CZ302333B6 - Vakcína - Google Patents

Abstract

Podstatu rešení tvorí vakcína, obsahující imunomodulátor pro prevenci nebo lécení infekcního onemocnení. Imunomodulátor se volí ze skupiny, zahrnující EtxB, CtxB nebo VtxB, prosté celého toxinu, vakcína obsahuje také antigen nebo antigenní determinantu uvedeného infekcního agens a imunogenní modulátor a antigen nebo antigenní determinanta jsou samostatné skupiny. Soucástí rešení je také sestava pro ockování savce. Rešení se rovnež týká použití imunomodulátoru pro výrobu lécebného prostredku pro prevenci nebo lécení infekcního onemocnení, vyvolaného bakterií, parazitem, patogenem zažívací soustavy nebo dýchacího systému nebo virem ze skupiny virus herpes, HIV, virus spalnicek, príušnic nebo rotavirus.

Description

Vakcína

Oblast techniky

Vynález se týká imunomodulátoru, který je možné použít ve vakcíně, jenž je určena pro použití proti řadě infekčních činidel. Dále se vynález vztahuje k vakcinačnímu prostředku, který obsahuje imunomodulátor, přednostně v kombinaci s antigenem a způsobu vakcinace za použití vakcinačního prostředku.

Dosavadní stav techniky

Toxin cholery (Ctx) a jeho blízce příbuzný tepelně labilní enterotoxin mikroorganizmu E. coli i? (Etx) jsou silné imunogeny a slizníční adjuvans. Jejich inherentní toxicita je činí nevhodným pro použití u lidí. Ačkoliv například Ctx je nejběžněji používané slizniční adjuvans u experimentálních zvířat, není vhodné pro použití u lidí, protože má vlastnosti vyvolávající průjem. Je snaha oddělit toxicitu od aktivity adjuvans, například použitím komponentů Ctx a Etx jako náhrady za samotné holotoxiny. Verotoxin mikroorganizmu E. coli (Vtx) je další známý bakteriální toxin.

Ctx a Etx jsou heterohexamerní proteiny, které vykazují enzymaticky aktivní podjednotku A a pentamerní podjednotku B. Ctx a Etx jsou známy, že váží GM 1-gangliozid (GM1), což je glykosfingolipid, který se nachází na povrchu savčích buněk. Vtx se váže na Gb3, který jc podobný typ receptoru pro GM 1.

V případě vývoje vakcíny se musí řešit problém toxicity, přičemž se už dříve zkoumala adjuvantní aktivita netoxických podjednotek B. Řada zpráv popisuje experimenty, ve kterých se používají komerční přípravky CtxB nebo EtxB. Tyto prostředky jsou nevyhnutelně kontaminovány malým, ale biologicky podstatným množstvím aktivního toxinu. Tak adjuvantní aktivita, která pochází z podjednotky B není oddělitelná od adjuvantní aktivity celého toxinu (Wu and Russell (1993) Infection and I mm unity 61: 314-322, US-5 182 109). Následná studie používající rekombinantní CtxB (rCtxB) naznačuje, že CtxB je slabé slizniční adjuvans a pouze přidání přirozeného holotoxinu může vyvolat silnou odezvu (Tamura et al., (1994) Vacci ne 12: 419 až 426). Jiné studie naznačují, že rCtxB postrádá ADP-ribosylující a cAMP stimulující aktivity holotoxinu a že jak adjuvanční mechanizmus je spojen s těmito vlastnostmi, CtxB není vhodný v případě použití jako adjuvans (Vajdy and Lycke (1992) Immunology 75: 488 až 492, Lycke etal. (1992) Eur. J. Immunol. 22: 2277-2281, Douce et al., (1997) Infection and lmmunity 65; 2821 až 2828).

V jiné studii intranazální aplikace ovalbuminu za použití rCtxB jako adjuvans vede k slabé proti40 látkové odezvě. Netoxický derivát Ctx s mutací v podjednotce A také vede ke slabé odezvě na antigeny, zatímco přítomnost aktivní podjednotky A dramaticky zvyšuje adjuvanční aktivitu, což naznačuje, že aktivní podjednotka A je podstatná (Douce et al., (1997) Infection and lmmunity 65:2821 až 2828).

Také se ukázalo, že rCtxB a rEtxB se může použít k podpoře tolerance na heterogenní antigeny (Sun et al (1994) Proč, Nati. Acad. Sci. 91: 4610 až 4614, Sun et al (1996) Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 7196 až 7201, Bergerot et al (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 4610 až 4614, Williams et al (1997) Proč. Nati. Acad. Sci. 94: 5290 až 5295), což naznačuje, že tyto molekuly jsou vhodné pro použití jako adjuvans.

Podstata vynálezu

Navzdory poznatkům v oboru, že CtxB a EtxB vykazuje slabý zesilující účinek adjuvans a může

5? ve skutečnosti působit jako tolerogen, se zkoumalo použití rEtxB (který neobsahuje žádný zbyt- i CZ 302333 B6 kový holotoxin nebo podjednotku A) v intranazální vakcíně vhodné pro HSV v myším modelu a překvapivě se zjistilo, že tento toxin je schopen stimulovat ochrannou imunitní odezvu na virovou vakcínu. Specificky se zjistilo, že:

i) činidla, jako je EtxB a CtxB stimulují vysoký stupeň místní (slizniční) produkce protilátek (ačkoli imunizace za použití rEtxB stimulovala nižší stupeň celkové produkce sérových protilátek ve srovnání s kombinací Ctx/CtxB), ii) produkce protilátek je nesymetricky rozdělena směrem k protilátkám, které nefixují komplem ment, zvláště na S-IgA a IgGl, iii) činidla, jako je EtxB a CtxB také stimulují místní a systémovou proliferativní odezvu T buněk, iv) činidla taková jako je CtxB a EtxB mají tendenci posunout imunitní odezvu z odezvy spojené s Th 1 k odezvě spojené s Th2,

v) v případě, že činidla, jako je CtxB a EtxB se používají jako imunomodulátory, je možné předejít některým z vážných účinků odezvy spojené s Th2, jako je vytvoření IgE, vi) rEtxB je více účinný imunomodulátor ve srovnání s rCtxB, v i i) činidla, jako je EtxB a CtxB jsou schopny změnit způsob, při kterém buňky prezentující antigen pohlcují a zpracovávají anti gen, čímž se zvyšuje perzistence anti genu, viii) v případě, že činidlo, jako je EtxB a CtxB je spojeno s antigenem, je možné změnit dráhu zpracování antigenu změnou vazby na imunomodulátor a ix) VtxB vykazuje podobné imunomodulační účiny na populaci leukocytů in vitro s těmi, které vykazuj í EtxB a CtxB.

Tyto důležité objevy jsou základem různých aspektů vynálezu a umožňují vynálezcům předpovědět, že čistý EtxB, CtxB a VtxB, stejně jako jiná činidlajsou schopny vázat se na GMl nebo Gb3 nebo napodobovat účinky navázání. Tato činidla je možné použít ve vakcíně jako imunomodulá35 tory při profylaktické a terapeutické vakcinaci proti infekci HSV-1, stejně jako jiných infekcí, jejichž prevence nebo léčba vyplývá z imunomodulace typů uvedených shora v textu.

Stimulace imunitní odezvy

4o EtxB, CtxB, VtxB a jiná činidla schopná vázat se nebo napodobit účinky navázání na GMl nebo Gb3 jsou schopny působit jako imunomodulátory a stimulovat specifické imunitní odezvy na imunizaci antigenem.

Podstatu vynálezu tvoří vakcína, obsahující imunomodulátor pro prevenci nebo léčení infekčního onemocnění, vyvolaného bakterií, parazitem, patogenem zažívací soustavy nebo dýchacího systému nebo virem ze skupiny virus herpes, HIV, virus spalniček, příušnic nebo rotavirus, přičemž novost spočívá v tom, že imunomodulátor se volí ze skupiny, zahrnující EtxB, CtxB nebo VtxB, prosté celého toxinu, vakcína obsahuje také antigen nebo anti gen ní determinantu uvedeného infekčního agens a imunogenní modulátor a antigen nebo antigenní determinanta jsou samostatné skupiny.

Součástí podstaty vynálezu je také sestava pro očkování savce, která obsahuje i) antigenní determinantu, uvedenou svrchu a ii) imunomodulátor ze skupiny, zahrnující EtxB, CtxB nebo VtxB, prostý celého toxinu, pro současné podání savci.

Vynález se rovněž týká použití imunomodulátoru pro výrobu léčebného prostředku pro prevenci nebo léčení infekčního onemocnění, vyvolaného bakterií, parazitem, patogenem zažívací soustavy nebo dýchacího systému nebo virem ze skupiny virus herpes, HIV, virus spalniček, příušnic nebo rotavirus, přičemž imunomodulátor se volí ze skupiny, zahrnující EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, léčebný prostředek obsahuje také antigen nebo antigenní determinantu uvedeného infekčního agens a imunogenní modulátor a antigen nebo antigenní determinanta jsou samostatné skupiny.

Antigen a imunomodulátor se mohou vázat. Mohou být například spojeny kovalentně nebo geneticky za vzniku jediného účinného činidla. Ve specifickém provedení vynálezu antigen a imunomodulátor se může chemicky kombinovat. Antigen a imunomodulátor se může spojit chemicky za použití hcterobifunkčního síťovadla. Ve většině aplikací uvedeného aspektu podle vynálezu se preferuje oddělená aplikace (při které antigen a imunomodulátor není spojen), protože to umožňuje oddělenou aplikaci různých částí.

Vakcinační prostředek a sada podle vynálezu se může použít při proíylaktické a terapeutické

2o vakcinační metodě, kde „proíylaktická vakcína“ se aplikuje zdravým jedincům, aby došlo k prevenci vývoje onemocnění a „terapeutická vakcína“ se aplikuje jednotlivcům s existující infekcí, aby se omezila nebo minimalizovala infekce nebo se odstranily imunopatologické jevy onemocnění.

Činidla jako je EtxB vykazují kapacitu změnit podstatu imunitní odezvy poté, co se objeví infekce. Terapeutická vakcína (to je vakcína, kde není nutné, aby obsahovala antigen) obsahující takové činidlo může najít uplatnění zvláště v okolnostech, kdy imunitní odezva selhala při boji s infekcí. Tato vakcína se může zvláště použít při léčbě chronického onemocnění, například onemocnění, kdy kauzativní agens se vybralo ze skupiny zahrnující virus herpes, virus hepatitidy,

HIV, TB a parazity.

Dále vynález popisuje způsob prevence nebo léčby onemocnění hostitele, přičemž uvedený způsob zahrnuje inokulaci uvedeného hostitele vakcínou, která obsahuje alespoň jednu antigenní determinantu a imunomodulátor, kde imunomodulátor je (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo jiné než EtxB nebo CtxB, které vykazuje GM1 vazebnou kapacitu nebo činidlo jiné než je VtxB a vykazuje Gb3 vazebnou kapacitu nebo (iii) činidlo, které vykazuje účinek na nitrobuněěné signalizační jevy zprostředkované navázán im na GM1 a Gb3.

Vakcína se může balit tak, aby byla vhodná pro ko-aplikaci a může se aplikovat řadou různých způsobů, jako je intranazální, orální, intravaginální, uretrální nebo oční aplikace. V současné době se preferuje intranazální imunizace. V případě, že vakcína se aplikuje intranazálně, může se aplikovat jako aerosol nebo v kapalné formě.

Antigenní determinanta a imunomodulátor se může aplikovat subjektu jako jediná dávka nebo více dávek.

Imunomodulátor, vakcína, sada a způsob podle vynálezu se mohou použít proti onemocnění, kde infekční agens je členem rodiny viru herpes. Infekční činidlo se může vybrat ze skupiny zahrnující HSV-1, HSV-2, EBV, VZV, CMV, HHV-6, HHV-7 a HHB-8. Tímto infekčním činidlem je HSV-1, HSV-2, CMV nebo EBV.

- 3 CZ 302333 B6

V tomto provedení vynálezu antigenní determinanta produktu středně časného, časného nebo pozdního genu (například povrchového glykoproteinu) viru herpes. Jestliže infekční činidlo je HSV-1 nebo HSV-2. pak antigenní determinanta může být antigenní determinantou genového produktu vybraného z následující skupiny: gD, gB, gC nebo transkriptu spojeného s latencí (LAT).

Jestliže infekční činidlo je EBV, pak antigenní determinanta může být antigenní determinanta gp340 nebo gp350 nebo latentní protein (například EBNA 1, 2, 3A, 3B, 3C a -LP, LMP-1, -2A io a 2B nebo EBER).

V jiném provedení vynálezu se vakcína, sada a způsob používají proti onemocnění, kde infekčním agens je virus chřipky.

is V tomto provedení vynálezu antigenní determinantou je virový obalový protein (například hemaglutinin a neuraminidáza) nebo vnitřní protein (například jaderný protein).

V tomto provedení vynálezu imunomodulátor, vakcína, sada a způsob se používají proti onemocnění, kde infekční agens je virus parainfluenza.

V dalším provedení vynálezu imunomodulátor, vakcína, sada a způsob se použily v případě onemocnění, kde infekčním agens je respirační syncytiální virus.

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily při onemocně25 ní, kde infekční agens je virus hepatitidy. Infekční agens se vybralo například ze skupiny zahrnující hepatitidu A, B, C a D. Infekční agens může být zvláště hepatitida A nebo C.

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily v případě meningitidy, kde infekční činidlo se vybralo ze skupiny zahrnující Neisseria meningitidis,

Haemophilus influenzae type B and Streptococcus pneumoniae.

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily proti onemocnění pneumonia nebo infekce dýchacích cest, kde infekční agens se vybralo ze skupiny zahrnující mikroorganizmy Streptococcus pneumoniae, Legonella pneumophila and Mycobacterium tuberculosis.

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily proti pohlavním nemocím, kde infekční agens se vybralo ze skupiny zahrnující Neisseria gonnorheae, HIV1, H1V-2 and Chlamydia trachomatis.

•io

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily při onemocnění trávicího traktu, kde infekční agens se vybralo ze skupiny zahrnující enteropatogenní, enterotoxické a enteroinvazivní E. coli, rotavirus, Salmonella enteritidis, Salmonella typhi, Helicobacter pylori, Bacillus cereus, Campylobacter jejuni and Vibrio cholerae.

Jestliže se infekční agens vybralo ze skupiny zahrnující enteropatogenní, enterotoxické, enteroinvazivní, enterohemoragické a enteroagregační E. coli, pak antigenní determinantou může být antigenní determinanta bakteriálního toxinu nebo adhezivního faktoru.

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily při superfíciální infekci, kde infekční agens se vybralo ze skupiny zahrnující Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes a Streptococcus mutans.

-4 CZ 302333 B6

V dalším provedení vynálezu se imunomodulátor, vakcína, sada a způsob použily při onemocnění způsobené parazity, kde infekční agens se vybralo ze skupiny zahrnující malárii, Trypanasoma spp., Toxoplasma gondii, Leishmania donovcmi a Oncocerca spp.

Stimulace slizniční imunitní odezvy

EtxB, CtxB, VtxB a jiná agens schopná vázat se nebo napodobovat účinky navázání na GM1 nebo Gb3 jsou schopny specificky pozitivně regulovat produkci slizniěních protilátek.

io Vakcínační imunomodulátor, vakcinaění prostředek a sada podle vynálezu jsou zvláště účinné při onemocnění, kde ochrana proti onemocnění nebo léčbě je ovlivněna in vivo slizniční imunitní odezvou. Například při onemocnění, pří kterém během infekce se infekční agens váže na sliznici nebojí kolonizuje. Příklady takového onemocnění je onemocnění způsobené viry (HIV, HSV, EBV, CMV, virus chřipky, spalničkový virus, virus příušnic, rotavirus atd.) nebo bakteriemi i? (jako je E. coli, Salmonella, Shigella, Chlamydia, N, gonnorhoea, T. pallidium, druh Streptococcus, které zahrnují ty, jenž způsobují zubní kazy) nebojsou způsobené parazity.

V preferovaném provedení vynálezu se použije vakcína proti infekci HSV-1 obsahující alespoň jednu HSV-1 antigenní determinantu a imunomodulátor, kde imunomodulátorem je:

(i) EtxB, CtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a vykazuje GM1 vazebnou aktivitu, nebo činidlo, které je jiné než je VtxB a vykazuje Gb-3 vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované GM1 navázáním nebo Gb3 navázáním.

Upřednostňuje se, aby imunomodulátor byl EtxB.

V preferovaném provedení vynálezu se používá sada vhodná pro vakcinaci savců proti HSV-1, která obsahuje:

a) vakcínační imunomodulátor, kterým je:

(i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a vykazuje GM1 vazebnou aktivitu, nebo činidlo, které je jiné než je VtxB a vykazuje Gb~3 vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazujícího účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované GM! navázáním nebo Gb3 navázáním a (b) alespoň jednu antigenní determinantu HSV-1 vhodnou pro společnou aplikaci s uvedeným 45 vakcinačním imunomodulátorem.

Vynález dále popisuje použití (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a vykazuje GM1 vazebnou aktivitu, nebo činidla, které je jiné než je VtxB a vykazuje Gb-3 vazebnou aktivitu nebo (iii) činidla vykazujícího účinek na nitrobuněčný signalizační jevy zprostředkované GM1 navázáním nebo Gb3 navázáním

-5CZ 302333 B6 při pozitivní regulaci produkce protilátek na povrchu sliznic. Produkce sérových protilátek, které ne fixují kom plemení se mohou také regulovat negativním způsobem. Upřednostňuje se, když se S-IgA produkuje v souladu se způsobem podle vynálezu.

Imunomodulátor, vakcína, sada a způsob podle vynálezu se mohou použít ve spojení s jednou nebo více antigenních determinant.

Negativní regulace patologických komponentů imunitní odezvy.

Také se zjistilo, že, když se použil čistý EtxB jako imunomodulátor popsaným způsobem, tak se zabránilo ničivým účinkům odezvy spojené s Th2, jako je tvorba velkého množství potencionálně patologických IgE. Navzdory tomu imunitní odezva vyvolaná použitím EtxB (nebo CtxB nebo VtxB) jako imunomodulátoru se jeví vhodná pro vyvolání cytokinů spojených s Th2. Jinými slovy EtxB (nebo CtxB) vyvolává posun z odezvy typu Thl na typ Th2. To umožňuje předpovídat, že čisté EtxB, CtxB nebo VtxB stejně jako jiná činidla schopná vázat se nebo napodobovat účinky navázání na GM1 nebo Gb3 budou schopná negativně regulovat patologické komponenty imunitní odezvy spojené s aktivací Thl a Th2.

Vynález dále popisuje použití (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidla, které je jiné než EtxB nebo CtxB a vykazuje GM1 vazebnou aktivitu, nebo činidla, které je jiné než je VtxB a vykazuje Gb-3 vazebnou aktivitu nebo (iii) činidla vykazujícího účinek na nitrobuněčný signalizační jevy zprostředkované GMl navázáním nebo Gb3 navázáním a při negativní regulaci patologických komponentů imunitní odezvy spojené sTh2. Patologické komponenty imunitní odezvy spojené s Thl se mohou také negativně regulovat.

Je známo, že EtxB a CtxB se váže na GMl a vyvolává diferenciální účinky na populaci lymfocytů, které zahrnují specifickou depleci CD8+T buněk a spojenou aktivaci buněk B (WO 97/0204). Protože se uvažuje, že EtxB a CtxB mění rovnováhu imunitní odezvy tak, že reakce spojené se zánětlivým Thl se negativně regulují zatímco odezvy spojené s Th2 se regulují pozitivně. Odezva Thl zahrnuje vylučování ylFN aktivovanými buňkami, což vede k aktivaci makrofágů a oddálení reakcí hypersenzitivního typu. Takové odezvy mohou být důležitým patologickým jevem během infekcí řadou patogenů. Odezvy Th2 zahrnují aktivaci T buněk, aby io došlo k produkci cytokinů, jako je IL-4, IL—5, IL—10 a jsou známy tím, že podporují vylučování velkého množství protilátek, zvláště IgA.

Pak se překvapivě zjistilo, že když se jako imunomodulátor používá EtxB popsaným způsobem, předchází se škodlivým účinkům odezvy spojené s Th2, jako je vytvoření velkého množství potencionálně patologického IgE. Proto EtxB a CtxB jsou schopny negativně regulovat patologické komponenty spojené s aktivací Thl a Th2. Takové odezvy se mění, aby se dosáhlo vysoké produkce sérových protilátek, které nefixují komplement, a produkce IgA na povrchu sliznic.

Použití činidla v souladu s předměty vynálezu je zvláště použitelné při terapeutické vakcinaci onemocnění, kde jsou zahrnuty imunopatologické mechanizmy. Příklady takových onemocnění jsou HSV-1, HSV-2, TB a HIV.

Činidla, jako je EtxB, se mohou použít současně jako imunomodulátor a terapeutické činidlo. Například pri onemocnění, kde jsou zahrnuty imunopatologické mechanizmy, použití činidel, které jsou zahrnuty ve vakcíně, jako je EtxB nebo CtxB mohou způsobovat ne pouze omezení

-6CZ 302333 B6 infekce, ale také odstraňují patologické procesy onemocnění. Imunomodu lační činidlo tak působí jak profy takticky tak terapeuticky. Příklady infekcí, kde vakcinace tímto způsobem je proto pravděpodobně zvláště významná, zahrnuje onemocnění způsobené virem herpes simplex, patogeny trávicích a dýchacích cest.

Imunomodulace způsobu zpracování antigenů a) prodloužená prezentace io Také se zjistilo, že když se ExtB (nebo CtxB nebo VtxB) použije jako imunomodulátor, změní se pohlcení antigenů a způsob jeho zpracování. Přítomnost podjednotky B způsobuje prodlouženou prezentaci, pravděpodobně změnou dráhy uvnitř buněk, které prezentují antígen tak, že rozklad antigenů je oddálen a proto přetrvává po delší časový úsek. Tento rys prezentace podjednotky B spojené s antigenem znamená, že vakcíny obsahující činidlo podle vynálezu zvýší odolnost antiis genu, a to vede k trvalé imunologické paměti.

Vynález dále popisuje použití:

(i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidla, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidla, které je jiné než VtxB a které vykazuje Gb3~vazebnou aktivitu nebo (iii) činidla vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním na

GMlneboGb3, jako imunomodulátoru ve vakcíně, aby se prodloužila prezentace antigenů a u savce vznikla trvalá imunologická paměť.

Vynález popisuje vakcinační prostředek, který je vhodný pro použití proti infekčnímu onemocnění, které obsahuje antigenní determinantu a imunomodulátor vybraný z (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GM l-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které je jiné než je VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním na GM1 neboGb3, kde uvedená antigenní determinanta je antigenní determinantou uvedeného infekčního onemocnění a kde imunomodulátor prodlužuje přítomnost antigenní determinanty a dává vzniku trvalé imunologické paměti.

b) nitrobuněčné cílení antigenů do dráhy spojené s MHC-I nebo MHC-ÍI

Jak se uvádí shora v textu, imunomodulátor a antígen může být v terapeutické nebo profylaktické vakcíně geneticky nebo kovalentně vázán za vzniku jediného účinného činidla. Zjistilo se, že je možné řídit antígen do různých částí buněk a proto je možné dosáhnout různých drah prezentace antigenů změnou vazby antigenů na imunomodulátor.

Spojením antigenů nebo antigenní determinanty s imunomodulátorem v jisté dráze, je možné dosáhnout trans lokací antigenů pres endozomální membránu do cytozolu. Předpovědělo se, že to bude zvyšovat nanesení antigenních peptidů na molekuly MHC třídy I. Použití konjugátu anti55 gen-imunomodulátor se může proto použít, aby se specificky zvýšila aktivace cytotoxických C

-7CZ 302333 B6 buněk (CTL). Indukce CTL je výhodné při prevenci a léčbě rady onemocnění zvláště těch, které jsou způsobeny viry, nitrobuněčnými bakteriemi a parazity.

Spojení konjugátu antigen-imunomodulátor je možné také vybrat tak, že antigen je zaveden do jádra.

Vynález dále popisuje konjugát, který obsahuje antigen nebo antigenní determinantu a ímunomodulátor vybraný z io (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které je jiné než VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkovávané navázáním naGMl neboGb3,

Vynález dále popisuje vakcinační prostředek, který je vhodný při použití proti infekčnímu onemocnění, kde infekční onemocnění je způsobeno infekčním činidlem. Vakcinační prostředek obsahuje konjugát anti genu nebo antigenní determinanty a imunomodulátoru vybraného z (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které je jiné než VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním na GM1 nebo Gb3, kde uvedený antigen nebo antigenní determinanta je antigen nebo antigenní determinanta uvedeného infekčního činidla.

Antigen nebo antigenní determinanta je spojena s imunomodulátorem různými způsoby, které zahrnují genetické spojení nebo chemickou konjugaci. V preferovaném provedení vynálezu je konjugát fúzní protein připravený genetickou vazbou antigenu nebo antigenní determinanty s imunomodulátorem. Upřednostňuje se, aby se antigen nebo antigenní determinanta geneticky spojila sC-koncem imunomodulátoru. Ve druhém preferovaném provedení vynálezu antigen nebo antigenní determinanta je chemicky spojená s imunomodulátorem. Upřednostňuje se, aby antigen nebo antigenní determinanta se spojila s imunomodulátorem za použití zesíťovacího činidla se dvěmi funkcemi, jako je heterobifunkční síťovadlo, Více se preferuje, aby síťovadlo byl ester N-y(-maleimido-butyroxyl)-sukcinimidu (GMBS) nebo N-sukcinimidyI-(3-pyridyldithio)-propionát (SPDP). Vakcinační prostředek se může aplikovat řadou různých cest, jako je intranazální, orální, intravaginální, uretální nebo oční. Preferuje se intranazální imunizace.

Vynález dále popisuje použití (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které jejiné než VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním na GM1 nebo Gb3,

- 8 CZ 302333 Bó v konjugátu s antigenem nebo s antigenní determinantou za účelem zavedení uvedeného antigenu nebo antigenní determinanty do cytozoíu nebo jádra buňky, která prezentuje antigen.

Vynález popisuje použití (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které je jiné než je VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo io (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním na GM1 neboGb3, v konjugátu s antigenem nebo antigenní determinantou za účelem zesílení prezentace uvedené antigenní determinanty nebo antigenní determinanty získané z uvedeného antigenu molekulami MHC třídy I.

Preferované použití konjugátu podle vynálezu je použití v kombinaci s použitím činidla podle vynálezu za účelem stimulace silné odezvy CTL a pozitivní regulace produkce slizničních proti20 látek. Tato aktivita je zvláště použitelná při prevenci a léčbě virových infekcí, jako je například chřipka.

EtxB je preferovaný imunomodulátor

Uvažuje se, že EtxB a CtxB vykazují podobné vlastnosti. Zjistilo se však, že rEtxB je silnějším a účinným modulátorem ve srovnání s rCtxB. Protože preferovaným imunomodulátorem je EtxB nebo činidlo, které napodobuje účinky EtxB.

EBV

EBV je jeden z osmi známých lidských herpesových virů. Infekce se obvykle objevuje v raném dětství, ale klinické symptomy jsou v tomto stádiu obvykle slabé nebo nejsou detekovatelné. Primární infekce EBV je později v životě spojena s infekční mononukleázou (IM), která je druhým nejvíce častým onemocněním v USA v době dospívání. EBV vykazuje také onkogenní potenciál. Existuje silná vazba mezi EBV a endemickým Burkitovým lymfomem (BL) a nediferenciovaným nazofaryngeálním karcinomem (NPC). Také velká část lymfomů, které se objevují u imunokompromitovaných pacientů jsou způsobeny EBV a existuje vztah mezí jistými Hodgkinovými lymfomy a EBV.

Buňky latentně infikované EBV exprimují malé množství tzv. „latentních“ proteinů. Uvedené latentní proteiny zahrnují šest jaderných proteinů (EBNA 1, 2, 3 A, 3B, 3C a-LP). tři integrované membránové proteiny (LMP-1, 2A a 2B) a RNA získanou z nepolyadenylovaného viru (EBER) s určitou rolí při sestřihu RNA.

EBV latentní membránový protein 1 (LMP-1) je přítomen v plazmatické membráně infikovaných buněk. Také se exprimuje v nazofaryngeálních karcinomech (NPC) a Hodgkinových lymfomech, které jsou EBV pozitivní (NPC) a Hodgkinových lymfomech, které jsou EBV pozitivní (HD), což indikuje úlohu LMP-1 pri vývoji těchto nádorů. Gen LMP-1 může změnit fenotyp ne infikovaných buněk, což způsobuje pozitivní regulaci aktivačních markérů na povrchu buňky, což podporuje proliferaci buněk. LPM-1 může také změnit signalizační dráhy a má antiapoptické účinky. Buněčná imunitní odezva řízená proti tomuto virovému antigenu se nespojuje s žádným zdravým nosičem nebo s pacienty s nádory.

Řada zvířecích virů zahrnuje mechanizmy, které umožňují zabránit jejich odhalení imunitním systémem hostitele. V běžném případě tento mechanizmus zahrnuje interferenci peptidovým

-9CZ 302333 B6 trans lokačním systémem spojeným s TAP. Uvažuje se, že EBV vykazuje podobné mechanizmy, jak předejít detekci imunitním systémem, což umožňuje jeho přetrvávání v hostiteli. To vysvětluje, proč jisté buněčné imunitní odezvy nejsou detekovatelné EBV latentním proteinem EBNA1 a zjevnou absenci takové imunitní odezvy proti LMP1.

Vynález dále popisuje vakcinační prostředek, který dále obsahuje

a) jedno z následujících činidel:

io (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které je jiné než VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním naGMl nebo Gb3,

b) antigen EBV vhodný pro použití pří léčbě a/nebo prevenci onemocnění spojené s EBV.

V určitém vakcinačním prostředku podle vynálezu jsou zahrnuty EtxB, CtxB nebo činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB, které vykazuje GMM1 vazebnou aktivitu.

Vynález dále popisuje terapeutický prostředek, který obsahuje:

2? (i) EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, (ii) činidlo, které je jiné než EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu nebo činidlo, které je jiné než VtxB a které vykazuje Gb3-vazebnou aktivitu nebo (iii) činidlo vykazující účinek na nitrobuněčné signalizační jevy zprostředkované navázáním naGMl neboGb3, přičemž uvedený terapeutický prostředek se použije při léčbě onemocnění spojeného s EBV.

Vynález dále popisuje terapeutickou kompozici podle vynálezu, která obsahuje EtxB, CtxB nebo činidlo, které se liší od EtxB nebo CtxB a které vykazuje GMl-vazebnou aktivitu.

Na základě znalostí, že EtxB se spojuje sLMPl a že EtxB podporuje fragmentaci LMP-1 se vyslovila teorie, že EtxB (a jiná činidla podobná CtxB vykazující vazebnou aktivitu GM1) je to použitelný při stimulaci anti-EBV imunitní odezvy. Tato aktivita nachází uplatnění ve vakcínách, kde brání onemocnění spojené s EBV a zajišťuje léčbu v případě, že dojde k onemocnění.

Věří se, že v případě, že EtxB se spojuje s LMP-1, antigen se zpracovává odlišným nitrobuněčným způsobem, který umožňuje antigenu projít normálním způsobem zpracování, který je bloko45 ván virem. Antigen se tak účinně prezentuje na povrchu buňky. Působení EtxB tak mohou způsobovat různé epítopy antigenu, kteréjsou přítomny na povrchu buňky. Tyto epitopy se mohou lišit od epitopů, kteréjsou přítomny na povrchu buňky v případě, že se zpracovávají běžnou cestou.

Vakcína podle vynálezu se může použít při prevenci infekce způsobené EBV nebo vývojem one50 mocnění spojeném s EBV u jedinců infikovaných EBV. Vakcína může také obsahovat oddělené adjuvans nebo činidlo (jako je EtxB nebo CtxB), které může působit jako adjuvans.

Činidla podle vynálezu se mohou podle vynálezu použít samotná (to znamená bez antigenu) při léčbě onemocnění spojené s EBV v případě, že subjekt už onemocněl.

- 10CZ 302333 B6

Preferovaným činidlem vhodným pro použití podle vynálezu je EtxB.

EBV antigen je antigen odvozený od samotného EBV nebo antigen, který exprimují hostitelské buňky infikované EBV působením EBV. Upřednostňuje se, aby antigen byl latentní membránový protein EBV. Zvláště se preferují antigeny LMP-ΐ, LPM-2A, LPM-2B a EBNA-1, stejně jako jejich antigenní fragmenty. Antigen se může izolovat přímo z buněk infikovaných EBV nebo se mohou připravit syntetickým nebo rekombinantním způsobem.

Dále vynález popisuje léčbu a/nebo prevenci následujících onemocnění: infekční mononukleózu, io Bukrittův lymfom, nazofaryngeální karcinomy a Hodgkinovy lymfomy. Věří se, že vynález je vhodný pro léčbu a/nebo prevenci nazofaryngeálních karcinomů a Hodgkinových lymfomů.

Vakcína nebo terapeutická kompozice podle vynálezu se může použít při prevenci vývoje nebo léčby onemocnění spojené s EBV u savce, aplikací imunologicky účinného množství subjektu.

Savec může být například zdravý jedinec infikovaný nebo neinfikovaný EBV, imunodeficitní jedinec nebo jedinec s onemocněním spojeným s EBV.

Vakcína se může aplikovat libovolným vhodným způsobem. Činidlo a antigen se mohou apliko20 vat savci společně nebo odděleně. Činidlo a antigen se mohou vyskytovat odděleně nebo mohou být vázány například kovalentně nebo geneticky za vzniku jediného účinného činidla.

Signalizace spojená s GM-1 a Gb-3

Věří se, že navázání GM1 nebo Gb3 může vést k nitrobuněčné signalizaci přímo nebo nepřímo. Také se našel důkaz, který naznačuje, že EtxB interaguje s alespoň jedním jiným receptorem, který se podílí na nitrobuněčné signalizaci spojené s GM1. Může dojít k tomu, že navázání EtxB (nebo CtxB) na GM1 umožňuje navázání na protein, který způsobuje nitrobuněčnou signalizaci. Je známo, které procesy mohou způsobit nitrobuněčnou signalizaci. Může to být fosfory láce

GM1 nebo proteinu. V případě, že EtxB/CtxB se váže na GM1, který se nachází na povrchu buněk, navázaný GM1 se intemalizuje do vesiklů (Williams et al (1999) Immunology Today 20, 95 až 101). GM1 a jiné glykolipidy (jako je Gb3) jsou známy tím, že se přednostně nacházejí v „membránových štěpech“, kde se také nacházejí klíčové proteinové receptory. Je proto možné, že intemalizace GM1, což je výsledek navázání B-podjednotky, způsobuje spojení takových pro35 teínů, což vede ke zprostředkování nitrobuněčných signalizačních jevů.

Definice

Adjuvans je sloučenina, která nespecificky zvyšuje imunitní odezvu na antigen, čímž se liší od nosiče vakcíny, důvodem je cílení antigenu na požadované místo. Termín „imunomodulátor“ se použije pro indikaci činidla, které působí jako adjuvans, aby stimuloval jistou imunitní odezvu, ale které také řídí imunitní odezvu do určitého směru.

Termín „společná aplikace“ se používá v případě, že místo a čas aplikace antigenu a imunomodu45 látoru jsou takové, že se stimuluje nezbytná imunitní odezva. Zatímco antigen a imunomodulátor se může aplikovat ve stejný okamžik a na stejném místě, může být výhodné aplikovat antigen v odlišném čase a/nebo na odlišné místo ve srovnání s imunomodulátorem. Antigen a imunomodulátor se může aplikovat spolu s prvním krokem pak se může imunitní odezva podpořit v druhém kroku aplikací samotného antigenu.

Termín „antigenní determinanta“ znamená místo na antigenu, které rozeznávají protilátky nebo receptor T-buňky. Přednostně jde o krátký peptid získaný z proteinového antigenu nebo jako jeho část, termín se však také zahrnuje glykopeptidy a sacharidové antigenní determinanty. Termín také zahrnuje upravené sekvence aminokyselin nebo sacharidů, které stimulují odezvy, které rozeznávají celý organizmus.

CZ 302333 Β6

Existuje řada známých metod, kterými je možné identifikovat antigenní determinanty v případě daného infekčního agens.

Potencionální ochranné antigeny se mohou identifikovat zesílením imunitní odezvy v infikovaných pacientech nebo u rekonvalescentů, u infikovaných zvířat nebo rekonvalescentů nebo monitorováním imunitní odezvy in vitro na přípravky obsahující antigen. Například:

i) vzorky sér od infikovaných nebo rekonvalescentních pacientů nebo infikovaných nebo rekonvalescentuích zvířat se mohou testovat proti lyzátům celých buněk infekčním agens nebo lyzáty buněk infikovaných uvedeným činidlem standardními metodami westernová přenosu, aby se detekoval antigen(y) rozeznávané imunitním sérem;

i i) vzorky sér z infikovaných nebo rekonvalescentních pacientů nebo infikovaných nebo rekonvalescentních zvířat se mohou testovat proti částečně nebo vysoce čištěným antigenům, které pocházejí z infekčního agens, nebo lyzáty buněk infikovanými uvedeným agens, standardní metodou testu ELISA, kde částečně nebo vysoce čištěné antigeny se používají k potažení prohlubní na mikrotitračních destičkách nebo pomocí imunoblotování pro detekci těchto antigenů, které jsou rozeznávány imunitním sérem, iii) vzorky séra z infikovaných nebo rekonvalescentních pacientů nebo infikovaných nebo rekonvalescentních zvířat se mohou testovat proti lyzátům celých buněk získaných z rekombinantních expresívních systémů, která kódují jeden nebo více antigenů rozeznávaných imunitním sérem;

i v) vzorky séra z infikovaných nebo rekonvalescentních pacientů nebo z infikovaných nebo rekonvalescentních zvířat se mohou testovat proti expresívní knihovně, která obsahuje klonované geny z infekčních agens za použití imunodetekce přenosem kolonií za účelem zjistit ty klony, které exprimují antigeny nebo jejich fragmenty pomocí imunitního systému nebo

v) PBL z krve infikovaných nebo rekonvalescentních pacientů nebo PBL, buněk mízních uzlin, buněk sleziny nebo buněk lamina propria z infikovaných nebo rekonvalescentních zvířat se mohou kultivovat in vitro v přítomnosti částečně nebo zcela čištěných antigenů získaných buď z infekčního činidla, nebo lyzátů buněk infikovaných uvedeným činidlem nebo rekombinantním expresívním systémem, který kóduje jeden nebo více antigenů tak, že detekuje specifické proliferativní odezvy T buněk.

V jiném případě je možné detekovat genové produkty, které jsou podstatné pro přežití patogenů in vitro jak se ukazuje pomocí metody značené mutageneze vyvinuté Holdenem nebo detekcí genových produktů specificky indukovaných in vivo, jako je IVET (technologie exprese in vivo), kterou vyvinul Mekalanos, nebo diferenciální fluorescenční indukcí, kterou vyvinul Falkow, identifikace sady genů mezi které patří potencionální ochranné antigeny. Za použití těchto metod se mohou genové produkty testovat, jak se uvádí shora v textu. Geny se mohou klonovat do expresívních vektorů a antigeny se získaly z inkluze do vakcinačních sloučenin spolu s činidly, které modulují aktivitu spojenou s glykosfingolipidem.

Zde existuje řada známých metod, které umožňují izolaci antigenů v případě daného infekčního agens.

Povrchové komponenty infekčního činidla obsahující jeden nebo více potencionálních ochranných antigenů se mohou extrahovat z agens nebo z buněk infikovaných agens za použití postupů, které umožní získání antigenů. To může zahrnovat použití metody porušení buněk, přičemž se lyžují buňky, jako je sonikace a/nebo extrakce detergentem.Centrifugace, ultrafíltrace nebo srážení se mohou použít při přípravě shromážděných antigenů. Přípravky antigenů, které obsahují

- 12CZ 302333 B6 glykoproteiny HSV-1 se popisují v publikaci Richards et al., (1998) J. Infect. Dis. 177, 1451 až 7, kde se nacházejí příklady takových metod.

Antigeny infekčního Činidla nebo z buněk infikovaných uvedeným agens se mohou extrahovat s různými postupy, které zahrnují extrakci z moče, zásaditou nebo kyselou extrakci nebo extrakci detergentem a se podrobí chromatografické separaci. Materiál získaný v mezerovém prostoru nebo při maximu eluce obsahující jeden nebo více potencionálních ochranných antigenů se může použít u vakcinačních sloučenin.

ίο V jiném případě geny, které kódují jeden nebo více potencionálních ochranných antigenů se může klonovat do různých expresívních vektorů vhodných pro produkci antigenu. To může zahrnovat bakteriální nebo eukaryontní expresívní systémy. Jsou to například Escherichia coli, Bacillus spp., Vibrio spp., Sacarromyces cerevisiae, buněčné linie savců a hmyzu. Antigeny se mohou získat běžnou extrakcí, separací a/nebo chromatografickými postupy.

Termíny „CtxB“. „EtxB“ a „VtxB“ zahrnují přirozené a rekombinantní formy molekul. Zvláště se preferuje rekombinantní forma. Rekombinantní forma molekuly se může produkovat způsobem, při kterém gen nebo geny kódující specifický polypeptidový řetězec (nebo řetězce), ze kterého se tvoří peptid, se začlení do vhodného vektoru a pak se použije při transfekci vhodného

2(t hostitele. Například gen kódující polypeptidový řetězec, ze kterého vzniká EtxB se pak může začlenit například do plazmidu pMN68, který se pak použije k transfekci hostitelských buněk, jako je Vibrio sp.60. Protein se pak čistí a izoluje řadou způsobů. Mutantní geny exprimující aktivní mutantní protein CtxB, EtxB nebo VtxB se mohou produkovat známými metodami z genu divokého typu.

Termíny „CtxB“, „EtxB“ a VtxB také zahrnují mutantní molekuly a jiné syntetické molekuly (obsahující části CtxB, EtxB nebo VtxB), které si uchovávají kapacitu napodobovat účinky navázání GMl nebo Gb3.

Činidla jiná než je EtxB a CtxB, která si uchovávají vazebnou kapacitu a činidla jiná než VtxB, která si uchovávají vazebnou aktivitu Gb3 zahrnují protilátky, které váží GMl nebo Gb3.

V případě produkce protilátek se různí hostitelé zahrnující kozy, králíky, krysy, myši atd. se mohou imunizovat injekcí GMl nebo Gb3 nebo jejich libovolným derivátem nebo homologem.

V závislosti na specie hostitele mohou se za účelem zvýšení imunologické odezvy použít různá adjuvans. Taková adjuvans zahrnují, ale nejsou omezeny na minerální gely podle Freunda, jako je hydroxid hlinitý a povrchově aktivní látky, jako je lyzolecitin, pluronové polyoly, polyanionty, peptidy, olejové emulze, hemocyanin přílipkovitých plžů a dinitrofenol. BCG (Bacilli CalmetteGuerin) a Corynebacterium parvum se mohou použít jako lidská adjuvans.

Podle vynálezu se preferují humanizované monoklonální protilátky. Monoklonální protilátky se mohou připravit za použití metody, která je vhodná pro produkci molekul protilátek kontinuální kultivací buněčných linií. Metody zahrnují, ale nejsou omezeny na techniku hybridomu, která se popisuje shora v textu (Koehler and Milstein, 1975, Nature 256: 495 až 497), techniku hybrido45 mu lidských B-buněk (Kosbor et al., (1983) Immunol, Today 4: 72, Cote et al., (1983) Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 2026 až 2030) a technika EBV-hybridomu (Cple et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R Liss lne., pp 77 až 96). Navíc se může použít metoda vyvinutá pro produkci „chimérových protilátek“, sestřih genů myších protilátek na geny lidských protilátek za vzniku molekuly s vhodnou antigenní specifitou a biologickou aktivitou (popisuje se v publikaci Morrison et al., (1984) Proč. Nati. Acad, Sci. 81: 6851 až 6855, Neuberger et al., (1984) Nature 312: 604 až 608, Takeda et al., (1985) Nature 314: 452 až 454). V jiném případě metoda popsaná pro produkci protilátek s jedním řetězcem (patent US 4 946 779) se může upravit pro produkci cílové interakční části specifických jednořetězcových protilátek.

- 13 CZ 302333 B6

Protilátky se mohou produkovat indukcí produkce in vitro v populaci lymfocytů nebo testováním knihovny rekombinantních imunoglobulinů nebo panelů vysoce specifických vazebných činidel, jak se popisuje v publikaci Orlandí et al„ 1989, Proč. Nati. Acad. Sci 86: 3833 až 3837 a Winter G and Milstein C., 1991, Nátuře 3837 a Winter G and Milstein C., (1991), Nátuře 349: 293 až

299.

Mohou se vytvořit fragmenty protilátek, které obsahují specifická vazebná místa pro GM1 nebo Gb3. Takové fragmenty například zahrnují fragmenty F(ab')2, které mohou vznikat trávením molekuly protilátek pepsinem a fragmenty Fab, se mohou vytvořit snížením množství disulfidolo vých můstků fragmentů F(ab')i. V jiném případě se může zkonstruovat expresívní knihovna Fab, což umožní rychle a jednoduše stanovit monoklonální fragmenty Fab s požadovanou spécifitou (Huse WD et al., (1989) Science 256: 1275 až 1281).

Peptidové nebo organické knihovny se mohou připravit kombinační chemií a pak se u nich může i? testovat jejich schopnost vázat GMl/Gb3. Syntetické sloučeniny, přirozené produkty a jiné zdroje potencionálně biologicky aktivních materiálů se mohou testovat řadou způsobů, které jsou v oboru dobře známy.

GMl nebo Gb3 nebo jejích fragmenty se mohou použít při testování peptidů nebo molekul libovolnou z řady testovacích technik. Molekula může být volná v roztoku, fixovaná na pevném povrchu, může vznikat na buněčném povrchu nebo se může nacházet uvnitř buňky. Měří se odstranění aktivity nebo tvorby vazebných komplexů mezi GMl nebo Gb3.

Jiný způsob stanovení navázání na GM1/Gb3 je použitím čištěného GM1/Gb3 pro potažení mikrotitračních destiček. Po blokování destiček se zkoumané činidlo aplikuje na destičku a nechá se reagovat před promytím a detekcí se specifickými protilátkami s uvedeným činidlem. Konjugace protilátek buď přímo, nebo nepřímo s enzymem nebo s radioaktivní značkou umožňuje následnou kvantifikaci navázání buď za použití kolorimetrických, nebo radioaktivních metod (test EL1SA nebo RIA).

Jiný způsob navázání GM1/Gb3 je navázáním sacharidové části GMI/Gb3 na vhodnou kolonovou matrici, aby mohla proběhnout standardní afinitní chromatografie. Odstranění známých sloučenin aplikovaných na kolonu z ředidla se použije jako důkaz pro vazebnou aktivitu, kde směs sloučenin se aplikuje na kolonu. Eluce a následná analýza stanoví vlastnosti činidla vázané35 ho na gangliozid. V případě proteinů analýza bude zahrnovat sekvenování peptidů a mapování tryptickým štěpením, pak následuje porovnávání s dostupnou databází. Jestliže eluované proteiny se nemohou identifikovat způsobem standardní biochemické analýzy, pak se pro další charakterizace sloučeniny použije například stanovení hmotnosti laserovou desorpční hmotnostní spektrofotometru. Neproteinové látky, které se eluovaly z GMl-afinitních kolon se budou analyzovat io pomocí HPLC a hmotnostní spektrofotometr!(jednotlivých homogenních píků.

Jiným způsobem stanovení schopnosti vázat se na GM1/Gb3 a přesné afinity interakce bude použitím plasmonové povrchové rezonance, jak se popisuje v publikaci Kuziemko et al,, (1996) Biochem. 35: 6375 až 6384).

V jiném případě vykázání fágů je možné použít pri identifikaci vhodného činidla, které se váže na GMl nebo Gb3.

Vykazování fágů je protokol molekulárního testování, které využívá rekombínantního bakterioso fága. Technologie zahrnuje transformaci bakteriofága genem, který kóduje vhodný ligand (v tomto případě vhodného kandidáta jako činidlo), jenž je schopný reagovat s GM 1 /Gb3 (nebo jeho derivátem nebo homologem) nebo nukleotidovou sekvenci (nebo jeho derivát nebo homolog), která kóduje to samé. Transformovaný bakteriofág (kteiý se přednostně váže na pevný povrch) exprimuje vhodný ligand (takový, jako je kandidát činidla) a objevuje se v obalu fága.

Izolovaly se a amplifikovaly se entity (jako jsou buňky) nesoucí cílové molekuly, které rozezná- 14 CZ 302333 B6 vají kandidáta činidla. Úspěšný kandidát činidla se pak dále charakterizuje. Vykázání fága má ve srovnání se standardní technologie testování afinity ligandů jisté výhody. Na povrchu fága se objevuje kandidát činidla ve třírozměrné konfiguraci, která je velmi blízká jeho přirozené konfiguraci. To umožňuje specifické a vysoce afinitní navázání za účelem testování.

Jinou metodou testování je testování s vysokou propustností. Testují se činidla, která mají vhodnou vazebnou afinitu vůči GM1 nebo Gb3 a testy se zakládají na metodě popsané v dokumentu WO 84/03 564. Na pevném substrátu se syntetizovalo velké množství různých malých peptidových testovaných sloučenin, jako jsou plastové kuličky nebo některé jiné povrchy. Peptidová io testovací činidla reagují s fragmenty cílových interakčních komponentů a promyjí se. Vázaný cílový interakční komponent se pak detekuje vhodnou adaptovanou metodou známou v oboru.

Čištěný cílový interakční komponent se může také protáhnout přímo na plotny za účelem použití ve shora v textu popsané testovací metodě vhodné pro léky. V jiném případě se mohou pro zachycení peptidu použít protilátky, které nejsou neutralizující, a mobilizují ho na pevném povr15 chu.

Činidlo, které vykazuje GMI nebo Gb3 vazebnou aktivitu je také schopné zesítění receptorů GM1 nebo Gb3. EtxB je jedno takové činidlo, které je schopné zesítění receptorů GM1 na základě své pentamemí formy.

Existuje řada metod pro identifikaci činidel, které vykazují účinek na nitrobuněčnou signalizaci zprostředkovanou navázáním GM1/GĎ3, ale které se sami neváží na GMi nebo Gb3. Jestli například činidlo pozitivně reguluje CD25 nebo MHC třídy Π na B buňkách nebo pozitivně reguluje CD25 nebo podporuje apoptózu buněk CD8+T nebo pozitivně reguluje vylučování II—10 mono25 cyty, není schopno se vázat na GM1 nebo Gb3 (což se prokáže jedním z vazebných testů, které se popisují shora v textu), pak je možné vytvořit závěr, že činidlo je schopné napodobit účinek navázání na GMl/Gb3.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. 1 znázorňuje stimulaci celkového Ig a IgA v séru (MS) a IgA v roztoku po promytí očí (EW) u myší imunizovaných HSV-1 glykoproteiny/rEtxB.

Obrázek č. 2 znázorňuje proliferaci T buněk (mezenterických mízních uzlin) MLN nebo (cervikálních mízních uzlin) CLN lymfocytů u myší imunizovaných HSV-1/rEtxB.

Obrázek č. 3 znázorňuje T buněčnou proliferaci buněk z MLN a CLN myší imunizovaných intranazálně HSV-1 Gp v přítomnosti 1 až 20 gg EtxB.

Obrázek Č. 4 znázorňuje množství anti—HSV-1 sérového lg u myší po aplikaci glykoprcteinů HSV-l třikrát v desetidenních intervalech s různým množstvím rEtxB nebo rCtxB jako adjuvans.

Obrázek č. 5 znázorňuje omezení tvorby viru, klinického onemocnění a latence u myší imunizo45 váných HSV-1/rEtxB.

Obrázek č. 6 znázorňuje distribuci izotopu Ig v MS následující po infekci způsobené HSV-1 nebo po imunizaci HSV-1 Gp v přítomnosti EtxB nebo CtxB jako imunomodulátoru.

Obrázek č. 7 znázorňuje distribuci podtříd Ig po intranazální aplikaci HSV-1 Gp buď rEtxB, nebo rCtxB jako imunomodulátoru.

Obrázek č. 8 znázorňuje imunogenní účinek různého množství rEtxB nebo rCtxB na množství IgA specifických pro HSV-1 v roztoku po promytí očí, což následuje po aplikaci glykoproteinů

HSV-1.

- 15 CZ 302333 B6

Obrázek č. 9 znázorňuje odezvu sérových imunoglobulinů po imunizaci myší HSV-1 nebo samotných napodobenin glykoproteinů (gp) nebo glykoproteinů v přítomnosti adjuvans.

Obrázek č. 10 znázorňuje sliznicové IgA v roztoku po vymytí očí po intranazální imunizaci myší HSV-1 nebo samotnými napodobeninami glykoproteinů nebo v přítomnosti adjuvans.

Obrázek Č. 11 znázorňuje sliznicové IgA v roztoku po promytí vagíny po intranazální imunizaci myší HSV-1 nebo samotnými napodobeninami glykoproteinů (gp) nebo napodobeninami glykoproteinů v přítomnosti adjuvans.

Obrázek č. 12 znázorňuje množství imunoglobulinu specifického pro HSV-1 v séru myší imunizovaných glykoproteiny HSV-l v přítomnosti různých dávek rEtxB jako adjuvans.

Obrázek č. 13 znázorňuje množství IgA v roztoku po promytí očí u myší imunizovaných glykoproteiny HSV-1 v přítomnosti různých koncentrací rEtxB.

Obrázek č. 14 znázorňuje množství IgA v roztoku po promytí vagíny u myší imunizovaných glykoproteiny HSV-1 v přítomnosti různých koncentrací rEtxB.

Obrázek č. 15 znázorňuje distribuci podtřídy IgG odezvy sérových protilátek na HSV-1 po intranazální imunizaci Ctx/CtxB nebo rEtxB nebo po oční infekci HSV-1.

Obrázek č. 16 znázorňuje produkci cytokinů z kultur buněk mízních uzlin, které se odebraly z myší infikovaných buď HSV-1 prostřednictvím skarifikace očí, nebo se imunizovaly intranazální aplikací HSV-1 glykoproteinů Ctx/CtxB nebo rEtxB jako adjuvans.

Obrázek č. 17 znázorňuje stupeň ochrany před oční infekcí HSV-1 u myší imunizovaných intranazálně směsí HSV-1 nebo glykoproteiny v přítomnosti rEtxB jako imunomodulátoru.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: rEtxB se může pro účely imunizace používat ve spojení s HSV-1 Gp.

Myši se imunizovaly intranazálně třikrát lOpg glykoproteinů HSV-1 (Gp) a buď s 10, nebo 20 pg rEtxB. Kontroly se buď neupravovaly, nebo vznikly napodobeniny virového glykoproteinů získaného z tkáňových kultur buněk, které nejsou infikovány HIV. Množství protilátek se exprimuje jako procento množství po infekci. Produkce celkového množství Ig a IgA v séru a IgA v roztoku po promytí očí se stimulovalo HSV-1 glykoproteiny/rEtxB (obrázek č. 1). Ukázalo se, že dávky rEtxB, které jsou tak nízké jako je 0,1 pg, jsou stále účinné při stimulaci uvedené odezvy.

T-lymfocyty, které pocházejí z imunizovaných myší z cervikálních mízních uzlin (které tvoří vakcinační místo) a z mezenterických mízních uzlin (které jsou vzdáleny od vakcinačního místa), proliferují, když se kultivují in vitro HSV-1, ale nikoliv, když se kultivují in vitro s napodobeninou HSV-1 Gp nebo bez antigenu (obrázek č. 2).

Proliferace T lymfocytů MLN a CLN myší imunizovaných HSV-1 Gp a kolísavé množství EtxB při odezvě HSV-1 Gp je zobrazeno na obrázku č. 3.

Produkce sérových Ig anti-HSV-1 u myší po aplikaci glykoproteinů HSV-1 ve třídenních intervalech s různými množstvími EtxB (nebo CtxB) je zobrazena na obrázku č. 4.

- 16CZ 302333 B6

Nakonec se ukázalo, že myši imunizované HSV-1 a rEtxB vykazují zvýšenou tvorbu viru po skarifikaci rohovky HSV-1 (obrázek č. 5a) a omezení lokálního šíření (otok), rozšíření tri gem i nálního ganglionu (infekce zosteriformu), rozšíření na centrální nervový systém (encefalitida) a latenci ve srovnání s kontrolou (5b).

Příklad 2: rCtxB a rEtxB působí jako imunomodu látory

V případě, že EtxB se použije jako imunomodulátor, rozložení izotopu Ig je asymetrické (obrázek č. 6). Rozložení podtříd Ig se liší v závislosti na skutečnosti, zda se použije jako imunomodulátor rCtxB nebo rEtxb (obrázek č. 7).

Příklad 3: rEtxB je účinnější modulátor ve srovnání rCtxB

Množství IgA specifického pro HSV (obrázek č. 8) je po stimulaci rEtxB/HSV-1 Gp vyšší ve srovnání s rCtxB/HSV-1 Gp.

Příklad 4: (obrázek č. 9)

Myši se imunizovaly třikrát intranazálně se samotnými glykoproteiny HSV-l, napodobenými přípravky glykoproteinů HSV-1 (připravených tak, že se vezmou neinfikované tkáňové kultury buněk a vystavíme je stejnému režimu léčby jako ty buňky, které slouží pro izolaci a čištění protein HSV-1) nebo glykoproteiny HSV-1 v kombinaci s různými zdánlivými slizničními adjuvans. V každém případě dávka glykoproteinů HSV-1 byla při imunizaci 10 pg a ty se kombinovaly s 10 pg rekombinantního EtxB nebo CtxB, které slouží jako adjuvans nebo směs 0,5 pg Ctx a 10 pg CtxB. Tři týdny po konečné imunizací se sebraly vzorky krve a testem ELISA se změřilo celkové množství protilátek proti HSV-1. Množství protilátek se vykazuje jako procento množství stimulovaných po oční infekci vyvolané skarifikaci s 10⁵ pfu HSV-1 kmen SC16. Data (zobrazená na obrázku č. 9) ukazují, že nej silnější sérová proti látková odezva se stimuluje, když se antigen kombinuje se směsí celého Ctx a CtxB. Silná odezva se však také stimuluje, když se rEtxB použije jako adjuvans. Naopak rCtxB je velmi slabé adjuvans.

Příklad 5 (obrázek č. 10)

Myši se imunizovaly jak se popisuje v příkladu 4. Sekreční produkce IgA v očích se testovaly tak, že se získaly roztoky vymytím slz z očí v po sobě jdoucích dnech a tyto vzorky se pak shromáždily a zkoumaly se testem ELISA za použití specifických protilátek, které detekují IgA. Množství protilátek se exprimuje jako procento množství stimulované po oční infekci vyvolané 10⁵ pfu HSV-1 kmen SCI6. Data jasně demonstrují (znázorněno na obrázku č. 10), že vysoké množství vylučovaných protilátek se produkuje po imunizaci v přítomnosti buď Ctx/CtxB, nebo EtxB. Na rozdíl od výsledků analýzy sérové protilátkové odezvy neexistuje rozdíl v množství protilátek v očích mezi zvířaty imunizovanými Ctx/CtxB nebo EtxB, které slouží jako adjuvans. Stejně jako se sérovými protilátkami existuje jasný důkaz, že rCtxB je velmi slabé adjuvans,

Příklad 6: (Obrázek č. 11)

Myši se imunizovaly způsobem, který se popisuje v příkladu 4. Sekreční produkce IgA ve vagíně se testovala odebráním roztoku po promytí pohlavních orgánů v po sobě jdoucích dnech a tyto vzorky se pak slily a testovaly se testem ELISA za použití specifických anti-IgA detekčních protilátek. Množství protilátek se vyjadřuje jako koncové titry, které se vypočítaly lineární regresní analýzou. Data jasně ukazují, že velké množství vylučovaných anti-HSV-1 protilátek se produ- 17 CZ 302333 B6 kuje v jistých místech sliznice po imunizaci v přítomnosti buď Ctx/CtxB, nebo EtxB. Ve vagíně sc uvolňuje největší množství protilátek po imunizaci v přítomnosti rEtxB. Menší množství se uvolnilo po imunizaci Ctx/CtxB a k velmi malému vylučování dochází, když se jako adjuvans použije rCtxB.

Příklad 7: (obrázek č. 12)

Myši se imunizovaly třikrát intranazálně glykoproteiny HSV—1 (10 gg), a to buď samotnými, ιο nebo v přítomnosti zvyšující se dávky rEtxB, které slouží jako adjuvans. Tři týdny po konečné imunizaci se odebrala krev a množství anti-HSV-protilátek se testovalo testem ELISA. Množství protilátek se vyjádřilo jako procento množství vyvolané po oční infekci indukované skarifikací

10⁵ pfu HSV-1 kmen SC16. Data jasně ukazují, že kapacita rEtxB vyvolat protilátkovou odezvu na heterologní přidané antigeny je jev závislý na dávce, kdy maximální odezva se objeví při dávi5 ce v množství 20 až 50 gg rEtxB. Dále je jasné, že při dávce 20 gg rEtxB je množství anti—HSV1 protilátek stimulovaných intranazální infekcí srovnatelná nebo vyšší s množstvím vyvolané infekcí živým virulentním virem.

Příklad 8: (obrázek č. 13)

Myši se imunizovaly, jak se popisuje v příkladu 7. Sekreční produkce IgA v očích se stanovila získáním roztoků po vymytí slz v po sobě jdoucích dnech a tyto vzorky se pak slily a testovaly se testem ELISA za použití specifických anti-IgA detekujících protilátek. Množství protilátek se exprimuje vyjadřuje jako procento množství stimulované po oční infekci vyvolané skarifikací

Kf pfu HSV-1 kmen SCI6. Data demonstrují, že maximální IgA odezva v očích se stimuluje, když se aplikují HSV-1 glykoproteiny v kombinaci s 20 gg rEtxB. Při této dávce Produkce IgA je nižší než produkce během virové infekce očí.

Příklad 9: (obrázek č. 14)

Myši se imunizovaly způsobem, který se popisuje v příkladu 7. Sekreční produkce IgA ve vagíně se stanovila tak, že se získaly roztoky po promytí pohlavních orgánů během po sobě jdoucích dní a tyto vzorky se pak slily a testovaly se testem ELISA za použití specifických anti-IgA detekujících protilátek. Množství protilátek se vykazuje jako konečné titry, které se vypočítaly lineární regresní analýzou. Data ukazují, že optimální anti-HSV-1 odezva se stimuluje ve vagíně, když se jako adjuvans použije 20 gg nebo více rEtxB.

Příklad 10: (obrázek ě. 15)

Myši se infikovaly buď 10⁵ pfu HSV-1 kmen SCI6 skarifikací rohovky, nebo třínásobnou nazální imunizací 10 gg glykoproteinů HSV-1 v kombinaci Ctx/CtxB nebo rEtxB. Tři týdny po konečné inokulaci se odebralo sérum a analyzovala se vněm testem ELISA přítomnost IgGl IgG2 proti HSV-1. Množství protilátek se exprimovalo jako konečné titry, které se vypočítaly lineární regresní analýzou (obrázek ě. 7a). Data jasně ukazují, že podstata protilátkové odezvy na HSV-1 je ovlivněna způsobem, jakým se antigeny prezentují imunitnímu systému. Infekce HSV-1 přednostně aktivuje produkci protilátek spojenou s Thl, jak se charakterizuje vysokým množstvím izotypu protilátek fixující komplement IgG2a, Infekce stimuluje relativně malé množství isotypu IgG spojeného s Th2 IgGl. Tento profil imunitní odezvy je jasně viditelný, když data se exprimují jako poměr IgGl :IgG2, jak se ukazuje na obrázku ě. 7b. Poměr je po infekci podstatně nižší než 1. Intranazální imunizace v přítomnosti Ctx/CtxB jako adjuvans umožňuje uvolnění IgGl spojeného sTh2. Také se produkuje podstatné množství IgG2, což naznačuje, že

Ctx/CtxB způsobuje aktivaci buněk Thl a Th2. Aktivace obou odezev a relativní dominance Th2

- 18CZ 302333 B6 se odráží v poměru lgGl:IgG2, který je přibližně 3. Je zajímavé, že podstata odezvy na HSV-1 stimulovaná rEtxB, které slouží jako adjuvans, skoro exkluzivně dominuje Th2. Vysoké množství IgGl vzniká pouze s malým množstvím lgG2a. Tento silný sklon směrem kTh2 odpovědi se odráží v hodnotě poměru IgGl: IgG2, která je přibližně 9.

Příklad 11: (obrázek č. 16)

Myši se infikovaly bud’ 10⁵ pfu HSV-1 kmen SCI6 skarifikací rohovky, nebo se třikrát imunizoio vály intranazálně 10 gg HSV-1 glykoproteiny v kombinaci s Ctx/CtxB nebo rEtxB. Tři týdny po konečné inokulaci se ze zvířat odstranily mízní uzliny a použily se k vytvoření suspenzí z jediné buňky, které se kultivovaly buď v přítomnosti mrtvých HSV-1, nebo napodobeniny přípravku viru z tkáňových kultur buněk, které nejsou infikovány. 4. a 7. den kultivace se odebraly vzorky a provedl se test ELISA, přičemž se projevilo vylučování cytokinů. Data jasně ukazují, že Τι 5 buňky v kulturách byly schopny odpovídat na HSV-1, ale nikoli na napodobeninu virového přípravku. Buňky mízních uzlin získané z myší, které se infikovaly HSV-1, produkují převážně cytokin spojený s Thl γ-interferon (γ-IFN). Buňky mízních uzlin odebrané zvířatům, které se imunizovaly intranazálně produkovaly velké množství cytokinů spojených sTh2, IL-4 a IL—10.

Navíc, jak Ctx/CtxB a rEtxB vedly k aktivaci T buněk, které vylučují γ-IFN po in vitro stimulaci 20 pomocí HSV-1. To indikuje, že ačkoli při odezvě na adjuvans dominuje produkce cytokinů Th2, objevuje se také aktivace Thl. Toto zjištění odpovídá zjištění vycházející z analýzy protilátkové odpovědi.

Claims (23)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   30 1. Vakcína, obsahující imunomodulátor pro prevenci nebo léčení infekčního onemocnění, vyvolaného bakterií, parazitem, patogenem zažívací soustavy nebo dýchacího systému nebo virem ze skupiny virus herpes, HIV, virus spalniček, příušnic nebo rotavirus, vyznačující se tím, že

   35 imunomodulátor se volí ze skupiny, zahrnující EtxB, CtxB nebo VtxB, prosté celého toxinu, vakcína obsahuje také antigen nebo antigenní determinantu uvedeného infekčního agens a imunogenní modulátora antigen nebo antigenní determinanta jsou samostatné skupiny.
2. 2. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že imunomodulátorem je EtxB bez celého toxinu.
3. 3»

   3. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním

   45 je onemocnění, vyvolané virem ze skupiny virus herpes.
4. 4. Vakcína podle nároku 3, vyznačující se tím, že se infekční agens volí ze skupiny, zahrnující HSV-1, HSV-2, EBV nebo CMV.

   50
5. 5. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků laž4, vyznačující se tím, že onemocnění souvisí s EBV.
6. 6. Vakcína podle nároku 5, vyznačující se tím, že onemocněním je nasopharyngeální karcinom nebo Hodgkinův lymphom.

   - 19CZ 302333 B6
7. 7. Vakcína podle nároku 5, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je onemocnění respiračního traktu.
8. 8. Vakcína podle nároku 7, v y z π a č uj í c í se t í m, že infekčním onemocněním je TB.
9. 9. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je gastrointestinální onemocnění.

   H)
10. 10. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je parazitární onemocnění.
11. 11. Vakcína podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je onemocnění, vyvolané bakteriemi.

    15
12. 12. Vakcína podle nároku 11, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je onemocnění, vyvolané E. coli, Salmonella, Shigella, Chlamydia, N. gonorrheae, T. pallidum nebo Streptococcus species včetně kmenů, vyvolávajících zubní kaz.
13. 13. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12, vyznačující se tím, že obsahuje 20 imunomodulátor, zvolený ze skupiny zvyšující při léčení nebo prevenci infekčního onemocnění produkci protilátek na povrchu sliznic.
14. 14. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že obsahuje imunomodulátor, zvolený ze skupiny, prodlužující při léčení nebo prevenci infekčního onemoc25 není prezentaci antígenu a udržující imunologickou paměť savce.
15. 15. Vakcína podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeho složky jsou zpracovány na farmaceutický prostředek.
16. 16. Vakcína podle nároku 15, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je infekce HSV-1 a antigenní determinantou je antigenní determinanta HSV-l.
17. 17. Vakcína podle nároku 15, vyznačující se tím, že infekčním onemocněním je infekce EBV a antigenní determinantou je antigenní determinanta EBV.
18. 18. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 15, 16 nebo 17, vyznačující se tím, že imunomodulátorem je EtxB bez celého toxinu.
19. 19. Vakcína podle kteréhokoliv z nároků 15 až 18, vyznačující se tím, že obsahuje 40 antigen, přičemž antigenní determinanta je součástí antígenu.
20. 20. Sestava pro očkování savce proti infekčnímu onemocnění, vyvolanému infekčním agens definovaným v nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje

    45 (i) antigenní determinantu infekčního agens, definovaného v nároku 1 a (ii) imunomodulátor ze skupiny EtxB, CtxB nebo VtxB, prostý celého toxinu, pro současné podání savci.
21. 21. Použití imunomodulátoru pro výrobu léčebného prostředku pro prevenci nebo léčení infekčního onemocnění, vyvolaného bakterií, parazitem, patogenem zažívací soustavy nebo dýchacího systému nebo virem ze skupiny virus herpes, HIV, virus spalniček, příušnic nebo rotavirus, přičemž

    -20CZ 302333 B6 imunomodulátor se volí ze skupiny, zahrnující EtxB, CtxB nebo VtxB bez celého toxinu, léčebný prostředek obsahuje také antigen nebo antigenní determinantu uvedeného infekčního agens a imunogenní modulátor a antigen nebo antigenní determinanta jsou samostatné skupiny.
22. 22. EtxB nebo CtxB bez celého toxinu pro léčení onemocnění, spojeného s EBV.

    io
23. 23. EtxB nebo CtxB bez celého toxinu podle nároku 21, kde onemocněním, spojeným s EBV je nasopharyngeální karcinom nebo Hodgkinův lymphom.