CZ303657B6

CZ303657B6 - Konský herpes virus

Info

Publication number: CZ303657B6
Application number: CZ20022809A
Authority: CZ
Inventors: Seyboldt@Christian; Osterrieder@Nikolaus; Elbers@Knut
Original assignee: Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh
Priority date: 2000-02-17
Filing date: 2001-02-15
Publication date: 2013-02-06
Also published as: CN1400907A; DK1259258T3; CZ20022809A3; CA2399846C; UY26588A1; US20040063095A1; EP1129722A1; PL210441B1; EP1259258B1; ES2322236T3; BR0108442A; CN100378216C; EP1259258A1; NZ521365A; AU2001248313B2; WO2001060403A1; HUP0204446A3; HK1052462A1; US8017317B2; CN101230336A

Abstract

Konský herpes viru (EHV), v nemz je protein gM modifikován tak, ze tento modifikovaný protein gM je nefunkcní pokud jde o imunomodulacní schopnost pri interakci virus-hostitel, pricemz chybí alespon 70 % genu pro protein gM. Ve výhodných provedeních chybí alespon 80 % genu pro protein gM nebo dokonce az 90 % tohoto genu.

Description

Koňský herpes virus

Oblast techniky

Vynález se týká gM-negativních mutant koňského herpes viru EHV. V těchto mutantách protein gM v podstatě chybí nebo je modifikován a není funkční, pokud jde o imunomodulační schopnost. Vynález se rovněž týká kódových nukleových kyselin, farmaceutického prostředku s obsahem těchto virů nebo nukleových kyselin a použití uvedených látek. Pří použití uvedených mutant je možno zlepšit odpověď imunitního systému na podání vakcín EHV proti infekcím divokým typem EHV.

Dosavadní stav techniky

Koňské herpetické viry 1, EHV-1 náleží do skupiny Alphaherpesvirinae, jde o hlavní příčinu virového zmetání u lichokopytníků, mimo to vyvolává tento virus onemocnění dýchacího a nervového systému. Byla určena úplná sekvence DNA pro EHV-1, kmen Ab4p podle publikace Tleford E. A. E. a další 1992. Jen malý počet genů a produktů těchto genů však byl charakterizován s ohledem na jejich význam pro virulenci EHV.

V případě léčení infekcí EHV-1 jde o dva odlišné přístupy. Především byla vyvinuta modifikovaná živá vakcína MLV, včetně vakcíny pro kmen RacH (Mayr A. a další 1968, Hubert P. H. a další, 1996), tato vakcína je široce rozšířena v Evropě i ve Spojených státech. Mimo to byly podrobeny zkouškám inaktivované vakcíny a nezávisle exprimované virové glykoproteiny na imunogenní a ochrannou účinnost. Mezi glykoproteiny, které byly exprimovány při použití rekombinantních bakulovirů je možno uvést glykoproteiny (g) B, C, D a H, které jsou schopné vyvolat částečnou ochranu proti následné infekci EHV-l na krysím modelu (Awak A. R. a další, 1990, Tewari D. a další, 1994, Osterrieder N. a další, 1995, Stokes A. a další, 1996). Vakcíny typu MLV jsou však výhodnější než vakcíny, které obsahují usmrcené viry ajejich podjednotky. Vakcíny typu MLV jsou vysoce účinné při vyvolání buněčné zprostředkované odpovědi imunitního systému, tato odpověď patrně chrání proti uvedenému onemocnění (Allen G. P. a další, 1995, Mumford J. A. a další, 1995).

Glykoproteiny herpetických virů se vždy účastní jako podstatná složka v časných stádiích infekce, pri uvolnění virionů z buněk a pri přímém šíření virionů od buňky k buňce splýváním sousedních buněk. Až dosud bylo identifikováno 11 glykoproteinů viru herpes simplex typu 1, HSV-1, tyto glykoproteiny byly identifikovány včetně kódové sekvence a byly označeny gB, gC, gD, gE, gG, gH, gl, gJ, gK, gL a gM. HSV-1 mutanty, kterým chybí gC, gE, gG, gí, gJ a gM, jsou životaschopné, což prokazuje, že tyto geny nejsou nezbytné po replikaci pri pěstování na buněčné kultuře. Pri srovnání HSV-1 a nukleotidové sekvence koňského herpetického viru 1 se ukázalo, že všechny známé glykoproteiny HSV-1 jsou konzervovány také v EHV-1. Na základě běžného názvosloví jsou tyto glykoproteiny označovány názvem jejich HSV-1 homologů. Je známo, že EHV-1 gC, gE a gl nejsou podstatné pro růst v buněčné kultuře, zatímco gB a gD jsou pro růst viru na buněčné kultuře podstatné. Úloha jiných glykuproteínů EHV— í pfi Γϋ&ΐϋ nd buíičCuycl kulturách není známa (Flowers C. C. a další, 1992). Šest obalových glykoproteinů EHV-1 byk identifikováno při použití Žgtl 1 banky pro expresi a pri použití monoklonálních protilátek (MAb) proti čištěnému HIV-1 (Allen G. P. a další 1987). Mimo to se pri analýze proteinů a při transkripci prokázalo, že k expresi glykoproteinů gB, gC, gD, gG, gH a gK dochází v buňkách, infikovaných EHV-1. Glykoprotein gM (kódem pro tento glykoprotein je gen UL10 podle Bainer J. D. a další, 1991, Baines J. D. a další, 1983) je HSV-1 glykoprotein, který byl v poslední době podrobně analyzován. Jde o jediný známý nepodstatný glykoprotein, který je konzervován ve všech podčeledích herpetického viru a který byl popsán i u cytomegaloviru Člověka a krysy a u Gammaherpesvirinae ze skupiny EHV-2, u herpesvirus saimiri a u viru Epstein-Barr. Stejně jako u řady glykoproteinů herpetických virů je HSV-l gM přítomen ve virionech a v membránách

- I CZ 303657 B6 infikovaných buněk. Mutanty HSV-1, jimž chyběl pouze gM rostly až do titru, který byl přibližně 1 Okřát nižší ve srovnání s virem divokého typu a virulence těchto vírů na krysím modelu byla snížena (Baines J. D. a další, 1991, MacLean C. A. a další 1993). Homolog EHV-1 gM (gp21/22a, dále bude označován EHV-1 gM) byl poprvé popsán v publikaci Allen G. P. a další 1987 a bylo prokázáno, že jde o hlavní složku obalu viru. Další výzkumy prokázaly, že gen 52, který je homologní genu HSV-1 UL10 je kódovým genem pro 450 aminokyselin polypeptidu EHV-1 gM (Pilling A. a další, 1994, Telford E. A. E. a další, 1992). EHV-1 gM představuje hydrofobní protein, který obsahuje 8 transmem bráno vých domén a bylo prokázáno, že je přítomen v infikovaných buňkách a v čištěných virionech jako protein s M_r 45 000 (Pilling A. a další, 1994, Telford E. A. R a další, 1992).

V roce 1996 provedli Osterrieder a další pokusy, pri nichž srovnávali schopnosti průniku virových mutant (Ll lAgM) s genem Escherichia coli lac Z, vloženým do genu gM EHV-1 kmene RacLl 1 (otevřený čtecí rámec 52), s vlastnostmi původního EHV-1 RacLl 1 a došlí k závěru, že EHV-1 gM hraje důležitou úlohu při průniku viru do cílových buněk a pri šíření viru od buňky k buňce. V roce 1997 Neubauer a další prokázalo, že svrchu popsaná mutanta EHV-1 gM může vyvolat ochrannou imunitu, jak je možno prokázat vyhodnocením protilátek, neutralizujících virus, a přítomností EHV-1-specifických T-buněk ve slezinách imunizovaných myší.

Vynález si klade za úkol nalézt nové modifikované viry uvedeného typu, které by měly podstatně zlepšené imunogenní vlastnosti při léčení a prevenci infekcí EHV.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří koňský herpes virus, v němž je protein gM modifikován tak, že tento modifikovaný protein gM je nefunkční pokud jde o imunomodulační schopnost při interakci virus-hostitel, přičemž chybí alespoň 70 % genu pro protein gM.

Ve výhodném provedení chybí alespoň 80 % tohoto genu. V nej výhodnějším provedení chybí alespoň 90 % tohoto genu.

Podle dalšího výhodného provedení je protein gM modifikovaný a nefunkční. Může jít o vypuštění, mutaci nebo zařazení jiných nukleotidů do kódového genu pro protein gM.

Bylo neočekávaně zjištěno, že v případě, že protein gM v podstatě chybí neboje modifikován a je tedy nefunkční pokud jde o jeho předpokládanou imunomodulační schopnost, dochází ke znatelnému zlepšení ochranné imunity proti herpetickému viru. Bylo tedy poprvé prokázáno, že protein gM mění imunogenní vlastnosti EHV. Je zajímavé, že drive známé virové mutanty Ll lAgM a HAgM-Ins mají také imunogenní vlastnosti, pokud jde o původní kmeny RacLl 1 a RacH. Přestože autoři, Osterrieder a další, 1996 a Neubauer a další 1997, neprokazovali ve své době gM pro viry HAgM pomocí protilátek, má HAgM-Ins mutanta imunomodulační potenciál, podobný potenciálu původního kmene, produkujícího gM. Tato skutečnost je pravděpodobně způsobena zbývající částí gM, k jejíž expresi dochází v HAgM-Ins navzdory vložení lacZ, jak bylo prokázáno analýzou Western blot. Tato zbývající část gM tedy musí být zodpovědná za imunomodulační působení gM. Vynález tedy poprvé popisuje EHV, v němž protein gM v podstatě chybí neboje modifikován aje nefunkční, pokud jde o jeho imunomodulační kapacitu v hostiteli viru.

Pojem „v podstatě chybí“ byl použit z toho důvodu, že poloha sousedního genu pro homolog proteinu UL9 (gen 53), a také jeho orientace, se překrývají s kódovým genem pro protein gM, takže musí zůstat alespoň minimální nukleotidová sekvence genu pro gM k umožnění exprese genu 53 a tím i k udržení životaschopnosti viru. Jak již bylo uvedeno, podle jednoho z výhodných provedení chybí alespoň 70 % genu pro gM, v dalším výhodném provedení chybí až 80 % a v nej výhodnějším provedení až 90 % genu pro gM.

. i

Pojem „nefunkční“ protein gM se rozumí s ohledem na imunomodulační vliv, pokud jde o interakci mezi virem a hostitelem. Rozdíl mezi imunogenním potenciálem EHV podle vynálezu ve srovnání s jinými kmeny EHV, u nichž dochází k expresi funkčního gM je možno určit na stan5 dardním živočišném modelu, tak, jak je to běžné ve veterinární virologii. Jeden z možných postupů pro stanovení, zda dochází k expresi funkčního nebo nefunkčního gM je uveden v následujícím příkladu 1. Tímto postupem je možno poměrně snadno a přesně stanovit rozdíl v imunomodulační schopnosti modifikovaného kmene EHV ve srovnání s kmeny, které se liší pouze tím, že u nich dochází k expresi úplného a nemodifikovaného funkčního proteinu gM. Postup, dále io uvedený v příkladu l, je zvláště vhodný z toho důvodu, že chování kmenů EHV u myší BALB/c je v korelaci s chováním těchto virů v přírodním hostiteli (Mayr, A. a další, 1968, van Woensel, P. A. M. a další, 1995, Colle, C. F.a další Hubert, P, H. a další, 1996, Matsumura, T. a další,

1996).

K odstranění proteinu gM z EHV nebo k dosazení toho, aby tento protein byl nefunkční, je možno použít různé postupy (Sambrook J. a další, 1989). Nelimitující příklady zahrnují vypuštění, mutaci nebo zařazení různých prvků do kódového řetězce pro protein gM. Při vypuštění odpovídající úplné nebo částečné nukleotidové sekvence z viru může dojít k úplné nepřítomnosti nebo k expresi nefunkčního proteinu gM. Téhož výsledku je možno dosáhnout mutací nukleotidové sekvence nebo uložením dalších nukleotidů do oblasti genu nebo do jeho řídicí oblastí. Ve výhodném provedení se vynález týká EHV, modifikovaného vypuštěním, mutací nebo zařazením dalších prvků do kódové sekvence genů pro protein gM.

Sekvence gM ORF se překrývá s UL9 ORF a promotorovými sekvencemi (poloha 94389 až

9 7 0 52, protein s vazbou na Ori, Telford a další, 1992). Protein, pro nějž je kódem UL9 ORF je podstatný pro růst viru, jak bylo prokázáno například pro HSV-1 (Carmichael a další, 1988, Malik a další, 1992). Z tohoto důvodu se výhodné provedení vynálezu týká EHV, v němž je kódová sekvence genu pro protein gM vypuštěna nebo modifikována a současně není exprese kódového genu pro homolog UL9 (gen 53) nijak ovlivněna. Pod tímto pojmem se nerozumí urči30 té množství nebo vlastnosti UL9, avšak prostě skutečnost, že exprese genu není ovlivněna, dochází k expresi proteinu virem a toto množství je v podstatě dostatečné pro životaschopnost viru.

Vynález se týká ve velmi výhodném provedení EHV, v němž jsou nukleotidy 93254 až 94264 vypuštěny, číslování odpovídá číslování u kmene EHV-1 Ab-4p (Telford, E. A. R. a další, 1992) nebo u dalších kmenů. Po vypuštění těchto 1010 nukleotidů gM ORF z celkových 1352 nukleotidů dochází k tomu, že prokazatelné množství peptidů gM již není přítomné. Při tomto téměř úplném vypuštění nukleotidů genu pro gM však stále dochází k tomu, že virus je životaschopný, avšak v podstatě u něj nedochází k expresi derivátů proteinu gM, přičemž exprese všech ostat40 nich genů EHV-1 není ovlivněna. Specificky neovlivní toto vypuštění expresi UL9 ORF.

Svrchu uvedené polohy nukleotidů se týkají kmene EHV-1 Ab-4p, číslování je podle publikace Telford a další, 1992 (banka GenBank/EMBL, přírůstkové číslo M86664). Tyto polohy nukleotidů nejsou žádným způsobem omezeny přesnými polohami, definovanými pro kmen Ab4p EHV45 !, nýbrž jsou prostě použity jako příklad, z něhož má být zřejmé, že jde o nukleotidy v této poloze nebo v odpovídající poloze genu pro gM u jiných kmenů EHV. Pro jiné kmeny EHV virů může být číslování poloh nukleových kyselin odlišné, avšak odborník v molekulární biologii virů čeledi Alphaherpesvirinae snadno identifikuje polohy těchto výhodných nukleotidů vzhledem k polohám jiných nukleotidů v sekvenci. Pro životaschopnost viru je důležité, aby docházelo k funkční expresi viru v těsném sousedství genu gM.

Nejvýhodnějším kmenem EHV podle vynálezu je kmen EHV-1 HAgM-3bl, který byl uložen pod přírůstkovým číslem 99101536 ve sbírce ECACC (Evropská sbírka buněčných kultur, Salisbury, UK).

- j CZ 303657 B6

Vynález je zvláště vhodný v případě EHV typu 1 a 4, protože oba tyto typy viru jsou velice blízce příbuzné (Telford, E. A. R. a další 1992 a 1998).

EHV podle vynálezu je zvláště vhodný k léčebným účelům, obecně pro přenos heterologního materiálu a zvláště pro přenos cizorodých antigenů pro použití v živých vakcínách. Informace o EHV jako heterologním vektoru jsou uvedeny například v dokumentech EP 507 179, WO98/27 216, WO 94/00 587 a WO 98/27 216. V případě, že u EHV podle vynálezu dochází k expresi heterologního materiálu u některého živočicha, nedochází k imunologickým vlastnostem na bázi gM. EHV je proto zvláště vhodný pro imunizaci proti jiným patogenům v případě, že po uložení ío odpovídajících nukleotidových sekvencí do genomu viru EHV dochází k expresi antigenů s imunologickými vlastnostmi. Jinak náleží vakcíny na bázi herpetických virů jako vektorů do známého stavu techniky (například Schmiott, J. a další, 1999, Peeters, B. a další, 1997, Yokoyama a další, 1998). Ve výhodném provedení se vynález týká také EHV, který nese jeden nebo větší počet heterologních genů.

Součást podstaty vynálezu tvoří rovněž kódové nukleové kyseliny pro EHV podle vynálezu. Nukleotidy jsou použitelné pro další modifikaci EHV nebo pro rekombinantní produkci EHV podle vynálezu. Je také možno je použít pro přípravu vakcín na bázi nukleových kyselin.

Vzhledem ke zlepšeným imunologickým vlastnostem, spojeným s EHV, u nějž dochází k expresi modifikovaného nefunkčního gM nebo u nějž nedochází vůbec k expresi gM, je EHV podle vynálezu zvláště vhodný jako účinná složka farmaceutického prostředku, určeného k profylaxi a léčení infekcí EHV. Podle dalšího provedení tedy tvoří součást podstaty vynálezu také farmaceutické prostředky, které obsahují EHV podle vynálezu.

Nukleotidy podle vynálezu je také možno použít pro přípravu vakcín s obsahem DNA ve vektoru. V těchto vakcínách jsou nukleotidy aplikovány živočichům přímo nebo nepřímo přes vektory, odlišné od původního viru. Nukleotidové vakcíny a vakcíny s obsahem vektorů jsou známé a nebudou podrobněji probírány.

Podle dalšího provedení tvoří součást vynálezu farmaceutický prostředek, který obsahuje nukleovou kyselinu podle vynálezu. Vynález se také týká farmaceutického prostředku, obsahujícího EHV podle vynálezu.

Jako nelimitující příklad farmaceutického prostředku, obsahujícího EHV podle vynálezu je možno uvést prostředek, kterýje možno připravit následujícím způsobem: supematant infikované buněčné kultury se smísí se stabilizátorem, například spermidinem a/nebo sérovým albuminem skotu, BSA, a směs se lyofilízuje nebo se zbaví vody jiným způsobem. Před očkováním se ke směsi opět přidá voda, obvykle fyziologický roztok chloridu sodného, popřípadě s fosfátovým pufrem PBS nebo se přidá nevodný roztok, například olejová emulze nebo pomocný prostředek na bázi hliníku.

EHV a nukleotidy pro EHV jsou velmi vhodné pro použití k přípravě farmaceutického prostředku.

Farmaceutický prostředek obvykle obsahuje jednu nebo větší počet složek, které mají schopnost modifikovat fyziologické, například imunologické funkce organismu. Tyto prostředky se podávají živým organismům systemicky nebo na jejich povrch, nejde však o omezení na antibiotika a anti paraziti cké látky, je možno přidávat i jiné složky k dosažení některých výhodných vlastností, například jednoduchého zpracování, sterility, stability, vhodnosti prostředku pro enterální nebo parenterální podání, například pro perorální podání, podání nosní sliznici, nitrožilní, nitrosvalové, podkožní nebo intradermální podání nebo podání jiným vhodným způsobem nebo podání s řízeným uvolněním účinné látky.

-4CZ 303657 B6

Pomocí těchto prostředků je možno zlepšit odpověď imunitního systému, vyvolanou podáním vakcíny proti divokému typu viru EHV, zvláště v případě, že vakcína obsahuje EHV podle vynálezu.

Podle dalšího provedení je možno živou vakcínu EHV odlišit od viru divokého typu. EHV podle vynálezu se liší alespoň jednou důležitou vlastností od izolátů divokého typu. Aby bylo možno tyto kmeny odlišit, produkují kmeny podle vynálezu podstatně modifikovaný protein gM. Tento protein je modifikován tak, že jako specifický antigenní cíl se podstatně lišt od gM virů divokého typu nebo tento protein v podstatě chybí.

io

V jednom z možných provedení lze odlišit živočicha, infikovaného divokým typem EHV od živočicha, léčeného modifikovaným EHV podle vynálezu tak, že se stanoví totožnost proteinu gM u obou živočichů a prokáže se podstatná nepřítomnost tohoto proteinu u modifikovaného viru.

Ve výhodném provedení se postupuje tak, že se

a) zkoumaný vzorek přidá k izolovanému gM nebo jeho modifikovaným derivátům,

b) přidá se protilátka, specifická pro izolovaný protein gM nebo jeho modifikované deriváty a

c) stanoví se vazba protilátky.

Ve velmi výhodném provedení vynálezu je možno odlišit živočicha, infikovaného divokým typem EHV od živočicha, léčeného modifikovaným EHV podle vynálezu tak, že se stanoví rozdíl mezi kódovou sekvencí nukleových kyselin pro protein gM divokého víru a kódovou sekvencí nukleových kyselin pro modifikovaný protein gM nebo se prokáže nepřítomnost těchto nukleo25 vých kyselin.

Podle dalšího provedení se vynález týká zkušebních balíčků, určených pro odlišení živočichů, infikovaných EHV divokého typu od živočichů, léčených modifikovaným EHV podle vynálezu. Tyto balíčky obsahují běžné analytické pomůcky, pufry, rozpouštědla a mechanické pomůcky. Mimoto obsahují protein gM divokého typu, isolovaný modifikovaný protein gM, protilátky, specifické pro protein gM divokého typu, protilátky, specifické pro izolovaný modifikovaných protein gM a specifické nukleotidové sondy, schopné se vázat na nukleotidové kódové sekvence pro protein gM divokého typu a také specifické nukleotidové sondy, schopné se vázat na kódové nukleotidové sekvence pro modifikovaný protein gM.

Seznam literárních citací

Allen, G. P., Yeargan, M., Costa, L. R. R. and Cross, R., 1995. Major histocompatibility complex class I-restricted cytotoxic T-lymphocyte responses in horses infected with equine herpesvirus 1.

J. Virol. 69, 606 až 612.

Allen, G. P. and Yeargan, M. R., 1987. Use of Xgtl 1 and monoclonal antibodies to map the genes for the six major glycoproteins of equine herpesvirusl. J. Virol. 61,2454 až 2461.

Awan, A. R., Chong, Y.-C. and Field, H. J., 1990. The pathogenesis of equine herpesvirus type 1 in the mouše: A new model for studying host responses to the infection. J. Gen. Virol. 71, 1131 ,ϊ 11ΊΑ ílZ. 1 l-tu.

Baines, J. D. and Roizman, B., 1991. The open reading frames UL3, UL4, UL10 and UL16 are dispensable vor the replication of herpes simplex virus 1 in cell culture. J. Virol. 65, 938 až 944. Baines, J. D. and Roizman, B., 1993. The UL10 gene of herpes simplex virus 1 encodes a novel viral glycoprotein, gM, whtch is present in the virion and in the plasma membrane of infected cells. J. Virol. 67, 1441 až 1452.

Carmichael, E. P., Kosovsky, M. J. and Weller. S. K., 1988. Isolation and characterization of herpes simplex, virus type 1 host range mutants defectíve in viral DNA synthesis. J. Viro.. 62(1), až 99.

- 5 CZ 303657 B6

Day, L„ 1999. Characterisation of selected glycoprotein of equine herpesvirus-1: immune responses in the murine model. PhD thesis, Department of Microbiology, University of Leeds, UK.

Flowers, C. C. and O'Callaghan, D. J., 1992, The equine herpesvirus type 1 (EHV-1) homolog of herpes simplex virus type 1 US9 and the nátuře of a major deletion wethin the unique short segment of the EHV-1 KyA strain genome. Virology 190, 307 až 315.

Hubert, P. H., Birkenmaier, S., Rhiza, H. J. and Osterrieder, N., 1996. Alterations in the equine herpesvirus type-1 (EHV-1) strain RacH during attenuation. J. Vet. Med. B 43, 1 až 14.

Kyh se-Andersen, J., 1984. Electroblotting of multiple gels: a simple apparatus without tank for io rapid transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose. J. Biochem. Biophys. Methods 10, 203 až 210.

Laemmli, U. K., 1970. Cleavage of structural protein during the assemboly of the head of bacteriophage Γ4. Nátuře 227, 680 až 685.

MacLean, C. A., Robertson, L. M., and Jamieson, F. E., 1993. Characterization of the UL10 gene i? product of herpes simplex virus type 1 and investigation of ist role in vivo. J. Gen. Virol. 74, 975 až 983.

Malik, A. K., Martinez, R., Muncy, L., Carmichael, E. P. and Weller, S. K., 1992.Genetic analysis of the herpes simplex virus type 1 UL9 gene: isolation of a LacZ insertion mutant and expression in eukaryotic cells. Virology 190(2), 702 až 715.

Mayr, A., Pette, J., Petzoldt, K. and Wagener, K., 1968. Untersuchungen zuř Entwicklung eines Lebendimpfstoffes gegen die Rhinopnemonitis (Stutenabort) der Pferde. J. Vet. Med. B 15, 406 až 418.

Meindl, A. and Osterrieder, N. The equine herpesvirus 1 Us2 homolog encodes a nonessential membrane-associated virion component J. Virol. 73(4):3430 až 7, 1999.

Mumford, J. A., Hannant, D. A., Jessett, D. M., O'Neill, T., Smith, K. C. and Ostlund, E. N.,

1995. Abortigenic and neurological disease caused by experimental infection with liquid herpesvirus-1. In „Proceedings 7¹'¹ International Conference of Equine Infectious Disease“ (H. Nakajima and W. Plowright, Eds.) pp. 261 až 175. R&W PubL, Newmarket, U. K. United Kingdom.

Neubauer, A., Beer, M., Brandmiiller, C., Kaaden, O.-R. and Osterrieder, N., 1997. Equine herpesvirus 1 mutants devoid of glycoprotein B or M are apathohenic for mice but induce protection against chailenge infection. Virology 239, 36 až 45.

Osterrieder, N., Neubauer, A., Brandmiiller, C., Braun, B., Kaaden, O.-R. and Baines, J. D.,

1996. The equine herpesvirus 1 glycoprotein gp21/22a, the herpes simplex virus type 1 gM homolog, ís ínvolved in virus penetration and cell—to-cell spread of virions. Journal of viroloy,

June 1996, p. 4110 až 4115.

Osterrieder, N., Wagner, R., Brandmiiller, C., Schmidt, P. ,Wolf, H. and Kaaden, O.-R., 1995. Protection against EHV-l chailenge infection in the murine model after vaccination with various formulations of recembinant glycoprotein gp!4 (gB). Virology 208, 500 až 510.

Peeters, B., Biendowska-Szewcyk, K., Hulst, M. Giellens, A. and Kimman, T.,

1997. Biologically safe, non-transmissible pseudorabies virus vector vaccine protects pigs against both Aujeszky' disease and classical swine fever. J. Gen. Virol. 78, 3311 až 3315.

Pilling, A., Davison, A. J., Telford, E. A. R. and Meredith, D. M., 1994. The equine herpesvirus type 1 glycoprotein homologous to herpes simplex virus type 1 glycoprotein M is a major con15 stituent of the virus particle. J. Gen. Virol. 75, 439 až 442.

Sambrook, J., Fritsch, D. F. and Maniatis, T., 1989. Molecular Cloning: A laboratory manual. 2^nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.

Schmitt, J., Becher, P., Thiel, H. J. and Keil, G. M. 1999. Expression of bovíne viral diarrhoea virus glycoprotein E2 by bovíne herpesvirus-1 from a synthetic ORF and incorporation of E2 so into recombinant virions. J. Gen Virol. 80, 2839 až 2848.

-6CZ 303657 B6

Stokes, A., Alber, D. G., Greensill, J. Amellal, B., Carvaiho, R., Taylor, L. A., Doel, T. R., Killington, R. A., Halliburton, I. W. and Meredith, D. M., 1996. The expression of the proteins of equine herpesvirus 1 which share homology with herpes simplex virus 1 glycoproteins H and L. Virus Res. 40, 91 až 107.

Telford, E. A. R.., Watson, M. S., MacBride. K. and Davison, A. J., 1992. The DNA sequence of equine herpesvirus-1. Virology 189, 304 až 316.

Telford, E. A., R., Watson, M. S., Petry, J., Cullinane, A. A., and Davison, A. J., 1998. The DNA sequence of equine herpesvirus-4. Journal of Gen. Virol. 79, 1197 až 1203.

Tewari, D., Whalley, J. M. Love, D. N. and Field, H. J., 1994. Characterisation of immune io responses to baculovires expressed equine herpesvirus type 1 glycoproteins D and H ín a murine model. J. Gen. Virol. 75, 1735 až 1741.

Yokoyama, N., Fujita, K., Damiani, A., Sáto, E., Kurosawa, K., Miyazawa, T., Ishiguro, S., Mochizuki, M., Maeda K. and Mikami, I., 1998. Further development of a recembinant feline herpesvirus type 1 vector expressing feline calicivirus immunogenic antigen. J. Vet. Med. Sci.

i? 60, 717 až 723.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkresech

Na obr. 1 jsou znázorněny průměrné tělesné hmotnosti v procentech průměrné hmotnosti ve skupině ve dni infekce.

Skupiny, imunizované HAgM-3bl, to znamená skupiny 7 až 9 byly srovnávány se všemi ostatními imunizovanými skupinami zvířat, aby bylo možno analyzovat potenciální příznivý účinek tohoto viru ve srovnání s ostatními dvěma viry. Použitý virus má v podstatě vypuštěnou sekvenci nukleotidů pro glykoprotein M (vypuštění A A 70-406), zatímco v případě HAgM-lns ve skupinách 4 až 6 je otevřený čtecí rámec pro gM přerušen zařazením kazety LacZ. Tato mutanta viru je však stále ještě schopná exprimovat karboxyterminální část otevřeného čtecího rámce gM, pravděpodobně od methioninového zbytku v poloze 226. Virus RacH ve skupinách 1 až 3 je původní virus, z nějž byly připraveny viry HAgM-3bl a HAgM-lns, jde o virus, široce využívaný pro vakcinaci.

Z výsledků, uvedených na obr. 1 je zřejmé, že u zvířat, očkovaných kmenem HAgM—3b 1 došlo k nej menšímu přechodnému snížení tělesné hmotnosti v případě vakcinace myší při použití 10³ PFU ve skupině 10 ve srovnání se živočichy, vakcinovanými 10³ PFU kmene MAgM-Ins ve skupině 6 nebo 10³ PFU kmene RacH ve skupině 3, Závislost dávky na snížení tělesné hmotnosti po následné infekci je nižší u skupin, jimž byla podána vakcína s obsahem kmene HAgM-3bl ve skupinách 7 až 9 ve srovnání se skupinami, očkovanými kmenem HAgM-lns ve skupinách 4 až 6 nebo kmenem RacH ve skupinách 1 až 3.

Na obr. 2 je znázorněna analýza titru viru. Ve dni 1 po infekci p.i. byly analyzovány plíce infikovaných myší u dvou zvířat, ve dni 3 p.i. u tří zvířat a ve dni 5 p.i. u dvou zvířat. Plíce myší byly vyjmuty, homogenizovány spolu s mořským pískem a uvedeny do suspenze v 1 ml DMEM s 10 % FCS. Titr viru v homogenátu plic byl určen počítáním paků podle publikace Neubauer a další,

1997. Výsledky prokazují, že po imunizaci kmenem HAgM-3bl ve skupinách 7 až 9 je množství viru EHV, reizolované z plicní tkáně sníženo ve srovnání s infekcí kmene HAgM-lns ve skupinách 4 až 6 nebo kmene RacH ve skupinách 1 až 3. Každá plíce byla přitom vyjmuta odděleně, so na výkrese je uveden průměrný titr viru z jednotlivých plic. Svrchu uvedený účinek je zvláště vyjádřen při použití nejnižŠí vakcinační dávky 10³ PFU uvedených virů a pak teprve při vyšších dávkách 10⁴ nebo 10⁵ PFU. Také trvání viremie je zkráceno, stejně jako je sníženo množství viru. kteréje možno zpětně izolovat ze zvířat, očkovaných kmenem HAgM-3bl po 5 dnech ve srov-7CZ 303657 B6 nání s vakcinací kmenem HAgM-Ins nebo RacH, a to zvláště ve skupinách, očkovaných dávkou IO³ PFU.

Na obr. 3 jsou znázorněny výsledky analýzy Western blot u lysátů infikovaných buněk při použití protilátky anti-gB mab 3F6 (Allen a Yergan, 1987, laskavě dodáno od Dr. G. Allen, Lxington, Ky, USA) v případě A nebo při použití protilátky anti-gM mab A8 (od dr. R. A. Killington, Leeds, UK) v případě B. Lysáty buněk byly uvedeny do suspenze v pufru pro vzorek a okamžitě byly děleny pomocí SDS-10%-PAGE. Proteiny byly přeneseny na nitrocelulóžové membrány, které byly inkubovány s protilátkami a výsledky byly odečítány způsobem, uvedeným io v následujícím odstavci. Dráha 1: buňky, infikované RacH. Dráha 2: buňky, infikované HAgM(ns mutantou. Dráha 3: buňky, infikované HAgM-3bl. Dráha 4: buňky, infikované po druhé pasáži HAgM-3bl na buňkách Rkl3. Z výsledků na panelu A specifická identifikace gB u buněk, infikovaných RacH, HAgM-Ins a HAgM-3bl jasně prokazuje expresi virového proteinu a replikaci viru v infikovaných buňkách. Je možno jasně pozorovat dimery a oligomery gB, takže je is možno prokázat správné zpracování glykoproteinu. Pokud jde o panel B, je možno pozorovat protein gM s očekávanou zjevnou molekulovou hmotností po detekci monoklonáíní protilátkou A8 u buněk, infikovaných RacH ve dráze 1. U buněk, infikovaných HAgM-Ins je otevřený čtecí rámec přerušen uložením genu lacZ. Z tohoto důvodu má identifikovaný protein gM nižší zjevnou molekulovou hmotnost ve dráze 2. Vzhledem k tomu, že intenzita signálu western blot pro bílkovinu gM, kjejíž expresi dochází u HAgM-Ins je srovnatelná se signálem, získaným u buněk, infikovaných RacH, je zřejmé, že při zkrácení genu nedochází k přerušení exprese gM proteinu nebo k okamžité degradaci proteinu v infikovaných buňkách. Mimo to dochází v případě HAgM-Ins také k expresi karboxyterminální části gM vzhledem k tomu, že protilátka A8 je namířena proti hydrofilní části karboxyterminálního konce gM. V drahách 3 a 4 není možno pro25 kázat podle očekávání žádný protein gM vzhledem k vypuštění odpovídající nukleotidové sekvence u HAgM-3bl.

Materiály a metody (analýza Western blot)

3ϋ K provedení analýzy Western blot byly lyzáty infikovaných buněk upraveny na stejnou koncentraci proteinu při použití zkoušky BCA™ (Pierce), vzorky byly uvedeny do suspenze v pufru pro vzorek s konečnou koncentrací 50mM Tris-Cl o pH 6,8, 3,2% dodecyl sulfát sodný SDS, 5% 2merkaptoethanol, 10% glycerol. Vzorky byly uloženy do ledu po celou dobu provedení zkoušky a nebyly zahřívány. Proteiny byly od sebe odděleny přerušovanou elektroforézou na polyakryl35 amidovém gelu (SDS-10% polyakrylamidový gel, Laemmli, 1970) a pak přeneseny na nitrocelulózovou membránu (Schleicher & Schiill) podle publikace Kyhse-Andersen, 1984. Po přenosu byly membrány inkubovány v 10% odstředěném mléce ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem s obsahem 0,05 % Tween20 (PBS-T) po dobu 16 hodin při teplotě 4 °C. Pak byly membrány promyty 10 minut při použití PBS-T pri teplotě místnosti, načež byla přidána monoklonáíní protilátka (mab) 3F6 podle Allen a Yergan, 1987 nebo anti-gM mab A8 podle Day, 1999 v uvedeném ředění v PBS-T. Nitrocelu lóžové membrány pak byly inkubovány s monoklonálními protilátkami 1 hodinu pri teplotě místnosti, načež byly 2krát promyty vždy 10 minut při použití PBS-T při teplotě místnosti. Vázané monoklonáíní protilátky byly prokazovány pomocí protilátek proti myšímu imunoglobulinu G, konjugovaných s peroxidázou (Sigma) celkem 1 hodinu pri teplotě místnosti podle doporučení výrobce. Pak byly uskutečněny dva konečné promývací stupně pri použití PBS-T vždy na 10 minut a reaktivní pásy byly zviditelněny pomocí chemoluminiscence (ECL™, Amersham—Pharmacia) podle návodu výrobce.

Na obr. 4 je schematicky znázorněn popis genomu HAgM-3bl. Jsou uvedena restrikční místa pro enzym BamHI a organizace genomu v oblasti gM pro virus EHV-1 RacH a také struktura gM pro negativní virus RacH HAgM-3bl. Jsou uvedena místa působení restrikčních enzymů, která je možno použít pro klonování.

-8CZ 303657 B6

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1 io Zkouška na ovlivnění imunogenních vlastností viru proteinem gM Provedení pokusu

Myši BALB/c (Charles River) ve stáří 3 až 4 týdny byly náhodně rozděleny do 10 skupin po 14 is zvířatech a byly nosní sliznicí imunizovány pri použití RacH (skupiny 1 až 3), negativní mutantou HAgM-Ins podle Neubauer a další, 1997 ve skupinách 4 až 6 nebo virem HAgM-3bl, jemuž chybí v podstatě celý otevřený čtecí rámec pro gM, ve skupinách 7 až 9. Myši byly imunizovány jediným podáním 1 x 10^ jednotek pro tvorbu plaků PFU ve skupinách 1, 4, 7 nebo 1 x 10⁴ PFU ve skupinách 2, 5 a 8 nebo 1 x IO³ PFU 3, 6 a 9 vždy v objemu 2 μΙ. Simulovaná infekce myší ve skupině 10 byla provedena při použití 20 μΙ prostředí DMEM s 10 % FCS. 29 dnů po imunizaci byly myši infikovány nosní sliznicí dávkou 1 x 10⁵ PFU kmene RacLl 1 ve formě suspenze v objemu 20 μΐ. Tělesné hmotnosti jednotlivých myší byly denně zaznamenávány ode dne infekce, který byl označen jako den 0. Ve dni 13 byly stanoveny relativní tělesné hmotnosti v procentech podle rovnice hmotnost ve dni n/hmotnost ve dni 0 x 100. Ve dni 1 po infekci p.i.

byla usmrcena dvě zvířata, ve dni 3 p.i. byla usmrcena 3 zvířata a ve dni 5 p.i. byla usmrcena 2 zvířata v každé skupině a plíce byly analyzovány. Plíce myší byly opět homogenizovány s mořským pískem a uvedeny do suspenze v 1 ml prostředí DMEM s 10 % FCS podle Meindl a Osterrieder, 1999. Titr viru v plicích myší byl stanoven s použitím buněk Rkl3 podle Neubauer a další 1997. Statistická analýza denně zaznamenávané tělesné hmotnosti byla uskutečněna dále uvedeným způsobem.

Výsledky

Primárním cílem svrchu uvedených pokusů bylo prokázat rozdíly v ochranném potenciálu po imunizaci kmenem HAgM-3bl ve skupinách 7 až 9 ve srovnání se skupinami l až 3, imunizovanými RacH a skupinami 4 až 6, imunizovanými HAgM-Ins, ukazatelem byla tělesná hmotnost myší po infekci virulentním kmenem EHV-1. Dalším cílem bylo srovnání skupin I až 9 se skupinou 10 se simulovanou infekcí. Skupiny 7 až 9, imunizované kmenem HAgM-3bl, byly srovnávány se všemi ostatními imunizovanými skupinami k průkazu potenciálního příznivého účinku tohoto viru ve srovnání s oběma zbývajícími kmeny, protože uvedený kmen má úplně vypuštěnou nukleotidovou sekvenci pro glykoprotein M, zatímco v případě kmene HAgM-Ins, použitého ve skupinách 4 až 6, je pouze přerušen otevřený čtecí rámec pro gM v vložením kazety LacZ. Tato mutanta viru je však stále schopna exprese karboxyterminální části otevřeného čtecího rámce gM. Kmen RacH, použitý u skupin 1 až 3 je původní virus, od nějž byly odvozeny oba další kmeny a představuje široce používaný kmen pro vakcinaci.

Statistické metody

Statistická analýza byla provedena pri použití softwaru Win Version 6.12 na PC, který dodává

SAS (Heildeberg).

Aby bylo možno vyhodnotit primární koncový bod, byla provedena opakovaně analýza variance pri použití PROČ GLM (SAS) při použití programu CONTRAST pro specifické srovnání mezi vybranými skupinami, místo programu PROČ ANOVA byl použit program PROČ GLM (gene- 9 CZ 303657 B6 ralizovaný lineární model tak, aby bylo možno vzít v úvahu nevyvážené situace, vznikající odliš ným počtem zvířat v různých dnech.

Program:

proč glm data=maus.obser;

cl as group;

model coli—coll4=group;

repeated time 14(1 23456789 1011 12 13 14)/summary;

contrast 'skupina 10 ve srovnání s ostatními' group-1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 -1 9;

contrast 'skupina 7 ve srovnání se skupinou 4' group 000-1 00 l 000;

contrast 'skupina 7 ve srovnání se skupinou 1' group -100000100 0;

contrast 'skupina 8 ve srovnání se skupinou 2' group 0-1 00000 1 0 0;

contrast 'skupina 8 ve srovnání se skupinou 5' group 0000-1 00 1 0 0;

contrast 'skupina 9 ve srovnání se skupinou 3' group 00-1000001 0;

contrast 'skupina 9 ve srovnání se skupinou 6' group 0 0 0 0 0 -1 0 0 1 0;

means group/waller;

run; quit;

Výsledky vyhodnocení tělesné hmotnosti

Průměrná hmotnost myší ve skupinách v gramech:

Kurzivou jsou uvedeny směrodatné odchylky.

DPI*	SkuDina č.
. 1 I	2 \|	3 (	4		5 I
0	16,58 í 0,8469	17,67: 1,1585	17,12 í 1,0871	16,94	1,0603	16,80 j 1,1350
1	' 16,68 I 0,8432	17,691 0,9844	17,04; 1,0058	17,00	1,1754	16,94; 1,0867
2	'16,64 i 0,8437	17,36! 0,9459	16,441 1,0390	16,91	1,2538	16,741 0,9904
3	15,02 i 0,8451	15,41 \| 1,0361	14,71 ! 0,9307	15,92	1,5361	15,'76 \|Y 2168
4	14,661 1,2315	14,571 1,1995	13,73; 0,9326	15,52	1,8727	15,58; 1,2695
5	15,51 j 1,7635	15,42 i 1,3433	13,92 i 1,2286	16,31	1,6221	16,611 1,1692
6	16,19 j 1,4357	16,02\| 1,2215	14,54! 1,5804	16,68	1,1977	16,69; 1,1357
7	16,52 i 1,2090	16,661 1,2205	15,26; 1,5153-	16,91	\| 1,3459	16,70 j 0,9209
8	16,70 í 1,0296	17,26 ί 0,9893	15,84 i 1,2634	17,14 ί 1,4034	16,68 í 0,8931
9	16,601 1,2506*	17,33 ’ 1,0436	16,31j 1,2655	17,04	1,0628	16,75; 0,7635
10	16,88! 1,0685	17,54 i 1,0293	16,44 j 1,0114	17,39	1,1305'	16,821 0,8035
11	16,551 1,0747	17,50: 0,9092	16,81 i 0,9634	17,40	1,2689	16,78! 0,6706
12	16,67 0,9004	.17,631 0,9517	.16,87: 0,8118	.17,31,	í 0,8494	16,921 0,7808
13	16,73 0,8066	17,86 ί 1,0130	16,921 1,1191	17,31	S 0,9100	16,92; 0,5811
14	17,13 I 0,9873	17,99 j 1,3184	17,061 1,0518	17,56	i 0,8080	17,10 í 0,7099

*DPI = dny po infekci

Průměrná hmotnost myší ve skupinách v gramech:

Kurzivou jsou uvedeny směrodatné odchylky.

- 10CZ 303657 B6

DPI*	Skupina č.
	6	7 I I	8 I	9 t	I	10
0	17,27 1,1339	17,36 j 0,9500	17,14 2,3207	16,72	0,9839	16,tP	1,0418
1	17,67 0,7016	17,53 i 1,0266	.17,21 2,2860	16,81	0,9841		0,8949
2	17,73 i 0,8097	17,35 i 1,0713	17,27 2,2001	16,83	1,0572	'16,46	0,8653
3	16,75 i 1,0424	16,33 i 1,7499	^: 16,291 2,5749	16,08	1,6208	15,04	0,8039
4	16,22 1,2952	16,52 i 2,2320	16,05 [ 2,7071	15,78	2,1063	13,97	0,4880
i 5	14,881 1,6816	17,56; 1,6396	‘16,81 ! 2,8616	,16,64	2,1378	13,39	0,4947
6	15,31 [ 1,8380	17,83 i 1,1386	\ 16,32! 2,8217	16,87	1,4950	12,85	0,6285
7	16,77 í 2,0265	18,20! 1,1437	16,69} 2,8737	17,10	1,4787	12,70	1,2629
3	17,00 I 1,6817	18,10 i 1,1331	16,931 2,8099	17,19	1,1922	12,66	I 1,9100
9	17,38 í 1,4892	18,18 I 1,0759	17,01 i 2,5142	17,31	1,0699	13,801	i 2,0347
10	17,521 1,6130	18,27 í 1,0893	17,07! 2,4635	17,51	1,0885	14,15	2,1142
11	17,55 i 1,5333	18,32 ( 1,1179	17,11 I 2,1721	17,44	1,0706	14,40	1,9849
12	17,771 1,5410	18,28 Í 1,0962	17,24! 2,2693	17,49	1,0007	14,78	1,8945
13	17,72! 1,5211	18,55 I 1,0095	17,37} 2,4432	17,47	1,0128	15,40	1,5033
14	17,68 i 1,4959	18,53! 1,0093	17,43} 2,3915	17,43	1,1086,	15,83í 1,1615

*DPI - dny po infekci

1. Srovnání zvířat se simulovanou infekcí ve skupině 10 s imunizovanými zvířaty. Následující 5 tabulka uvádí průměrnou tělesnou hmotnost simulované imunizovaných zvířat, tato tělesná hmotnost byla statisticky významně vyšší ve dni 3 nebo vysoce statisticky významně nižší ve dnech 4 až 13 po infekci ve srovnání s hmotností v ostatních skupinách.

Tabulka 1.

Skupina 10 proti Hodnota F¹ Hodnota p ostatním

Den 1²	2.56	0.1156
Den 2	1.33	0.2541
Den 3	9.03	0.0040*
Den 4	20.46	0.0001**
Den 5	54.83	0.0001**
Den 6	72.31	0.0001**
Den 7	84.82	0.0001**
Den 8	61.62	0.0001**
Den 9	52.91	0.0001**
Den10	40.47	0.0001**
Den 11	35.21	0.0001**
Den 12	24.18	0.0001**
Den 13	18.52	0.0001**

- 11 CZ 303657 B6 = statistický test = statistické výsledy jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05)

- *♦ = statisticky vysoce významné (<0,0001)

2. V následující tabulce je uvedeno srovnání myší ve skupině 7, imunizovaných kmenem HAgM3b 1 v dávce 10⁵ PFU/myŠ se skupinou myší, imunizovaných RacH (skupina 1, 10⁵ PFU) a skupinou myší, imunizovaných HAgM-Ins (skupina 4, 10⁵ PFU), pokud jde o prevenci snížení tělesné in hmotnosti po infekci.

Výsledky prokazují, že nebylo možno pozorovat statisticky významné rozdíly v průměrné tělesné hmotností u skupin, imunizovaných nejvyššími dávkami viru nezávisle na tom, který kmen byl použit k imunizaci.

Tabulka 2.

Skupina 7 proti skupině 4	Hodnota F¹	Hodnot
Den 1²	0.00	0.9452
Den 2	0.27	0.6047
Den 3	1.50	0.2257
Den 4	1.85	0.1800
Den 5	0.82	0.3693
Den 6	0.82	0.3683
Den 7	0.06	0.8112
Den θ	0.38	0.5396
Den 9	0.00	0.9765
Den 10	0.01	0.9246
Den 11	0.03	0.8552
Den 12	0.65	0.4228
^en 13	0.03	0.8535
Skupina 7 proti

skupině 1

- 12 CZ 303657 B6

Den 1	0.50	0.4831
Den 2	2.54	0.1167
Den 3	3.22	0.0782
Den 4	1.23	0.2719
Den 5	0.40	0.5281
Den 6	0.27	0.6030
□en 7	0.01	0.9287
Den 8	0.12	0.7288
Den &	0.03	0.8720
Den jO	0.45	0.5048
Den 11	0.13	0.7213
□en ^2	0.64	0.4266
Den 13	0.03	0.8588

= statistický test

2 - statistické výsledky jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05) ** = statisticky vysoce významné (<0,000l) io 3. Srovnání zvířat ve skupině 8, imunizovaných kmenem HAgM-3bl v dávce 10⁴ PFU/myš se zvířaty, imunizovanými RacH ve skupině 2 pri použití dávky 10⁵ PFU a se zvířaty, imunizovanými HAgM-Ins ve skupině 5 pri použití 10⁴ PFU, pokud jde o prevenci snížení tělesné hmotnosti po infekci. V následující tabulce je uvedena statistická analýza pro skupiny myší, jimž byla podána dávka 10⁴ PFU. Rozdíly v průměrné tělesné hmotnosti byly statisticky významné mezi zvířaty ze skupiny 8 (10⁴ PFU HAgM-3bl) a ze skupiny 5 (HAgM-Ins) ve dnech 1 a 11 až 13. Avšak u zvířat ve skupině 2, imunizovaných RacH. byly průměrné tělesné hmotnosti významně nebo vysoce statisticky významně nižší ve všech dnech po infekci při srovnání se skupinou 8, imunizovanou HAgM-3bl.

- 13 CZ 303657 B6

Tabulka 3.

Skupina 8 proti	Hodnota F¹	Hodnota
skupině 5
A Den. ‘	6.91	0.0112*
Den 2	3.23	0.0782
Den . 3	3.08	0.0849
Den 4	0.85	0.3614
Den 5	1.67	0.2014
Den 6	0.75	0.3911
Den ⁷	2.62	0.1113
Den 8	3.23	0.0779
Den . θ	3.19	0.0800
Den 1Q	4.00	0.0506
Den 11	4.20	0.0453*
Den Ί2	5.75	0.0200*
Den 13	4.98	0.0299*
Skupina 8 proti
skupině 2
Den1	11.06	0.0016*
Den 2	10.75	0.0018*
Den 3	18.26	0.0001**
Den 4	14.56	0.0004*
Den 5	13.66	0.0005*
Den 6	12.44	0.0009*
Den 7	9.87	0.0028*
Den 8	11.07	0.0016*
Den 9	8.75	0.0046*
Den 10	10.08	0.0025*
Den 11	10.83	0.0018*
Den 12	10.36	0.0022*
Den 13	10.50	0.0021*

= statistický test io 2 = statistické výsledky jsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %)

- 14CZ 303657 B6 * = statisticky významné (<0,05) ** = statisticky vysoce významné (<0,0001)

4. Srovnání myší, imunizovaných HAgM-3bl ve skupině 9 při použití 10³ PFU/myš se skupinou 5 3, imunizovanou RacH vdávce 10³ PFU a skupinou 6, imunizovanou HAgM-Ins vdávce

10³ PFU, pokud jde o prevenci snížení tělesné hmotnosti po infekci,

V následující tabulce jsou uvedeny výsledky pro nejnižší dávku, použitou k imunizaci. Je možno shrnout, že myši, jimž byl podán kmen HAgM-3bl v nejnižší dávce, měly statisticky významně io nebo vysoce statisticky významně vyšší průměrnou tělesnou hmotnost ve dnech 4 až 9 ve srovnání se zvířaty, jimž byla podána stejná dávka kmene HAgM-Ins nebo RacH. Mimoto došlo u zvířat, imunizovaných kmenem RacH k podstatnému snížení tělesné hmotnosti ve srovnání se zvířaty, imunizovanými HAgM-3bl ve dnech 1 až 3 po infekci.

Tabulka 4.

Skupina 9 proti Hodnota F¹ Hodnota p skupině 6

Den 1²	0.00	0.9505
Den ²	1.55	0.2193
Den 3	2.51	0.1190
Den 4	22.95	0.0001**
Den 5	24.34	0.0001**
Den 6	8.23	0.0059*
Den 7	6.81	0,0118*
Den 8	4.22	0.0449*
Den 9	4.87	0.0316*
Den 10	3.60	0.0631
Den 11	2.64	0.1103
Den 12	3.33	0.0735
Den 13	3.45	0.0687

Skupina 9 proti 20 skupině 3

- 15 CZ 303657 B6

Den 1	16.62	0.0002*
Den 2	15.11	0.0003*
Den 3	32.13	0.0001**
Den 4	35.92	0.0001**
Den 5	36.46	0.0001**
Den 6	23.68	0.0001**
Den 7	14.81	0.0003*
Den 8	9.03	0.0041*
Den 9	9.45	0.0033*
Den 10	3.77	0.0574
Den 11	3.88	0.0542
Den 12	3.87	0.0543
Den 13	2.55	0.1161

= statistický test = statistické výsledkyjsou uvedeny ode dne 1 do dne 13, ve dni 0 jsou všechny výpočty totožné 5 (tyto hmotnosti jsou považovány za 100 %) * = statisticky významné (<0,05) ** = statisticky vysoce významné (<0,0001)

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

15 1. Koňský herpes virus, v němžje protein gM modifikován tak, že tento modifikovaný protein gM je nefunkční pokud jde o imunomodulační schopnost při interakci virus-hostitel, přičemž chybí alespoň 70 % genu pro protein gM.
2. Koňský herpes virus podle nároku 1, v němž chybí alespoň 80 % genu pro gM.
3. Koňský herpes virus podle nároku 1, v němž chybí alespoň 90 % genu pro gM.
4. Koňský herpes virus podle některého z nároků 1 až 3, v němž kódový gen pro protein gM je vypuštěn, přičemž exprese kódového genu pro homolog UL9, to znamená genu 53, není ovlivně25 na.
5. Koňský herpes virus podle nároku 1, kde kmenem koňského herpes viru je kmen HAgM3b 1, který je uložen pod přírůstkovým číslem 99101536 ve sbírce ECACC.

30
6. Koňský herpes virus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, který je typem 1 nebo typem 4

EHV.
7. Koňský herpes virus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6, který nese jeden nebo větší počet heterologních genů.

- 16CZ 303657 B6
8. Kódová nukleová kyselina pro koňský herpes virus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
9. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje koňský herpes virus s podle některého z nároků l až 7.
10. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje nukleovou kyselinu podle nároku 8.

io
11. Koňský herpes virus podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 nebo kódová nukleová kyselina pro koňský herpes virus podle nároku 8 pro použití ve veterinárním lékařství.
12. Použití koňských herpes virů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro přípravu farmaceutického prostředku pro profylaxi a léčení infekcí koňským herpes virem.
13. Použití nukleové kyseliny podle nároku 8 pro výrobu farmaceutického prostředku pro profylaxi a léčení infekcí koňským herpes virem.
14. Použití koňských herpes virů podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro přípravu farmaceutic20 kého prostředku pro zlepšení imunitní reakce, která byla vyvolána vakcínou proti infekcím koňským herpes virem divokého typu.
15. Způsob rozlišení živočicha, infikovaného divokým typem koňského herpes viru od živočicha, léčeného modifikovaným koňským herpes virem podle některého z nároků 1 až 7,

25 vyznačující se tím, že se stanoví přítomnost proteinu gM divokého typu viru nebo identita proteinu gM, k jehož expresi dochází, nebo jeho nepřítomnost v modifikovaném viru.
16. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se stanoví rozdíly mezi kódovou nukleovou kyselinou pro protein gM divokého typu viru a kódovou nukleovou kyselinou pro

30 protein gM modifikovaného typu viru nebo nepřítomnost kódové nukleové kyseliny pro protein gM.
17. Způsob podle nároku 15, vyznačující se tím, že se

a) zkoumaný vzorek přidá k izolovanému proteinu gM nebo jeho modifikovanému derivátu,

35 b) přidá se protilátka specifická proti izolovanému proteinu gM nebo jeho modifikovaným derivátům,

c) stanoví se vazba této protilátky.