CZ304941B6 - Prostředek s obsahem antigenu pro sublingvální podávání pro poskytnutí slizniční a systémové imunitní odpovědi - Google Patents

Abstract

Použití prostředku obsahujícího alespoň jeden antigen a glykolipidovou adjuvantní látku pro přípravu léčiva pro sublingvální podávání pro poskytnutí slizniční a systémové imunitní odpovědi a použití pro přípravu léčiva pro léčení nebo prevenci nebo snížení vnímavosti vůči bakteriální infekci, virové prionové infekci, autoimunitě, rakovině, sliznicí přenášenému onemocnění nebo alergii u člověka nebo zvířete.

Description

Prostředek s obsahem antigenů pro sublingvální podávání pro poskytnutí slizniční a systémové imunitní odpovědi

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká způsobu vytvoření slizniční a systémové imunitní odpovědi za použití zejména, ne však výhradně, sublingválně (pod jazyk) podávaného prostředku pro použití jako profylaktické nebo léčebné vakcíny při imunizaci, nebo při léčbě alergie.

Dosavadní stav techniky

Imunitní systém se specificky rozvíjel k určení a odstranění cizího nebo nového materiálu z těla hostitele. Tento materiál může být virového, bakteriálního nebo parazitárního původu a může se usadit vně či uvnitř buněk hostitele, nebo může být nádorového původu. Může také pocházet z jiných zdrojů a patogenně nebo vnitřně nepoškozovat veškeré subjekty.

Slizniční imunitní systém (MIS, mucosal immune systém) sestává z lymfoidní tkáně v epiteliální výstelce a přímo pod ní v respiračním, genitourinámím a gastrointestinálním traktu, stejně jako přímo pod kanálkovým systémem slinných, slzných a prsních žláz. Prvotním produktem MIS je IgA.

Vakcinace je nejlépe známou a nejúspěšnější aplikací imunologického principu na lidské zdraví. Přirozeně, aby byla použita a osvědčila se, musí být vakcína účinná a účinnost všech vakcín se čas od času kontroluje. Účinnost vakcíny ovlivňuje mnoho faktorů. Vakcína se například obvykle podává subkutánně (podkožně) nebo intramuskulámě (do svalu). Nedávno bylo pro podání léčebných protialergických vakcín použito podání sublingvální (pod jazyk). Účinná vakcína musí indukovat příslušnou imunitu, pokud se týká kvantitativních a kvalitativních účinků a být stálá při skladování. Zejména u neživých vakcín je často nezbytné posílit jejich imunogenost pomocí adjuvantní látky. Ta může být rovněž použita u některých živých, například oslabených vakcín. Adjuvantní látkou je sloučenina, která zvyšuje imunitní odpověď vůči antigenů.

Během prací na výrobě zvířecího antiséra pro humánní léčbu bylo ve 20. letech minulého století zjištěno, že určité látky, zejména hlinité sole, přidané k antigenům nebo emulze, začleňující antigen, vysoce zvyšují produkci protilátek, to znamená, působí jako adjuvantní látky. Hydroxid hlinitý je stále široce používán například se záškrtovým toxoidem a tetanovým toxoidem a nerozpustný tyrosin se používá s některými vakcínami proti alergii. Požadované účinky, jako je indukce zvýšené imunitní odpovědi nebo vzbuzení odpovědi například typu TH1, mají rovněž další rozpustnější adjuvantní látky.

3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A je známý z GB-A 2 220 211 (Ribi). Chemicky se může jednat o směs 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A s 4-, 5- nebo 6-acylovanými řetězci aje nyní vyráběn firmou Corixa Corporation. Upřednostňovaná forma 3-de-O-acylovaného monofosforyllipidu A (nazývaného zde rovněž MPL® adjuvans) je popsána v mezinárodní patentové přihlášce WO 92/16 556.

Mezinárodní patentový spis WO 98/44 947 popisuje prostředek pro použití v desenzitizační léčbě pacientů trpících alergií, který obsahuje volitelně modifikovaný alergen, tyrosin a 3-de-O-acylovaný monofosforyllipid A.

Vytvoření lepších adjuvantních látek, zejména pro odpovědi zprostředkované buňkami T, bylo věnováno značné úsilí, ale mělo by být zdůrazněno, že málo z těchto pozdějších adjuvantních látek je už přijatelných pro rutinní humánní použití. Adjuvantní látka MPL® byla ovšem chráněna

- 1 CZ 304941 B6 pro použití s vakcínou vůči melanomu a vakcíny proti alergii obsahující adjuvans MPL® jsou dostupné jako „Specials“ v Německu, Itálii a Španělsku.

WO 00/50 078 (Chiron) popisuje prostředek, který zahrnuje biologicky adhezivní látky v kombinaci s adjuvantními látkami a antigeny k podání na sliznici. Ovšem prokazuje pouze vytváření imunitní odpovědi IgG tímto prostředkem. Biologicky adhezivní látka je činidlo, které se fyzikálně nebo chemicky váže na hlen. Předpokládá se, že mohou existovat bezpečnostní ohledy, spojené s takovou biologickou adhezi některých prostředků s obsahem antigenu. Podání pod jazyk zde není uvedeno, testovaný prostředek byl podáván intranasálně (na nosní sliznici).

Je zřejmé, že se stále projevuje potřeba takových prostředků, které vyvolávají slizniční a systémovou imunitní odpověď k ochraně proti bakteriím, virům a jiným parazitickým organismům, a které by mohly být použity jako vakcína proti alergii. V ideálním případě by takový prostředek měl být podáván cestou, která je spojena s ochotou pacienta spolupracovat, jako je podání pod jazyk. Bylo rovněž zjištěno, že sublingvální podání může poskytnout rychlou absorpci a dobrou biologickou dostupnost podávané látky. Sublingvální podání může být také výhodné k udržení příslušných koncentrací v krvi spíše než periodické injikace podávané látky. Prostředek by měl s výhodou používat běžně dostupné adjuvantní látky.

Předkládaný vynález se týká sublingválně podávaného systému a vykazuje výhody, spojené s tímto způsobem podávání. Konkrétněji autoři vynálezu nyní zjistili, že je možné použít glykolipidovou adjuvantní látku, jako je MPL® adjuvans, společně s antigenem k vytvoření slizniční imunitní odpovědi (MIR) při sublingválním podání. Předpokládají, že jsou první, kteří vystihli, že použití glykolipidové adjuvantní látky při sublingválním podání může vytvořit systémovou IgG odpověď, stejně jako slizniční odpověď zprostředkovanou IgA. Překvapivě rovněž zjistili, že slizniční imunitní odpověď, MIR, může být vyvolána v místě, které je vzdálené místu sublingválního podání, stejně jako v místě podání samém. IgA může být například detegován v dalších lymfoidních tkáních, jako v intestinálním traktu, respiračním traktu a v genitourinámím traktu. To má zvláště důležité důsledky pro léčbu například sexuálně přenosných onemocnění, neboť sublingvální podání je přijatelné a může se tedy setkávat s ochotou pacienta při jakémkoli režimu dávkování.

Předpokládá se, že účinek adjuvantních látek spočívá zejména ve dvou aktivitách: přetrvávající koncentrací antigenu v místě, kde jsou lymfocyty nebo jiné kompetentní buňky vystaveny antigenu („depotní efekt“) a v indukci cytokinů, které regulují funkci lymfocytů. Žádné nástroje, jako liposomy a imunitu-stimulující komplexy (ISCOMS), nemohou dosáhnout stejného účelu, tj. zajištění, aby na ně přichycené antigeny byly dodány k buňkám, předkládajícím antigen. Předpokládá se, že bakteriální produkty, jako mykobakteriální buněčné stěny, endotoxin a podobně působí stimulačně na tvorbu cytokinů. Indukce cytokinů může být zvláště výhodná u pacientů se sníženou imunitou, kteří často nereagují na normální vakcíny. Je naděje, že taková indukce cytokinů by mohla být užitečná i pro nasměrování imunitní odpovědi do požadovaného směru, například u chorob, u nichž je žádoucí pouze odpověď buněk TH1 nebo TH2 (Roitt se spoluautory, Immunology, 4. vydání).

Autoři vynálezu rovněž poskytují antigenní prostředek, který může ovlivnit rovnováhu TH1-TH2 ve prospěch odpovědi TH1 a který může být podáván na sliznici s výhodou v ústech a zejména v místě pod jazykem. Tento prostředek je vhodný k imunoterapii, zejména v oboru vakcín. Je vhodný také ke studiu imunitních odpovědí a k vytváření protilátek.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká použití prostředku obsahujícího alespoň jeden antigen a glykolipidovou adjuvantní látku pro přípravu léčiva pro sublingvální podávání pro poskytnutí slizniční a systémové imunitní odpovědi.

-2CZ 304941 B6

Vynález se dále týká použití pro přípravu léčiva pro léčení nebo prevenci nebo snížení vnímavosti vůči bakteriální infekci, virové prionové infekci, autoimunitě, rakovině, sliznicí přenášenému onemocnění nebo alergii u člověka nebo zvířete.

Ve svém nejširším pojetí se předkládaný vynález týká zjištění, že glykolipidy budou vyvolávat systémovou a slizniční humorální odpověď vůči antigenů, pokud bude prostředek s jejich obsahem podán člověku nebo zvířeti sublingválně (pod jazyk). Autoři vynálezu zjistili, že může být použita jakákoliv sublingválně podávatelná pomocná látka. Schopnost glykolipidové adjuvantní látky vyvolat při sublingválním podání spolu s antigenem vznik sérového IgG, IgGl a IgG2 ukazuje, že vynález je použitelný v proíylaktických vakcínách i pro alergickou desensitizaci. Schopnost glykolipidové adjuvantní látky vyvolat po sublingválním dávkování slizniční IgA kromě toho ukazuje, že vynález je vhodnou cestou k vyvolání slizniční imunity. Vyvolání slizniční imunity je vhodné zejména k ochraně vůči vzduchem přenášeným patogenům a vůči sexuálně přenosným chorobám.

Obecně se předkládaný vynález týká prostředku, obsahujícího A) alespoň jeden antigen a B) glykolipidovou adjuvantní látku a použití takového prostředku.

Popisuje se způsob vytvoření slizniční a/nebo systémové imunitní odpovědi u člověka nebo zvířete, který nebo které to potřebuje a tento způsob zahrnuje podávání prostředku, obsahujícího alespoň jeden antigen a glykolipidovou adjuvantní látku.

Z jiné stránky se předkládaný vynález týká použití alespoň jednoho antigenů a glykolipidové adjuvantní látky pro přípravu léčiva k vytvoření slizniční a/nebo systémové imunitní odpovědi.

Popisuje se způsob léčení sliznicí přenášené choroby, zahrnující sublingvální podání, člověku nebo zvířeti, prostředku, obsahujícího alespoň jeden antigen a glykolipidovou adjuvantní látku.

Z ještě jiné stránky se předkládaný vynález týká použití alespoň jednoho antigenů a glykolipidové adjuvantní látky k výrobě sublingválně podavatelného léčiva k léčbě sliznicí přenášených chorob.

Tyto způsoby mohou vytvářet imunitní odpověď zprostředkovanou IgA.

Popisuje se také způsob vytváření imunitní odpověď zprostředkované IgA u lidí nebo zvířat, přičemž tento způsob zahrnuje sublingvální podání prostředku, který obsahuje alespoň jeden antigen a glykolipidovou adjuvantní látku.

Z jiné stránky se předkládaný vynález týká použití alespoň jednoho antigenů a glykolipidové adjuvantní látky k výrobě sublingválně podavatelného léčiva k vyvolání imunitní odpovědi zprostředkované IgA.

Prostředek by měl být podáván v účinném množství. Výraz „účinné množství“ se vztahuje k netoxickému, ale dostatečnému množství prostředku k poskytnutí požadované imunologické odpovědi. Příslušné účinné množství může být stanoveno odborníkem v oboru.

Prostředky mohou být buď profylaktické (tj. předcházející infekci), nebo léčebné (k léčbě choroby po infekci).

Prostředek podle předkládaného vynálezu může vytvářet také imunitní odpověď, zprostředkovanou IgG.

Podle jednoho aspektu předkládaného vynálezu je zde poskytnut prostředek obsahující:

-3 CZ 304941 B6 (A) jeden nebo více antigenů; a (B) glykolipidovou adjuvantní látku.

Ve zvláště upřednostňovaném ztělesnění je glykolipidem adjuvantní látka, indukující odpověď TH1.

Prostředek podle předkládaného vynálezu s výhodou obsahuje sublingválně podavatelné ředidlo, pomocnou látku nebo nosič, napomáhající biologické dostupnosti složek (A) a (B) v místě podání (sliznice pod jazykem).

Antigen je s výhodou zvolen z bakteriálního, virového, prionového, novotvarového, autoantigenního, rostlinného, zvířecího nebo jiného patogenního či nepatogenního organismu, syntetického nebo rekombinantního materiálu.

Antigen může zahrnovat vybrané části antigenních molekul, nebo molekul vyrobených syntetickými či rekombinantními postupy.

Antigenem je s výhodou alergen. Alergeny jsou takové typy antigenů, které mají sklon indukovat alergii. Alergen může obsahovat vybrané části alergenních molekul, nebo molekul vyrobených syntetickými či rekombinantními postupy.

V tomto popisu výrazy antigen nebo antigeny zahrnují výrazy alergen nebo alergeny.

Antigen je s výhodou ve formě polypeptidu, sacharidu nebo lipidu. Alternativně může být antigen ve formě vektoru, obsahujícího polynukleotid, kteiý kóduje antigenní polypeptid a uvedený polynukleotid je operativně vázaný na regulační sekvenci, která reguluje expresi zmíněného polynukleotidu.

Adjuvantní látkou, indukující odpověď TH1, je s výhodou, ne však výhradně, MPL® adjuvans, 3D-MPL nebo jeho derivát či sůl, nebo se jedná o některou jinou adjuvantní látku indukující odpověď TH1 anebo kombinace takových adjuvantních látek.

Prostředek je s výhodou ve formě vakcíny.

Prostředek je s výhodou ve formě vodného roztoku, gelu, náplasti, pastilky, tobolky nebo tablety a nejvýhodněji se jedná o vodný nebo gelový roztok.

Předkládaný vynález také poskytuje prostředek pro použití k výrobě léčiva pro léčbu nebo prevenci bakteriální, virové, prionové infekce nebo jiných chorob jako je rakovina, autoimunitní onemocnění nebo alergie u člověka nebo zvířete.

Vynález dále poskytuje použití prostředku ve způsobu vytváření jedné nebo více protilátek, rozpoznávající zmíněný antigen. Vytvářené protilátky mohou být použity k výrobě léčiva pro léčbu bakteriální nebo virové infekce, rakoviny, autoimunitního onemocnění nebo alergie u člověka či zvířete. Předkládaný vynález je zvláště důležitý ve vztahu ke vzduchem přenášeným patogenům a sexuálně přenosným chorobám.

Předkládaný vynález dále poskytuje způsob výroby antiséra nebo z něho vytvořeného imunoglobulinového přípravku, přičemž tento způsob zahrnuje imunizaci člověka nebo zvířete prostředkem podle předkládaného vynálezu.

Předkládaný vynález také poskytuje způsob výroby prostředku podle vynálezu, zahrnující smísení roztoku antigenů a glykolipidové adjuvantní látky s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem, nebo pomocnou látkou, s výhodou vodným roztokem nebo gelem.

-4CZ 304941 B6

Různé další upřednostňované rysy a ztělesnění předkládaného vynálezu budou nyní popsány jako příklady, na něž se vynález neomezuje.

Imunitní odpověď

Imunitní odpověď je selektivní odpovědí, poskytovanou imunitním systémem obratlovců, při níž jsou vůči proniknuvším mikroorganismům, parazitům, transplantované tkáni a mnoha jiným látkám, které jsou rozpoznány jako tělu cizí, tj. antigeny, vytvářeny specifické protilátky a/nebo cytotoxické buňky. Vytváření protilátek, které obíhají v krvi, je známo jako humorální odpověď; vytváření cytotoxických buněk je pak známo jako buněčně zprostředkovaná nebo buněčná imunitní odpověď.

Buňky, zahrnuté v imunitním systému, jsou k účinnějšímu plnění jejich funkcí organizovány do tkání a orgánů. Tyto struktury jsou souhrnně nazývány jako lymfoidní systém. Lymfoidní systém zahrnuje lymfocyty, účinné látky (makrofágy a buňky předkládající antigen) a v některých případech i epiteliální buňky. Je uspořádán buď do odděleně opouzdřených orgánů, nebo shluků difuzní lymfoidní tkáně. Hlavní lymfoidní orgány a tkáně jsou klasifikovány buď jako primární (centrální), nebo sekundární (periferní). Předkládaný vynález se zaměřuje na sekundární lymfoidní orgány. Sekundární lymfoidní orgány zahrnují se sliznicí spojené tkáně a poskytují prostředí, v němž mohou lymfocyty vzájemně reagovat s účinnými buňkami a s antigeny.

Konkrétněji po vytvoření lymfoeytů v primárních lymfoidních orgánech (lymfopoezi) následuje jejich migrace do periferních sekundárních tkání. Sekundární lymfoidní tkáně zahrnují dobře organizované opouzdřené orgány - slezinu a lymfatické žlázy - a neopouzdřené shluky, které se nacházejí v celém těle. Velké množství neorganizované lymfoidní tkáně se nachází ve spojení se slizničními povrchy a je označováno jako se sliznicí spojená lymfoidní tkáň, MALT (mucosaassociated lymphoid tissue).

Slizniční systém chrání organismus vůči antigenům, vstupujícím do těla přímo přes epitelové slizniční povrchy. Proto lze nalézt lymfoidní tkáně spojené s povrchy střevního traktu, dýchacího traktu a genitourinámího traktu. Předkládaný vynález se zvláště týká lymfoidních tkání, spojených s povrchovou vrstvou sublingvální oblasti. Hlavní účinný mechanismus v těchto místech je sekreční IgA (sigA), vylučovaný přímo na epiteliální slizniční povrch nebo trakt.

Sekreční IgA představuje přes 95 % veškerého imunoglobulinu, který se nachází v sekretech a primárně se jedná o dimemí formu, dvou monomemích jednotek, kovalentně spojených řetězcem J. Dimemí IgA se váže na polymerní imunoglobulinový receptor pIGR na bazálním povrchu epitelových slizničních buněk. Tento komplex IgA-plGR je endocytován a přenášen k apikálnímu (luminálnímu) povrchu epitelové buňky. Během tohoto přenosu je malý kus pIGR odštěpen a zbývající složka je nově nazývána sekreční složkou IgA je tedy vylučován jako dimemí IgA, vázaný na sekreční složku.

Sekreční IgA neaktivuje systém komplementu, ale pokrývá bakterie a viry jako jsou poliovirus, coxsakcie, rotavirus a herpesvirus, čímž zabraňuje jejich adhezi k vrstvě slizničního epitelu. Některé viry ve slizničním epitelu mohou být také neutralizovány prostřednictvím pIGR, intemalizovaným IgA.

Vytvoření sekrečního IgA a tedy vyvolání slizniční imunitní odpovědi (nazývané zde MIR) může být detegováno za použití postupů, které jsou v oboru obvyklé, jako je stanovení ELISA. Jako příklad je popsaný v příkladu výroby 1 pouze standardizovaný ovalbuminový test ELISA, použitý v příkladech 1 a 2.

-5 CZ 304941 B6

Slizniční imunitní odpověď vůči antigenů může vést ke stavu systémové odpovědi na tento antigen, což je známo jako slizniční nebo orální snášenlivosti. Slizniční imunizace je tedy účinným způsobem, jak stimulovat místní i systémovou imunitní odpověď.

Antigen

Historicky byl výraz „antigen“ v oboru používán pro jakoukoliv molekulu, indukující buňky B k vytváření specifické protilátky. Nyní však lze tento výraz použít k označení jakékoliv molekuly, která může být specificky rozpoznána adaptivními prvky imunitní odpovědi, tj. buňkami B buňkami T nebo oběma typy buněk. Výraz „antigen“ je tedy v oboru chápán jako označení molekuly, která reaguje s přeformovanou protilátkou a/nebo s různými specifickými receptory na buňkách T a buňkách B. Tato definice zahrnuje i látky, tradičně známé jako „alergeny“, tj. činidlo, například pylový prášek, které vyvolává imunoglobulinem E zprostředkovanou přecitlivělost.

Alergie (přecitlivělost typu I) je odpovědí na okolní antigen (alergen), při níž se u alergických subjektů, ve srovnání s nealergickými osobami, vytvářejí v poměrně značeném množství protilátky IgE aje spojena zejména se žímými buňkami a bazofily. Reakce bezprostřední přecitlivělosti je vytvářena produkty žímých buněk (histaminem a podobně), které jsou uvolněny po reakci mezi IgE na povrchu žímé buňky nebo bazofilu a alergenem vyvolávajícím astma, sennou rýmu, sérové onemocnění, systémovou anafylaxi nebo kontaktní dermatitidu. Existují čtyři typy přecitlivělosti (typ I, II, III a IV). Typ II a III jsou protilátkové zprostředkované a čtvrtý typ je zprostředkován pouze buňkami T a makrofágy. Vynález umožňuje imunizaci jedince alergenem k přesměrování alergické imunitní odpovědi zprostředkované IgE směrem k nealergické imunitní odpovědi.

„Antigenem“, užitým v předkládaném vynálezu, může tedy být „alergen“, získaný z jakékoliv látky vyvolávající alergii, jako je pyl (například pyl břízy nebo ambrosie) jídlo, hmyzí jed, plíseň, zvířecí srst nebo roztoči v domácím prachu (D. farinae nebo D. pteronissinuš).

Antigen, použitý v předkládaném vynálezu, je s výhodou imunogenem, tj. antigenem, který aktivuje imunitní buňky k vytváření imunitní odpovědi vůči němu samému.

V upřednostňovaném ztělesnění se předkládaný vynález týká prostředku pro použití jako vakcína a antigenem je antigen, hodící se do takové vakcíny.

Antigenem, použitým v předkládaném vynálezu, může být jakýkoliv vhodný antigen, který je dostupný nebo se může stát dostupným.

Typ antigenů, použitého ve vakcíně, závisí na mnoha faktorech. Obecně je výhodnější, pokud je ve vakcíně více mikrobiálních antigenů a živoucí organismy bývají účinnější než usmrcené. Výjimkou z tohoto pravidla jsou onemocnění, u nichž je za jakýkoliv patogenní účinek odpovědný toxin. V takovém případě může být vakcína založena na samotném toxinu nebo toxoidu.

Antigen použitý v předkládaném vynálezu může být získán z kteréhokoliv živého organismu; z intaktních nebo neživých organismů; ze subbuněčných fragmentů; z toxoidů; z antigenů na bázi rekombinantní DNA nebo anti-idiotypů nebo syntetických antigenů. Antigen může být získán z přírodních nebo oslabených organismů, které mohou být virové nebo bakteriální. Antigen může být typu kapsulámího polysacharidu, povrchového nebo vnitřního antigenů. Pokud se jedná o antigen na bázi rekombinantní DNA, může být získán z klonovaného nebo exprimovaného genu nebo čisté DNA.

Antigen může být modifikován reakcí například se síťujícím činidlem, jako je dialdehyd a konkrétněji glutaraldehyd.

-6CZ 304941 B6

Mikroorganismy, vůči nimž jsou vakcíny dostupné nebojsou dosud hledány, zahrnují například kmeny Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Próteus, Yersinia, Vibrio, Aeromonas, Pasteurella, Pseudomonas, Acinetobacter, Moraxella, Flavobacterium, Bordetella, Actinobacillus, Neisseria, Brucella, Haemophilus a Escheria coli.

Upřednostňované vakcíny zahrnují kravské neštovice (pro pravé neštovice); hraboší bakterii pro tuberkulózu; dětskou obrnu; spalničky, příušnice; zarděnky; žlutou zimnici; varicellu-zoster; BCG; vzteklinu; chřipku; hepatitidu typu A; tyfus; černý kašel; tyfoid; choleru; mor; pneumokok; meningokok; Haemophylus influensae·, hepatitidu typu B; hepatitidu typu C; tetanus a záškrt. Na toxinu založené vakcíny zahrnují Clostridium tetani, Coryne bacterium, diphtheriae, Vibrio cholerae a Clostridium perfringens.

Jiná hlavní onemocnění, vůči nimž mohou být úspěšné vakcíny, zahrnují: HTV, herpetické viry, adenoviry, rhinoviry, stafylokoky, stafylokoky skupiny A, onemocnění způsobená mikroorganismy Micobacterium leprae, Treponema pallidum, Chlamydia, Candida, Pneumocystis, malárii, trypanosomiázu, Chagasovu chorobu; schistostomózu a onchocerkózu.

Sexuálně přenosné choroby, pro něž mohou být přínosné vakcíny, zahrnují kromě výše zmíněných HIV a herpetických chorob onemocnění způsobená mikroorganismy: Neisseria gonorrhoea, Treponema pallidum, Trichomonas vaginalis, Haemophylus ducreyi, Chlamydia, Calimmatobacterium granulomatis a hepatitidu.

Prokázána byla rovněž přítomnost nádorových antigenů a jako výsledek vznikl koncept vakcínace proti rakovině. V principu mohou být také koncepce a implantace přerušeny indukováním imunity vůči široké škále těhotenských a jiných reproduktivních hormonů.

Antigenem bude typicky polypeptid, ale použity mohou být rovněž jiné antigenní struktury, jako nukleové kyseliny, sacharidy, tuky, celé nebo oslabené organismy jako viry, bakterie nebo prvoci.

Výraz „polypeptid“ je obecně použit k označení molekul, sestavených z množství aminokyselin, přičemž aminokyseliny jsou vzájemně kovalentně vázány, jako prostřednictvím peptidových vazeb. Obecně je výraz „polypeptid“ používán záměrně s výrazem bílkovina nebo peptid, aniž by zahrnoval rozdíl ve velikosti nebo funkci. Rekombinantní polypeptidy mohou být připraveny způsoby, které jsou v oboru dobře známé, jako jsou ty, popsané Sambrookem se spoluautory v „Molecular Cloning: A laboratory manual“; 2. vydání, Cold Spring Harbor Lab. Press 1989. Glykolipidová adjuvantní látka

Obecně je adjuvantní látkou taková látka, která nespecificky zvyšuje imunitní odpověď vůči antigenu, tj. je imunostimulantem. Glykolipid je obecně tuková, lipidová molekula buněčné membrány se sacharidovým řetězcem, připojeným na hydrofobní strukturu. Upřednostňovanými glykolipidovými adjuvantními látkami podle předkládaného vynálezu jsou modifikované lipopolysacharidy. Lipopolysacharid je modifikován tak, že jeho toxicita je snížena ve srovnání s odpovídajícím neupraveným typem lipopolysacharidů nebo s polysacharidem, od něhož byl odvozen. Glykolipidovou adjuvantní látkou, používanou v předkládaném vynálezu, je s výhodou detoxifikovaný enterobakteriální lipopolysacharid nebo jeho složka lipidu A. Výraz „detoxifikovaný“ se vztahuje jak na zcela netoxické mutanty toxinu, tak i na mutanty s nízkou zbytkovou toxicitou. Detoxifikovaná adjuvantní látka si s výhodou zachovává toxicitu menší než 0,01 % a lépe menší než 0,001 % vzhledem k odpovídajícímu neupravenému typu toxinu. Toxicita může být měřena v buňkách CHO stanovením jejich morfologických změn.

Glykolipidovou adjuvantní látkou je s výhodou adjuvantní látka indukující TH1. Adjuvantní látkou indukující TH1 míní autoři vynálezu adjuvantní látku, mající vlastnosti, které zvyšují odpověď typu TH1 na antigen. Taková adjuvantní látka ovšem může mít také sklon jednoduše

-7CZ 304941 B6 zvyšovat hladinu produkovaných protilátek nebo antigenně specifických buněk, nebo dokonce, indukcí modulujících cytokinů, vyvolat anergii (neodpovídavost) určitých buněčných populací.

Konkrétněji je imunitní odpověď vůči antigenů obecně zprostředkována buď buňkami T (které mohou zahrnovat zabíječské buňky), nebo humorálně (produkcí protilátek po rozpoznání epitopů antigenů). Typ produkce cytokinů buňkami T zastoupenými v imunitní odpovědi může ovlivnit to, který z uvedených typů odpovědi převládne: například buněčné zprostředkovaná imunita (TH1) je charakterizována vysokou produkcí interleukinu-2 (IL-2) a interferonu γ (IFN-γ), ale nízkou produkcí IL-4. Oproti tomu humorální imunita (TH2) se může projevit nízkými hladinami IL-2 a IFN-γ a vysokými hladinami ILM, IL-13 a IL-5. Odpovědi jsou obvykle modulovány na úrovni sekundárních lymfoidních orgánů nebo buněk, takže farmakologické ovlivnění typu specifických buněk T a cytokinů buněk předkládajících antigen může ovlivnit typ a rozsah vyvolané imunitní odpovědi.

Rovnováha mezi TH1 a TH2 se vztahuje k vnitřní konverzi nebo převládnutí dvou různých forem pomocných buněk T. Tyto dvě formy mají široký rozsah a často opačné účinky na imunitní systém. Pokud imunitní odpověď upřednostňuje buňky TH1, potom budou takové buňky vytvářet buněčnou odpověď s připojenou produkcí protilátek, zatímco buňky TH2 budou vytvářet protilátkově dominantní odpověď. Izotyp protilátek, zodpovědných za některé alergické reakce, IgE a s ním spojené zánětlivé odpovědi jsou indikovány cytokiny z buněk TH2.

Účinnost adjuvantní látky jako adjuvantní látky indukující TH1 může být stanovena určením profilu protilátek namířených vůči antigenů a vzniklých po podání tohoto antigenů ve vakcínách, které také zahrnují různé adjuvantní látky.

Adjuvantní látkou je s výhodou modifikovaný lipopolysacharid. Silným imunostimulátorem jsou enterobakteriální lipopolysacharidy (LPS), jak je popsáno v patentu US 4 912 094. Mohou ovšem vyvolat také škodlivou a někdy až fatální odpověď. Nyní je známo, že endotoxické aktivity, spojené s LPS, vyplývají z jeho složky tvořené lipidem A. Podle předkládaného vynálezu je mnohem výhodněji používán detoxifikovaný derivát lipidu A. Firma Corixa Corporation vyrábí derivát lipidu A, původně známý jako přečištěný detoxifikovaný endotoxin (RDE, refined detoxified endotoxin), nyní však známý jako monofosforyllipid A (MPL® adjuvans). Adjuváns MPL® může být vyráběno refluxováním (varem pod zpětným chladičem) LPS nebo lipidu A, získaných z heptózu nevykazujících mutantů gramnegativních bakterií (například kmene Salmonella), v roztocích minerální kyseliny střední síly (například 0,1 mol χ Γ¹ HC1) po dobu přibližně 30 minut. Toto působení má za následek ztrátu fosfátu v poloze 1 na redukčním konci glukosaminu. Kromě toho může být během tohoto působení odstraněn sacharid jádra z polohy 6' neredukujícího glukosaminu. Adjuvans MPL® a 3-deacylovaný monofosforyllipid A, stejně jako způsoby jejich výroby, jsou uvedeny v patentech US 4 436 727 a US 4 912 094 a osvědčení o opětném průzkumu Bl

912 094.

výhodou se ovšem používá modifikovaný LPS nebo lipid A, kde si detoxifikovaný lipid A uchovává částici jádra připojenou v poloze 6' neredukujícího glukosaminu. Takové deriváty LPS a lipidu A jsou rovněž popsány v patentu US 4 912 094. Konkrétněji patent US 4 912 094 předkládá modifikovaný lipopolysacharid, který se získá způsobem selektivního odstranění pouze beta-hydroxymyristilového acylového zbytku lipopolysacharidu, kterýje esterově vázán na redukující konec glukosaminu v poloze 3' zmíněného lipopolysacharidu a tento způsob zahrnuje podrobení zmíněného lipopolysacharidu alkalické hydrolýze. Takto de-O-acylovaný monofosforyllipid A (MPL® adjuvans), difosforyllipid A (DPL) a LPS mohou být použity v předkládaném vynálezu. V upřednostňovaném ztělesnění tedy předkládaný vynález používá MPL® adjuvans, DPL nebo LPS, jejichž poloha 3' redukujícího konce glukosaminu je de-O-acylována. Tyto sloučeniny jsou známé jako 3D-MPL, 3D-DPL a 3D-LPS.

V patentu US 4 987 237 jsou popsány deriváty MPL® adjuvans mající vzorec:

-8CZ 304941 B6

OPO₃H₂

kde R¹ a R² jsou vodíkový atom, R³ je rovný nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec, složený z C, H a volitelně z O, N a S, které pokud se vyskytují ve větším počtu, mohou být stejné nebo odlišné; přičemž celkové množství uhlíkových atomů nepřekračuje 60 a kruh představuje jádro MPL. Derivát MPL® adjuvans může mít alternativně vzorec

HO

II

-N—R—C H jx° > HO

z.

-opo₃h₂ kde segment derivátu, představovaný strukturou

O

II

H—N—R—CH

Jx obsahuje 2 až 60 atomů uhlíku a R³ je rovný nebo rozvětvený uhlovodíkový řetězec, sestávající z C, H a volitelně z O, N a S, které pokud se vyskytují ve větším počtu, mohou být stejné nebo odlišné; xje nejméně 1 a může být jakýmkoliv celým číslem tak, aby celkový počet uhlíkových atomů ve všech x segmentech nepřevyšoval 60; chemická struktura každého substituentu R³ může být stejná nebo odlišná v každém takovém segmentu a kruhová struktura představuje jádro MPL.

Jedna obchodně dostupná adjuvantní látka firmy Corixa Corporation zahrnuje 2 % skvalenu, 0,2 % Tween 80 (monooleát polyoxyethylensorbitanu) a MPL® adjuvans.

Jinou obchodně dostupnou adjuvantní látkou je adjuvans Detox® (Corixa Corporation), které obsahuje MPL® adjuvans a kostru mykobakteriální buněčné stěny.

V předkládaném vynálezu mohou být použity veškeré takové deriváty, nebo sole LPS nebo lipidu A, které jsou nebo se stanou dostupné. Upřednostňovanými deriváty a solemi jsou takové, které jsou farmaceuticky přijatelné.

Adjuvantní látka, indukující TH1, může být smísena sjinými složkami prostředku bezprostředně před podáním. Jinou možností je její formování spolu sjinými složkami během výroby produktu. Alternativně může být podávána v jiné době než jiné složky. Podávání se může provádět mnoha způsoby. Glykolipidová adjuvantní látka se s výhodou podává v množství od 1,0 do 250 mg a lépe od 25 do 50 mg.

Vakcíny

Jeden aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu indukování imunologické odpovědi, s výhodou slizniční imunologické odpovědi u savců, s výhodou u lidí, který zahrnuje sublingvální

-9CZ 304941 B6 očkování jedince prostředkem podle předkládaného vynálezu k vytváření protilátky, s výhodou IgA, a/nebo imunitní odpovědi buněk T. Taková odpověď je s výhodou dostatečná k ochraně zmíněného jedince proti infekci, zvláště proti bakteriální nebo virové infekci. Odpověď je s výhodou dostatečná k ochraně zmíněného jedince proti onemocnění, ať už je takové onemocnění u tohoto jedince předem rozvinuté, nebo nikoliv. Imunologická odpověď tedy může být použita léčebně nebo profylakticky.

Vakcíny mohou být vyrobeny z prostředku podle předkládaného vynálezu. Výroba vakcín, obsahujících antigen jako aktivní složku, je odborníkům v oboru známa. Typicky se takové vakcíny vyrábějí buď jako kapalné roztoky, nebo suspenze; připraveny mohou být rovněž pevné formy, vhodné k rozpuštění nebo suspendování v kapalině před jejich podáním. Přípravek může být také ve formě gelu či emulze, nebo ho lze zapouzdřit do liposomu. Vhodnými pomocnými látkami jsou například voda, fosforečnan amonný, dextróza, glycerol, ethanol a podobně nebo kombinace takových látek.

Prostředky zahrnují takové běžně používané pomocné látky jako jsou například mannitol, laktóza, škrob, stearan hořečnatý, sodná sůl sacharinu, celulóza, uhličitan hořečnatý a podobně ve farmaceutické čistotě. Prostředky nabývají formy roztoků, suspenzí, tablet, pilulek, tobolek, prostředků s prodlouženým uvolňováním nebo prášků a obsahují 10% až 95% aktivní složky, s výhodou pak 25 až 70 % aktivní složky. Pokud je vakcinační prostředek lyofilizován, může být lyofilizovaný materiál rekonstituován před podáním, například jako suspenze. Rekonstituce se s výhodou provádí v pufru.

Kromě toho, pokud je to žádoucí, může vakcína obsahovat malá množství přídavných látek, jako jsou smáčedla nebo emulgátory, pufrační činidla a/nebo další adjuvantní látky, které zvyšují účinnost vakcíny.

Podíl antigenů a adjuvantní látky se může měnit v širokém rozmezí za předpokladu, že jsou obě složky přítomné v účinných množstvích. Vakcíny jsou typicky formovány tak, aby obsahovaly konečnou koncentraci antigenů v rozmezí od 0,2 do 200 pg/ml, lépe od 5 do 50 pg/ml a nejlépe přibližně 15 pg/ml. Upřednostňované přípravky mohou být stanoveny podle známého protokolu rozmezí dávek, přičemž odkaz lze nalézt v práci: Remington, The Science and Practice of Pharmacy, Mack Publishing Company, 19. vydání, 1995.

Po zformování může být vakcína začleněna do zásobníku, který může být sterilní a poté ho lze uzavřít a skladovat při nízké teplotě, například 4 °C, nebo může být lyofilizována. Lyofilizace umožňuje dlouhodobé skladování ve stabilizované formě.

Antigeny, použité ve vynálezu, mohou být do vakcíny formovány v neutrální formě nebo ve formě solí. Farmaceuticky přijatelné sole zahrnují kyselé adiční sole (formované s volnými aminovými skupinami peptidů), které jsou vytvářeny s anorganickými kyselinami jako například kyselinou chlorovodíkovou nebo fosforečnou, nebo s organickými kyselinami, jako s kyselinou octovou, šťavelovou, vinnou a maleinovou. Sole, formované s volnými karboxylovými skupinami, mohou být odvozeny také od anorganických bází jako například hydroxidu sodného, draselného, amonného, vápenatého nebo železitého a takových organických bází jako izopropylaminu, trimethylaminu, 2-ethylaminoethanolu, histidinu a procainu.

Prostředek může být předkládán jako tableta, tobolka nebo jiný vhodný přípravek spolu s pomocnými látkami, které jsou potřebné k vytvoření takového přípravku.

Příprava protilátek za použití prostředku podle vynálezu

Prostředky podle tohoto vynálezu mohou být použity přímo jako imunogeny za využití zde popsaných způsobů podávání, bez použití dalších adjuvantních látek k vytvoření antisér, specific-10CZ 304941 B6 kých imunoglobulinů nebo monoklonálních protilátek. Vynález tedy poskytuje způsob indukování antigenně specifické produkce imunoglobulinu, zahrnující kroky, v nichž se:

a) zvíře imunizuje prostředkem podle předkládaného vynálezu; a

b) získá ze séra imunizovaného zvířete imunoglobulin, specifický vzhledem k oblasti antigenů prostředku;

c) vyberou buněčné klony, produkující monoklonální protilátku.

Postupy k vytváření protilátek jsou popsány v práci Cohlera a Milsteina, Nátuře 256, 495 -497, 1975.

Zvířaty, použitými k produkci protilátky, mohou být jakákoliv zvířata, která se běžně užívají k tomuto účelu, zvláště savci. Přednost se dává zvláště myším, potkanům albínům, morčatům a králíkům. Zvířata budou ovlivňována zde popsanými prostředky.

Prostředky podle předkládaného vynálezu, obsahující antigen, mohou být použity k vytváření protilátek, a to jak polyklonálních, tak monoklonálních. Pokud jsou požadovány polyklonální protilátky, je vybraný savec (například myš, králík, koza, kůň a podobně) imunizován. Sérum imunizovaného zvířete je shromážděno a ovlivněno známými postupy. Pokud sérum obsahuje polyklonální protilátky vůči jiným antigenům, mohou být požadované polyklonální protilátky vyčištěny imunoafinitní chromatografií. Postupy k výrobě a zpracování polyklonálního antiséra jsou v oboru známé.

Monoklonální protilátky, zacílené vůči antigenům použitým ve vynálezu, mohou být odborníkem z oboru rovněž snadno vyráběny. Obecná metodologie pro přípravu monoklonálních protilátek prostřednictvím hybridomů je dobře známa. Nesmrtelné buněčné linie produkující protilátku mohou být vytvořeny buněčnou fůzí a rovněž jinými postupy, jako je přímá transformace lymfocytů B onkogenní DNA nebo transfekce virem Epsteina a Barrové. Soubory monoklonálních protilátek, produkovaných vůči antigenům, mohou být testovány vzhledem k různým vlastnostem tj. vzhledem k izotypu a epitopové afinitě.

Alternativní postupy zahrnují prověřování knihoven uvádějících „phage display“ (tj. jak se fág projevuje), přičemž fág například exprimuje na povrchu svého obalu fragmenty scFv (protilátky s jednoduchým řetězcem) s velkým množstvím doplňkových určujících regionů (CDRs, complementary determining regions). Tento způsob je v oboru dobře známý.

Protilátky, jak monoklonální tak polyklonální, které jsou zaměřeny vůči antigenům, jsou zvláště vhodné pro diagnózy a ty, které jsou neutralizující, jsou vhodné pro pasivní imunoterapii. Zejména monoklonální protilátky mohou být použity ke zvýšení anti-idiotypových protilátek. Antiidiotypové protilátky jsou imunoglobuliny, které nesou „vnitřní obraz“ antigenů infekčního činidla, vůči němu je žádoucí ochrana.

Postupy pro zvýšení anti-idiotypových protilátek jsou v oboru známé. Tyto anti-idiotypové protilátky mohou být vhodné také k léčbě, stejně jako k objasnění imunogenních oblastí antigenů.

Pro účely tohoto vynálezu, pokud není stanoveno jinak, zahrnuje výraz „protilátka“ fragmenty (části) celých protilátek, které si udržují jejich vazebnou aktivitu k cílovému antigenů. Takové fragmenty zahrnují fragmenty Fv, F(ab') a F(ab')2, stejně jako protilátky s jednoduchým řetězcem (scFv). Nadto mohou být protilátky a jejich fragmenty humanizovanými protilátkami, například jak je popsáno v EP-A 23 9400.

- 11 CZ 304941 B6

Výroba prostředku

Prostředek podle předkládaného vynálezu může být vyroben smísením vodného roztoku antigenů s glykolipidovou adjuvantní látkou a přidáním ředidla podávatelného na sliznice, pomocné látky nebo nosiče, buď před, nebo po výše zmíněném smísení. Alternativně může být glykolipidová adjuvantní látka společně vysrážená s antigenem. Tak, jako může být glykolipidová adjuvantní látka před podáním buď smísena, nebo společně vysrážená s jinými složkami prostředku, může být také podávána na odlišná místa a/nebo v odlišném čase než ostatní složky. Směs glykolipidové adjuvantní látky a antigenů může být rovněž začleněna do gelů, pilulek, tobolek a podobně, nebo může být předkládána prostřednictvím různých prostředků, jako jsou náplastě, které mohou být obousměrné nebo s výhodou jednosměrné.

MPL® (nebo jiná adjuvantní látka indukující TH1), která byla předem rozpuštěna pomocí ultrazvuku (sonikací) nebo jinými prostředky, (popsáno dále v „Příprava roztoku adjuvantní látky MPL®“) může být před přidáním k antigenům rozpuštěna různými způsoby. Příprava MPL se nejprve provádí v koncentraci typicky od 0,5 do 4 mg/ml, například 1 mg/ml. Poté může být zředěna na koncentraci od 500 do 20 pg/ml, s výhodou 100 μg/ml. Toto zředění se může provádět v čisté vodě nebo v jiných rozpouštědlech, jako ve vodném roztoku glycerolu, obsahujícím od 1 do 50 % glycerolu.

Vhodné fyziologicky přijatelné nosiče a ředidla zahrnují sterilní vodu, nebo 5% vodný roztok dextrózy. Prostředky jsou určeny pro humální nebo veterinární použití a jsou formovány pro slizniční, s výhodou sublingvální podání.

Zde popsané způsoby podání a dávkování jsou uváděny pouze jako vodítko, neboť zkušený praktik bude schopen snadno určit optimální způsob podání na sliznici a dávkování pro kteréhokoliv konkrétního pacienta za konkrétních podmínek.

Formování dávkování a podávání prostředků

Prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být vhodně formovány s farmaceuticky přijatelným ředidlem, nosičem nebo pomocnou látkou, které jsou vhodné pro sublingvální podání. Podrobnosti o farmaceutických pomocných látkách lze nalézt v: Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2. vydání, 1994, The Pharmaceutical Press, Londýn, vydavatelé Wade & Weller.

Autoři tohoto vynálezu zjistili, že důležitým aspektem předkládaného vynálezu je sublingvální podání prostředku podle předkládaného vynálezu. Lze předpokládat, že upřednostňovanou formou prostředku bude gel nebo jiný viskózní prostředek, umožňující zvýšený kontakt antigenů se sublingválním povrchem. Výsledky však mohou být dosaženy také s dalšími typy prostředku, jako je vodný roztok. U myší bylo zjištěno, že jednoduchý roztok poskytuje podobné výsledky jako gelový přípravek. Není vyžadováno a ani není žádoucí, aby se prostředek fyzikálně nebo chemicky vázal na slizniční tkáně.

Prostředky vhodné pro sublingvální podání zahrnují vodné a nevodné sterilní roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostatické sloučeniny, tekutiny, které poskytují prostředku izotoničnost s tělními tekutinami, s výhodou s hlenem jedince; vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspenzní činidla nebo zahušťovadla. Prostředky mohou být předkládány v zásobnících pro jednu nebo více dávek, například v uzavřených ampulích a lahvičkách a mohou být skladovány v lyofilizovaném stavu, vyžadujícím pouze přidání sterilního kapalného nosiče bezprostředně před použitím.

V prostředku podle vynálezu je s výhodou přítomný také nosič. Nosičem může být emulze oleje ve vodě, nebo hlinitá sůl, jako je fosforečnan hlinitý nebo hydroxid hlinitý.

-12CZ 304941 B6

Netoxické emulze oleje ve vodě ve vodném nosiči s výhodou obsahují netoxický olej, například skvalan nebo skvalen, emulgátor, například Tween 80. Vodným nosičem může být například fosfátem pufrovaný solný roztok.

Předkládaný vynález rovněž poskytuje polyvalentní vakcinační prostředek, obsahující vakcinační přípravek podle vynálezu v kombinaci s jinými antigeny, zejména antigeny vhodnými k léčbě rakoviny, autoimunitních onemocnění a odpovídajících stavů.

Nosiče mohou obecně obsahovat, ne však výhradně, dextrózu, vodu, glycerol, ethanol a kombinaci takových látek.

Vynález se dále týká farmaceutických sad a balení, obsahujících jeden nebo více ze zásobníků, naplněných jednou nebo více z přísad výše uvedených prostředků podle vynálezu.

Podání takových prostředků se může provádět ve formě mastí, past, gelů, roztoků, prášků a podobně. Gely mohou být výhodně formovány za použití karbopolu, známého také jako karbomer, karboxyvinylový polymer, nebo zahušťovadla na bázi celulózy, jako hydroxyethylcelulózy, hydroxypropylcelulózy nebo hydroxypropylmethylcelulózy, sodné karboxymethylcelulózy, vápenaté karboxymethylcelulózy, ethylcelulózy a methylcelulózy. Gely mohou být vhodně formovány také za použití klovatiny, kyseliny alginové, bentonitu, cetostearylalkoholu, želatiny, guarové gumy, křemičitanu hořečnatohlinitého, maltodextrinů, polyvinylalkoholu, propylenkarbonátu, propylenglykolalginátu, koloidního oxidu křemičitého, alginátu sodného, tragakantu a/nebo xanthanové gumy. Zvláštní přednost se dává karbopolu a činidlům na bázi celulózy.

Prostředky jsou podávány takovým způsobem, který je slučitelný s formulací dávky a v takovém množství, aby bylo profylakticky a/nebo léčebně účinné. Množství podání, které se obecně pohybuje v rozmezí od 0,5 do 250 pg antigenů na dávku, závisí na léčeném subjektu, kapacitě imunitního systému tohoto subjektu pro syntézu protilátek a na stupni požadované ochrany. Upřednostňované rozmezí je přibližně od 2 do 40 pm na dávku. V některých případech bude pacient léčen sérií podání, která bude zahrnovat zvýšené dávky antigenů.

Vhodná velikost dávky je přibližně 0,1 ml, ovšem v rámci režimu se může vycházet z nižšího objemu a končit vyšším objemem. Přesná množství podávané aktivní přísady mohou záviset na posouzení praktického lékaře a mohou být příznačné pro každý jednotlivý subjekt.

Prostředek může být podáván v jediné dávce nebo s výhodou podle schématu vícečetného dávkování. Schéma vícečetného dávkování je takové, kdy primární průběh vakcinace může probíhat v jedné až deseti oddělených dávkách, po nichž následují další dávky, podávané v následujících časových intervalech, vyžadovaných k udržení a posílení imunitní odpovědi; například během jednoho až čtyř měsíců pro druhou dávku a pokud je to potřebné, po uplynutí několika měsíců pro následující dávku či dávky. Pokud je výrobek používán k léčbě alergie, bude režim dávkování zahrnovat mnohem častější podávání. Dávkovači režim bude také, alespoň částečně, určen potřebami jedince a bude záviset na posouzení praktickým lékařem.

Kromě toho může být prostředek obsahující antigen či antigeny podáván ve spojení s jinými imunoregulačními činidly, například s imunoglobuliny.

Vynález bude nyní popsán ve vztahu k následujícím příkladům, které jsou zamýšleny jako ozřejmění a nikoliv jako omezující.

- 13CZ 304941 B6

Příklady uskutečnění vynálezu

Příprava roztoku MPL® adjuvans

Roztok 4 mg/ml sloučeniny l,2-dipalmitoyl-SN-glycero-3-fosfocholinu (DPPC) se připraví v absolutním ethanolu. Pro každý 1,0 mg soli MPL-TEA (triethylaminové soli MPL), který má být solubilizován, se k rozpuštění MPL přidá 27 μΐ DPPC. MPL lze připravit tak, jak bylo popsáno výše. Ethanol se odstraní jemným proudem dusíku, přiváděného do lahvičky. K suché směsi MPL/DPPC se přidá další 1,0 ml apyrogenní vody pro injekce na každý 1 mg MPL. Roztok se dezintegruje ultrazvukem v temperovaném sonikátoru při teplotě 60 až 70 °C až do té doby, než se stane čirým. Poté se roztok MPL/DPPC filtračně sterilizuje filtrací přes SFCA 290-4520 Nalgene 0,2 pm filtr. Roztok MPL/DPPC se asepticky naplní v množství 1,0 mg/ml do depyrogenovaných lahviček, označených MPL-AF (MPL solubilizovaný v povrchově aktivní látce DPPC) a uchovává se při teplotě 4 °C.

Přípravek sublingválního gelu ovalbuminu (XOA/MPL® adjuvans)

Indukční aktivita TH1 u myší se může rovnat produkci specifických IgG2a a IgG2b protilátek a indukční aktivita TH2 produkci specifických IgGl protilátek a IgE protilátek. Specifické sekrecní IgA protilátky mohou identifikovat, zda po sublingvální imunizaci vznikla slizniční odpověď a zda je lokální (slzné protilátky) nebo vzdálená (vaginální protilátky). Může být stanoven imunogenní potenciál prostředku, ovšem měřením pouze specifické odpovědi IgG v séru.

Proto byl, jako příklad, proveden pokus na myších k ozřejmění profilů alergenně specifických protilátek vůči ovalbuminu (XOA), který je brán jako modelový antigen a je rovněž dobře známým alergenem získaným ze slepicích vajec.

Zásobní látky

I. Zásobní roztok karbopolu TR-1 NF (0,83 %)

A. 100 mg Carbopol TR-1 NF v 20 ml vody pro injekce = 0,9 % gel (hmotnost/objem)

B. Ke složce A bylo přidáno 0,8 ml 10 % triethanolaminu (TEOA) = 0,8 % gel (hmotnost/objemu)

II. MPL AF glycerol (20 mg/ml)

A. MPL 40 mg

DPPC 4,32 mg glycerol 0,8 ml voda pro inj. dle potřeby 40 ml sonikováno k získání velikosti částic přibližně 80 nm

B. Lyofilizace

C. Rekonstituce pomocí 1,2 ml vody pro inj. a 20 mg/ml MPL.

III. Zásobní ovalbumin (33 mg/ml) ovalbumin 33 mg voda pro inj. 1,0 ml

- 14CZ 304941 B6

Injikační přípravek zásobní karbopol 1920 μΐ zásobní ovalbumin 480 μΐ glycerol 480 μΐ voda pro inj. 720 μΐ

MPL glycerol 400 μΐ

1. Karbazol, XOA, glycerol a voda pro injekce byly přidány do lahvičky o objemu 5 ml a smíšeny za použití míchadla.

2. MPL glycerol byl přidán k výše uvedené směsi a ta byla dále míchána.

Imunizace myší

Skupiny zahrnující 5 myších samic kmene Balb/C ve věku 8 týdnů byly uvedeny do anesteze prostřednictvím Ketaminu. Bezvládným zvířatům bylo aplikováno 20 μΐ příslušného gelu, obsahujícího různá množství XOA, a to pod jazyk po dobu 5 minut. Po uplynutí této doby byly gely z ústní dutiny vypláchnuty prostřednictvím 1,0 ml 0,9% solného roztoku za použití stříkačky a jehly žaludeční sondy.

Po uplynutí 3 týdnů byly myši ovlivněny stejným způsobem, jak bylo popsáno výše. Po uplynutí dalších 2 týdnů byla myším odebrána krev a byla shromážděna séra. V nich byly stanoveny specifické protilátky IgG vůči XOA za použití testu ELISA.

Výsledky

Odpovědi anti-ovalbumin-IgG u myší, jimž byl podán ovalbumin v dávce buď 83,2 pg, nebo 3,4 pg a MPL v dávce 33,6 pg v 20 pl karbopolového gelu sublingválně a zesilovací dávka byla aplikována po 3 týdnech; krev byla odebrána po dalších 2 týdnech (hodnoty průměrné optické hustoty, OD, pro skupiny 5 myší):

Hodnoty optické hustoty při různých naředěních séra

	1/10	1/30	1/90	1/270	1/610
skupina 1 dávka 83,2 pg XOA	1,1	1,0	0,75	0,5	0,3
skupina 2 dávka 3,4 pg XOA	0,6	0,5	0,35	0,15	0,05
skupina 3 jen karbopol	0,15	0,1	0,05	0,05	0,05

- 15 CZ 304941 B6

Příklad 2

Příprava materiálu pro imunizaci myší

Imunizační dávky XOA/MPL v karbopolu nebo alternativně v ředidle (vodném přípravku) bez MPL byly připraveny stejným způsobem jako v příkladu 1, kromě použití různých dávek.

Imunizace myší

1. Každé myši byla před podáním poskytnuta anesteze.

2. 20 μΐ příslušného materiálu bylo umístěno pod jazyk na dobu 5 minut. Každé ze skupin myší byla tedy podána následující množství látek v 20 μΐ:

Skupina	Antigen	MPL	Pomocná látka
1	80 pg ovalbuminu	20 pg MPL	karbopol
2	80 pg ovalbuminu	0 pg MPL	karbopol
3	0 pg ovalbuminu	160 pg MPL	karbopol
4	80 pg ovalbuminu	40 pg MPL	ředidlo

3. Materiál byl z ústní dutiny vypláchnut po uplynutí 5 minut prostřednictvím 1,0 ml 0,9% solného roztoku.

4. 3 týdny pro primární vakcinaci a opět po dalších 2 týdnech byla vakcinace opakována.

5. Myším byla odebrána krev 2 týdny po 3. aplikaci a séra byla až do použití skladována při teplotě - 20 °C. Provedeny byly také nasální a plicní výplachy a byly skladovány za stejných podmínek.

6. Séra a výplachy byly testovány na přítomnost protilátek specifických vůči ovalbuminu tak, jak bylo popsáno výše.

Výsledky

Sérové IgG protilátky specifické pro XOA filtr log2/referenční titr log2 (směrodatná odchylka, SD):

skupina	sérové IgG 1	sérové lgG2a	sérové IgG
1	0,625 (0,375)	0,35 (0,4)	0,6 (0,3)
2	0	0	0,2 (0,05)
3	0	0	0,25 (0,02)
4	0,95 (0,01)	0,85 (0,2)	1,0 (0,05)

- 16CZ 304941 B6

Geometrický průměr protilátek anti-XOA-IgA v různých tekutinách (SD):

skupina	sérum	nasal. výplach	plicní výplach
1	0	73,6(154,2)	238,5 (533,4)
2	0	0	0
3	0	0	0
4	2 291,3(2 577,1)	568,5 (395,4)	2 518,4(3 403,1)

Silná sérová odpověď IgG vůči XOA vyžaduje přidání MPL, který se zdá rovněž stimulovat odpověď typu TH1, jak ukazuje odpověď protilátek IgG2a.

Novým a neočekávaným zjištěním byla silná indukce vůči XOA specifické odpovědi IgA při použití MPL jako adjuvantní látky.

Použití karbopolu jako pomocné látky neposkytlo u myší žádnou zjevnou výhodu. Ve skutečnosti existují jednoznačné důkazy, že vodný přípravek XOA a MPL projevil ve srovnání s karbopolem vyšší imunogennost vzhledem k indukci jak IgG, tak IgA. Sem patří i přítomnost sérového IgA, pozorovaná v nepřítomnosti karbopolu. Ovšem při formování vakcín je použití pomocných látek nezbytné a karbopol může být užitečnou a vhodnou pomocnou látkou pro humální i veterinární použití.

Preparační příklad 1 - stanovení ovalbuminu testem ELISA

1. Séra (naředěná 1:2 v borátovém pufru) z každé z 5 myší v každé skupině jsou testována v testu ELISA ke stanovení titrů anti-ovalbumin-IgG nebo IgA protilátek.

2. K provedení testu ELISA je potřebné následující vybavení a materiál:

A. Destičky Immulon 2, o 96 jamkách s plochým dnem firmy Dynatech Laboratories, katal. č. 011-010-3455. 3 destičky na testovaný produkt (dostačují k duplicitnímu testování sér 10 myší.

B. Ovalbumin (z vaječného žloutku) firmy Sigma čistoty 5; zásobní roztok (1 mg/ml ve vodě pro injekce) se čerstvě připravuje při každém stanovení.

C. Čisté (autoklávované) pipetové špičky.

D. Automatické pipety o objemu 20, 100, 200 a 1 000 μΐ.

E. Osmikanálová automatická pipeta o objemu 200 μΐ.

F. Čisté (nové testovací zkumavky v délce 13 mm nebo kryozkumavky o objemu 2 ml a zásobník).

G. Parafilm nebo fólie Saran.

H. lmol χ Γ¹ roztok H₂SO₄.

- 17CZ 304941 B6

I. Křenovou peroxidázou označené sekundární protilátky anti IgG nebo anti IgA (použité v ředění 1:5 000), firmy Southern Biotechnology Associates, Inc.

J. Sada OPD: tablety o-fenylendiaminu, jedna na destičku a ředidlo. In vitro test č. 7181E firmy Abbott Labs, běžně dostupný.

K. Testovaná myší séra. Séra by měla být zředěna v poměru 1:2 borátovým pufrem pro dlouhodobé skladování.

L. Borátový pufr (BB): následující složky se rozpustí ve 4 1 sterilní vody pro injekce:

12,4 g kyseliny borité, firmy Fisher Scientific, kat. č. A73-500 0,764 g borátu sodného (boraxu), firmy Fisher Scientific, kat. č. S248-500 17,53 g chloridu sodného, firmy Fisher Scientific, kat. č. S271-500 Skladuje se při teplotě místnosti po dobu 6 měsíců.

M. Borátový pufr + 0,1 % Tween 20 (BB-T20):

ml Tween 20 (Sigma, kat. č. P—1379) se přidá do 1 1 borátového pufru a důkladně se promíchá. Skladuje se při teplotě místnosti po dobu 6 měsíců.

N. Borátový pufr-Tween 20-1% BSA (BB-BSA):

1,9 g čtyřsodné soli kyseliny ethylendiamintetraoctové, EDTA, firmy Fisher Scientific, kat. č. BP121-500 a 10 g hovězího sérového albuminu, BSA (frakce V, bez přítomnosti proteázy, firmy Boehringer Mannheim, kat. č. 100-350) se rozpustí v 1 1 BB-T20.

O. 0,05 mol χ Γ¹ uhličitanový pufrační roztok:

4,2 g NaHCO₃ a 5,3 g Na₂CO₃ se rozpustí v 1 1 redestilované vody nebo sterilní vody pro výplachy a pH se upraví na hodnotu 2,6. Skladuje se při teplotě 4 °C po dobu 3 měsíců. Před použitím se nechá ohřát na teplotu místnosti.

Ρ. Víceobj emová automatická pipeta

Q. Mixér Vortex

R. Mikrocentrifugační zásobníky

S. Odečítač destiček, schopný měřit optickou hustotu při 490 nm.

T. Inkubátorová sada pracující při 37 °C.

U. Serologické pipety o objemu 25 ml firmy Fisher Scientific.

V. Polypropylenové kónické zkumavky o objemu 15 ml firmy Fisher Sci.

W. Nádobky pro reagencie používané pro vícekanálovou pipetu.

X. Automatický promývač destiček.

-18 CZ 304941 B6

3. Postup testu ELISA

A. NAVÁZÁNÍ TESTOVANÉHO ANTIGENŮ

I. Koncentrace antigenů pro navázání na destičky používané v adjuvantním stanovení je 50 pg/ml:

2,5 ml zásobního roztoku ovalbuminu (1 mg/ml) se přidá k 47,5 ml 0,05 mol χ Γ¹ roztoku uhličitanového pufru. Toto množství dostačuje k naplnění 4 mikrotitračních destiček o 96 jamkách objemem 100 pl/jamku.

II. Destičky se poté pokryjí fólií Saran a ponechají se bez pohybu přes noc ve tmě při teplotě 4 °C.

B. NAŘEDĚNÍ SÉRA

Každý vzorek séra před zředěním a poté před přidáním na destičku krátce promíchá mixérem Vortex. K odebrání séra ze zásobních zkumavek při přípravě zředěných vzorků by měly být použity vždy nové pipetové špičky.

I. Výchozí zředění sér, získaných od myší imunizovaných adjuvantní látkou a ovalbuminem,je 1:6.

C. BLOKOVÁNÍ DESTIČEK

I. Po naředění všech vzorků sér se destička připraví důkladným protřepáním s povlékacím pufrem v nádobě.

II. Destičkou se ostře poklepe na papírový ručník k odstranění přebytku roztoku. Poté se destička trojnásobně promyje promývacím roztokem BB-T20 za použití automatického promývače destiček, naprogramovaného k promývání objemem 350 pl s prodlevou 5 sekund mezi každým promytím.

III. Za použití vícekanálové pipety se přidá 250 pl roztoku BB-BSA na jamku. Destička se uzavře a obalí fólií Saran a inkubuje se 30 minut při 37 °C.

D. NAPLNĚNÍ DESTIČKY

I. Destička se důkladně protřepe s blokačním pufrem a poté se s ní ostře poklepe na papírový ručník k odstranění přebytku roztoku.

II. Do každé jamky všech destiček se přidá 100 pl roztoku BB-BSA. Do příslušných jamek ve sloupci I se poté přidá 100 pl patřičně naředěných vzorků séra. Každý vzorek séra by měl být testován duplicitně.

III. Vzorky ve sloupci I se promíchají pipetováním objemu 100 pl osmkrát ven z jamky a zpět do jamky za použití vícekanálové automatické pipety a poté se 100 pl promíchaného roztoku přenese do jamek sloupce II. Obsah jamek sloupce II se opět promíchá stejným způsobem a 100 pl promíchaného roztoku se přenese do jamek sloupce III. Sériová ředění se opakují až do sloupce XII. Ze sloupce XII se po promíchání odstraní 100 pl promíchaného roztoku. Nyní by každá jamka mikrotitrační destičky měla obsahovat 100 pl roztoku.

- 19CZ 304941 B6

E. INKUBACE

Mikrotitrační destičky se uzavřou a překrytí Parafilmem nebo fólií Saran. Poté se inkubují 1 hodinu při 37 °C. Nenavázané protilátky se odstraní postupem popsaným v kroku 3a a destičky se opět trojnásobně promyjí roztokem BB-T20.

F. KONJUGACE

I. Konjugát peroxidázou značených protilátek anti IgG se připraví naředěním těchto protilátek v poměru 1:5 000 v roztoku BB-BSA (10 μΐ protilátek v 50 ml roztoku BB-BSA v kónické zkumavce o objemu 50 ml). Zkumavka se více než 20x převrátí a promíchává se za pomocí míchadla Vortex po dobu 30 sekund k důkladnému promísení. Poté se zředěné protilátky vlijí do čisté reagenční nádoby. Konjugát anti IgA může být připraven odpovídajícím způsobem.

II. Do každé jamky mikrotitrační destičky se přidá 100 μΐ roztoku konjugátu, a to včetně kontrolních jamek.

III. Destička se uzavře a inkubuje se 1 hodinu při 37 °C.

IV. Roztok konjugátu se odstraní a destička se trojnásobně promyje stejným způsobem jako v kroku 3 a.

G. VÝVOJ ZABARVENÍ

I. Substrátové/kolorimetrické činidlo se připravuje 10 až 15 minut před použitím (aby mělo čas se dostatečně rozpustit) rozpuštěním 3 tablet vyvíjejících optickou hustotu v 30,4 ml substrátového pufru za použití fólií zakryté polypropylenové kónické zkumavky o objemu 50 ml.

II. Reakční činidlo se prostřednictvím vícekanálové automatické pipety přidává do každé jamky v množství 100 μΐ. Inkubace probíhá 15 minut při teplotě místnosti.

III. Ukončení reakce se provádí po 15 minutách přidáním 50 μΐ 1 mol x Γ¹ roztoku kyseliny sírové do každé jamky prostřednictvím vícekanálové automatické pipety.

H. ODEČÍTÁNÍ DESTIČEK

I. Reakci v jamkách jednotlivých destiček je nutné ukončit nikoliv současně ale následně, s prodlevou 1 až 2 minut mezi jednotlivými destičkami, tak, aby doba mezi ukončením reakce a odečtením optické hustoty byla u všech destiček souhlasná (po ukončení reakce na poslední destičce se odečítá optická hustota v první destičce pomocí příslušného zařízení při 490 nm. Druhá destička je odečítána o 1 až 2 minuty později a třetí destička rovněž o 1 až 2 minuty později).

I. URČENÍ TITRU IMUNOGLOBULINU

Titr každého ze sérových vzorků je definován jako převrácená hodnota prvního sériového dvojnásobného zředění majícího hodnotu optické hustoty větší nebo rovnou dvojnásobku pozadí. Hodnoty optické hustoty u kontrolních zvířat byly pro každé zředění zprůměrovány a u každé skupiny byla stanovena průměrná hodnota titru.

Claims (13)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Použití prostředku obsahujícího alespoň jeden antigen a glykolipidovou adjuvantní látku pro přípravu léčiva pro sublingvální podávání pro poskytnutí slizniční a systémové imunitní odpovědi.
2. 2. Použití podle nároku 1, kde slizniční imunitní odpověď je vytvářena v místě distálně vzhledem k místu sublingválního podávání, stejně jako lokálně v místě sublingválního podávání.
3. 3. Použití podle nároku 1 nebo 2, při kterém je poskytována imunitní odpověď IgA.
4. 4. Použití podle některého z nároků 1 až 3, při kterém je poskytována imunitní odpověď IgG.
5. 5. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 4, kde prostředek dále obsahuje sublingválně podávatelné ředivo, excipient nebo nosič.
6. 6. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, kde glykolipidová adjuvantní látka je adjuvantní látka indukující TH1.
7. 7. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde antigenem je alergen.
8. 8. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 7, kde antigen je odvozený z bakteriálního, virového, prionového, nádorového, autoantigenního, zvířecího, rostlinného, rekombinantního, nebo syntetického materiálu.
9. 9. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 8, kde antigen je ve formě polypeptidu.
10. 10. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 6, kde antigen je ve formě vektoru obsahujícího polynukleotid, který kóduje antigenní polypeptid, a kde uvedený polynukleotid je operativně navázaný na regulační sekvenci, která reguluje expresi uvedeného polynukleotidu.
11. 11. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 10, kde glykolipidová adjuvantní látka je zvolená z adjuvans 3de-O-acylovaný monofosforyllipid nebo jejich derivátu nebo soli.
12. 12. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 11, kde prostředek je ve formě vodného roztoku, gelu, tobolky, pilulky nebo tablety.
13. 13. Použití podle kteréhokoli z nároků 1 až 12 pro přípravu léčiva pro léčení nebo prevenci nebo snížení vnímavosti vůči bakteriální infekci, virové prionové infekci, autoimunitě, rakovině, sliznicí přenášenému onemocnění nebo alergii u člověka nebo zvířete.