CZ303704B6 - Protilátka a farmaceutický prostredek s jejím obsahem, hybridom, sekvence nukleové kyseliny, zpusob pro hodnocení (ne)prítomnosti IL-18 pro diagnostiku autoimunitního onemocnení - Google Patents

Abstract

Je popsána krysí neutralizacní monoklonální protilátka 2C10, která je specifická pro lidský interleukin 18 (IL-18), a od ní odvozené humanizované ci chimérické protilátky. Protilátka 2C10 má vazebnou afinitu charakterizovanou disociacní konstantou K.sub.D.n. 3,9 x 10.sup.-11.n. M. Dále se popisuje farmaceutický prostredek s jejím obsahem a pouzití humanizovaných a chimérických protilátek pro výrobu farmaceutického prostredku, pro lécbu stavu spojených s autoimunitním onemocnením jako je roztrousená skleróza, diabetes mellitus typu 1, zánetlivé onemocnení strevní a psoriasa. Dále je popsán zpusob pro hodnocení prípadné prítomnosti lidského IL-18 u cloveka a zpusob pro diagnostiku autoimunitního onemocnení.

Description

Protilátka a farmaceutický prostředek s jejím obsahem, hybridom, sekvence nukleové kyseliny, způsob pro hodnocení (ne)přítomnosti IL-18 a pro diagnostiku autoimunitního onemocnění

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká krysí neutralizační monoklonální protilátky, která je specifická pro lidský IL-18, jakož i humanizované či chimérické protilátky a farmaceutického prostředku io s jejím obsahem a použití takové protilátky pro výrobu farmaceutického prostředku, hybridomu, izolované sekvence nukleové kyseliny, způsobu pro hodnocení případné přítomnosti lidského

IL-18 u člověka a způsobu pro diagnostiku autoimunitního onemocnění,

Dosavadní stav techniky

Lidský interleukin-18 je nedávno identifikovaný cytokin, který'je syntetizován ve formě biologicky inaktivního prekurzorového proteinu velikosti 193 aminokyselin (Ushio et al., J. Immunol. 156: 4274, 1996). Štěpení tohoto prekurzorového proteinu, například kaspasou 1 nebo kaspasou

4. uvolňuje 156 aminokyselinový zralý protein (Gu et al.. Science 275: 206, 1997; Ghayur et al.,

Nátuře 386: 619, 1997), který vykazuje své biologické aktivity, mezi které patří ko-stimulace proliferace T—lymfocytů, zesílení cytotoxicity NK buněk, indukce produkce IFN—gamma Tlymfocyty a NK buňkami, a potenciace diferenciace pomocných T lymfocytů typu 1 (Thi) (Okamura et al., Nátuře 378: 88, 1995; Eur. J. Immunol. 26: 1647, 1996; Kohno et al., J. Immu25 nol. 158: 1541, 1997; Zhang et al., Infect Immunol. 6: 3594, 1997; Robinson et al., Immunity 7: 571, 1997). Dále, IL-18 je účinným induktorem lidských monocytárních prozánětlivých mediátorů, včetně IL—8, faktoru nekrózy nádorů—alfa (TNF-alfa) a prostaglandinu E₂ (PGE₂) (Ushio, S. et al., J. Immunol. 156: 4274 - 4279, 1996; Furen, A. J. ct al., J. Clin. Invest. 10: 711 až 721, 1997; Podolin et al., J. Immunol., odevzdáno, 1999).

Dříve klonovaný protein příbuzný s receptorem pro IL-1 (IL-lRrp) (Parnet et al., J. Biol. Chem. 271: 3967, 1996) byl nedávno identifikován jako podjednotka IL-18 receptoru (Kd = 188nM) (Torigoe et al., J. Biol. Chem. 272: 25737, 1997). Druhá podjednotka IL-18 receptoru vykazuje homologii s doplňkovým proteinem IL—1 receptoru a byla označena jako AcPL (jako podobný doplňkovému proteinu). Exprese IL-lRrp a AcPL je nutná pro aktivaci NF-kB a JNK indukovanou IL-18 (Bom et al., J. Biol. Chem. 273: 29445, 1998). Kromě NF-kB a JNK signalizuje IL18 prostřednictvím kinázy asociované s IL-1 receptorem (IRÁK), p561ck (LCK) a protein kinázy aktivované mitogenem (MAPK) (Micallef et al., Eur. J. Immunol. 26: 1647, 1996; Matsumoto et al., Biophys Biochem. res. Comm. 234: 454, 1997; Tsuji-Takayama et al., Bíochem. Biophys.

Res. Comm. 237: 126, 1997).

Thi lymfocyty, které produkují prozánětlivé cytokiny jako jsou IFN-gamma, IL-2 a TNF-beta (Mosmann et al., J. Immunol. 136:2348, 1986), se pravděpodobně účastní na mnoha autoimunitních onemocněních, včetně roztroušené sklerózy (MS), revmatoidní artritidy (RA), diabe45 tes mellitus dependentního na inzulínu (IDDM, typ 1), zánětlivých onemocnění střevních (IBD) a psoriázy (Mossman and Sad, Immunol. Today, 17: 138, 1996). Proto se předpokládá, že antagonizování cytokinů stimulujícího Thi, jakoje IL-18, bude inhibovat vznik onemocnění. mAb specifické pro ÍL-18 mohou být použity jako antagonisté.

Byla prokázána role IL-18 při vzniku autoimunitních onemocnění. Tak bylo prokázáno, že exprese IL—18 je signifikantně zvýšena ve slinivce břišní a slezině neobézních diabetických (NOD) myší bezprostředně před vznikem diabetů (Rothe et al., J. Clin. Invest. 99: 469, 1997). Obdobně, bylo prokázáno, že koncentrace IL-18 jsou značně zvýšené v synoviální kapalině pacientů s revmatoidní artritidou (Kawashima et al., Arthritis and Rheumatism 39: 598, 1996).

Dále bylo prokázáno, že podání IL—18 zesiluje klinickou závažnost myší experimentální aler- 1 CZ 303704 B6 gické encephalomyelitidy (EAE), autoimunitního onemocnění zprostředkovaného Thl, které je modelem pro roztroušenou sklerózu. Dále bylo prokázáno, že neutralizující anti-krysí IL-18 antisérum brání vzniku EAE u samic Lewisových krys (Wildbaum et al., J. Immunol. 191: 6368, 1998). Proto je IL—18 žádoucím cílem pro vývoj nových terapeutik pro léčbu autoimunitních onemocnění.

Taniguchi et al., J. Immunol. Methods 206: 107, popisuje sedm myších a šest krysích anti-Iidský IL—18 mAb, které se váží na čtyři různá antigenní místa. Jedna z myších mAb (125-2H) a šest krysích mAb inhibují produkci IFN-gamma indukovanou KG-1 buňkami, kdy krysí mAb vykazují neutralizační aktivity 10-krát nižší než 125-2H. Jak bylo prokázáno westernovou hybrídizací, tři myší mAb, ale žádná z krysích mb, jsou silně reaktivní s lidským IL—18 vázaným na membránu. Dále, je popsán enzymový imunosorbentní test (ELISA) pro detekci lidského IL—18, který využívá 125-2H a krysí mAb. Limitem detekce tohoto ELISA testuje 10 pg/ml.

Evropská patentová přihláška EP 0712931 popisuje dvě myší anti-lidský IL—18 mAb, Hl (IgGl) a H2 (IgM). Jak je prokázáno westernovou hybridizací, reagují obě mAb s lidským IL—18 vázaným na membránu, ale ne s lidským IL—12 vázaným na membránu. Hl je použita v imunoafinitní chromatografií pro přečištění lidského IL—18 a v ELISA pro měření IL—18. H2 je použita v radioimunotestu pro měření lidského IL-18.

Neutralizační IL-18 protilátky mohou být potenciálně použity pro zmírnění autoimunitních onemocnění a souvisejících příznaků u člověka. Proto v oboru existuje potřeba vysoce afinitních antagonistů IL—18, jako jsou neutralizační monoklonální protilátky k lidskému interleukinu 18, které budou redukovat diferenciaci a proliferaci Thl a tak auto imunitní onemocnění a související příznaky.

Podstata vynálezu

Předmětem tohoto vynálezu je krysí neutralizační monoklonální protilátka, která je specifická pro lidský interleukin-18, zahrnující regiony určující komplementaritu CDRL1 ze SEQ ID NO: 4, CDRL2 ze SEQ ID NO: 6, CDRL3 ze SEQ ID NO: 8, CDRH1 ze SEQ ID NO: 12, CDRH2 ze SEQ ID NO: 14 a CDRH3 ze SEQ ID NO: 16 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,9 x 10“^llM. Výhodným provedením tohoto vynálezu je monoklonální protilátka uvedená svrchu, která zahrnuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce SEQ ID NO: 2 a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce SEQ ID NO: 10.

Předmětem tohoto vynálezu je také hybridom, který produkuje monoklonální protilátku uvedenou svrchu.

Předmětem tohoto vynálezu je také humanizovaná protilátka specifická pro lidský interleukin18, zahrnující regiony určující komplementaritu CDRL1 ze SEQ ID NO: 4, CDRL2 ze SEQ ID NO: 6, CDRL3 ze SEQ ID NO: 8, CDRH1 ze SEQ ID NO: 12, CDRH2 ze SEQ ID NO: 14 a CDRH3 ze SEQ ID NO: 16 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,9 x 10M.

Předmětem tohoto vynálezu je také chimérická protilátka specifická pro lidský interleukin-18, která zahrnuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce SEQ ID NO: 2 a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce SEQ ID NO: 10.

Předmětem tohoto vynálezu je také farmaceutický prostředek, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje protilátku uvedenou svrchu a farmaceuticky přijatelný nosič.

-2CZ 303704 B6

Předmětem tohoto vynálezu je také použití protilátky uvedené svrchu pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu stavů spojených s auto imunitním onemocněním. Výhodným provedením tohoto vynálezu je použití, kde uvedeným onemocněním je roztroušená skleróza, jakož i použití, kde uvedeným onemocněním je revmatoidní artritida nebo diabetes mellitus typu 1 závislý na inzulínu, stejně jako použití, kde uvedeným onemocněním je zánětlivé onemocnění střevní, stejně jako použití, kde uvedeným onemocněním je psoriáza.

Předmětem tohoto vynálezu je také izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

(a) sekvence nukleové kyseliny kódující humanizovanou protilátku uvedenou svrchu;

(b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k (a);

(c) sekvence nukleové kyseliny kódující chimérickou protilátku uvedenou svrchu;

(d) sekvence nukleové kyseliny komplementární k (c); a (e) sekvence nukleové kyseliny kódující sekvence nukleové kyseliny vybrané ze skupiny sestávající ze sekvence nukleové kyseliny kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky se SEQ ID NO: 2 a sekvence nukleové kyseliny kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky se SEQ ID NO: 10.

Předmětem tohoto vynálezu je také způsob pro hodnocení přítomnosti nebo nepřítomnosti lidského IL—18 u člověka, jehož podstata spočívá vtom, že zahrnuje kontaktování monoklonáíní protilátky uvedené svrchu se vzorkem biologické kapaliny získaným od pacienta za podmínek, při kterých se tvoří komplex IL—18 / monoklonáíní protilátka, a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedeného komplexu IL—18 / monoklonáíní protilátka.

Předmětem tohoto vynálezu je také způsob pro diagnostiku autoimunitního onemocnění, jehož podstata spočívá v tom, že zahrnuje krok určení množství lidského IL— 18 ve vzorku získaném od pacienta způsobem uvedeným v předchozím odstavci, a srovnání tohoto množství s průměrným množstvím lidského IL—18 v normální populaci, kde přítomnost významně vyššího množství lidského IL—18 u pacienta ukazuje na přítomnost autoimunitního onemocnění.

Další aspekty a výhody předkládaného vynálezu jsou popsány dále v zařazeném podrobném popisu ajeho výhodných provedeních.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 (SEQ ID NO: 1 a 2) ukazuje variabilní region lehkého řetězce pro krysí protilátku 2C10. Obr. 1 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 3-8).

Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 2 (SEQ ID NO: 9 a 10) ukazuje variabilní region těžkého řetězce pro krysí protilátku 2C10. Obr, 2 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 11 až 16). Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 3 (SEQ ID NO: 17 a 18) ukazuje variabilní region lehkého řetězce pro myší protilátku 13G9. Obr. 3 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 19 až 24). Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

Obr. 4 (SEQ ID NO: 25 a 26) ukazuje variabilní region těžkého řetězce pro myší protilátku 13G9.

Obr. 4 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 27 až 32).

Oblastí uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primeru.

-3 CZ 303704 B6

Obr. 5 (SEQ ID NO: 33 a 34) ukazuje variabilní region lehkého řetězce pro krysí protilátku 14B7. Obr. 5 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 35 až 40). Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primerů.

Obr. 6 (SEQ ID NO: 41 a 42) ukazuje variabilní region těžkého řetězce pro krysí protilátku 14B7. Obr. 6 uvádí sekvence pro oba řetězce. Oblasti v rámečku ukazují CDR (SEQ ID NO: 43 až 48). Oblasti uvedené tučně jsou sekvence degenerovaného primerů.

Podrobný popis vynálezu

V prvním aspektu vynález poskytuje hlodavci (například krysí a myší) neutralizační monoklonální protilátky specifické pro lidský interleukin 18, které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10 ¹¹M, jak je popsáno dále. Příklady takových monoklonálních protilátek jsou krysí monoklonální protilátka 200 a myší monoklonální protilátky jako je 14B7 a 13G9. Dalším aspektem vynálezu jsou hybridomy jako je 19522C10(2)F2(l)Al, 195214B7(1H1O a 187413G9(3)F12.

V příbuzném aspektu poskytuje předkládaný vynález neutralizační Fab fragmenty nebo jejich F(ab')₂ fragmenty specifické pro lidský interleukin-18 produkované delecí Fc regionu hlodavcích neutralizačních monoklonálních protilátek podle předkládaného vynálezu.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje pozměněnou protilátku specifickou pro lidský interleukin-18, která obsahuje regiony určující komplementaritu (CDR), odvozené z non—lidské neutralizační monoklonální protilátky (mAb), která má vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10M pro lidský interleukin-18, a molekuly nukleové kyseliny kódující tyto protilátky. Když je pozměněnou protilátkou humanizovaná protilátka, tak jsou sekvence kódující regiony určující komplementaritu (CDR) znonlidského imunoglobuíinu insertovány do prvního imunoglobulinového partnera, ve kterém je alespoň jeden, lépe všechny regiony určující, komplementaritu (CDR), nahrazen CDR z nonlidské monoklonální protilátky. Výhodně je první imunoglobulinový partner operabilně navázán také na druhého imunoglobulinového partnera, který obsahuje celý nebo část konstantního řetězce imunoglobuíinu.

V příbuzném aspektu poskytuje předkládaný vynález CDR odvozené z non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek (mAb), které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantu rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10“ M pro lidský interleukin-18, a molekuly nukleové kyseliny kódující tyto CDR.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje chimérickou protilátku obsahující konstantní regiony lidského těžkého a lehkého řetězce a variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce odvozené z non-lidských neutralizačních monoklonálních protilátek, které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10“M pro lidský interleukin-18.

V ještě jiném aspektu vynález poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje jednu (nebo více) výše uvedených pozměněných protilátek a farmaceuticky přijatelný nosič.

Na vynálezu je založen způsob léčby onemocnění u člověka, která jsou asociovaná s nadměrnou produkcí Thl, například autoimunitních onemocnění, kde uvedený způsob zahrnuje podávání účinného množství farmaceutického prostředku podle předkládaného vynálezu uvedenému jedinci.

-4CZ 303704 B6

Na vynálezu je založen způsob pro rekombinantní produkci pozměněných protilátek a složky k tomu potřebné (například geneticky upravených protilátek, CDR, Fab nebo F(ab')₂ fragmentů nebo jejich analogů), které jsou odvozené z non-lidských neutralizačních, monoklonálních protilátek (mAb), které mají vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než přibližně 3,9 x 10 M pro lidský interleukin-18. Mezi uvedené složky patří izolované sekvence nukleové kyseliny kódující tyto složky, rekombinantní plazmidy obsahující sekvence nukleové kyseliny pod kontrolou vybraných regulačních sekvencí, které mohou řídit expresi v hostitelských buňkách (výhodně savčích) transfektovaných rekombinantními plazmidy. Způsob produkce zahrnuje kultivaci transfekovaných hostitelských buněk podle předkládaného io vynálezu za podmínek, při kterých je pozměněná protilátka, výhodně humanizovaná protilátka, exprimována v uvedených buňkách, a izolaci exprimovaného produktu.

Na vynálezu je založen rovněž způsob pro diagnostiku onemocnění spojených s nadměrnou produkcí Thl u člověka, který zahrnuje získání vzorku biologické kapaliny od pacienta a kontak15 tování protilátek a pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu se vzorkem za podmínek, při kterých se tvoří komplex IL-18/protilátka (monoklonáíní nebo pozměněná) a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedeného komplexu IL—18/protilátka.

V krátkosti uvedeno, předkládaný vynález poskytuje různé protilátky, pozměněné protilátky ajejich fragmenty, kteréjsou charakterizované vazebnou specifícitou pro lidský IL-18, neutralizační aktivitou a vysokou afinitou pro lidský IL—18, jak je doloženo příkladem krysí monoklonální protilátky IL—18, jak je doloženo příkladem krysí monoklonáíní protilátky 200, myší monoklonáíní protilátky 13G9 a krysí monoklonáíní protilátky 14B7. Protilátky podle předkládaného vynálezu se připravily běžnými technikami hybridomů používanými pro generování nových neutralizačních protilátek. Tyto produkty jsou použitelné pro léčbu onemocnění zprostředkovaných IL-18, například autoimunitních onemocněních, včetně roztroušené sklerózy (MS), revmatoidní artritidy (RA), diabetes mellitus dependentního na inzulínu (IDDM, typ 1), zánětlivých onemocnění střevních (1BD) a psoriázy (Mossmann and Sad, immunol. Today, 17: 138, 1996). Tyto produkty jsou také použitelné pro diagnostiku onemocnění zprostředkovaných IL-18 pomocí měření (například ELISA testem) endogenních koncentrací IL-18 u člověka nebo IL-18 uvolňovaného ex vivo z aktivovaných buněk.

I. Definice „Pozměněná protilátka“ je protein kódovaný pozměněným regionem kódujícím imunoglobuliny, který může být získán expresí ve vybrané hostitelské buňce. Takové pozměněné protilátky jsou geneticky upravené protilátky (například chimérické nebo humanizované protilátky) nebo protilátky bez celého nebo části konstantního imunoglobulinového regionu, například Fv, Fab nebo F(ab')₂ fragmenty a podobně.

„Pozměněný region kódující imunoglobulin“ je sekvence nukleové kyseliny kódující pozměněnou protilátku podle předkládaného vynálezu. Když je pozměněnou protilátkou protilátka s přeneseným CDR nebo humanizovaná protilátka, tak jsou sekvence, které kódují regiony určující komplementaritu (CDR) z non-lidského imunoglobulinu, insertovány do prvního imuno45 globu!inového partneru obsahujícího variabilní pracovní sekvence. Volitelně je první imunoglobulinový partner operativně navázán na druhý imunoglobulinový partner.

„První imunoglobulinový partner“ je sekvence nukleové kyseliny kódující lidský pracovní rámec nebo variabilní region lidského imunoglobulinu, ve kterém jsou přirozené regiony kódující CDR nahrazeny regiony kódujícími CDR zdárcovské protilátky. Lidský variabilní region může být těžký řetězec imunoglobulinu, lehký řetězec imunoglobulinu, jejich analog nebo funkční fragment. Takové CDR regiony, umístěné ve variabilním regionu protilátek (imunoglobulinů), mohou být určeny za použití známých metod. Například Kabat et al. (Sequences of Proteins of

Immunological Interest, 4. vydání, U.S. Department of Health and Human Services, National

-5CZ 303704 B6

Institutes of Health (1987)) popisuje pravidla pro lokalizaci CDR. Kromě toho jsou známé počítačové programy, kteréjsou použitelné pro identifikaci CDR region ů/struktur.

„Neutralizační“ označuje protilátku, která inhibuje aktivitu IL—18 tím, že brání vazbě lidského

IL—18 na specifický receptor, nebo tím, že inhibuje signalizaci IL—18 prostřednictvím jeho receptorů, když dojde k vazbě. mAb je neutralizační, pokud je z 90 % účinná, výhodně z 95 účinná a nejlépe ze 100 % účinná v inhibici aktivity IL—18, jak je měřena v IL—18 neutralizačním testu, viz příklad 1 a tabulka 1.

Termín „vysoceafinitní“ označuje protilátku s vazebnou afinitou charakterizovanou K_d rovnou nebo menší než 3.9 x 10“^llM pro lidský IL—18, jak je určeno analýzou optickým biosenzorem (viz příklad 2 a tabulka 1).

Termín „vazebná specificita pro lidský IL-18“ znamená vyšší afinitu pro lidský IL—18 než pro myší nebo jiný IL-18.

Termín „druhý ímunoglobulinový partner“ označuje jinou nukleotidovou sekvenci kódující protein nebo peptid, na který je první Ímunoglobulinový partner fúzován ve čtecím rámci nebo prostřednictvím volitelně běžné spojovací sekvence (t.j. je operativně navázán). Výhodně se jed20 ná o ímunoglobulinový gen. Druhý ímunoglobulinový partner může obsahovat sekvenci nukleové kyseliny kódující celý konstantní region stejné (t.j. homologní - první a druhá pozměněná protilátka jsou ze stejného zdroje) nebojiné (t.j. heterologní) požadované protilátky. Může se jednat o ímunoglobulinový těžký nebo lehký řetězec (nebo o oba řetězce jako součásti jednoho polypeptidu). Druhý Ímunoglobulinový partner není omezen na určitou třídu nebo izotyp imunoglo25 bulinů. Dále, druhý ímunoglobulinový partner může obsahovat část imunoglobulinového konstantního regionu, jak je tomu u Fab nebo F(ab')2 (t.j. diskrétní část vhodného lidského konstantního regionu nebo pracovního regionu). Takový druhý ímunoglobulinový partner může také obsahovat sekvenci kódující integrální membránový protein přítomný na vnějším povrchu hostitelských buněk, například jako část fágové zobrazovací knihovny, nebo sekvenci kódující protein pro analytickou nebo diagnostickou detekci, například křenovou peroxidasu, betagalaktosidasu atd.

Termíny Fv, Fc, Fd, Fab a F(ab')2 mají standardní významy (viz např. Harlow et al., Antibodies: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988).

Termín „geneticky upravená protilátka“ označuje typ pozměněné protilátky, t.j. kompletní syntetickou protilátku (například chimérickou nebo humanizovanou protilátku, na rozdíl od fragmentu protilátky), ve které jsou části variabilních domén lehkého a/nebo těžkého řetězce vybrané akceptorové protilátky nahrazeny analogickými částmi z jedné nebo více donorových protilátek, které mají spec i fi citu pro vybraný epitop. Například mohou takové molekuly zahrnovat protilátky charakterizované tím, že obsahují humanizovaný těžký řetězec asociovaný s nemodifikovaným lehkým řetězcem (nebo chimérickým řetězcem) nebo naopak. Upravené protilátky mohou být také charakterizované alterací sekvence nukleové kyseliny kódující pracovní regiony variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce, což vede k zachování vazebné specificity dárcovské protilátky. Tyto protilátky mohou zahrnovat nahrazení jednoho nebo více CDR (výhodně všech) v akceptorové protilátce CDR z dárcovské protilátky, která je zde popsána.

Termín „chimérická protilátka“ označuje typ upravené protilátky, která obsahuje přirozený variabilní region (lehký řetězec a těžké řetězce) z dárcovské protilátky ve spojení s konstantními regiony lehkého a těžkého řetězce z akceptorové protilátky.

Termín „humanizovaná protilátka“ označuje typ upravené protilátky, která má své CDR odvozené od non-lidského dárcovského imunoglobulinu a zbývající imunoglobulinové části molekuly odvozené od jednoho (nebo více) lidských imunoglobulinu. Dále, zbytky pracovního regionu

-6 CZ 303704 B6 mohou být pozměněny tak, aby byla zachována vazebná afinita (viz například Queen et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86: 10029-10032 (1989), Hodgson etak, Bio/Technology 9: 421 (1991)).

Termín „dárcovská protilátka“ označuje protilátku (monoklonální nebo rekombinantní), která dodává sekvence nukleové kyseliny pro své variabilní regiony, CDR nebo jejich jiné funkční fragmenty nebo analogy, pro první imunoglobulinový partner, aby byl získán pozměněný region kódující imunoglobulin a nakonec aby byla exprimovaná pozměněná protilátka s antigenní specifickou a neutralizační aktivitou charakterizovanou pro dárcovskou protilátku. Jednou dareo vskou protilátkou vhodnou pro použití v tomto vynálezu je non-lidská neutralizační monoio klonální protilátka (tj, krysí) označená jako 200. Protilátka 200 je definována jako vysoceafínitní neutralizační protilátka specifická pro lidský IL—18 (tj. nerozpoznávající myší IL-18) izotypu IgG_lk mající DNA a aminokyselinové sekvence variabilního lehkého řetězce SEQ ID NO: 1 a 2 a DNA a aminokyselinové sekvence variabilního těžkého řetězce SEQ ID NO: 9 a 10 na vhodném myším konstantním regionu IgG.

Termín „akceptorová protilátka“ označuje protilátku (monoklonální nebo rekombinantní) heterologní k donorové protilátce, která dodává všechny (nebo část, ale výhodně všechny) sekvence nukleové kyseliny kódující pracovní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce a/nebo konstantní regiony těžkého a/nebo lehkého řetězce pro první imunoglobulinový partner. Výhodně je akcep20 torovou protilátkou lidská protilátka.

„CDR“ jsou definovány jako komplementaritu určující regiony aminokyselinových sekvencí protilátky, které jsou hypervariabilními regiony lehkých a těžkých řetězců imunoglobulinů. Viz například Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4. vydání,

U.S. Department of Health and Human Services, National Instítutes of Health (1987). Ve variabilní části imunoglobulinu jsou přítomny tři CDR těžkého řetězce a tři CDR lehkého řetězce. Termín „CDR“ tedy označuje všechny tři těžké řetězce CDR nebo všechny tři lehké řetězce CDR (nebo CDR těžkého i lehkého řetězce, pokud je to vhodné).

CDR dodávají většinu kontaktních zbytků pro vazbu protilátky na antigen nebo epitop. Požadované CDR podle předkládaného vynálezu jsou odvozeny od variabilních sekvencí těžkého a lehkého řetězce dárcovské protilátky a patří mezi ně analogy přirozených CDR, kde tyto analogy si také zachovávají stejnou vazebnou specificitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako dárcovská protilátka, ze které jsou odvozeny.

Výrazem „sdílí vazebnou specificitu pro antigen nebo neutralizační schopnost“ se míní to, že ačkoliv mAb 200 může být charakterizována určitou úrovní afinity pro antigen, může mít CDR kódovaný sekvencí nukleové kyseliny 200 ve vhodném strukturálním prostředí nižší nebo vyšší afinitu. Předpokládá se, že CDR 200 bude v takovém prostředí rozpoznávat stejný epitop jako

200. Příklady CDR lehkého řetězce 200 jsou:

SEQIDNO: 3;

SEQIDNO: 5;

SEQIDNO: 7; a příklady CDR těžkého řetězce 200 jsou:

SEQIDNO: 11;

SEQIDNO: 13; a

SEQIDNO: 15.

„Funkční fragment“ je část variabilní sekvence těžkého nebo lehkého řetězce (například s drobnými delecemi na amino- nebo karboxylovém konci variabilního regionu imunoglobulinu), která

-7CZ 303704 B6 si zachovává stejnou vazebnou specificitu pro antigen a/nebo neutralizační schopnost jako protilátka, ze které je fragment odvozen.

„Analog“ je aminokyselinová sekvence modifikovaná alespoň jednou aminokyselinou, kde uvedená modifikace může být chemická nebo substituce nebo reuspořádání několika aminokyselin (t.j. ne více než 10), kde tato modifikace umožňuje zachování biologických charakteristik aminokyselinové sekvence, například specificity pro antigen a vysoké afinity, nemodifikované sekvence. Například mohou být vytvořeny (silentní) mutace, pomocí substitucí, které vytvářejí místa pro restrikční endonukleasy v nebo okolo regionů kódujících CDR.

Analogy mohou být také alelické variace. „Alelická variace nebo modifikace“ je alterace sekvence nukleové kyseliny kódující aminokyselinové nebo peptidové sekvence podle předkládaného vynálezu. Takové variace nebo modifikace mohou být způsobeny degenerací genetického kódu nebo mohou být vytvořeny pro dosažení požadovaných charakteristik. Tyto variace a modifi15 kace mohou, ale nemusí vést k alteracím jakékoliv kódované aminokyselinové sekvence.

Termín „efektorová činidla“ označuje molekuly neprote i nových nosičů, na které mohou být pozměněné protilátky a/nebo přirozené nebo syntetické lehké nebo těžké řetězce donorové protilátky navázány běžnými prostředky. Mezi takové neproteinové nosiče patří běžné nosiče použí20 váné v diagnostice, například polystyrénové nebo plastové korálky, polysacharidy, jak jsou používané například v BIAcore (Pharmacia) systému, nebo jiné neproteinové substance použitelné v medicíně a bezpečné pro podání lidem nebo zvířatům. Mezi další efektorová činidla patří makrocykly pro chelataci iontů těžkých kovů, nebo radioizotopy. Taková efektorová činidla mohou být také použita pro zvýšení poločasu pozměněných protilátek, jak je tomu například u polyethylenglykolu.

II. Vysoce afinitní IL-18 monoklonální protilátky

Pro konstrukci protilátek, pozměněných protilátek a fragmentů protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být použity non-lidské druhy (například skot, ovce, opice, kuřata, hlodavci (například myši a krysy) atd.) pro generování požadovaných imunoglobulinů po setkání s přirozeným lidským IL-18 nebo jeho peptidovým epitopem. Běžné hybridomové techniky se použijí pro získání hybridomní buněčné linie secemující non—lidské mAb k IL—18. Takové hybridomy se potom testují na vazbu pomocí 96jamkových ploten potažených IL-18, jakje popsáno v části

Příkladů, nebo alternativně pomocí biotinylovaného IL-18 navázaného na plotny potažené streptavidinem.

Jedním příkladem vysoce afinitní neutralizační mAb podle předkládaného vynálezu je mAb 200, krysí protilátka, která může být použita pro vývoj chimérické nebo humanizované proti40 látky, a tato protilátka je popsána podrobněji v příkladech. 200 mAb je charakterizována vazebnou specificitou pro lidský IL-18 s K_d přibližně 3,9 x 10^_1,M. Tato mAb je izotypu IgGi

Jinou vhodnou dárcovskou protilátkou je myší mAb 13G9, Tato mAb je izotypu IgG|._K. mAb má disociační konstantu pro IL-18 přibližně 12 x 10”⁹M.

Jinou vhodnou dárcovskou protilátkou je krysí mAb 14B7. Tato mAb má disociační konstantu pro IL-18 přibližně 1,5 x 10~^l0M ajetaké izotypu IgGi «

Předkládaný vynález není omezen na použití 13G9, 2C10, 14B7 nebo jejich hypervariabilních (t.j. CDR) sekvencí. Jakákoliv jiná vhodná vysoceafinitní IL—18 protilátka charakterizovaná disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,9 x 10“^llM pro lidský IL-18 a příslušné anti—IL 18 CDR může být také použita. Když je v následujícím popisu dárcovská protilátka popsána jako 13G9, 200, 14B7, tak je to pouze z důvodu zjednodušení popisu.

-8CZ 303704 B6

III. Fragmenty protilátek

Předkládaný vynález také zahrnuje použití Fab fragmentů nebo F(ab')₂ fragmentů odvozených z mAb proti lidskému IL-18. Tyto fragmenty jsou použitelné jako činidla chránící in vivo před stavy zprostředkovanými IL-18 nebo THI, nebo in vitro jako součást diagnostických prostředků pro IL-18. Fab fragment obsahuje celý lehký řetězec a amino-koncovou část těžkého řetězce; a F(ab')₂ fragment je fragment tvořený dvěma Fab fragmenty vázanými disulfidovými vazbami. Mab 13G9, 2CI0, 14B7 a jiné vysoce afínitní protilátky k IL-18 jsou zdroji Fab fragmentů io a F(ab')₂ fragmentů, které mohou být získány běžnými prostředky, například štěpením mAb vhodnými proteolytickými enzymy, papainem a/nebo pepsinem, nebo rekombinantními způsoby. Tyto Fab fragmenty a F(ab')₂ fragmenty jsou sami o sobě použitelné jako terapeutická, profylaktická nebo diagnostická činidla, a jako donory sekvencí včetně variabilních regionů a CDR sekvencí použitelných v přípravě rekombinantních nebo humanizovaných protilátek podle předklá15 daného vynálezu.

Fab a F(ab')₂ fragmenty mohou být připraveny pomocí kombinatoriální fágové knihovny (viz například Winter et al., Ann. Rev. Immunol. 12: 433—455 (1994)) nebo pomocí míšení imunoglobulinových řetězců (viz např. Marks et al., Bio/technology 10: 779-783 (1992), kde obě práce jsou uvedeny jako odkazy ve své úplnosti), kde v těchto způsobech se Fd nebo V_H imunoglobulin dané protilátky (například 13G9) nechá asociovat s repertoárem lehkých imunoglobulinů, V_L (nebo V_K), za zisku nových Fab. Naopak, lehký řetězec imunoglobulinů z dané protilátky se může nechat asociovat s repertoárem těžkých řetězců imunoglobulinů, V_I{ (nebo Fd) za zisku nových Fab.

IV. Požadované anti-IL-18 aminokyselinové a nukleotidové sekvence mAb 200 nebo jiné protilátky popsané výše mohou dodávat sekvence, jako například variabilní peptidové sekvence lehkého a/nebo těžkého řetězce, pracovní sekvence, CDR sekvence, funkční fragmenty ajejich analogy, a nukleotidové sekvence kódující tyto sekvence, které jsou použitelné pro navrhování a získání různých pozměněných protilátek, které mají vazebnou specificitu pro antigen dárcovské protilátky.

Například předkládaný vynález poskytuje variabilní sekvence lehkého a těžkého řetězce z IL-18 mAb 2C10 a sekvence odvozené z těchto sekvencí.

Sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, nebo jejich fragmenty, kódující variabilní peptidové sekvence lehkého řetězce a těžkého řetězce, jsou použitelné pro vkládání specifických změn v sekvencích nukleové kyseliny kódujících CDR a pracovní regiony, a pro

4o inkorporaci vzniklých modifikovaných nebo fúzních sekvencí nukleové kyseliny do plazmidů za účelem exprese.

Když se bere v úvahu degenerace genetického kódu, tak mohou být konstruovány různé kódující sekvence, které kódují variabilní aminokyselinové sekvence těžkého a lehkého řetězce a CDR sekvence podle předkládaného vynálezu, stejně jako jejich funkční fragmenty a analogy, které mají stejnou antigenní specificitu jako dárcovská protilátka. Izolované sekvence nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu, nebo její fragmenty, kódující peptidové sekvence variabilního řetězce nebo CDR, mohou být použity pro produkci pozměněných protilátek, například chimérických nebo humanizovaných protilátek, nebo jiných geneticky upravených protilátek podle předkládaného vynálezu, když jsou operativně kombinovány s druhým imunoglobulinovým partnerem.

Je třeba si uvědomit, že kromě izolovaných sekvencí nukleové kyseliny kódujících části pozměněné protilátky a protilátek spadají další takové sekvence nukleové kyseliny do rozsahu předklá55 daného vynálezu, jako například sekvence komplementární k sekvencím kódujícím přirozené

-9CZ 303704 B6

CDR nebo komplementární k modifikovanými lidským pracovním regionům okolo regionů kódujících CDR. Použitelnými DNS sekvencemi jsou ty sekvence, které hybridizují za přísných hybridizačních podmínek (viz T. Maniatis et al,, Molecular Cloning (A Laboratory Manual), Cold Spring Harbor Laboratory (1982), str. 387-389) na DNA sekvence. Příkladem takových přísných hybridizačních podmínek je hybridizace při 4xSSC při 65 °C, následovaná promytím vO,lXSSX při 65 °C po dobu 1 hodiny. Alternativním příkladem přísných hybridizačních podmínek je 50% formamid, 4XSSC při 42 °C. Výhodné mají tyto hybridizující DNA sekvence délku alespoň 18 nukleotidů, t.j. přibližně velikost CDR.

ίο V. Pozměněné imunoglobulinové molekuly a pozměněné protilátky.

Pozměněné imunoglobulinové molekuly mohou kódovat pozměněné protilátky, mezi které patří geneticky upravené protilátky, jako jsou chimérické protilátky a humanizované protilátky. Požadovaný pozměněný region kódující imunoglobulin může obsahovat regiony kódující CDR, které kódují peptidy mající antigenní specificitu protilátky proti IL—18, výhodně vysoce afínitní protilátky podle předkládaného vynálezu, které jsou insertovány do prvního imunoglobulinového partnera (lidského pracovního rámce nebo variabilního regionu lidského imunoglobuíinu).

Výhodně je první imunoglobulinový partner navázán na druhý imunoglobulinový partner. Druhý imunoglobulinový partner je definován výše a může obsahovat sekvenci kódující požadovaný region druhé protilátky, například Fc region. Druhý imunoglobulinový partner může také obsahovat sekvence kódující jiný imunoglobulin, na které je konstantní region lehkého nebo těžkého řetězce navázán ve čtecím rámci nebo pomocí spojovací sekvence. Mohou být navrženy upravené protilátky namířené proti funkčním fragmentům nebo analogům IL—18, aby bylo dosaženo silnější vazby stejné protilátky.

Druhý imunoglobulinový partner může být také asociován s efektorovým činidlem, jak byla popsána výše, včetně neproteinových nosičů, na které může být druhý imunoglobulinový partner navázán běžnými prostředky.

Fúze nebo vazba mezi druhými imunoglobulinovými partnery, například protilátkovými sekvencemi, a efektorovým činidlem, může být provedena jakýmikoliv vhodnými prostředky, například běžnou ko valentní nebo iontovou vazbou, proteinovou fúzí, nebo pomocí hetero—bifunkčních spojovacích skupin, jako je například karbodiimid, glutaraldehyd a podobně. Takové techniky jsou známé v oboru a jsou popsány v běžných chemických a biochemických učebnicích.

Dále, běžné spojovací sekvence, které pouze dodávají prostor mezi druhým imunoglobulinovým partnerem a efektorovým činidlem, mohou být také obsaženy v regionu kódujícím pozměněný imunoglobulin. Takové spojovací skupiny jsou dobře známé v oboru.

Signální sekvence pro molekuly podle předkládaného vynálezu mohou být modifikovány tak, aby bylo dosaženo zesílení exprese.

Příkladem pozměněné protilátky obsahují peptidové nebo proteinové sekvence variabilního těžkého a/nebo lehkého řetězce mající antigenní specificitu pro mAb 200, například V_H a V_L řetězců. Ještě jiná výhodná pozměněná protilátka podle předkládaného vynálezu je charakterizována aminokyselinovou sekvencí obsahující alespoň jeden, výhodně všechny, CDR variabilního regionu těžkého a/nebo lehkého řetězce krysí protilátky 200 a zbývající sekvence odvozené z lidského zdroje nebo jeho funkčního fragmentu nebo analogu.

V ještě dalším provedení může být upravená protilátka podle předkládaného vynálezu navázána na další činidlo. Například, rekombinantní DNA technologie může být použita pro produkci upravené protilátky podle předkládaného vynálezu, ve které je Fc fragment nebo CH2 CH3 doména kompletní protilátky nahrazena enzymem nebo jinou detekovatelnou molekulou (t.j. polypeptídovou efektorovou nebo reportérovou molekulou).

- 10CZ 303704 B6

Druhý ímunoglobulinový partner může být také operativně navázán na neimunoglobulinový peptid, protein nebo fragment heterologní k sekvenci obsahující CDR, například mající antigenní specificitu krysí 200. Výsledný protein může mít po expresi jak antigenní specificitu k IL-18, tak neimunoglobulinové charakteristiky. Těmito charakteristikami fúzního partnera mohou být, například, funkční charakteristiky jako je jiná vazba nebo receptorová doména, nebo terapeutické charakteristiky, pokud je fúzní partner sám terapeutický protein, nebo další antigenní charakteristiky.

io Jiným výhodným proteinem podle předkládaného vynálezu může být kompletní protilátková molekula obsahující kompletní těžké a lehké řetězce nebo jakékoliv jejich samostatné fragmenty, jako jsou Fab nebo F(ab')₂ fragmenty, dimer těžkého řetězce nebo jakékoliv jejich minimální rekombinantní fragmenty, jako je F_v nebo jednořetězcová protilátka (SCA) nebo jakákoliv jiná molekula se stejnou specificitou jako vybraná dárcovská mAb, například mAb 200. Takový protein může být použit ve formě pozměněné protilátky nebo může být použit v nefúzované formě.

I když je druhý Ímunoglobulinový partner odvozen od protilátky odlišné od dárcovské protilátky, například od pracovních regionů nebo konstantních regionů jakéhokoliv izotypu nebo třídy imu20 noglobutinů, vzniká geneticky upravená protilátka. Upravené protilátky mohou obsahovat konstantní regiony a variabilní pracovní imunoglobulinové regiony z jednoho zdroje, například z akceptorové protilátky, a jeden nebo více (výhodně všechny) CDR z dárcovské protilátky, například zanti-IL-18 protilátky, která je zde popsána. Dále mohou být provedeny alterace, například delece, substituce nebo adice pracovního regionu variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb, nebo CDR regionů donorové protilátky, za účelem zachování vazebné specificity pro antigen dárcovské protilátky.

Lakové upravené protilátky jsou navržené tak, aby využívaly jeden (nebo oba) variabilní těžké a/nebo lehké řetězce IL—18 mAb (volitelně modifikované popsaným způsobem) nebo jeden nebo více níže identifikovaných CDR těžkého nebo lehkého řetězce. Předpokládá se, že upravené protilátky budou neutralizační, t.j. budou blokovat vazbu receptorů na IL—18 protein a také budou blokovat nebo bránit proliferaci buněk závislých na IL-18.

Takové upravené protilátky mohou zahrnovat humanizované protilátky obsahující pracovní regiony vybraného lidského imunoglobulinu nebo podtypu imunoglobulinu, nebo chimérické protilátky obsahující lidské těžké a lehké konstantní regiony fúzované na funkční fragmenty IL18 protilátky. Vhodnou lidskou (nebojinou živočišnou) akceptorovou protilátkou může být protilátka vybraná z běžné databáze, například z KABAT® databáze, Los Alamos databáze a Swiss Protein databáze, podle homologie s nukleotidovou a aminokyselinovou sekvencí dárcovské protilátky. Lidská protilátka charakterizovaná homologii s pracovními regiony dárcovské protilátky (na úrovni aminokyselin) může být vhodná pro dodání konstantního regionu těžkého řetězce a/nebo variabilního pracovního regionu těžkého řetězce pro inserci do dárcovské CDR. Vhodná akceptorová protilátka dodávající konstantní nebo variabilní pracovní regiony lehkého řetězce může být vybrána stejným způsobem. Je třeba uvést, že těžké a lehké řetězce akceptorové proti45 látky nemusí pocházet ze stejné akceptorové protilátky.

Požadované heterologní pracovní a konstantní regiony jsou vybrány z lidských imunogiobulinových tříd a podtypů, jako je IgG (podtypy 1 až 4), IgM, IgA a IgE. Nicméně, akceptorová protilátka nemusí obsahovat pouze lidské imunoglobulinové sekvence. Například může být připraven gen, ve kterém je DNA sekvence kódující část lidského imunoglobulinového řetězce fúzována na DNA sekvenci kódující imunoglobulinovou aminokyselinovou sekvenci, jako je polypeptidový efektor nebo reporterová molekula.

Jeden příklad zejména výhodné humanizované protilátky obsahuje CDR 200 inzertovaný do pracovních regionů vybrané lidské protilátky. Pro neutralizační humanizované protilátky jsou

- 11 CZ 303704 B6 jeden, dva nebo lépe tři CDR z variabilních regionů těžkého a/nebo lehkého řetězce IL-18 protilátky inzertovány do pracovních regionů vybrané lidské protilátky, kde nahrazují přirozené CDR této protilátky.

Výhodně jsou v humanizované protilátce variabilní domény v lidských těžkých a lehkých řetězcích upraveny jednou nebo více náhradami CDR. Je možno použít všech šesti CDR nebo různé kombinace méně než šesti CDR. Výhodně se nahradí všech šest CDR. Je možno nahradit CDR pouze v lidském těžkém řetězci a jako lehkého řetězce použít nemodifikovaný lehký řetězec z lidské akceptorové protilátky. Alternativně, kompatibilní lehký řetězec může být vybrán zjiné lidské protilátky z běžné databáze protilátek. Zbytek upravené molekuly může být odvozen z jakéhokoliv vhodného akceptorového lidského imunoglobulinu.

Upravená humanizovaná protilátka má tedy výhodnou strukturu přirozené lidské protilátky nebo jejího fragmentu a má kombinaci vlastností nutných pro účinné terapeutické použití, například pro léčbu zánětlivých onemocnění zprostředkovaných IL-18 u člověka, nebo pro diagnostické použití.

Jako jiný příklad může upravená protilátka obsahovat CDR variabilního regionu lehkého řetězce 2C10 a CDR variabilního regionu těžkého řetězce 13G9. Vzniklá humanizovaná protilátka by měla být charakterizována stejnou vazebnou specificitou pro antigen a vysokou afinitou jako mAb 200.

Odborníci v oboru by si měli uvědomit, že upravená protilátka může být dále modifikována změnami v aminokyselinách variabilní domény bez toho, že by byla nutně ovlivněna specifická a vysoká afinita dárcovské protilátky (t.j. jedná se o analog). Předpokládá se, že aminokyseliny těžkého a lehkého řetězce mohou být substituovány jinými aminokyselinami v pracovním regionu variabilní domény nebo v CDR nebo v obou.

Dále, konstantní region může být pozměněn za účelem zesílení nebo zeslabení vybraných vlastností molekul podle předkládaného vynálezu, například dimerizace, vazby na Fc receptory nebo schopnosti vázat a aktivovat komplement (viz např. Angal et al., Mol. Immunol. 30: 105— 108 (1993); Xu et al., J. Biol. Chem. 269: 3469-3474 (1994); Winter et al., Ep 307434-B).

Pozměněná protilátka, kterou je chimérická protilátka, se liší od humanizované protilátky popsané výše tím, že obsahuje celý variabilní region těžkého a lehkého řetězce non—lidské dárcovské protilátky, včetně pracovních regionů, společně s konstantními regiony lidského imunoglobulinu pro oba řetězce. Předpokládá se, že chimérické protilátky, které si obsahují další nonlidské sekvence ve srovnání s humanizovanými protilátkami podle předkládaného vynálezu, mohou vyvolat u člověka významnou imunitní reakcí.

Takové protilátky mohou být použitelné v prevenci a léčbě onemocnění zprostředkovaných IL— 18, jak je popsáno dále.

VI. Produkce pozměněných protilátek a geneticky upravených protilátek

Variabilní sekvence lehkých a/nebo těžkých řetězců a CDR mAb 2C10 nebo jiných vhodných dárcovských protilátek ajejich kódující nukleové kyseliny jsou použity pro konstrukci pozměněných protilátek, výhodně humanizovaných protilátek, podle předkládaného vynálezu, za použití následujícího postupu. Stejné nebo podobné techniky mohou být použity pro přípravu jiných provedení tohoto vynálezu.

Hybridom produkující vybranou dárcovskou protilátku, například krysí protilátku 200, se běžným způsobem klonuje a DNA pro jeho variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce se získá technikami známými odborníkům v oboru, například technikami popsanými v Sambrook et al.

(Molecular Cloning (A Laboratory manual), 2. vydání, Cold Spríng Harbor Laboratory (1989)).

- 12CZ 303704 B6

Variabilní regiony těžkého a lehkého řetězce 200 obsahující alespoň regiony kódující CDR a ty části pracovních regionů variabilní domény lehkého a/nebo těžkého řetězce akceptorové mAb nutné pro zachování vazebné spéciFicity dárcovské mAb, stejně jako zbývající imunoglobu línové části proti látkových řetězců z lidského imunoglobulinu, mohou být získány za použití poly5 nukleotidových primerů a reverzní transkriptasy. Regiony kódující CDR se identifikují pomocí známých databází a srovnáním s jinými protilátkami.

Potom může být připravena krysí/lidská chimérická protilátka a může být testována na vazebnou schopnost. Taková chimérická protilátka obsahuje celé V_H a V_L regiony non-lidské dárcovské io protilátky a konstantní regiony lidského Ig pro oba řetězce.

Humanizovaná protilátka může být odvozena z chimérické protilátky nebo, výhodněji, může být připravena synteticky inzercí regionů kódujících CDR dárcovské mAb z těžkých a lehkých řetězců do vybraného pracovního rámce těžkého a lehkého řetězce. Alternativně může být huma15 nizovaná protilátka podle předkládaného vynálezu připravena standardními technikami mutagenese. Získaná humanizovaná protilátka obsahuje lidské pracovní regiony a regiony kódující CDR dárcovské protilátky. Mohou být provedeny další úpravy zbytků pracovního rámce. Získaná humanizovaná protilátka může být exprimována v rekombinantní hostitelské buňce, jako jsou COS, CHO nebo myelomové buňky. Touto technikou mohou být připraveny jiné humanizované protilátky za použití jiných vhodných neutralizačních, vysoce afínitních non-lidských protilátek specifických pro IL-18.

Běžné expresní vektory nebo rekombinantní plazmidy mohou být připraveny umístěním těchto kódujících sekvencí pro pozměněnou protilátku do operativní vazby s běžnými regulačními kontrolními sekvencemi schopnými kontroly replikace a exprese v, a/nebo sekrece z hostitelské buňky. Mezi regulační sekvence patří promotorové sekvence, jako je například CM V promotor, a signální sekvence, které mohou být získány ze známých protilátek. Obdobně může být připraven druhý expresní vektor, kteiý obsahuje DNA sekvenci, která kóduje komplementární lehký nebo těžký řetězec protilátky. Výhodně je tento druhý expresní vektor identický jako první expresní vektor s výjimkou kódující sekvence a selektovatelných markérů, aby bylo co možná nejlépe zajištěno to, že každý polypeptidový řetězec je funkčně exprimován. Alternativně mohou být kódující sekvence pro těžký a lehký řetězec pozměněné protilátky umístěny na jediném vektoru.

Vybraná hostitelská buňka se současně transfektuje běžnými technikami jak prvním, tak druhým vektorem (nebo se jednoduše transfektuje jediným vektorem) za zisku transfektované hostitelské buňky podle předkládaného vynálezu obsahující oba buď rekombinantní, nebo syntetické lehké a těžké řetězce. Transfektovaná buňka se potom kultivuje běžnými technikami za zisku geneticky upravené protilátky podle předkládaného vynálezu. Humanizovaná protilátka, která je tvořena spojením rekombinantního těžkého a/nebo lehkého řetězce, se vyhledává v kultuře pomocí vhodného testu, jako je ELISA nebo RIA. Podobné běžné techniky mohou být použity pro konstrukci jiných pozměněných protilátek a molekul podle předkládaného vynálezu.

Vhodné vektory pro klonování a subklonování použité ve způsobech a přípravě prostředků podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkům v oboru. Například může být použito běžné pUC série klonovacích vektorů. Jedním použitelným vektorem je pUC19, který je komerčně dostupný od dodavatelů jako je Amersham (Buckinghamshire, Velká Británie) nebo Pharmacia (Uppsala, Švédsko). Dále, jakýkoliv vektor, který je snadno replikovatelný, má dostatek klonovacích míst a selektovatelných genů (například pro rezistenci na antibiotika) a snadno se s ním pracuje, může být použit pro klonování. Proto není výběr klonovacího vektoru limitujících faktorem pro předkládaný vynález.

Obdobně, vektory použité pro expresi upravených protilátek podle předkládaného vynálezu mohou být vybrány odborníkem v oboru z mnoha běžných vektorů. Vektory také obsahují vybra55 né regulační sekvence (jako jsou CMV promotory), které řídí replikaci a expresi heterologních

- 13CZ 303704 B6

DNA sekvencí ve vybrané hostitelské buňce. Tyto vektory obsahují výše popsané DNA sekvence, které kódují upravenou protilátku nebo pozměněný region kódující imunoglobulin. Dále mohou vektory obsahovat vybrané imunoglobulinové sekvence modifikované inzercí požadovaných restrikčních míst pro snadnou manipulaci.

Expresní vektory mohou být také charakterizovány geny vhodnými pro amplifikaci exprese heterologních DNA sekvencí, například savčí gen pro dihydrofolát reduktasu (DHFR). Mezi jiné výhodné vektorové sekvence patří póly A signální sekvence, například z hovězího růstového hormonu (BG) a promotorové sekvence betaglobinu (betaglopro). Použitelné expresní vektory mohou být syntetizovány technikami dobře známými odborníkům v oboru.

Složky takových vektorů, například replikony, selekční geny, zesilovače transkripce, promotory, signální sekvence a podobně, mohou být získány z komerčních nebo přirozených zdrojů nebo mohou být syntetizovány známými postupy, a potom jsou tyto složky použity pro řízení exprese a/nebo sekrece produktu rekombinantní DNA ve vhodném hostiteli. V oboru známé expresní vektory různých typů pro savčí, bakteriální, hmyzí, kvasinkovou a mykotickou expresi mohou být tak vybrány pro tento účel.

Předkládaný vynález také zahrnuje buněčnou linii transfektovanou rekombinantním plazmidem obsahujícím kódující sekvence upravené protilátky nebo jejích imunoglobulinových molekul. Hostitelské buňky vhodné pro klonování a jiné manipulace s těmito klonovacími vektory jsou také běžné. Nicméně, pro replikaci klonovacích vektorů a další stupně konstrukce pozměněných protilátek podle předkládaného vynálezu se nejvýhodněji použijí různé kmeny E. coli.

Vhodné hostitelské buňky nebo buněčné linie pro expresi upravené protilátky nebo pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu jsou výhodně savčí buňky jako CHO, COS, fibroblasty (například 3T3) a myeloidní buňky, nejlépe CHO nebo myeloidní buňky. Mohou být použity lidské buňky, což umožňuje dosažení lidského charakteru glykosylace molekuly. Alternativně mohou být použity jiné eukaryotické linie. Výběr vhodných savčích hostitelských buněk a způsobů pro transformaci, kultivaci, amplifikaci, testování a produkci produktu a přečištění, je v oboru známé. Viz, například, Sambrook et al., citovaný výše.

Bakteriální buňky mohou být vhodné jako hostitelské buňky vhodné pro expresi rekombinantních Fab podle předkládaného vynálezu (viz např. Pluckthun, A., Immunol. Rev. 130: 151-188 (1992)). Nicméně, vzhledem k tendenci proteinů exprimovaných v bakteriálních buňkách být v nesložené nebo nesprávně složené formě nebo v neglykosylované formě, musí být každý rekombinantní Fab produkovaný v bakteriální buňce testován na zachování vazebné schopnosti pro antigen. Pokud je molekula exprimovaná v bakteriální buňce produkována ve správně složené formě, tak bude tato bakterie vhodným hostitelem. Například, různé kmeny E. coli používané pro expresi jsou dobře známými hostitelskými buňkami v oblasti biotechnologií. V tomto způsobu mohou být také použity různé kmeny B. subtilis, Streptomyces, jiných bacilů a podobně.

Pokud je to žádoucí, mohou být kmeny kvasinek známé v oboru také použity jako hostitelské buňky, stejně jako hmyzí buňky, například Drosophila a Lepidoptera a virové expresní systémy. Viz například Miller et al., Genetic Engineering 8: 277-298, Plenům Press (1986) a odkazy zde citované.

Obecné způsoby, kterými mohou být připraveny vektory podle předkládaného vynálezu, způsoby transfekce nutné pro produkci hostitelských buněk podle předkládaného vynálezu a způsoby kultivace nutné pro produkci pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu z takových hostitelských buněk, jsou všechno běžné techniky. Obdobně, po produkci mohou být pozměněné protilátky podle předkládaného vynálezu přečištěny z buněčného obsahu za použití standardních technik, včetně srážení síranem amonným, afinitních kolon, chromatografie na koloně, gelové elektroforesy a podobně. Takové techniky jsou známé v oboru a nelimitují předkládaný vynález.

- 14CZ 303704 B6

Ještě jiný způsob exprese humanizovaných protilátek může využívat expresi vtransgenním zvířeti, jak je popsáno v US patentu 4873316. Tento patent popisuje expresní systém využívající promotoru zvířecího kaseinu, který po transgenní inkorporaci do savce umožňuje produkci rekombinantního proteinu v mléku samic.

Po expresi požadovaným způsobem se upravená protilátka testuje na aktivitu in vitro pomocí vhodného testu. V současnosti se využívá běžných ELISA testovacích formátů pro hodnocení kvalitativní a kvantitativní vazby upravené protilátky na IL-18. Kromě toho mohou být pro verifikaci neutralizační aktivity použity jiné testy in vitro před tím, než se provedou klinické studie na lidech pro hodnocení persistence upravené protilátky v těle za působení obvyklých vylučovacích mechanismů.

Podle obecných postupů popsaných pro přípravu humanizovaných protilátek může odborník v oboru také konstruovat humanizované protilátky z jiných dárcovských IL-18 protilátek, variabilních regionů a CDR peptidů, které zde byly popsány. Upravené protilátky mohou být produkovány s pracovními regiony variabilních regionů potenciálně rozpoznávanými jako „vlastní“ příjemcem upravené protilátky. Malé modifikace pracovních regionů variabilních regionů mohou způsobit velké zvýšení vazby na antigen bez významného zvýšení imunogen icity pro příjemce. Takové upravené protilátky mohou účinně léčit onemocnění zprostředkované IL-18 u člověka. Takové protilátky mohou být také použitelné pro diagnostiku takových onemocnění. VII. Terapeuti cké/profyl akt i cké použití

Předkládaný vynález se také týká způsobu léčby lidí s příznaky souvisejícími s autoimunitní reakcí, jako je MS, kde uvedený způsob zahrnuje podání účinné dávky protilátek včetně jedné nebo více upravených protilátek podle předkládaného vynálezu nebo jejich fragmentů.

Terapeutická odpověď indukovaná použitím molekul podle předkládaného vynálezu je produkována vazbou na lidský IL-18 a následným blokováním stimulace Thl. Tak jsou molekuly podle předkládaného vynálezu, v prostředcích a přípravcích pro terapeutické použití, vhodné pro jedince s autoimunitním onemocněním, jako je například MS, RA, IDDM, IBD a psoriáza.

Pozměněné protilátky, protilátky ajejich fragmenty podle předkládaného vynálezu mohou být také použity společně s jinými protilátkami, zejména s lidskými mAb reaktivními s jinými markéry (epitopy) odpovědnými za stavy, proti kterým je namířena upravená protilátka podle předkládaného vynálezu.

Předpokládá se, že terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu jsou vhodná pro léčbu autoimunitních onemocnění v délce od 2 dnů do 6 měsíců nebo podle potřeby. Delší léčba může být žádoucí například tehdy, když se léčí MS nebo podobné onemocnění. Dávka a trvání léčby souvisí s relativním přetrváváním molekul podle předkládaného vynálezu v lidské cirkulaci a tyto veličiny mohou být upraveny odborníkem v oboru podle léčeného onemocnění a celkového zdravotního stavu pacienta.

Způsob podání terapeutického činidla podle předkládaného vynálezu může být jakýkoliv vhodný způsob, kterým je možno dodat činidlo hostiteli. Pozměněné protilátky, protilátky, geneticky upravené protilátky ajejich fragmenty, a farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu jsou zejména vhodné pro parenterální podání, t.j. podkožní, intramuskulámí, intravenosní nebo intranasální.

Terapeutická činidla podle předkládaného vynálezu mohou být připravena jako farmaceutické prostředky obsahující účinné množství upravené (například humanizované) protilátky podle předkládaného vynálezu jako aktivní složku ve farmaceuticky přijatelném nosiči. U proiylaktických činidel podle předkládaného vynálezu se upřednostňuje vodná suspenze nebo roztok obsahující upravenou protilátku, výhodně pufrované na fyziologické pH, ve formě připravené pro

- 15CZ 303704 B6 injekční podání. Prostředky pro parenterální podání budou obvykle obsahovat roztok upravené protilátky podle předkládaného vynálezu nebo jejich směs rozpuštěný ve farmaceuticky přijatelném nosiči, výhodně ve vodném nosiči. Mohou být použity různé vodné nosiče, například 0,4% šalinický roztok, 0,3% glycin a podobně. Tyto roztoky jsou sterilní a neobsahují částečky. Tyto roztoky mohou být sterilizovány běžnými, dobře známými sterilizačními technikami (například filtrací). Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné pomocné substance nutné pro přiblížení se fyziologickým podmínkám, jako jsou činidla upravující pH a pufrovací činidla atd. Koncentrace protilátky podle předkládaného vynálezu v takových farmaceutických prostředcích se může velmi lišit, t.j. od méně než 0,5 %, obvykle okolo 1 %, do až 15 nebo 20 % hmotnostních io a bude vybrána hlavně podle objemu kapalin, viskozity atd., pro konkrétní vybraný způsob podání.

Tak mohou být farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu pro intramuskulámí injekci obsahovat 1 ml sterilní pufrované vody a přibližně 1 ng až přibližně 100 mg, například

50 ng až přibližně 30 mg, nebo lépe přibližně 5 mg až přibližně 25 mg, upravené protilátky podle předkládaného vynálezu pro intravenosní infusi mohou obsahovat přibližně 250 ml sterilního Ringrova roztoku a přibližně 1 až přibližně 30 a výhodně 5 mg až přibližně 25 mg upravené protilátky podle předkládaného vynálezu. Způsoby přípravy prostředků pro parenterální podání jsou dobře známé odborníkům v oboru a jsou podrobněji popsány, například, v Remíngton's Pharma20 ceutical Science, 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania.

Je výhodné, aby terapeutické činidlo podle předkládaného vynálezu, když je ve farmaceutickém prostředku, bylo ve formě dávkových jednotek. Vhodná terapeuticky účinná dávka může být snadno určena odborníkem v oboru. Pro účinnou léčbu zánětlivých onemocnění u člověka nebo jiného zvířete by měla být jedna dávka od přibližně 0,1 mg do přibližně 20 mg na 70 kg tělesné hmotnosti proteinu nebo protilátky podle předkládaného vynálezu podána parenterálně, výhodně i.v. nebo i.m. (intramuskulámě). Taková dávka může být, pokud je to nutné, opakována ve vhodných časových intervalech vybraných lékařem během léčby onemocnění.

Pozměněné protilátky a upravené protilátky podle předkládaného vynálezu mohou být také použity v diagnostických režimech, například v testech pro určení onemocnění zprostředkované IL-18 nebo pro sledování progrese onemocnění. Jako diagnostická činidla mohou být tyto protilátky běžně značeny pro použití v ELISA a jiných běžných testech pro měření koncentrace IL-18 v séru, plasmě nebo jiné vhodné tkáni, nebo pro měření uvolňování IL-18 v lidských buňkách v kultuře. Testy, ve kterých jsou pozměněné protilátky použity, jsou běžné a neomezují předkládaný vynález.

Tak se jedno provedení předkládaného vynálezu týká způsobu pro diagnostiku autoimunitního onemocnění a jiných stavů asociovaných s produkcí Thl T-lymfocytů u pacientů, který zahrnuje kroky určení množství lidského IL-18 ve vzorku (plazmy nebo tkáně) získaného od uvedeného pacienta a srovnání uvedeného určeného množství s průměrným množstvím lidského IL-18 v normální populaci, kde přítomnost signifikantně zvýšeného množství IL-18 ve vzorku od pacienta ukazuje na přítomnost autoimunitního onemocnění a jiných stavů spojených s nadbytkem produkce Th 1 T-lymfocytů,

Protilátky, pozměněné protilátky ajejich fragmenty zde popsané mohou být lyofilizovány pro skladování a rekonstituovány pomocí vhodného nosiče před použitím. Bylo prokázáno, že tato technika je účinná pro běžné imunoglobuliny a mohou být použity v oboru známé techniky lyofílizace a rekonstituce.

Následující příklady ilustrují různé aspekty vynálezu včetně konstrukce příkladných upravených protilátek ajejich exprese ve vhodných vektorech a hostitelských buňkách, a nijak neomezují rozsah vynálezu. Všechny aminokyseliny jsou označeny běžným trojpísmenným nebo jednopísmenným kódem. Všechny nutné restrikční enzymy, plazmidy a jiná činidla a materiály jsou získané z komerčních zdrojů, pokud není uvedeno jinak. Všechny obecné způsoby klonování

- 16CZ 303704 B6 a jiné techniky rekombinantní DNA metodologie jsou provedené podle T. Maniatis et al., výše, nebo druhého vydání této publikace (1989), ed. Sambrook et al., stejný vydavatel („Sambrook et al.“).

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Produkce mAb k IL-18 io

A. Příprava monoklonální protilátky

Myší (Fl hybridy Balb/c a C57BL/6) nebo krysy (Sprague Dawley) se imunizují 30 pg rekombinantního IL— 18 v adjuvans a o 4 týdny později 30 pg IL—18 v adjuvans. Podle dobrého sérového titru protilátek proti IL-18 byla zvířatům podána další imunizace 10 až 30 pg IL-18 (i.p. v salinickém roztoku. Tři dny po poslední imunizaci byla provedena splenektomie. Myší nebo krysí buňky sleziny se použily pro přípravu hybridomů za použití standardních technik (Zola, H., ed., Monoclonal Antibodies, CRC Press lne., 1987). Pozitivní hybridomy se klonovaly metodou limitního ředění.

B. Přečištění mAb mAb se přečistily pomocí ProsepA (Bio Processing, Consett, UK) chromatografie podle návodu výrobce. mAb měly více než 95% čistotu podle SDS-PAGE.

C. Izotypování mAb

Všechny krysí a myší mAb byly izotypovány za použití komerčně dostupných kitů (Zymed, Amersham) a bylo zj ištěno, že náleží do třídy IgG 1 kappa.

Příklad 2: Testy

A. Biotinylace IL-18

IL-18 se biotinyloval za použití kitu zakoupeného od Molecular Probes, lne., za použití poměru 10:1 biotinylačního činidla. Biotinylace neměla žádný vliv na aktivitu IL-18.

B. Testování hybridomů

96-jamkové plotny byly potaženy streptavidinem (2 pg/m, 100 pg/jamku v PBS) inkubací přes noc při teplotě 4 °C. Roztok se potom aspiroval a nespecifická vazebná místa se blokovala 250 pg/jamku 1% hovězího sérového albuminu (BSA) v TBS pufru (50mM Tris, 150mM NaCl, 0,02% Kathon, pH 7,4) po dobu 5-60 minut při teplotě místnosti. Po tomto a každém dalším kroku se plotna promyla 4-krát v promývacím pufru (lOmM Tris, 150mM NaCl, 0,05% Tween 20, 0,02% Kathon, pH 7,4). Do každé jamky se přidalo 100 pl biotin-IL—18 (100 ng/ml) v testovacím pufru (0,5% BSA, 0,05% hovězí gamma-globulin, 0,1% Tween 40, 20pM kyselina diethylentriaminpentaoctová v TBS pufru) a plotny se inkubovaly přes noc po dobu 30 minut při teplotě místnosti v inkubátoru za třepání. Potom se do každé jamky přidalo 50 pl hybridomového média a 50 pl testovacího pufru a provedla se inkubace po dobu 60 minut při teplotě místnosti v inkubátoru za třepání. Do každé jamky se potom přidalo 100 pl 0,5 pg/ml Bu³⁺ značené antimyší nebo anti-krysí protilátky v testovacím pufru. Nakonec se přidalo 200 pg/jamku zesilovacího činidla (Wallac) a provedla se inkubace po dobu 5 minut při teplotě místnosti a měřila se fluorescence v čase. Hybridomy s hodnotami > 100 K se expandovaly do 24 jamkových ploten.

- 17CZ 303704 B6

C. Imunotesty

Pro stanovení specificity připravených anti-IL-18 mAb se 96-jamkové plotny potáhly, bloko5 vály se a inkubovaly se s biotinem-IL18 způsobem uvedeným výše. Všechny následující inkubace se provedly v inkubátoru za třepání při teplotě místnosti. Po promytí jamek 50 μΐ IL—18 (3 pg/ml) nebo testovacím pufrem se přidalo 50μΜ mAb a provedla se inkubace po dobu 60 minut. Po promytí jamek se na dobu 60 minut přidalo 100 μΐ 0,5 μβ/ηιΐ Bu³⁺ značené antimyší nebo anti-krysí protilátky v testovacím pufru a jamky se potom promyly 100 μΙ/jamku zesiio lovacího činidla (Wallac) a provedla se inkubace po dobu 5 minut při teplotě místnosti a měřila se fluorescence v čase. Všechny pozitivní hybridomy vykazovaly odstranění vazby IL—18.

D. Neutralizační test

PBMC od zdravých dárců se izolovaly Ficol-Paque (Pharmacia) gradientem a kultivovaly se v 96-jamkových plotnách v 10% PBS DMEM/F12 médiu s 1 μg/ml ConA (Sigma) za přítomnosti IL—18 (5 ng/ml) a/nebo mAb. Po 18 hodinové kultivaci při teplotě 37 °C, 5% CO₂ ve vzduchu, 90% vlhkosti, se odebralo 25 μΐ média a koncentrace interferonu gamma (IFNg) se měřila imunotestem. Výsledky, získané z průměru 3 pokusů, jsou shrnuty v tabulce 1.

E. Měření afinity monoklonální protilátky

Afinita přečištěných mAb se měřila pomocí BIAcore optického biosenzoru (Pharmacia Biosensor, Uppsala, Sweden) za použití průtoku 30 μΙ/min. Data kinetíky se hodnotila pomocí vztahů popsaných dříve (Karlsson et al., J. Immunol. Meth. 145: 229-240 (1991), která jsou zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti. mAb (ředěné v HBS pufru, lOmM HEPES, 150mM NaCI, 0,01% Tween-20, pH 7,4) se inj i kovaly přes králičí anti-myší IgG Fc nebo kozí anti-krysí IgG Fc povrch a potom se pufr nechal protékat a zaznamenávala se RU. Potom se po dobu 180 sekund injikoval IL—18 (ředěný v HBS pufru) a pufr se nechal protékat po dobu 500 sekund a zaznameso návaly se RU. Povrch sensorového čipu se regeneroval injekcí 0,lM kyseliny fosforečné. Vstupní hodnoty (Kass) a výstupní hodnoty (Kdiss) vazby se vypočetly za použití BÍAcore softwaru a společně vedly k zisku rovnovážné konstanty (K_D) 12xl0“⁹M pro mAb 13G9, 3,9xl0“^llM pro mAb 2C10a 1,5 x 10 ^,θΜ pro mAb 14B7. Viz tabulka 1.

F. Analýza epitopu monoklonální protilátky

Analýza epitopů přečištěných mAb byla měřena v BIAcore. Při použití průtoku 10 μΙ/min se inj i kovala první mAb (ředěná v HBS pufru) přes králičí anti-myší IgG Fc nebo kozí anti-kiysí IgG Fc povrch a potom se provedla injekce IL—18 na dobu 240 sekund a injekce blokovacích mAb po dobu 48 hodin a injekce druhé mAb po dobu 240 sekund. Povrch se regeneroval injekcí 0,lM kyseliny fosforečné a RU se zaznamenávaly po každé injekci. Bylo zjištěno, že mAb 13G9, 2C10 a 14B7 mají podobné nebo překrývající se epitopy.

- 18CZ 303704 B6

Tabulka 1: Afinita a neutralizační aktivita mAb reaktivních s lidským IL—18

mAb	Kd (pM)~	Neutralizace IC=Q (nM)to
2C10 (krysí)	39	0,1
14B7 (krysí)	150	0,2
13G9 (myší)	12000	3,0

^a Určeno analýzou optickým biosensorem (BIAcore) (25 °C) ^b Inhibice produkce IFN-gamma (v nM) PBMC v reakci na 5 ng/ml lidského IL—18.

Příklad 3: CDR sekvence io Klonování genu a analýza sekvence:

Geny variabilních těžkých a lehkých řetězců se klonovaly z hybridomových buněk za použití standardních molekulárně biologických metod, kteréjsou stručně popsány dále. Celková RNA se izolovala z hybridomových buněk za použití TRIzol činidla (Life Technologies kat.

č. 15596-026) podle návodu výrobce. RNA se reverzně transkribovala pomocí RT-PCR kitu podle návodu výrobce (Boehringer Mannheim kat. č. 1483-188) za použití póly—dT oligonukleotidu pro priming. Po syntéze prvního řetězce cDNA se těžké a lehké V regiony amplifikovaly PCR za použití 3' primerů specifických pro konstantní region a degenerovaných 5' prtmerů. Degenerované 5'—příměrové sekvence se navrhly tak, aby kódovaly dříve určené N—koncové aminokyselinové sekvence variabilních regionů těžkého nebo lehkého řetězce. Kompletní sekvence z mnoha klonů se získaly z každé PCR amplifikace a sestavily se tak, aby byla získána konvenční sekvence. Tak je prvních 17 baží DNA sekvence pro těžké a lehké řetězce generováno PCR prímerem, nicméně translatovaná proteinová sekvence je přirozená.

Nukleotidové a odvozené aminokyselinové sekvence pro hybridomové protilátky 200, 13G9 a 14B7 jsou uvedeny na obr. 1-6. V každém případě jsou CDR ajejich kódující nukleotidové sekvence orámečkované. Degenerované příměrové sekvence jsou uvedeny tučně.

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Krysí neutralizační monoklonální protilátka, kteráje specifická pro lidský ínterleukin-18, zahrnující regiony určující komplementaritu CDRL1 ze SEQ ID NO: 4, CDRL2 ze SEQ ID

   35 NO: 6, CDRL3 ze SEQ ID NO: 8, CDRH1 ze SEQ ID NO: 12, CDRH2 ze SEQ ID NO: 14 a CDRH3 ze SEQ ID NO: 16 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,9 x 10‘^HM.
2. 2. Monoklonální protilátka podle nároku 1, která zahrnuje aminokyselinovou sekvenci variabil40 ní oblasti lehkého řetězce SEQ ID NO: 2 a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce SEQ ID NO: 10.
3. 3. Hybridom, který produkuje monoklonální protilátku podle nároku 2.

   45
4. 4. Humanizovaná protilátka specifická pro lidský interleukin-18, zahrnující regiony určující komplementaritu CDRL1 ze SEQ ID NO: 4, CDRL2 ze SEQ ID NO: 6, CDRL3 ze SEQ ID NO: 8, CDRH1 ze SEQ ID NO: 12, CDRH2 ze SEQ ID NO: 14 a CDRH3 ze SEQ ID NO: 16 a mající vazebnou afinitu charakterizovanou disociační konstantou rovnou nebo menší než 3,9 x 10“ⁿM.

   -39CZ 303704 B6
5. 5. Chimérická protilátka specifická pro lidský interleukin—18, která zahrnuje aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti lehkého řetězce SEQ ID NO: 2 a aminokyselinovou sekvenci variabilní oblasti těžkého řetězce SEQ ID NO: 10.

   5 6. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje protilátku podle nároku 4 nebo 5 a farmaceuticky přijatelný nosič.

   7. Použití protilátky podle nároku 4 nebo 5 pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčbu stavů spojených s autoimunitním onemocněním.

   io

   8. Použití podle nároku 7, kde uvedeným onemocněním je roztroušená skleróza.

   9. Použití podle nároku 7, kde uvedeným onemocněním je revmatoidní artritida nebo diabetes mellitus typu 1 závislý na inzulínu.

   10. Použití podle nároku 7, kde uvedeným onemocněním je zánětlivé onemocnění střevní.

   11. Použití podle nároku 7, kde uvedeným onemocněním je psoriáza.

   20 12. Izolovaná sekvence nukleové kyseliny, která je vybrána ze skupiny, kterou tvoří:

   (a) sekvence nukleové kyseliny kódující protilátku podle nároku 4;

   (b) sekvence nukleové kyseliny komplementární k (a);

   (c) sekvence nukleové kyseliny kódující protilátku podle nároku 5;

   25 (d) sekvence nukleové kyseliny komplementární k (c); a (e) sekvence nukleové kyseliny kódující sekvence nukleové kyseliny vybrané ze skupiny sestávající ze sekvence nukleové kyseliny kódující variabilní oblast lehkého řetězce protilátky se SEQ ID NO: 2 a sekvence nukleové kyseliny kódující variabilní oblast těžkého řetězce protilátky se SEQ ID NO: 10.

   13. Způsob pro hodnocení přítomnosti nebo nepřítomnosti lidského IL-18 u člověka, vyznačující se tím, že zahrnuje kontaktování monoklonální protilátky podle nároku I se vzorkem biologické kapaliny získaným od pacienta za podmínek, při kterých se tvoří komplex IL—18 / monoklonální protilátka, a detekci přítomnosti nebo nepřítomnosti uvedeného komplexu

   35 IL— 18 / monoklonální protilátka.

   14. Způsob pro diagnostiku autoimunitního onemocnění, vyznačující se tím, že zahrnuje krok určení množství lidského IL—18 ve vzorku získaném od pacienta způsobem podle nároku 13, a srovnání tohoto množství s průměrným množstvím lidského IL—18 v normální popu40 láci, kde přítomnost významně vyššího množství lidského IL18 u pacienta ukazuje na přítomnost autoimunitního onemocnění.
6. 6 výkresů

   -40CZ 303704 B6

   VkZclO

   1 0 30 1 D z Q M T 0 S P A S L Ξ A S L 15 GAC ATT CAA ATG ACC CAG TCT CCA GCT TCC CTG TCT GCA TCT CTG CTG TAA GTT TAC TGG GTC AGA GGT CGA AGG GAC AGA CGT AGA GAC CDRI 50 7 0 90 16 G E T V Ξ I E C L A S E D I Y 30 GGA GAA ACT GTC TCC ATC GAA TGT CTG GCA AGT GAG GAC ATA TAC CCT CTT TGA CAG AGG TAG CTT ACA GAC CGT TCA CTC CTG TAT ATG

   1 10 13 0 31 T Y L T W Y Q Q K P G K s P Q 45 ACT TAT TTA ACA TGG TAT CAG CAG AAA CCA GGG AAA TCT CCT CAA -TGA ATA AAT TGT ACC ATA GTC GTC TTT GGT CCC TTT AGA GGA GTT

   CDRII

   150 _ , ....... _ 1 70

   46 L CTC GAG L CTG GAC I ATC TAG Y TAT ATA G GGT CCA A GCA CGT N AAT TTA K AAG TTC L TTG AAC Q CAA GTT D GAT CTA G GGG CCC V GTC CAG P CCA GGT S TCA AGT 60 19 0 210 61 R F S G S G S G T Q Y s L K I 75 CGG TTC AGT GGC AGT GGA TCT GGC ACA CAG TAT TCT CTC AAG ATC GCC AAG TCA CCG TCA CCT AGA CCG TGT GTC ATA AGA GAG TTC TAG 2 30 25 0 270 76 £ G I Q P E D E G D Y F C L Q 90 AGC GGC ATA CAA CCT GAA GAT GAA GGG GAT TAT TTC TGT CTA CAG TCG CCG TAT GTT GGA CTT CTA CTT CCC CTA ATA AAG ACA GAT GTC

   CDRIII

   2 90.

   G S K F P L T GGT TCC AAG TTT CCG CTC ACG CCA AGG TTC AAA GGC GAG TGC

   31 0

   FGSGTKLE 105 TTC GGT TCT GGG ACC AAG CTG GAG AAG CCA AGA CCC TGG TTC GAC CTC

   106 ϊ K R 108 ATC AAA CGG TAG TTT GCC

   Obr. 1

   -41 CZ 303704 B6

   VH2CI0

   1 0 30 E v Q L Q 0 S G A E L V R P G GAG GTC CAG CTA CAO CAG TCT GGG GCT GAG CTT GTG AGA CCT GGG CTC CAG GTC GAT GTC GTC AGA CCC CGA CTC GAA CAC TCT GGA CCC

   50 7 0 90 T S V K L S C K v S G E I Ξ T ACC TCT GTG AAG TTA TCT TGC AAA GTT TCT GGC GAA ATA AGT ACA TGG AGA CAC TTC AAT AGA ACG TTT CAA AGA CCG CTT TAT TCA TGT

   CDRI

   3 Y Y F H 3GA TAC TAT TTC CAC CCT ATG ATA AAG GTG

   1 10 13 O

   FVRRRPGQGL TTT GTG AGG CGA AGG CCT GGA CAG GGT CTG AAA CAC TCC GCT TCC GGA CCT GTC CCA GAC

   CDRTI

   E w 1 G 150 1 70 R I D P £ D D S T K. Y GAA TGG ATA GGA AGG ATT GAT CCT GAG GAT GAT AGT ACT AAA TA1 CTT ACC TAT CCT TCC TAA CTA GGA CTC CTA CTA TCA TGA TTT ATA

   1 9 fl 210 E R F K D R A T L T A Q T S aCT GAG AGG TTC AAA GAC AGG GCG ACG CTC ACT GCA CAA ACA TCC :ga CTC TCC AAG TTT CTG TCC CGC TGC GAG TGA CGT GTT TGT AGG 2 30 25 0 270 s N T A Y L N L 5 S L T S £ D TCC AAC ACA GCC TAC CTG AAC CTC AGC AGC CTG ACC TCT GAG GAC AGG TTG TGT CGG ATG GAC TTG GAG TCG TCG GAC TGG AGA CTC CTG

   2 90 31 0 T A T Y F C T T W R I Y R D S ACT GCA ACT TAT TTT TGT ACC ACA TGG CGG ATA TAC CGA GAT AGl TGA CGT TGA ATA AAA ACA TGG TGT ACC GCC TAT ATG GCT CTA TCÍ

   CDRIXI

   330

   S G R P F Y V M D A TCT GGC CGC CCC TTC TAT GTT ATG GAT GCC AGA CCG GCG GGG AAG ATA CAA TAC CTA CGG

   3 50

   W G Q G A TGG GGT CAA GGA GCT ACC CCA GTT CCT CGA

   37 0

   S V Τ V S S 126

   TCA GTC ACT GTC TCC TCA AGT CAG TGA CAG AGG AGT

   Obr. 2

   -42CZ 303704 B6

   Vkl3g9

   1 0 30 1 D V V M T Q T P L S L P V S L GAC GTT GTT ATG ACT CAA ACT CCT CTC TCC CTG CCT GTC AGT CTT CTG CAA CAA TAC TGA GTT TGA GGA GAG AGG GAC GGA CAG TCA GAA CDR I 50 7 0 90 16 G D Q A S I S C R S S Q s L V GGA GAT CAA GCC TCC ATC TCT TGC AGA TCT AGT CAG AGC CTT GTA CCT CTA GTT CGG AGG TAG AGA ACG TCT AGA TCA GTC TCG GAA CA^r' 1 10 13 0 31 H S N G N T Y L H W Y L Q K ? CAC AGT AAT GGA AAC ACC TAT TTA CAT TGG TAC CTG CAG AAG CCA GTG TCA TTA CCT TTG TGG ATA AAT GTA ACC ATG GAC GTC TTC GGT

   CDR II

   150 1 70 46 G Q S P K L L X Y K v S N R F GGC CAG TCT CCA AAG CTC CTG ATC TAC AAA GTT TCC AAC CGA TTT CCG GTC AGA GGT TTC GAG GAC TAG ATG TTT CAA AGG TTG GCT AAÍ

   19 0 210 61 5 G V P D R F S G S G S G T D PCT GGG GTC CCA GAC AGG TTC AGT GGC AGT GGA TCA GGT ACA GAT kGA :CCC CAG GGT CTG TCC AAG TCA CCG TCA CCT AGT CCA TGT CTA 2 30 25 0 270 76 F T L K I S R V E A E I> L G V TTC ACA CTC AAG ATC AGC AGA GTG GAG GCT GAG GAT CTG GGA GTT AAG TGT GAG TTC TAG TCG TCT CAC CTC CGA CTC CTA GAC CCT CAA CDR III 2 90 31 0 91 Y F C s Q S T H v P p Y T F G TAT TTC TGC TCT CAA AGT ACA CAT GTT CCT CCG TAC ACG TTC GGA ATA AAG ACG AGA GTT TCA TGT GTA CAA GGA GGC ATG TGC AAG CCT 330 106 G G T K L E 1 K R 114 GGG GGG ACC AAG CTG GAA ATA AAA CGG CCC CCC TGG TTC GAC CTT TAT TTT GCC

   105

   -43CZ 303704 B6

   VH13G9

   1 0 30 Q V T L K E S G P G I L K P S CAA GTT ACT CTT AAG GAG TCT GGC CCT GGG ATA TTG AAG CCC TCA GTT CAA TGA GAA TTC CTC AGA CCG GGA CCC TAT AAC TTC GGG AGT

   50 7 0 90 Q T L S L T c S F S G F S L S CAG ACC CTC AGT CTG ACT TGT TCT TTC TCT GGG TTT TCT CTG AGC GTC TGG GAG TCA GAC TGA ACA AGA AAG AGA CCC AAA AGA GAC TCG 1 10 13 0 T S G M G I A W V R Q P S G K ACT TCT GGT ATG GGT ATT GCC TGG GTT CGT CAG CCT TCA GGG AAG TGA AGA CCA TAC CCA TAA CGG ACC CAA GCA GTC GGA AGT CCC TTC 150 1 70 G L E W L A D I W W D D N R Y GGT CTG GAG TGG CTG GCA GAC ATT TGG TGG GAT GAT AAT AAG ΤΑΊ CCA GAC CTC ACC GAC CGT CTG TAA ACC ACC CTA CTA TTA TTC AT?

   11 0 210 r N P S L E S Q 1» T I S K D T DAT AAT CCA TCC CTG GAG AGC CAG CTC ACA ATC TCC AAG GAT ACC kTA TTA GGT AGG GAC CTC TCG GTC GAG TGT TAG AGG TTC CTA TGG 2 30 25 0 270 S R N Q V F L T I T S V D T A TCC AGA AAC CAG GTA TTC CTC ACG ATC ACC AGT GTG GAC ACT GCA AGG TCT TTG GTC CAT AAG GAG TGC TAG TGG TCA CAC CTG TGA CGT 2 90 31 0 D s A T Y Y c A R H H Y D G S GAT TCT GCC ACT TAT TAC TGT GCT CGT CAT CAT TAC GAC GGT AGl CTA AGA CGG TGA ATA ATG ACA CGA GCA GTA GTA ATG CTG CCA TC? 730 3 50 S L L P M D Y W G Q G T S V T AGC CTC CTG CCT ATG GAC TAC TGG GGT CAA GGA ACC TCA GTC ACC TCG GAG GAC GGA TAC CTG ATG ACC CCA GTT CCT TGG AGT CAG TGG

   V S S 123

   GTC TCC TCA

   CAG AGG AGT

   Obr. 4

   -44CZ 303704 B6

   Vkl4B7

   10 30

   1 D I Q M T Q S P A S L S A S L 15 GAT ATT CAA ATG ACG CAG TCT CCA GCT TCC CTG TCT GCA TCT CTG CTA TAA GTT TAC TGC GTC AGA GGT CGA AGG GAC AGA CGT AGA GAC

   50 S TCC AGG I ATC TAG E GAA CTT 7 C TGT ACA 0 CDR I 90 30 16 G GGA CCT £ GAA CTT T ACT TGA V GTC CAG L CTA GAT A GCA CGT S AGT TCA E GAG CTC D GAC CTG I ATA TAT Y TAC ATG 1 10 13 0 31 s Y L A W Y Q Q K P G K S P Q 45 AGT TAT TTA GCA TGG TAT CAA CAG AAG CCA GGG AAA TCT CCT CAG TCA ATA AAT CGT ACC ATA GTT GTC TTC GGT CCC TTT AGA GGA GTC 150 CDR II 3 . 70 46 L L T Y A T K R L Q D G V P S 60 CTC CTG ATC TAT GCC ACA AAA AGG TTG CAA GAT GGG GTC CCA TCA GAG GAC TAG ATA CGG TGT TTT TCC AAC GTT CTA CCC CAG GGT AGT 19 0 210 Sl R P S G S G s G T Q Y S L K I 75 CGG TTC AGT GGC : AGT GGA TCT GGC ACA CAG TAT TCT CTC AAA ATA GCC AAG TCA CCG i TCA CCT AGA CCG TGT GTC ATA AGA GAG TTT TAT

   2 30 25 0 270 76 S D Q P E D E G D Y p C L Q AGC GAC ATG CAA CCT GAA GAT GAA GGG GAT TAT TTC TGT CTA CAG TCG CTG TAC GTT GGA CTT CTA CTT CCC CTA ATA AAG ACA GAT GTC CDR III 2 90 31 0 91 N s K F P V T F G S G T K L E AAT TCC AAG TTT CCG GTC ACG GGT TCT GGG ACC AAG CTG GAG TTA AGG TTC AAA GGC CAG TGC AAG CCA AGA CCC TGG TTC GAC CTC

   105

   106 I K R 108 ATC AAA CGG TAG TTT GCC

   Obr. 5

   -45 CZ 303704 B6

   VH14B7

   1 E GAG CTC 1 0 Q CAG GTC S TCT AGA G GGG CCC A GCT CGA 30 E GAG CTC L CTT GAA V GTG CAC R AGA TCT P CCT GGA G GGG CCC 15 v GTT CAA Q CAG GTC L CTT GAA Q CAG GTC 50 7 0 90 16 T Ξ V K F s C K V S G D T P T 30 ACC TCT GTG AAG TTT TCT TGC . AAA GTT TCT GGC GAT ACC CCT ACA TGG AGA CAC TTC AAA AGA ACG TTT CAA AGA CCG CTA TGG GGA TGT CDR I 1 10 13 i 0 31 T Y Y V H F v R Q R P G Q G L 45 ACA TAC TAC GTG CAC TTT GTG AGA CAA AGG CCT GGA CAG GGT CTG TGT ATG ATG CAC GTG AAA CAC TCT GTT TCC GGA CCT GTC CCA GAC 150 1 70 CDR II 46 E W I G R I D P E D T S T K Y 60 GAA TGG ATA GGA AGG ATT GAT CCT GAG GAT ACT AGT ACT AAA TAT CTT ACC TAT CCT TCC TAA CTA GGA CTC CTA TGA TCA TGA TTT ATA 19 0 210 61 A E K F R N K A T F T A D P S 75 GCT GAG AAG TTC AGA AAT AAG GCG ACA TTC ACT GCA GAT CCA TCC CGA CTC TTC AAG TCT TTA TTC CGC TGT AAG TGA CGT CTA GGT AGG 2 30 25 0 270 76 S N T A Y L N L s S L T P E D 90 TCC AAC ACA GCC TAC CTA AAC CTC AGC AGC CTG ACC CCT GAG GAC AGG TTG TGT CGG ATG GAT TTG GAG TCG TCG GAC TGG GGA CTC CTG 2 90 31 0 91 T A T Y F C T I M R Y H S T Y 105 ACT GCA ACC TAT TTT TGT ACC ATA ATG CGG TAC CAT AGT ACC TAT TGA CGT TGG ATA AAA ACA TGG TAT TAC GCC ATG GTA TCA TGG ATA CDR III 330 3 50 106 R V Y V M D F W G Q G T A V T 120 AGG GTC TAT GTT ATG GAT TTC TGG GGT CAA GGA ACT GCA GTC ACT TCC CAG ATA CAA TAC CTA AAG ACC CCA GTT CCT TGA CGT CAG TGA

   121 V S 122 GTC TCC TC CAG AGG AG