným zbytkem, který se přidal jako chemicky reaktivní zbytek. V jiných preferovaných provedeních vynálezu použití restrikčních enzymů ajejich sekvencí, které rozeznávají, způsobují, že se začlení přibližně 3 až 5 zbytků, které zahrnují požadovaný chemicky reaktivní zbytek.

io Inzert obsahující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek se začlenil do přirozeného jaderného proteinu hepatitidy B v poloze odpovídající aminokyselinovému zbytku od přibližně 50 do 100. Preferovaná oblast inzerce do jaderného proteinu hepatitidy B je v imunodominantní oblasti smyčky (aminokyselinový zbytek v poloze 70 až 90). Více se upřednostňuje začlenění v oblasti smyčky, která přirozenému jadernému proteinu hepatitidy B odpovídá v poloze odpovídající aminokyselině 78 až 82, Nejvíce se preferuje, aby se inzert začlenil do polohy zbytku číslo 78 až 80 sekvence SEQ ID NO: 2.

Když se řekne, že inzert Je v poloze“ znamená to, že N-konec inzertu je peptid vázaný na Ckonec odpovídajícího aminokyselinového zbytku sekvence jaderného proteinu hepatitidy B, který je určen uvedeným číslem aminokyselinového zbytku. Jinými slovy inzert bezprostředně následuje po zbytku, který se nachází v uvedené poloze.

Inzerce se může provést obecně používanou metodou, která je dobře známa v oboru. Genetická manipulace metodou založenou na PCR se popisuje v příkladu 1 a 5. Navíc se může použít místně řízená mutageneze zprostředkovaná oligonukleotidem, která se popisuje v publikaci Sambrook et al. Molecular Cloning: a laboratory manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 15.51-ff. (1989). Tato metoda umožňuje přidání jednoho kodonu požadované sekvence DNA hybridizující stemplátem, přičemž kodon obsahuje jediný zbytek, pak následuje vyplnění zbývající sekvence nukleové kyseliny. V publikaci Dawson et al., Science 266: 776 až 779 (1994) se popisuje způsob navázání polypeptidových řetězců na jejich peptidovou kostru tak, že dojde k vytvoření fúze peptidových fragmentů.

Chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek se může nacházet v libovolné poloze inzertu. Upřednostňuje se, aby chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek byl v poloze, která odpovídá aminokyselinovému zbytku s čísly od 70 do 90 přirozeného jádra (divokého typu) a nejvíce se upřednostňuje zbytek v poloze 78 až 82. Když se například začlení inzert o délce 10 aminokyselin do polohy odpovídající zbytku 73 přirozeného jaderného proteinu, pak chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek se nachází přednostně v poloze inzertu 5 až 9. Když se inzert obsahující 30 aminokyselin začlenil do polohy odpovídající zbytku 58 přirozeného jaderného proteinu, pak chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek je přednostně v poloze inzertu 22 až 24. Zavedený chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek má chemicky reaktivní vedlejší řetězec, který poskytuje funkční skupinu vhodnou pro derivatizaci strategicky upraveného HBc (to znamená konjugaci haptenu s modifikovaným HBc). Použitelné funkční skupiny postranního řetězce zahrnují epsilon-aminoskupiny, beta- nebo gamma- karboxylové skupiny, thiolové sku45 piny (-SH) a aromatické kruhy (například tyrozin a histidin). Chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek je v typickém případě lyzinový, cysteinový nebo histidinový zbytek nebo zbytek obsahující karboxyl, jako je kyselina aspartová nebo glutamová. Zvláště preferovaným chemicky reaktivním aminokyselinovým zbytkem je lyzin.

Je nutné poznamenat, že sekvence aminokyselinových zbytků jaderného proteinu hepatitidy B kódovaná sekvencí SEQ ID NO: 1 a uvedená v sekvenci SEQ ID NO: 2 má dva konsekutivní endogenní zbytky obsahující karboxyl. Je to kyselina glutamová (glu, E) a aspartová (asp, D) v poloze 77 a 78. Vynález předpokládá zavedení alespoň jednoho dalšího exogenního chemicky reaktivního aminokyselinového zbytku. Dokument Evropského patentu č. EP 385610 uvádí, že neuspokojivých výsledků se dosáhlo při pokusu chemicky spojit polypeptidové hapteny s částice-11CZ 302092 B6 mi HBc. Je nutné poznamenat, že pokusy spojení byly řízeny směrem na aminoskupinu a nikoli na karboxylové skupiny aminokyselinových postranních řetězců.

Vedle použití jednotlivého chemicky reaktivního aminokyselinového zbytku v inzertu, jako je kyselina aspartová nebo lyzin, se může použít v podstatě libovolná sekvence požadované délky, která obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Příklady inzertů větší než jediný zbytek zahrnují epitop HRV-2 VP2 buňky B, (popisuje se v publikaci B.E. Clarke et al. Vaccines 91: 313 až 318 (1991)), sekvence HBsAg Pre_S(l)27 až 53, (popisuje se v publikaci F. Schodel etal., J. Virol. 66(1): 106 až 114 (1992)) a sekvence HbsAg Pre-S(2)133 až 143 (popisuje se v publikaci F. Schodel etal., Vaccines 90: 193 až 198 (1990)), Vhodným epitopem T buňky je hapten, který se může také použít jako inzert. Příklady sekvencí zahrnují ty uvedené v SEQ ID NO: 28, 32, 33, 34, 47, 48,49, 50 a 55.

i i. Další úprava jaderného proteinu

Dále se uvádí, že strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B, jak se popisuje shora v textu, vykazuje jiné úpravy. Uvažované úpravy strategicky upraveného jádra zahrnují v podstatě inzert obsahující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek, zkrácení N-konce, zkrácení C-konce, fúzi na C-konci, převislé spojení s oblastí C-konce.

Inzert obsahující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek, se kterým se hapten spojí, může mít další využití například jako chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Uvažuje se, že inzert obsahující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek je aminokyselinová sekvence stimulující T buňku. Aminokyselinová sekvence stimulující T buňku je přednostně epitop T buňky ze stejného zdroje, jako je epitop B buňky, který se spojí santigenem. Oba mohou například pocházet z mikroorganizmu Mycobacterium tubercul o sis. Příklady epítopů se diskutují dále v textu.

Inzert obsahující chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek se může také vybrat za účelem potvrzení další požadované vlastnosti, jako je zvýšení stability nebo rozpustnosti.

Strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B se může chemicky upravit způsobem, který je dobře znám v oboru. Řada takových metod se také popisuje v publikaci Roger L. Lundblad, Techniques in Proteínn Modifiaction, CRC Press (Ann Arbor, Michigan: 1994). Takové chemické úpravy se provádějí pro zvýšení nebo potlačení vlastností například se může blokovat aminoskupina lyzinu, aby se změnil izoelektrický bod proteinu, čímž se mohou odděleně separovat proteiny na pryskyřici při chromatografií s výměnou iontů.

Také se udává, že C-konec sekvence jaderného proteinu je zkrácen na aminokyselinový zbytek v poloze 140. Sekvence bohatá na arginin začínající zbytkem 150 SEQ ID NO: 2 se váže na nukleové kyseliny a může bránit čištění a manipulaci ex pr i mo váného jaderného proteinu. V SEQ ID NO: 2 sekvence bohaté na arginin začínají v poloze 150. Preferovaný strategicky upravený protein HBc v poloze zbytku 149 má C-terminální val i nový zbytek (V).

iii. Příprava strategicky upraveného jaderného proteinu

Strategická úprava jaderného proteinu hepatitidy B se v typickém případě provádí procesem známým v oboru na úrovni DNA, například začleněním kodonů odpovídajících aminokyselinám, které se mají začlenit. Upravovaný gen se pak exprimuje ve vhodném systému, který je znám v oboru, například ve virové kultuře v infikovaných usmrcených buňkách.

Metody produkující HBcAg proteiny a zvláště pak pre-jademé, jaderné proteiny a proteiny HBeAg, jsou dobře známy v oboru. Stejné metody se upravily pro izolaci částic upraveného jaderného proteinu podle vynálezu. Navíc HBcAg a HBeAg se mohou produkovat řadou velmi dobře známých metod rekombinace DNA (popisuje se například v dokumentech US patentu

- 12CZ 302092 B6

US 4 356 270 (Itakura) a US 4 563 423 (Murray et al,,). Tyto metody rekombinace DNA se mohou jednoduše upravit k produkci upravených jaderných částic podle vynálezu. Upravené jaderné proteiny se mohou spojovat s haptenem před nebo po vytvoření částic. Preferuje se po vytvoření jaderné částice a po jejím čištění.

C. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B

Libovolný hapten, proti kterému se požaduje vznik protilátek, může být spojen se strategicky upraveným jaderným proteinem hepatitidy B, aby vznikl imunogenní konjugát strategicky upralo veného jaderného proteinu hepatitidy B podle vynálezu. Hapten inzertu je v typickém případě determinanta B buňky. Hapten může být polypeptid, sacharid nebo chemická látka, která není sacharidem ani polypeptidem, jako je například 2,4-dinitrobenzen.

Metody vhodné pro operativní spojení jednotlivých haptenů s proteinem nebo polypeptidem pro15 strednictvím postranního řetězce aminokyselinového zbytku proteinu nebo polypeptidu za vzniku převisle spojeného imunogenního konjugátu, jako je například polypeptidový polymér s větveným řetězcem, jsou dobře známy v oboru. Tyto metody zahrnují spojení prostřednictvím jednoho nebo více typů funkčních skupin na různých postranních řetězcích, ěímž dochází k tomu, že polypeptidová kostra nosičového proteinu je převisle spojena- kovalentní vazbou (kopulace) s hapte2« nem, aleje oddělena alespoň jedním postranním řetězcem.

Metody navázání nosičových proteinů na hapten za použití každé ze shora uvedených funkčních skupin se popisují v publikaci Erlanger, Method of Enzymology, 70: 85 (1980), Aurameas, et ak, Scand, J. Immunol., Vol. 8, Suppl. 7, 7 až 23 (1987) a US patent US 4 493 795 (Nestor etal.,).

Navíc se může provést místně řízená kondenzační reakce, jak se popisuje v publikaci Rodwell etal., Biotech., 3, 889 až 894 (1985) tak, že v podstatě nedojde k porušení biologické aktivity polypeptidu.

V oboru je známo, že protein HBcAg a polypeptid hapten se mohou použít v jejich přirozené formě nebo jejich obsah funkční skupiny se může upravit sukcinylací lyzinových zbytků nebo reakcí s cystěin-thiolaktonem. Sulfhydrytová skupina se může také začlenit buď do nosičového proteinu nebo reakcí aminofunkcí s 2-iminothiolanem nebo N-hydroxysukcinimidesterem 3-(3dithiopyridyOpropionátu.

Protein HBc nebo heptan se mohou také upravit tak, že se do nich začlení rameno mezemíku, jako je hexamethylendiamin nebo jiné biofunkční molekuly podobné velikosti, aby umožnily převislé navázání.

Polypeptidový hapten

Metody kovalentního navázání polypeptidového haptenu jsou extrémně rozmanité a jsou dobře známy v oboru imunologie. Například následující dokument US patent US 4 818 527 popisuje reakci m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysukcinimidesteru (ICN Biochemicals, lne.) nebo sukcinimidy 1-4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l -karboxylatu (SMCC, Pierce) reaguje se strate45 gicky upraveným jaderným proteinem za vzniku aktivovaného nosiče. Aktivovaný nosič pak reaguje s polypeptidem, který obsahuje buď terminální cystein nebo se k němu přidá N- nebo Cterminální cysteinový zbytek za vzniku kovalentně vázaného konjugátu strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy Β. V jiném příkladu aminoskupina polypeptidového haptenu může nejdříve reagovat s N-sukcin imidy 1—3—(2—py ridy Ithioj-propionátem (SPDP, Sigma) a pak poly50 peptid obsahující thíolovou skupinu může po redukci reagovat s aktivovaným nosičem. Samozřejmě část obsahující síru a Michaelův akceptor obsahující dvojnou vazbu se může vrátit. Tyto reakce se popisují v dodané literatuře a také v publikaci Kitagawa etal., J. Biochem., 79: 233 (1976) a Lachmann et al., In 1986 Synthetic Peptides as Antigens, (Ciba Foundation Symposium 119), pp. 25 až 40 (Wiley, Chichester: 1986).

- 13CZ 302092 B6

US patent US 4 767 842 popisuje několik módů kovalentní vazby mezi nosičem a polypeptidem, které je zde možné použít. U jedné metody tolylendiizokyanát reaguje s nosičem v pufru dioxanu při teplotě 0 °C za vzniku aktivovaného nosiče. Pak se přidá polypeptidový hapten a reaguje s aktivovaným nosičem za vzniku konjugatu kovalentně vázaného strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B.

Zvláště použitelné je velké množství heterobífunkěních činidel, které tvoří disulfidovou vazbu s funkční skupinou na jednom konci a peptidovou vazbu na druhém konci, která zahrnují N-sukcidimidy 1-3-( 2 - pyridy Id ith io)propionát (SPDP). Toto činidlo vytvoří mezi sebou a thiolovou skupinou buď strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B nebo haptenu disulfidový můstek. Může to být například cysteinový zbytek v polypeptidovém haptenu a amidová vazba na kondenzačním partnerovy, což je například aminoskupina na lyzinu nebo jiná volná aminoskupina na nosičovém proteinu. Je známa řada takových činidel, která tvoří disulfid nebo amid (popisují se například v publikaci Immun. Rev. (1982) 62: 185. Jiná bifunkční kondenzační činidla tvoří thioether spíše než disulfidovou vazbu. Řada těchto činidel, která tvoří thioether, jsou komerčně dostupná a zahrnují reaktivní estery 6-maleiimidokapronové kyseliny, kyseliny 2bromooctové, kyseliny 2-jodooctové, 4-(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylové kyseliny a podobně. Karboxylové skupiny se mohou aktivovat jejich kombinací s sukcinimidem nebo I hydro.\y 2 nitro-4-sulfonovou kyselinou nebo sodnou solí. Zvláště preferované kondenzační činidlo vhodné pro způsob podle vynálezu je sukcinimidyM—(N-maleimidomethyl)cyklohexanI-karboxylát (SMCC) získaný od firmy Pierce Company, Rockford, 111. Následující seznam není vyčerpávající a může dojít k úpravám jmenovaných látek, například sulfo-SMCC znázorněný na obrázku.

Polypeptidový hapten se může získat řadou způsobů, které jsou dobře známy v oboru. Mohou se použít obvyklé metody peptidové syntézy. Mohou se použít například rekombinantní metody a metody založené na PCR, přičemž vznikají delší peptidy. Protože požadované sekvence jsou relativně krátké, používá se chemická syntéza na pevné fázi.

Jak se uvádí dále v textu DNA sekvence, které kódují různé polypeptid ové hapteny, jsou známy v oboru. Kódující sekvence vhodná pro peptidy délky, která se zde předpokládá, se může jednoduše syntetizovat chemickými metodami například fosfotr i esterovou metodou popsanou v publikaci Matteucci etal., J. Am, Chem. Soc. 103: 3 185 (1981). V chemicky syntetizované kódující sekvenci je možné samozřejmě vyrobit jednoduše požadované úpravy substitucí vhodných bází. Do kódující sekvence se mohou pak vnést vhodné linkery a ligovaly se do expresívních vektorů, které nejsou běžně dostupné v oboru. Regulační vektory se používají k transformaci vhodných hostitelů za účelem produkce požadovaného proteinu.

Je dostupná řada takových vektorů a vhodných hostitelských systémů. Například promotorové sekvence kompatibilní s bakteriálními hostiteli existují v plazmidech, které obsahují vhodná restrikční místa pro začlenění požadované kódující sekvence. V typickém případě takové vektorové plazmidy jsou například pUC8 a pUC13, které je možné získat u J. Messing, v instituci University of Minnesota (popisuje se například v publikaci Messing et al., Nucleic Acids Res. 9: 309 (1981)) nebo pBR322, který je dostupný u instituce New England Biolabs. Vhodné promotory zahrnují například promotorové systémy beta-laktamasy (penicilinasy) a laktózy (lac) (popisuje se v publikaci Chang et al., Nátuře 198: 1 056 (1977)) a tryptofanový (trp) promotorový systém (popisuje se v publikaci Goeddel et ak, Nucleic Acids Res. 8: 4 057 (1980)). Výsledné expresívní vektory se transformovaly do vhodných bakteriálních hostitelů za použití metody s chloridem vápenatým, jak se popisuje v publikaci Cohen, etak, Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 69: 2 110 (1972). Transformanty mohou produkovat požadované polypeptidové fragmenty ve větším množství než je množství, které se nachází v kmenech produkujících nepoškozené pili. Samozřejmě je možné také použít jako hostitele kvasinky a savčí buňky, přičemž je nutné použít vhodné vektory a řídicí sekvence.

- 14CZ 302092 B6

Tabulka č. 2: polypeptidové hapteny

organizmus	epitop antigen ψ nebo B sekvence buňky	SEQ ID NO
Streptococcus pneumoniae	PspA	B	KLEELSDKIDELDAE	25
Streptococcus pneumoniae	PspA	B	SQKKYDEDQKKTEEKAALEKA ASEEMDKAVAAVQQA	26
Cryptosporidium parvum	P2 3	B	QDKPADAPAAEAPAAEPAAQQ DKPADA	27
HIV	P24	T	GPKEPFRDYVDRFYKC	28
HIV	GP120	B	RKRIHIGPGRAFYITKN	29
FMDV	VP1	B	YNGECRYNRNAVPNLRGDLQV LAQKVARTLP	30
Corynebacterium diphtheriae	toxin	T	FQWHNSYNRPAYSPGC	31
Borrelia burgdorferi	OspA	τ	VEIKEGTVTLKREIDKNGKVT VSLC	32
Borrelia burgdorferi	OspA	τ	TLSKNISKSGEVSVELNDC	33
Influenza A8/PR8	HA	τ	SSVSSFERFEC	34
Influenza A8/PR8	HA	Β	YRNLLWLTEK	35
Yersinia pestis	V Ag	Β	DILKVIVDSMNHHGDARSKLR EELAELTAELKIYSVIQAEIN KHLSSSGTINIHDKSINLMDK NLYGYTDEEIFKASAEYKILE KMPQTTIQVDGSEKKIVSIKD FLGSENKRTGALGNLKNSYSY NKDNNELSHFATTCSD	36
Haemophilus influenzae	pBOMP	Β	CS SSNNDAAGNGAAQFGGY	37
Haemophilus influenzae	pBOMP	Β	NKLGTVSYGEE	38
Haemophilus influenzae	pBOMP	Β	NDEAAY S KNRRAVLAY	/39
Moraxella catarrhalis	copB	Β	LDIE KDKKKRTDEQLQAELDD KYAGKGY	40
Moraxella catarrhalis	copB 1	Β	LDIEKNKKKRTEAELQAELDD KYAGKGY	41 .
Moraxella catarrhalis	copB	Β	IDIEKKGKIRTEAELLAĚLNK DYPGQGY	42

- 15CZ 302092 B6

Porphyromona s gingivalis	HA	B	GVSPKVCKDVTVEGSNEFAPV QNLT	43
Porphyroroonas gingivalis	HA	B	RIQSTWF.QKTVDLPAGTKYV	ί 44 1
T ryp ano s oma cruzi		T	SHNFTLVASVIIEEAPSGNTC	45
T ryp ano s oma cruzi		B	KAA I APAKAAAA P AKAAT APA	46
Plasmodium falciparum	ΜΞΡ1	T i	SVQIPKVPYPNGIVYC	47
Plasnodium falciparum	MSP1	5 τ	DFNHYYTLKTGLEADC	48
Streptococcus sobrinus	Agl/Il	B & T	KPRPIYEAKLAQNQKC	49
Streptococcus sobrinus	Agl/II	B & T	AKADYEAKBAQYEKDLC	50
lymphocyti c. Chořioneningitis virus	NP	T	RPQASGVYMGNLTAQC	51
Shigella flexneri	Invasin	B	KDRTLIEQK	52
re-spiračni syncitiálni virus	G	B	CSICSNNPTCWAICK	53
Plasmodium vivax	CS	B	GDRADGQ PAGDRADG QPAG	54
Clostridium tetani	tox	T	QYIKANSKFIGITELC	55
Entamoeba histolytica	lectin	B	VECASTVCQNDNSCPIIADVE KCNQ	5 6
Schistosoma j aponicum	para	B	DLQSEISLS LENGELIRRAKS AESLASELQRRVD	57 Í i
i Schiscosoma mansoni	para	B	DLQSEISLSLEMSELIRRAKA AESLASDLQRRVD	58
Plasmodium vivax		B	DRAAGOPAGDRADGQPAG	83
Influenza virus	Infl	B	CNNPHRIL	84
Influenza virus	Infl	T	C P KYVKQNTLKLATGMRNVPE KQTR	85
Influenza virus	Infl	B	SIMRSDAPIGTCSSECITPNG SIPNDKPFQNVNKITY	14
Influenza virus	infl	B	RGIFGAIAGFIENGWEGMIDG WYGFRHQN	15 J
Influenza virus	Infl	B	EKQTRGIFGA	16
Mycobacterium tuberculosis		T	AVLEDPYILLVSSKV	86
Mycobacterium tuberculosis		T j i	LLVSSKVSTVKDLLP	87

- 16CZ 302092 B6

Mycobacterium tuberculosis		T	LLPLLEKVIGAGKPL	88
Mycobacterium tuberculosis		T	AILTGGQVISEEVGL	89
Mycobacterium tuberculosis		T	IAFNSGLEPGWAEK	90
Mycobacterium tuberculosis		T	ARRGLERGLNALADAVKV	91
Mycobacterium tuberculosis		T	EK1GAELVKEVAKK	92
Mycobacterium tuberculosis		T	GLKRGIEKAVEKVTETL	93
Mycobacterium tuberculosis		T	IEDAVRNAKAAVEEG	94
virus kočičí leukemie	FeLV	B	CDIIGNTWNPSDQEPFPGYG	95
virus kočičí leukemie	FeLV	B	ClGTVPKTHQALCNETQQGHT	96
virus kočičí i ' leukemie	FeLV	B	GNYSNQTNPPPSC	97
virus kočičí leukemie	FeLV	B	TDIQALEESISALEKSLTSLS E	98
virus kočičí leukemie	FeLV		AKLRERLKQRQQLF	99
virus kočičí ' leukemie	FeLV		DSQQGWFEGWFNKSPWFTTLI ss	100
virus kočičí 'leukemie	FeLV		QVMTI TPPQAMGPNLVLP	101
virus kočičí leukemie	FeLV		DQKPPSRQSQIESRVTP	102
virus kočičí leukemie	FeLV		RRGLDILFLQEGGLC	103
virus kočičí leukemie	FeLV		QEGGLCAALEECQIGGLCAAL KEEC	104
Plasmodium falciparum		B	NANPNANPNANP	105
Ci r cutnsporozoi te			QAQGDGANAGQP	113

Chemický hapten.

Příbuzné chemické metody se používají ke kondenzaci chemických látek s nosičovými proteiny. V typickém případě se v chemické látce navrhla funkční skupina vhodná pro kondenzaci.

Protilátky proti látce 6-O-fosfocholinhydroxyhexanoát chrání proti organizmu Streptococcus io pneumoniae (popisuje se v publikaci Randy T. Fisher etal., J. Immunol., 154: 3 373 až 3 382 (1995)).

- 17CZ 302092 B6

Tabulka č. 3: Chemické hapteny

Chemický hapten	citace
piperidin-N-oxid	US patent č . US 5 304 252
fosfolakton nebo laktamid	US patent č.uS 5 248 611
komplexu kovových iontů	US patent č . us 5 236 825
[2.2.1] nebo [7.2.2] bicyklické kruhové látky	US patent Č.US 5 208 152
iontově nabité látky obsahující hydroxy1	US patent č . US 5 126 258
fosfonátové analogy karboxylátesteru	US patent č.
analogy kokainu	Carrera et al., Nátuře 378: 725 (1995)

Sacharidový hapten. Existuje řada metod, které jsou známé v oboru, že spojují nosičové proteiny s polysacharidy. Aldehydové skupiny se mohou vytvořit bud¹ na redukčním konci (popisuje se v publikaci Anderson, Infect. Immun., 39: 233 až 238 (1983), Jennings, etal., J. Immunol., 127: 1 011 až 1018 (1981), Poren etal., Mol. Immunol., 22: 907 až 919 (1985)) nebo terminálním io konci (Anderson et al., J, Immunol., 137: 1 181 až I 186 (1986), Beuvery et al., Dev. Bio. Scand.,

65: 197 až 204 (1986)) oligosacharidu nebo na relativně malém póly šach ar idu, který se může spojit s nosičovým proteinem pomocí redukční aminace.

Velké polysacharidy se mohou konjugovat buď terminální aktivací (Anderson et aL, J. Immunol., 15 137: 1 181 až I 186 (1986) nebo náhodnou aktivací několika funkčních skupin podél polysacharidového řetězce (Chu etal., Infect. Immun., 40: 245 až 256 (1983), Gordon, US patent

US 4 619 828 (1986), Marburg, US patent US 4 882 317 (1989)). Náhodná aktivace několika funkčních skupin podél polysacharidového řetězce může vést ke vzniku konjugátu, který je vysoce zesítěný, což je způsobeno náhodnými vazbami mezi póly sacharidovým řetězcem. Optimální ao poměr póly sacharidu ku proteinu závisí na určitém použitém polysacharidu, nos i čo vém proteinu a konjugátu.

V publikaci Dick etal., v Contributions to Microbilogy and Immunology, Vol. 10, Cruse etal., eds., (S. Karger: 1989), pp. 48 až 114, Jennings etal., v Neoglycoconjugates: Preparation and

Applications, Lee etal., eds., (Academie Press: 1994), pp. 325 až 371, Alpin etal., CRC Crit.

Rev. Biochem., 10: 259 až 306 (1981) a Stowell etal., Adv. Carbohydr. Chem. Biochem., 37:

225 až 281 (1980) se uvádí detailní přehled metod konjugace sacharidu s nosičovými proteiny.

Samotné sacharidy je možné syntetizovat způsoby, které jsou známy v oboru, například enzyma30 tickou glykoproteínovou syntézou, která se popisuje v publikaci Witte et al., J. Am. Chem. Soc.,

119: 2 114 až 2 118(1997)).

Několik oligosacharidu, syntetických a semi-syntetických a přirozených se popisuje v následujících paragrafech jako příklady oligosacharidu, které jsou hapteny používané pří vytvo35 ření konjugátu strategicky upraveného jaderného proteinu podle vynálezu.

-18CZ 302092 B6

Oligosacharidový hapten vhodný pro přípravu vakcín pro léčbu onemocnění způsobených virem

Haemophilus Influenza typ b (Hib) se připravil z 2 až 20 repetic D-ribosa-D-ribitol-fosfátu (I, dále v textu), D-ribitol-fosfát-D-ribosy (II, dále v textu) nebo fosfát-D-ribosa-D-ribitolu (III, dále v textu) (popisuje se v publikaci Eduard C. Beuvery et al., EP 0 276 616 Bl.

V dokumentu US patent US 4 220 717 se popisuje polyribosylri bito (fosfátový (PRP) hapten vhodný pro Haemophilus influenzae typ b.

Ellena M. Peterson etak, Infection and Immunity, 66 (8): 3 848 až 3 855 (1998) popisuje trisacharidový hapten, aKdo(2 8) aKdo(2 4)aKdo, který poskytuje ochranu proti organizmu Chlamudia pneumoniae.

Chlamydia pneumoniae způsobuje lidské respiraění infekce, které jsou v rozmezí od faringitidy až k fatální pneumonii. Kdo je 3~deoxy-D-/»a«rtí>-okt-2-ulosonová kyselina.

V dokumentu Bengt Andersson etak, EPO 126 043 Al se popisují sacharidy, které se mohou použít při léčbě, profylaxi nebo diagnostice bakteriálních infekcí způsobených mikroorganizmem Streptococci pneumoniae. Jedna třída používaných sacharidů se získala z disacharidu GlcNAcpl 3 Gal. V dokumentu Bengt Andersson et ak, EP 0 126 043 Al se také popisuje, zeje možné použít neolaktotetraosylceramid, který je Galpl 4GlcNAcpl 3Galpl 4Glc~Cer.

Evropský patent EP 0 157 899 Bl popisuje izolaci pneuomokokálních sacharidů, které je možné použít v rámci vynálezu. Následující tabulka uvádí typy pneumokokálních kultur, které produkují kapsulámí polysacharidy, které je možné použít jako hapteny podle vynálezu.

- 19C7. 302092 B6

dánský typ	americké názvosloví	1978 ATCC katalogové
názvosloví		číslo
1	1	6301
2	2	6302
3	3	6303
4	4	6304
5	5
6A	6	6306
6B	26	6326
7F	51	10351
8	8	6308
9a	9	6309
9V	68
10A	34
11A	43
12F	12	6312
14	14	631 4
15B	54
17F	17
18C	56	10356
19A	57
1.9F	19	6319
20	20	6320
22F	22
23F	23	632 3
25	25	6 32 5
33F	7 0

Je známo, že organizmus Moraxella (Branhamella) catarrhalis způsobuje otitidu a sinusitidu u 5 dětí a infekce dýchacích cest u dospělých. Štěpí se vazba mezi kyselinou 3-deoxy-D-mannooktulosonovou a glukosaminem, čímž se uvolní lipid A lipopolysacharidového povrchového antigenu (LOS) bakterie. Produkt štěpení se ošetří v slabém alkalickém prostředí, aby se odstranily přes ester vázané mastné kyseliny, zatímco se ochrání mastné kyseliny vázané amidem. Tak se získá z organizmu M. catarrhalis detoxifikovaný Iipopolysacharid (dLOS). dLOS není imunoio genní až do okamžiku, kdy není zachycen na proteinový nosič (popisuje se v publikaci Xin-Xing

Gu, etal., Infection and Immunity 66(5): 1 891 až 1 897(1998)).

Streptokoci skupiny B (GBS) mohou způsobit u lidí sepsí, meningitidu a příbuzné neurologické poruchy. Je známo, že protilátky specifické proti kapsulárnímu polysacharidu chrání kojence

-20CZ 302092 B6 před infekcí (popisuje se v publikaci Jennings et al., US 5 795 580). Opakující se jednotka kapsulámího polysacharidu GBS typ II je 4)-p-D-GlčpNAc-(l,3)-[p-I>-Galp(l,6)3-p-DGalp( l,4)-pí-D-Glcp-( 1,3)-β-ΕΜ31ςρ41,2)-[a-D-NeupNAc(2,3)H-D-Gal/Hl, kde část v závorce je větev přímo spojená s částí, která není v závorce. Opakující se jednotka kapsulámího polysacharidu GBS typ V je 4) -a-D-NeupNAc-(2,3)“[p-D-Galp(l,4)]-p-D-Galp(l,4)-p-DGlcpN Ac-( 1,6)-a-D-GIc/)-( 1,4HP~D-Glcp( 1,3)]-£-D-Galp-( 1,4)-p-D-Glc/H i ·

Dokument přihláška evropského patentu EP 0 641 568 Al (Dr. Helmut Bradě) popisuje způsob získání antigenů s páskovou strukturou podobnou žebříčku z organizmu Chlamydia trachomatis, pneumoniae apsittaci.

D. Konjugát příbuzný patogenu s upraveným HBc

V jednom provedení vynálezu hapten, který tvoří konjugát se strategicky upraveným proteinem HBc je determinanta patogenu B buňky. Determinanty řady patogenů B buňky jsou známy v oboru a několik jich bylo zobrazeno už dříve v textu, kde se diskutují polypeptidové a sacharidové hapteny.

V preferovaných provedeních se použije jako hapten hapten, který je příbuzný patogenu. Použití části patogenové proteinové nebo sacharidové sekvence jako haptenu má jisté výhody oproti expozici k aktuálnímu patogenu a dokonce oproti vystavení pasivní nebo „usmrcené“ verze patogenu.

Příkladné hapteny příbuzné patogenu určité důležitosti se získaly z bakterií, jako je B. pertussis, S. typosa, S. paratyphoid A a B, C. diptheriae, C. tetani, C. botulinum, C. perfringerns, B. anthracis, P. pes tis, P. multocida. V. cholerae, N. meningitides. N gonorrhea, H. influenzae. T palladium a podobně.

Jiné příkladu důležitých zdrojů haptenů příbuzných patogenu jsou viry, jako je poliovirus, adenovirus, virus parainfluenza, virus spalniček, parotitida, respirační syncytikální virus, virus influenza, koňský virus encefalomyelitidy, virus cholery suis, Newcastle virus, virus planých neštovic, virus vztekliny, virus psinky, virus FMDV, HIV a SIV a podobně. Jiné důležité zdroje haptenů příbuzných patogenu zahrnují rickettsie, epidemický a endemický tyfus, skvmivka a podobně.

Polypeptidové hapteny příbuzné patogenu jsou dobře známy v oboru a popisují se v řadě dokumentů, jako je US Patent US 3 149 036, US 3 983 228 a US 4 069 313 v Essential Immunology, 3^rd Ed., Roit, nakl. Blackwell Scientific Publicarions, v Fundamentals of Clinical Immunology a Alexander and Good, nakl. W.B. Saunders, v Immunology, Bellanti.

Zvláště preferované hapteny příbuzné patogenu se popisují v dokumentech US patent US 4 625 015, US 4 544 500, US 4 454 931, US 4 663 436, US 4 631 191, US 4 629 783 a mezinárodní přihláška dokumentu Patent Cooperation Treaty International Publícation WO 87/02775 a WO 87/02892.

Protilátky, které imunologicky reagují s virem hepatitidy B se mohou získat použitím upraveného HBc konjugovaného s polypeptidovým haptenem, který odpovídá sekvenci části determinanty HbsAg, zvláště zbytkům 110 až 137 povrchové oblasti „S“ popsané v publikaci Gerin et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80: 2 365 (1983).

Jiný konjugát odpovídá aminokyselinám 93 až 103 kapsidovému proteinu VPI polioviru typu 1 (PV1, kmen Mahoney), což je analog proteinu, který se použil v práci popsané v publikaci Delpeyroux etal., Science, 233: 472 až 475 (1986). Takový upravený konjugát HBc poskytuje protilátky, které imunologicky reagují s polio. Jiné potencionální hapteny pocházející z polioviru typ 1, kmeny Mahoney a Sabin se popisují v dokumentu evropského patentu EP 385610.

-21 CZ 302092 B6

V preferovaných provedeních podle vynálezu se použije hapten příbuzný patogenu, který je s ním imunoreaktivní. To znamená, že se imunologicky váže na protilátky indukované patogenem. Více se upřednostňuje, aby hapten příbuzný patogenu vyvolal proti látkovou odezvu, která poskytuje ochranu proti infekci patogenem.

Způsoby stanovení přítomnosti protilátek v imunogenu ve vzorku těla z imunizovaného zvířete jsou dobře známy v oboru. Metody vhodné pro stanovení přítomnosti zkříženě reagujících a ochranných protilátek jsou dobře známy v oboru.

V jiném provedení podle vynálezu imunitní odezva vůči determinantě buňky B je zesílena aplikací determinantou buňky T stimulující polypeptidy získané z nukleokapsidového proteinu HBV. Jiné determinanty T buňky jsou známé v oboru a mohou se použít jako operativně spojené determinanty v uvažovaném upraveném proteinu HBc nebo v částici.

Zvláště preferované provedení vynálezu, jako je determinanta T buňky se získala ze stejného patogenu, jako determinanta buňky B, která je spojená s upraveným HBc. Determinanty buňky T různých patogenu se popisují v oboru.

Ačkoli se preferuje, že determinanty buňky B a T se odvodily od stejného patogenu, není nezbytné, aby byly ze stejného proteinu uvedeného patogenu. Například determinanta buňky B z proteinu VP1 FMDV se může spojit s upravenou částicí HBc, kde protein HBc se dále upravuje tak, aby měl determinantu T buňky získanou z proteinu VP4 FMD.

Navíc determinanta T buňky se může zavést do upraveného proteinu HBc na genetické úrovni a to na konec sekvence proteinu HBc (N- a C-konec), kdy se použijí metody dobře známé v oboru. Jako část začleněné DNA zahrnuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek, ale preferuje se fúzní protein na C-konci. V jiném případě může být operativně spojena s konjugovanou determinantou buňky B nebo se strategicky upraveným proteinem HBc další determinanta buňky B.

V dokumentech US patent US 4 428 941 (Galibert, etal.,), US 4 237 224 (Cohen etal.,) US 4 273 875 (Manis), US4431 739 (Riggs), US4 363 877 (Goodman etal.,) a v publikaci Rodriguez and Tait, Recombinant DNA Techniques: An lntroduction, The Benjamin-Cummings Publishing Co., Inc. Menlo Park, Calif. (1983) se popisují metody genového inženýrství sekvence DNA, které se mohou použít při produkci fúzního proteinu podle vynálezu.

E. Inokula a vakcíny

V jiném provedení podle vynálezu upravený protein HBc nebo částice konjugované s haptenem (konjugát HBc) se použily jako imunogen inokula. které vyvolává produkci protilátek, které imunologicky reagují s haptenem nebo jako vakcína poskytují ochranu proti patogenu, ze kterého se hapten odvodil.

Uvažované inokulum nebo vakcína obsahuje konjugát HBcAg, který je rozpuštěný nebo dispergovaný ve farmaceuticky přijatelném ředidle, které v typickém případě také obsahuje vodu. Když se zvířeti, jako je savec (například myš, pes, koza, ovce, kůň, hovězí dobytek, opice, bezocasá opice nebo člověk) nebo pták (například kuře, krocan, kachna a husa), inokulum aplikuje vyvolá v imunologicky účinném množství, pak protilátky, které imunologicky reagují s konjugovaným haptenem. Vakcína je typ inokula, ve kterém hapten je příbuzný patogenu a indukuje protilátky, které nejsou pouze imunoreaktivní s patogenem nebo s nemocnou buňkou, ale také neutralizují uvedený patogen nebo nemocnou buňku.

Příprava inokula a vakcín, které obsahují proteinové materiály jako aktivní ingredienty, jsou dobře známy v oboru. V typickém případě takové inokulum nebo vakcíny se připravují tak, aby se daly aplikovat parenterálně, bud'jako kapalné roztoky nebo suspenze. Dále se připravují jako

-22CZ 302092 B6 pevné formy vhodné pro přípravu roztoků nebo suspenze nebo kapalin pro zavedení ve formě injekce. Přípravek může být také ve formě emulze. Imunogenní aktivní složka se často míchá sekcipienty, které jsou farmaceuticky přijatelné a kompatibilní s aktivní složkou. Vhodnou pomocnou látkou například voda, fyziologický roztok, dextrosa, glycerol, ethanol a podobně a jejich kombinace. Navíc je-li to nutné inokulum nebo vakcína mohou obsahovat malé množství pomocných látek, jako jsou smáčecí a emulgační činidla, činidla upravující pH nebo adjuvans, které zvyšuje imunogenní účinnost kompozice.

Příklady adjuvans zahrnují kompletní Freundovo adjuvans (CFA), které nelze použít v případě lidí, nekompletní Freundovo adjuvans (IFA) a alum, které jsou dobře známy v oboru a jsou běžně dostupné z několika zdrojů. Také se uvažuje použití malých molekul adjuvans.

Příkladem jedné skupiny adjuvans s malými molekulami jsou tak zvané analogy muramyldipeptidu, které se popisují v dokumentu US patent US 4 767 842. Jiný typ adjuvans s malými molekulami se popisuje v dokumentu US patent US 4 787 482, který je také možné použít jako směs v objemovém poměru 4:1 se skvalenem nebo skvalenem a Aracel^ttm)A (manidmonooleát).

Dalším typem adjuvans s malou molekulou je derivát 8-oxo-guanosinu substituovaný v poloze 7 nebo S-sulfo-guanosin, jenž se popisují v dokumentech patent US 4 539 205, US 4 643 992, US 5 011 828 a US 5 093 318. Z těchto materiálů se zvláště preferuje 7-allyl-8-oxoguanosin (loxoribin). Tato molekula se zdá zvláště účinná při indukci odezvy na specifický antigen (imunogen).

Inokula a vakcíny se aplikují parenterálně, injekcí například podkožně nebo do svalu. Další formulace, které jsou vhodné pro další způsoby aplikace, zahrnují čípky a v některých případech orální formulace nebo nasální spreje. V případě čípků mohou přípravky zahrnovat tradiční pojidla a nosiče. Jsou to například polyalkalenglykoly nebo triglyceridy. Například čípky se mohou tvořit ze směsí obsahující aktivní složku v rozmezí 0,5 až 10%, upřednostňuje se 1 až 2%. Orální formulace zahrnují také běžně používané pomocné látky, jako je například manitol v čistotě farmaceutického stupně, laktózu, škrob, stearát hořečnatý, sodnou sůl sacharinu, celulózu, uhličitan hořečnatý a podobně.

Inokolum nebo vakcína může mít formu roztoku, suspenze, tablet, pilulek, kapsulí, formulací, které se nepřetržitě uvolňují nebo prášku a obsahují imunogenní množství konjugátu strategicky upraveného proteinu HBc nebo konjugátu strategicky upravené proteinové částice, které jsou aktivní složkou. V typické kompozici imunogenní množství konjugátu strategicky upraveného proteinu HBc nebo částice strategicky upraveného proteinu HBc je přibližně 50 pg až přibližně 2 mg aktivní složky v jedné dávce a více se upřednostňuje přibližně 100pg až 1 mg aktivní složky na dávku.

Z částic a proteinových konjugátů se může vytvořit vakcína, jako neutrální forma nebo forma soli. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují kyselé adiční sole (tvořené s volnými aminoskupinami peptidu) a ty sole, které vznikají s anorganickými kyselinami, jako je například kyselina chlorovodíková nebo fosforečná, nebo s organickými kyselinami, jako je kyselina octová, šťavelová, vinná, mandlová a podobně. Sole tvořené volnými karboxy lovými skupinami se mohou také získat ve formě anorganických bází, jako je například hydroxid sodný, draselný, amonný, vápenatý nebo železitý a takové organické báze jako je izopropylamin, trimetylamin, 2-etyiaminoetanol, histidin, prokain a podobně.

Inokulum a vakcína se aplikovaly způsobem kompatibilním s dávkou formulace a v takovém množství, které je terapeuticky účinné a imunogenní. Aplikované množství závisí na subjektu, který se má léčit, na kapacitě imunitního systému subjektu syntetizovat protilátky a stupni požadované ochrany. Přesné množství aktivní látky, které je nutné aplikovat, závisí na úsudku praktického lékaře a je charakteristické pro každého jedince. Vhodné rozmezí dávek je však řádově několik stovek mikrogramů aktivní látky na jedince. Vhodný režim počáteční aplikace a posilují-23CZ 302092 B6 cích injekcí je také variabilní, aleje typické, že se začíná iniciační dávkou a pak v určitých intervalech se aplikují následné injekce nebo dojde k další aplikaci.

Jiné provedení podle vynálezu je způsob indukce protilátek ve zvířecím modelu, který obsahuje kroky aplikace inokula uvedenému zvířecímu hostiteli. Inokulum používané v tomto postupu obsahuje imunogenní množství konjugátu strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B rozpuštěné nebo dispergované ve farmaceuticky přijatelném ředidle. Konjugát strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B užívaný v tomto postupu obsahuje hapten převisle spojený se strategicky upraveným jaderným proteinem hepatitidy B. Upřednostňuje se, aby se strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B vyskytoval ve formě částic. Strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B obsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci jaderného proteinu hepatitidy B SEQ ID NO: 2 zahrnující aminokyselinové zbytky číslované od 10 do přibližně 140 a navíc obsahuje inzert v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným přibližně od 50 do 100. Uvedený inzert (i) obsahuje 1 až přibližně 40 aminokyselinových zbytků a (ii) obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek. Hapten je nezávisle spojen se strategicky upraveným jaderným proteinem hepatitidy B pomocí chemicky reaktivního aminokyselinového zbytku. Upřednostňuje se, aby hapten byl příbuzný patogenu. Zvíře se udržuje po dostatečně dlouhou dobu, aby se mohly indukovat protilátky.

Přehled obrázků na výkrese

Na obrázku č. 1, který tvoří část popisu vynálezu a který znázorňuje schéma 1, se ilustruje reakční sekvence pro převislé navázání haptenu na částice, které obsahují strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B (sm-HBc) za použití sulťo-sukcinimidyl-4—(N-maleimidomethyl)cyklohexan-l-karboxylátu (sulfo-SMCC). Částice sm-HBc je znázorněna jako box (z důvodu jasnosti obrázku) s jednou přesahující aminokyselinou.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Konstrukce expresívního vektoru upraveného jaderného proteinu hepatitidy B

Použitím místně řízené mutageneze se lyzinový kodon (TTT) zavedl mezi aminokyseliny D78 a P79 genu HBc spolu s restrikčními místy EcoRI (GAATTC) a Sací (GAGCTC), což umožňuje genetické začlenění jiných kodonů vhodných pro produkci strategicky upravených hybridních částic HBc. Inzert tak měl sekvenci aminokyselinových zbytků GIQKEL, kde G1Q je artefakt restrikčního místa EcoRI a EL je artefakt restrikčního místa Sací. Strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B proto obsahuje 155 aminokyselinových zbytků. Konstrukce expresívního plazmidů pKK322-HBc 155-K81 se popisuje dále v textu.

Oligonukleotidové primery P1F (SEQ ID NO: 17) a PÍR (SEQ ID NO: 18 na komplementárním řetězci) se použily kamplifikací 5'konce genu HBc (báze 1-234, aminokyseliny 1-78) a současně se začlení restrikční místo Ncol (CCATGG) na 5'konec a restrikční místo EcoRI (GAATTC) na 3'konec amplifikovaného produktu. Oligonukleotidové primery (SEQ ID NO: 19) P2F a P2R (SEQ ID NO: 20, na komplementárním řetězci) se použity k amplifikací 3'konce genu HBc (báze 232 až 450, aminokyseliny 79 až 149) a současně se začlení na 5 konec amplifikovaného produktu restrikční místo EcoRI (GAATTC) a sousedící restrikční místo Sací (GAGCTC) a mezi nimi je začleněný lyzinový kodon (AAA) a na 3'konci je restrikční místo Hindlll (AAGCTT).

Dva produkty PCR (kódující aminokyseliny I až 78 a aminokyseliny 79 až 149) se štěpily restrikčním enzymem EcoRI a ligovaly se dohromady svými přesahy EcoRI. Dále se štěpily restrikčními enzymy Ncol a Hindlll a klonovaly se do expresívního plazmidů pKK332 (Pharmacia)

- 24CZ 302092 B6 za použití standardních metod. Výsledný plazmid se nazval pKK332-HBc-K81. Tento plazmid se může použít za účelem exprese strategicky upraveného proteinu HBc, který nese lyzin v imunodominantní smyčce. Exprimovaný strategicky upravený protein HBc spontálně tvoří částice. Strategicky upravený HBc tohoto příkladu tak nese inzert odpovídající poloze 78 HBc SEQ ID NO: 2, chemicky reaktivní lyzinový zbytek v poloze odpovídající poloze 82 HBc sekvence SEQ ID NO: 2 a zkrátil se v poloze odpovídající poloze 149 HBc sekvence SEQ ID NO: 2. Příklad 2: Čištění upravených jaderných Částic Hepatitidy B

Strategicky upravené částice HBc popsané v příkladu 1 se exprimovaly v mikroorganizmu E. coli v typickém případě E. coli BLR nebo BL21 od firmy Novagen (Madison, Wisconsin) nebo v mikroorganizmu E. coli TBl l od firmy Amersham (Arlington Heíghts, Illinois). Transfekované buňky E. coli označené HBcl55~K81 exprimovaly plazmid pKK332-HBcl55-K81. Strategicky upravené částice HBc se čistily pomocí chromatografie na sefaróze CL—4B za použití stanovených postupů. Protože se částice čistí způsobem, který lze předpovědět, monitorování eluce částic za použití jednoduché spektroskospie (OD₂go) spolu s analýzou SDS-PAGE slouží před spojením jednotlivých frakcí k odhadu jejich čistoty. Tento postup je dostatečný, aby umožnil rutinní čištění elektroforeticky čistých částic s vysokým výtěžkem (5 až 120 mg/l buněčné kultury). Specifická kultura čistých strategicky upravených jaderných částic hepatitidy B je zřetelně viditelná na elektronovém mikrografu.

Příklad 3: Chemická kondenzace syntetických peptidů a upravené jaderné částice hepatitidy B

U produktu strategicky upravených jaderných částic hepatitidy B vznikajícího expresí plazmidu pKK.1 332-HBcl 55-K81, který se popisuje v příkladu 1, se testovala jeho chemická reaktivita. Reaktivita se porovnávala s podobně exprimovanou a čištěnou, zkrácenou jadernou částicí hepatitidy B „divokého typu“ HBc 149, která je shodná s HBcl55-K81. Liší se pouze tím, že ji chybí zavedení lysínového zbytku a 5 lemujících aminokyselin. Syntetické peptidy (hapteny) se chemicky spojily s částicemi HBc za použití sukcinimidyl—4-(N-maleimido-methyl)cyklohexan-1-karboxylátu (SMCC), což je ve vodě rozpustné heterobifunkční síťovadlo. SMCC reaguje se sulťylhydrylovou skupinou aprimámí aminoskupinou. Toto činidlo umožňuje sekvenční konjugaci syntetických peptidů s částicemi HBc, jejichž primární aminoskupiny se dříve upravily pomocí SMCC. Dále rameno mezemíku 11,6 angstromů napomáhá pomocí SMCC redukovat prostorové překážky mezí haptenem a nosičem HBc, přičemž umožňuje vyšší účinnosti spojení.

Částice HBcl55-K81 a HBc 149 odděleně reagují s3 násobným přebytkem SMCC, který se vztahuje k celkovému množství aminoskupin (přirozené aminoskupiny nebo přirozené aminoskupiny plus jeden z lyzinových zbytků inzertu) po dobu 2 hodin, při teplotě místnosti a v 50 mM fosforečnanu sodném pH 7,5, přičemž vznikají částice HBc aktivované maleimidem. Nezreagované SMCC se odstranilo opakovanou dialýzou proti 50 mM fosforečnanu sodnému pH 7,0. SMCC derivatizace částic HBc vede ke zvýšení minimální molekulové hmotnosti, kterou nebylo možné detekovat SDS-PAGE. Analýza PAGE však nepotvrdila integritu proteinů HBc dříve než došlo ke zpracování v kroku konjugace peptidů.

Aby mohlo dojít ke spojení syntetických peptidů s částicemi HBc, peptidy se navrhly tak, že Nterminální cysteinové zbytky umožňují přímou konjugaci peptidových haptenů s primárním aminem na postranním řetězci zavedeného lyzinového zbytku prostřednictvím cysteinové sulťyhydrylové skupiny haptenu.

Tabulka č. 2 obsahuje syntetické peptidy získané z lidských enzymů cytochromu P450, které se chemicky konjugovaly s částicemi HBc. Syntetické peptidy se rozpustily v 50 mM fosforečnanu sodném pH 7,0 v koncentraci 10 mg/ml. Syntetické peptidy se pak přidaly po kapkách k Snásobnému přebytku vzhledem k celkovým aminoskupinám ve strategicky upravených částicích HBcl55-K81 a umožňuje reagovat při teplotě místnosti po dobu 2 hodin. Částice HBc 149

-25 CZ 302092 B6 aktivované maleimidem reagovaly se dvěma peptidy 2D6 (206 a 206—C), které se použily jako kontroly.

Tabulka 5: Hapteny cytochromu P-^450

jméno peptidu	sekvence	SEQ ID NO:
1A1 (289-302)	CQEKQLDENANVQL	21
1A2 (291-302)	CSKKGPRASGNLI	22
2D6 (263-277)	CLTEHRMTWDPAQPPEDLT	23
3A4 (253-273)	CVKRMKESRLWDTQKHRVDF LQ	24
1A1-C	CMQLRS	106
1A2-C	CRFSIN	107
206-c	CAVPR	108
2E1-C	C1PRS	109
2C-c	CFIPV	110
3A3/4/7-C	CTVSGA	111
3A5-C	CTLSGE	112

io

Příklad 4: Analýza konjugátů upravených jaderných částic

Strategicky upravené částice HBc převisle spojené s determinantními hapteny cytochromu P-450 příkladu 3 se analyzovaly SDS-PAGE a imunobloty za účelem stanovení, zda syntetické peptidy se úspěšně spojily s HBc. Denaturační podmínky elektroforézy rozkládají částice na jejich základní podjednotky na monoméry HBc. Protože monoméry HBc mají molekulovou hmotnost přibližně 16 000, je jednoduché rozlišit částice HBcl55-K81 chemicky konjugované s peptidy 1A1 (289 až 302), 1A2 (291 až 302), 2D6 (263 až 277) nebo 3A4 (253 až 273), přičemž tyto peptidy mají relativní molekulovou hmotnost přibližně 2 000 a způsobují proto viditelný růst molekulové hmotnosti proteinových monomerů HBc. Z relativních intenzit konjugovaných a nekonjugovných pruhů na SDS-PAGE se ukázalo, že přibližně 50 % monomerů HBcl55-K81 se operativně spojily s haptenem, zatímco pouze přibližně 5 % částic HBcl49 „divokého typu“ je spojeno s haptenem. Znatelné zvýšení navázaného haptenu na strategicky upravený jaderný protein hepatitidy B podporuje závěr, že pozorovaná vazba se objevuje prostřednictvím začleněného lyži nového zbytku, který je také přítomen u „divokého typu“. Posun pohyblivosti částic HBc spojených s kratšími C-terminálními P450 peptidy (5 a 6-mery) se neprojevuje v analýze SDSPAGE, jako u delších inhibičntch peptidu, ale jasně zřetelný byl posun molekulové hmotnosti na hodnotu přibližně 700, které se dosáhlo u úspěšně spojených monomerů HBcl55-K81. Strategicky upravený protein HBcl55-K81 vykazoval znatelně zvýšenou schopnost vázat hapten přes částice HBcl49 „divokého typu“, který vykazuje minimální konjugaci.

V modelu jaderných dvacetistěnných částic navržených autorem Conway et al„ existuje buď 180 nebo 240 připojených jaderných proteinových monomerů (popisuje se v publikaci Nátuře, 386: 91 až 94 (1997)). Dimery relativně exponované imunodominantních oblastí smyčky jaderných monomerů trčí ze sestavené jaderné částice do roztoku jako špendlíky. „Špendlíky“ jsou na povrchu částice HBc uspořádány velmi blízko sebe. Strategické uspořádání zavedeného lyzin ového zbytku na konci špendlíku minimalizuje s navázanými náchylnost, aby sterické překážky

-26CZ 302092 B6 reagovaly hapteny jaderné částice. Maximálně 50 % strategicky upravených monomerů HBc se úspěšně konjugovalo se syntetickými peptidy Cyt P-450. Toto množství převislých vazeb odpovídá průměrně jednomu haptenu navázanému na „špendlík“ jaderné částice. To předpokládané rozložení haptenové vazby se strategicky upravenou částicí HBc je podporováno výsledky analýzy PAGE při semi-denaturačních podmínkách, které rozkládají částici, zatímco se uchovává dimerové spojení.

Částice HBc-2D6 připravené spojením peptidů se testovaly za použití imunoblotů, aby se potvrdila přítomnost epitopu 2D6. Když se použije anti-HBc antisérum chemicky spojené částice vedou ke vzniku dvou odlišných monomerů reprezentující částice s peptidem 2D6 a bez něho. Pouze horní pruh pozitivně reagoval s anti-2D6 antisérem, což potvrzuje korelaci mezi posunem mobility a zachycením peptidu 2D6.

Příklad 6: Strategické začlenění lyzinu

Aby došlo ke konstrukci částic HBc se začleněnými lyzinovými zbytky v každé poloze v imunodominantní oblasti smyčky (aminokyseliny 75 až 85), použilo se pro amplifikaci 5' a 3 fragmentů genu HBc PCR a pomocí oligonukleotidových primerů se zavedl jediný lyzinový kodon. Oligonukleotidové primery a výsledné aminokyselinové sekvence jsou zobrazeny v sekvenci SEQ ID NO: 61 až 82. Sekvence „divokého typu“ jsou zobrazeny v sekvencích SEQ ID NO: 59 až 60.

Za účelem vytvořit lyzinové inzerty v polohách 75 až 84 (HBcK75 až HBc-K84) se páiy fragmentů PCR Štěpily restrikcními endonukleázami Msel, které rozeznávají sekvenci A ATT. Upravený gen se obnovil ligací oligonukleotidového primeru (obsahujícího lyzin) ve vhodném restrikěním místě, které se nachází v polohách nukleotidů 221 až 224. V případě HBc-K85 (SEQ ID NO: 85 až 86) je nezbytné vytvořit dva fragmenty, které se ligovaly do běžného restrikčního místa Xhol (CTCGAG), které není přítomné v genu divokého typu, ale může se zavést do polohy 239 až 244, aniž se změní libovolná z aminokyselin.

Tabulka č. 6: Mutanti HBc v imunodominantní smyčce s inzercí lyzinu

jméno	sekvence	SEQ ID NO:
Bc divokého typí	j TWVGVNLEDPASRDLWSYV	60
K75	TWVGVKNLEDPASRDLWSYV	62
K76	TWVGVNKLEDPASRDLWSYV	64
K77	TWVGVNLKEDPASRDLWSYV	66
K78	TWVGVNLEKDPASRDLWSYV	68
K79	TWVGVNLEDKPASRDLWSYV	70
K80	TWVGVNLEDPKASRDLWSYV	72
K81	TWVGVNLEDPA&SRDLWSYV	74
K82	TWVGVNLEDPASKRDLWSYV	76
K83	TWVGVNLEDPASRKDLWSYV	78
K84	TWVGVNLEDPASRDKLWSYV	80
K85	TWVGVNLEDPASRDLKWSYV	82

-27CZ 302092 B6

Aby se vyčistily strategicky upravené proteiny HBc, centrifugované buněčné lyzáty z fermentace o objemu 1 I se srážely 45% síranem amonným a výsledný pelet se nanesl na gelovou filtraci za použití chromatografie na sefaróze CLMB (2,5 cm x 100 cm). Částice HBc, když se analyzují uvedeným typem kolony, vykazují charakteristickou polohu eluce, která je nezávislá na začlenění aminokyselin, které se provedlo v Částici. 11 strategicky upravených částic, které se vytvořily pro tuto studii, se analyzovalo za použití uvedeného postupu a eluční profily se měřily pomocí spektrofotometru při absorbanci 280 nm.

Tři z konstrukcí (HBc-K75, HBc-K77 a HBc-K79) se produkovaly v koncentraci mezi 50 a 100 ío mg/1, což je srovnatelné s typickým výtěžkem v případě neupravených částic HBc divokého typu.

Jsou to například částice HBc 149. Čtyři konstrukce (HBcK76, HBc-K78, HBc-K81 a HBc-K82) se produkovaly v relativně nízké koncentrací mezi 1 a 20mg/l. Nakonec čtyři z částic (HBcK80, HBc-K83, HBc-K84 a HBc-K85) se produkovaly v malém množství, které není skoro možné detekovat (méně než 1 mg/1).

Tabulka č. 7: Výtěžek čištěných částic HBc, které obsahují lyzin z fermentace o objemu 1 1.

částice	výtěžek mg/1
HBc-150(K75)	77
HBc-150(K76)	5
HBc-150 (K77)	74
HBc-150(K78)	10
HBc-150(K79)	94
HBc-150(K80)	0
HBC-150(K81)	17
HBc-150(K82)	1
HBc-150(K83)	0
HBc-150(K84)	0
HBc-150(K85)	0

Seznam sekvencí <110> Birkett, Ashley J.

<120> Konjugát strategicky upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, jeho částice, inokulum a způsob indukce protilátek.

<I3O> SYN-101 4564/69529 <140> PCT/US99/ <I41> 1999-02-11 <150> 60/074537

-28 CZ 302092 B6 <151> 1998-02-12 <160> 113 <170> Patentln Ver. 2.0 <210> 1 <211> 553 <212>DNA io <213> virus hepatitidy B <220>

<221>CDS <222> (1)..(549) <300>

<303> přirozený <304> 281 <306> 64620 <307> 1979 <400> 1

atg

gac

atc

gac

cct

tat

aaa

gaa

ttt

gga

gct

act

gtg

gag

tta

ctc

Met 1

Asp

Ile

Asp

Pro 5

Tyr

Lys

Glu

Phe

Gly 10

Ala

Thr

Val

Glu

Leu 15

Leu

tcg

ttt

ttg

cct

tet

gac

ttc

ttt

cct

tca

gta

ega

gat

ctt

cta

gat

Ser

Phe

Leu

Pro 20

Ser

Asp

Phe

Phe

Pro 25

Ser

Val

Arg

Asp

Leu 30

Leu

Asp

acc

gcc

tca

gct

ctg

tat

cgg

gaa

gcc

tta

gag

tet

cct

gag

cat

tgt

Thr

Ala

Ser 35

Ala

Leu

Tyr

Arg

Glu 40

Ala

Leu

Glu

Ser

Pro 45

Glu

His

Cys

144

tca Ser

cct Pro 50

cac His

cat His

act Thr

gca Ala

CtC Leu 55

agg Arg

caa Gin

gca Ala

att Ile

ctt Leu 60

tgc Cys

tgg Trp

ggg Gly

gaa Glu

192

cta

atg

act

cta

get

acc

tgg

gtg

ggt

gtt

aat

ttg

gaa

gat

cca

gcg

240

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Thr

Trp

Val

Gly

Val

Asn

Leu

Glu

Asp

Pro

Ala

65

70

75

80

tet

aga

gac

cta

gta

gtc

agt

tat

gtc

aac

act

aat

atg

ggc

cta

aag

288

Ser

Arg

Asp

Leu

Val

Val

Ser

Tyr

Val

Asn

Thr

Asn

Met

Gly

Leu

Lys

85

90

95

ttc

agg

caa

CtC

ttg

tgg

ttt

cac

att

tet

tgt

ctc

act

ttt

gga

aga

336

Phe

Arg

Gin

Leu

Leu

Trp

Phe

His

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Arg

100

105

110

gaa

aca

gtt

ata

gag

tat

ttg

gtg

tet

ttc

gga

gtg

tgg

att

ege

act

384

Glu

Thr

val

Ile

Glu

Tyr

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

115

120

125

cct

cca

get

tat

aga

cca

cca

aat

gcc

cct

atc

cta

tca

aca

Ctt

ccg

432

Pro

Pro

Ala

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

gag

act

act

gtt

gtt

aga

ega

ega

ggc

agg

tcc

cct

aga

aga

aga

act

480

Glu

Thr

Thr

Val

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Thr

145

150

155

160

ccc

tcg

cct

ege

aga

ega

agg

tet

caa

tcg

ccg

cgt

ege

aga

aga

tet

528

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

165

170

175

caa

tet

cgg

gaa

tet

caa

tgt

tagt

553

Gin

Ser

Arg

Glu

Ser

Gin

Cys

180 <2I0>2 <211> 183 <212> PRT <213> virus hepatitidy B <400>2 <400> 2

Met Asp Ile Asp Pro Tyr Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu Leu 15 10 15

-30CZ 302092 B6

Ser

Phe

Leu

Pro 20

Ser

Asp Phe

Phe

Pro 25

Ser Val

Arg Asp

Leu 30

Leu

Asp

Thr

Ala

Ser

Ala

Leu

Tyr

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Ser

Pro

Glu

His

Cys

35

40

45

Ser

Pro

H5 s

His

Thr

Ala

Leu

Arg

Gin

Ala

Ile

Leu

Cys

Trp

Gly

Glu

50

55

60

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Thr

Trp

Val

Gly

Val

Asn

Leu

Glu

Asp

Pro

Ala

65

70

75

80

Ser

Arg

Asp

Leu

Val

Val

Ser

Tyr

Val

Asn

Thr

Asn

Met

Gly

Leu

Lys

85

90

95

Phe

Arg

Gin

Leu

Leu

Trp

Phe

His

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Arg

100

105

110

Glu

Thr

Val

Ile

Glu

Tyr

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

115

120

125

Pro

Pro

Ala

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

Glu

Thr

Thr

Val

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Thr

145

150

155

160

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

165

170

175

Gin

Ser

Arg

Glu

Ser

Gin

Cys

180 <210> 3 <211> 552 <212>DNA <213> virus hepatitidy B <220>

<221>CDS to <222> (1)..(549) <300>

<303> Nucleic Acids Res. <304> 11 <306> 1747— <307>

<400>

a tg Met 1

gac Asp

att Ile

gac Asp

ccg Pro 5

tat Tyr

aaa Lys

gaa Glu

ttt Phe

gga Gly 10

gca Ala

tet Ser

gtg Val

gag Glu

tta Leu 15

ctc Leu

48

tet

ttt

ttg

cct

tet

gac

ttc

ttt

ccg

tet

att

ega

gat

ctc

ctt

gac

96

Ser

Phe

Leu

Pro

Ser

Asp

Phe

Phe

Pro

Ser

Ile

Arg

Asp

Leu

Leu

Asp

20

25

30

dCC

gcc

tet

get

ctg

tat

cgg

gag

gcc

tta

gag

tet

ccg

gaa

cat

tgt

144

Thr

Ala

Ser

Ala

Leu

Tyr

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Ser

Pro

Glu

His

Cys

35

40

45

tea

cct

cac

cat

aca

gca

ctc

agg

caa

get

att

ctg

tgt

tgg

ggt

gag

1 92

Ser

Pro

His

His

Thr

Ala

Leu

Arg

Gin

Ala

Ile

Leu

Cys

Trp

Gly

Glu

50

55

60

tta

atg

aat

ctg

gcc

acc

tgg

gtg

gga

agt

aat

ttg

gaa

gac

cca

gca

240

Leu

Met

Asn

Leu

Ala

Thr

Trp

Val

Gly

Ser

Asn

Leu

Glu

Asp

Pro

Ala

65

70

75

80

ccc

agg

gaa

tta

gta

gtc

age

tat

gtc

aat

gtt

aat

atg

ggc

cta

aaa

288

Ser

Arg

Glu

Leu

Val

Val

Ser

Tyr

Val

Asn

Val

Asn

Met

Gly

Leu

Lys

85

90

95

atc

aga

caa

cta

ttg

tgg

ttt

cac

att

tec

tgc

ctt

act

ttt

gga

aga

336

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu

Trp

Phe

His

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Arg

100

105

110

gaa

act

gtt

ttg

gag

tat

ttg

gta

tet

ttt

gga

gtg

tgg

att

ege

act

384

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

115

120

125

cct

ccc

get

tac

aga

cca

cca

aat

gcc

cct

atc

tta

tea

aca

ctt

ccg

432

Pro

Pro

Ala

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

gaa

act

act

gtt

gtt

aga

ega

ega

ggc

agg

tcc

cct

aga

aga

aga

act

480

Glu

Thr

Thr

Val

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Thr

145

150

155

160

ccc

tcg

cct

ege

aga

ega

agg

tet

caa

tcg

ccg

cgt

ege

aga

aga

tet

523

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

165

170

175

-32CZ 302092 B6 caa tet cgg gaa tet caa tgt tag Gin Ser Arg Glu Ser Gin Cys

180 <210> 4 <211> 183 <212> PRT <213> virus hepatitidy B <400> 4

552

Met 1

Asp

Ile

Asp

Pro 5

Tyr

Lys Glu

Phe Gly Ala Ser Val Glu Leu Leu

10

15

Ser

Phe

Leu

Pro

Ser

Asp

Phe

Phe

Pro

Ser

Ile

Arg

Asp

Leu

Leu

Asp

20

25

30

Thr

Ala

Ser

Ala

Leu

Tyr

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Ser

Pro

Glu

His

Cys

35

40

45

Ser

Pro

His

His

Thr

Ala

Leu

Arg

Gin

Ala

Ile

Leu

Cys

Trp

Gly

Glu

50

55

60

Leu

Met

Asn

Leu

Ala

Thr

Trp

Val-

Gly

Ser

Asn

Leu

Glu

Asp

Pro

Ala

65

70

75

80

Ser

Arg

Glu

Leu

Val

val

Ser

Tyr

Val

Asn

val

Asn

Met

Gly

Leu

Lys

85

90

95

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu

Trp

Phe

His

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Arg

100

105

110

Glu

Thr

Val

Leu

Glu

Tyr

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

115

120

125

Pro

Pro

Ala

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

3 35

140

Glu

Thr

Thr

Val

Val

Arg

Arg

Arg

Gly

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Thr

145

150

155

160

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

165

170

175

Gin

Ser

Arg

Glu

Ser

Gin

Cys

180

<210>5

<211> 558 <212> DNA <213> virus hepatitidy B <220>

<221>COS <222> (1)..(555) <300>

io <3O3> Nucleic Acids Res. <304> 11 <3O6> 1747— <3O7> 1983 is <400> 5

a tg Met 1

gac Asp

att Ile

gac Asp

cct Pro 5

tat Tyr

aaa Lys

gaa Glu

ttt Phe

gga Gly 10

gct Ala

act Thr

gtg Val

gag Glu

tta Leu 15

ctc Leu

48

tcg

ttt

ttg

cct

tet

gac

ttc

ttt

cct

tcc

gta

ega

gat

ctc

cta

gac

96

Ser

Phe

Leu

Pro

Ser

Asp

Phe

Phe

Pro

Ser

Val

Arg

Asp

Leu

Leu

Asp

20

25

30

acc

gcc

tca

gct

ctg

tat

cqa

gaa

gcc

tta

gag

tet

cct

gag

cat

tgc

144

Thr

Ala

Ser

Ala

Leu

Tyr

Arg

Gl u

Ala

Leu

Glu

Ser

Pro

Glu

His

Cys

35

40

45

tca

cct

cac

cat

act

gca

ctc

agg

caa

gcc

att

ctc

tgc

tgg

ggg

gaa

192

Ser

Pra

His

His

Thr

Ala

Leu

Arg

Gin

Ala

Ile

Leu

Cys

Trp

Gly

Glu

50

55

60

ttg

atg

act

cta

gct

acc

tgg

gtg

ggt

aat

aat

ttg

caa

gat

cca

gca

240

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Thr

Trp

Val

Gly

Asn

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Ala

65

70

75

80

tcc

aga

ga t

cta

gta

gtc

aat

tat

gtt

aat

act

aac

atg

ggt

tta

aag

288

Ser

Arg

Asp

Leu

Val

Val

Asn

Tyr

Val

Asn

Thr

Asn

Met

Gly

Leu

Lys

85

90

95

atc

agg

caa

cta

ttg

tgg

ttt

cat

ata

tet

tgc

ctt

act

ttt

gga

aga

336

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu

Trp

Phe

His

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Arg

100

105

110

gag

act

gta

ctt

gaa

tat

ttg

gtc

tet

ttc

gga

gtg

tgg

att

ege

act

384

-34CZ 302092 B6

Glu Thr Val

Leu Glu Tyr

Leu Val 120

Ser

Phe

Gly Val

Trp 125

Ile Arg

Thr

115

cct

cca

gcc

tat

aga

cca

cca

aat

gcc

cct

atc

tta

tea

aca

ctt

ccg

432

Pro

Pro

Ala

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

gaa

act

act

gtt

gtt

aga

ega

cgg

gac

ega

ggc

agg

tec

cct

aga

aga

480

Glu

Thr

Thr

val

Val

Arg

Arg

Arg

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

145

150

155

160

aga

act

ccc

tcg

cct

ege

aga

ege

aga

tet

caa

tcg

ccg

cgt

ege

aga

528

Arg

Thr

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

165

170

175

aga

tet

caa

tet

cgg

gaa

tet

caa

tgt

tag

558

Arg

Ser

Gin

Ser

Arg

Glu

Ser

Gin

Cys

180

185

<210>6 <2H> 185 <212> PRT <213> virus hepatitidy B

<400>6

Asp

Pro Tyr 5

Lys Glu Phe Gly Ala Thr Val Glu Leu

Leu

Met Asp 1

Ile

10

15

Ser

Phe

Leu

Pro

Ser

Asp

Phe

Phe

Pro

Ser

Val

Arg

Asp

Leu

Leu

Asp

20

25

30

Thr

Ala

Ser

Ala

Leu

Tyr

Arg

Glu

Ala

Leu

Glu

Ser

Pro

Glu

His

Cys

35

40

45

Ser

Pro

His

His

Thr

Ala

Leu

Arg

Gin

Ala

Ile

Leu

Cys

Trp

Gly

Glu

50

55

60

Leu

Met

Thr

Leu

Ala

Thr

Trp

Val

Gly

Asn

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Ala

65

70

75

80

Ser

Arg

Asp

Leu

Val

Val

Asn

Tyr

Val

Asn

Thr

Asn

Met

Gly

Leu

Lys

85

90

95

Ile

Arg

Gin

Leu

Leu

Trp

Phe

His

Ile

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Arg

100

105

110

-35CZ 302092 B6

Glu

Thr

Val 115

Leu

Glu

Tyr

Leu

Val 120

Ser

Phe

Gly

Val

Trp 125

Il.e

Arg

Thr

Pro

Pro

Ala

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

lle

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

Gl u

Thr

Thr

Val

Val

Arg

Arg

Arg

Asp

Arg

Gly

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

145

150

155

160

Arg

Thr

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

165

170

17 5

Arg

Ser

Gin

Ser

Arg

Glu

Ser

Gin

Cys

180 Ϊ85 <210> 7 <211> 188 <212> PRT <213> virus hepatitidy B <3()0>

<301 > Schodel, Florian et al., io <302> zvířecí virus hepatitidy B

<303

> Ad

v. Vi

ral 0

incol.

<304

>8

<306

>73-

-102

<307

> 1989

<400

> 7

Met

Asp

lle

Asp

Pro

Tyr

Lys

Glu

Phe

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gin

Leu

Leu

1

5

10

15

Asn

Phe

Leu

Pro

Lgu

Asp

Phe

Phe

Pro

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Val

Asp

20

25

30

Thr

Ala

Ala

Ala

Leu

Tyr

Glu

Glu

Glu

Leu

Thr

Gly

Arg

Glu

His

Cys

35

40

45

Ser

Pro

His

His

Thr

Ala

lle

Arg

Gin

Ala

Leu

Val

Cys

Trp

Asp

Glu

50

55

60

Leu

Thr

Lys

Leu

lle

Ala

Trp

Met

Ser

Ser

Asn

lle

Thr

Ser

Glu

Gin

65

7 0

75

80

-36CZ 302092 B6

Val Arg

Thr

Ile

Ile Val Asn His Val Asn Asp Thr Trp Gly Leu Lys

85

90

95

Val

Arg

Gin

Ser

Leu

Trp

Phe

His

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Gin

100

105

110

His

Thr

Val

Gin

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

115

120

125

Pro

Ala

Pro

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

130

135

140

Glu

His

Thr

Val

Ile

Arg

Arg

Arg

Gly

Gly

Ala

Arg

Ala

Ser

Arg

Ser

145

150

155

160

Pro

Arg

Arg

Arg

Thr

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

165

170

175

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Ser

Ala

Asn

Cys

180 185 <210>8 <211> 654 <212>DNA <213> virus hepatitidy B <220>

<221>CDS io <222> (1)..(651) <300>

<302> zvířecí virus hepatitidy B <303> Adv. Viral Oncol.

<304> 8 <306> 73-102 <307> 1989 <400> 8

atg	tat	ctt	ttt	cac
Met 1	Tyr	Leu	Phe	His 5
act	gtt	caa	gcc	tcc
Thr	Val	Gin	Ala 20	Ser

ctg	tgc	ctt	gtt	ttt	gcc
Leu	Cys	Leu	Val	Phe	Ala
				10

aag	ctg	tgc	ctt	gga	tgg
Lys	Leu	Cys	Leu	Gly	Trp
			25

tgt Cys	gtt Val	cca Pro	tgt Cys 15	cct Pro	48
ctt	tgg	gac	atg	gac	96
Leu	Trp	Asp	Met	Asp
		30

-37CZ 302092 B6

dta ile

gat Asp

ccc Pro 35

tat Tyr

aaa Lys

gaa Glu

ttt ggt

tet Ser

tet Ser

tat Tyr

cag Gin

ttg Leu 4 5

ttg Leu

aat Asn

ttt Phe

144

Phe

Gly 40

ctí

cct

ttg

gac

ttt

ttt

cct

gat

etc

aat

gca

ttg

gtg

gac

act

gct

192

Leu

Pro

Leu

Asp

Phe

Phe

Pro

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Val

Asp

Thr

Ala

50

55

60

gct

gct

ctt

tat

gaa

gaa

gaa

tta

aca

ggt

agg

gag

cat

tgt

tet

cct

240

Ala

Ala

Leu

Tyr

Glu

Glu

Glu

Leu

Thr

Gly

Arg

Glu

His

Cys

Ser

Pro

65

70

75

80

cat

cat

act

gct

att

aga

cag

gcc

tta

gtg

tgt

tgg

gaa

gaa

tta

act

288

Hí s

His

Thr

Ala

Ile

Arg

Gin

Ala

Leu

Val

Cys

Trp

Glu

Glu

Leu

Thr

85

90

95

aga

tta

att

aca

tgg

atg

agt

gaa

aat

aca

aca

gaa

gaa

gtt

aga

aga

336

Arg

Leu

Ile

Thr

Trp

Met

Ser

Glu

Asn

Thr

Thr

Clu

Glu

Val

Arg

Arg

100

105

110

ri i.t

rttt

gtt

gat

cat

gtc

aat

aat

act

tgg

gga

ctt

aaa

gta

aga

cag

384

Ile

Ile

Val

Asp

His

Val

Asn

Asn

Thr

Trp

Gly

Leu

Lys

Val

Arg

Gin

115

120

125

act

tta

tgg

ttt

cat

tta

tea

tgt

ctt

act

ttt

gga

caa

cac

aca

gtt

4 32

Thr

Leu

Trp

Phe

His

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Cly

Gin

HiS

Thr

Val

130

135

140

caa

gaa

ttt

ttg

gtt

agt

ttt

gga

gta

tgg

att

aga

act

cca

gct

cct

480

Gin

Glu

Phe

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

Pro

Ala

Pro

145

150

155

160

tat

aga

cca

cct

aat

gca

CCC

att

tta

tea

act

ctt

ccg

gaa

cat

aca

528

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Fro

Glu

His

Thr

165

170

17 5

gtc

atr.

agg

aga

aga

gga

ggt

tea

aga

gct

gct

agg

tcc

CCC

ega

aga

576

Val

Ile

Arg

Arg

Arg

Gly

Gly

Ser

Arg

Ala

Ala

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

ISO

185

1 90

cgc

set

CCC

tet

cct

ege

agg

aga

agg

tet

caa

tea

ccg

cgt

cgc

aga

624

Arg

Thr

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

195

200

205

cgc

tet

caa

tet

cca

gct

tcc

aac

t gc

tga

654

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Asn

Cys

210

215

38CZ 302092 B6 <210> 9 <211> 217 <212> PRT <213> virus hepatitidy B

<400>9

Phe

His 5

Leu

Cys

Leu

Val

Phe 10

Ala

Cys Val

Pro

Cys 15

Pro

Met 1

Tyr

Leu

Thr

Val

Gin

Ala

Ser

Lys

Leu

Cys

Leu

Gly

Trp

Leu

Trp

Asp

Met

Asp

20

25

30

Ile

Asp

Pro

Tyr

Lys

Glu

Phe

Gly

Ser

Ser

Tyr

Gin

Leu

Leu

Asn

Phe

35

40

45

Leu

Pro

Leu

Asp

Phe

Phe

Pro

Asp

Leu

Asn

Ala

Leu

Val

Asp

Thr

Ala

50

55

60

Ala

Ala

Leu

Tyr

Glu

Glu

Glu

Leu

Thr

Gly

Arg

Glu

His

Cys

Ser

Pro

65

70

75

80

His

His

Thr

Ala

Ile

Arg

Gin

Ala

Leu

Val

Cys

Trp

Glu

Glu

Leu

Thr

85

90

95

Arg

Leu

Ile

Thr

Trp

Met

Ser

Glu

Asn

Thr

Thr

Glu

Glu

val

Arg

Arg

100

105

110

Ile

Ile

Val

Asp

His

Val

Asn

Asn

Thr

Trp

Gly

Leu

Lys

Val

Arg

Gin

115

120

125

Thr

Leu

Trp

Phe

His

Leu

Ser

Cys

Leu

Thr

Phe

Gly

Gin

His

Thr

Val

130

135

140

Gin

GlU

Phe

Leu

Val

Ser

Phe

Gly

Val

Trp

Ile

Arg

Thr

Pro

Ala

Pro

145

150

155

160

Tyr

Arg

Pro

Pro

Asn

Ala

Pro

Ile

Leu

Ser

Thr

Leu

Pro

Glu

His

Thr

165

170

175

Val

Ile

Arg

Arg

Arg

Gly

Gly

Ser

Arg

Ala

Ala

Arg

Ser

Pro

Arg

Arg

180

185

190

Arg

Thr

Pro

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Arg

Arg

Arg

195

200

205

Arg

Ser

Gin

Ser

Pro

Ala

Ser

Asn

Cys

210

215

-39CZ 302092 B6 <210> 10 <21 1> 918 <212> DNA <213> virus hepatitidy B <220>

<221>CDS <222> (1)..(915) <400> 10

atg Met 1

tgg Trp

tet Ser

cta Leu

aga Arg 5

tta Leu

cac His

ccc Pro

tet Ser

cca Pro 10

ttc Phe

gga Gly

get Ala

gcg Ala

tgc Cys 15

caa Gin

48

ggt

atc

ttt

acg

tcg

acc

tcg

ctg

ttg

ttc

ctt

gtg

act

gta

cct

ttg

96

Gly

Ile

Phe

Thr

Ser

Thr

Ser

Leu

Leu

Phe

Leu

Val

Thr

Val

Pro

Leu

20

25

30

gta

tgt

acc

att

gtt

tat

gat

tet

tgc

tta

tat

atg

gat

gtc

aat

get

144

Val

Cys

Thr

Ile

Val

Tyr

Asp

Ser

Cys

Leu

Tyr

Met

Asp

Val

Asn

Ala

35

40

4 5

tca

aga

get

tta

gca

aat

gta

tat

gat

ctg

cca

gat

gat

ttc

ttt

cct

192

Ser

Arg

Ala

Leu

Ala

Asn

Val

Tyr

Asp

Leu

Pro

Asp

Asp

Phe

Phe

Pro

50

55

60

cag

att

gat

gat

ctt

gtt

aga

gat

get

aag

gat

get

tta

gaa

cct

tat

240

Gin

Ile

Asp

Asp

Leu

Val

Arg

Asp

Ala

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Pro

Tyr

65

70

75

80

tgg

aaa

gcc

gaa

aca

ata

aag

aaa

cat

gtt

tta

att

get

act

cac

ttt

288

Trp

Lya

Ala

Glu

Thr

Ile

Lys

Lys

His

Val

Leu

Ile

Ala

Thr

His

Phe

85

90

95

gtg

gat

ttg

att

gag

gac

ttc

tgg

cag

acc

act

cag

ggt

atg

age

caa

336

Val

Asp

Leu

Ile

Glu

Asp

Phe

Trp

Gin

Thr

Thr

Gin

Gly

Met

Ser

Gin

100

105

110

att

gca

gac

gcc

ctc

ega

gca

gta

att

cca

cct

act

acc

gta

cca

gta

384

*40

Ile

Ala

ASp 115

Ala

Leu

Arg Ala Val 120

Ile

Pro

Pro Thr Thr Val 125

Pro

Val

ccg

gag

ggt

ttt

ctc

att

act

cat

agt

gag

gca

gaa

gag

atc

ccc

ttg

432

Pro

Glu

Gly

Phe

Leu

Ile

Thr

His

Ser

Glu

Ala

Glu

Glu

Ile

Pro

Leu

130

135

140

aac

gat

ctc

ttt

tca

aat

caa

gag

gag

agg

ata

gtc

aat

ttc

caa

cct

480

Asn

Asp

Leu

Phe

Ser

Asn

Gin

Glu

Glu

Arg

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Pro

145

150

155

160

gac

tat

ccc

att

aca

get

aga

att

cat

acc

cac

tta

cgt

gtt

tat

act

528

Asp

Tyr

Pro

ile

Thr

Ala

Arg

Ile

His

Thr

His

Leu

Arg

Val

Tyr

Thr

165

170

175

aaa

ttg

aat

gaa

caa

get

ttg

gac

aaa

get

ege

aga

ttg

ctt

tgg

tgg

576

Lys

Leu

Asn

Glu

Gin

Ala

Leu

Asp

Lys

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

Trp

180

185

190

cat

tac

aat

tgc

ctc

ctc

tgg

gga

gaa

gcc

act

gtt

aca

aat

tat

att

624

His

Tyr

Asn

Cys

' Leu

Leu

Trp

Gly

Glu

Ala

Thr

Val

Thr

Asn

Tyr

Ile

195

200

205

tet

ege

ctc

cgt

act

tgg

ctt

tet

act

ccc

gaa

aaa

tat

ega

ggc

aag

672

Ser

Arg

Leu

Arg

Thr

Trp

Leu

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Tyr

Arg

Gly

Lys

210

215

220

gat

gcc

cca

acc

att

gaa

gca

atc

act

aga

cca

atc

cag

gtg

get

caa

720

Asp

Ala

Pro

Thr

Ile

Glu

Ala

Ile

Thr

Arg

Pro

Ile

Gin

Val

Ala

Gin

225

230

235

240

gga

ggc

aga

aat

caa

act

aag

gga

act

aga

aaa

cct

cgt

gga

ctc

gaa

768

Gly

Gly

Arg

Asn

Gin

Thr

Lys

Gly

Thr

Arg

Lys

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

245

250

255

cct

aga

aga

ega

aag

gtt

aaa

acc

aca

gtt

gtc

tat

ggg

aga

aga

cgt

816

Pro

Arg

Arg

Arg

Lys

Val

Lys

Thr

Thr

Val

Val

Tyr

Gly

Arg

Arg

Arg

2 60

265

270

tet

aag

tec

ega

ggc

agg

aga

tcc

tet

cca

tcc

caa

cgt

gcg

ggc

tcc

864

Ser

Lys

Ser

Arg

Gly

Arg

Arg

Ser

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Ala

Gly

Ser

275

280

285

cct

ctc

cca

cgt

aat

cgg

gga

aac

cag

aca

ega

tcc

ccc

tca

cct

agg

912

Pro

Leu

Pro

Arg

Asn

Arg

Gly

Asn

Gin

Thr

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Arg

290

295

300

-41 CZ 302092 B6 gaa tag

Glu

305 <210> 11 <21 1> 305 <212> PRT <213> virus hepatitidy B <400> 11

918

Met 1

Trp

Ser

Leu

Arg 5

Leu

His

Pro

Ser

Pro 10

Phe

Gly Ala

Ala

Cys 15

Gin

Gly

Ile

Phe

Thr

Ser

Thr

Ser

Leu

Leu

Phe

Leu

Val

Thr

Val

Pro

Leu

20

25

30

Val

Cys

Thr

Ile

Val

Tyr

Asp

Ser

Cys

Leu

Tyr

Met

Asp

Val

Asn

Ala

35

40

45

Ser

Arg

Ala

Leu

Ala

Asn

Val

Tyr

Asp

Leu

Pro

Asp

Asp

Phe

Phe

Pro

50

55

60

Gin

Ile

Asp

Asp

Leu

Val

Arg

Asp

Ala

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Pro

Tyr

65

70

75

80

Trp

Lys

Ala

Glu

Thr

Ile

Lys

Lys

His

Val

Leu

Ile

Ala

Thr

His

Phe

85

90

95

Val

Asp

Leu

Ile

Glu

Asp

Phe

Trp

Gin

Thr

Thr

Gin

Gly

Met

Ser

Gin

100

105

110

Ile

Ala

Asp

Ala

Leu

Arg

Ala

Val

Ile

Pro

Pro

Thr

Thr

Val

Pro

Val

115

120

125

Pro

Glu

Gly

Phe

Leu

Ile

Thr

His

Ser

Glu

Ala

Glu

Glu

Ile

Pro

Leu

130

135

140

Asn

Asp

Leu

Phe

Ser

Asn

Gin

Glu

Glu

Arg

Ile

Val

Asn

Phe

Gin

Pro

145

150

155

160

Asp

Tyr

Pro

Ile

Thr

Ala

Arg

Ile

His

Thr

His

Leu

Arg

Val

Tyr

Thr

165

170

175

Lys

Leu

Asn

Glu

Gin

Ala

Leu

Asp

Lys

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

Trp

180

185

190

-42 CZ 302092 B6

His Tyr Asn Cys Leu

Leu Trp

Gly Glu Ala Thr Val Thr Asn Tyr Ile

195

200

205

Ser

Arg

Leu

Arg

Thr

Trp

Leu

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Tyr

Arg

Gly

Lys

210

215

220

Asp

Ala

Pro

Thr

Ile

Glu

Ala

Ile

Thr

Arg

Pro

Ile

Gin

Val

Ala

Gin

225

230

235

240

Gly

Gly

Arg

Asn

Gin

Thr

Lys

Gly

Thr

Arg

Lys

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

245

250

255

Pro

Arg

Arg

Arg

Lys

Val

Lys

Thr

Thr

Val

Val

Tyr

Gly

Arg

Arg

Arg

260

2 65

270

Ser

Lys

Ser

Arg

Gly

Arg

Arg

Ser

Ser

Pro

Ser

Gin

Arg

Ala

Gly

Ser

275

280

285

Pro

Leu

Pro

Arg

Asn

Arg

Gly

Asn

Gin

Thr

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Arg

290 295 300

Glu

305 <210> 12 <2ll>918 s <212> DNA <213> virus hepatitidy B

<220> <221>CDS <222> (1)..(915)

<400> 12

atg tgg

aac

tta

aga

att

aca

ccc

ctc

tcc

ttc

gga

get

get

tgc

caa

Met Trp

Asn

Leu

Arg

Ile

Thr

Pro

Leu

Ser

Phe

Gly

Ala

Ala

Cys

Gin

1

5

10

15

ggt atc

ttt

acg

tet

aca

ttg

ctg

ttg

tcg

tgt

gtg

act

gta

cct

ttg

Gly Ile

Phe

Thr

Ser

Thr

Leu

Leu

Leu

Ser

Cys

Val

Thr

Val

Pro

Leu

20

25

30

gta tgt

acc

att

gtt

tat

gat

tet

tgc

tta

tat

atg

gat

atc

aat

get

Val Cys

Thr

Ile

Val

Tyr

Asp

Ser

Cys

Leu

Tyr

Met

Asp

Ile

Asn

Ala

35

40

45

-43 CZ 302092 B6

T.Ct B (1 r

aga Arg ‘jíl

gcc Ala

tta Leu

gcc Ala

aat Asn

gtg Val 55

tat Tyr

gat Asp

cta Leu

cca Pro

gat Asp 60

gat Asp

ttc Phe

ttt Phe

cca Pro

192

aaa

ata

gat

gat

ctt

gtt

aga

gat

get

aaa

gac

get

tta

gag

cct

tat

240

Lys

Ile

Asp

Asp

Leu

Val

Arg

Asp

Ala

Lys

Asp

Ala

Leu

Glu

Pro

Tyr

65

70

75

80

tgg

a aa

tea

gat

tea

ata

aag

aaa

cat

gtt

ttg

att

gca

act

cac

ttt

288

Trp

Lys

Ser

Asp

Ser

Ile

Lys

Lys

His

Val

Leu

Ile

Ala

Thr

His

Phe

85

90

95

gtg

(jat

ctc

att

gaa

gac

ttc

tgg

cag

act

aca

cag

ggc

atg

cat

gaa

336

Val

Asp

Leu

Ile

Glu

Asp

Phe

Trp

Gin

Thr

Thr

Gin

Gly

Met

His

Glu

100

105

110

a t a

gcc

gaa

tea

tta

aga

get

gtt

ata

cct

ccc

act

act

act

cct

gtt

384

Ile

Ala

Glu

Ser

Leu

Arg

Ala

Val

Ile

Pro

Pro

Thr

Thr

Thr

Pro

Val

115

120

125

cca

ccg

ggt

tat

ctt

att

cag

cac

gag

gaa

get

gaa

gag

ata

cct

ttg

432

Pro

Pro

Gly

Tyr

Leu

Ile

Gin

His

Glu

Glu

Ala

Glu

Glu

Tle

Pro

Leu

130

135

140

gga

gat

tta

ttt.

aaa

cac

caa

gaa

gaa

agg

ata

gta

agt

ttc

caa

ccc

480

Gly

Asp

Leu

Phe

Lys

His

Gin

Glu

Glu

Arg

Ile

Val

Ser

Phe

Gin

Pro

.14 5

150

155

160

gac

tat

ccg

att

a cg

get

aga

att

cat

get

cat

ttg

3 del

get

tat

gca

528

Asp

Tyr

Pro

Ile

Thr

Ala

Arg

Ile

His

Ala

His

Leu

Lys

Ala

Tyr

Ala

165

170

175

aaa

att

aac

gag

gaa

tea

ctg

gat

agg

get

agg

aga

ttg

ctt

tgg

tgg

576

Lys

Ile

Asn

Glu

Glu

Ser

Leu

Asp

Arg

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

Trp

180

185

190

cat

tac

aac

tgt

tta

ctg

tgg

gga

gaa

get

caa

gtt

act

aac

tat

att

624

His

Tyr

Asn

Cys

Leu

Leu

Trp

Gly

Glu

Ala

Gin

Val

Thr

Asn

Tyr

Ile

195

200

205

tet

cgt

ttg

cgt

act

tgg

ttg

tea

act

cct

gag

aaa

tat

aga

ggt

aga

672

Ser

Arg

Leu

Arg

Thr

Trp

Leu

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Tyr

Arg

Gly

Arg

210

215

220

gat

gcc

ccg

acc

att

gaa

gca

atc

act

aga

cca

atc

cag

gtg

get

cag

720

Asp 225

Ala

Pro

Thr

lle

Glu 230

Ala

lle

Thr

Arg

Pro 235

lle

Gin

Val

Ala

Gin 240

gga

ggc

aga

aaa

aca

act

acg

ggt

act

aga

aaa

cct

cgt

gga

ctc

gaa

768

Gly

Gly

Arg

Lys

Thr 245

Thr

Thr

Gly

Thr

Arg 250

Lys

Pro

Arg

Gly

Leu 255

Glu

cct

aga

aga

aga

aaa

gtt

aaa

acc

aca

gtt

gtc

tat

ggg

aga

aga

cgt

816

Pro

Arg

Arg

Arg 260

Lys

Val

Lys

Thr

Thr 2 65

Val

Val

Tyr

Gly

Arg 270

Arg

Arg

tca

aag

tcc

cgg

gaa

agg

aga

gcc

cct

aca

CCC

caa

cgt

gcg

ggc

tcc

864

Ser

Lys

Ser 275

Arg

Glu

Arg

Arg

Ala 280

Pro

Thr

Pro

Gin

Arg 285

Ala

Gly

Ser

cct

ctc

cca

cgt

agt

tcg

agc

agc

cac

cat

aga

tet

CCC

tcg

cct

agg

912

Pro

Leu 2 90

Pro

Arg

Ser

Ser

Ser 295

Ser

His

HiS

Arg

Ser 300

Pro

Ser

Pro

Arg

aaa taa 918

Lys

305 <210> 13 <211> 305 <212> PRT <213> virus hepatitidy B <400> 13

Met Trp Asn Leu Arg lle Thr Pro Leu Ser Phe Gly Ala Ala Cys Gin 15 10 15

Gly lle Phe Thr Ser Thr Leu Leu Leu Ser Cys Val Thr Val Pro Leu 20 25 30

Val Cys Thr lle Val Tyr Asp Ser Cys Leu Tyr Met Asp lle Asn Ala 35 40 45

Ser Arg Ala Leu Ala Asn Val Tyr Asp Leu Pro Asp Asp Phe Phe Pro 50 55 60

Lys lle Asp Asp Leu Val Arg Asp Ala Lys Asp Ala Leu Glu Pro Tyr 65 70 75 80

Trp Lys Ser Asp Ser lle Lys Lys His Val Leu lle Ala Thr His Phe 85 90 95

-45CZ 302092 B6

Val

Asp

Leu

Ile Glu Asp Phe Trp Gin Thr Thr Gin Gly Met His

Glu

100

105

110

Ile

Ala

Glu

Ser

Leu

Arg

Ala

Val

Ile

Pro

Pro

Thr

Thr

Thr

Pro

Val

115

120

125

Pro

Pro

Gly

Tyr

Leu

Ile

Gin

His

Glu

Glu

Ala

Glu

Glu

Ile

Pro

Leu

130

135

140

Gly

Asp

Leu

Phe

Lys

His

Gin

Glu

Glu

Arg

Ile

Val

Ser

Phe

Gin

Pro

145

150

155

160

Asp

Tyr

Pro

Ile

Thr

Ala

Arg

Ile

His

Ala

His

Leu

Lys

Ala

Tyr

Ala

165

170

175

Lys

Ile

Asn

Glu

Glu

Ser

Leu

Asp

Arg

Ala

Arg

Arg

Leu

Leu

Trp

Trp

180

185

190

His

Tyr

Asn

Cys

Leu

Leu

Trp

Gly

Glu

Ala

Gin

Val

Thr

Asn

Tyr

Ile

195

200

205

Ser

Arg

Leu

Arg

Thr

Trp

Leu

Ser

Thr

Pro

Glu

Lys

Tyr

Arg

Gly

Arg

210

215

220

Asp

Ala

Pro

Thr

Ile

Glu

Ala

Ile

Thr

Arg

Pro

Ile

Gin

Val

Ala

Gin

225

230

235

240

Gly

Gly

Arg

Lys

Thr

Thr

Thr

Gly

Thr

Arg

Lys

Pro

Arg

Gly

Leu

Glu

245

250

255

Pro

Arg

Arg

Arg

Lys

Val

Lys

Thr

Thr

Val

Val

Tyr

Gly

Arg

Arg

Arg

260

265

270

Ser

Lys

Ser

Arg

Glu

Arg

Arg

Ala

Pro

Thr

Pro

Gin

Arg

Ala

Gly

Ser

275

280

285

Pro

Leu

Pro

Arg

Ser

Ser

Ser

Ser

His

His

Arg

Ser

Pro

Ser

Pro

Arg

290 295 300 <210> 14 <211> 37 <212>PRT <213> Influenza virus <400> 14

Ser Ile Met Arg Ser

Asp

Ala Pro

Ile Gly 10

Thr Cys

Ser Ser

Glu 15

Cys

1

5

Ile Thr Pro

Asn Gly

Ser

Ile

Pro

Asn

Asp

Lys

Pro

Phe

Gin

Asn

val

20

25

30

Asn Lys Ile

Thr Tyr

35

<210> 15 <211> 29 <212> PRT

<213> Influenza virus

<400> 15 Arg Gly Ile

Phe Gly

Ala

Ile

Ala

Gly

Phe

Ile

Glu

Asn

Gly

Trp

Glu

1

5

10

15

Gly Met Ile

Asp Gly

Trp

Tyr

Gly

Phe

Arg

His

Gin

Asn

<210> 16 <211> 10 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 16

Glu Lys Gin Thr Arg Gly Ile Phe Gly Ala 15 10 <210>17 <211> 23 <212>DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> Description of Artificial Sequence: Hepatitis B virus PCR primer with an Ncol restriction site <400> 17 ttgggccatg gacatcgacc tta 23 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: primery PCR s restrikčním místem Ncol viru hepatitidy B

-47CZ 302092 B6 <400> 18 gcggaatLcc atcttccaaa ttaacaccca c 31 <210> 19 <211>4l <212> DNA <213> Artifícial Sequence <220>

ío <223> popis syntetické sekvence: příměry PCR s restrikčním místem EcoRl viru hepatitidy B <400> 19 cgcgaattca aaaagagctc ccagcgtcta gagagaccta g 41 <210> 20 <2ll>31 <212> DNA <213> syntetická sekvence ío <220>

<223> popis syntetické sekvence: primery PCR s restrikčními místy EcoRl a Sací viru hepati tidy B a začleněným lyzinovým kodonem <400> 20 cgcaagctta uacaacagta gtctccggaa g 31 <2IO> 21 <21l> 14 <212> PRT ío <213> Hepatitis B virus <400> 21

Cys Gin Glu Lys Gin Leu Asp Glu Asn Ala Asn Val Gin Leu 1 5 10 <2I0>22 <211> 13 <212> PRT <213> Hepatitis B virus <400> 22

Cys Ser Lys Lys Gly Pro Arg Ala Ser Gly Asn Leu Tle 15 10 <210> 23 <211> 19 <212>PRT <213> Hepatitis B virus <400> 23

-48CZ 302092 B6

Cys Leu Thr Glu His Arg Met Thr Trp Asp Pro Ala Gin Pro Pro Arg 15 10 15

Asp Leu Thr <210> 24 <211> 22 <212>PRT <213> Hepatitis B virus <400> 24

Cys Val Lys Arg Met Lys Glu Ser Arg Leu Glu Asp Thr Gin Lys His 15 10 15

Arg Val Asp Phe Leu Gin 20 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae 15 <300>

<310> EP-0 786 521-A <400> 25

Lys Leu Glu Glu Leu Ser Asp Lys Ile Asp Glu Leu Asp Ala Glu 15 10 15 <210> 26 <211> 35 <212> PRT <213> Streptococcus pneumoniae <300>

<310> EP-0 786 521-A <400> 26

Gin Lys Lys Tyr Asp Glu Asp Gin Lys Lys Thr GLu Glu Lys Ala Ala 15 10 15

Leu Glu Lys Ala Ala Ser Glu Glu Met Asp Lys Ala Val Ala Ala Val 20 25 30

Gin Gin Ala <210> 27 <211> 31 <212>PRT

-49CZ 302092 B6 <213> Cryptosporidium parvum <300>

<310> WO 98/07320 s

<400> 27

Gin Asp Lys Pro Ala Asp Ala Pro Ala Ala Glu Ala Pro Ala Ala Glu 15 10 15

Pro Ala Ala Glu Pro Ala Ala Gin Gin Asp Lys Pro Ala Asp Ala 20 25 30 <210> 28 io <211>16 <212> PRT <213>H1V <300>

is <310> US 5 639 854 <400> 28

Gly Pro Lys Glu Pro Phe Arg Asp Tyr Val Asp Arg Phe Tyr Lys Cys 15 10 15 io <210> 29 <211> 17 <212> PRT <213> HIV <300>

<310> WO 98/07320 <400> 29

Arg Lys Arg Ile His Ile Gly Pro Gly Arg Ala Phe Tyr Ile Thr Lys 15 10 15

Asn <210> 30 <211> 31 <212> PRT <213> FMDV <300>

<310> US 4 544 500 <400> 30

Tyr Asn Gly Glu Cys Arg Tyr Asn Arg Asn Ala Val Pro Asn Leu Arg 15 10 15

Gly Asp Leu Gin Val Leu Ala Gin Lys Val Ala Arg Thr Leu Pro 40 20 25 30

-50CZ 302092 B6 <210> 31 <211> 17 <212> PRT <213> Corynebacterium diphtheriae <300>

<3t0> EP-0 399 011—Bl <400> 31

Phe Gin Val Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly 15 10 15

Cys <210> 32 <211> 25 <212> PRT <213> Borrelía burgdorferi <300>

<301 > Bockenstedt, L. K. et al., <303> J. Immunol.

<304> 157 <305> 12 <306> 5496<307>(1966) <400> 32

Val Glu lle Lys Glu Gly Thr Val Thr Leu Lys Arg Glu lle Asp Lys 15 10 15

Asn Gly Lys Val Thr Val Ser Leu Cys 20 25 <210> 33 <211> 19 <212> PRT <213> Borrelía burgdorferi <300>

<301> Zhong, W. et al., <303> Eur. J. Immunol. <304> 26 <3O5> 11 <306> 2749<307> 1996 <400> 33

-51 CZ 302092 B6

Thr Leu Ser Lys Asn Ile Ser Lys Ser Gly Glu Val Ser Val Glu Leu 15 10 15

Asn Asp Cys <210> 34 <211> 11 s <212>PRT <213> lnfluenza A virus <300>

<301> Brumeanu, T. D. io <303> Immunotechnology <304> 2 <3O5> 2 <306> 85<307> (1996) <400> 34

Ser Ser Val Ser Ser Phe Glu Arg Phe Glu Cys 15 10 <210> 35 <211>10 <212> PRT <213> lnfluenza A virus <300>

<301> Brumeanu, T. D.

<303> Immunotechnology <304> 2 <305> 2 <306> 85— <307>(1996) <400> 35

Tyr Arg Asn Leu Leu Trp Leu Thr Glu Lys 1 5 10 <210>36 <211> 142 <212> PRT <213> Yersinia pestis <300>

<301> Hill, J. et al., <303> lnfect. Immun.

<304> 65 <305> 11 <306> 4476<307> (1997) <400> 36

-52CZ 302092 B6

Asp Ile 1

Leu

Lys

Val 5

Ile Val Asp

Ser Met Asn His His Gly Asp Ala

10

15

Arg

Ser

Lys

Leu

Arg

Glu

Glu

Leu

Ala

Glu

Leu

Thr

Ala

Glu

Leu

Lys

20

25

30

Ile

Tyr

Ser

Val

Ile

Gin

Ala

Glu

Ile

Asn

Lys

His

Leu

Ser

Ser

Ser

35

40

45

Gly

Thr

Ile

Asn

Ile

His

Asp

Lys

Ser

Ile

Asn

Leu

Met

Asp

Lys

Asn

50

55

60

Leu

Tyr

Gly

Tyr

Thr

Asp

Glu

Glu

Ile

Phe

Lys

Ala

Ser

Ala

Glu

Tyr

65

70

75

80

Lys

Ile

Leu

Glu

Lys

Met

Pro

Gin

Thr

Thr

Ile

Gin

Val

Asp

Gly

Ser

85

90

95

Glu

Lys

Lys

Ile

Val

Ser

Ile

Lys

Asp

Phe

Leu

Gly

Ser

Glu

Asn

Lys

100

105

110

Arg

Thr

Gly

Ala

Leu

Gly

Asn

Leu

Lys

Asn

Ser

Tyr

Ser

Tyr

Asn

Lys

115

120

125

Asp

Asn

Asn

Glu

Leu

Ser

His

Phe

Ala

Thr

Thr

Cys

Ser

Asp

130 135 140 <210> 37 <211> 19 s <212> PRT <213> Haemophilus influenzae

<300> <310> EP-0 432 220-B1
<400> 37 Cys Ser Ser Ser Asn Asn Asp Ala Ala Gly Asn 15 10	Gly Ala Ala Gin Phe 15

Gly Gly Tyr <210> 38 15 <211> 11 <212> PRT <213> Haemophilus influenzae <300>

<310> EP-0 432 220-B1 <400> 38

Asn Lys Leu Gly Thr Val Ser Tyr Gly Glu Glu 15 10 <2I0>39 <211> 16 <212> PRT <213> Haetnophilus influenzae io <300>

<310> EP-0 432 220-B1 <400> 39

Asn Asp Glu Ala Ala Tyr Ser Lys Asn Arg Arg Ala Val Leu Ala Tyr 15 10 15 <210> 40 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis <300>

<310> WO 98/06851 <400> 40

Leu Asp Ile Glu Lys Asp Lys Lys Lys Arg Thr Asp Glu Gin Leu Gin 15 10 15

Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr

20 25 <210> 41 <211> 28 <212> PRT io <213> Moraxella catarrhalis <300>

<310> WO 98/06851 <400>4I

Leu Asp Ile Glu Lys Asn Lys Lys Lys Arg Thr Glu Ala Glu Leu Gin 15 10 15

Ala Glu Leu Asp Asp Lys Tyr Ala Gly Lys Gly Tyr 20 25 <210> 42 <211> 28 <212> PRT <213> Moraxella catarrhalis

-54CZ 302092 B6 <300>

<310> WO 98/06851 <400> 42

Ile Asp Ile Glu Lys Lys Gly Lys Ile Arg Thr Glu Ala Glu Leu Leu 15 10 15

Ala Glu Leu Asn Lys Asp Tyr Pro Gly Gin Gly Tyr ^{20 25} <210> 43 <211> 25 <212> PRT io <213> Porphyromonas gingivalis <300>

<304> 110 <3O5> 2 <306> 285— <307> 1997 <400> 43

Gly Val Ser Pro Lys Val Cys Lys Asp Val Thr Val Glu Gly Ser Asn 15 10 15

Glu Phe Ala Pro Val Gin Asn Leu Thr 20 25 <210> 44 <211> 20 <212> PRT <213> Porphyromonas gingivalis <300>

<304> 110 <305> 2 <306> 285— <307> 1997 <400> 44

Arg Ile Gin Ser Thr Trp Arg Gin Lys Thr Val Asp Leu Pro Ala Gly 15 10 15

Thr Lys Tyr Val 20 <210>45 <211> 20 <212> PRT <213> Trypanosoma cruzi <300>

-55CZ 302092 B6 <304> 159 <305> 9 <306> 4444<307>(1997) <400> 45

Ser His Asn Phe Thr Leu Val Ala Ser Val Ile Ile Glu Ala Pro Ser 15 10 15

Gly Asn Thr Cys 20 <210> 46 io <2ll>21 <212> PRT <213> Trypanosoma eruzi <300>

<310> WO 97/18475 <400> 46

Lys Ala Ala Ile Ala Pro Ala Lys Ala Ala Ala Ala Pro Ala Lys Ala 15 10 15

Ala Thr Ala Pro Ala 20 <2í0> 47 <211> 16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <300 <303> Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.

<304> 114 <305> l <306> 1550 <400 47

Ser Val Gin Ile Pro Lys Val Pro Tyr Pro Asn Gly Ile Val Tyr Cys 15 10 15 <210>48 <211>16 <212> PRT <213> Plasmodium falciparum <300>

<303> Int. Arch. Allergy Appl. Immunol.

<304> 114 <305> 1 <306> 15- 56CZ 302092 B6 <400> 48

Asp Phe Asn His Tyr Tyr Thr Leu Lys Thr Gly Leu GLu Ala Asp Cys 15 10 15 <210> 49 5 <211>16 <212> PRT <213> Streptococcus sobrinus <300>

io <303> Arch. Oral Bioi.

<304> 35 <306> Suppl. 475<307>(1990) ls <400> 49

Lys Pro Arg Pro Ile Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gin Asn Gin Lys Cys 15 10 15 <210> 50 <211> 17 io <212>PRT <213> Streptococcus sobrinus <300>

<303> Arch. Oral Bioi.

<304>35 <306> Suppl. 475— <307>(l990) <400> 50

Ala Lys Ala Asp Tyr Glu Ala Lys Leu Ala Gin Tyr Glu Lys Asp Leu 15 10 15 ^C*^S <210> 51 <211> 16 <212> PRT <213> Lymphocytic.choriomeningitis virus <300>

<303> Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A.

<304> 94 <3O5> 7 <306> 3314<307>(1997) <400>51

Arg Pro Gin Ala Ser Gly Val Tyr Met Gly Asn Leu Thr Ala Gin Cys <210> 52

-57CZ 302092 B6 <211>9 <212> PRT <213> Shigella flexneri <300>

<3O3> J. Biol. Chem.

<304> 271 <3O5> 52 <306> 33670io <307> (1996) <400> 52

Lys Asp Arg Thr Leu Ile Glu Gin Lys 1 5 <210>53 <211> 15 <212> PRT <213> respirační syncitiální virus

2o <300>

<304> 234 <3O5> 1 <306> 118<307> 1997 <400> 53

Cys Ser Ile Cys Ser Asn Asn Pro Thr Cys Třp Ala Ile Cys Lys 15 10 15 <210> 54 <211> 19 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <300>

<303> Vaccíne <304> 15 <305> 4 <306> 377<307> 1997 <400> 54

Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gin Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gin 15 10 15

Pro Ala Gly <210> 55 <211>16 <212> PRT <213> Clostridium tetani

- 58 CZ 302092 B6 <300>

<303> Vaccine <304> 15 <305> 4 <306> 377<307> 1997 <400> 55

Gin Tyr Ile Lys Ala Asn Ser Lys Phe Ile Gly Ile Thr Glu Leu Cys 15 10 15 <210> 56 <211> 25 <212> PRT <213> Entamoeba histolytica 15 <300>

<303>J. Exp. Med.

<304> 185 <3O5> 10 <306> 1793<307> 1997 <400> 56

Val Glu Cys Ala Ser Thr Val Cys Gin Asn Asp Asn Ser Cys Pro Ile 15 10 15

Ile Ala Asp Val Glu Lys Cys Asn Gin 20 25 <210> 57 <211> 34 <212> PRT <213> Schistosoma japonicum <300>

<303> Vaccine <304> 15 <305> 1 <306> 79<307> 1997 <400> 57

Asp Leu Gin Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Gly Glu Leu Ile 15 10 15

Arg Arg Ala Lys Ser Ala Glu Ser Leu Ala Ser Glu Leu Gin Arg Arg 20 25 30 <210> 58 <211> 34 <212> PRT <213> Schistosoma mansoni

-59CZ 302092 B6 <300>

<3O3> Vaccine <304> 15 <3O5> l <306> 79 <3O7> 1997 <400> 58

Asp Leu Gin Ser Glu Ile Ser Leu Ser Leu Glu Asn Ser Glu Leu Ile 15 10 15

Arg Arg Ala Lys Ala Ala Glu Ser Leu Ala Ser Asp Leu Gin Arg Arg _l() 20 25 30 <210> 59 <211> 63 <212>DNA ís <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: místo rozeznávané restrikční endonukleázou Msel začleněné do sekvence hepatitidy B divokého typu do polohy 75 <220>

<221>CDS <222> (3)..(63) <400> 59

get

acc tgg

gtg

ggt gtt

aat

ttg

gaa

gat

cca gcg

tet

aga

gac

cta

48

Ala

Thr Trp

Val

Gly Val

Asn

Leu

Glu

Asp

Pro Ala

Ser

Arg

Asp

Leu

1

5

10

15

gta	gtc	agt	tat	gtc	63
Val	Val	Ser	Tyr	Val

<210> 60 <211> 21 io <212>PRT <213> syntetická sekvence <400> 60

Ala Thr Trp Val Gly Val Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Leu 15 10 15

Val Val Ser Tyr Val 20 <210> 61 <211> 41 <212> DNA

-60CZ 302092 B6 <213> syntetická sekvence <220>

<223> Popis syntetické sekvence: K se začleněný do aminokyseliny v poloze 75 jaderného proteinu hepatitidy B <220>

<221>CDS <222> (1)..(39) <400 61 gct acc tgg gtg ggt gtt aaa aat ttg gaa gat cca gcg tc 41

Ala Thr Trp Val Gly Val Lys Asn Leu Glu Asp Pro Ala

10 <210> 62 <211> 13 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 62

Ala Thr Trp Val Gly Val Lys Asn Leu Glu Asp Pro Ala 15 10 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 76 <220>

<221>CDS <222> (3)..(26) <400> 63 tt aat aaa ttg gaa gat cca gcg tet a 27

Asn Lys Leu Glu Asp Pro Ala Ser

5 <210> 64 <211> 8 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 64

Asn Lys Leu Glu Asp Pro Ala Ser 1 5 <210 65 <211> 27 <212>DNA <213> syntetická sekvence

-61 CZ 302092 B6 <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 77 <220>

<221>CDS <222> (3)..(26) <4()0> 65 tt aat ttg aaa gaa gat cca gcg tet a 27

Asn Leu Lys Glu Asp Pro Ala Ser

H) ¹ 5 <210> 66 <211> 8 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 66

Asn Leu Lys Glu Asp Pro Ala Ser 1 5 io <2l0> 67 <211> 32 <212> DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 78 <220>

<221>CDS io <222> (3)..(32) <400> 67 tt aat ttg gaa aaa gat cca gcg tet aga gac 32

Asn Leu Glu Lys Asp Pro Ala Ser Arg Asp

10 <210> 68 <211> 10 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 68

Asn Leu Glu Lys Asp Pro Ala Ser Arg Asp

10 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> syntetická sekvence

-62CZ 302092 B6 <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 79 <220>

<221>CDS <222> (3)..(35) <400> 69 tt aat ttg gaa gat aaa cca gcg tet aga gac cta g 36

Asn Leu Glu Asp Lys Pro Ala Ser Arg Asp Leu <210> 70 <211> 11 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 70

Asn Leu Glu Asp Lys Pro Ala Ser Arg Asp Leu 1 5 10 <210>71 <211> 39 <212>DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 80 <220>

<22I>CDS <222> (3)..(38) <400> 71 tt aat ttg gaa gat cca aaa gcg tet aga gac cta gta g 39

Asn Leu Glu Asp Pro Lys Ala Ser Arg Asp Leu Val

5 10 <210>72 <211> 12 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 72

Asn Leu Glu Asp Pro Lys Ala Ser Arg Asp Leu Val

5 10 <210> 73 <211>43 <212>DNA <213> syntetická sekvence

-63CZ 302092 B6 <220>

<223> Popis syntetické sekvence : K se začleněný do aminokyseliny v poloze 81 jaderného pro ternu hepatitidy B <220>

<221>CDS <222> (3)..(41) io <400> 73 tt aat ttg gaa gat cca gcg aaa tet aga qac cta gta gtc ag 43

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Lys Ser Arg Asp Leu Val Val

10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 74

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Lys Ser Arg Asp Leu Val Val 15 10 <210> 75 <21l> 45 <212> DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 82 <220>

<221>CDS <222> (3)..(44) <400> 75 tt aat ttg gaa gat cca gcg tet aaa aga gac cta gta gtc agt t 45

Asn Leu Glu Asp pro Ala Ser Lys Arg Asp Leu Val Val Ser

10 <210> 76 <211> 14 <212> PRT <213> syntetická sekvence 40 <400> 76

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Lys Arg Asp Leu Val Val Ser

10 <2IO> 77 <211>50 <212> DNA <213> syntetická sekvence

-64CZ 302092 B6 <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 83 <220>

<221>CDS <222> (3)..(50) <400> 77 tt aat ttg gaa gat cca gcg tet aga aaa gac cta gta gtc agt tat 47

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Lys Asp Leu Val Val Ser Tyr

10 15 gtc 50 <21O> 78 <211> 16 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 78

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Lys Asp Leu Val Val Ser Tyr Val 15 10 15 <210>79 <211> 50 <212> DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 84 <220>

<221>CDS io <222> (3)..(50) <400> 79 tt aat ttg gaa gat cca gcg tet aga gac aaa cta gta gtc agt tat 47

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Lys Leu Val Val Ser Tyr

10 15 gtc 50

Val <210>80 <211> 16 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 80

-65CZ 302092 B6

Asn Leu Glu Asp Pro Ala Ser Arg Asp Lys Leu Val Val Ser Tyr Val 15 10 15 <210> 81 <211> 31 <212> DNA <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: K začleněné k aminokyselině jádra hepatitidy B v poloze 85 to <220>

<221>CDS <222> (2)..(31) <400> 81 c tcg aga gac cta aaa gta gtc agt tat gtc 31

Ser Arg Asp Leu Lys Val Val Ser Tyr Val

10 <21O> 82 <211> 10 <212> PRT <213> syntetická sekvence <400> 82

Ser Arg Asp Leu Lys Val Val Ser Tyr Val 15 10 <2I0> 83 <211> 18 <212> PRT <213> Plasmodium vivax <400> 83

Asp Arg Ala Ala Gly Gin Pro Ala Gly Asp Arg Ala Asp Gly Gin Pro 15 10 15

Ala Gly <210> 84 35 <211>8 <212> PRT <213> Influenza virus <400> 84

Cys Asn Asn Pro His Arg Ile Leu 40 ^{1 5} <21O> 85 <211> 25 <212> PRT

-66CZ 302092 B6 <213> Influenza virus <400> 85

Cys 1	Pro	Lys	Tyr	Val Lys Gin Asn Thr Leu Lys	Leu Ala Thr Gly Met 15
5	10
Arg	Asn	Val	Pro	Glu	Lys	Gin	Thr	Arg
			20					25

<210> 86 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 86

Ala Val Leu Glu Asp Pro Tyr Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys Val 15 10 15 <210> 87 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 87

Leu Leu Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro 15 10 15 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 88

Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gly Ala Gly Lys Pro Leu 15 10 15 <210> 89 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 89

Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gin Val Ile Ser Glu Glu Val Gly Leu 15 10 15 <210> 90 <211> 15 <212> PRT <213> Mycobacterium tuberculosis <400> 90

Ile Ala Phe Asn Ser Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu Lys 15 10 15

-67CZ 302092 B6 <210>91 <211> 18 <212>PRT <213> Myeobacterium tuberculosis <400> 91

Ala Arg Arg Gly Leu Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val 15 10 15

Lys Val <210>92 <211> 14 <212>PRT <213> Myeobacterium tuberculosis <400> 92

Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys 15 10 <210 93 <211> 17 io <212>PRT <213> Myeobacterium tuberculosis <400 93

Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu Thr 15 10 15

Leu <210> 94 <211> 15 <212> PRT <213> Myeobacterium tuberculosis 50 <400> 94

Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly 15 10 15 <210> 95 35 <211>20 <2!2> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 95

Cys Asp Ile Ile Gly Asn Thr Trp Asn Pro Ser Asp Gin Glu Pro Phe 15 10 15

Pro Gly Tyr Gly

-68CZ 302092 B6 <210> 96 <211> 21 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 96

Cys Ile Gly Thr Val Pro Lys Thr His Gin Ala Leu Cys Asn Glu Thr 15 10 15

Gin Gin Gly His Thr 20 <210>97 <211> 13 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie is <400> 97

Gly Asn Tyr Ser Asn Gin Thr Asn Pro Pro Pro Ser Cys 15 10 <210> 98 <21I> 22 <212>PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 98

Thr Asp Ile Gin Ala Leu Glu Glu Ser Ile Ser Ala Leu Glu Lys Ser 15 10 15

Leu Thr Ser Leu Ser Glu <210> 99 <211> 14 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 99

Ala Lys Leu Arg Glu Arg Leu Lys Gin Arg Gin Gin Leu Phe 15 10 <210> 100 <211>23 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 100

-69CZ 302092 B6

Asp Ser Gin. Gin Gly Trp Phe Glu Gly Trp Phe Asn Lys Ser Pro Trp 15 10 15

Phe Thr Thr Leu Ile Ser Ser 20 <210> 101 <211> 18 <212>PRT <213> virus kočičí leukemie <400> 101

Gin Val Met Thr Ile Thr Pro Pro Gin Ala Met Gly Pro Asn Leu Val

5 10 15 _((t Leu Pro <210> 102 <211> 17 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 102

Asp Gin Lys Pro Pro Ser Arg Gin Ser Gin Ile Glu Ser Arg Val Thr 15 10 15

Pro <210> 103 <211> 15 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 103

Arg Arg Gly Leu Asp Ile Leu Phe Leu Gin Glu Gly Gly Leu Cys 1 5 10 15 <210> 104 <211> 25 <212> PRT <213> virus kočičí leukémie <400> 104

Gin Glu Gly Gly Leu Cys Ala Ala Leu Glu Glu Cys Gin Ile Gly Gly 15 10 15

Leu Cys Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys

25 <210> 105 <211> 12 <212> PRT

-70CZ 302092 B6 <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P-450 <300>

<303> Science <304> 228 <306> 1436-1440 io <307> 1985 <400> 105

Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro 15 10 <210> 106 <211>6 <212> PRT <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P-450 <400> 106

Cys Met Gin Leu Arg Ser 1 5 <210> 107 <21t>6 <212> PRT <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P-450 <400> 107

Cys Arg Phe Ser Ile Asn ⁵ <2I0> 108 <21l>5 <212> PRT <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P-450 <400> 108

Cys Ala Val Pro Arg

5 <210> 109 <211>5

-71 CZ 302092 B6 <212> PRT <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P-450 <400> 109

Cys Ile Pro Arg Ser 1 5 io <210> 110 <211>5 <212> PRT <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P—450 <400> 110

Cys Phe Ile Pro Val 1 5 <210> 111 <211> 6 <212> PRT <213> syntetická sekvence <220>

<223> popis syntetické sekvence: fragment cytochromu P-450 <400> 111

Cys Thr Val Ser Gly Ala

1 5 <210> 112 <211>6 <212> PRT <213> Plasmodium knowlesi <400> 112

Cys Thr Leu Ser Gly Glu 1 5

4« <210> 113 <211> 12 <212> PRT <213> Plasmodium knowlesi <400> 113

Gin Ala Gin Gly Asp Gly Ala Asn Ala Gly Gin Pro

Claims (13)

1. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B obsahující upravený jaderný protein hepatitidy B převisle vázaný na hapten, kde upravený jaderný protein hepatitidy B obsahuje aminokyselinovou sekvenci odpovídající aminokyselinové sekvenci jaderného proteinu hepatitidy B SEQ ID NO: 2, která zahrnuje aminokyselinové zbytky číslované 10 až 140, a dále obsahuje inzert aminokyselinové sekvence v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným 50 až 100, přičemž uvedený inzert (i) obsahuje 1 až 40 aminokyselinových zbytků a (ii) obsahuje chemicky reaktivní aminokyselinový zbytek na kterém je převisle vázaný hapten.

2. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku I, kde inzert je v oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným 70 až 90.

3. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 1, kde inzert jev oblasti odpovídající aminokyselinovým zbytkům číslovaným 78 až 82.

4. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 1, kde hapten je polypeptidový hapten, chemický hapten nebo sacharidový hapten.

5. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 1, kde hapten je hapten příbuzný patogenu.

6. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 5, kde uvedený protein dále obsahuje sekvenci aminokyselinových zbytků stimulující T buňky, která je operativně spojená s C-koncem uvedené aminokyselinové sekvence hepatitidy B.

7. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 6, kde sekvence aminokyselinových zbytků stimulující T buňku je příbuzná se stejným patogenem jako převisle vázaný s patogenem příbuzný hapten.

8. Konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B obsahující shluklou podjednotku upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, kde velké množství podjednotek jsou konjugáty upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 1.

9. Konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 8, kde se na hapten převisle váže přibližně 0,1 až 0,5 podjednotek upraveného jaderného proteinu hepatitidy B.

10. Konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 8 obsahující velké množství podjednotek upraveného jaderného proteinu hepatitidy B, které jsou převisle vázány na různé hapteny.

11. lnokulum obsahující imunogenní množství konjugátu upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároků 1 až 7 nebo konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároků 8 až 10 rozpuštěné nebo dispergované ve farmaceuticky přijatelném ředidle.

12. Konjugát upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároku 1 až 7 nebo konjugát částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároků 8 až 10 pro použití pří terapii.

13. Použití konjugátu upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároků 1 až 7 nebo konjugátu částice upraveného jaderného proteinu hepatitidy B podle nároků 8 až 10 pro výrobu léčiva pro podání zvířeti pro indukci jeho protilátek.