CZ303155B6 - Terapeutický prostredek pro lécení nádorové bunky v nádoru nebo metastázích nádoru a souprava jej obsahující - Google Patents

Abstract

Rešení se týká použití a) cinidla potlacujícího angiogenezi, kterým je antagonista .alfa..sub.v.n..beta..sub.3.n., který je vybraný ze skupiny obsahující peptid obsahujíc RGD, monoklonální protilátku proti .alfa..sub.v.n..beta..sub.3.n., monoklonální protilátku proti receptoru .alfa..sub.v.n..beta..sub.3.n.; a b) protinádorového imunoterapeutického cinidla, kterým je protinádorový antigen/ cytokin fúzní protein pro výrobu léciva pro lécení rakoviny bunek, pricemž protinádorový antigen/ cytokin fúzní protein obsahuje alespon antigen vázající cást protilátky proti nádorovému antigenu. Dále se rešení týká farmaceutického prostredku obsahujícího tato cinidla a soupravy pro lécení rakoviny.

Description

Terapeutický prostředek pro léčení nádorové buňky v nádoru nebo metastázích nádoru a souprava jej obsahující

Oblast techniky

Vynález se týká použití činidel potlačujících angiogenezi a protinádorových imunoterapeutickýeh činidel pro výrobu kombinovaného léčiva pro léčení rakoviny buněk, přičemž za použití terapie založené na kombinovaném použití antiangiogenní terapie a cílené protinádorové imunoterapie dojde k potlačení primárních nádorů a metastází.

Dosavadní stav techniky

Vytváření nových krevních cév, neboli angiogeneze, hraje klíčovou roli v rozvoji nádorové nemoci a vzbudila velký zájem o vývoj činidel, která angiogenezi potlačují (viz například Holmgren, L., O Reilly, M. S. & Folkman, J. (1995) „Latentní stav mikrometastáz: rovnovážné množení a apoptóza v přítomnosti suprese angiogeneze“. Nátuře Medicíně 1, 149 až 153; Folkman, J. (1995) Angiogeneze u rakoviny, cévních, revmatických a jiných chorob“, Nátuře io Medicíně 1, 27 až 31; O'Reilly, M. S., a kol., (1994) „Angiostatin; nový inhibitor angiogeneze, který zprostředkuje supresi metastází u Lewisova plicního karcinomu“, Cell 79, 315 až 328; Kerbel, R. S. (1997) „Rakovinná terapie, která je rezistentní k rezistenci“, Nátuře 390, 335 až 336; Boehm, T., a kol., (1997) „Antiangiogenní terapie pokusných rakovin nenavozuje získanou lékovou rezistenci“, Nátuře 390, 404 až 7; a Volpert, O. V., a kol., „Lidský fibrosarkom inhibuje systémovou angiogenezi a růst pokusných metastází pomocí trombospondinu-1“, Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 95, 6343 až 6348).

Použití antagonistů integrinu α_γβ₃ pro potlačení angiogeneze je známé v rámci metod, které potlačují růst pevného nádoru tím, že snižují přísun krve do pevného nádoru. Viz například patent

US 5 753 230 (Brooks & Cheresh) a patent US 5 776 591 (Brooks & Cheresh), které popisují použití takových antagonistů α_νβ₃, jako jsou syntetické polypeptidy, monoklonální protilátky a sloučeniny napodobující α_γβ₃, které se vážou na receptor pro α_νβ₃ a potlačují angiogenezi.

Dále byly popsány terapie používající fuzní proteiny protilátka-cytokin, které posilují imunitní odpovědí zprostředkované potlačení již ustavených nádorů, jako jsou metastázy karcinomů. Například cytokin interleukin-2 (IL-2) byl fúzován s těžkým řetězcem monoklonální protilátky, který imunologicky reaguje, ve dvou oddělených fúzních proteinech, s molekulami adhezními antigenů epiteliálních buněk spojených s nádorem (Ep-CAM, KS A, KS 1/4 antigen) nebo s disialogangliosidem GD₂ za použití protilátek KS1/4, respektive chl4.18a, a vytvořil tak fuzní proteiny chl4.18-IL-2, respektive KS 1/4—IL-2. Viz například patent US 5 650 150 (Gillies).

Určení inhibitorů angiogeneze, které specificky potlačují vznik nových cév a působí v součinnosti s léčebnými postupy tím, že specificky působí na oblast nádoru, umožní navržení optimálně účinných postupů pro léčení rakoviny.

Angiogeneze je charakterizována vniknutím, migrací a množením buněk výstelky, a tyto procesy jsou závislé na interakcích buněk se složkami mimobunéčné základní hmoty. V této souvislosti bylo ukázáno, že adhezní receptor integrinu α_νβ₃ u výstelkových buněk hraje klíčovou úlohu v tom, že poskytuje pro antiangiogenní léčebné strategie cíl, který specificky souvisí s cévním zásobením (Brooks, P. C„ Clark, R. A. & Cheresh, D. A. (1994) „Požadavek angiogeneze na cévní integrin alfa v beta 3“, Science 264, 569 až 571; Friedlander, M„ a kol., „Definice dvou angiogenních drah pomocí odlišných alfa vintegrinů“, Science 270, 1500 až 1502). Požadavek na cévní integrin α_νβ₃ v angiogenezi byl demonstrován na několik in vivo modelech, kde vytváření nových krevních cév transplantovaných lidskými nádory bylo zcela inhibováno buď

- 1 CZ 303155 B6 systémovým podáváním peptidových antagonistů integrinu α_νβ3, nebo protilátky LM609 proti α_νβι (Brooks. P. C., a kol., (1994) Science 264, 569 až 571; Brooks, P. C., a kol., (1994) „Antagonisté integrinu alfa v beta 3 vyvolávají regresi nádoru indukováním apoptózy angiogenních krevních cév“. Cell 79, 1157 až 1164). Myší hybridem LM609 byl 15. září 1987 uložen v Americké sbírce typových kultur (ATCC, Rockville, MD, USA) jako mezinárodního úřadu pro ukládání biologických vzorku podle budapešťské smlouvy a bylo mu přiřazeno ATCC označení 1IB9537. l akoví antagonisté blokují připojení integrinu α_νβ₄, který podporuje apoptózu množících se angiogenních cévních buněk a tedy přerušuje dozrávání nove se vytvářejících krevních cév, což je záležitost podstatná pro růst nádorů.

Růstový faktor cévní výstelky (VEGF) byl zjištěn jako selektivní angiogenní růstový faktor, který může stimulovat detení výstelkových buněk. Biopsie lidských nádorů vykazují zvýšenou expresi VEGF mRNA v nádorových buňkách a zvýšenou expresi mRNA pro VEGF receptory v přilehlých výstelkových buňkách. Exprese VEGF se zdá být nejvyšší v těch oblastech nádorů, které sousedí s nekrotickými oblastmi bez cév (pro přehled viz Thomas a kol., (1996) „Růstový faktor cévní výstelky jako účinné a selektivní angiogenní činidlo“, J. Biol. Chem. 271(2): 603 - 606). Účinné protinádorové terapie mohou využívat VEGF receptor jako cíl pro potlačování angiogeneze pomocí monoklonálních protilátek (Witte L. a kok, (1998) „Cílené působení monoklonálních protilátek na VEGF reeeptor-2 (Flkl/KDR) jako strategie antiangiogenní terapie“, Cancer Metastasis Rev. 17(2): 155-61).

Hlavní překážkou účinné léčby rozptýlených maligních nádorů je to, že zbytkové mikrometastáze postrádají dobře vytvořené cévní zásobení, kterým by do nich bylo možno dopravovat léčiva. V tomto ohledu se nová imunoterapeutická strategie ukazuje jako účinná tím, že používá monoklonální protilátky specifické proti součástem nádoru pro nasměrování cytokinů do nej bližšího okolí nádoru. Toto bylo dosaženo pomocí rekombinantních fůzních proteinů protilátka-cytokin, vytvořených pro to, aby byla zachována jedinečná schopnost monoklonálních protilátek specificky zasáhnout nádor, spolu s imunomodulační funkcí cytokinů. Použití fúzního proteinu protilátka-IL-2 pro nasměrování IL-2 na složku nádoru, indukovalo aktivaci efektorových buněk, které vnikaly do nej bližšího okolí nádoru a výsledkem bylo účinné vymýcení existujících mikrometastáz, a to u třech modelů syngenních myších nádorů (Becker, J, C., a kol., (1996) „Vymýcení metastází myšího melanomu zprostředkované T buňkami pomocí cílené terapie inteleukinem 2“, J. Exp. Med. 183, 2361 až 2366; Xiang, R. a kol., (1997) „Eliminace metastází rakoviny tlustého střeva u myší pomocí léčby fúzním proteinem, proti látka-interleukin-2“, Cancer Res. 57, 4948 až 4955; Lodě, Η. N., a kol., (1998) „Vymýcení metastází neuroblastomu do kostního morku, zprostředkované přirozenými zabíječi při cílené terapii interleukinem-2“, Blood 91, 1706 až 1715). Třebaže je velmi účinný v počátečních stádiích nádorové metastázy, tento přístup nasměrování na složky nádoru může pouze zbrzdit růst metastází v pozdějším stádiu nádorového růstu, který je charakterizován plně vyvinutou cévní složkou. Zde jsme si položili otázku, zda by existovalo výhodné, doplňující se použití specifických cévních léčebných strategií a léčebných strategií, zaměřených na složky nádoru, když by byly použity v časově následných nebo současných kombinacích.

Toto bylo testováno na třech modelech syngenních myších nádorů tlustého střeva, melanomu a neuroblastomu, přičemž poslední z nichž je charakteristický svými metastázemi do jater. Všechny tři modely vykazují blízké podobnosti s lidskými nemocemi. Melanomový a neurobí astomový model exprimují disialogangliosid GD2, což je dobře známý antigen spojený s nádory neuroektodermálních rakovin (Irie, R. F., Matsuki, T. & Morton, D. L. (1989) „Použití lidské monoklonální protilátky proti gangliosidu GD2 pro léčení melanomu“, Lancet 1, 786 až 787; Handgretinger, R., a kol., (1995) „První fáze studia chimémí člověk/myš protilátky chl4.18 proti gangliosidu GD2 u pacientů s neuroblastomem“, Eur. J. Cancer 31 A, 261 až 267) a model karcinomu tlustého střeva je charakteristický expresí adhezní molekuly epiteliálních buněk (Ep-CAM, KSA, antigen KS 1/4), což je cílová molekula s úspěchem používaná při pasivní ímunoterapii u člověka (Riethmuller, G. a kol., (1994) „Zkoušení náhodných monoklonálních protilátek pri terapii chirurgicky odstraněného Dukeova karcinomu konečníku“, Lancet 343, 1177

-2CZ 303155 B6 až 1 183). Tyto antigeny specificky vymezí v těchto modelech tu část nádoru, která bude cílem fúzních proteinu prot i látka- interleukin-2 s chiméru i človčk/myš protilátkou proti GD2 (ch 14.18-1L-2) (Gillies, S. D., a kol., (1992) „Interleukin-2 zaměřený pomocí protilátky stimuluje zabíjení autologních nádorových buněk T buňkami'¹. Proč. Nati. Acad. Sci. (USA) 892,

1428 až 1432) a /ušlechtěných protilátek KS 1 /4-1L-2 proti Ep-CAM (proti KSA, proti antigenů

KS 1/4) (Xiang, R„ a kol., (1997) „Eliminace metastází rakoviny tlustého střeva u myší pomocí léčby fúzním proteinem proti látka—interleukin—Cancer Res. 57, 4948 až 4955; Gillies, S., a kol., (1998) „Fúzní proteiny protilátka—IL—2 jsou účinné u SC1D myších modelů metastází prostaty a karcinomu tlustého střeva, J. Immunol. 160, 6195 až 6203). Cévní složka těchto io nádorových modelů, jak je popsáno u několika živočišných modelů, je definována expresí integrinu α_νβ₃ na nově vytvářených krevních cévách (Brooks, P. C. a kol., (1994) „Antagonisté integrinů alfa v beta 3 vyvolávají regresi nádoru indukováním apoptózy angiogenních krevních cév. Cell 79, 1157 až 1164). Údaje, které jsou zde uvedené, ukazují na synergický účinek současného a postupného léčení specificky zaměřených nádorů a cévních složek primárních nádorů a vzdálených metastází. Mechanizmus pro tento synergický účinek spočívá ve snížení vytváření krevních cév a v zesílení zánětu pouze u zvířat, léčených touto kombinovanou terapií. Tato pozorování zdůrazňují blahodárný vliv kombinování antiangiogenních a nádorově specifických protínádorovýeh imunoterapeutických přístupů.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká použití

a) činidla potlačujícího angiogenezi, kterým je antagonista α_νβ₃, který je vybraný ze skupiny obsahující peptid obsahující RGD, monoklonální protilátku proti α_νβ3, monoklonálních protilátku proti receptoru α_νβ3; a

b) proti nádorového imunoterapeutického činidla, kterým je protinádorový antigen/cytokin fúzní protein pro výrobu léčiva pro léčení rakoviny buněk, přičemž protinádorový antigen/cytokin fúzní protein obsahuje alespoň antigen vázající část protilátky proti nádorovému antigenů.

Léčivo je zaměřeno na léčení nádorových buněk u pacienta, který takovou léčbu vyžaduje, při35 čemž se uvedenému pacientovi podá činidlo inhibující angiogenezi a proti nádorové imunoterapeutické činidlo v množstvích, která inhibují množení nádorových buněk. Potlačení množení nádorových buněk může zahrnovat potlačení růstu nádorových buněk v již existujícím nádoru nebo v metastázích nádoru, potlačení vytváření dalších metastází nádoru a dokonce usmrcení nádorové buňky. Činidlo inhibující angiogenezi a proti nádorové imunoterapeutické činidlo mohou být podány v podstatě současně nebo následně po sobě.

V jednom provedení popisuje předložený vynález způsob léčení nádoru nebo metastází nádoru u pacienta tím, že pacientu je podána kombinace alespoň jednoho činidla inhibuj ící ho angiogenezi a alespoň jednoho protinádorového imunoterapeutického činidla. Tímto způsobem může být u uvedeného pacienta dosaženo účinné inhibice množení nádorových buněk.

Pacient může obdržet výše zmíněné léčivé prostředky buď před, v průběhu, nebo po chirurgickém zákroku, odstraňujícím celý nádor nebo jeho část. Podání může být provedeno přímým ponořením; systémovou nebo lokální intravenózní (i.v.), intraperitoneální (i.p.), podkožní (s.c.), intramuskulámí (i.m.), nebo přímou injekcí do hmoty nádoru; a/nebo orálním podáváním vhodných přípravků.

Činidlo potlačující angiogenezi, vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je takové, které může potlačovat vytváření nových krevních cév (neovaskularizace) nebo zvětšování již existujících kapilárních systémů v tkáních blízko nádorové buňky. Vhodnými

-3CZ 303155 B6 činidly potlačujícími angiogenezi mohou být peptidy s aktivitou, která potlačuje angiogenezí, jako je například nádorový antigen PSA. Jinými vhodnými činidly potlačujícími angiogenezi mohou být antagonisté angiogeneze spojené s VEGF, například antagonisté receptorů VEGF na povrchu buněk. Výhodným činidlem potlačujícím angiogenezi je antagonista vazby α_νβ₃ integri5 nu na buňky. Antagonista α_νβ₃, vhodný pro použití v metodách předloženého vynálezu je takový, který je schopen potlačovat angiogenezi v nádorových tkáních nebo v tkáni nádorové metastáze, když je podán do dotyčné tkáně nebo k dotyčným buňkám. Takovými antagonisty mohou být jedinečné lineární nebo cyklické polypeptidy, lineární nebo cyklické polypeptidy, obsahující RGD, protilátky nebo sloučeniny napodobující α_νβ₃, které se vážou k receptorů α_νβ₃ a potlačují io angiogenezi.

Tam kde je antagonistou α_νβ₃ protilátka, předpokládá se, že tato protilátka může být polyklonální, monoklonální nebo se může jednat o její fragment, který váže antigen, má antigenovou vazebnou specifitu pro α_νβ₃ nebo pro receptor α_νβ₃. Výhodnou monoklonální protilátkou, která se váže k integrinu α_νβ₃, je monoklonální protilátka označení jako LM609 (ATCC HB 9537).

Výhodným činidlem potlačujícím angiogenezi je polypeptid, který je antagonistou receptorů α_νβ₃, který může inhibovat receptor integrinu na cílové buňce. Nej výhodnějším provedením antagonisty integrinu α_νβ₃ je syntetický peptid obsahující RGD, eyklo (RGDfN-MeV) (SEQ ID NO:

2o 11) a podobné. Cyklické peptidy tohoto obecného typu jsou popsány v patentu US 5 262 520 (Plow a kol.). Peptidy, které neobsahují RGD, jsou popsány v patent US 5 780 426 (Pal lad i no a kol.).

Protinádorové imunolerapeutické činidlo, vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem

2? tohoto vynálezu, je takové imunoterapeutické činidlo, které obsahuje účinnou buněčnou složku ve spojení se složkou, která je schopna tento komplex zaměřit na nádorový antigen.

Vhodné účinné buněčné složky mohou zahrnovat cytotoxické chemikálie, cytotoxické radioaktivní izotopy a buněčná signální činidla, jako jsou cytokiny.

Vhodnými složkami, která jsou schopny se zaměřit na antigen, jsou polypeptidové řetězce, jako jsou řetězce receptorových proteinů nebo řetězce imunoglobulinů, které se vážou k nádorovým antigenům, přítomným na nádorových buňkách nebo v základní hmotě tkáně, která obklopuje nádorové buňky.

Nádorové antigeny, které mohou být využity jako cíle imunoterapeutických činidel, zahrnují nádorové antigeny, vybrané ze skupiny zahrnující AFP, CA 125, CEA, CD19, CD20, CD44, CD45, receptor EFG, GD₃, GD₃, GM1, GM2, Her-2/Neu, Ep-CAM (KSA), receptor IL-2, Lewis-Y, Lewis-W (CD-I5), glykoprotein MCSP spojený s melanomem, receptor PSA a receptor pro transferin.

Výhodné imunoterapeutické činidlo má účinnou složku, kterou je polypeptid cytokinů, spojený se složkou, která je schopna zaměřit se na antigen, což je imunoglobulinový (lg) polypeptidový řetězec, Imunoglobulinový polypeptidový řetězec obsahuje variabilní oblast, která se váže k nádorovému antigenů. Je výhodné, když uvedený imunoglobulinový řetězec, když je spojen s vhodným doplňujícím řetězcem (tj. těžký řetězec doplňuje lehký řetězec), definuje aktivní místo protilátky, které je specifické pro nádorový antigen.

Na nádor zaměřená část imunoglobulinu, která je součástí imunoterapeutického činidla, může obsahovat celou aminokyselinovou sekvenci imunoglobulinového řetězce, nebo alespoň ten její fragment, který obsahuje tu část proteinu, která má vazebnou specifitu pro antigen. Tedy vhodný imunoglobulinový polypeptidový řetězec bude mít alespoň variabilní oblast imunoglobulinu, specifickou pro nádorový antigen.

-4CZ 303155 B6

Protilátky a jejich polypeptidové řetězce vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, budou mít aminokyselinovou sekvenci, která může být původem z jakéhokoliv savce. Tam, kde takový protein protilátky není téhož původu jako očekávaný pacient, tam mohou být použity fragmenty proteinu protilátky, jako jsou F(ab')2, Fab, Fv nebo metodami genového inženýrství upravený Fv protein jed noře tězcové protilátky. Aby byla dále snížena antigenicita proteinu protilátky, mohou být provedeny změny aminokyselinové sekvence, které snižují antigenítu tím, že upraví protein tak, že se více podobá složkám normálních pacientových protilátek. Například aminokyselinové sekvence myších monoklonálních protilátek mohou být pro podávání lidským pacientům pozměněny tak, aby se zdály více podobné sekvencím lidských protilátek, což io je možno učinit různými postupy pro zušlechťování protilátek.

Jinou možností je, že protilátka může být lidského původu (geneticky kódovaná lidskými imunoglobulinovými geny), ale je produkována v transgenním živočichovi, transformovaném, aby exprimoval lidské imunoglobulinové geny namísto svých vlastních imunoglobulinovýeh genů. is Například mohou být konstruovány transgenní myši, které exprimují DNA lidského původu, kódující lidské imunoglobulinové proteiny. Příprava monoklonálních protilátek z takových transgenních myší bude pocházet z hybridomů myších B buněk, které exprimují lidskou DNA kódující protilátky, které mají aminokyselinové sekvence lidského původu. To velmi sníží imunogenítu těchto protilátek při použití k léčení lidských pacientů.

Protilátkami výhodnými při léčení lidských pacientů, a vhodnými pro použití v metodách nárokovaného vynálezu, jsou zušlechtěné monoklonální protilátky ch14.18 proti nádorovému antigenů GD2 a monoklonální protilátky KS 1/4, proti nádorovému antigenů KS 1/4 (také známému jako Ep-CAM a KSA).

Na buňky účinkující složkou ímunoterapeutického činidla, vhodného pro použití v metodách, prostředcích a soupravách, které jsou provedením předloženého vynálezu, je cytokin vybraný ze skupiny zahrnující: BDNF, CTNF, EGF, Epo, FGF, Flt3L, G—CSF, GM-CSF, I-309/TCA-3, gama-lP-10, α-IFN, β-IFN, γ-IFn, IL-1, IL-2, IL-3, IL-A IL-5, IL-6, IL-7, 1L-8, IL-9,

1L-10, IL-11, IL-12, IL-13, 1L-14, IL-15. IL-16, IL-17, IL-18, LIF, LT, MCP-1 až MCP-3,

M-CSF, MIF, MIP-1, alfa, MIP-1 beta, MIP-2, NGF, NT-3, NT-4, OSM, PBP, PBSF, PGFD, ΡΓΒ RANTES, SCF, a-TGF, β-TGF, a-TNF, Tpo a VEGF. Vhodný cytokin, který je chemokin, může být vybrán ze skupiny zahrnující: CIO, EMF-1, ENA-78, Eotaxin, GCP-2, HCC-1, 1-309, IL—8, IP-10, Lymfotaktin, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MGSA, MIG, MIP-1 alfa,

MIP-1 beta, MIP-2, NAP-2, PF4, RANTES, SCM-1 a SDF-1. Cytokinová část výše zmíněného ímunoterapeutického činidla může být celou aminokyselinovou sekvencí cytoki nového proteinu nebo fragment takového fúzního proteinu, který postačuje pro vyvolání biologické odpovědi, specifická pro cytokin.

Ve výhodném provedení má cytokinová část Ímunoterapeutického činidla biologickou aktivitu IL-2.

V imunoterapeutickém činidle, které obsahuje polypeptid cytokinú spojený s imunoglobulinovým polypeptidem, vhodným spojením mezi řetězce polypeptidů cytokinú a řetězcem imunoglobuli45 nového polypeptidů je přímá polypeptidová vazba, spojení tvořené polypeptidovým linkerem mezi dvěma řetězci nebo jiná chemická vazba mezi řetězci, včetně použití biotinylace či komplexu avidin-biotin. Výhodné spojení je buď přímé, nebo pomocí polypeptidového linkeru, který prodlužuje délku spojení polypeptidů. Takováto přímá vazba umožňuje expresi imunoterapeutického činidla jako jediného fúzního proteinu v hostitelských buňkách transformovaných vhodným expresním vektorem, kódujícím fúzní protein ímunoterapeutického činidla.

Výhodným imunoterapeutickým činidlem, které je vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je tedy b i funkční fúzní protein, který má cytokinovou složku a složku zaměřenou proti nádorovému antigenů, kde složkou zaměřenou proti nádorovému anti55 genu je polypeptidový řetězec imunoglobulinu, který má specifitu proti nádorovému antigenů.

-5CZ 303155 B6

Příklady takových výhodných imunotcrapeutíckýeh činidel zahrnují luzní protein ch 18.18-11.2 proti nádorovému antigenů UD2 a luzní protein KSI/4-IL2 proti nádorovému antigenů KS 1/4 (také známý jako Ep-CAM a KS A).

Jinou možností je, že jiná iinunolerapeutická činidla, vhodná pro použití v metodách, prostředcích a soupravách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou mít na buňky účinkující složku, která je cytotoxiekým činidlem. Vhodným cytotoxiekým činidlem je takové, které má přímý cytotoxieký účinek na nádorovou buňku, tj. imunotoxiny, radioaktivní izotopy, cy to toxické léky a podobně. Stejně jako výše popsaná cytokinová imunoterapeutika, také cytotoxické peptidy io mohou být spojeny s polypeptidy imunoglobulinu proti nádorovým antigenům a vytvářet tak luzní protein buď přímo, nebo spojený linkerovým peptidem nebo řetězcem. Může být vytvořeno i chemické spojení chemických cytotoxinů k polypeptidům imunoglobulinů. Mohou být také zkonstruovány řetězce protilátek, které nesou radioaktivní izotopy.

Jiné provedení vynálezu zahrnuje léčebný prostředek, který obsahuje činidlo potlačující angiogenezii a protinádorové imunoterapeutické činidlo. Je výhodné, když protinádorové imunoterapeutické činidlo zasahuje nádor nebo buňky metastáze nádoru tím, že jsou v něm spojeny složka se spec ifi tou proti nádorovému antigenů se složkou účinkující na buňky. Ve výhodném léčebném prostředku, který je předmětem tohoto vynálezu, je protinádorové imunoterapeutické io činidlo bifunkční protein, který má účinnou složku, kterou je polypeptid cytokinu, spojenou se složkou zaměřenou proti nádoru, kterou je polypeptidový řetězec imunoglobulinu (Ig), přičemž uvedený imunoglobulinový řetězec obsahuje variabilní oblast, která se váže k nádorovému antigen u.

Ještě jiným provedením vynálezu je souprava pro léčení nádoru a nádorových metastáz. Souprava obsahuje činidlo potlačující angiogenezi, jako je antagonista α_νβ₃, který je schopen potlačovat angiogenezi v uvedeném nádoru nebo v metastázách nádoru; bifunkční proteinovou složku, která má cytokinovou aktivitu a specifltu proti nádorovému antigenů; a návod pro léčení nádorových bunčk v nádorech a v metastázích nádoru. Souprava může také obsahovat specifické nálepky s označením, jak používat složky soupravy pro léčení nádorů nebo nádorových metastáz.

Podrobný popis vynálezu

Potlačení a vymýcení primárních nádorů a odděleně se vyskytujících metastází je hlavním cílem alternativních léčebných strategií pro rakovinu, jako jsou potlačení angiogeneze a cílená imunoterapie.

V této práci bylo zjištěno, že existuje nepředpokládaný zesilující vliv na účinnost léčení nádoro40 vých buněk v nádorech a metastázích nádoru, při kombinovaném použití dvou léčebných postupů, které jsou zde označovány jako (1) antiangiogenní, tj, terapie potlačující angiogenezi (vytváření krevních cév) a (2) protinádorová imunoterapie. Zvláště je zde popsáno kombinování léčení antagonistou a_v a léčení fúzním proteinem proti nádorový antigen/cytokin.

Bylo zjištěno, že nastává zesilující vliv mezi dvěma specifickými monoterapiemi, zaměřenými proti cévní a nádorové složce; respektive antagonistou integrinu a_v, který specificky působí proti rozvoji cév v nádoru, a nádorově specifickými fúzními proteiny protilátka-IL-2.

Současné a následné kombinování těchto monoterapii účinně vymýtilo spontánní metastáze v ját50 rech u slabě imunogenního syngenního modelu ne urobí astomu. Toto bylo v protikladu ke kontrolám, které byly léčeny monoterapiemi buď s antagonistou antiangiogenního integrinu ct_v, nebo fúzními proteiny protilátka-IL-2, které byly pouze částečně účinné při podávaných dávkových hladinách.

-6CZ 303155 B6

Dále, současné léčení pomocí antagonisty integrinu a _v a nádorové specifických fúzních proteinů proti látka—II .--2 indukovalo dramatické regrese u tří syngenních myších nádorových modelů, tj. melanom, karcinom tlustého střeva a neuroblastom. Každé toto činidlo, použité v monoterapii samostatně, indukovalo pouze zpomalení nádorového růstu.

Protinádorová odpověď byla doprovázena současným 50% snížením hustoty cév v nádoru a pětinásobným zvýšením počtu zánětlivých buněk v nej bližším okolí nádoru. Následkem toho se projevila nekróza nádoru pouze u živočichů, kterým byla podána kombinovaná terapie, a nikoli, když bylo každé činidlo aplikováno jako monoterapie. Výsledky ukazují, že tyto synergícké ío léčebné postupy poskytují nový a účinný nástroj pro budoucí léčení rakovin s metastázemi.

Vynález popisuje metody pro léčení nádorů a nádorových metastáz, léčebné prostředky a léčebné soupravy (balené systémy), které jsou vhodné pro praktické provádění zde popisovaných synergických léčebných postupů.

1. Léčebné prostředky

Jsou popsány rozmanité léčebné prostředky, které jsou vhodné pro praktické provádění postupů, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Prostředky zahrnují činidla potlačující angiogenezi, jako jsou antagonisté α_νβ₃ a protinádorová činidla, jako jsou fúzní proteiny nádorový antigen/cytokin, buď samotné, nebo v různých kombinacích.

A. Inhibitor angiogeneze

V prostředcích a metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být použity inhibitory angiogeneze, které potlačují angiogenezi ve tkáních, které jsou jimi léčeny. Výhodným inhibitorem angiogeneze je antagonista ot_v a zvláště antagonista ανβ?· Antagonista α_νβ₃ inhibující angiogenezi (antiangiogeneze) může být peptid, peptid obsahující RGD, protilátky proti α_νβ₃, protilátka proti receptorů α_νβ₃ nebo látky napodobující α_νβ₃. Příklady antagonistů α_νβ₃ jsou popsány .ío v patentu US 5 753 230 (Brooks & Cheresh) a patentu US 5 766 591 (Brooks & Cheresh), jejichž popisy týkající se přípravy a použití antagonistů αγβ₃ jsou sem specificky zahrnuty formou odkazu.

Výhodnými antagonisty jsou peptidy obsahující RGD, jako je cyklický peptid cyklo (RGDfN35 MeV) (SEQ ID NO: 11). V literatuře byly popsány další antagonisté včetně podobných organických sloučenin a cyklické peptidy neobsahující RGD, které fungují jako antagonisté α_νβ₃- Viz například Brooks a kol., mezinárodní publikace WO 97/45 137 (PCT/US97/09158).

Testy vhodné pro určení antagonisty α_νβ₃, vhodného pro použití jako antagonisty, jsou popsány v citovaných patentech USa proto se má za to, že pro praktické uplatnění předloženého vynálezu je možno snadno určit alternativní antagonisty.

Vhodná monoklonální protilátka proti α_νβ3 může být modifikována, aby obsahovala své úseky, které vážou antigen, včetně F(ab)2, Fab a metodami genového inženýrství upravený Fv nebo jednoretězcovou protilátku (SCA). Metody pro přípravu takových fragmentů jsou v oboru známé (viz například Hermanson, G. T., Bioconjugate Techniques, Academie Press, 1996). Metody předloženého vynálezu, popisující použití protilátek, také zahrnují vhodnou modifikaci celé protilátky, pokud se týká jejich fragmentů, které vážou antigen. Jedna taková vhodná protilátka je označena jako LM609(ATCC HB 9537).

U jiných antagonistů α_νβ₃ receptorů bylo ukázáno, že účinně potlačují angiogenezi a mohou být vhodní pro použití v metodách předloženého vynálezu. Například chemičtí antagonisté receptorů, jako je (5)-10,1 l-dihydro~3-[3-(2-pyridiny lamino)-1 -propy loxy ]-5/7—dibenzofo, ď]cyklohepten-10-octová kyselina (známa jako SB-265 123), byly testovány na různých savčích

-7CZ 303155 B6 modelových systémech (viz například Keenan, R. M. a kol.., (1998) Bioorg. Med. Chem. Let 8(22), 3171 až 6; Ward, Κ. V. a kol., (1999) Drug Metab. Dispos., 27(11): 1232 až 41).

Růstový faktor cévní výstelky (VEGF) byl určen jako selektivní angiogenní růstový faktor. Tedy alternativním nebo přídavným činidlem i nh i bujícím angiogenezi může být inhibitor aktivity VEGF, kterýje postačující pro inhibici angiogenního růstu. Takový inhibitor může být kompetitivní inhibitor nebo molekula vázající se k VEGF a inaktivující jej, nebo antagonista VEGF receptoru. Například možnými inhibitoru mohou být neangiogenní chemické sloučeniny napodobující VEGF a kompetující o vazbu VEGF/receptor, modifikované neangiogenní deriváty VEGF, io protilátka, která se k EGF váže tak dostatečně specificky, aby inhibovala angiogenní aktivitu, nebo možná jiný specifický protein, který se váže k VEGF (jako např. izolovaný protein VEGF receptoru), nebo protilátka, která se váže k VEGF receptoru a blokuje interakcí s VEGF.

Na základě schopností sloučeniny inhibovat angiogenezi byly zjištěny i jiné sloučeniny, napří15 klad izolovaný nádorový antigen PSA.

B. Protinádorová imunoterapie

Metody a prostředky vhodné pro použití v tomto předloženém vynálezu počítají s kombinovaným podáváním alespoň jednoho (antiangiogeneze) léčiva potlačujícího angiogenezi spolu s alespoň jedním proti nádorovým imunoterapeutickým činidlem. Výhodné protinádorové imunoterapeutické činidlo v sobě spojuje složku zaměřenou proti nádoru a buněčnou efektorovou složku, jako je eytokin, imunotoxin, radioaktivní činidlo a podobně. Složka zaměřená proti nádoru s výhodou obsahuje alespoň vazebnou část pro antigen od protilátky, namířené proti nádorovému antigenu.

V jednom výhodném provedení je efektorovou složkou eytokin. a) Nádorové antigeny

Nádorové antigeny jsou cílem, pomocí kterého je imunoterapeutické činidlo, vhodné pro použití so v metodách, prostředcích a soupravách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, nakonec zaměřeno na nádorovou buňku. V oboru je známo, že nádorové antigeny se vztahují vždy k určitým typům nádorů. Ve většině případů jsou nádorové antigeny buněčné povrchové antigeny, které jsou exprimovány způsobem, ke kterému za normálních okolností v normálních buňkách nedochází. Jiné nádorové antigeny jsou z buněk vylučované molekuly nebo složky spojené s extra35 celulární základní hmotou, které běžně nesou nacházeny ve spojení s normální zralou tkání.

Některé nádorové antigeny jsou proteiny, které jsou exprimovány v časnějších vývojových stádiích tkáně a nevyskytují se ve zralých tkáních (někdy jsou nazývány onkofetální proteiny). Jiné nádorové antigeny jsou exprimovány normálními zralými buňkami, ale nádorovými buňka4ú mi jsou exprimovány ve větších množstvích. Nádorové antigeny mohou být mutované formy normálně exprimovaných buněčných markérů nebo extracelulámích složek. Ještě jiné nádorové antigeny se podobají pozměněným nebo neobvyklým formám glykosylaee u proteinů, lipidů nebo extracelulámích složek nebo se jedná o nové sacharidové složky.

Tedy nádorové antigeny mohou široce varírovat a definují, alespoň částečně, typ nádoru, kterýje možno léčit metodami, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Variabilita typů nádorů a nádorových antigenů, které jsou jimi exprimovány, je široká a je dobře prostudována v oboru, který se rakovinou zabývá.

V současné době se studuje mnoho dalších nádorových markérů a pokud jsou jednou určeny a charakterizovány jako nádorové antigeny, stávají se vhodným cílovým antigenem pro nasměrování imunoterapeutického činidla na požadované místo nádoru nebo metastáze.

Byly popsány způsoby nasměrování vektorů genové terapie na nádorové buňky pomocí mono55 klonálních protilátek proti antigenu Lewis-Y (Kurane, S., a kol., Jpn. J. Cancer Res. 89(11): 1212

-8CZ 303155 B6 až 9 (1998)). Podobné bylo také popsáno nasměrování lipozomů pomocí protilátky proti gangliosidu GM3 nebo protilátky proti antigenů Lcwis-X (Nam, S. M., a kol., Oncol. Res. 11(1): 9 až 16 (1999).

Jak bude diskutováno dále, v oboru jsou známy metody pro to, jak připravit vhodné protilátky proti určitému antigenů, které se budou specificky k tomuto antigenů vázat. Tímto způsobem mohou být zjištěny nádorové antigeny a mohou být připraveny protilátky, které budou vhodné pro využití v rámci předloženého vynálezu. Pro přehled metod přípravy nádorových antigenů viz popis v Human Cancer Markers, The Humana Press, lne., vyd. Seli and Wahren, 1982. Standardní ní biochemické a molekulární techniky použitelné při přípravě antigenů a/nebo cytokinů a podobně, jc možno nalézt například v Sambrook a kol., (1989) Molecuiar Cloning: A Laboratory

Manual, 2“^d cd. (Cold Spring Harbor Press, CSH NY).

Povrchové antigeny nádorových buněk mohou být specifické pro třídu nádorů nebo pro jédnotli15 vý typ nádoru. Mnoho sekvencí nukleových kyselin a/nebo aminokyselinových sekvencí příbuzných s nádorovými antigeny a kódujícími je, je dostupných na internetu ve veřejných počítačových databázích, do kterých existuje přístup přes různé služby, např. NCB1 (Národní centrum pro biotechnologické informace; www3.ncbi.nlm.nih.gov) ajsou obyčejně určeny jménem a přístupovým číslem (několik typů příkladů přístupné sekvenční informace je uvedeno poznámkou „viz

2o přístupu číslo).

Výhodnými cílovými nádorovými antigeny jsou mimo jiné AFP (viz přístup NP001125), CA 125 (viz přístup NP005890), CEA (viz přístup AAA62835), CD 19 (viz přístup P15391), CD20 (viz přístup Pl 1836), CD44 (viz přístup P16070), CD45 (viz přístup P08575), receptor EGF (viz přístup P00533), GD₃, GD₃, GM1, GM2, Her-2/Neu (viz přístup AAA58637), Ep-CAM (KSA) (viz přístup P16422, AAA36151), receptor IL-2 (viz přístup P14784, NP000197, PO 1589), Lewis-Y, Lewis-X (CD 15), s melanomem spojený glykoprotein MCSP (víz přístup NPOO1888), PSA (viz přístup P07288), PMSA, transferinový receptor (viz přístup NP0032I8, NP003225, AAF04564), protein markéru karcinomu slinivky GA733-1 (viz přístup P09758), receptor kyseli30 ny listové (viz přístup NP000793), L6 (viz přístup P30408) a CO-029 (viz přístup A3O56, P19075).

Jak je zde popsáno, zvláště výhodnými nádorovými antigeny, na které je možno zaměřit cílená imunoterapeutická činidla, jsou GD₂ a KSA (Ep-CAM; antigen KS1/4).

Proteiny nádorových antigenů jsou komerčně dostupné neboje možno je připravit pomocí standardních technik pro rekombinantní DNA, buněčné kultury a expresi proteinů, které jsou v oboru známé. Například Sigma (St. Louis, MO) má na prodejním seznamu disialogangliosid GD2 (G 0776), disialogangliosid GD3 (G 5904), monosialogangliosid GM1 (G 7641), monosialogan40 gliosid GM2 (G 4551), antigen Ca-19-9 z gastrointestináiního nádoru (G 8660, G 8535), karcinoembryonální antigen CEA (C4835), trisacharid Lewis-X (L 5152) a Lewis-Y (L 7401).

Komerčně dostupné jsou i protilátky proti mnoha z těchto nádorových antigenů. (Např. od USB, RDIO, Accurate Chemical and Scientific Corp., Zymed Lab.). Například Sigma (St. Louis, MO) prodává mnoho monoklonálních protilátek, jako jsou proti AFP (A 8452), proti CEA (C2331), proti receptorů EGF (E 3138), proti rozpustnému receptorů IL-2 (I 5652, í 5777, 1 5902), proti CD19 (F 3899), proti CD20 ( C8080), proti CD44 (C7923) a proti CD45 (C7556).

Dokonce i když nejsou komerčně dostupné, mohou být protilátky specifické proti nádorovým antigenům připraveny pomocí známých metod pro přípravu monoklonálních protilátek, za použití příslušného antigenů jako imunogenu. Například byly popsány variabilní domény těžkého a lehkého řetězce myší protilátky proti antigenů Lewis-Y (viz přístup AAB25798 a AAB25799). Podobně byly popsány i variabilní domény těžkého a lehkého řetězce myší protilátky proti GMI asialogangliosidu (viz přístup AAD09194 a AAD09195). Byla vyřešena krystalová struktura těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky proti gangliosidu GD2 (viz přístup 2 554 841,

-9CZ 303155 B6

554 842). Byly popsány protilátky, které se vážou na receptor kyseliny listové (vazebný protein), klerý byl rozpoznán jako markér pro rakovinu vaječníků (viz přístup NP 000793). Byla také popsána sekvence nukleové kyseliny, kódující variabilní oblast těžkého a lehkého řetězce monoklonální protilátky proti CA 125, a použita k vložení do kazetového vektoru (viz přístup

ΑΛΒ33454,33455).

Zvláště výhodné jsou zde popsané protilátky ch 14.18 a KSI/4.

b) Monoklonální protilátka a její části, které vážou antigen io

Od objevu metod přípravy monoklonálních protilátek, prvně publikovaného Kohlerem aMilsteinem, se v oboru staly dobře známými zdokonalené postupy. (Viz například Dean, C. J. v Metodách molekulární biologie, sv. 80: Imunochemické protokoly, 2. vydání (vyd. Pound, J. D., Humana Press, lne., Totowa NJ, 1998) kapitola 4; a Ausubel, F. M. a kol., Krátké protokoly i5 molekulární biologie, 2. vydání (Současné protokoly, John Wiley & Sons, NY, 1992) kapitola

11). Připravovat monoklonální protilátky, které se vážou na určitý antigen, je nyní běžnou praxí.

Také byly zdokonaleny hromadné prohledávací protokoly pro selekci protilátek, které se vážou s vysokou afinitou, pokud je tato požadována.

Typickými zdroji pro přípravu hybridomů jsou myši nebo jiní hlodavci.

Překážkou pro opakované léčení lidských pacientů pomocí myších protilátek jsou HAMA (lidské protimyší protilátky), vytvářené u pacientů jako odpověď na toto léčení. Metody pro překonání této překážky zahrnují zušlechtění proteinů myší protilátky pomocí substituce antigenních amino25 kyselin myšího proteinu za lidské proteinové sekvence, o kterých se předpokládá, že jsou méně antigenní. Jiné metody spočívají ve vnesení aminokyselinových zbytků nebo oblastí, které určují vazebnou specifitu, do podpůrných oblastí lidské protilátky.

Schopnost exprimovat protein protilátky fágovými prezentujícími systémy umožňuje selektovat protilátky, které byly podrobeny mutagenezi, která buď zdokonalila jejich vazebné vlastnosti, nebo snížila imunogenitu (viz například Antibody Ingeneering McCafferty, J. a kol., vydavatelé, Oxford University Press, 1996). Nedávno umožnila substituce lidských imunoglobulinových genů pro transgenní myši použití myších hostitelů pro přípravu protilátek, a to monoklonálních protilátek, jejichž původ je v lidské sekvenci nukleové kyseliny.

U protilátek může také být zmenšena jejich velikost pomocí fragmentování, aby byla snížena antigenicita, nebo aby byly vytvořeny menší terapeutické molekuly. Například celý protein protilátky může být zmenšen, a to buď štěpením vhodnými enzymy, nebo přípravou menšího proteinu pomocí metod rekombinantní DNA. Vhodné fragmenty budou obsahovat alespoň tu část celé molekuly, která váže antigen, a může obsahovat konstrukty Fab, F(ab)2, F(ab)3, Fv nebo jeden řetězec Fv (jednořetězcová protilátka; SCA).

Předvídá se, že všechny složky terapeutických činidel, založených na monoklonální protilátce, které jsou vhodné pro použití v metodách pro léčení lidských pacientů, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou mít užitek z modifikací snižujících imunogenitu a potenciální HAMA, jak jsou popsány výše.

Je také možné použít protein specifického receptoru, který se může specificky vázat k určitému nádorovému antigenů, jako cílenou složku imunoterapeutických činidel, kterájsou popsána výše.

Z funkčního hlediska může být pro zaměření specifický receptor stejně vhodný jako specifická protilátka, závisí to na specifitě receptoru a jeho afinitě k cílovému nádorovému antigenů. Péče musí být věnována minimalizování důsledků křížově reaktivních vazeb k podobným proteinům, které nemusí být nezbytně nádorového původu.

- 10CZ 303155 B6

c) Cytokiny

V jednom provedení obsahují protinádorové imunoterapeutické konstrukty, které jsou předmětem tohoto vynálezu, část účinkující na buňky, kterou je s výhodou cytokin.

Účinná složka protinádorových terapeutických činidel, která jsou předmětem tohoto vynálezu, muže obsahovat jakýkoliv z řady cytokinů pro indukci biologické odpovědi, specifické pro cytokin u buněk, které na svém povrchu nesou receptor pro cytokin. Cytokiny jsou dobře charakterizovány a proto vynález nemá být chápán tímto jako omezený. Cytokiny zahrnují podtřídu mole10 kul, označovaných jako chemokiny. V kontextu předloženého vynálezu je chemokin považován za člena nadrodiny cyotkinů. Proto termín cytokin, jak je zde používán, označuje jak cytokiny, tak chemokiny. Pro popis stavu oboru cytokinů viz Callard and Gearing. The Cytokine Facts Book, Academie Press, lne., 1994. Pro popis stavu oboru chemokinu viz Vaddi a kol., The Chemokine Facts Book, Academie Press. lne., 1997. Mnoho sekvencí nukleovýeh kyselin a/nebo i? aminokyselinových sekvencí příbuzných s cytokiny je dostupných na internetu ve veřejných počítačových databázích, do ktefych existuje přístup přes různé služby, např. NCBI (Národní centrum pro biotechnologické informace; www3.ncbi.nlm.nih.gov) a jsou obyčejně určeny jménem a přístupovým číslem (několik zde citovaných typů příkladů přístupu k sekvenční informaci je uvedeno poznámkou „viz přístup“ s odkazem na identifikační číslo).

Cytokiny savců mohou být druhově specifické a mohou také varírovat v rámci druhu z důvodu mutace a/nebo alelové variace. Cytokiny vhodné pro použití mohou být vybrány podle toho, jaké druhy savců budou léčeny. Tam, kde existuje větší množství alel, může být proveden výběr podle cytokinové aktivity, nebo může být pro použití vybrána směs alelových variant cytokinů. Tak může být veterinární použití metod, které jsou předmětem tohoto vynálezu, přizpůsobeno léčeným druhům zvířat nebo výběr cytokinů může být proveden od blízce příbuzných druhů, pokud takový cytokin není k dispozici od druhu, u kterého bude probíhat léčení. Při léčení lidí je dávána přednost lidskému homologu, pokud je tento znám.

io Cytokiny vhodné pro používání v rámci předloženého vynálezu zahrnují mimo jiné BDNF (víz přístup 4 502 393), CTNF (viz přístup 4 758 020), EGF (viz přístup pOl 133), Epo (viz přístup 4 503 589), FGF (viz přístup CAB61690), FIt3L, G-CSF (viz přístup CAA27290), GM-CSF (viz přístup 4 503 077), I-309/TCA-3, gamma-IP-10 (viz přístup P01579), IL-1 až 1L-18 (viz přístup P01583, P01584, P01585, P08700, P05112, P05113, P05231, P13232,

P41324, P15248, P22301, P20809, P29459, P46658, P35225, P40222, P40933, Q14005,

NP002I81, Q14116), LIF (viz přístup AAC05I74), LT (viz přístup 4 504 031), MCP-1 až MCP-3, M-CSF (viz přístup 4503 075), MIF (viz přístup 4 505 185), ΜΙΡ-lalfa, MI P-l beta, MIP-2, NGF (viz přístup 4 505 391), NT-3 (viz přístup P20783), NT-4 (viz přístup P34130), OSM (viz přístup P13725), PBP (viz přístup 4 505 621), PBSF, PGFD, PF-L RANTES, SCF

4t) (viz přístup P21583), TGF alfa (viz přístup P01135), TGF beta (viz přístup P01137), TNF alfa (viz přístup P01375), Tpo (viz přístup P40225) nebo VEGF (viz přístup AAD03710).

Chemokiny vhodné pro používání v rámci předloženého vynálezu zahrnují mimo jiné CIO (viz přístup P33861), EMF-1 (viz přístup P08317), ENA-78 (viz přístup A55010), Eotaxin (viz přístup BAA84579), GCP-2 (viz přístup P80162), HCC-1 gl004267), 1-309 (viz přístup g4506833), IL-8 (viz přístup AAA59158), IP-9 (viz přístup CAA75510), IP—10 (viz přístup 4 504 701), Lymfotakin (viz přístup 4 506 853), MCP-1 (viz přístup 4 506 841), MCP-2 (viz přístup P80075), MCP-3 (viz přístup CAB59723J), MCP-4 (viz přístup Q99616), MGSA (viz přístup P09341), MIG (viz přístup P35625), M IP-1 alfa (viz přístup P10855), Ml P-l beta (viz přístup P13236), MlP-2, NAP-2 (viz přístup P20775), PF4 (viz přístup 4 505 733), RANTES (viz přístup 4 506 847), SCM-1 (viz přístup P47992) nebo SDF-1 (viz přístup P48061). Mezi cytokiny, výhodné pro používání v rámci předloženého vynálezu, patří IL-2 a IL-12 nebo jejich biologicky aktivní fragmenty, které si podržely alespoň část efektorové aktivity celé nedotčené molekuly.

Cytokin výhodný pro používání v rámci předloženého vynálezu je IL-2.

Cytokiny vhodné pro používání v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou být připraveny pomocí vhodných sekvencí nukleových kyselin, za použití standardních technik mole5 kulami biologie. Metody genové exprese jsou v oboru známé (například viz Goeddel, D. V., vydavatel, Metody v enzymologii, sv. 185: Technologie genové exprese (Academie Press, lne., NY NY 1991). Cytokiny jsou také dostupné z komerčních zdrojů (tj. Sigma, St, Louis MO).

d) Protinádorová imunoterapeutická činidla s cytokiny io

Tato protinádorová imunoterapeutická činidla, vhodná pro používání v předloženém vynálezu, obsahují efektorovou složku působící na buňku, touto složkou je s výhodou cytokin, vázaný ke složce namířené proti nádoru. Vazba složky, která se váže na nádor se složkou efektorovou, může být provedena různými metodami.

1) Fúzní proteiny protilátek

Byla popsána imunoterapeutická protinádorová činidla, která nasměrují cytokinovou funkci k buňce nebo tkáni, která nese nádorové antigeny, a tím pomocí cytokinů posilují imunitní

2o odpověď proti buňkám, které nesou nádorový antigen nebojsou s nádorovým antigenem jinak spojeny. Tato imunoterapeutická činidla jsou označována jako protinádorové fúzní proteiny antigen/cytokin, protože fúzní protein obsahuje fúzi cytokinů s rekombinantním polypeptidovým řetězcem imnoglobulinu (lg), který imunologicky reaguje s předem vybraným nádorovým antigenem.

.lak je zde používáno, fúzní protein imunoterapeutického proti nádorového činidla antigen/cytokin zahrnuje fúzní konstrukty mezi fragmenty proteinu protilátky, které obsahují alespoň jednu část, která váže antigen, a cytokiny, které obsahují alespoň efektorovou část cytokinů, postačující k tomu, aby si podržela biologickou signální funkci cytokinů. Fúzní proteiny, které jsou předmětem

3o tohoto vynálezu, mohou být fúzovány přímo nebo jejich části mohou být propojeny jedním nebo více peptidovými linkery.

Protinádorové fúzní proteiny antigen/cytokin jsou v oboru známé a zvláště jsou popsány například v patentu US 5 650 150 (Gillies), jehož popisy, týkající se přípravy a použití fúzních protei35 nů, jsou výslovně zahrnuty odkazem,

Fúzní proteiny mohou být zaměřeny proti jakémukoli z množství nádorových antigenů, které jsou povrchovými buněčnými antigeny, a tedy vynález nemá být chápán v tomto směru jako omezený. Například je známa příprava fúzního proteinu za použití cytokinů a těžkého řetězce imunoglobu40 linu, stejně jako příprava rekombinantního těžkého řetězce imunoglobulínu, odvozeného z monoklonální protilátky. Dále, příprava monoklonálních protilátek je v oboru zavedena, aje známo, jak připravit takové protilátky proti nádorovým antigenům. Postupy týkající se přípravy monoklonálních protilátek jsou popsány v práci „Monoklonální protilátky a léčba rakoviny“, Alan R. Liss, lne., vyd. Reisfeld a Seli, 1985.

V typickém případě je imunoglobulinovým polypeptidovým řetězcem polypeptid těžkého nebo lehkého imunoglobulinového řetězce, který obsahuje N-koncovou variabilní oblast specifickou pro buňky, které nesou povrchový buněčný nádorový antigen. Fúzní protein má v typickém případě polypeptid imunoglobulínu připojený na svém karboxylovém konci peptidickou vazbou so k aminokyselině cytokinů na jeho aminovém konci. Tam kde je polypeptidem imunoglobulínu těžký řetězec, imunoglobulinový těžký řetězec typicky obsahuje domény CHI a CH2 a může případně dále obsahovat doménu CH3. Avšak pokud je to žádoucí, mohou být takové konstantní domény odstraněny kvůli snížení imunogenity, velikosti nebo nespecifické vazby výsledného konstruktu fúzního proteinu. Aby bylo usnadněno spojení domén těžkého a lehkého řetězce, může být žádoucí zkonstruovat molekulu Fv, kde je těžký Fv řetězec připojen k lehkému Fv

- 12CZ 303155 B6 řetězci. Spojení je provedeno mezi karboxylovým koncem jednoho řetězce a aminovým koncem druhého, a je dostatečně dlouhé, aby po spojení domén a výsledném prostorovém uspořádání nebylo příliš drasticky změněno prostorové uspořádání kapsy, která se váže k antigenů.

Výhodný fúzní protein obsahuje cytokin IL 2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem GD₃. V jednom provedení výhodný fúzní protein obsahuje cytokin IL-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem Ep-CAM (také známý jako antigen KSA, KS 1/4). Příklady fúzních proteinů těchto provedení jsou popsány dále jako chl4.18-1L-2, respektive KSI/4-1L-2.

in

2) Konjugáty protilátek

V metodách a prostředcích, které jsou předmětem tohoto vynálezu, je možno použít alternativní imunoterapeutické konstrukty. Například s použitím systému biotin-avidin, který má vysokou i? afinitu, je možno za použití vhodné vazby konstruovat nezávislé biotinylované proteiny, obsahující řetězec protilátky specifické proti nádorovému antigenů, vázaný s biotinem (nebo aviďinem), a cytokin vázaný s v hodnému konjugátu (avidin nebo biotin). Při použití, biotinylovaný protein protilátky se může spojit s proteinem cytokinů in vitro nebo in vivo, buď před, nebo po podání, a vytvoří bifunkční imunoterapeutické činidlo, která má složku vázající nádorový antigen a efektorovou cytokinovou složku, vázanou pomocí komplexu avidin-biotin.

Biotinylované protilátky a proteiny jsou v oboru známé a mohou být připraveny pomocí komerčně dostupných reagencíí. Jedním z rysů použití biotinylované protilátky proti nádorovému antigenu je to, že molekula biotinu má mnoho míst, která vážou avidin, což umožňuje znásobení účinku efektorové složky, kterou je cytokin vázaný pomocí avidinu, na každé navázané protilátce nebo použití více než jedné efektorové složky. V oboru jsou známy také jiné přímé chemické konjugační metody a reagencie, a byly použity pro konjugováni protilátek s efektorovými molekulami buď přímo, nebo pomocí vloženého linkeru (viz například Haugland a You, v Metody v molekulární biologii, sv. 80: Imunochemické protokoly, 2. vyd. (Pound, J. D. vyd., Humana io Press, lne., Totowa, NJ, 1998), kapitola 17; a Hermanson, G. T. Techniky biokonjugátů (Academie Press, Ny NY, 1996). Imunoterapeutická činidla, která jsou předmětem tohoto vynálezu, tedy také zahrnují biotinylované konstrukty, jak bylo popsáno výše, mezi fragmenty proteinu protilátky, které obsahují alespoň tu část, která váže antigen, a cytokiny, které obsahují alespoň takovou efektorovou část cytokinů, postačující ktomu, aby si podržela biologickou signální funkci cytokinů.

e) Jiná imunoterapeutická činidla

Protinádorová imunoterapeutická činidla, vhodná pro použití v metodách, prostředcích a soupra40 vách, které jsou předmětem tohoto vynálezu, mohou obsahovat efektorovou část, která není cytokinem. Je předvídáno, že složkou působící na buňku může také být toxin nebo jiné cytotoxické činidlo, schopné poškodit nádor. Jiná vhodná protinádorová léčiva tak zahrnují konstrukty mezi fragmenty proteinu protilátky, které obsahují alespoň jednu část, která se váže k antigenů, a radioaktivními izotopy, imunotoxinem, cytotoxickým peptidem nebo cytotoxickým lékem.

1) Radioaktivně značené protilátky

Radioaktivně značené imunokonjugáty obsahující monoklonální protilátku, zaměřenou proti nádoru, a radioaktivní izotop, byly použity jako činidla proti rakovině. Specifita vazby k antigenů u monoklonální protilátky poskytuje schopnost lokalizovat nádorová místa, zatímco radioaktivní izotop poskytuje cytotoxické vlastnosti (viz Hermanson, G. T. Techniky biokonjugátů (Academie Press, Ny NY, 1996), kapitola 6). Tyto radioaktivně značené imunokonjugáty mohou být vhodné pro použití jako protinádorová léčiva v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

- 13 CZ 303155 B6

2) 1 ni unotoxi n-prot i látka

Konjugáty monoklonálních protilátek a proteinových toxinu, odvozených z řady zdrojů, jsou také testovány při proti nádorové léčbě (viz Hermanson, G. T, Techniky biokonjugátů (Academie Press, Ny NY, 1996), kapitola 8). Takové konjugáty mohou být vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

3) Cytotoxický lék-protilátka

Konjugáty monoklonálních protilátek a cytotoxických léků chemicky syntetizovaných a/nebo purifikovaných z řady zdrojů, mohou být také použity při protinádorové léčbě (viz Hermanson, G. T. Techniky biokonjugátů (Academie Press, Ny NY, 1996)). Takové konjugáty mohou být vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

4) Protilátka s mnohočetnou specifitou

Manipulace s fragmenty protilátek, které jsou vytvořeny enzymatickým štěpením, nebo manipulace s kódujícími sekvencemi DNA, umožňuje vytvoření b i spec ifických protilátek (BsABS), které jsou hybridními molekulami spojujícími dvě protilátky sráznými vazebnými specifitami. Tímto způsobem může být specifická vazba na cílový nádor spojena s vazbou k farmaceutickému činidlu, které je buněčným eťektorem (tj. cytokinů, léku nebo toxinu), a tím dosaženo nasměrování léčení na nádorové buňky (viz například French, R. R., v Metody v molekulární biologii, sv. 80: Imunochemické protokoly, 2. vydání, (Pound, J. D. vyd. Humana Press, Inc., Totowa, NJ, 1998), kapitola 12). Takové bifunkční nebo jiné vícefunkční protilátky mohou být vhodné pro použití v metodách, které jsou předmětem tohoto vynálezu.

2. Terapeutické metody

Terapeutické metody pro léčení nádorových buněk v nádorech a nádorových metastázích, které jsou předmětem tohoto vynálezu, jsou založeny na kombinovaném použití terapie potlačující angiogenezi (antiangiogeneze) a protinádorové imunoterapie. Je možno použít více než jeden typ činidla potlačujícího angiogenezi v kombinaci svíce než jedním typem protinádorového imunoterapeutického činidla. Kombinované použití se může uskutečnit současně, po sobě nebo se zahrnutím periody určitého časového období mezi léčeními. V průběhu léčení může být jakékoli specifické léčivo podáno více než jednou. Metoda, která je předmětem tohoto vynálezu, poskytuje kombinované použití činidla potlačujícího angiogenezi a protinádorového imunoterapeutického činidla, které může mít za následek zesílení inhibičního účinku každého jednotlivého léčiva na množení nádorových buněk, a výsledkem je účinnější léčba, než je možno dosáhnout podáváním jednotlivých složek samotných. V jednom provedení tedy metoda, která je předmětem tohoto vynálezu, spočívá v tom, že pacientovi je podávána kombinace činidla potlačujícího angiogenezi a protinádorového imunoterapeutického činidla v takových množstvích, která nemusejí mít za následek potlačení angiogeneze nebo aktivitu proti nádorovým buňkám, pokud jsou v těchto množstvích podávána jednotlivě.

Metoda, která je předmětem tohoto vynálezu, obsahuje množství variant postupů v jednotlivých krocích při praktickém uskutečňování vynálezu. Například antagonista a protinádorové imunoterapeutické činidlo (což je ve výhodném provedení fúzní protein nádorový antigen/cytokin) mohou být podávány po smíchání, tj. současně, nebo mohou být podávány po sobě, tj. odděleně. Dále antagonista a fúzní protein mohou být podávány odděleně s časovým intervalem až tří týdnů mezi jednotlivými dávkami, tj. od podání v podstatě bezprostředně po podání prvního aktivního činidla, až do podání asi po třech týdnech po podání prvního aktivního činidla. Dále se počítá s tím, že pořadí může být různé, tj. že antagonista α,νβ.ι může být podán před podáním fúzního proteinu, nebo že podání může být provedeno v obráceném pořadí.

-14CZ 303ί55 B6

V jednom provedení, metoda která je předmětem tohoto vynálezu, také spočívá v tom, že pacientovi, který vyžaduje léčení nádorů nebo metastáz, je podáno činidlo inhibující angiogenezi, jako je antagonista a_vPs, v takovém množství, které je schopno angiogenezi inhibovat, a takové množství prot i nádorové ho imunoterapeutického Činidla, které postačuje k vyvolání biologické odpovědi. Například v množství postačujícím vyvolat biologickou odpověď specifickou pro cytokin v případě, když takový bifunkční fúzní protein, který obsahuje cytokin a rekombinantní polypeptidový řetězec imunoglobulinu (Ig), kde imunoglobulin obsahuje variabilní oblast specifickou proti nádorové buňce, nesoucí nádorový buněčný povrchový antigen, a kde řetězec imunoglobulinu jc připojen peptidovou vazbou k cytokinů. A tam, kde imunoterapeutické činidlo obsahuje cytotoxické činidlo, množství může být takové, že je schopno v cílových nádorových buňkách vyvolat cytotoxickou biologickou odpověď.

V jiném provedení může být vynález prakticky prováděn ve spojení s chirurgickými postupy, kdy byla část nebo celá hmota nádoru odstraněna. V tomto ohledu může být metoda uplatněna po chirurgickém zásahu. Jinou možností je, že chirurgický zásah může být proveden v intervalu mezi podáváním prvního aktivního činidla a druhého aktivního činidla. Příkladem této metody je kombinace předložené metody s chirurgickým odstraněním nádoru, která je popsána dále.

Léčení podle metody, která je předmětem tohoto vynálezu, bude typicky spočívat v tom, že jsou léčebné prostředky podány v jednom nebo několika cyklech. Například tam, kde je používáno současné podávání, léčebný prostředek obsahující jak antagonistů α_νβ.3, tak protinádorové imunoterapeutické činidlo, je podáván v jednom cyklu v průběhu časového intervalu od asi dvou dní do asi tří týdnů. Potom může být léčebný cyklus opakován, pokud je to potřebné podle posouzení praktického lékaře. Podobně když se uvažuje postupné podávání, doba podání pro každé jednotlivé léčivo bude obyčejně upravena tak, aby pokrývala totéž časové období. Interval mezi cykly se může měnit od asi nuly do dvou měsíců.

Podávání může být uskutečněno periodicky podávanými dávkovými jednotkami, kontinuální infuzí, peristaltickým podáním, jednorázově podanou dávkou a podobně. Jako cesty podávání je možno používat intravenózní, podkožní, nitrosvalovou či ortotopickou injekci, ortotopickou infuzi, orální podání a podobně.

Léčebný prostředek používaný v metodě, která je předmětem tohoto vynálezu, obsahuje aktivní činidlo ve farmaceuticky přijatelném nosiči, jaký je dobře známý, a proto vynález nesmí být chápán jako omezený, pokud se týká prostředku, pokud je koncentrace aktivního činidla (činidel) v prostředku dostatečná pro dodání (podání) zmíněného aktivního činidla v množstvích, která jsou zde popsána.

Typické dávkování prot i nádorového imunoterapeutického činidla, jako je fúzní protein složky specifické pro antigen s cytokinem je od 0,01 do 10 mg, výhodně asi od 0,1 do 1 mg a ještě výhodněji asi 0,6 mg na kilogram tělesné hmotnosti za den.

Dávkování proti nádorového imunoterapeutického činidla, jako je cytotoxické činidlo zaměřené proti antigenů, může být typicky od 0,01 do 10 mg, výhodně asi od 0,1 do I mg a ještě výhodněji asi 0,6 mg na kilogram tělesné hmotnosti za den, kde dávkování radioaktivity může být vhodným způsobem upraveno v závislosti na požadované radioaktivní dávce. Izotopy o kterých bylo zjištěno, že jsou vhodné pro radioaktivní léčbu, zahrnují 57-kobalt; 67-měď; 99-technecium; 123-jód; 131-jód a 111-indium a podobně. Druhy radioaktivních farmaceutických činidel a jejich dávkování se bude měnit v závislosti na radioaktivním izotopu a cílové tkáni. Radioimunoterapie maligních novotvarů může využít vyšších dávek než tradiční radiační terapie, protože imunoterapeutické činidlo je směrování na místo nádoru a/nebo buňku. Například bylo zjištěno, že léčení B buněk lymfomu neHodgkinova typu pomocí radioimunoterapeutického činidla, které je namířeno proti B buňkám, má maximální tolerovanou dávku 0,4 mCui/kg tělesné hmotnosti (1 mCui = 37 MBg) (Witzig, T. E. a kol, (1999) „Phase I/ÍI trial of 1DEC-Y2B8 radioimmunotherapy for treatment of relapsed oř reefratory CD20 (+) B-cell non-Hodgkin'e lymphoma“ J.

- 15CA 303155 B6

Clin. Oncol. 17(12): 3793 až 803. Avšak radioimunoterapie cílená na specifické nádory nebo inelastáze nádoru umožňuje použít vyšší tolerované dávky než léčení lymfomů. U nahých myší bylo tolerováno podání dvou dávek 18,5 MBq protilátky značené I I 1—indiem (Saga, T„ a kol., „Radioimunoterapie xenoímplantátů lidského gliomu u nahých myší pomocí monoklonální protilátky značené indiem-l 11“ Eur. J. Cancer 35(8): 1281 až 5).

Typické dávkování antagonisty (Χνβ; jc od lé do 1000 mg, výhodně asi od 20 do 100 mg a výhodněji asi 50 mg na kilogram tělesné hmotnosti za den.

Předpokládá se, že rakovina se nalézá všude v živočišné říši, a že zde popsané principy jsou použitelné u všech živočichů, kde je možno potlačit angiogenezi pomocí antagonisty α_νβ.ι a těchto cytokinů v imunitním systému. Má se tedy za to, že vynález je možno uplatnit u všech savců a zvláště u lidí.

Dále je známo, že existuje velká rozmanitost nádorů, které vyžadují vznik nových cév, aby mohly růst, a jsou proto kandidáty na postupy kombinované terapie podle předložených metod. Nádory které při růstu indukují angiogenezi, zahrnují nádory pocházející z neuroektodermálních, výstelkových a podobných tkání. Příklady nádorů a metastází zahrnují adenom, angiosarkom, astrocytom, karcinom výstelky, germinom, glioblatom, gliom, hemartom, hemangioendoteliom, hemangiosarkom, hepatom, hepatoblastom, leukémii, lymfom, meduloblastom, melanom, neuroblastom, osteosarkom, retinoblastom, rabdomyosarkom, sarkom, teratom a podobné nádory.

3. Léčebné systémy

V jednom provedení vynálezu se uvažuje o systémech, obsahujících balení a/nebo soupravu, která poskytuje reagencie nezbytné pro praktické provádění metod, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Souprava pro léčení nádorových buněk v nádoru nebo v metastází nádoru obsahuje balení:

a) činidla inhibujícího angiogenezi, jako je antagonista α_νβ?, schopný inhibovat angiogenezi v nádoru nebo metastázích nádoru;

b) protinádorové imunoterapeutické činidlo, jako je bifunkční fúzní protein, který obsahuje cytokin a polypeptidový řetězec rekombínantního imunoglobulinu (Ig), kde imunoglobulinový řetězec obsahuje variabilní oblast, specifickou proti nádorovým buňkám nesoucím buněčný nádorový povrchový antigen, kde imunoglobulinový řetězec je spojen peptidovou vazbou scytokinem; a

e) návod pro použití reakčních činidel v metodách léčení nádoru a nádorových metastází.

Reakční činidlo v soupravě, která je předmětem tohoto vynálezu, je v typickém případě připraveno jako léčebný prostředek, jak zde bylo popsáno, a proto může být v jakékoli z rozličných forem, vhodných pro jeho distribuci v soupravě. Mezi tyto formy patří roztok, prášek, tableta, suspenze a podobné přípravky pro podání antagonisty a/nebo fúzního proteinu, které jsou předmětem tohoto vynálezu. Reagencie mohou být dodávány v oddělených nádobkách, vhodných pro oddělené podávání podle předložených metod, nebo popřípadě mohou být dodávány smíchány v prostředku v jedné nádobce balení.

V podobném případě, takové balení může obsahovat namísto nebo spolu s výše popsanými složkami jakákoli jiná protinádorová ímunoterapeutická činidla, jaká jsou popsána výše.

Balení může obsahovat takové množství, které je postačující pro jednu nebo více dávek reagencií, podle zde popsaných léčebných metod. V typickém případě bude balení obsahovat množství, které je postačující projeden cyklus léčení, jak zde bylo popsáno. Popis na balení bude popisovat, zda se jedná o kombinované nebo postupné použití obsažených reagencií pro léčení nádoru

- 16CZ 303155 B6 a/nebo metastází metodami, kteréjsou předmětem tohoto vynálezu. Takový popis na balení může být upevněn na každé lahvičce s reagenciemi, a/nebo na kompletním balíčku se všemi materiály.

Souprava, která je předmětem tohoto vynálezu, také obsahuje „návod k použití“ pro materiály v balení obsažené. Návod se týká metod kombinovaného použití antagonisty a fúzního proteinu pro léčení nádoru nebo nádorových metastází metodami, kteréjsou předmětem tohoto vynálezu. Protože metody mohou široce varírovat v závislosti na nádoru, pacientovi a stavu nemoci, návod může tedy varírovat stejně, aby specifikoval aplikační postupy. Vynález nemůže být považován za omezený na obsah návodu, který se týká zvláštního kombinovaného použití antagonisty a fúzního proteinu podle metod předloženého vynálezu.

Podobně mohou reagencie zahrnovat protinádorové imunoterapeutická cytotoxické činidla, jako je protilátka s připojeným radioaktivním izotopem, která se váže k nádorovému antigenů, nebo cytotoxické činidlo, jako je cytotoxický peptid nebo cytotoxický lék a podobně.

Přehled obrázků na výkresech

Výhodná provedení vynálezu jsou popsána dále s odkazem na následující doprovázející obrázky, kde:

Obrázek 1 graficky znázorňuje účinek kombinovaného léčení pomocí antiangiogenního antagonisty ct_v integrinu a imunoterapie specifické proti složce nádoru pomocí fúzních proteinů protilátka-! L-2, na primární nádory.

Obrázek 1A znázorňuje výsledky získané na primárních nádorech, indukovaných podkožní injekcí (2x10⁶) buněk neuroblastomu NXS2. Obrázek 1B znázorňuje výsledky získané na primárních nádorech, indukovaných podkožní injekcí (2x10⁶) buněk CT26-KSA rakoviny tlustého střeva. Obrázek IC znázorňuje výsledky získané na primárních nádorech, indukovaných podkožní injekcí (2x10⁶) buněk B78-D 14 melanomu.

Obrázek 2 graficky znázorňuje účinek kombinování terapie proti vzniku krevních cév a protinádorové terapie na vznik krevních cév a prot i nádorovou imunitní odpověď. Obrázek 2 A znázorňuje výsledky zjišťování hustoty krevních cév primárních nádorů po působení na cévní a nádorovou složku, buď pomocí antagonistů integrinu a_v, fúzního proteinu ch 14.18—IL—2 a jejich kombinace (*P>0,001, Studentův T-test). Obrázek 2B znázorňuje výsledky infiltrace leukocytů do primárních nádorů po působení na cévní, respektive nádorovou složku (*P>0,00I, Studentův Ttest).

Obrázek 3 graficky znázorňuje účinek postupného kombinování terapie proti vzniku krevních cév pomocí antiangiogenního antagonisty integrinu a_v a specifické protinádorové imunoterapie pomocí fúzního proteinu proti látka-IL-2 na vznik spontánních metastází neuroblastomu v játrech. Počet spontánních jatérních metastází byl určován makroskopickým počítáním ložisek v játrech (n=8) (**P<0,01, Wilcoxonův klasifikační test).

Obrázek 4 graficky znázorňuje účinek v podstatě současného podání kombinace terapie proti vzniku krevních cév pomocí antiangiogenního antagonisty integrinu ct_v a specifické protinádorové imunoterapie pomocí fúzního proteinu prot i látka-IL-2 na vznik spontánních metastází neuroblastomu v játrech. Jsou zde uvedeny výsledky léčení integrinem nebo antagonistů (17,5 pg/h) a nádorově specifickým fúzním proteinem (5 pgx5), započatým před (obrázek 4A) nebo po (obrázek 4B) odstranění primárního nádoru. Spontánní jatémí metastáze byly určovány makroskopickým počítáním ložisek v játrech (n=8) (**P<0,001, Wilcoxonův klasifikační test).

- 17CZ 303155 B6

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Příprava syntetických peptidů

Lineární a cyklické polypeptidy, uvedené dále v tabulce I, byly syntetizovány pomocí standardních syntetických technik na pevné fázi, které sou například popsány v Merrifield, R. B. (1969) „Syntéza peptidů na pevné fázi“, Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol., 32: 221 až 96; Merrifield, R. B. (1969) „Syntéza biologicky aktivních peptidů a proteinů“, JAMA 210(7): 1247 io až 54; a Fields, G. B. a Noble, R. L„ (1990) „Syntéza peptidů na pevné fázi za pomoci

9-ťluorenylmethoxykarbonylových derivátů aminokyselin“, Int. J. Peptide Protein Res., 35(3):

161 až 214.

Dva gramy (g) BOC- Gly-DArg-Gly-Asp-Phc Val-OMe (SEQ ID NO: l) byly napřed rozpuš15 těny v 60 mililitrech (ml) methanolu, k tomu bylo přidáno 1,5 ml 2N roztoku hydroxidu sodného, aby byla vytvořena směs. Směs byla potom míchána po dobu 3 hodin při 20 °C. Po odpaření byl zbytek doplněn vodou, okyselen na pH 3 pomocí zředěné HCI a extrahován ethylacetátem.

Extrakt byl sušen nad Na₂SO₄, znovu odpařen a výsledný BOC-Gly-DArg-GIy-Asp-Phe-ValOH (SEQ ID NO: 2) byl míchán při 20 °C po dobu 2 hodin s 20 ml 2N HCI v dioxanu. Výsledná 20 příměs byla odpařena a byl získán H-Gly-DArg-Ajily-Asp-Phe-Val-OH (SEQ ID NO: 3), který byl následně rozpuštěn ve směsi 1800 ml dichlormethanu a 200 ml dimethylformamidu (DMF) a následovalo ochlazení na teplotu 0°C. Potom bylo postupně za míchání přidáno 0,5 g dicyklohexylkarbodiimidu (DCCI), 0,3 g 1-hydroxy benztriazolu (HOBt) a 0,23 ml /V-methylmorfolinu.

Výsledná směs byla míchána po dobu dalších 24 hodin při 0°C a potom při 20 °C po dobu dalších 48 hodin. Roztok byl koncentrován a zpracován na směsném iontoměniči, aby byl zbaven solí. Poté co byl iontoměnič odstraněn filtrací, vyčištěný roztok byl odpařen a výtěžek byl purifikován pomocí chromatografie, výsledkem bylo získáno cyklo(Gly-DArg-Gly-Asp-Phe—Val) (SEQ ID NO: 4).

Analogicky byly získány následující peptidy, uvedené v tabulce 1 pomocí jednopí směnkového kódu pro aminokyselinové zbytky a označené číslem peptídu: cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-Val) (SEQ ID NO: 5); cyklo(Arg-Ala-Asp-DPhe-Val) (SEQ ID NO: 6); cyklo(Arg-DAla-Asp-PheVal) (SEQ ID NO: 8); cyklo(Arg-Gly-Asp-Phe-DVal) (SEQ ID NO: 7); a cyklo(Arg-G1y-Asp35 DPhe-NMeVal) (kde je methy lován α-atom dusíku v amidické vazbě zbytku val inu (SEQ ID NO: ll).

Peptid označený jako 66 203, který má sekvenci shodnou s peptidem 62 184, pouze se od něho liší tím, že je ve formě soli HCI na rozdíl od soli TFA, přítomné v 62 184 (SEQ ID NO: 5). Totéž platí pro peptidy 69 601 a 62 185 (SEQ ID NO: 6) a pro 85 189 a 121 974 (SEQ ID NO: 11).

Příklad 2: Syntéza cyklo(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO: 11), sůl TFA

Fmoc -Arg(Mtr> Gly-Asp(OBut)-DPhe-NMeVal ONa (SEQ ID NO: 14) je připraven pomocí syntézy Merrifíeldova typu na pevné fázi, s postupným přidáváním NMeVal, DPhe, Asp(OBut), Gíy a Fmoc-Arg(Mtr) v jednotlivých krocích k 4-hydroxymethyl-fenoxymethyl-poIystyrenové pryskyřici (pryskyřice Wangova typu) (obvykle jsou používány metody syntézy peptidů Merrifíeldova typu). Polystyrénová pryskyřice a prekurzory zbytků aminokyselin jsou komerčně dostupné od chemických společností Aldrich, Sigma nebo Fluka. Po ukončení postupného přidávání aminokyselinových zbytků je pryskyřice odstraněna z peptidového řetězce pomocí 1:1 směsi TFA/dichlormethan, která poskytne produkt Fmoc-Arg(MTr)-G]y-Asp(OBut)-DPhe-NMeValO (SEQ ID NO: 15). Skupina FMoc je potom odstraněna 1:1 směsí piperidin/DMF, která poskytne hrubý produkt Arg(Mtr)-Gly-Asp(OBut)-DPheNMeVal~OH (SEQ ID NO: 16), který je potom purifikován pomocí HPLC obvyklým způsobem.

- 18CZ 303155 B6

Pro cyklizaci je roztok 0,6 g Arg(Mfr)Cjly-Asp(OBut)-L)Phe-NMeVal-OH (syntetizovaný výše) (SEQ ID NO: 16) v 15 ml DMF (d i methyl formám id; Aldrich) rozpuštěn s 85 ml dichlormethanu (Aldrich) aje přidáno 50 mg NaHCO^. Po ochlazení ve směsi suchý led/aceton je přidá5 no 40 μΙ diíenylfosforylazidu (Aldrich). Po stání při teplotě místnosti po dobu 16 hodin je roztok koncentrován. Koncentrát je filtrován přes gel (sloupec SephadexGlO ve směsi isopropanol/voda 8:2) a potom purifikován pomocí HPLC obvyklým způsobem. Působením směsi TFA (kyselina trifluoroctováj/HiO (98:2) vznikne cyklo-(Arg-Gly-Asp~DPhe-NMeVal) (zde je také označován jako „eyklo(RFGDfN-MeV)“; (SEQ ID NO: 1 1) x TFA, který je potom purifikován pomocí io HPLC obvyklým způsobem; RT = 19,5; FAB-MS (M+H): 589.

Příklad 3: Syntéza „vnitřní solí“

Sůl TFA je odstraněna z produktu, připraveného výše popsaným způsobem tím, že byl cyklo(Arg-Oly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO: 11) x TFA resuspendován ve vodě a poté odpařen ve vakuu, aby byla TFA odstraněna. Takto vytvořený cyklický peptid je popisován jako „vnitřní sůl·⁴ aje označen cyklo-(Arg-Gly-Asp~DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO: 11). Termín „vnitřní sůl“ je použit proto, protože cyklický peptid obsahuje dva opačně nabité zbytky, které v důsledku vzá2o jemně elektrické rovnováhy vytvářejí navenek neutrální molekulu. Jeden z nabitých zbytků obsahuje kyselou složku a druhý nabitý zbytek obsahuje aminovou složku. Když jsou kyselá složka a aminová složka ve vzájemné těsné blízkosti, kyselá složka může ztratit proton vlivem aminové složky, a ta pak vytvoří soli karboxylová skupí na/amin, které mají celkově neutrální náboj.

Příklad 4: Působení HCI pro získání cyklo_(Arg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO:

ll)xHCI

Osmdesát miligramů cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe—NMeVal) (SEQ ID NO: 11) je rozpuštěno v

3o 0,001M HCI 5 až 6krát a po každém rozpuštění za mrazu vysušena. Následující purifikaci pomocí HPLC byl získán cyklo-fArg-Gly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO: 11) x HCI; FABMS (M+H): 589.

Příklad 5: Působení kyseliny methan sulfonové pro získání cyklo-(Arg-Gly-Asp-DPhe“

NMeVal) (SEQ ID NO: 11) x MeSO-,Η

Osmdesát miligramů cyklo-(Arg-Tjly-Asp-DPhe-NMeVal) (SEQ ID NO: 11) je rozpuštěno v0,01M MeSCfH (methansulfonová kyselina) 5 až 6krát a po každém rozpuštění za mrazu vysušena. Následující purifikaci pomocí HPLC byl získán cyklo-{Arg-Gly-Asp-DPheNMeVal) (SEQ ID NO: 11) x MeSO₃H; RT = 17,8; FAB-MS (M+H): 589.

Alternativní metody cyklizace zahrnují modifikaci skupin postranních řetězců necyklického peptidového prekurzoru sulfidovými skupinami, které po vystavení pH slabě vyššímu, než jsou nor45 mální fyziologické podmínky pH (pH 7,5), vytvářejí intramolekulární disulfidické vazby s jinými sulfidovými skupinami, přítomnými v molekule a vytvoří tak cyklický peptid. Dále C-konec karboxylové složky necyklického peptidového prekurzoru může reagovat s volnou sulfidovou složkou přítomnou v molekule, a vytvořit tak peptidy cyklizované pomocí thioesteru.

- 19CZ 303155 B6

Tabulka 1

Označení peptidu	Aminokyselinová sekvence	SEQ ID NO:
62 181	cyklo(GrGDFV)	4
62 184(66 203*)	cyklo(RADfV)	5
62 185 (69 601*)	cyklo(RADfV)	6
62 187	cyklo(RGDFv)	7
62 186	cyklo(RaDFV)	8
62 175	cyklo(ARGDfL)	9
62 179	cyklo(GRGDfL)	10
121 974 (85 189*)	cyklo(RGDfN-MeV}	11
112 784	cyklo(RGEfN-MeV)	12
135 981	cyklo(RADfN-MeV)	13

* Peptidy označené hvězdičkou jsou připraveny v HCI ajejich sekvence je shodná s peptidy uvedenými na stejné řádce; peptidy bez hvězdičky jsou připraveny v TFA. Malá písmena označu5 jí D-aminokyseliny; velká písmena označují L-aminokyseliny.

Příklad 6: Příprava a charakterizace fúzních proteinů protilátka specifická proti nádoru-cytokin io

Konstrukce a charakterizace fúzních proteinů chl4.18-IL-2 a huKSl/4-lL-2 protilátka-cytokin byly dříve popsány (Xiang, R., a kol., (1997); Gillies, S., a kol., (1992) viz výše). Charakteristiky vazby antigenu byly u obou konstruktů totožné s charakteristikami jejich výchozích protilátek a specifická EL-2 aktivita odpovídala komerčně dostupné rhIL-2. Byly syntetizovány is a charakterizovány antagonistický cyklický peptid 121 974 (cyklo(RGDfN-MeV)) (SEQ ID

NO: 11) integrinu a_vp3 a kontrolní peptid 135 981 (cyklo(RADfN-MeV)) (SEQ ID NO: 13).

Příklad 7: Buněčné linie a živočišné modely

Všechny buněčné linie a odpovídající živočišné modely byly zavedeny v podstatě tak, jak byly dříve popsány (Becker, J. C., a kol., (1996) viz výše; Xiang, R., a kol., (1996) viz výše; Lodě, H.N., a kol., (1998) „Vymýcení metastází neuroblastomu do kostního morku, zprostředkované přirozenými zabíječi při cílené terapii interleukinem-2“, Blood 91, 1706 až 1715). Nepřítomnost integrinu α_νβί v buňkách NXS2 a CT26-KSA byla ukázána za pomoci protilátky proti myšímu

CD61 (řetězec integrinu β₃) (Pharmingen, La Jolla, CA). Obě buněčné linie se neprojevovaly ve

FACS analýze žádným signálem (1 pg monoklonální protilátky proti myšímu CD61/10⁶ buněk), na rozdíl od buněk myších melanomů B16FG3 a B78-D14 pozitivních na integrin α_νβ.₃, které byly použity jako pozitivní kontrola. Dále buňky NXS2 nebyly schopny přilnout k plastické hmo30 tě potažené monoklonální protilátkou proti myšímu CD61 (10 pg/ml, 4 °C, 24 hodin), na rozdíl od protilátky chl4.18 proti GD₂ (10 pg/ml, 4 °C, 24 hodin), která byla použita jako pozitivní kontrola. Avšak všechny nádorové buňky exprimují podle výsledků FACS analýzy integrin αν a přilnou na vitronectin, což ukazuje na přítomnost integrinu α_νβ5·

Při všech chirurgických postupech byla myším provedena anestézie pomocí injekce ketaminu (100 mg/kg tělesné hmotnosti, íntraperitoneálně) a současného vdechování Metofanu (Pitman-20CZ 303155 B6

Moore, Mundelein, IL). Pro podávání antagonisty integrinu αν a kontrolního peptidu byly použity osmotieké pumpy (Alzeť“, model 2001, Palo Alto, CA), byla používána rychlost podávání

17,5 pg/hodinu. S těmito pumpami bylo zacházeno podle návodu výrobce a byly implantovány za sterilních podmínek do hřbetní podkožní tkáně. Všechny pumpy byly vyměněny 7. den po implantaci a odstraněny po 10 dnech léčení, jehož cílem bylo potlačení vzniku nových cév. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny podle MIH návodu o péči a použití laboratorních zvířat.

ío Příklad 8: Histologie a imunohistochemie

Zmražené řezy primárních nádorů, fixované v acetonu, byly inkubovány s 4% kozím sérem, aby byly blokovány nespecifické vazby. Poté byly provedeny inkubace s monoklonálními protilátkami proti myšímu CD31 a proti myšímu CD45 (Pharmingen, La Jolla, CA) (1:100) a následo15 válo barvení kozí protimyší protilátkou značenou rhodaminem (1:300), ve vlhké komoře při teplotě místnosti. Po každé inkubaci následovalo 5x promytí s PBS (x3). Počty krevních cév a bílých krvinek byly stanoveny pod mikroskopem při 200x zvětšení (Brooks, P. C., a kol., (1995) (Anti-integrin alfa v beta 3 blokuje růst lidské rakoviny prsu a angiogenezi v lidské kůži“, J. Clin. Inves. 815 až 1822). Reprezentativní oblasti byly fotografovány při 200x zvětšení (cévy), respektive pří 800x zvětšení (bílé krvinky).

Příklad 9: Primární nádory ustupují pouze u myší léčených antagonistou integrinu a_v, kombinovaným s fúzním i proteiny protilátek s IL-2.

Synergický účinek terapie potlačující angiogenezi (antagonista integrinu a_v) a imunoterapie (fúzní proteiny protilátky s IL-2) byl zjišťován u myší s vyvolanými podkožními nádory (110 až 130 μΐ) u všech tří syngenních modelů.

Obrázek 1 znázorňuje graficky účinek kombinované terapie antiangiogenním antagonistou integrinu a v a protinádorové imunoterapie, specifické k určitým složkám, pomoct fúzních proteinů protilátka-IL-2, na primární nádory. Obrázek IA znázorňuje výsledky získané u primárních nádorů indukovaných pomocí podkožní injekce (2x10⁶) buněk neuroblastomu NX2. Obrázek 1B znázorňuje výsledky získané u primárních nádorů indukovaných pomocí podkožní injekce (2x10⁶) buněk CT26-KSA z rakoviny tlustého střeva. Obrázek IC znázorňuje výsledky získané u primárních nádorů indukovaných pomocí podkožní injekce (2x10⁶) melanomových buněk B78-D

14. Léčení nádorů vyvinutých do velikosti asi (110 až 130 mm³) bylo započato denním podáváním intravenózních injekcí fúzních proteinů proti nádoru specifické protilátky-lL-2 huKSl/4— IL-2 (10 μg, rakovina tlustého střeva) a chl4.18-IL-2 (5 μg, neuroblastom, 10μg, melanom) (x5) a kontinuální podkožní infúzi antagonisty integrinu a_v, specifického pro tvorbu cév, nebo kontrolního peptidu, pomocí osmotieké pumpy po dobu 7 dní pri 17,5 pg/hodinu (schéma nahoře). Časový počátek léčby je znázorněn černou šipkou. Velikost primárních nádorů u myší v každé pokusné skupině (n=6) byla určována měřením pomocí mikrokaliperu (šířka x délka x šírka/2) (průměr ± standardní chyba). Zmenšení velikosti primárního nádoru u myši, která dostávala kombinovanou léčbu, ve srovnání s velikostí nádorů v době počátku léčby, bylo statisticky významné u třech různých modelů syngenních nádorů (P<0,001, Wilcoxonův klasifikační test), na rozdíl od všech kontrol (P>0,05).

Zaprvé bylo stanoveno suboptimální množství pro každý léčebný prostředek a následně započato jejich testování v kombinaci. Pouze myši léčené antagonistou integrinu a_v a fúzním i proteiny IL-2 vykázaly zmenšení velikosti nádoru ve všech třech modelech s frekvencí 50 až 90% (P<0,001). Ve skutečnosti polovina zvířat, která dostala injekci buněk neuroblastomu a rakoviny tlustého střeva, úplně své primární nádory odvrhla (údaje nejsou uvedeny). Toto je v protikladu k tomu, když jsou obě strategie použity jako monoterapie, která v nejlepším případě ve srovnání

-21 CZ. 303155 B6 s kontrolní skupinou rusí nádoru potlačily. Účinek každého způsobů léčby ajejich kombinace na cévní a nádorové složky byl posléze analyzován.

Byla provedena histologie primárních neuroblaslomových nádoru po kombinované antiangio5 genu i a nádorové specifické imunoterapii, které byly chirurgicky odebrány 20 dní po injekčním podání nádorových buněk. Krátce řečeno, primární nádory byly fixovány ve formalínu, obaleny parafinem a poté barveny hematoxylinem/eosinem. Byly určeny nek rot ické oblasti a i n filtráty leukocytů.

io Obrázek 2 znázorňuje graficky účinek kombinování terapie potlačující tvorbu cév a protinádorové imunoterapie, na vznik nových cév a na imunitní odpověď proti nádoru. Myši (n-6) s vyvinutými primárními neuroblastomovými nádory dostávaly kombinaci léčby s antagonistou integrinu cc, specifickým pro cévní složku, nespecifický peptid jako kontrolu a proti nádoru specifický fúzní protein ch 14.18-IL-2, jak je popsáno u obrázku 1, včetně kontrol, které dostaly každou léčbu jednotlivě. Na konci léčení byly podkožní nádory chirurgicky odebrány. Zmražené řezy z každého nádoru byly imunohistochemicky analyzovány pomocí protilátek specifických proti buňkám cévní výstelky (CD-31) respektive proti infiltrujícím leukocytům (CD45). CD45 je zavedený markér pro imunitní odpověď, specifickou proti složce nádoru, indukovanou fúzním proteinem ch!4.18-IL-2 (Becker, J. C., a kok, (1996) viz výše; Xiang, R., a kol., (1996)

2o viz výše; Lodě, H. N„ a kol., (1998) „Vymýcení metastází neuroblastomu do kostního morku, zprostředkované přirozenými zabíječi při cílené terapii interleukinem-2“, Blood 91, 1706 až 1715).

Obrázek 2A ukazuje výsledky zjišťování hustoty krevních cév u primárních nádorů pro léčbě cévní a nádorové složky buď pomocí antagonisty integrinu a, fúzního proteinu chI4.18-IL-2, nebo jejich kombinace (*P<0,001, Studentův T-test). Obrázek 2B ukazuje výsledky zjišťování infiltrace leukocytů u primárních nádorů po léčbě cévní, respektive nádorové složky (*P<0,001, Studentův T-test).

Myši, které dostaly antagonistou integrinu a v, vykazovaly 50% snížení vzniku nových cév (obrázek 2), v souhlase s opožděným růstem primárních nádorů, což ukazuje na účinné zasažení cévní složky. V tomto případě nebyla nádorová složka přímo ovlivněna (obrázek 1). Na rozdíl od toho myši léčené pouze pomocí fúzního proteinu anti-GD-IL-2 vykazovaly odlišný infiltrat leukocytů, což je zřetelná charakteristika pro tuto léčbu zaměřenou proti nádorové složce (Becker, J. C„ a kol., (1996) viz výše; Xiang, R., a kol., (1996) viz výše; Lodě, H. N„ a kol., (1998) „Vymýcení metastází neuroblastomu do kostního morku, zprostředkované přirozenými zabíječi při cílené terapii interleukinem-2“, Blood 91, 1706 až 1715), který vede k podstatnému snížení růstu podkožních nádorů (obrázek 1).

Avšak pouze myši léčené pomocí kombinace antagonisty integrinu ct_v a fúzního proteinu anti-GD-2-lL-2 vykázaly ve srovnání s myšmi, léčenými pouze pomocí fúzního proteinu anti-GD2-IL-2 samotného, pětinásobné zvýšení infiltrace bílých krvinek do nádoru a podobné snížení vzniku nových krevních cév. Zvýšení počtu zánětlivých buněk bylo prokázáno histologicky a imunohistochemicky, a bylo připsáno přílivu makrofágů, což je situace často se vyskytu45 jící v nekrotických tkáních v průběhu odstraňování buněčných zbytků. Ve skutečnosti byla taková nekrotická tkáň přítomna pouze v nádorech po kombinované léčbě, na rozdíl od kontrol, u kterých byla léčena každá složka odděleně.

Příklad 10: Postupné a současné zasažení cév a nádoru indukuje vymýcení spontánních metastází v játrech

Vedle úspěšného léčení primárních nádorů je závažnější otázkou, zda jsou takovouto kombinovanou léčebnou strategií proti cévní a nádorové složce ovlivněny vzdálené metastáze. To bylo zjišťováno na modelu neuroblastomu, pro který jsou charakteristické spontánní metastáze vját-22CZ 303155 B6 rech. Pro tento účel byla léčba primárního nádoru pomocí antiangiogenního antagonisty integrinu ct_v kombinována s následnou protinádorovou imunoterapií pomocí fúzního proteinu protilátka— IL-2.

Obrázek 3 znázorňuje graficky účinek postupného kombinování léčby pomocí antiangiogenního antagonisty integrinu a_v a specifické terapie proti nádorové složce pomocí fúzního proteinu protilátka-IL—2 na spontánní metastáze neuroblastomu v játrech. Léčba zaměřená proti vzniku nových krevních cév byla započata u myši s vyvinutými primárními nádory, jak je popsáno u obrázku 1, a trvala celkem 10 dní. Po chirurgickém odstranění primárních nádorů byla u myší io provedena imunoterapie specifická proti nádorové složce tak, že dostávaly denně nitrožilní injekce 5 pg fúzního proteinu chI4.l8-ÍL-2 (x5). Počet spontánních metastází v játrech byl určován makroskopickým spočítáním jaterních ložisek (n=8) (**P<0,01, Wilcoxonův klasifikační test).

t5 Pouze myši léčené postupně oběma činidly vykazovaly snížení počtu metastází v játrech o 1,5 až 2 logaritmy, na rozdíl od všech kontrol, kde léčení s každým činidlem formou monoterapie nebylo účinné (P<0,01) (obrázek 3). Ve skutečností čtyři z osmí myší, podrobených kombinované terapii vykazovaly naprostou nepřítomnost metastází v játrech, zatímco zbývající zvířata vykazovala pouze 1 až 5 malých metastatických poranění. V podstatě podobné výsledky byly získány pomocí souběžného kombinování antagonisty integrinu a_v s fúzním proteinem ch 14.18IL-2 (obrázek 4 nahoře).

Obrázek 4 znázorňuje graficky účinek současného kombinování léčby pomocí antiangiogenního antagonisty integrinu ct_v a specifické terapie proti nádorové složce pomocí fúzního proteinu proti látka-IL-2 na spontánní metastáze neuroblastomu v játrech. Spontánní metastáze byly indukovány po indukci primárních nádorů pomocí podkožní aplikace 2x10⁶ buněk NXS2 z neuroblastomu. Léčba integrinem nebo antagonistou (17,5 pg/hodinu) a nádorově specifickým fúzním proteinem chl4.18-lL-2 (5 pgx5) byla započata před (obrázek 4A) nebo po (obrázek 4B) odstranění primárního nádoru. Spontánní metastáze v játrech byly určovány makroskopickým spočítáním jatemích ložisek (n=8) (**P<0,01, Wilcoxonův klasifikační test).

Pouze myši léčené postupně oběma činidly vykazovaly buď naprostou nepřítomnost (obrázek 4A), nebo snížení počtu metastází v játrech o >1,5 logaritmu (obrázek 5B) (P<0,01), v závislosti na jejich podávání před nebo po odstranění primárního nádoru. To bylo ve výrazném protikladu oproti všem kontrolám, kde léčení bylo neúčinné, když bylo každé činidlo použito ve formě monoterapie.

Příklad 11: Synergická kombinace a účinná léčba

Rozrušení krevních cév v cévní složce maligních nádorů je účinná strategie v boji s rakovino. Nádor může být úspěšně léčen cíleným působením na výstelkové buňky cévního systému nádoru. Peptid antagonista, který cíleně působí na cévní systém tím, že reaguje s integriny a_v exprimovanými na angiogenních krevních cévách (Brooks, P. C. a kol., (1994) „Požadavek angiogenese na cévní integrin alfa v beta 3“, Science 264, 569 až 571; Friedlander, M., a kol., (1995) „Definice dvou angiogenních drah pomocí odlišných alfa v integrinů“, Science 270, 1500 až 1502), potlačoval vytváření krevních cév a výrazně potlačil následný růst nádoru. To bylo demonstrováno léčením tří agresivně rostoucích primárních nádorů a jednoho nádoru, který spontánně vytváří metastáze. Zatímco použitý antagonista integrinu αν byl primárně namířen proti α_νβ₃, také se váže na blízce příbuzný integrin α_νβ₃. Zkoumané nádory rakoviny tlustého střeva a neuroblastomu zřetelně postrádají avPs, ale pravděpodobně exprimují nějaký α_νβ₅. Melanomový model také exprimuje a_vp3. Avšak účinek tohoto antagonisty integrinu byl ve všech zvířecích modelech zřetelně omezen na cévní systém nádoru, jak bylo ukázáno u modelu neuroblastomu (obrázek 2). Je důležité, že protinádorový účinek zásahu do cévního systému nádoru je zesílen

-23 CZ 303155 B6 současným napadením nádorové složky, které je účinné jak proti primárním nádorům, tak proti spontánním metastázím. Toto je zvláště závažné, protože odstranění primárního nádoru před léčbou zvyšovalo růst a rozsévání metastází neuroblastomu, což je skutečnost dobře dokumentovaná u jiných modelů nádorů, způsobená tím, že jsou v důsledku vyříznutí primárního nádoru v oběhu sníženy hladiny inhibitorů angiogeneze (Holmgren, L. a kok, (1995) „Latentní stav mikrometastáz: rovnovážné množení a apoptóza v přítomnosti suprese angiogeneze“, Nátuře Medicine I, 149 až 153; Folkman, J. (1995) „Angiogeneze u rakoviny, cévních, revmatických a jiných chorob“. Nátuře Medicine I, 27 až 31). Současný zásah cévní a nádorové složky se ukázal velmi účinný, protože v sobě spojuje omezení vyživování nádorových buněk s aktivní destrukcí nádorových buněk, což vede k ústupu primárních nádorů a k vymýcení vzdálených metastáz. Toto je v protikladu k výsledkům jednostrannému postupu zaměřeného proti cévní složce, při kterém jsou využívány dvě různé strategie antiangiogenní léčby, kdy výsledkem u syngenního modelu bylo pouze potlačení růstu podkožních nádorů (Mauceri, H. J„ a kol., (1998) „Kombinovaný účinek angiostatinu a ionizujícího záření v léčbě nádorů“, Nátuře 394, 287 až 291).

V nyní předložené strategii je specifická odpověď, zaměřená proti nádorové složce, zprostředkována zánětlivými buňkami, které jsou aktivovány a zaměřeny proti nejbližšímu okolí nádoru působením fúzních proteinů protinádorová proti látka—IL—2. Důležité je, že strategie zaměřená proti angiogenezi, třebaže je velmi účinná pri potlačování růstu primárních nádorů sjiž vybudovaným cévním zásobením, postrádá tuto účinnost proti vzdáleným mikrometastázím, pokud je použita jako monoterapie (obrázky 3 a 4). Avšak za takové situace zbytkového stavu nemoci s malým nádorovým zatížením, kdy je pro nádory charakteristické nedostatečné prokrvení, je léčba zaměřená proti nádorové složce, používaná v kombinační terapii, dostatečně účinná, i pokud je použita jako monoterapie (Xiang, R„ a kol., (1997) „Eliminace metastází rakoviny tlustého střeva u myší pomocí léčby fúzním proteinem protilátka-interleukin-2“, Cancer Res. 57, 4948 až 4955; Lodě, Η. N., a kol., (1998) „Vymýcení metastází neuroblastomu do kostního morku, zprostředkované přirozenými zabiječi při cílené terapií interleukinem-2“, Blood 91, 1706 až 1715). Za této situace je jednou rolí léčby zaměřené proti angiogenezi potlačit mikrometastázami indukovanou tvorbu nových cév, a následující zvětšování ložisek metastází (Volpert., O. V., a kok, (1998) „Lidský fibrosarkom inhibuje systémovou angiogenezi a růst pokusných metastází pomocí trombospondinu-1“, Proč. Nati. Acad. Sci (USA) 95, 6343 až 6348). To ovšem usnadňuje vymýcení takových mikrometastází pomocí terapií zaměřených proti nádorové složce, které jsou optimálně účinné za situace zbytkového stavu nemoci s malým nádorovým zatížením (Becker, J. C„ a kok, (1996) „Vymýcení metastází myšího melanomu zprostředkované T buňkami pomocí cílené terapie interleukinem 2“, J. Exp. Med. 183, 2361 až 2366).

Účinná léčení primárních nádorů a roztroušených metastází zůstává hlavní výzvou klinické onkologie. Výsledky této zprávy ukazují, že při kombinování specifické antiangiogenní terapie s imunoterapií dochází k vzájemnému zesilování účinku, pokud se týká potlačování primárních nádorů a vymýcení metastází. Protože u obou léčebných přístupů, tj. používání antagonistů integrinu a_v a fúzních proteinů protilátka-interleukin-2, probíhá nyní klinické hodnocení jejich používání formou monoterapie, vzájemné zesilování účinku při jejich kombinovaném použití poskytuje nový a účinný nástroj léčby nádorů.

Výše uvedené příklady popisující určité formy provedení vynálezu jsou uvedeny pouze pro ilustraci, a neměly by být považovány za specificky omezující vynález. Navíc takové varianty vynálezu, ať známé již nyní nebo v budoucnosti vyvinuté, které by byly v rozsahu znalostí osoby se zkušenostmi v oboru, mají být považovány za spadající do rozsahu dále nárokovaného předloženého vynálezu.

-24CZ 303155 B6

Seznam :	sekvencí
<1 IO> 5	Lodě. 1 lolger N (jillies, Slephen D Cheresh, David A Reisťcld, Ralph A The Scripps Research Institute Lexigen Pharmaceuticals Corporation
10 <120>	METODY PRO LÉČENÍ NÁDORŮ A METASTÁZÍ POMOCÍ KOMBINOVÁNÍ ANTIANGIOGENNÍ A IMUNOLOGICKÉ LÉČBY
<130>	tsri681 1 pc
15 <140> <141>
<150> <151> 20 <160>	60/1 19,721 1999-02-12 16
<17O>	Patentln Ver. 2.0
25 <210> <211> <212> <213>	1 6 PRT Umělá sekvence
3o <220> <221> <222> <223>	MOD RES (0 blokovaný - BOC
35 <220> <221> <222> <223>	MOD RES (6) acetylace - OMe
40 <220> <221> <222> <223>	MOD RES (2) D-Arg
45 <220> <223>	Popis umělé sekvence: výchozí materiál
<400>	1

Gly Arg Gly Asp Phe Val 50

5

-25CZ 303155 B6

<210>	2
<211>	6
<212>	PRT
<2I3>	Umělá sekvence
<220>
<221 >	MOD RES
<222> <223>	(1) blokovaný - BOC
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(2)
<22 3>	D-Arg
<220> <223>	Popis umělé sekvence:	výchozí materiál
<400>	2
Gly Arg Gly Asp Phe	Val
1	5

<2 IO>	3
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Umělá sekvence
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(2)
<223>	D-Arg
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: výchozí materiál
<400>	3
Gly Arg Gly Asp Phe Val
1	5

<210>	4
<211>	6
<212>	PRT
<213>	Umělá sekvence
<220>
<221>	MOD RES
<222>	(2)
<223>	D-Arg

-26CZ 303155 B6 <220>

<221> řetězec

--222> (1)..(6) <223> cyklo <220>

<223> Popis umělé sekvence: cyklo (GrGDFV) <400> 4 io

Gly Arg Gly Asp Phe Val

	1	5
	<210>	5
15	<211>	5
	<212>	PRT
	<213>	Umělá sekvence
20	<220> <221>	MOD RES
	<222>	(4)
	<223>	D-Phe
25	<220> <223>	Popis umělé sekvence: cyklo (RGDíV)
	<220> <221>	řetězec
	<222>	(1)-.(5)
30	<223>	cyklo
	<400>	5
	Arg	Gly Asp Phe Val
	1	5
35
	<210>	6
	<211>	5
	<212>	PRT
40	<213>	Umělá sekvence
	<220> <221>	MOD RES
	<222>	(4)
45	<223>	D-Phe
	<220> <221>	řetězec
	<222>	(1)..(5)
50	<223>	cyklo

-27CZ 303155 B6 <220>

<223> Popis umělé sekvence: cyklo (RADfV)

c	<400>	6
	Arg	Ala Asp Phe Val
	1	5
	<210>	7
10	<211>	5
	<212>	PRT
	<2I3>	Umělá sekvence
	<220>
15	<221>	MOD RES
	<222>	(5)
	<223>	D-Val
	<220>
20	<221>	řetězec
	<222>	(1)-(5)
	<223>	cyklo
	<22 0>
25	<223>	Popis umělé sekvence:
	<400>	7
	Arg Gly Asp Phe Val
	1	5
30
	<210>	8
	<211>	5
	<212>	PRT
35	<213>	Umělá sekvence
	<220>
	<221>	MOD RES
	<222>	(2)
40	<223>	D-Ala
	<220>
	<221>	řetězec
	<222>	(1)-(5)
45	<223>	cyklo
	<220>
	<223>	Popis umělé sekvence: >

-28CZ 303155 B6 <400> 8

Arg Ala Asp Phe Val

5 <210> 9 <21l> 6 <212> PRT <213> U mčlá sekvence <220>

<221> MODRES <222> (5) <223> D-Phe <220>

<221> řetězec <222> (1)..(6) <223> cyklo <220>

<223> Popis umělé sekvence: cyklo (ARGDfL) <400> 9

Ala Arg Gly Asp Phe Leu

5 <210> 10 <211> 6 <212> PRT <213> U mělá sekvence <220>

<221> MODRES <222> (5) <223> D-Phe <220>

<221> řetězec <222> (1)..(6) <223> cyklo <220>

<223> Popis umělé sekvence: cyklo (GRGDfL) <400> 10

Gly Arg Gly Asp Phe Leu 1 5

-29CZ 303155 B6 <21 ()>

<21 1> <212> <213>

5 PRT Umělá sekvence

<220> <221> <222> <223>

MOD RES (4) D-Phe

<220> <221> <222> <223>	MOD RES (5) methy láce, NMeVal
<220> <221> <222> <223>	řetězec 0)45) cyklo
<220> <223>	Popis umělé sekvence: cyklo (RGEfmV)
<400>	1 1

Arg Gly Asp Phe Val 1 5

<210> <211> <2I2> <213>

12 5 PRT Umělá sekvence

<220> <221> <222> <223>

MOD RES (4) D-Phe

<220> <221> <222> <223>	MOD RES (5) methy láce, NMeVal
<220> <221> <222> <223>	řetězec (1)-(5) cyklo
<220> <223>	Popis umělé sekvence: cyklo (RGEfmV)

-30CZ 303155 B6 <400> 12

Arg Gly Glu Phe Val 1 5

<210> <211> <212> <213>

13 5 PRT Umělá sekvence

<220> <221 > <222> <223>

MOD RES (4) D-Phe

<220> <221> <222> <223>

MOD RES (5) methy láce, NMeVal

<220> <221> <222> --223>	řetězec (1)-(5) cyklo
<220> <223>	Popis umělé sekvence: cyklo (RGEfmV)
<400>	13

Arg Ala Asp Phe Val

1	5
<210> <211> <212> <213>	14 5 PRT Umělá sekvence

<220> <221> <222> <223>	MOD RES (1) formy láce - FMOC, Mtr
<220> <221> <222> <223>	MOD RES (3) OBut

<220> <221> <222>

MOD RES (4)

-31 CZ 303155 B6

<223>

D-Phe

<220> 221>	MOD RES
<222> <223>	(5) methy láce, N MeVal, -ON a
<220> <223>	Popis umělé sekvence: Alt Syn Prod
<400>	14

Arg Gly Asp Phe Val

5

<210> <211> <2I2> <2I3>

15 5 PRT Umělá sekvence

<220> <221> <222> <223>	MOD RES (D formy láce - FMOC, Mtr
<220> <221> <222> <223>	MOD RES (3) -OBut

<220> <221> <222> <223>

MOD RES (4) D-Phe

<220> <221> <222> <223>	MOD RES (5) methy láce, N MeVal
<220> <223>	Popis umělé sekvence: Alt Syn Start Prod
<400>	15

Arg Gly Asp Phe Val

5 <210> 16 <211> 5 <212> PRT

-32CZ 303155 B6

<213>	Umělá sekvence
<220>
<221 >	MOD RES
5 <222>	(i)
<223>	Mtr
<220>
<221>	MOD RES
io <222>	(3)
<223>	OBut
<220>
<221>	MOD RES
15 <222>	(4)
<223>	D-Phe
<220>
<221>	MOD RES
20 <222>	(5)
<223>	methy láce, NMeVal
<220>
<223>	Popis umělé sekvence: Alt Syn Produkt
25 <400>	16

Arg Gly Asp Phe Val

Claims (32)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití

   a) činidla potlačujícího angiogenezi, kterým je antagonista α_νβ₃, který je vybraný ze skupiny obsahující peptid obsahující RGD, monoklonální protilátku proti α_νβ₃, monoklonálních protilátku

   40 proti receptorů a

   b) proti nádorového imunoterapeutického činidla, kterým je protinádorový antígen/cytokin fúzní protein pro výrobu léčiva pro léčení nádorových buněk, přičemž protinádorový antigen/cytokin fúzní protein obsahuje alespoň antigen vázající část protilátky proti nádorovému antige45 nu.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde činidlo potlačující angiogenezi a protinádorové imunoterapeutické činidlo jsou ve formě pro současné nebo následné podání.

   50
3. 3. Použití podle nároku 1, kde činidlo potlačující angiogenezi je ve formě dávky obsahující 10 až 1000 mg na kilogram tělesné hmotnosti za den.

   -33CZ 303155 Bň
4. 4. Použití podle nároku I, kde protinádorové ímunoterapeutické činidlo je ve formě dávky (1,01 už 10 mg na ki logrům tělesné hmotnosti za den.
5. 5. Použití podle nároku I, kde peptid obsahující R.GD má sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 1 L
6. 6. Použití podle nároku 1, kde nádorová buňka je neuroektodermálního nebo epiteliálního původu.
7. 7. Použití podle nároku 1, kde protinádorové ímunoterapeutické činidlo je fúzní protein, který obsahuje cytokin 11-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem GD₂.
8. 8. Použití podle nároku I, kde protinádorové ímunoterapeutické činidlo je fúzní protein, který obsahuje cytokin IL-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem KSA.
9. 9. Použití podle nároku 1, kde cytokin je vybrán ze skupiny zahrnující IL-2, IL—12, IL—15.
10. 10. Použití podle nároku 1, kde cílový nádorový antigen je vybrán ze skupiny obsahující AFP, CA 125, CEA, CD 19, CD20, CD44, CD45, receptor EOF, GD₂, GD₃, GM1, GM2, Her-2/Neu, KSA, receptor IL-2, Lewis-Y, Lewis-X, melanomový glykoprotein MCSP, PSA a receptor transferinu.
11. 11. Použití podle nároku 1, kde cílový nádorový antigen pochází z nádorové buňky, která je vybrána ze skupiny zahrnující adenom, angiosarkom, astrocytom. karcinom výstelky, germinom, glioblastom, gliom, hamartom, hemangioendoteliom, hemangiosarkom, hepatom, hepatoblastom, leukémii, lymfom, medu lob lastom, melanom, neuroblastom, osteosarkom, retinoblastom, rabdomyosarkom, sarkom a teratom.
12. 12. Použití podle nároku 1, kde nádorová buňka je vybraná ze skupiny obsahující adenom, angiosarkom, astrocytom, karcinom výstelky, germinom, glioblastom, gliom, hamartom, hemangioendoteliom, hemangiosarkom, hepatom, hepatoblastom, leukémii, lymfom, medu lob lastom, melanom, neuroblastom, osteosarkom, retinoblastom, rabdomyosarkom, sarkom a teratom.
13. 13. Terapeutický prostředek k léčbě nádorové buňky v nádoru nebo metastázích nádoru, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jedno a) činidlo potlačujícího angiogenezi, kterým je antagonista a_vp3, který je vybraný ze skupiny obsahující peptid obsahující RGD, monoklonální protilátku proti α_νβ₂, monoklonální protilátku proti receptoru α_νβ₂; a alespoň jedno b) protinádorové Ímunoterapeutické činidlo, kterým je protinádorový antigen/cytokin fúzní protein, přičemž protinádorový antigen/cytokin fůzní protein obsahuje alespoň antigen vázající část protilátky proti nádorovému antigenů.
14. 14. Terapeutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že obsahuje:

    a. alespoň jedno činidlo potlačující angiogenezi v množství postačujícím pro potlačení angiogeneze v nádoru nebo metastázích nádoru; a

    b. alespoň jedno protinádorové ímunoterapeutické činidlo v množství postačujícím pro vyvolání biologické odpovědi.

    -34CZ 303155 B6
15. 15. Terapeutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že peptid obsahující RGD má sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 11.
16. 16. Terapeutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že protinádorové imunoterapeutické činidlo je fúzní protein, který obsahuje cytokin IL-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem GD₂.
17. 17. Terapeutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že protinádorové imunoterapeutické činidlo je fúzní protein, který obsahuje cytokin IL-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem KSA.
18. 18. Terapeutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že cytokin je vybrán ze skupiny zahrnující IL-2, IL-12, IL-15.
19. 19. Terapeutický prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že cílový nádorový antigen je vybrán ze skupiny obsahující AFP, CA 125, CEA, CD 19, CD20, CD44, CD45, receptor EGF, GD₂, GD₃, GM1, GM2, Her-2/Neu, KSA, receptor IL-2, Lewis-Y, Lewis-X, melanomový glykoprotein MCSP, PSA a receptor transferinu.
20. 20. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že cílový nádorový antigen pochází z nádorové buňky, která je neuroektodermálního nebo epiteliálního původu.
21. 21. Prostředek podle nároku 13, vyznačující se tím, že cílový nádorový antigen pochází z nádorové buňky, která je vybrána ze skupiny zahrnující adenom, angiosarkom, astrocytom, karcinom výstelky, germinom, glioblastom, gliom, hamartom, hemangioendoteliom, hemangiosarkom, hepatom, hepatoblastom, leukémii, lymfom, meduloblastom, melanom, neuroblastom, osteosarkom, réti nóbl astom, rabdomyosarkom, sarkom a teratom.
22. 22. Souprava pro léčení nádorové buňky v nádoru nebo metastázích nádoru, vyznačující se tím, že v balení obsahuje:

    a. činidlo potlačující angiogenezi, kterým je antagonista ανβ?, který je vybraný ze skupiny obsahující peptid obsahující RGD, monoklonální protilátku proti α_νβι, monoklonální protilátku proti receptoru α_νβ3; a

    b. protinádorové imunoterapeutické činidlo, kterým je protinádorový antigen/cytokin fúzní protein, přičemž protinádorový antigen/cytokin fúzní protein obsahuje alespoň antigen vázající část protilátky proti nádorovému antigenů, a

    c. návod pro použití činidel k léčbě nádorů nebo metastází nádoru.
23. 23. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že peptid obsahující RGD má sekvenci aminokyselinových zbytků SEQ ID NO: 11.
24. 24. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že protinádorové imunoterapeutické činidlo je fúzní protein, který obsahuje cytokin IL-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem GD₂.
25. 25. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že protinádorové imunoterapeutické činidlo je fúzní protein, který obsahuje cytokin IL-2 a těžký řetězec imunoglobulinu, který imunologicky reaguje s nádorovým antigenem KSA.
26. 26. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že cytokin je vybrán ze skupiny zahrnující IL-2, IL-12, IL-15.

    -35CZ 303155 B6
27. 27. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že eílový nádorový antigen je vybrán ze skupiny obsahující AFP, CA 125, CEA, CD 19, CD20, CD44, CD45, receptor EGF, GD₂, GDi, GM1, GM2, Iler-2/Neu, K.SA, receptor IL- 2, Lewis-Y, Lewis-X, melanomový glykoprotein MCSP, PSA a receptor transferinu.
28. 28. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že cílový nádorový antigen pochází z nádorové buňky, která je neuroektodermálního nebo epiteliálního původu.
29. 29. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že cílový nádorový antigen pochází z nádorové buňky, která je vybrána ze skupiny zahrnující adenom, angiosarkom, astrocytom, karcinom výstelky, germinom, glioblastom, gliom, hamartom, hemangioendoteliom, hemangiosarkom, hepatom, hepatoblastom, leukémii, lymfom, meduloblastom, melanom, neuroblastom, osteosarkom, retinoblastom, rabdomyosarkom, sarkom a teratom.
30. 30. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že činidlo potlačující angiogenezi a protinádorové imunoterapeutické činidlo jsou poskytnuty v balení v oddělených nádobách.
31. 31. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že činidlo potlačující angiogenezi a protinádorové imunoterapeutické činidlo jsou spojeny v balení do jedné nádoby.
32. 32. Souprava podle nároku 22, vyznačující se tím, že činidlo potlačující angiogenezi a protinádorové imunoterapeutické činidlo jsou spojeny v balení do jedné nádoby a označeny štítky pro kombinované použití.