CZ30265U1 - Mořicí zařízení obsahuje naklápěcí páteřový rám (8), na kterémje uspořádán míchací buben (1) včetně hnacího motoru (15), násypka (6) se škrticí klapkou (2) a rozprašovací tryskou (17) a výsypka (7), na kterou navazuje rozváděči šoupátko (19) a hrdlo (18) pro pytlování. Míchací buben (1)je uvnitř opatřen alespoň jednou řadou gravitačních žeber (3) se šikmo uspořádanými nabíracími lopatkami (4). Mořicí zařízeníje vhodné pro moření obilí o různých velikostech zrna. - Google Patents

Description

Oblast techniky

Technické řešení se týká hydrofobizováných esterových derivátů kyseliny hyaluronové nebo jejich solí obsahující alkylarylové nebo alkylheteroarylové substituenty, způsobu jejich přípravy a jejich použití pro enkapsulaci biologicky aktivních aromatických látek nerozpustných ve vodě. Hydrofobní substituenty hyaluronanu mohou ve vodných roztocích agregovat, vytvářet nepolární domény, ve kterých mohou být nekovalentně enkapsulovány kosmeticky nebo farmaceuticky aktivní látky pomocí fyzikálních π-π interakcí. Technické řešení se také týká nanomicelární kompozicí, způsobu jejich přípravy a použití pro farmaceutické a kosmetické aplikace.

Dosavadní stav techniky

Kyselina hyaluronová (nebo také hyaluronan neboli HA vzorce 1 níže) je polysacharid tvořený opakujícími se disacharidovými jednotkami glukuronové kyseliny a A-acetylglukosaminu spojených β-(1,4) a β-(1,3) glykosidovými vazbami. Molekulová hmotnost se pohybuje v rozmezí 10⁴ - 10⁷ g/mol. HA je hlavní komponentou extracelulámí matrix a je esenciální pro správný buněčný růst, strukturní stabilitu orgánů a organizaci tkání. Z farmaceutického hlediska je HA slibná látka díky svým vlastnostem, jako je biodegradabilita, biokompatibilita a netoxicita.

Modifikace kyseliny hyaluronové

Kyselina hyaluronová může být modifikována na hydroxylových či karboxylových skupinách. K modifikačním reakcím HA jsou používána různá aktivační činidla, která však mají mnohé nevýhody. Podle US 2007/0224277 se A/JY-karbonyldiimidazol (CDI) jako činidlo využívá pro přípravu esterů hyaluronanu (Schéma 1).

ha-cooh +

co₂

r₄oh

Ri

ΗΝ'^Ν \=J

Schéma 1: Schéma tvorby esteru pomocí CDI

Nicméně i CDI má mnohé nevýhody: je náchylné k hydrolýze a s vodou reaguje bouřlivě za vzniku CO₂ a imidazolu (viz Schéma 2) [1]. Musí být proto používán v prostředí bezvodých organických rozpouštědel, jako např. CHC1₃, THF, benzenu nebo DMF, ve kterých je však HA (kyselá i nativní forma) velmi obtížně rozpustná. Acylimidazolové deriváty jsou všeobecně relativně stabilní, a tedy i méně reaktivní, což může způsobit vznik vedlejších produktů [2]. Použití výrazného nadbytku CDI reakci urychlí, ale nadbytečný CDI zůstává v reakční směsi a brání acylaci [3].

- 1 CZ 30265 UI

C^N + h₂o + co.

Schéma 2: Hydrolýza CDI s vodou

K urychlení reakce jsou proto běžně přidávány organokatalyzátory jako 1-hydroxy-benzotriazol (HOBt), či l,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en (DBU) aj. Použití těchto činidel však s sebou nese mnohé nevýhody, jako je riziko exploze (HOBt) či toxicita (DBU) (Larrivee-Aboussafy et al., 2010). Podle US 2007/0224277 může být esterifikace doprovázena, při použití CDI jako aktivačního činidla, kross-linkační reakcí mezi hydroxylem a karboxylem HA. Patentový dokument US 2012/8324356 popisuje esterifikaci HA pomocí CDI ve formamidu, který je však teratogenní. CDI není použitelný ani pro reakce ve vodném prostředí, protože rychle degraduje (viz Schéma 2 výše). Podle patentového dokumentu WO 2012/013670 nebylo vyššího stupně substituce dosaženo ani při esterifikaci v THF, kde SS získaného produktu byl 2 %. Podle US 2012/0289478 byl získán produkt s SS = 7 % při hydrofobizaci kyselinou 3,4-dihydroxyskořicovou, ale také ve formamidu.

Modifikace karboxylových skupin HA není výhodná, pokud je zamýšlená aplikace derivátu HA spojena s terapií, ve které hrají důležitou roli HA receptory, protože chemická modifikace karboxylových skupin HA mění její biologické chování v organismu. HA nebývá po takové modifikaci rozpoznávána receptory pro HA [4]. V patentovém dokumentu US 1986/4851521 je popsáno, že estery HA modifikovaných přes karboxylovou skupinu HA jsou špatně rozpustné ve vodě (v závislosti na stupni substituce a Mw). Tato vlastnost limituje využití těchto derivátů jako nosičů aktivních látek, protože při některých, zejména farmaceutických aplikacích (např. intravenózních podáních) je nezbytné, aby byly polymemí nosiče zcela dobře rozpuštěné ve vodném prostředí, a neagregovaly ve větší celky.

Dalším běžně používaným aktivačním činidlem pro hydrofobizace HA je l-ethyl-3-(3-dimethylaminoisopropyl)karbodiimid (EDC). EDC je ve vodném prostředí používán spolu s organokatalyzátorem N-hydroxysukcimmidem (NHS) [1], ale i přesto modifikační reakce poskytují jen deriváty s nízkým stupněm substituce. Navíc při použití EDC může dojít k tvorbě nežádoucích vedlejších produktů a to intramolekulámím přesmykem vznikajícího acylu intermediátu: NHS-ester, anbydridy karboxylových kyseliny. N-acylmočoviny, nezreagované kyseliny a hydrolyzovaný terč. butyl ester [5]. Další velkou nevýhodou použití EDC/NHS je také nezbytnost kontroly pH reakce. NHS-intermediát vzniká při kyselém pH (3,5 - 4,5), zatímco nukleofilní atak aminu žádá neutrální či zásadité pH, ve kterém je NHS-intermediát hydrolyticky labilní [6]. Tyto reakční podmínky (zejména kyselé pH) navíc způsobují degradaci HA. Kromě výše zmíněných činidel může být HA aktivována také pomocí 4-(4,6-dimethoxy-l,3,5-triazin-2-yl)-4-methylmorfolinium chloridu (DMTMM). Pro modifikace HA byl popsán jako optimální nevýhodný až 4 násobný molámí nadbytek DMTMM vůči HA a dlouhá reakční doba (až 5 dní), (EP 2008/1992364, D’Este. Eglin & Alini, 2014).

Ν,Ν’-Dicyklohexylkarbodiimid (DCC) je kondenzační činidlo používané při přímých kondenzacích karboxylových kyselin s aminy a alkoholy. DCC je ve vodě nerozpustný, proto reakce se provádí v polárních aprotických organických rozpouštědlech (například v DMSO nebo DMF). V tomto prostředí je sodná sůl kyseliny hyaluronové nerozpustná a musí být převedena na kyselou formu či tetrabutylamoniovou sůl. Nevýhodou tohoto postupuje, že způsobuje degradaci řetězce HA [7]. Samotný DCC vykazuje nízkou reaktivitu, a proto se používá spolu s organokatalyzátory, například l,l,3,3-tetramethyl-4-(4-pyridyl)guanidinem [8], který je však komerčně nedostupný nebo 4-dimethylaminopyridinem (DMAP). Ve velkém molámím množství DCC dochází k intrai intermolekulámímu kross-linku HA.

Amfifilní graft polymer HA s aromatickým řetězcem jako nosič

Příprava amfifilního graft polymeru kyseliny hyaluronové byla provedena pomocí poly(a-kaprolaktonu) (PCL), který byl připraven polymerizací benzylalkoholu a ε-kaprolaktonu (viz vzorec 2

-2CZ 30265 Ul níže). Tato syntéza vykazuje mnoho nevýhod: využívá kyselou formu hyaluronanu a vysokou teplotu (80 °C po dobu 4 h), což degraduje polysacharidový řetězec, dalším problémem je použití bezvodého DMSO a inertní atmosféry, což je v průmyslovém měřítku neuskutečnitelné. Poslední nevýhodou je nemožnost přesně definovat délku alifatického řetězce během polymerizace. PCL je syntetický polymer, při jeho syntéze se používá vysoce toxický katalyzátor (2-ethylhexanoát cínatý), jenž není doporučený pro biomedicínské aplikace, což je zásadní problém kvůli registrační dokumentaci [9]. Velikou nevýhodou polymemích micel je relativně vysoké CAC (0,05 g.ml'¹)

vzorec 2: HA modifikovaná polykaprolaktonem

Pyrenem substituovaný hyaluronan byl připraven a popsán v publikaci [10]. 1-Pyrenmethylamin je navázán na karboxylovou skupinu HA a blokuje terapeuticky významné karboxylové skupiny HA [11]. Podobné výsledky byly získány s konjugátem 1-pyrenylbutyrové kyseliny a hyaluronanu pro cílení do nádorových buněk [12]. Bohužel, deriváty pyrenu způsobují nádory u myší po dermální i podkožní expozicí (Report on Carcinogens, 12. vydání, 2011, US Department of Health and Human Services, Public Health Service, National Toxicology program). Micely na bázi PEG, kyseliny skořicové a HA vykazovaly pomalé uvolňování léčiva a dosahovaly malého průměru. Hlavní nevýhodou těchto polymemích micel je vysoké CAC (0,366 mg/ml), nízká stabilita v krevních proteinech, zejména albuminu, a- a β- globulinu a γ- globulinu [13], která je způsobena jejich adsorbcí na povrch micel [14],

Polymemí micely na bázi graftované HA však také mají nějaké nevýhody:

1) známé polymemí micely HA patricí do stavu techniky nejsou vhodné pro použití in vivo, protože mohou mít nežádoucí vlastnosti, například vysokou toxicitu díky použitému línkem 1-pyrenmethylaminu.

2) hodnota CAC je vysoká, například od 0,12 nebo 0,30 mg/ml a vyšší [15]

Blokové kopolymery na bázi hyaluronanu (Di)-blokové kopolymery byly syntetizovány na reduktivním konci hyaluronanu nebo jiných polysacharidů pomocí oximové vazby („click reakcím“), v dextranu, hyalurononu nebo chitosanu [16]. Bohužel, pro tuto modifikaci je nutné HA převést na její kyselou formu [17], což způsobuje degradaci řetězce. Pro tento typ ko-polymeru hodnota CAC není známá.

Amfifilní kopolymery jako nosiče

Xu et al. publikovali amfifilní kopolymery poly(e-kaprolaktonu) (PCL) a poly(ethylenglykolu) (PEG), ale nevýhodou blokových kopolymerů oproti grafit polymerům je vysoká kritická agregační koncentrace (CAC) [18].

-3CZ 30265 Ul

Aromatické blokové kopolymery jako nosiče

Známé jsou například polymemí micely na bázi poly(ethylenglykol)-b-poly(karbonátko-L-laktid)blok kopolymeru [19] či micely aromaticky esterifikovaného poly(ethylenglykol)poly(betabenzyl L-aspartát)blok kopolymeru [20]. PEG je syntetický nebiodegradabilní polymer [21]. Nevýhodou syntetických polymeruje, že jejich charakter je tělu cizí a že může docházet kjejich nechtěné akumulaci v organismu.

Patentový dokument WO 2014082609 popisuje acylované deriváty HA, které však nevykazují potřebnou míru enkapsulace biologicky aktivních látek, zvláště těch, jež obsahují aromatickou strukturu nebo obsahují vyšší počet násobných vazeb. Jejich vazebná kapacita není dostatečná pro aplikační využití.

Podstata technického řešení

Vzhledem k tomu, že ELA nemůže být použita k agregaci a enkapsulaci hydrofobních léčiv ve své nativní formě, musí být k tomuto účelu provedena její modifikace. Vhodnou modifikací mohou být pro různé aplikace zlepšeny i další přirozené fyzikálně-chemické vlastnosti HA jako její rozpustnost, viskozita či amfifilita. Jak bylo popsáno výše, syntetické polymery HA stavu techniky mají značné nevýhody pro jejich použití k enkapsulaci biologicky aktivních aromatických látek nerozpustných ve vodě. Proto byly připraveny hydrofobizované esterové deriváty kyseliny hyaluronové nebo jejich soli obecného vzorce I podle technického řešení, obsahující alespoň jeden alkylarylový nebo alkylheteroarylový substituent

R¹ je H⁺ nebo její sůl,

R² je H nebo -CO(CH2)xC6H4-pR⁵ nebo -CO-C6H4-/?O(CH₂)_yCH₃, nebo -CO(CH₂)_zNCi₂H₈, kde R⁵ je H nebo CH3, x je celé číslo v rozmezí 4 až 21, s výhodou 4 až 15 nebo y je celé číslo v rozmezí 8 až 21 s výhodou 8 až 15, nebo z je celé číslo v rozmezí 3 až 16, s výhodou 7 až 11, nejlépe 10, a -(CH2)X. nebo -(CH2)y. nebo -(CH2)Z. je lineární nasycená nebo nenasycená část řetězce, přičemž alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více -CO(CH2)xC6H4-pR⁵ nebo -CO-CJI4-pO(CH₂)_yCH₃, nebo -CO-(CH₂)_ZNC,₂H₈;

R³jeHneboR²;

a kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 495 dimerů.

Výhodným provedením technického řešení je derivát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl obecného vzorce I výše, kde R² je -COÍCH^CsHt/jR⁵ nebo -CO-C₆H₄-pO(CH₂)_yCH₃, nebo -CO-(CH₂)_ZNC12H₈ alespoň v jedné opakující se jednotce, přičemž R³ je H. Výhodná je tedy substituce primární hydroxylové skupiny v pozici 6 glukosaminové části HA.

Dalším provedením technického řešení je derivát kyseliny hyaluronové obecného vzorce 1 výše, který je ve formě soli, kde R¹ je vybrán ze skupiny obsahující některý z iontů alkalických kovů nebo iontů kovů alkalických zemin, s výhodou Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ nebo Li⁺.

Ještě dalším provedením technického řešení je derivát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl obecného vzorce I výše, kde množství -COCCH^C^-pR⁵ nebo -CO-C₆H₄-pO(CH₂)_yCH₃, nebo -CO-(CH₂)_zNC_t2H₈ v hydrofobizovaném esterovém derivátu HA obecného vzorce I je od 0,1 do 50 % na 100 dimerů hyaluronové kyseliny nebo její soli, s výhodou 2 až 18 %, výhodněji 8 až

-4CZ 30265 Ul

%. Deriváty HA podle technického řešení s tímto stupněm substituce vykazují výbornou rozpustnost ve vodě. Chemická struktura je ukázána na Obr. 1 až 5.

Hydrofobizované esterové deriváty kyseliny hyaluronové nebo jejich soli podle technického řešení jsou vůči buňkám necytotoxické a to ani při delším působení, jak je i doloženo v příkladech a na Obr. 6, 7 a 8 dále. Další výhodou hydrofobizovaných esterových derivátů HA nebo jejích solí podle technického řešení je, že si zachovávají i po modifikaci HA volné karboxylové skupiny, které jsou zodpovědné za rozpoznání vazebných míst pro HA receptory. Tím, že si zachovávají biologické vlastnosti, jsou s výhodou použitelné jako nanomicelámí polymemí nosiče biologicky aktivních hydrofobních látek ve vodném prostředí pro cílení léčivé látky do požadoío váných míst, protože mohou být například rozpoznávány CD44 receptory, které jsou přítomny u řady nádorů.

Hydrofobizované deriváty HA podle technického řešení kombinují vlastnosti tohoto polysacharidu a biokompatibilních substituentů. Polymemí nosiče z nich vzniklé mohou rozšířit terapeutické aplikace na trhu.

Dalším provedením technického řešení je způsob syntézy derivátu HA obecného vzorce I podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že aromatická kyselina obecného vzorce II nebo obecného vzorce ΙΠ nebo obecného vzorce IV

R⁵0_eH,- ΡΗ₂|χΛ_οη (II), nebo (III), nebo

(IV), kde R⁵, x, y a z jsou, jak definovány výše, je aktivována pomocí benzoylchloridu vzorce V o

V XI (V), v přítomnosti organické báze, s výhodou v přítomnosti terciálního aminu, výhodněji VV-diisopropylethylaminu (DIPEA), směsi vody a vodou mísitelného polárního nebo nepolárního rozpouštědla za vzniku reaktivního anhydridu obecného vzorce VI,

-5 CZ 30265 Ul

O

(VI), kde R⁴ je -(CHzjxC^-pR⁵, nebo -C₆H₄-^O(CH₂)_yCH3, nebo -(CH₂)_ZNC₁₂H₈, kde R⁵, x, y a z jsou, jak definovány výše, který reaguje s kyselinou hyaluronovou nebo její solí v přítomnosti organické báze, s výhodou 5 v přítomnosti terciálního aminu vybraného ze skupiny obsahující triethylamin (TEA), JV.A-diisopropylethylaminu (DIPEA) nebo l,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO); s výhodou Ν,Ν-diisopropylethylaminu (DIPEA), výhodněji triethylamin (TEA), směsi vody a vodou mísitelného polárního rozpouštědla.

Aktivace aromatické nebo heteroaromatické kyseliny benzoylchloridem (A) s následnou aplikací ío na esterifikaci kyseliny hyaluronové nebo její soli je znázorněno na schématu 1 (B) níže:

Schéma 1

A)

OOJ-OH ci organická báze nebo

směs vody as vodou misitdného rozpouštědla o* organická báze, směs vody as vodou misitdného rozpouštědb

R¹, R², R³ jsou, jak definováno výše.

S výhodou se aktivace aromatické kyseliny obecného vzorce Π nebo ΠΙ nebo IV se provádí po dobu 5 až 120 minut při teplotě v rozmezí od -10 °C do 40 °C, s výhodou po dobu 30 minut od 0°C do 25 °C.

Podle výhodného provedení způsobu podle technického řešení je množství reaktivního anhydridu obecného vzorce VI, kde R⁴ je -(CH2)x-C6H4-pR⁵ nebo -(CH2)_ZNC]₂H₈, přičemž R⁵ a x nebo z jsou, jak definováno výše, odpovídá 0,01 až 3 ekvivalentům, s výhodou 0,5 až 1 ekvivalentům, výhodněji 0,7 ekvivalentů na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli. Podle dalšího výhodného provedení způsobu podle technického řešení je množství reaktivního anhydridu obecného vzorce VI, kde R⁴ je -C6H4-O(CH₂)_yCH₃, přičemž y je jak definováno výše, odpovídá 0,01 až 3 ekvivalentům, s výhodou 1,5 až 2,5 ekvivalentům, výhodněji 2,0 ekvivalentů na dimer kyseliny hyaluronové nebo její soli.

-6CZ 30265 Ul

Podle ještě dalšího výhodného provedení způsobu podle technického řešení tvorba hydrofobizovaného esterového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli je prováděna po dobu 1 až 48 hodin při teplotě v rozsahu od 0 do 60 °C, s výhodou 2 až 20 hodin při 25 °C, výhodněji 2 hodiny při 25 °C.

Výhodou způsobu přípravy derivátů HA podle tohoto technického řešení je jeho jednoduchost, použití účinných reakčních činidel, která nezpůsobují vedlejší reakce. Nepoužívají se ani toxická rozpouštědla nebo karcinogenní látky. Také reakční časy jsou krátké a reakční podmínky mírné, proto nedochází k degradaci řetězce HA.

Aktivace karboxylové skupiny alkylového řetězce s aromatickým susbtituentem v příkladech probíhá ve směsi voda a s vodou mísitelném protickém nebo aprotickém polárním rozpouštědle, například propan-2-olu (IPA), dimethylsulfoxidu (DMSO) nebo tetrahydrofuranu (THF), s výhodou propan-2-olu. Obsah rozpouštědla je v rozsahu 45 až 55 obj. %, a obsah vody v roztoku je v rozsahu 45 až 55 obj. %. V roztoku je množství HA pro chemickou modifikaci v rozsahu 1 až 5 hmotn.% s výhodou 2,5 hmotn.%.

Aktivace aromatické nebo heteroaromatické kyseliny probíhá po 0,5 do 6 h s výhodou 3 hod. 15 min při 0 °C až 60 °C, výhodněji při 10 °C pro ll-(4-methylfenyl)undekanovou kyselinu a deriváty kyseliny 3-alkyl-hydroxybenzoové.

Vhodná molekulová hmotnost kyseliny hyaluronové pro danou reakci je v rozmezí 6 χ 10³ až 2,50 χ 10⁵ g/mol, s výhodou 1,5 χ 10⁴ až 1,9 χ 10⁵ g/mol nebo 495 dimerů. Jiná molekulová hmotnost nebo HA sůl není pro reakci překážkou. Výhodou způsobu podle technického řešení oproti známým chemickým modifikacím kyseliny hyaluronové je velmi malá degradace polysacharidu vzhledem k mírným reakčním podmínkám.

Esterifikace hyaluronanu je dále uskutečněna přidáním organické báze, jako je terciární amin vybraný ze skupiny obsahující VTY-diisopropylethylamin (DIPEA), 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan (IDABCO) nebo triethylamin (TEA), s výhodou DIPEA. Esterifikace fungují s 0,01 až 6 ekvivalenty báze, výhodněji 4,0 ekvivalenty. Bližším studiem reakce bylo zjištěno, že stupeň substituce je závislý na ekvivalentním množství aktivovaného alkylového řetězce s arylovým nebo heteroarylovým substituentem. Chemické modifikace kyseliny hyaluronové fungují s 0,01 až 3 ekvivalenty aktivované aromatické nebo heteroaromatické kyseliny, výhodněji 0,7 do 1,5 ekvivalentu na dimer hyaluronanu.

Pro názornost jsou zde uvedeny hydrofobizované esterové deriváty HA mající alespoň jeden alkylarylový nebo alkylheteroarylový substituent obecných vzorců VII, VUI a IX, kde R¹, R³, R⁵, x, y a z jsou, jak definovány výše.

nebo

(IX)

-7CZ 30265 Ul

Ještě dalším provedením technického řešení jsou nanomicelámí kompozice na bázi hydrofobizovaného esterového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli podle obecného vzorce (I), jak je definován výše, přičemž obsahuje nanomicely, které obsahují hydrofobní jádro tvořené -CO(CH₂)_xC₆H₄-/?R⁵ nebo -COC₆H₄-/?O(CH₂)yCH₃ nebo -(CH₂)_zNCi₂H_g skupinami, kde x je celé číslo v rozmezí 4 až 21, s výhodou 4 až 15 a R⁵ je H nebo CH3, nebo y je celé číslo v rozmezí 8 až 21, s výhodou 8 až 15, nebo z je celé číslo v rozmezí 3 až 16, s výhodou 7 až 11, nejlépe 10, navázanými na kyselinu hyaluronovou a hydrofilní obal tvořený hydrofilními funkčními skupinami kyseliny hyaluronové a jednu nebo více biologicky aktivních aromatických látek fyzikálně vázaných v nanomicele.

Dalším výhodným provedením nanomicelámí kompozice podle technického řešení je kompozice obsahující 0,3 až 8,0 hmotn. %, s výhodou 2,5 až 8,0 hmotn. %, výhodněji 5,0 až 8,0 hmotn. % biologicky aktivních aromatických látek vzhledem k hmotnostnímu obsahu hydrofobizovaného esterového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli, přičemž biologicky aktivní aromatická látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky, zejména vitamíny, léčiva, s výhodou cytostatika, steroidy, dále fytoextrakty, fytokomplexy nebo íytoaktivní látky apod.

S výhodou se jedná o resveratrol, koenzym Q10, retinyl palmitát. Nanomicelámí kompozice podle technického řešení se použijí pro farmaceutické a kosmetické aplikace.

Ještě dalším výhodným provedením technického řešení je nanomicelámí kompozice, která obsahuje vyšší koncentraci hydrofobizovaného esterového derivátu kyseliny hyaluronové, než je jeho kritická agregační koncentrace. Jeho koncentrace v kompozici podle technického řešení ve vodném roztoku je v rozmezí 0,003 mg.ml'¹ až 20 mg.ml'¹, s výhodou 1 až 10 mg.ml'¹. Nanomicely obsahující hydrofobizované esterové deriváty kyseliny hyaluronové podle technického řešení zůstávají i pri koncentraci 0,003 mg.ml'¹ ve vodném roztoku intaktní, tedy neagregují se.

Ještě dalším provedením technického řešení je způsob přípravy nanomicelámí kompozice, který spočívá v tom, že se hydrofobizovaný esterový derivát kyseliny hyaluronové nebo jeho sůl podle obecného vzorce (I) rozpustí ve vodě a biologicky aktivní aromatická látka se rozpustí v organickém rozpouštědle vybraném ze skupiny obsahující trichlormethan, methanol nebo propan-2-ol, přičemž oba roztoky se smíchají, poté se organické rozpouštědlo odstraní. Organické rozpouštědlo se s výhodou odstraní vakuovou evaporací, následně se vodná fáze rehydratuje, získané nanomicelámí útvary se zfiltrují a nakonec lyofilizují.

Hydrofobizované esterové deriváty HA podle technického řešení, například deriváty ll-(4-methylfenyl)undekanoyl hyaluronátu (UNFEHA) (viz Příklady 39, 42, 49) nebo 4- oktyloxybenzoyl hyaluronátu (OBEHA) (viz Příklady 43, 44), vykazují až dvakrát vyšší enkapsulaci aktivní látky (Obr. 9), ve srovnání s deriváty s alifatickým řetězcem HA-C18:1 (viz Příklady 45, 46 a 50), HAC16 (viz Příklad 47) nebo HA-C6 (viz Příklad 48), které jsou uvedeny v dokumentu WO 2014082609. Hydrodynamická velikost (cca 40 až 200 nm. Obr. 10) a rozpustnost vzniklých agregátů ve vodném nebo fyziologickém prostředí je vhodná pro topickou i parenterální aplikaci nosičů loadovaných aktivními látkami. Nosiče jsou necytotoxické a mohou podporovat aktivitu vázané látky. Stabilita nosičů v přítomnosti bílkovin krevního séra se s výhodou zvyšuje s délkou substituentu (Obr. 11).

Deriváty HA s alkylarylovými nebo alkylheteroarylovými substituenty podle technického řešení mohou enkapsulovat biologicky aktivní aromatické látky, léčiva a další komponenty, přičemž biologicky aktivní aromatická látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky, s výhodou vitamíny, léčiva s výhodou cytostatika, steroidy, dále fytoextrakty, fytokomplexy nebo íytoaktivní látky apod.

Definice pojmů:

Část substituentu „CffLp-,, znamená fenylový zbytek nebo Ph, přičemž části substituentu jsou k němu navázány v pozici para.

Část substituentu „NCi₂H_g“ znamená karbazylový zbytek, který je ke zbytku substituentu navázán před heteroatom N.

-8CZ 30265 Ul

Termín „aktivovaná kyselina“ je produkt reakce mezi benzoylchloridem a substituovanou kyselinou benzoovou nebo fenyl(tolyl)alkylovou kyselinou, anebo směsného anhydridu kyseliny benzoové a kyseliny fenyl-alkylové, kyseliny alkyl-oxo-benzoové nebo karbazol N-alkylové kyseliny.

Termín „organická báze“ je alifatický amin, s výhodou terciální amin mající rozvětvenou, nasycenou nebo nenasycenou, substituovanou nebo nesubstituovanou C3-C30 alkylovou skupinu.

Termín „kritická agregaění koncentrace“ (CAC) je koncentrace polymeru, při níž se v roztoku polymeru začínají tvořit hydrofobní domény agregací nepolárních funkčních skupin. Pod touto koncentrací jsou jednotlivé polymemí řetězce v systému ve formě nezagregovaných řetězců. Termín „laboratorní teplota“ odpovídá 20 až 25 °C.

Termín „biologicky aktivní aromatická látka“ znamená látku, která vykazuje biologickou aktivitu při kosmetické nebo farmaceutické aplikaci a obsahuje delokalizovaný systém π elektronů v planámí molekule.

Stupeň substituce (SS) znamená (průměrný) počet substituentů -CO(CH₂)_X C6H4-/7CH3, nebo -COC6H4-pO(CH₂)yCH3 nebo CO-(CH₂)_zNCi₂H₈ na 100 dimerů HA nebo její soli.

Polymemí nanomicely jsou agregáty koloidních rozměrů tvořené polymemími řetězci amfifilních polymerů ve vodném prostředí, kdy jádro micely tvoří nepolární funkční skupiny polymeru, zatímco obal micely tvoří polární část polymeru.

Ekvivalent (ekv) se vztahuje na dimer kyseliny hyaluronové, není-li uvedeno jinak. Procenta se uvádějí jako hmotnostní procenta, pokud není uvedeno jinak.

Objasnění výkresů

Obr. 1. HSQC 6-fenylhexanoyl hyaluronátu

Obr. 2. DOSY 8-fenyloktanoyl hyaluronátu

Obr. 3. *H NMR 1 l-(4-methylfenyl)undekanoyl hyaluronátu (UNFEHA)

Obr. 4. HSQC ll-(4-methylfenyl)undekanoyl hyaluronátu (UNFEHA)

Obr. 5. ^]H NMR 4-oktyloxybenzoyl hyaluronátu (OBEHA)

Obr. 6. Vliv 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové naviabilitu Swiss 3T3 buněčné linie

Obr. 7. Vliv 1 l-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové na viabilitu Swiss 3T3 buněčné linie

Obr. 8. Vliv 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové na viabilitu Swiss 3T3 buněčné linie

Obr. 9. Porovnaní UV/Vis spekter stanovení resveratrolu v HA-0-CO(CH)ioC₆H4-p-CH₃ (UNFEHA) a derivátu HA-C18:1 podle WO 2014082609.

Obr. 10. DLS analýza a SEM s polymemími micelami z derivátu UNFEHA. Enkapsulován je resveratrol.

Obr. 11. Grafický výsledek stability micel tvořených jednotlivě deriváty kyseliny hyaluronové nebo jejich solemi podle obecného vzorce I, kde HA-O-CO(CH)_xC₆H4-p-CH₃ a x=3, 5, 7 a 10 v roztoku bovinního sérového albuminu (v koncentraci 40 mg/ml).

Literatura

1. Schanté CE, Zuber G, Herlin C, Vandamme TF. Chemical modifications of hyaluronic acid for the synthesis ofderivatives for a broad range of biomedical applications. Carbohydrate Polymers 2011;85(3):469-489.

-9CZ 30265 Ul

2. Larrivee-Aboussafy C, Jones BP, Price KE, Hardink MA, McLaughlin RW, Lillie BM, et al. DBU Catalysis of N,N’ -Carbonyldiimidazole-Mediated Amidations. Org Lett 2010, 12(2):324327.

3. Morton RC, Mangroo D, Gerber GE. A novel method of complete activation by carbonyldi5 imidazole: application to ester synthesis. Canadian Journal of Chemistry 1988

2015/07/15;66(7):1701-1705.

4. Jiang G, Park K, Kim J, Kim KS, Hahn SK. Target Specific Intracellular Delivery of siRNA/PEI-HA Complex by Receptor Mediated Endocytosis. Mol Pharm 2009, 6(3):727-737, 5. Wang C, Yan Q, Liu H-B, Zhou X-H, Xiao S-J. Different IEDC/NHS Activation Mechanisme io between PAA and PMAA Brushes and the Following Amidation Reactions. Langmuir 2011, 27(19):12058-12068.

6. D, Este M, Eglin D, Alini M. A systematic analysis of DMTMM vs IEIDC/NHS for ligation of amines to hyaluronan in water. Carbohydr Polym 2014 Aug 8,108:239-246,

7. Smejkalová D, Hermannová M, Buffa R, Cožiková D, Vištejnová L, Matulková Z, et al.

Structural characterization and biological properties of degradation by products from hyaluronan after acid hydrolysis. Carbohydrate Polymere 2012, 88(4):1425-1434,

8. Wang YM, Ikeda A, Hoři N, Takemura A, Ono H, Yamada T, et al. N,N-dicyclohexylcarbodiimide assisted synthesis and characterization of poly(vinyl alcohol-co-vinyl levulinate). Polymer 2005,46(23):9793-9802.

9. Huang P, Yang C, Liu J, Wang W, Guo S, Li J, et al. Improving the oral delivery efficiency of anticancer dnugs by chitosan coated polycaprolactone-grafted hyaluronic acid nanoparticles. Journal ofMaterials Chemistry B 2014, 2(25): 4021-4033.

10. Jang E, Lim E-K, Choi Y, Kim E, Kim H-O, Kim D-J, et al, pi-Hyaluronan nanocarriers for CD44-targeted and pH-boosted aromatic drug delivery. Journal ofMaterials Chemistry B 2014,

1(41):5686-5693.

11. Choi KY, Saravanakumar G, Park JH, Park K. Hyaluronic acid-based nanocarriers for intracellular targeting: interfacial interactions with proteins in cancer. Colloids Surf B Biointerfaces 2012 Nov 1,99:82-94.

12. Lim E-K, Kim H-O, Jang E, Park J, Lee K, Suh J-S, et al. Hyaluronan-modified magnetic nanoclusters for detection of CD44-overexpressing breast cancer by MR imaging. Biomaterials

2011,32(31):7941-7950.

13. Lai Y, Lei Y, Xu X, Li Y, He B, Gu Z. Polymeric micelles with [smáli pi]-[small pi] conjugated cinnamic acid as lipophilic moieties for doxorubicin delivery. Journal of Materials Chemistry B 2013, 1(34):4289-4296.

14. Sosnik A, Menaker Raskin M. 2015Polymeric micelles in mucosal drug delivery: Challenges towards clinical translation. Biotechnol Adv Jan 15.

15. Calce E, Ringhieri P, Mercurio FA, Leone M, Bugatti V, Saviano M, et al. A biocompatible process to prepare hyaluronan-based materiál able to self-assemble into stable nano-particles. RSC Advances 2015, 5(37):29573-29576.

16. Novoa-Carballal R, Muller AHE. Syntlhesis ofpolysaccharide-b-PEG block copolymers by oxime click. Chem Commun 2012,48(31):3781-3783.

17. Novoa-Carballal R, Silva C, Moller S, Schnabelrauch M, Reis RL, Pashkuleva I. Tunable nano-carriers from clicked glycosaminoglycan block copolymers. Journal ofMaterials Chemistry B 2014, 2(26):4177-4184.

18. Xu P, Tang H, Li S, Ren J, Van Kirk E, Murdoch WJ, et al. Enhanced Stability of Core-Surface Cross-Linked Micelles Fabricated from Amphiphilic Brush Copolymers. Biomacromolecules 2004, 5(5):1736-1744.

-10CZ 30265 Ul

19. Danquah M, Fujiwara T, Mahato RI. Self-assembling methoxypoly(ethylene glycol)bpoly(carbonate-co-L-lactide) block copolymers for drug delivery. Biomaterials 2010 Mar;31(8):2358-2370.

20. Watanabe M, Kawano K, YokoyamaM, Opanasopit P, Okano T, Maitani Y. Preparation of camptothecin-loaded polymeric micelles and evaluation of their incorporation and circulation stability. Int J Pharm 2006 Feb 3;308(l-2):183-189.

21. Jones M-C, Leroux J-C. Polymeric micelles: a new generation ofcolloidal drug carriers. Eur J Pharm Biopharm 1999,48(2):101-111.

Příklady uskutečněni technického řešení

Příklad 1: Syntéza 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,5064 g (1,25 mmol, 6 x 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění HA bylo k roztoku přidáno 0,435 ml (DIPEA, 2,5 mmol, 2 ekv. dimeru HA), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 2 mg (0,0125 mmol) 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) (0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna 0,4105 g, 4-kyselina fenylbutanová (2,5 mmol, 2 ekv) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté byla do roztoku přidána báze 0,435 ml (DIPEA, 2 ekv) a 0,29 ml benzoylchloridu (2,5 mmol, 2 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Směsný anhydrid kyseliny benzoové a kyseliny 4-fenyl-butanové (2 ekv) byl přidán k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě po dobu 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml), a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

'H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,9 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,35 - 2,5 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,6 2,73 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, CéHj). Signály HA: δ 2,1 ppm (s, 3H, NHCH₃), (m. 10H, skeletal HA), δ 4,5 ppm (d, 2H, diasterotopicky, HA)

SS 34%(‘HNMR)

Příklad 2: Syntéza 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DABCO

0,507 g (1,25 mmol, 6 x 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění HA bylo k roztoku přidáno 0,28 g (2,5 mmol, 2 ekv dimeru HA) l,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 2 mg 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) (0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna 0,4105 g kyselina 4-fenylbutanová (2,5 mmol, 2 ekv.) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté bylo do roztoku přidáno 0,28 g (2,5 mmol) l,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO; 2 ekv) a 0,29 ml benzoylchloridu (2,5 mmol, 2 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, za laboratorní teploty. Takto aktivovaná kyselina 4-fenylbutanová (2 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při 25 °C, po dobu 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml), a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,9 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,35 -2,5 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,6 2,73 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, CeHs). Signály HA: δ 2,1 ppm (s, 3H, NHCH₃), (m, 10H, skeletal HA), δ 4,5 ppm (d, 2H, diasterotopicky, HA)

SS2%('HNMR)

-11 CZ 30265 Ul

Příklad 3: syntéza 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,50 g (1,25 mmol, 18 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána 0,35 ml triethylamin (TEA, 3,75 mmol nebo 3,0 ekv.), absolutní propan-2-ol (6 ml) a 0,0015 g 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-fenylbutyrová (0,3 g, 1,8 mmol,

1.5 ekv.) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté byly do roztoku přidány (TEA, 3,75 mmol nebo 3,0 ekv.) a 0,22 ml benzoylchloridu (1,8 mmol, 1,5 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, za laboratorní teploty. Takto aktivovaná 4-fenylbutyrová kyselina (1,5 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml), a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

*H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,9 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,35 - 2,5 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,6 2,73 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, CéH₅). Signály HA: δ 2,1 ppm (s, 3H, NHCH₃), (m. 10H, skeletal HA), δ 4,5 ppm (d, 2H, diasterotopicky. HA)

SS43%(’HNMR)

Příklad 4: Syntéza 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,501 g (1,25 mmol, 1,8 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byl přidán izopropanol (4 ml), 0,29 ml triethylaminu (TEA,

2.5 mmol, 2 ekv) a 0,0015 g dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-fenylmáselná (0,4105 g, 2,5 mmol, 2 ekv) v izopropanolu (4 ml), poté byly do roztoku přidány TEA (0,29 ml, 2,5 mmol, 2 ekv) a benzoylchlorid (2,5 mmol, 2,0 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Takto aktivovaná kyselina 4-fenylmáselná (2 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu a reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 h. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního isopropanolu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem isopropanolu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním isopropanolem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 h při 40 °C

SS 29 % (*H NMR).

’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,9 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,35 - 2,5 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,6 2,73 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, C6H₅).

Příklad 5: Syntéza 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,5040 g (1,25 mmol, 1,8 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byly přidány izopropanolu (4 ml), 0,35 ml triethylaminu (TEA, 2,5 mmol, 2 ekv) a 0,0015 g dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-fenylmáselná (0,532 g, 3,15 mmol, 2,5 ekv) v izopropanolu (4 ml), poté byly do roztoku přidány TEA (0,35 ml, 2,5 mmol, 2 ekv) a benzoylchlorid (3,12 mmol, 2,5 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Takto aktivovaná kyselina 4-fenylmáselná (2,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu a reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 h. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního isopropanolu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem isopropanolu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním isopropanolem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 h při 40 °C

SS 20 % (*H NMR).

’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,9 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,35 - 2,5 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,6 2,73 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, C^).

- 12CZ 30265 Ul

Příklad 6: Syntéza 6-fenylhexanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,503 g (1,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,5 ml (DIPEA, 2,5 mmol, 2,0 ekv.), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 0,0015 g 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna 0,16 g kyselina 6-fenylhexanová (0,87 mmol, 0,7 ekv.) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté byly do roztoku přidány 0,5 ml DIPEA (2,5 mmol, 2,0 ekv.) a 0,29 ml benzoylchlorid (0,87 mmol, 0,7 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, za laboratorní teploty. Takto aktivovaná 6-kysebna fenylhexanová (0,2 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS: 32 % (’H NMR) HSQC je ukázáno v Obr. 1.

'H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,2 - 1,4 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,5 - 1,72 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,25 - 2,5 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,55 - 2,7 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, ΰ₆Η₅). Příklad 7: Syntéza 6-fenylhexanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,5 g (1,25 mmol, 6 x 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,44 ml (DIPEA, 2,5 mmol, 2 ekv.), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 0,0015 mg 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 6-fenylhexanová (0,481 g, 2,5 mmol, 2 ekv.) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté byly do roztoku přidány 0,44 ml IDIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.) a 0,29 ml benzoylchloridu (2,5 mmol, 2 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, za laboratorní teploty. Takto aktivovaná 6-kyselina fenylbexanová (2,0 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 52%('HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,2 - 1,4 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,5 - 1,72 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,25 - 2,5 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,55 - 2,7 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, C₆H₅). Příklad 8: Syntéza 6-fenylhexanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byly přidány tetrahydroťuran (4 ml), A/jV-diisopropylethylamin 0,44 ml (DIPEA, 2,5 mmol, 2 ekv) a 0,0015 g dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 6-fenylhexanová (0,4105 g, 2,5 mmol, 2 ekv.) v tetrahydrofuranu (4 ml), poté byly do roztoku přidány 0,44 ml DIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.) a benzoylchlorid (2,5 mmol, 2 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Takto aktivovaná kyselina 6-fenylhexanová (2,0 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 h. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního isopropanolu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem isopropanolu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním isopropanolem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 h při 40 °C. SS45%(^]HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,2 - 1,4 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,5 - 1,72 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,25 - 2,5 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,55 - 2,7 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,2 ppm (m, 5H, C₆H₅).

-13CZ 30265 Ul

Příklad 9: Syntéza 8-fenyloktanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,5 χ 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,43 ml (DIPEA, 2 ekv.), absolutní propan-2ol (4 ml) a 0,0015 g 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 8-fenyloktanová (0,048 g, 0,25 mmol, 0,2 ekv.) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté byly do roztoku přidány DIPEA (0,2 ekv.) a 0,029 ml benzoylchloridu (0,25 mmol, 0,2 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Aktivovaná kyselina 8-fenyloktanová (0,2 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala 2 hod při laboratorní teplotě. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 14%(’HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,2 - 1,4 ppm (bs, 6H, CH₂), 1,48 - 1,67 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,25 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,54 - 2,68 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,1 ppm (m, 5H, CeHj).

Příklad 10: Syntéza 8-fenyloktanoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,5 χ 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,43 ml (DIPEA, 2 ekv.), absolutní propan-2ol (4 ml) a 0,0015 g 4-dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 8-fenyloktanová (0,08 g, 0,25 mmol, 0,3 ekv.) v absolutním propan-2-olu (4 ml), poté byly do roztoku přidány DIPEA (0,43 ml, 2 ekv.) a 0,041 ml benzoylchloridu (0,37 mmol, 0,3 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Aktivovaná kyselina 8-fenyloktanová (0,3 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala 2 hod při laboratorní teplotě. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 11 % (*H NMR) DOSY je ukázáno v Obr. 2.

'H NMR (D₂O) signály acylu: δ 1,2 - 1,4 ppm (bs, 6H, CH₂), 1,48 - 1,67 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,25 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,54 - 2,68 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,1 - 8,1 ppm (m, 5H, CsHj).

Příklad 11: Syntéza linkeru: kyseliny ll-(4-methylfenyl)undekanové krok 1) protekce

Syntéza methyl-(ll-bromundekanoátu): 7,173 g (37,71 mmol, 2 ekv.) monohydrátu kyseliny /7-toluensulfonové bylo rozpuštěno v 20 ml methanolu. K tomuto roztoku bylo přidáno 5 g (18,86 mmol kyseliny) 11-bromundekanové. Výsledný roztok byl refluxován 5 hod. Po ochlazení reakční směsi byl methanol odpařen na RVO, získaný olej byl naředěn vodou (20 ml) a extrahován diethyletherem (DEE) (3 x 20 ml). Spojené organické podíly byly extrahovány vodou (2 x 40 ml) a solankou (1 x 30 ml). Organická fáze byla sušena nad Na₂SO₄ a odpařena na RVO. Produktem byl žlutý olej. Výtěžek byl 94 %.

ΜθΟΗ reflux .COOMe

- 14CZ 30265 Ul ’Η NMR (CDC1₃): δ 1,25 - 1,34 ppm (m. 10H, CH₂), δ 1,42 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 1,62 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 1,85 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 2,30 ppm (t, 2H, CH₂), δ 3,40 ppm (t, 2H, CH₂), δ 3,67 ppm (s, 3H, CH₃).

krok 2) Friedel-Craftsova alkylace:

syntéza methyl-(ll-(4-methyfenyl)undekanoátu). 2,4 g (18 mmol) bezvodého A1C1₃ bylo rozsuspendováno v 25 ml bezvodého toluenu a vzniklá suspenze byla vychlazena na 4 °C. Do míchané suspenze byl v pětiminutových intervalech ve třech dávkách přidán methyl-(l 1-bromundekanoát) (2,9 ml, 12 mmol). Směs byla zahřáta na 60 °C a při této teplotě byla míchána 2 hod. Po ochlazení byla reakční směs nalita na led. Vodná fáze byla extrahována diethyletherem (3 x 25 ml), spojené organické podíly byly extrahovány 10% vodným roztokem NaHCO₃ (1 x 50 ml). Organická fáze byla sušena nad Na₂SO₄ a odpařena na RVO. Produkt je nažloutlý olej. Výtěžek byl 95 %.

*H NMR (CDC1₃): δ 1,05 - 1,35 ppm (m, 12H, CH₂), δ 1,45 - 1,65 ppm (m, 4H, CH₂), δ 2,2 2,3 ppm (m, 5H, CH₂, CH₃), 2,55 ppm (t, 2H, CH₂), 3,65 ppm (m, 3H, CH₂), δ 6,9 - 7,2 ppm (m, CH).

krok 3) deprotekce, syntéza ll-(4-methylfenyl)undekanové kyseliny: methyl-(ll-(4methylfenyl)undekanoát) (3,328 g, 11,36 mmol) byl emulgován v 10% roztoku NaOH v MeOH (30 ml). Reakční směs byla refluxována 1 hod. Po 10 min zahřívání vznikla bílá sraženina. Po ukončení zahřívání byl z reakční směsi odpařen MeOH. Sraženina byla zalita 20 ml H₂O a pomocí koncentrované HC1 bylo pH upraveno na hodnotu 2 až 3. Produkt byl extrahován diethyletherem (3 x 30 ml). Spojené organické podíly byly promyty 10% NaHCO₃ (1 x 20 ml), H₂O (1 x 20 ml) a sušeny nad Na₂SO₄.

Organická fáze byla sušena nad Na₂SO₄ a odpařena na RVO. Produkt je nažloutlý olej. Výtěžek byl 87 %.

’H NMR (CDC1₃): δ 1,05 - 1,35 ppm (m, 12H, CH₂), δ 1,45 - 1,65 ppm (m, 4H, CH₂), δ 2,25 30 2,38 ppm (m, 5H, CH₂, CH₃), δ 2,55 ppm (t, 2H, CH₂), δ 6,9 - 7,2 ppm (m, CH).

Příklad 12: Syntéza ll-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA), pomocí báze DIPEA

1,8 g (4,50 mmol, 15 χ 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 18 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze DIPEA (2 ekv.), absolutní propan-2-ol (9 ml) a 0,006 g DMAP (0,045 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina ll-(4-methylfenyl)undekanová (0,871 g, 3,15 mmol, 0,7 ekv.) v absolutním propan-2-olu (9 ml), poté byly do roztoku přidány DIPEA (2 ekv.) a benzoylchlorid (3,15 mmol, 0,7 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min při teplotě cca 0 °C. Takto aktivovaná ll-(4-methylfenyl)undekanová kyselina (0,7 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 150 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 2 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantací byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 50 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 50 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 24 hod, při 40 °C.

- 15CZ 30265 Ul

SS 13%(*HNMR) ‘H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,95 - 1,4 ppm (bs, 12H, CH₂), δ 1,4 - 1,7 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,3 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 2,35 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,5 - 2,67 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,4 - 8,2 ppm (m, C₆H₅).

Příklad 13: Syntéza ll-(4-metlhylfenyl)undelkanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA), pomocí báze DIPEA

1,8 g (4,50 mmol, 15 x 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 18 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze DIPEA (2 ekv), v dimethylsulfoxidu (9 ml) aDMAP (0,045 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina ll-(4-methylfenyl)undekanová (0,871 g, 3,15 mmol, 0,7 ekv) v dimethylsulfoxidu (9 ml), poté byly do roztoku přidány 1,16 g DIPEA (9 mmol, 2 ekv.) a 0,37 ml benzoylchlorid (3,15 mmol, 0,7 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, při laboratorní teplotě (25 °C). Takto aktivovaná kyselina ll-(4-methylfenyl)undekanová (0,7 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 150 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 2 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 50 ml) a poté absolutním propan-2olem (4 x 50 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS8%(’HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,95 - 1,4 ppm (bs, 12H, CH₂), δ 1,4 - 1,7 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,3 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 2,35 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,5 - 2,67 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,4 - 8,2 ppm (m. C₆H₅).

Příklad 14: Syntéza ll-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA), pomocí báze DIPEA

1,8 g (4,50 mmol, 15 x 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 18 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 1,17 g DIPEA (9 mmol, 2 ekv.) v tetrahydroíuranu (9 ml) a DMAP (0,045 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina ll-(4-methylfenyl)undekanová (0,871 g, 3,15 mmol, 0,7 ekv.) v tetrahydrofuranu (9 ml), poté byly do roztoku přidány DIPEA (2 ekv) a benzoylchlorid (3,15 mmol, 0,7 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min při teplotě cca 0 °C. Takto aktivovaná kyselina 1 l-(4-methylfenyl)undekanová (0,7 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 150 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 2 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 50 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 50 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 17%(¹HNMR) *H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,95 - 1,4 ppm (bs, 12H, CH₂), δ 1,4 - 1,7 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,3 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 2,35 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,5 - 2,67 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,4 - 8,2 ppm (m, C₆H₅).

Příklad 15: Syntéza 1 l-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA)

2,00 g (5,0 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 20 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byl do roztoku HA přidán isopropanol (10 ml), 1,25 g nebo

1,74 ml DIPEA (10 mmol, 2 ekv) a 6,1 mg DMAPu (0,5 mmol, 0,01 ekv.). V 10 ml IPA bylo rozpuštěno 0,96 g kyseliny 11-(4-methylfenyl)undekanové (3,5 mmol, 0,7 ekv), poté bylo do roztoku přidáno 1,74 ml N,N-diisopropylethylaminu (10 mmol, 2 ekv.) a 0,40 ml benzoylchloridu (3,50 mmol, 0,7 ekv.). Při aktivaci byla reakční směs míchána při 10 °C po 30 min. Roztok aktivované kyseliny 1 l-(4-methylfenyl)undekanová (0,7 ekv), byl přimíchán do roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté byl k reakční směsi přidán nasycený roztok chloridu sodného (cca 2 ml) a dále 150 ml 100 % isopropanolu, aby došlo k vysrážení

- 16CZ 30265 Ul produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 50 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 50 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 h při 40 °C.

SS 10 % (*H NMR) na Obr. 3 a HSQC na Obr. 4.

*H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,95 - 1,4 ppm (bs, 12H, CH₂), δ 1,4 - 1,7 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,3 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 2,35 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,5 - 2,67 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,4 - 8,2 ppm (m, C₆H₅).

Příklad 16: Syntéza 1 l-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA)

0,43 g (1,075 mmol, 1,5 χ 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 18 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,37 ml (DIPEA, 2,15 mmol, 2 ekv.), absolutní propan-2-ol (9 ml) a 0,006 g DMAP (0,045 mmol, 0,01 ekv). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 1 l-(4-methylfenyl)undekanová (0,29 g, 1,07 mmol, 1,0 ekv.) v absolutním propan-2-olu (9 ml), poté bylo do roztoku přidáno 0,37 ml DIPEA (2,15 mmol, 2 ekv.), a 0,12 ml benzoylchloridu (3,15 mmol, 1,0 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min při teplotě cca 0 °C. Takto aktivovaná kyselina 1 l-(4-methylfenyl)undekanová (1,0 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 2 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 150 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 2 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 50 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 50 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 33%(*HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,95 - 1,4 ppm (bs, 12H, CH₂), δ 1,4 - 1,7 ppm (bs, 4H, CH₂), δ 2,3 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 2,35 - 2,48 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 2,5 - 2,67 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,4 - 8,2 ppm (m, C₆H₅).

Příklad 17: Příprava 4-alkyl-oxy-benzoové kyseliny (RO-C6H4-COOH)

Stručně, 2,0 g kyseliny 4-hydroxybenzoové (14,5 mmol) bylo rozpuštěno v 10% roztoku NaOH ve vodě (1,252 g NaOH v 12,5 ml vody). Poté bylo přidáno 50 ml DMSO při teplotě 80 °C. Do reakce byl přidáván n-alkyl-bromid (15,5 nmol, 1,1 ekv). Reakční směs byla míchána 4 hod, při laboratorní teplotě. Reakční směs byla vlita do ledové vody (120 ml), Pomocí koncentrované HC1 bylo pH převedeno do kyselé oblasti (pH 2). Precipitát byl filtrován přes fritu pomocí sníženého tlaku. Produkt byl rekrystalizován s roztokem acetonitril: vodu (50/50 obj/obj).

HO·

1) NaOH, n-alkylbromid, DMSO : H₂O

OH

2) led, HC1

RO

OH

a) kyselina 4-oktyl-oxy-benzoová: 'H NMR (CDC1₃): δ 0,89 ppm (t, 3H, CH₃), δ 1,2 - 1,4 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,47 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 1,81 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 4,02 ppm (t, 2H, CH₂), δ 6,93 ppm (d, 2H, CH), δ 8,05 ppm (d, 2H, CH), δ 11,88 ppm (s, 1H, COOH).

Výtěžek: 84 %

b) Kyselina-4-(decanoyl-oxy)benzoová: 'H NMR (CDC1₃): δ 0,8 ppm (t, 3H, CH₃), δ 1,2 1,4 ppm (m, 10H, CH₂), δ 1,47 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 1,8 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 4,02 ppm (t, 2H, CH₂), δ 6,93 ppm (d, 2H, CH), δ 8,05 ppm (d, 2H, CH), δ 11,88 ppm (s, 1H, COOH).

Výtěžek: 60 %

c) Kyselina-4-(dodekanoyloxy)benzoová.: ’H NMR (CDC1₃): δ 0,8 ppm (t, 3H, CH₃), δ 1,2 1,4 ppm (m, 12H, CH₂), δ 1,47 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 1,8 ppm (kv, 2H, CH₂), δ 4,02 ppm (t, 2H, CH₂), δ 6,93 ppm (d, 2H, CH), δ 8,05 ppm (d, 2H, CH), δ 11,88 ppm (s, 1H, COOH).

- 17 CZ 30265 Ul

Výtěžek. 45 %

Příklad 18: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,5 g (1,25 mmol, 6 χ 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 4,4 ml DIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.), absolutní propan-2-ol (4 ml) a dimethylaminopyridin (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-oktyl-oxybenzoová (0,6960 g, 2,5 mmol, 2 ekv) v absolutním propan-2-olu (8 ml), poté bylo do roztoku přidáno 6,6 ml DIPEA (3,75 mmol, 3 ekv.) a 0,25 ml benzoylchloridu (2,5 mmol, 2 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, za laboratorní teploty. Takto aktivovaná kyselina 4-oktyl-oxybenzoová (2 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při 37 °C, 12 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 0,57 %(‘H NMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,85 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,19 - 1,40 ppm (m, 12H, CH₂), δ 1,45 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,84 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 (bs, 2H, CH₂), δ 7,28 - 8,21 ppm (m, 4H, Cdh).

Příklad 19: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,1 g (0,25 mmol, 6 χ 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 2 ml, demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,102 ml (TEA, 3 ekv), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 2 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna 0,094 g kyseliny 4-oktyloxybenzoové (0,375 mmol, 1,5 ekv.) v absolutním propan-2-olu (2 ml), poté byly do roztoku přidány 0,102 ml TEA (3 ekv.) a 0,044 ml benzoylchlorid (0,375 mmol, 1,5 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána 30 min, za laboratorní teploty. Takto aktivovaná kyselina 4-oktyloxybenzoová (1,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala 3 hod při laboratorní teplotě. Poté bylo k reakční směsi přidáno 25 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 5,7%(*HNMR) *H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,86 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,21 -1,40 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,41 1,51 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,85 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,35 - 8,19 ppm (m, 4H, CéH,).

Příklad 20: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

1,0 g (2,5 mmol, 6 χ 10³ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 2 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 1,02 ml (TEA, 3 ekv), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 2 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna 0,94 g kyseliny 4-oktyloxybenzoové (3,75 mmol, 1,5 ekv.) v absolutním propan-2-olu (2 ml), poté byly do roztoku přidány 1,02 ml (TEA, 3 ekv), a 0,53 ml benzoylchloridu (0,375 mmol, 1,5 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána 3 hod. 15 min za 5 °C. Takto aktivovaná kyselina 4-oktyloxybenzoová (1,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala 19 hod při laboratorní teplotě. Poté bylo k reakční směsi přidáno 25 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté

-18CZ 30265 Ul absolutním propan-2-olem(4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 6,7%(*HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,86 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,21 -1,40 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,41 5 1,51 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,85 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,35 - 8,19 ppm (m, 4H, CeH»).

Příklad 21: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,50 g (1,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 10 ml demineraliío zované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,170 ml (TEA, 1 ekv), absolutní propan2-ol (10 ml) a 8 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0625 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna 0,313 g kyseliny 4-oktyloxybenzoové (1,25 mmol, 1,0 ekv.) v absolutním propan-2olu (2 ml), poté byly do roztoku přidány 0,170 ml TEA (1 ekv.) a 0,144 ml benzoylchloridu (1,25 mmol, 1,0 ekv). Reakční směs byla míchána 30 min. za laboratorní teploty. Takto aktivo15 váná kyselina 4-oktyloxybenzoová (1,0 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala 3 hod při laboratorní teplotě. Poté bylo k reakční směsi přidáno 25 ml absolutního propan-2olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem(4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, pri 40 °C.

SS 4,4%^ NMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,86 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,21 -1,40 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,41 1,51 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,85 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,35 - 8,19 ppm (m, 4H, C6H4).

Příklad 22: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 10 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,5 ml (TEA, 3 ekv.) v absolutním propan-2olu (4 ml) a 8 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla roz30 puštěna kyselina 4-oktyloxybenzoová (0,469 g, 1,87 mmol, 1,5 ekv.) v absolutním propan-2-olu (10 ml), poté byly do roztoku přidány TEA (3 ekv.) a benzoylchlorid (1,87 mmol, 1,5 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 4 hod při 60 °C. Takto aktivovaná 4oktyloxybenzoová kyselina (1,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala pri laboratorní teplotu 24 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem(4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 3,8 % (‘H NMR) *H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,86 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,21 - 1,40 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,41 1,51 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,85 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,35 - 8,19 ppm (m, 4H, CóHt).

Příklad 23: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,1 g (0,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 10 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,102 ml (TEA, 2 ekv.), absolutní propan-2ol (4 ml) a 2 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-oktyloxybenzoová (0,125 g, 0,5 mmol, 2 ekv.) v absolutním propan-2-olu (10 ml), poté byly do roztoku přidány TEA (2 ekv.) a 0,44 ml benzoylchloridu (0,375 mmol,

-19CZ 30265 Ul ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min za laboratorní teploty. Takto aktivovaná 4-oktyloxybenzoová kyselina (2 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při 60 °C, 24 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 5,0% (‘HNMR) *H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,86 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,21 -1,40 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,41 1,51 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,85 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,35 - 8,19 ppm (m, 4H, CéH/.

Příklad 24: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,15 x 10⁵ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 10 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,5 ml (TEA, 3 ekv.) v absolutním propan2-olu (4 ml) a 8 mg dimethylaminopyridinu (IDMAP, 0,0125 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-oktyloxybenzoová (0,469 g, 1,87 mmol, 1,5 ekv.) v absolutním propan-2olu (10 ml), poté byly do roztoku přidány TEA (3 ekv.) a benzoylchlorid (1,87 mmol, 1,5 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 3 hod. 15 min za 10 °C. Takto aktivovaná 4-oktyloxybenzoová kyselina (1,5 ekv.)byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala za laboratorní teploty po dobu 20 h. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) potom absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS 22,7 % (*H NMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,86 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,21 -1,40 ppm (m, 8H, CH₂), δ 1,41 1,51 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,85 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,35 - 8,19 ppm (m, 4H, CsH,).

Příklad 25: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

1,0 g (2,5 mmol, 4,2 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 1,02 ml (TEA, 7,5 mmol 3 ekv.), absolutní propan-2-ol (4 ml) a 16 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,01 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-oktyl-oxybenzoová (0,93 g, 3,75 mmol, 1,5 ekv.) v absolutním propan-2olu (8 ml), poté byly do roztoku přidány 1,02 ml TEA (7,5 mmol, 3 ekv.) a 0,43 ml benzoylchloridu (3,75 mmol, 1,5 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 3 hod. 15 min. za 10 °C. Takto kyselina aktivovaná 4-oktyloxybenzoová (1,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 20 h. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85% obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 h při 40 °C. SS 16 % (*H NMR) na Obr. 5.

‘HNMR (D₂O) signály acylu: δ 0,85 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,19 - 1,40 ppm (m, 12H, CH₂), δ 1,45 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,84 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,28 - 8,21 ppm (m, 4H, C₆H₄).

-20CZ 30265 Ul

Příklad 26: Syntéza 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,5 g (1,25 mmol) 1,98 χ 10⁵ g/mol hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 10 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 0,5 ml TEA (3,75 mmol, 3 ekv.) v absolutní propan-2-olu(4 ml) a 8 mg dimethylaminopyridinu (DMAP, 0,0125 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-oktyloxybenzoová (0,469 g, 1,87 mmol, 1,5 ekv.) v absolutním propan-2-olu (10 ml), poté byly do roztoku přidány TEA (3 ekv.) a benzoylchlorid (1,87 mmol,

1,5 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 3 h 15 min za 10 °C. Takto aktivovaná 4-oktyloxybenzoová kyselina (1,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala za laboratorní teploty 20 h. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x25 ml) potom absolutním propan-2olem(4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, pri 40 °C.

SS 35%(‘HNMR) ’H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,85 ppm (s, 3H, CH₃), δ 1,19 -1,40 ppm (m, 12H, CH₂), δ 1,45 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 1,70 - 1,84 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 4,09 - 4,24 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 7,28 - 8,21 ppm (m, 4H, CeKt).

Příklad 27: Syntéza 4-dekanoyloxybenzoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,5 χ 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 1,2 ml TEA (6,25 mmol, 6 ekv.), absolutní propan-2-ol (4 ml) a dimethylaminopyridin (DMAP 0,065 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-dekanoxybenzoová (0,8 g, 2,5 mmol, 2,0 ekv.) v absolutním propan-2-olu (8 ml), poté byly do roztoku přidány 1,2 ml TEA (6,25 mmol, 6 ekv.), a benzoylchlorid (2,5 mmol, 2,0 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 2 h min. za 10 °C. Takto aktivovaná kyselina 4-dekanoxybenzoová (2,0 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala pri laboratorní teplotě 20 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 bod, pri 40 °C.

SS 10 «/.('Η NMR) *H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,83 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 1,18 - 1,50 ppm (m, 18H, CH₂), δ 1,69 ppm (m, 2H, CH₂), δ 4,12 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 6,82 - 8,18 ppm (m, 4H, C₆H4).

Příklad 28: Syntéza 4-dodecyloxybenzoyl derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze TEA

0,5 g (1,25 mmol, 1,5 χ 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpuštěno v 8 ml demineralizované vody. Po úplném rozpuštění byla přidána báze 1,2 ml TEA (6,25 mmol, 6 ekv.), absolutní propan-2-ol (4 ml) a dimethylaminopyridin (DMAP, 0,0065 mmol, 0,05 ekv.). Zároveň byla rozpuštěna kyselina 4-dodecyl-oxy-benzoová (0,9 g, 2,5 mmol, 2,0 ekv.) v absolutním propan-2-olu (8 ml), poté byly do roztoku přidány 2 ml TEA (6,25 mmol, 6 ekv.), a benzoylchlorid (2,5 mmol, 2,0 ekv.). Po přídavku benzoylchloridu byla reakční směs míchána právě 30 min, za 10 °C. Takto aktivovaná kyselina 4-dodecyl-oxy-benzoová (2,5 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 20 bod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla nechána dekantovat. Sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml). Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS7%(’H NMR) *H NMR (D₂O) signály acylu: δ 0,83 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 1,18 - 1,50 ppm (m, 18H, CH₂), δ 1,69 ppm (m, 2H, CH₂), δ 4,12 ppm (bs, 2H, CH₂), δ 6,82 - 8,18 ppm (m, 4H, C₆H4).

-21 CZ 30265 Ul

Příklad 29: Příprava kyseliny 1 l-(9-karbazolyl)undekanové:

Krok 1. Alkylace karbazolu. 1,008 g (5,985 mmol) karbazolu a 1,8 ml (7,459 mmol) methyl 11-bromundekanoátu bylo přidáno v acetonitrilu, dále 0,4805 g K₂CO₃ (17,95 mmol) bylo rozsuspendováno v směs. Reakce byla zahřívána k refluxu 28 h, po chlazení na laboratorní teplotu byla zfiltrována přes skládaný filtr, organická fáze byla odpařena, v baňce zůstala směs bílých a žlutých krystalů a jasně žlutá kapalina. Výtěžek: 0,70 g.

Krok 2, štěpení: 0,6820 g (17,05 mmol) NaOH bylo rozpuštěno v 6,85 ml MeOH, v tomto roztoku bylo smícháno 0,9995 g methylesteru kyseliny ll-(9-karbazolyl)undekanové:, prášek byl dispergován a zahříván k refluxu 5h. Disperze byla vlita na fritu. Filtrát byl okyselen koncentrovanou HC1, potom byl filtrován přes fritu za sníženého tlaku, promyt EtOH, část krystalků prošla přes fritu. Výtěžek: 0,5651 g.

’H NMR (CDC1₃): δ 0,83 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 1,2 -1,30 ppm (m, 13H, CH₂), δ 1,6 ppm (m, 2H, CH₂), δ 1,9 ppm (m, 2H, CH₂), δ 4,3 ppm (m, 2H, CH₂), δ 7,2 ppm (m, 2H, δ 7,3 ppm (m, 4H, CéHt), δ 8,0 ppm (m, 2H, CeHt)

Příklad 30: Syntéza kyseliny ll-(9-karbazolyl)undekanové derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,4996 g (1,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpouštěno v 8 ml demi H₂O, poté byly přidány 0,3231 g DIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.) a AIPA (2 ml) a DMAP (1,8 mg). 0,2 g kyseliny 1 l-(9-karbazolyl)undekanové (0,6242 mmol, 0,5 ekv.) bylo rozpuštěno v 8 ml AIPA po cca 5 min, bylo přidáno 0,3231 g DIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.), a přídavek 0,07 ml benzoylchloridu (0,62 mmol, 0,5 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla směs míchána 30 min, při laboratorní teplotě. Takto aktivovaná kyselina 1 l-(9-karbazolyl)undekanová (0,5 ekv) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 3 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS = 4 % (DS určováno podle píků na 0,83 (2H) a 2,1 (3H) ppm ’H NMR (D₂O): signály acylu: δ 0,83 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 1,2 - 1,30 ppm (m, 13H, CH₂), δ 1,6 ppm (m, 2H, CH₂), δ 1,9 ppm (m, 2H, CH₂), δ 3,2 - 4,0 ppm, δ 7,2 ppm (m, 2H), δ 7,3 ppm (m, 4H, C^), δ 8,0 ppm (m, 2H, CeH,). Signály HA: δ 2,1 ppm (s, 3H, NHCH₃), (m, 10H, skeletal HA), δ 4,5 ppm (d, 2H, diasterotopicky, HA)

Příklad 31: Syntéza kyseliny ll-(9-karbazolyl) undekanové derivátu kyseliny hyaluronové pomocí báze DIPEA

0,51 g (1,25 mmol, 1,5 x 10⁴ g/mol) hyaluronanu sodného bylo rozpouštěno v 8 ml demi H₂O, poté byly přidány 0,3231 g DIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.), a AIPA (2 ml) a DMAP (1,8 mg). 0,2 g kyseliny 1 l-(9-karbazolyl)undekanové (1,25 mmol, 1 ekv) bylo rozpuštěno v 8 ml AIPA. Po cca 5 min, bylo přidáno 0,3231 g DIPEA (2,5 mmol, 2 ekv.), a přídavek 0,14 ml benzoylchloridu (1,25 mmol, 1 ekv). Po přídavku benzoylchloridu byla směs míchána 30 min, při laboratorní teplotě. Takto aktivovaná kyselina ll-(9-karbazolyl)undekanová (1 ekv.) byla přidána k roztoku hyaluronanu. Reakce probíhala při laboratorní teplotě 3 hod. Poté bylo k reakční směsi přidáno 100 ml absolutního propan-2-olu a nasycený roztok NaCl (cca 0,5 ml), aby došlo k vysrážení produktu. Tato směs byla ponechána dekantovat. Po dekantaci byla většina tekutiny slita a sraženina byla promyta vodným roztokem propan-2-olu (85 % obj., 4 x 25 ml) a poté absolutním propan-2-olem (4 x 25 ml) pro odstranění vody. Sraženina byla sušena 15 hod, při 40 °C.

SS = 15 % (DS určováno podle píků na 0,83 (2H) a 2,1 (3H) ppm)

1H NMR (D₂O): signály acylu: δ 0,83 ppm (bs, 3H, CH₃), δ 1,2 - 1,30 ppm (m, 13H, CH₂), δ 1,6 ppm (m, 2H, CH₂), δ 1,9 ppm (m, 2H, CH₂), δ 3,2 - 4,0 ppm, δ 7,2 ppm (m, 2H), δ 7,3 ppm (m, 4H, CTE), δ 8,0 ppm (m, 2H, C6H4). Signály HA: δ 2,1 ppm (s, 3H, NHCH₃), (m, 10H, skeletal HA), δ 4,5 ppm (d, 2H, diasterotopicky, HA)

-22CZ 30265 Ul

Příklad 32: Cytotoxicita 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové

Cytotoxicita esteru kyseliny hyaluronové popsaného v Příkladu 1 byla testována na Swiss 3T3 buněčné linii. Tedy, 0,1 (hm./obj.) % roztok derivátu byl rozpuštěn v kompletním kultivačním mediu a míchán přes noc. Poté byl roztok filtrován přes sterilní filtrační zařízení (0,22 pm), vytvářející konečné koncentrace vzorku, například 1, 0,5 a 0,1 mg/ml. 3000 buněk (Swiss 3T3) bylo nasazeno na jamku 96-ti jamkových testovacích destiček. Buňky byly pěstovány po dobu 24 hodin před přidáním testovaných roztoků. Buněčná životaschopnost byla měřena 0, 24, 48, 72 hodin po ošetření pomocí testu s 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyl tetrazolium bromidem (MTT). Stručně, 20 μΐ zásobního roztoku MTT (5 mg/ml) bylo přidáno do 200 μΐ media buněčné kultury v každé jamce. Destičky byly inkubovány pří 37 °C v inkubátoru buněčných kultur po 2,5 hodiny. MTT roztok byl odstraněn a bylo přidáno 220 μΐ lyzačního roztoku. Buňky byly lyžovány po 30 minut při laboratorní teplotě na orbitální třepačce a optická hustota byla měřena pomocí Microplate reader VERSAmax při 570 nm. Experimentální provedení bylo doplněno sadou kontrolních buněk pěstovaných v běžném mediu bez ošetření a blankovými vzorky. MTT test byl využit k získání základních informací o buněčném metabolismu a proliferaci. Test životaschopnosti buněk byl opakován minimálně třikrát a je vypočítán průměr (v procentech) ve srovnání s kontrolou a směrodatná odchylka průměrů (SEMs). Tedy, tento derivát byl nalezen tak, aby nebyl cytotoxický do koncentrace 1000 pg/ml. Grafický důkaz viability je znázorněn na Obr. 6.

Přiklad 33: Cytotoxicita ll-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA)

Cytotoxicita esteru kyseliny hyaluronové popsaného v Příkladu 12 byla testována na Swiss 3T3 buněčné linii stejným postupem a za stejných podmínek, jak je popsáno v Příkladu 32. Grafický důkaz viability je znázorněn na Obr. 7.

Příklad 34: Cytotoxicita 4-oktyloxybenzoyl derivátu kyseliny hyaluronové

Cytotoxicita esteru kyseliny hyaluronové popsaného v Příkladu 25 byla testována na Swiss 3T3 buněčné linii stejným postupem a za stejných podmínek, jak je popsáno v Příkladu 23. Grafický důkaz viability je znázorněn na Obr. 8.

Příklad 35: Enkapsulace Koenzymu Q10 do 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové

100 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného v Příkladu 1 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok Koenzymu Q10 (7 mg v 5 ml isopropanolu). Propan-2-ol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění propan-2-olu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován. Množství navázaného koenzymu Q10 (HPLC stanovení): 4,0 % (hmotn.)

Příklad 36: Enkapsulace Nilské červeně do 4-fenylbutanoyl derivátu kyseliny hyaluronové

100 mg derivátu připraveného v Příkladu 1 bylo rozpuštěno v 10 ml demineralizované vody. K připravenému roztoku byl přidán roztok Nilské červeně (3,0 mg ve 3 ml CHC1₃) a směs roztoků byla řádně promíchána. CHC1₃ byl z roztoku odstraněn vakuovou evaporací. Poté byly přidány další 2 ml CHC1₃ a CHC1₃ byl z roztoku opět odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění CHC1₃ byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázané nilské červeně (fluorescenční stanovení): 0,2 % (hmotn.).

Příklad 37: Enkapsulace FRET barviv do fenyl-alkylových derivátů kyseliny hyaluronové

200 mg derivátů HA obecného vzorce I, kde R₂ je -CCXCHjxCéHipRs, kde x=3, 5,7 a 10a R5 je -H nebo -CH₃ bylo jednotlivě rozpuštěno v 20 ml demineralizované vody. 2 mg DiO (donor) byly rozpuštěny v 10 ml absolutního propan-2-olu. 2 mg Dii (akceptor) bylo rozpuštěno v 15 ml absolutního propan-2-olu. Oba roztoky (DiO a Dii) byly smíseny a polovina tohoto roztoku byla

-23CZ 30265 Ul přilita k vodnému roztoku derivátu připraveného v Příkladech 4, 6, 9 nebo 12. Propan-2-ol byl z roztoku odstraněn vakuovou evaporací. Poté byl přidán zbytek roztoku (DiO a Díl) a propan-2ol byl z roztoku opět odstraněn evaporací. Po odstranění propan-2-olu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Příklad 38: Stanovení stability micel nosiče fenyl alkylových derivátů kyseliny hyaluronové s FRET barvivý fluorescenční metodou mg derivátů připravených dle Příkladů 37 bylo jednotlivě rozpuštěno v 4 ml roztoku bovinního sérového albuminu (BSA) o koncentraci 40 mg/ml ve fyziologickém roztoku. Emisní spektra roztoků byla proměřována na fluorometru RF-5301 (Shitnadzu) při excitaci 484 nm.

Emise byla snímána v rozmezí 495 - 600 nm. Měření probíhalo při 37 °C a v časech 0 min, 15 min, 30 min, 45 min, 60 min, 75 min, 90 min, 105 min, 2 h, 3 h, 4 h, 5 h a 24 h. Stabilita micel nosiče byla stanovena porovnáním intenzit píků akceptoru a donoru. Grafický výsledek stability je na Obr. 11.

Příklad 39: Enkapsulace Resveratrolu do ll-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA)

100 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného v Příkladu 10 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (5 mg ve 3 ml isopropanolu). Propan-2-ol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění propan-2-olu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován. Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 3,0 % (hmotn.)

Příklad 40: Stanovení zeta potenciálu nanomicel hyaluronanu

Zeta potenciál byl stanoven na Zetasizeru Nano-ZS (Malvem Instruments) vybaveném He-Ne laserem (633 nm). V 0,9% NaCl zeta potenciál klesl na -30 až -23 mV. Absolutní hodnota zeta potenciálu tedy indikuje vysokou stabilitu připravených nanomicel ve vodných roztocích a relativně vysokou stabilitu v solných roztocích. Velikost nanomicel hyaluronanu UNFEHA s enkapsulovaným resveratrolem (příklad 39): 40 - 60 nm (DLS distribuce Obr. 10).

Příklad 41: Morfologická analýza nanomicel hyaluronanu

Mikroskopické analýzy byly provedeny na scanning elektronovým mikroskopem. Nosič s resveratrolem připraveno v příkladu 39 byl rozpuštěn na koncentraci 10 mg/ml v H₂O. Z takto připraveného roztoku bylo odebráno 10 μΐ vzorku do eppendorfky a přidáno 10 μΐ 1% roztoku kyseliny fosfowolframové. Na mřížku bylo přeneseno 10 μΐ roztoku, takto připravená mřížka byla inkubována 20 min pri 40 °C. Poté byl odsát přebytečný roztok pomocí filtračního papíru a mřížka byla připravena k měření. Snímky polymemích micel s loadovaným resveratrolem z elektronového mikroskopu jsou na Obr. 10.

Příklad 42: Enkapsulace Resveratrolu do 1 l-(4-methylfenyl)undekanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEHA)

100,4 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného v Příkladu 12 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (5 mg ve 3 ml ethanolu). Ethanol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění methanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 μιη skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 2,91 % (hmotn.)

-24CZ 30265 Ul

Příklad 43: Enkapsulace Resveratrolu do 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové

100.4 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného v Příkladu 22 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (5 mg ve 3 ml etanolu). Etanol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění metanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 2,61 % (hmotn.)

Příklad 44: Enkapsulace Resveratrolu do 4-oktyloxybenzoyl derivátu (OBEHA) kyseliny hyaluronové

103 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného v Příkladu 22 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (3 mg ve 3 ml isopropanolu). Propan-2-ol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění propan-2-olu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován. Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 1,7 % (hmotn.)

Srovnávací příklad 45: Enkapsulace Resveratrolu do HA-C18:1 derivátu kyseliny hyaluronové (podle W02014082609)

100.1 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného podle WO 2014082609 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (5 mg ve 5 ml isopropanolu). Propan-2-ol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění propan-2-olu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 1,3 % (hmotn.)

Srovnávací příklad 46: Enkapsulace Resveratrolu do HA-C18:1 derivátu kyseliny hyaluronové (podle WO2014082609)

100.5 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného podle patentu WO 2014082609 Al bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (5 mg ve 10 ml ethanol). Ethanol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění methanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 1,2 % (hmotn.)

Srovnávací příklad 47: Enkapsulace Resveratrolu do HA-C16 derivátu kyseliny hyaluronové (podle W02014082609)

101.2 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného podle WO 2014082609 Al bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok resveratrolu (2,2 mg ve 2 ml isopropanolu). Propan-2-ol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění propanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 1,68 % (hmotn.)

Srovnávací příklad 48: Enkapsulace Resveratrolu do HA-C6 derivátu kyseliny hyaluronové (podle WO 2014082609)

99,8 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného podle patentu WO 2014082609 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého mí-25CZ 30265 Ul cháni postupně přidáván roztok resveratrolu (3,3 mg ve 3 ml methanolu). Methanol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění methanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného resveratrolu (UV-Vis stanovení): 0,7 % (hmotn.)

Příklad 49: Enkapsulace retinyl palmitátu do ll-(4-methylfenyl)undelkanoyl derivátu kyseliny hyaluronové (UNFEE1A)

100,4 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného v Příkladu 12 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok retinyl palmitátu (12,4 mg ve 5 ml isopropanolu). Isopropanol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění metanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného retinyl palmitát (Superkritické fluidní chromatografie stanovení): 7,22 % (hmotn.)

Srovnávací příklad 50: Enkapsulace retinyl palmitátu do HA-C18:1 derivátu kyseliny hyaluronové (podle WO 2014082609)

101,6 mg acylového derivátu hyaluronanu připraveného podle patentu WO 2014082609 bylo přes noc rozpouštěno v 10 ml vody za stálého míchání. K připravenému roztoku byl za stálého míchání postupně přidáván roztok retinyl palmitátu (6 mg ve 5 ml isopropanolu). Propan-2-ol byl z roztoku kontinuálně odstraněn vakuovou evaporací. Po odstranění isopropanolu byla vodná fáze vysušena do sucha, rehydratována na vodní lázni a zfiltrována přes 1 pm skleněný filtr. Filtrát byl zlyofilizován.

Množství navázaného retinyl palmitát (Superkritické fluidní chromatografie stanovení): 3,14 % (hmotn.)

NÁROKY NA OCHRANU

Claims (8)

1. Hydrofobizovaný esterový derivát kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I kde

R¹ je H⁺ nebo jeho sůl,

R² je H nebo -CO(CH2)xC6H4-pR⁵ nebo -CO-CftH₄-pO(CH₂)_yCH₃, nebo -CO-(CH₂)_zNCi₂H₈, kde R⁵ je H nebo CH3; x je celé číslo v rozmezí 4 až 21, s výhodou 4 až 15 nebo y je celé číslo v rozmezí 8 až 21, s výhodou 8 až 15 nebo z je celé číslo v rozmezí 3 až 16, s výhodou 7 až 11, nejlépe 10; a -(CH2)X. nebo -(CH2)y. nebo -(CH2)Z. je lineární nasycená nebo nenasycená část řetězce, přičemž alespoň v jedné opakující se jednotce je jeden nebo více -CO(CH2)xC6H4-pR⁵ nebo -CO-C6H₄-₂oO(CH₂)_yCH₃, nebo -CO-(CH₂)_zNCi₂H₈;

R³ je H nebo R²;

a kde n je celé číslo v rozmezí 1 až 495 dimerů.

2. Derivát podle nároku 1, kde R² je -CO(CH2)xC6H4-pR⁵ nebo -CO-C6H₄-pO(CH₂)_yCH₃, nebo -CO-(CH₂)_zNCi₂H₈ alespoň v jedné opakující se jednotce, přičemž R³ je H.

-26CZ 30265 Ul

3. Derivát podle nároku 1, kde R¹ je vybrán ze skupiny obsahující některý z iontů alkalických kovů nebo iontů kovů alkalických zemin, s výhodou Na⁺, K⁺, Mg²⁺, Ca²⁺ nebo Li⁺.

4. Derivát podle nároku 1, kde množství -CO(CH₂)_xC₅H₄-pR⁵ nebo -CO-C6H4-pO(CH₂)_yCH3, nebo -CO-(CH₂)_zNCi₂H_g v derivátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli obecného vzorce I je od

5 0,1 do 50 % na 100 dimerů hyaluronové kyseliny nebo její soli, s výhodou 2 až 18 %, výhodněji

8 až 15%.

5. Nanomicelámí kompozice na bázi hydrofobizovaného esterového derivátu kyseliny hyaluronové podle nároku 1 obecného vzorce (I), vyznačující se tím, že obsahuje nanomicely, které obsahují hydrofobní jádro tvořené -CO(CH₂)_xC

6H4-pR⁵ nebo -COCdUr

10 pO(CH₂)_yCH₃ nebo -(CH₂)_zNCi₂H₈ skupinami, kde x je celé číslo v rozmezí 4 až 21, s výhodou 4 až 15 a R⁵ je H nebo CH₃, nebo y je celé číslo v rozmezí 8 až 21, s výhodou 8 až 15, nebo z je celé číslo v rozmezí 3 až 16, s výhodou 7 až 11, nejlépe 10, navázanými na kyselinu hyaluronovou a hydrofilní obal tvořený hydrofilními funkčními skupinami kyseliny hyaluronové a jednu nebo více biologicky aktivních aromatických látek fyzikálně vázaných v nanomicele.

15 6. Nanomicelámí kompozice podle nároku 5, vyznačující se tím, že obsahuje 0,3 až 8,0 hmotn. %, s výhodou 2,5 až 8,0 hmotn. %, výhodněji 5,0 až 8,0 hmotn. % biologicky aktivních látek vzhledem k hmotnostnímu obsahu hydrofobizovaného esterového derivátu kyseliny hyaluronové nebo jeho soli, přičemž biologicky aktivní aromatická látka je vybrána ze skupiny zahrnující farmaceuticky a kosmeticky aktivní látky, zejména vitamíny, léčiva s výhodou cyto20 statika, steroidy.

7. Nanomicelámí kompozice podle nároku 5 nebo nároku 6, vyznačující se tím, že biologicky aktivní aromatická látka je vybrána ze skupiny obsahující resveratrol, koenzym Q10, retinyl palmitát.

8. Nanomicelámí kompozice podle kteréhokoli z nároků 5 až 7, vyznačující se

25 t í m , že koncentrace derivátu kyseliny hyaluronové v kompozici ve vodném roztoku je v rozmezí 0,003 mg.ml¹ až 20 mg.ml'¹, s výhodou 1 až 10 mg.ml¹.

8 výkresů