CZ305786B6 - Způsob detekce alergenních proteinů a peptidů - Google Patents
Způsob detekce alergenních proteinů a peptidů Download PDFInfo
- Publication number
- CZ305786B6 CZ305786B6 CZ2011-223A CZ2011223A CZ305786B6 CZ 305786 B6 CZ305786 B6 CZ 305786B6 CZ 2011223 A CZ2011223 A CZ 2011223A CZ 305786 B6 CZ305786 B6 CZ 305786B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- peptide
- protein
- milk
- peptides
- ige
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 229
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 176
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 174
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 106
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 85
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 80
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 172
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 claims abstract description 70
- 239000008267 milk Substances 0.000 claims abstract description 70
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 claims abstract description 70
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims abstract description 58
- 235000020247 cow milk Nutrition 0.000 claims abstract description 51
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 claims abstract description 50
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 43
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 29
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 claims description 88
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 claims description 88
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 claims description 46
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 31
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 18
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims description 5
- 238000000539 two dimensional gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims 1
- 210000003979 eosinophil Anatomy 0.000 abstract description 23
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 abstract description 9
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 abstract description 9
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 abstract description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract description 8
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000013566 allergen Substances 0.000 description 81
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 67
- 230000007815 allergy Effects 0.000 description 54
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 53
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 49
- 229960004784 allergens Drugs 0.000 description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- 102000004407 Lactalbumin Human genes 0.000 description 29
- 108090000942 Lactalbumin Proteins 0.000 description 29
- 235000021241 α-lactalbumin Nutrition 0.000 description 29
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 21
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 21
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 17
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 description 14
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 description 14
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 14
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 14
- 208000009793 Milk Hypersensitivity Diseases 0.000 description 13
- 201000010859 Milk allergy Diseases 0.000 description 13
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 12
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 12
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 10
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 10
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- -1 BLGB Proteins 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 7
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 7
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 7
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 241000283725 Bos Species 0.000 description 5
- 101000946384 Homo sapiens Alpha-lactalbumin Proteins 0.000 description 5
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000009534 blood test Methods 0.000 description 5
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 5
- 238000000132 electrospray ionisation Methods 0.000 description 5
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 235000013350 formula milk Nutrition 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 4
- 239000013574 grass pollen allergen Substances 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000010181 skin prick test Methods 0.000 description 4
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 102000009366 Alpha-s1 casein Human genes 0.000 description 3
- 108050000244 Alpha-s1 casein Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 102000010445 Lactoferrin Human genes 0.000 description 3
- 108010063045 Lactoferrin Proteins 0.000 description 3
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 3
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 3
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 3
- 235000020251 goat milk Nutrition 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N l-phenylalanyl-l-lysyl-l-cysteinyl-l-arginyl-l-arginyl-l-tryptophyl-l-glutaminyl-l-tryptophyl-l-arginyl-l-methionyl-l-lysyl-l-lysyl-l-leucylglycyl-l-alanyl-l-prolyl-l-seryl-l-isoleucyl-l-threonyl-l-cysteinyl-l-valyl-l-arginyl-l-arginyl-l-alanyl-l-phenylal Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 CSSYQJWUGATIHM-IKGCZBKSSA-N 0.000 description 3
- 235000021242 lactoferrin Nutrition 0.000 description 3
- 229940078795 lactoferrin Drugs 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 238000000816 matrix-assisted laser desorption--ionisation Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 3
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 241000894007 species Species 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 208000016557 Acute basophilic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- 244000105624 Arachis hypogaea Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 2
- 238000004252 FT/ICR mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 208000004262 Food Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000019298 Lipocalin Human genes 0.000 description 2
- 108050006654 Lipocalin Proteins 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 2
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000000211 autoradiogram Methods 0.000 description 2
- 102000007478 beta-N-Acetylhexosaminidases Human genes 0.000 description 2
- 108010085377 beta-N-Acetylhexosaminidases Proteins 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000010805 cDNA synthesis kit Methods 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000003112 degranulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000007933 dermal patch Substances 0.000 description 2
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 239000013568 food allergen Substances 0.000 description 2
- 235000020932 food allergy Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000000774 hypoallergenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 2
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 238000004452 microanalysis Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 235000014571 nuts Nutrition 0.000 description 2
- 235000020232 peanut Nutrition 0.000 description 2
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 150000003180 prostaglandins Chemical class 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000010845 search algorithm Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 108050001786 Alpha-s2 casein Proteins 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 1
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 1
- 235000018185 Betula X alpestris Nutrition 0.000 description 1
- 235000018212 Betula X uliginosa Nutrition 0.000 description 1
- 101000946377 Bos taurus Alpha-lactalbumin Proteins 0.000 description 1
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 1
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 1
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010012442 Dermatitis contact Diseases 0.000 description 1
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- 108010092408 Eosinophil Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000044708 Eosinophil peroxidases Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000030902 Galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108060003306 Galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102000002268 Hexosaminidases Human genes 0.000 description 1
- 108010000540 Hexosaminidases Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 241000598436 Human T-cell lymphotropic virus Species 0.000 description 1
- 102000028554 IgE binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091009324 IgE binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000001718 Immediate Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 108091036060 Linker DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 102100033468 Lysozyme C Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100219625 Mus musculus Casd1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 208000012266 Needlestick injury Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 1
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 101710093543 Probable non-specific lipid-transfer protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 1
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 241000238711 Pyroglyphidae Species 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 1
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 241000256248 Spodoptera Species 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 206010045240 Type I hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000036592 analgesia Effects 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000010216 atopic IgE responsiveness Diseases 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 229940072440 bovine lactoferrin Drugs 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 101150055766 cat gene Proteins 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 210000000991 chicken egg Anatomy 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 208000010247 contact dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000000586 desensitisation Methods 0.000 description 1
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 1
- 235000013399 edible fruits Nutrition 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001437 electrospray ionisation time-of-flight quadrupole detection Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046533 house dust mites Drugs 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000000899 immune system response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002597 lactoses Chemical class 0.000 description 1
- 235000021374 legumes Nutrition 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 108091005981 phosphorylated proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 235000021251 pulses Nutrition 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 1
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000009959 type I hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 235000008939 whole milk Nutrition 0.000 description 1
- 235000013618 yogurt Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Transplantation (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
Abstract
Předložené řešení se týká způsobu detekce alergenních proteinů a peptidů. Přesněji řešení poskytuje způsob detekce alergenních mléčných proteinů a/nebo peptidů a zahrnuje kroky opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozené z tkáně mléčné žlázy kojícího savce, výhodně kojící krávy, exprimující nejméně jeden protein nebo peptid kódovaný uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu, jak je uvedeno v kroku c) u bazofilů, eozinofilů nebo mastocytů a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že bazifily, eozinofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním proteinem z kroku d) uvolní nejméně jeden mediátor.
Description
Způsob detekce alergenních proteinů a peptidů
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu detekce alergenních kravských mléčných alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinových proteinů a/nebo peptidů.
Dosavadní stav techniky
Přibližně 2 až 8 % dětí mladších 3 let a přibližně 2 % dospělé populace jsou postižena potravinovými alergiemi. Přibližně 80 % alergických reakcí u dětí je výsledkem alergie na kravské mléko (CM), na slepičí vejce a luštěniny (např. arašídy a sójové boby). U dospělé populace však alergie na ovoce, arašídy a ořechy stromů představují nejčastěji se vyskytující alergii.
Kravské mléko patří mezi jednu z prvních potravin dětské stravy, a proto je jednou znejčastějiších příčin potravinové alergie u dětí. Přibližně 2,5 % novorozenců má nežádoucí reakce na kravské mléko v prvním roce života.
Symptomy alergie na kravské mléko (CMA) jsou akutního nebo opožděného typu a v rozsahu od mírných po závažné reakce zahrnující kůži, respirační aparát, gastrointestinální trakt a v nej horším případě se projevují jako život ohrožující systémové reakce (anaíýlaxe). Na rozdíl od buňkami zprostředkovaného opožděného typu reakcí jsou akutní reakce způsobené tvorbou protilátek imunoglobulinu E (IgE) jako reakce na jinak neškodné antigeny (hypersenzitivita typu I). Interakce protilátek IgE s alergenní molekulou vede ke specifické aktivaci efektorových buněk (mastocytů, bazofilních granulocytů) a následnému uvolnění zánětlivých mediátorů, jako například histaminu, prostaglandinu a leukotrienu, které jsou zodpovědné za akutní typ alergických reakcí.
Kravské mléko obsahuje 25 proteinů a některé z nich jsou známé jako alergenní. Působením chymozinu (reninu) nebo okyselením mléka na pH 4,6 se získají dvě frakce: dvacet procent proteinů se nachází v syrovátkové frakci a 80 % proteinů obsahuje kaseinová frakce. Alergenní molekuly jsou obsaženy u obou frakcí a považují se za významné nebo méně významné alergeny v závislosti na výskytu uváděných alergických reakcí v populaci CMA.
Významnými alergeny přítomnými v kravském mléku jsou alfa-laktalbumin, beta-laktoglobulin, alfaSl-kasein, beta-kasein a kappa-kasein. Méně významnými alergeny přítomnými v kravském mléku jsou alfaS2-kasein, laktoferin, hovězí sérový albumin a imunoglobulin.
Alfa-laktalbumin (Bos d4), beta-laktoglobulin (Bos d5), imunoglobuliny (Bos d7), BSA a laktoferin jsou dobře známé IgE-reaktivní složky syrovátky. AlfaSl-kasein, alfaS2-kasein, beta-kasein a kappa-kasein jsou silné alergeny v kaseinové frakci (Bos d8), (Wal, 2004).
Beta-laktoglobulinová (BLG) a alfa-laktalbuminová (ALA) frakce syrovátky se považují za hlavní alergeny. Beta-laktoglobulin globulámí a velmi stabilní protein, který patří k lipokalinům, proteinové superrodině, která váže hydrofobní ligandy. Jiné alergeny, jako hlavní psí alergeny Can fl a Can f2 a alergeny jiné srstnaté zvěře (kůň, kočka a morče) patří také k této superrodině. Beta-laktoglobulin se přirozeně vyskytuje v dimemí formě o molekulové hmotnosti 36 kDa. Existují dvě hlavní izoformy beta-laktoglobulinu, genetické varianty A (BLGA) a B (BLGB), které se liší v aminokyselinách 64 a 118 (kyselina asparagová a valin u BLGA, glycin a alanin u BLGB). Stabilita a skutečnost, že beta-laktoglobulin patří k rodině lipokalinů může vysvětlovat vysoký alergenní potenciál této molekuly.
Alfa-laktalbumin je 14 kDa kyselý monomer vážící Ca2+ stabilizovaný čtyřmi disulfidickými můstky, jde o regulátorovou složku v galaktosyltransferázovém systému, který syntetizuje laktó
- 1 CZ 305786 B6 zu. Sekvenční analýza prokázala vysokou sekvenční homologii aminokyselin s lidským alfalaktalbuminem (hALA) a lysozymem slepičího vejce; hlavním alergenem slepičího vejce. Alergenicitu alfa-laktalbuminu je možné vysvětlit jeho stabilitou.
V suspenzi proteinů kaseinové frakce tvoří uspořádané agregáty (micely) s konstantním rozměrem jednotlivých molekul: alfaSl- a alfaS2-kasein každý 37 %, beta a kappa-kaselin každý 13 %. Čtyři kaseinové molekuly mají nízkou primární strukturní homologii, mají různé funkční vlastnosti, ale všechny jsou fosforylované proteiny s reomorfm, vysoce hydratovanou terciární strukturou, které mohou být snadno degradovány některými proteázami. Tato senzitivita k proteolytickému štěpení je poněkud nezvyklou charakteristikou důležitého alergenu. Kaseiny kravského mléka sdílejí až 90% sekvenční homologii aminokyselin s kaseiny savců, jako například kozy a ovce. Tato sekvenční homologie může být důvodem Často se vyskytující křížové reaktivity mezi kravským mlékem a mlékem jiných zvířat.
Vynález vychází z potřeby nalezení metody umožňující detekovat alergenní proteiny a peptidy přítomné v biologickém zdroji.
Podstata vynálezu
Předmět vynálezu se týká způsobu detekce alergenních kravských mléčných alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinových proteinů a/nebo peptidů zahrnujícího kroky:
a) opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozené z tkáně mléčné žlázy kojící krávy,
b) exprimace nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou,
c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappakaseinového proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na kravské mléko,
d) kontaktování nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu, jak je uvedeno v kroku c) u bazofilů nebo mastocytů a
e) detekce nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že bazofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinovým proteinem nebo peptidem v kroku d) uvolní nejméně jeden mediátor.
V jednom výhodném provedení může způsob podle vynálezu dále zahrnovat krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu detekovaného podle tohoto způsobu.
Vynález také uvádí způsob detekce alergenních proteinů a/nebo peptidů kódovaných DNA nebo cDNA expresní knihovnou zahrnující krok opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od nejméně jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj, zejména savčí mléko, výhodně kravské mléko, a nutriční formule obsahující savčí mléko, výhodně kravské mléko, kontakt uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofi
-2CZ 305786 B6 ly, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediator po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Vynález tak poskytuje způsob detekce alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidu kódovaného DNA nebo cDNA expresní knihovnou zahrnující krok opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od alespoň jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj, kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem.
V jiném výhodném provedení vynálezu je dále možné stanovit přítomnost nejméně jednoho alfaS 1 alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu hmotnostní spektrometrií.
Výhodně, alfaS 1-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinové proteiny a peptidy přítomné ve vzorku se izolují před hmotnostní spektrometrií.
V dalším výhodném provedení je možné izolovat alfaS 1-, a!faS2-, beta- nebo kappa-kaseinové proteiny a peptidy elektroforetickou metodou.
Výhodně, elektroforetickou metodou může být dvojdimenzionální elektroforéza.
V dalším výhodném provedení je možné izolovat alfaS 1-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinové proteiny a peptidy vysoko účinnou kapalinovou chromatografií.
Vynález také uvádí způsob detekce alergenních proteinů a/nebo peptidů zahrnující jednak krok opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojícího savce, například kojící krávy, dále expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, dále stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, například kravské mléko, dále kontakt uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Vynález dále poskytuje způsob detekce alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidu zahrnující jednak krok opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojícího savce, například kojící krávy, dále expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, dále stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, například kravské mléko, dále kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Dále je zde popsán způsob podle popisu výše, přičemž alergenní proteiny a peptidy jsou mléčné alergenní proteiny a peptidy, alespoň jedna expresní knihovna obsahuje DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojícího savce, například kojící krávy, a jedinec citlivý na alergenní zdroj je jedincem citlivým na savčí mléko, například kravské mléko.
Podle dalšího aspektu vynálezu je popsán způsob dále zahrnující krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného způsobem.
Zde je také uváděn způsob detekce alergenních proteinů a/nebo peptidů kódovaných DNA nebo cDNA expresní knihovnou zahrnující krok opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující
-3 CZ 305786 B6
DNA nebo cDNA odvozenou od nejméně jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj, zejména savčí mléko, například kravské mléko, a nutriční formule obsahující savčí mléko, například kravské mléko, kontakt uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem. Rovněž je zde popsán způsob detekce alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidu kódovaného DNA nebo cDNA expresní knihovnou zahrnující krok opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od alespoň jednoho alergenního zdroje, expresi nejméně jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj, kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty a detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako alergenního v případě, že uvedené bazofily, eozinofily nebo mastocyty uvolňují nejméně jeden mediátor po kontaktu s uvedeným alespoň jedním proteinem nebo peptidem.
Dále je zde popsán způsob detekce alergenních proteinů a peptidů ve vzorku obsahujícím kravské mléko zahrnující krok detekce přítomnosti nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle obrázků 1A, IBa 1C(SEQ IDč. 22-84) a tabulek 1A, IB a tabulky 2 (SEQ IDč. 1-21).
Podle zde popsaného vynálezu může být savčím mlékem, například kravským mlékem, hydrolyzované savčí mléko, například hydrolyzované kravské mléko. V jiném výhodném provedení vynálezu je dále možné stanovit přítomnost nejméně jednoho proteinu nebo peptidu hmotnostní spektrometrií. Proteiny a peptidy přítomné ve vzorku mohou být izolovány před hmotnostní spektrometrií. Proteiny a peptidy mohou být izolovány elektroforetickou metodou nebo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Elektroforetickou metodou může být dvojdimenzionální elektroforéza.
Jiný předmět přihlášky zde popsán se týká proteinu nebo peptidu detekovaného způsobem podle popisu. Další předmět popisu přihlášky se týká proteinu nebo peptidu vybraného z obrázků 1A, IB, 1C (SEQ ID č. 22-84), tabulek 1 A, 1B nebo tabulky 2 (SEQ ID č. 1-21).
Jiný předmět popisu přihlášky se týká nejméně jednoho proteinu nebo peptidu pro použití v diagnostice alergie nebo predispozice k alergii u jedince. Alergií může být alergie na mléko.
Rovněž je zde popsán způsob diagnostiky alergie nebo predispozice k alergii u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho uvedeného proteinu nebo peptidu jedinci s předpokladem alergie nebo vývinem alergie a stanovení, zda jedinec rozvine alergickou reakci proti tomuto proteinu nebo peptidu.
Podle tohoto způsobu je výhodné, když v případě alergie nebo predispozice k alergii se jedná o alergii na mléko nebo predispozici k alergii na mléko. Způsob výhodně zahrnuje navíc provedení kožního testu a/nebo krevního testu. Kožní test výhodně zahrnuje (i) kožní prick test, (ii) intradermální test, (iii) kožní náplasťový test nebo (iv) jakoukoli kombinaci testů (i) až (iii), kde pozitivní výsledek testů (i) až (iv) je indikací alergie nebo predispozice k alergii u jedince. Krevní test výhodně zahrnuje kroky (i) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle popisu se vzorkem krve, vzorkem séra nebo plazmy uvedeného jedince a (ii) stanovení zda uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se váže k protilátce IgE v uvedeném vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k protilátce IgE indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince; a/nebo (i') kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle popisu s bazofily, eozinofily nebo mastocyty u jedince a (ii ) stanovení, zda bazofíly, eozinofily nebo mastocyty uvolňují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem
-4CZ 305786 B6 nejméně jeden mediátor nebo degranulují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem, kde uvolnění nejméně jednoho uvedeného mediátoru po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince.
Rovněž je zde popsán nejméně jeden protein nebo peptid podle popisu pro použití u alergenové imunoterapie alergie u jedince. Alergií je výhodně alergie na mléko.
Ještě dále je zde popsán způsob alergenové imunoterapie alergie u jedince s alergií zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle popisu. Alergií je výhodně alergie na mléko.
Rovněž je zde popsán způsob detekce alergie nebo predispozice k alergii u jedince, kde způsob zahrnuje a) kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle popisu se vzorkem krve, vzorkem séra nebo plazmy, kde vzorek krve, vzorek séra nebo plazmy je nebo byl izolován z uvedeného jedince a b) stanovení, zda uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se váže k protilátce IgE v uvedeném vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k protilátce IgE indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince; a/nebo a') kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu podle popisu s bazofily, eozinofíly nebo mastocyty, kde uvedené bazofily, eozinofíly nebo mastocyty jsou nebo byly izolovány z uvedeného jedince a b) stanovení, zda bazofily, eozinofíly nebo mastocyty (i) uvolňují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nejméně jeden mediátor nebo (ii) degranulují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem, kdy uvolnění nejméně jednoho uvedeného mediátoru po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s uvedeným nejméně jedním proteinem nebo peptidem indikuje alergii nebo predispozici k alergii u daného jedince.
Podle tohoto způsobu je výhodné, pokud alergií nebo predispozicí k alergii je alergie na mléko nebo predispozice k alergii na mléko. Tento způsob může dále zahrnovat odlišení jedinců se závažnou alergií od jedinců, kteří jsou citliví, ale asymptomatiětí, a/nebo odlišení jedinců, u kterých alergie s věkem pominula, od jedinců, u kterých alergie s věkem nepominula.
Rovněž je zde popsán způsob detekce IgE-reaktivního nealergenního mléčného proteinu nebo peptidu kódovaného DNA nebo cDNA nejméně jedné expresní knihovny zahrnující krok a) opatření alespoň jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojícího savce, například kojící krávy, b) expresi alespoň jednoho proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou, c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho proteinu nebo peptidu k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na savčí mléko, například kravské mléko, d) kontakt alespoň jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE s vazebnou kapacitou jak je uvedeno v kroku c) s bazofily, eozinofíly nebo mastocyty, e) stanovení, zda s bazofily, eozinofíly nebo mastocyty (i) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem uvolňují alespoň jeden mediátor nebo (ii) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují a f) detekci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu jako nealergenního, pokud bazofily, eozinofíly nebo mastocyty (i’) po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem neuvolňují alespoň jeden mediátor nebo (ii') po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nedegranulují.
Podle tohoto způsobu nejméně jeden protein nebo peptid detekovaný způsobem nebo uvedený ve popisu se použije k léčbě alergie. Popis uvádí také způsob léčby alergie u jedince zahrnující aplikaci nejméně jednoho proteinu nebo peptidu stanoveného způsobem podle popisu nebo uvedeného v popisu.
Uvedeným jedincem nebo pacientem může být člověk. Eozinofíly, mastocyty nebo bazofily jsou vždy savčí a mohou být lidského původu. Obecně, pojem „kojící savec“ zahrnuje savce druhu krávy, kozy, ovce, koně, buvola, velblouda, ale neomezující se na ně.
-5 CZ 305786 B6
Objasnění výkresů
Obrázek 1A ukazuje předpokládanou aminokyselinovou sekvenci cDNA kódující IgE-reaktivní alfaSl- a alfaS2-kasein celé délky a IgE-reaktivní alfaSl- a alfaS2-kaseinové fragmenty. Aminokyselinové sekvence alfaSl- a alfaS2- kaseinu jsou uvedeny nahoře. Sekvence IgEreaktivních alfaSl- a alfaS2-kaseinových fragmentů (čísla klonů na pravém okraji) jsou uvedeny na řádcích. Čísla uvádějí první a poslední aminokyselinu každého klonu.
Obrázek 1B ukazuje předpokládané aminokyselinové sekvence cDNA kódujících IgE reaktivní kappa-kasein a beta-laktoglobulin celé délky a IgE-reaktivní fragmenty těchto proteinů.
Aminokyselinové sekvence beta-, kappa-kaseinu a beta-laktoglobulinu celé délky jsou uvedeny nahoře. Sekvence IgE-reaktivních fragmentů (čísla klonů na pravém okraji) jsou uvedeny na řádcích. Čísla uvádějí první a poslední aminokyselinu každého klonu. Podtržené sekvence v betakaseinové sekvenci (nahoře) odpovídají nealergenním peptidům detekovaným hmotnostní spektrometrií formulace značně hydrolyzovaného hypoalergenního mléka.
Obrázek 1C uvádí aminokyselinovou sekvenci alfa-laktalbuminu, albuminu hovězího sérového séra a laktoferinu.
Obrázek 2 ukazuje screening IgE expresní knihovny cDNA získané z hovězí mléčné žlázy. Buňky E.coli Y1090 infikované fágem nesoucím cDNA knihovnu byly vyprovokovány k syntéze rekombinantních proteinů. Tyto proteiny byly přeneseny na nitrocelulózový filtr a vystaveny sérovému IgE pacientů s alergií na mléko s následnou inkubací s 1251-značenou anti-protilátkou IgE člověka, v tomto autoradiogramu filtru se IgE reaktivní klony jeví jako černé skvrny.
Obrázek 3 uvádí alergenní aktivitu vzorků mléka a složek. Biologická aktivita se stanovila měřením lidského RBL. Procenta séra pacienta (n=78) vykazující pozitivní reakci u měření lidského RBL jsou uvedena jako černé čáry (osa y). Analyzovaly se následující mléčné složky: vzorky mléka různých druhů (GM, kozí mléko; CM, kravské mléko; SM ovčí mléko; HM, lidské mléko; MM, kobylí mléko), kaseinová frakce různých druhů (GC, kozí kasein; CC, kravský kasein; SC, ovčí kasein), přírodní přečištěné proteiny (ACalfa-kasein; BC, beta-kasein; K.C, kappa- kasein; ALA, alfa-laktalbumin, BLGB, beta-laktoglobulinová varianta B; BLGA, beta-laktalbuminová varianta A; BSA, hovězí sérový albumin; SSA, ovčí sérový albumin; hALA, lidský alfa-laktalbumin; Lf, laktoferin), rekombinatní proteiny (rASIC, rekombinantní alfaS 1-kasein; rAS2C, rekombinantní aS2-kasein; rBC, rekombinantní beta-kasein; rKC, rekombinantní kappa-kasein; rALA, rekombinantní alfa-laktalbumin; rBLG, rekombinantní beta-laktoglobulin), rekombinantní fragmenty BSA (Fl, rekombinantní fragment 1 z BSA; F2, rekombinantní fragment 2 z BSA; F3, rekombinantní fragment 3 BSA) a syntetické peptidy aSl -kaseinu (Casl - Cas6).
Obrázek 4 uvádí seznam alergenních sekvencí nalezených v mléce.
Obrázek 5 uvádí separaci hydrolyzované mléčné formulace s použitím nano kapalinové chromatografie s následnou MS (electrospray ionization). Prezentace celého iontového chromatogramu 1 pg hydrolyzovaného vzorku mléka. Retenční časy jsou uvedeny na ose x a intenzita signálu v cps (počet impulsů za sekundu) je uvedena na ose y.
Obrázek 6 uvádí výpis výsledků hledání pomocí algoritmu Mascot search a detekci peptidů odvozených od beta-kaseinu v hydrolyzovaném kravském mléku.
Obrázek 7 uvádí beta-kasein-odvozené peptidy v hydrolyzovaném kravském mléku detekované jako IgE nereaktivní.
-6CZ 305786 B6
Podrobný popis
Předmětem vynálezu je poskytnutí způsobu detekce alergenních mléčných proteinů a/nebo peptidů jak je definován v nárocích.
Způsob podle vynálezu je vhodný zejména k identifikaci proteinů a peptidů vykazujících alergenní vlastnosti, za účelem identifikace alergenních vlastností proteinů nebo peptidů se jejich požadované množství pohybuje v rozmezí pouze mikrogramů nebo nanogramů. Tyto proteiny nebo peptidyjsou kódovány DNA nebo cDNA knihovnou, získanou ze zdroje, o kterém je známo, že obsahuje nebo syntetizuje proteiny a/nebo peptidy vyvolávající alergickou reakci u jedince. Alergenní zdroj může obsahovat různé typy tkání a buněk, které mohou být zodpovědné za biosyntézu alergenů. Pokud jsou tyto buňky a tkáně známé, je možné specificky vytvořit knihovny DNA nebo cDNA z uvedených buněk nebo tkání, které je možné použít způsobem podle vynálezu. Například, mléčné alergeny savce, například krávy, je možné detekovat izolací DNA nebo cDNA z tkáně mléčné žlázy kojícího savce.
Exprimované proteiny a peptidy expresní knihovny DNA a cDNA se kontaktují s IgE nejméně jednoho séra nejméně jednoho jedince citlivého na nejméně jeden alergenní zdroj. V prvním kroku se zjistí, které z těchto proteinů a peptidů jsou schopné vazby s IgE a tím mají předpoklad k alergickým reakcím. Pojem „IgE-reaktivní“ podle vynálezu znamená kapacitu aminokyselinové sekvence vázat IgE. V dalším kroku se peptidy a proteiny vázající se k IgE dále kontaktují z bazofily nebo mastocyty, které byly dříve v kontaktu s IgE nejméně jednoho jedince, o kterém je známo, že je alergický na nejméně jeden alergen alergenního zdroje. Bazofily nebo mastocyty, nesoucí alergen specifické IgE molekuly uvolňují po kontaktu s příslušným alergenem mediátory, jako například histamin a/nebo jiné mediátory alergie uvolňované bazofily nebo mastocyty, které značí, že proteiny a peptidy schopné vazby IgE jsou také schopné vyvolat degranulaci bazofilů nebo mastocytů po kontaktu s těmito buňkami. Vhodnými alergenními mediátory jsou výhodně histamin, heparin, prostaglandin, leukotrien, chemokiny, cytokiny. Jiné alergenní mediátory, které mohou být použitelné v souvislosti s vynálezem, zahrnují β-hexosaminidázu, eozinofilperoxidázu, ribonukleázu (RNáza), deoxyribonukleázu, lipázu, plazminogen a hlavní bazický protein. Odborníkovi v oboru jsou známy mediátory uvolňované těmito buňkami, které jsou obecně známé (viz například Janeway a kol. 2002: Immunology, Spektrum Akademischer Verlag; Auflage: 5. Auflage; Paul a kol. 1989: Fundamental Immunology, Raven Press Ltd.; druhé vydání).
Cleny knihovny DNA a cDNA, kteří se vážou k IgE alergického jedince a jsou schopné vyvolat degranulaci bazofilů nebo mastocytů, je možné izolovat a jejich DNA nebo cDNA inzert je možné sekvenovat metodami známými ze stavu techniky. Proteiny a peptidy exprimované příslušnými členy knihovny je možné případně izolovat metodami známými ze stavu techniky a analyzovat hmotnostní spektrometrií nebo například aminokyselinovým sekvenováním.
Cleny DNA nebo cDNA knihovny je možné odvodit ze zdroje nesoucího biologický materiál, který je známý nebo neznámý z hlediska vyvolání alergické reakce po kontaktu s jedincem. Pojem „alergenní zdroj“, jak se zde užívá, se týká jakéhokoli druhu biologického materiálu schopného syntetizovat alergeny.
Pojem „peptid“ nebo “protein“ představuje sekvenci aminokyselin spojenou vzájemně peptidickými vazbami. „Peptid“, jak se zde užívá, znamená, že molekula obsahuje nezbytně až 250 aminokyselin, jako například až 200 aminokyselin, jako například až 150 aminokyselin, jako například až 100 aminokyselin, jako například až 50 aminokyselin, jako například až 45 aminokyselin, jako například až 40 aminokyselin, jako například až 30 aminokyselin, jako například až 20 aminokyselin a výhodně více než 2 aminokyselinové zbytky. „Protein“, jak se zde užívá, znamená, že molekula obsahuje nezbytně více než 250 aminokyselin. Blízko horní hranice (to znamená kolem 250 aminokyselin) ve vynálezu může být použit pojem protein a peptid pro stejný typ molekuly.
-7CZ 305786 B6
Alergeny (látky, které jsou schopné vyvolat alergickou reakci u jedince) se syntetizují různými organismy, včetně rostlin a zvířat. Nejméně jeden alergenní zdroj může být zvířecího původu, přesněji savčího. Zvířata jsou známé zdroje alergenů. Tyto alergeny jsou většinou přítomny u zvířat (například kočky nebo psa) s nebezpečím kožního kontaktu, stejně jako kontaktu s jejich slinami a močí. Savci, například, vylučují alergeny také do mléka. Savci, jako kráva, kůň, koza, ovce, velbloud, buvol, tak mohou obsahovat vysoké množství alergenů. cDNA a DNA používané k detekci těchto alergenů mohou být izolované z kojících savců, kde DNA nebo cDNA se výhodně získá z mléčné žlázy kojícího savce.
Jiným zdrojem alergenů jsou roztoči, jako například roztoči domácího prachu, ryby, vejce apod. Tato zvířata jsou známá tvorbou látek, které vyvolávají alergické reakce u jedinců.
Dalším zdrojem alergenů jsou rostliny. Zejména plevele a ořechy jsou známým zdrojem alergenů. Samozřejmě také stromy, jako například bříza, jsou zdrojem alergenů.
DNA (jako například genomovou DNA a jiné typy DNA kromě cDNA) nebo cDNA je možné získat z alergenního zdroje, jako například savčího mléka, výhodně kravského mléka nebo nutričních formulací obsahujících savčí mléko, výhodně kravské mléko, metodami známými ze stavu techniky. Tyto molekuly nukleových kyselin se výhodně získávají z buněk a tkání, které jsou známy nebo u kterých se předpokládá tvorba alergenů. Za účelem snížení množství screenovaných klonů pro detekci alergenů je však výhodná inzerce cDNA molekul (cDNA molekuly jsou odvozené od mRNA) do expresních knihoven, protože tyto molekuly odrážejí zásobárnu proteinů a peptidů exprimovaných v příslušných buňkách a tkáni. Podle vynálezu, k přípravě cDNA z buněk, které exprimují (potenciálně) alergen, je možné použít jakoukoli metodu. Tyto metody jsou odborníkovi v oboru dobře známé ze stavu techniky (viz například Sambrook a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. vyd. (1989) a Ausubel, F. M. a koi., Current Protocols in Molecular Biology, (Current Protocol, 1994)). Existuje také mnoho komerčně dostupných souprav pro izolaci dvouvláknové DNA například Superscript II nebo souprava Superscript III (Invitrogen, USA, katalogové č. 18580008), souprava Great Lengths cDNA Synthesis Kit (Clontech, USA, katalogové č. K-l048-1), souprava cDNA Synthesis Kit (Stratagene, USA, katalogové č. 200301) a podobně.
Molekuly cDNA a DNA je možné ligovat se spojovníkovými DNA sekvencemi obsahujícími vhodná místa rozeznatelná restrikčními enzymy. Tyto DNA spojovníky jsou známy ve stavu techniky a jsou komerčně dostupné, například od Promega Corporation, USA a od New England Biolabs, USA. Molekuly cDNA a DNA je možné dále štěpit restrikčními enzymy, jednotlivé délkové fragmenty oddělit na kolonách nebo gelech nebo jakoukoli jinou vhodnou známou metodou ze stavu techniky pro odborníka v oboru.
Knihovny cDNA a DNA se pak inzertují do expresních vektorů, které mohou obsahovat nukleotidové sekvence kódující tágy, sekvence, které řídí replikaci DNA v bakteriálních buňkách, sekvence, které řídí transkripci DNA a mRNA translaci v eukaryotických buňkách a podobně. Vhodné expresní vektory, které obsahují popsané regulátorové prvky jsou známé ze stavu techniky. Molekuly cDNA nebo DNA popsány výše mohou být navrženy pro přímé zavedení nebo zavedení pomocí lipozomů, fágových vektorů nebo virových vektorů (například adenovirových, retrovirových) do buňky. Typické savčí expresní vektory obsahují promotorový prvek, který zprostředkovává transkripci mRNA, proteinu kódujícího sekvenci a signály požadované pro zakončení transkripce a polyadenylace transkriptu. Je možné zahrnout také prvky, jako například počátek replikace, gen lékové rezistence, regulátory (součást indukovatelného promotoru). Typickým indukovatelným promotorem je lac promotor, užitečný u eukyryotických buněk, který může být indukovaný s použitím laktózového analogu izopropylthiol-b-D-galaktosidu. (IPTG). U rekombinantní exprese a sekrece se může molekula požadovné cDNA nebo DNA ligovat (popsáno v Ghahroudi a kol., 1997, FEBS Letters 414:521-526). Další prvky mohou zahrnovat zesilovače transkripce, Kozákovu sekvenci a intervenující sekvence lemované donorovými a akceptorovými
-8CZ 305786 B6 misty pro sestřih RNA. Velmi efektivní transkripce je možné dosáhnout časnými a pozdními promotory z SV40, dlouhými terminálními repeticemi (LTRs) z retrovirů, například RSV, HTLV, HIV a časného promotoru cytomegaloviru (CMV). Buněčné prvky je však možné také použít (například lidský aktinový promotor). Rekombinantní protein nebo peptid může být případně exprimován ve stabilní buněčné linii, která obsahuje genový konstrukt integrovaný do chromozomu. Kotransfekce s volitelným markérem, jako například dhfr, gpt, neomycinem, hygromycinem umožňuje identifikaci a izolaci transferovaných buněk. Expresní vektory vhodně zahrnují nejméně jeden volitelný ukazatel. Reprezentativní příklady příslušných hostitelů výhodně zahrnují, ale neomezují se na bakteriální buňky, jako například E.coli, Streptomyces a Salmonella tyfimurium; buňky hub, jako například kvasnic; buňky hmyzu, jako například Drozofila S2 a Spodoptera Sf9; zvířecí buňky, jako například CHO, COS,293 a buňky Bowesova melanomu; a rostlinné buňky. Příslušné živné půdy kultury a podmínky výše popsaných hostitelských buněk jsou známé ze stavu techniky. Inzerce knihovny cDNA a DNA (cDNA nebo DNA zásoba specifických buněk nebo tkáně) do expresních vektorů vede k expresním knihovnám.
Expresní knihovna používaná k expresi molekul cDNA a DNA alergenního zdroje je výhodně fágová knihovna nebo bakteriální expresní knihovna. Členové („konstrukty“) těchto knihoven se pak inzertují do buněk schopných exprimovat proteiny a peptidy kódované cDNA a DNA. Výhodné buňky se vyberou podle typu použitého vektoru k vytvoření cDNA a DNA knihoven. V případě, že jsou vektory určeny pro bakteriální expresi, buňky jsou bakteriální buňky. Knihovny cDNA a DNA se zavedou do buněk metodami dobře známými odborníkovi v oboru a popsanými (například transformací), například v Sambrook a kol., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2.vyd., Cold Spring Harbor Press (Cold Spring Harbor, N. Y.. 1989). Další kroky kultivace bakteriálních buněk k výběru transformátů a tvorbě jednotlivých bakteriálních kolonií (klonů) jsou dobře známy ze stavu techniky. Po selekci transformantů na agarových miskách se kultivované bakteriální kolonie mohou jednotlivě odebrat a použít k inokulaci tekuté kultury navržené ve stanovení v podobě vzoru mřížky pro vytvoření bakteriálních mřížkových zásobáren, jako například v 96 jamkových mikrotitračních destičkách. Toto provedení umožňuje reprezentativní růst každého bakteriálního klonu v nezávislé jamce a usnadňují následnou subselekci pozitivně hodnocených zásobáren klonů.
Zvláště výhodné je použití vektorů pro expresní knihovnu, které jsou schopné vylučovat vytvořené proteiny a peptidy do vnější oblasti buňky. Uvolněné proteiny a peptidy mohou dále obsahovat membránovou kotvicí doménu, která umožňuje imobilizaci exprimovaných molekul na povrchu buněk. Metody a prostředky potřebné k vytvoření těchto knihoven jsou známy odborníkovi v oboru.
Za účelem detekce vazby alergen specifických IgE molekul k peptidům a/nebo proteinům kódovaných knihovnami cDNA nebo DNA se nejméně jeden protein nebo peptid imobilizuje na pevném podkladu. Pevný podklad se následně kontaktuje s molekulami IgE odvozenými od jedinců trpících alergií a hodnotí se vazba uvedených molekul IgE na pevném podkladu.
Vazby IgE k proteinům a peptidům imobilizovaných na pevném podkladu je možné dosáhnout použitím protilátek nebo jejich fragmentů schopných vazby k IgE. Tyto protilátky jsou dobře známy ve stavu techniky.
Pevným podkladem pro použití podle vynálezu může být membrána, výhodně nitrocelulózová membrána. Ve zvláště výhodném provedení se tyto membrány kontaktují s bakteriálními koloniemi nesoucími knihovny cDNA nebo DNA přítomné na agarové misce za účelem vytvoření repliky těchto kolonií. Tuto replikuje možné použít k detekci vazby alergen specifického IgE k specifické kolonii.
Bazofily nebo mastocyty, které byly v kontaktu s alergen specifickým IgE jedinců trpících alergií, je možné použít ke stanovení alergického potenciálu proteinů nebo peptidů kódovaných knihovnou DNA nebo cDNA. Bazofily nebo mastocyty mohou být savčího původu, kdy výhodné je
-9CZ 305786 B6 použití humanizované krysí buňky bazofilové leukemie (RBL) (například klon RBL-703/21). Buňky je možné humanizovat zavedením a expresí DNA, která kóduje všechny nebo část lidského Fc-receptoru, s výhodou DNA, která kóduje všechny nebo část lidského IgE-receptoru I. Metody přípravy humanizovaných buněk jsou známy ze stavu techniky. Pro přípravu kultur humanizovaných buněk se výhodně použije metoda popsaná v Hoffmann a kol. (lok. lit.). Metody přípravy nahých bazofilů jsou popsány v Kieine Budde a kol. (Int Arch Allergy Immunol, 126(4)).
Po identifikaci proteinů/peptidů, které jsou schopné vazby alergen specifického IgE se výhodně detekuje aminokyselinová sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu, jak je uvedeno v kroku c), a před krokem d) se chemicky syntetizuje nebo rekombinantně vytvoří nejméně jeden protein nebo peptid, který je schopný vazby k alergen specifickému IgE a může se použít v kroku d).
Způsob podle vynálezu podle výhodného provedení dále zahrnuje krok detekce aminokyselinové sekvence nejméně jednoho proteinu nebo peptidu uvedeného v kroku e).
Aminokyselinová sekvence proteinů nebo peptidů kódovaných a exprimovaných knihovnou DNA nebo cDNA se může stanovit například hmotnostní spektrometrií nebo Edmanovým odbouráváním. Pokud se použije taková metoda, proteiny a/nebo peptidy exprimované knihovnou DNA nebo cDNA musí být před aminokyselinovým sekvenováním izolovány. Izolaci je možné provést metodami známými ze stavu techniky. K usnadnění izolace proteinů a peptidů se mohou spojit s tágem (například histidinovým tágem). Případně je možné izolovat příslušný DNA nebo cDNA klon a sekvenovat DNA nebo cDNA inzert.
Vhodné metody stanovení aminokyselinové sekvence peptidů a proteinů zahrnují, ale neomezují se na, Edmanovo odbourávání, (tandem) hmotnostní spektrometrii a podobně (viz například Edman, P. Mol. Biol. Biochem. Biophys., (1970), 8: 211 -255; US 6 799 121). Aminokyselinovou sekvenci proteinů a peptidů je možné porovnat s aminokyselinovou sekvencí známých proteinů.
Pojem „hmotnostní spektrometrie“, jak se zde užívá, zahrnuje různé metody, jako například tandemovou hmotnostní spektrometrii, MALDI (matrix assisted laser desorption ionization) TOF (time-of-flight) hmotnostní spektrometrii, MALDI-TOF-TOF hmotnostní spektrometrii, hmotnostní spektrometrii MALDI Quadrupole-time-of-flight (Q-TOF), ESI (electrospray ionization)TOF hmotnostní spektrometrii, ESI-Q-TOF, „ESI-ion trap“ hmotnostní spektrometrii, „ESI Triple quadrupole“ hmotnostní spektrometrii, hmotnostní spektrometrii FTMS (ESI Fourier Transform), MALDI-FTMS, MALDI-Ion Trap-TOF a ESI-ion Trap TOF. Tyto metody hmotnostní spektrometrie jsou dobře známy ve stavu techniky (viz např. Gary Siuzdak, Mass Spectrometry for Biotechnology, Academic Press, NY, (1996)). Na své základní úrovni hmotnostní spektrometrie zahrnuje ionizaci molekuly a následně měření hmoty výsledného iontu. Vzhledem k tomu, že molekuly ionizují dobře známým způsobem, molekulovou hmotnost molekuly je možné obecně přesně stanovit z hmoty iontu. Tandemovou hmotnostní spektrometrii je například možné použít k detekci proteinů, protože může poskytnout informaci navíc k rodičovské molekulové hmotnosti iontu. Tandemová hmotnostní spektrometrie zahrnuje nejprve získání hmotnostního spektra příslušného iontu, pak fragmentaci tohoto iontu a získání hmotnostního spektra fragmentů. Tandemová hmotnostní spektrometrie tak poskytuje informaci o molekulové hmotnosti i fragmentační vzor, který je možné použít v kombinaci s informací o molekulové hmotnosti k detekci přesné sekvence peptidu nebo proteinu (viz např. Hunt a kol. (1986) PNAS USA 83:6233-6237; Shevchenko a kol., (1996) PNAS USA 93:14440-14445; Figeys a kol. (1996) Anal. Chem. 68:1822-1828 a Wilm a kol. (1996) Nature 379:466-469.
Pojem „savčí mléko, výhodně vzorek obsahující kravské mléko“ v souvislosti s přihláškou se týká vzorku potraviny nebo nutričního vzorku obsahujícího savčí mléko, výhodně kravské mléko. Neomezujícím vzorkem je (kravské) mléko, tvaroh, smetana, máslo, jogurt a potravina obsahující
-10CZ 305786 B6 jednu z uvedených složek. V mléku, výhodně vzorku obsahujícím kravské mléko je přítomen alespoň jeden protein nebo peptid v množství, které umožňuje stanovení alergenicity mléka, výhodně vzorku obsahujícího kravské mléko. Obvyklé požadované množství proteinu nebo peptidu dostatečného k detekci alergenicity je v řádu mikrogramů nebo nanogramů.
Proteiny a peptidy uvedené na obrázcích 1A, IB a IC (SEQ ID č. 22 až 84) a v tabulkách ΙΑ, 1B a tabulce 2 (SEQ ID č. 1 až 21) je možné použít ke stanovení, zda vzorek obsahující kravské mléko obsahuje alergenní molekuly. Pokud je jen jeden z uvedených proteinů nebo peptidů přítomen ve vzorku obsahujícím kravské mléko, vzorek se považuje za alergenní.
Uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se výhodně detekuje imunostanovením zahrnujícím protilátky nebo jejich fragmenty vážící se k proteinům a peptidům, uvedeným na obrázcích 1A, IB a 1C (SEQ ID č. 22 až 84) a tabulkách 1A, IB a tabulce 2 (SEQ ID č. 1 až 21).
Uvedený nejméně jeden protein a/nebo peptid se výhodně stanoví hmotnostní spektrometrií. Za účelem detekce složek savčího mléka, výhodně kravského mléka, přítomných ve vzorku obsahujícím savčí mléko, výhodně kravské mléko, je možné použít hmotnostní spektrometrii. Hmotnostní spektrometrie umožňuje detekovat mléčné složky uvedené na obrázcích 1A, IB a 1C (SEQ ID č. 22 až 84) a v tabulkách 1A, IB a v tabulce 2 (SEQ ID č. 1 až 21). Srovnání fragmentů přítomných ve vzorku s proteiny a peptidy uvedenými na obrázcích 1A, IB a 1C (SEQ ID č. 22 až 84) a v tabulkách 1A, IB a v tabulce 2 (SEQ ID č. 1 až 21) umožňuje stanovit, zda vzorek obsahuje alergenní složky odvozené od kravského mléka.
Za účelem dosažení lepších výsledků se proteiny a peptidy přítomné ve vzorku výhodně před provedením hmotnostní spektrometrie izolují. Izolaci je možné provést elektroforeticky, výhodně dvojdimenzionální elektroforézou nebo vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií. Screening produktu/proteinů/peptidů ve stanovení vazby IgE (krok c) a degranulace bazofilů (humanizovaných mastocytů) skutečně poskytuje data o potenciální alergenicitě a tyto metody se používají v klinické praxi. Údaje expresní knihovny cDNA však přidají kompletní seznam potenciálních alergenních peptidů/peptidových sekvencí určitých alergenů (například kravského mléka). Vynález kombinuje tyto metody (zlepšená detekce potenciálních alergenních struktur), umožňujíc použití hmotnostní spektrometrie k ověření přítomnosti těchto potenciálních alergenních struktur v matricích produktu. Tato kombinace sekvenční databáze alergenních mléčných proteinů a peptidů vytvořená v kombinaci s reaktivitou IgE a degranulací (bioaktivita) poskytne základ pro vývoj spolehlivější, citlivější a reprodukovatelnější metody stanovení a předpovědi alergenicity produktů obsahujících mléko. Ačkoli byly k identifikaci alergenů použity alergeny travního pylu (Ball et al. 1994, Journal of Biological Chemistry,269; Issue of Nov 11, p. 28323-28328), výsledky podle vynálezu jsou nicméně překvapující, protože odborník v oboru by nepředpokládal, že metoda podle Ball et al. 1994 nebo podobná metoda by mohla být úspěšně aplikována na mléčné alergeny. Pro další vysvětlení, IgE vazba alergenů travního pylu, stejně jako IgE vazba k jiným respiračním alergenům, zásadně závisí na aminokyselinových zbytcích v okolí alergenu. Alergeny travního pylu a respirační alergeny se obecně seskupují do konformačních (diskontinuálních) IgE epitopů. Vrtatla a kol. (J. Clin. Invest, ročník 99, No 7, strany 1673-1681) prokazuje, že ztráta konformace, například u rekombinantních fragmentů odvozených od konformačních alergenů, vede k zásadnímu snížení kapacity IgE vazby a uvolnění histaminu z bazofilů pacienta. Naopak, alergeny travního pylu a respirační alergeny, mléčné alergeny a potravinové alergeny mají obecně epitopy, které nejsou konformační, ale rozevřené (Jarvinen a kol., Int Arch Allergy Immunol, ročník 126, strany. 11 1-1 18 a Jarvinen a kol., Allergy, ročník 62, strany 758 až 765). Stav techniky popisuje pouze IgE vazbu rozevřených alergenů odvozených například z mléka a vejce. Uvolnění mediátoru z bazofilů nebo mastocytů nebylo uvedeno, ani vynálezcům známo. Vezmou-li se v úvahu výsledky Vrtatla a kol. (lok. lit.), odborník v oboru by předpokládal, že fragmenty alergenů a rekombinantně vytvořené alergeny mléka, které nemají IgE reaktivitu, by ani nebyly schopné vyvolat uvolnění histaminu z bazofilů pacienta. Podobně, vezmou-li se v úvahu výsledky Vrtatla a kol. (lok. lit.), odborník v oboru by předpokládal, že fragmenty alergenů a rekombinantně vytvořené alergeny mléka, které mají IgE reaktivitu, by také byly schopné vy
- 11 CZ 305786 B6 volat uvolnění histaminu z bazofilů pacienta. Krok dalšího testování uvolňování histaminu u IgE reaktivních mléčných proteinů a peptidů by se podle stavu techniky jevilo jako zbytečné. Naopak, vynálezci překvapivě zjistili, že pouze způsob zahrnující kroky reaktivity IgE a uvolnění mediátoru z bazofilů a mastocytů může spolehlivě detekovat alergenní mléčné proteiny a peptidy. Dále je třeba zmínit, že pouze kombinované testování reaktivity IgE a uvolňování mediátoru umožňuje spolehlivé stanovení alergenicity proteinu nebo peptidu odvozeného z mléka. V závislosti na testovaném jedinci mohou peptidy a proteiny případně vyvolat uvolnění mediátoru. Nealergenní proteiny a peptidy, které pouze vykazují IgE reaktivitu bez zprostředkování uvolnění mediátoru z bazofilů nebomastocytů, je proto možné odlišit od alergenních proteinů nebo peptidů (alergenů). Proto pouze způsob podle vynálezu může spolehlivě stanovit alergenicitu proteinu nebo peptidu podle vynálezu pro daného jedince, to znamená specificky odlišit od nealergenní IgE vazby. Zvláště překvapivé bylo zjištění, že způsob podle vynálezu vedl k detekci peptidů uvedených v tabulkách 1 A, IB a tabulce 2 (SEQ ID č. 1 až 22), protože tyto peptidy jsou všechny rozložené peptidy a proto nemají konformační epitopy.
Zlepšený způsob detekce potenciálních alergenů použitím expresní knihovny cDNA probíhal podle expresního systému fágového peptidu a funkčního screeningu s použitím IgE vazby a IgE zprostředkované degranulace bazofilních buněk nebo mastocytů. Tento výsledek umožňuje monitorování/screening a předpověď přítomnosti potenciálních potravinových alergenů v surových materiálech, složkách a výsledném produktu za účelem vývoje výroby nutričních formulí.
Alergenní proteiny nebo peptidy zde uvedené nebo detekované popsanými způsoby podle vynálezu je možné použít k diagnostice alergie nebo predispozice k alergii u jedince, výhodně alergie na mléko nebo predispozice k alergii na mléko. Diagnostika alergie zahrnuje obecně kožní nebo krevní test k nalezení látky nebo alergenu, který může vyvolat alergickou reakci u jedince. Kožní testy jsou většinou výhodnější, protože jsou rychlejší, spolehlivější a obecně levnější než krevní testy, ale může se použít jakýkoli typ testu. U kožního testu se na kůži nebo pod kůži aplikuje vhodné množství alespoň jednoho alergenního proteinu nebo peptidu zde uvedeného nebo detekovaného způsoby zde popsanými a sleduje se, zda se vyvine alergická reakce. Existují tři typy vhodných kožních tesů: (1) Kožní prick test se provádí umístěním kapky roztoku obsahujícího uvedený nejméně jeden alergenní protein nebo peptid (alergenní roztok) na pokožku a série rýh nebo bodnutí jehlou umožní roztoku vstoupit do kůže. V případě, že kůže zčervená, objeví se svědící oblasti (pupeny ve tvaru kola), většinou to znamená, že osoba je alergická na daný alergen. Tato reakce je označovaná jako pozitivní. (2) Během intradermálního testu se malé množství alergenního roztoku injekčně aplikuje do kůže. Intradermální alergický test je možné provést v případě, že látka nevyvolává reakci v kožním prickově testu, ale je stále považována u jedince za alergen. (3) U kožního náplasťového testu, se roztok alergenu umístí na podušku, která se přiloží na kůži na dobu 24 až 72 hodin. Tento test se používá k detekci kožní alergie zvané kontaktní dermatitida. U krevního testuje možné stanovit alergii u jedince krokem (i) kontaktu nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného způsoby podle vynálezu nebo specificky uvedeného ve vynálezu se vzorkem krve, séra nebo plazmy jedince, a (ii) stanovení, zda uvedený nejméně jeden protein nebo peptid se váže k IgE protilátce u uvedeného vzorku krve, séra nebo plazmy, kde vazba uvedeného alespoň jednoho proteinu nebo peptidu k IgE protilátce je projevem alergie nebo predispozice k alergii u jedince; a/nebo (i') kontakt nejméně jednoho proteinu nebo peptidu detekovaného způsoby podle vynálezu nebo specificky uvedeného s bazofily nebo mastocyty jedince a (ii1) stanovení, zda bazofily nebo mastocyty uvolňují po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem alespoň jeden mediátor nebo po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem degranulují, kde uvolnění uvedeného alespoň jednoho mediátoru po kontaktu s uvedeným s nejméně jedním proteinem nebo peptidem nebo degranulace po kontaktu s nejméně jedním proteinem nebo peptidem je příznakem alergie nebo predispozice k alergii u uvedeného jedince.
Navíc alergenní proteiny nebo peptidy zde specificky uvedené nebo detekované popsanými způsoby podle vynálezu je možné použít u alergenové imunoterapie alergie u jedince.
-12CZ 305786 B6
Alergenová imunoterapie (také označovaná jako hyposenzitizační terapie, imunologická desenzitizace nebo alergen specifická imunoterapie) podle popisu je formou imunoterapie u alergických onemocnění, kdy je pacient očkován zvyšujícím se množstvím alergenu za účelem vyvolání imunologické tolerance. Alergenová imunoterapie je pouze léčebná strategie, která léčí stávající následek alergického onemocnění. Jedná se o nákladnou a velmi účinnou léčebnou metodu, jejímž výsledkem je lepší kvalita života a potlačení symptomů spojených s alergií a alergenem. Imunoterapie prokázala dlouhodobou remisi alergických symptomů, zmírnění souvisejících alergických reakcí a snížila počet změn ve vývoji nových senzitizací proti alergenům. Toho se dosahuje pomocí imunoterapie zprostředkující reakci imunitního systému na alergeny. Alergenová imunoterapie může snížit spotřebu léků, míru symptomů nebo celkově eliminovat hypersenzitivitu. Alergen specifická imunoterapie je pouze druhem léčby, u níž je známé, že ovlivňuje proces alergického onemocnění (s možností léčby onemocnění), zatímco jiné druh léčby více potlačují symptomy.
Je výhodné, pokud nejméně jeden protein nebo peptid podle popisu pro použití podle jakéhokoli zde popsaného způsobu nebo použití pro diagnostiku nebo způsob a použití u alergenní imunoterapie je přítomen ve farmaceutické kompozici. Pojem „farmaceutická kompozice“ podle popisu se týká kompozice pro aplikaci pacientovi, výhodně člověku. Farmaceutická kompozice obsahuje sloučeniny popsané výše. Může volitelně obsahovat další molekuly schopné zesílit vlastnosti sloučenin podle popisu, například stabilizací, zprostředkováním a/nebo aktivací jejich funkce. Kompozice může být pevná, kapalná nebo plynná a může být mimo jiné ve formě (a) prášku (prášků), tablety (tablet), roztoku (roztoků) nebo aerosolu (aerosolů). Farmaceutická kompozice může volitelně a navíc obsahovat farmaceuticky přijatelný nosič. Příklady vhodných farmaceuticky přijatelných nosičů jsou známé ze stavu techniky a zahrnují fyziologický roztok s fosfátovým pufrem, vodu, emulze, jako například olejové/vodní emulze, různé typy zvlhčovačích látek, sterilních roztoků, organických roztoků včetně DMSO atd. Kompozice obsahující tyto nosiče může být formulována běžnými metodami. Tyto farmaceutické kompozice je možné podávat jedinci ve vhodné dávce. Dávkování určí lékař podle klinických faktorů. Jak je známo v lékařské praxi, dávkování u pacienta závisí na mnoha faktorech včetně jeho hmotnosti, povrchu těla, věku, druhu aplikované sloučeniny, pohlaví, době a způsobu aplikace, celkovému zdravotním stavu a dalších současně užívaných léčivech. Terapeuticky účinné množství v určité situaci je třeba stanovit rutinními experimenty a s určitou lékařskou zkušeností a posouzení běžného klinického praktika nebo lékaře. Farmaceutická kompozice pro použití podle popisu může být formulována běžným způsobem pomocí metod známých ze stavu techniky s použitím fyziologických nosičů nebo excipientů, viz například Ansel a kol., Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 7.vydání, Lippincott Williams & Wilkins Publishers, 1999. Farmaceutická kompozice se může aplikovat orálně, parenterálně, subkutánně, intravenózně, intramuskulámě, intraperitoneálně, intratekálně, transdermálně, transmukulámě, subdurálně, lokálně nebo lokálně pomocí iontoforézy, sublinguálně, inhalací spreje, aerosolu nebo rektálně a podobně v dávkách jednotkových formulací volitelně obsahujících běžné farmaceuticky přijatelné excipienty. Farmaceutickou kompozici podle popisuje možné aplikovat jako roztok aktivní látky nebo se může aplikovat v kombinaci s jinými látkami.
Příklady blíže vysvětlují vynález.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Detekce sekvencí cDNA kódujících IgE-reaktivní mléčné složky a jejich fragmenty.
Pro detekci IgE-reaktivních proteinů a IgE-reaktivních proteinových fragmentů obsažených v kravském mléce se nejprve vytvořila cDNA expresní knihovna s použitím tkáně mléčné žlázy kojící krávy. Tato knihovna se screenovala pomocí sér pacientů alergických na kravské mléko. Detekovaly se cDNA kódující IgE-reaktivní alfaSl-, alfaS2-, beta-, kappa-kasein a beta-laktoglo
- 13 CZ 305786 B6 bulin celé délky, stejně jako jejich IgE-reaktivní fragmenty. Poněkud překvapivým výsledkem bylo, že savčí proteiny se tvořily v bakteriálním systému, který nepřidává eukaryotické posttranslační modifikace, které by někdy mohly hrát roli v IgE vazbě jako je popsáno pro hlavní alergeny roztočů domácího prachu (Jacquet a kol., 2002). Předpokládané aminokyselinové sekvence jsou uvedeny na obrázcích 1A-C (SEQ ID č. 22 až 84). Získané IgE-reaktivní alergenové fragmenty umožňují vytvořit závěr o umístění epitopů IgE.
Experimentální protokol
Získaly se hovězí mléčné žlázy krávy (plemeno Fleckvieh) a čerstvá tkáň se ihned zmrazila a skladovala do použití při -80 °C. Z tkáně se izolovala celková RNA a získala se cDNA s použitím soupravy cDNA Synthesis System. Přečištěná cDNA se inzertovala do fágů lambda s použitím soupravy Lambda gtll/EcoR 1/CJAP-Treated/Gigapack III Cloning Kit (Stratagene, La JoIIa, CA). Buňky E.coli se infikovaly fágovou knihovnou, umístily na destičky LB Amp (průměr 145 mm). Exprese bakteriálního proteinu se vyvolala použitím nitrocelulózové membrány (Whatman Schleicher & Schueli, Dassel, Germany). Adsorbované proteiny se inkubovaly se sérem od CMA pacientů a detekovala se vazba IgE protilátek (IBL, Hamburg, Germany) pomocí anti-IgE protilátek značených 125I. Membrány se vystavily rentgenografickému filmu (Kodak, Rochester, NY). Pozitivní klony, jejichž proteiny byly schopné vazby lidského IgE se projevily jako tmavé skvrny na rentgenografickém filmu (příklad autoradiogramu takovéto membrány je uveden na obrázku 2).
Fágová DNA pozitivních klonů se amplifikovala s použitím lambda gt 11 původního primeru (5' CGG GAT CCC GGT TTC CAT ATG GGG ATT GGT GGC GAC GAC TCC TGG AGC CCG TGA GTA TCG GCG GAA TTC 3') a lambda gtl 1 zpětného primeru (5' GAA TTC CAG CTG AGC GCC GGT CGC TAC CAT TAC CAG TTG GTC TGG TGT CAA CGG GAT CGC CG 3') a naamplifikované PCR produkty se sekvenovaly. Získané nukleotidové sekvence se analyzovaly srovnáním se sekvenční databází (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/).
Příklad 2: Neshoda v alergenní aktivitě a IgE-reaktivita mléčných složek
Za účelem vyhodnocení, zda má molekula alergenní potenciál je třeba prokázat nejen její IgEreaktivitu, ale také biologickou aktivitu. Vědecky ověřeným modelem pro testování biologické reaktivity molekul je vyvolání uvolnění histaminu z lidských bazofilových granulocytů (Purohit 2005). K tomuto účelu se použila buněčná linie žímých buněk exprimující α-řetězec lidského FceRI receptoru (Hoffmann a kol., Int Arch Allergy Immunol, ročník 126(4), p. 277-285). Testovaly se různé mléčné složky (n=33) včetně celých mléčných extraktů různých druhů, mléčných frakcí, přečištěných přírodních a rekombinantních kravských mléčných proteinů a fragmentů rekombinantních proteinů. Stanovila se procenta ze 78 pacientů, jejichž sérové IgE protilátky vyvolaly uvolnění β-hexosaminidázy z humanizovaných buněk RBL jako reakce na jednotlivé složky mléka, (obrázek 3).
Nejpotentnější buňku aktivující složkou bylo kravské mléko s rychlostí stimulace 47,4 % (obrázek 3, panel vzorky mléka). Ale také kozí a ovčí mléko vykazovalo hodnoty 35,9 a případně 28,2 %, potvrzující křížovou reaktivitu mléčných proteinů z různých zdrojů. U jedné složky přečištěné proteiny, kaseiny (AC, BC, KC), stejně jako beta-laktoglobulin A (BLGA) vykazovaly nejvyšší aktivitu a vyvolávaly uvolnění 25 až 34,6 % pacientova séra. Zajímavé je, že rekombinantní forma alfa-laktalbuminu (rALA) vyvolala mnohem větší uvolnění než přírodní forma. Každý ze syntetických peptidů měl poněkud nižší buněčný aktivační potenciál, přičemž bylo dosaženo stimulační rychlosti 2,6 až 7,7%. Biologická aktivita se srovnala s aktivitou IgE (tabulka 2).
-14CL 305786 B6
Tabulka 2: Vazebná kapacita IgE a biologická aktivita mléčných složek; rozdíl mezi IgE a alergenní aktivitou mléčných složek. Mléčné složky vykazovaly větší IgE reaktivitu než alergenní aktivitu ve stanovení s lidskými RBL.
Biologická aktivita (% Vazba IgE (% pacientů) pacientů)
| i ............. _ ........ - ...... | |||||
| 1 Vzorky mléka | UM | JO,* ; | - | ||
| CM | 47,4 ' | 85,9 | |||
| · .............. | SM............ | 28,2 .................. | 82,1 ' | ---------- j | |
| . ................—......---------------.. | UM | 9.0 ................... । | 17,9 | ||
| MM . iGC | 9.0 | 29,5 | |||
| i .......... *..... ......— -....... | 24,4 ' | 46 2 | '' ...........’ i | ||
| : Kaseinové frakce L. __ | |||||
| CČ | 41,0 | 52,6................ | |||
| f | sc | .28,2 i | 46.2 | ............................-i | |
| - . .... . . | Ác | 25.6 · | 50,0 | ||
| Přírodní přečištěné | |||||
| wv | 34,6 | 44,9 | ΐ ............ j | ||
| [ proteiny | |||||
| KC..... | 25.6 | 30,8 | |||
| ALA | 11,5 | 65,4 | i | ||
| j | íSlga ' | 78.2 ’ | 50,0 | ||
| BLGB | i 19,2 . | 51,3 | |||
| BSA 1 | 2.1 .................................. | M.......... | |||
| SSA | 2,6 | | I1·3 | |||
| hALA........í 1 i | 16.4............ । | !30,a | 1 | ||
| Lf ' ’ | 2,6 ....................... | 5,1....... | |||
| i | |||||
| : Rekombinantní | rAS1Č | | 19,2................... - -- --......- | 48,7 | ||
| proteiny | rAS2C ! | i 5,1........................................... | 9.0 ........ | ..........................1 | |
| rBC 10.3 | 55,1 ! ' I | ||||
| rKC j .............. I | 8,4 | 21,8 | |||
| /BLG | 12,8 | 23,1............. | |||
| •rALA .L........ | 218 i | 25,6 |
- 15CZ 305786 B6
| i | Biologická aktivita Vazba IgE (% (% pacientů) pacientů) | ||
| Rekombinantní fragmenty BSA | BšÁy 1 | ||
| í 4,3 ;2,1 | |||
| i | BSA_F 2 | i · Í4.3 | 8,5 ’ ____________________________________j |
| BSA_F 3 | 8,5 i | i 8,5 | |
| ΐ | i j - ______ — - _____ w , | I | |
| Syntetické peptidy AS1C | Cas 1 | ]6,4 | i 43.6 |
| , i | Cas2 | Í3>8......................~~...................~1 | i 15,4 |
| Cas 3 | 2,6 | 46,2 | |
| Čas 4 | 3,8 | ; 35,9 i [ ______ .I | |
| Čas 5 | 5,1 ' i____________J | 41,0 [ | |
| Cas 6 | ;7,7 | [37,2 j |
Největší množství testovaných složek mléka, jako například kravského a kozího mléka, přečištěné A a B varianty přírodního beta-globulinu (BLGA a BLGB) a rekombinantní alfaSl- a (rASIC) alfaS2-kasein (rAS2C) prokázali přibližně dvakrát větší procento IgE-reaktivity než biologické aktivity. Tyto výsledky je možné vysvětlit přítomností IgE vazebných epitopů, které jsou schopné vazby IgE, ale nejsou schopné zesíťovat receptor, vázat IgE a vyvolat uvolnění mediátorů. Pouze v případě pěti složek (rekombinantního BSA fragmentu 3 (F3), rekombinantního alfa-laktalbumin (rALA), frakce kravského kaseinu (CC), přírodního přečištěného kappa- (KC) a beta-kaseinu (BC)) dosahovala procenta IgE-reaktivity a biologické aktivity podobných hodnot. Míra degranulace u syntetických peptidů odvozených od alfaSl-kaseinu byla poněkud nižší v rozsahu od přibližně od desetiny (Cas 3, Cas 4, Cas 5) až čtvrtiny (Cas 2, Cas 6) aktivity celého proteinu.
Bylo zjištěno, že mnoho IgE-reaktivních alfa-S 1-kaseinových peptidů nemůže vyvolat degranulaci ve stanovení uvolňování bazofily a reprezentovat tak IgE-reaktivní hapteny. Tyto peptidy (hapteny) jsou proto nealergenní. Z tohoto výsledku vyplývá, že samotné testování IgE by vedlo k falešně pozitivním závěrům s ohledem na stanovení alergenicity. Na druhé straně IgE-reaktivní hapteny mohou být využitelné jako terapeutické látky k nasycení mastocytů vážících se k IgE před vystavením alergenu a mohou být užitečnými kandidáty pro bezpečnou imunoterapii alergických onemocnění. Dále byly nalezeny peptidy odvozené od AlfaSl-kaseinu, které se váží k IgE a vyvolávají uvolnění bazofily, a u sér některých pacientů bylo zjištěno, že nevykazují IgEreaktivitu k některým peptidům, ale při kontaktu s těmito peptidy byla vyvolána degranulace bazofilů. Pozdější výsledek může být vysvětlen vyšší citlivostí stanovení uvolňování bazofily.
V souhrnu, srovnání měření reaktivity IgE a biologické aktivity odhalilo, že séra pacienta vykazovala vyšší kapacitu ve vazbě IgE než ve vyvolání degranulace bazofilů. Skutečnost, že stanovení alergenicity odráží potenciál molekuly vyvolat alergické symptomy, vede k závěru, že měření reaktivity IgE samo o sobě není možné použít k detekci určitých alergenních složek, ale je třeba jej doplnit biologickým stanovením.
-16CZ 305786 B6
Kombinace obou měření, stanovení IgE vazebné kapacity a biologické reaktivity umožňuje vytvořit databázi obsahující alergenní proteiny/fragmenty/peptidy, které je možné detekovat hmotnostní spektrometrií. Obrázek 4 ukazuje seznam sekvencí alergenních mléčných peptidů a proteinů, které představují prototyp této databáze. Uvedeny jsou mléčné složky testované na reaktivitu IgE séra z hlediska alergenní aktivity. Uvedeny jsou také informace vztahující se k názvům alergenů, molekulové hmotnosti (MW) v kilo Daltonech (kDa), funkce a příprava alergenů stejně jako odkazy.
Experimentální protokol
Použila se séra 78 pacientů, kteří byli vybráni podle pozitivní anamnézy, pozitivní reakce kožního prick testu a stanovení specifického IgE k extraktu kravského mléka s použitím zařízení CAPFELA System (Phadia, Uppsala, Sweden). Séra se získala od pěti dospělých a 73 dětí (30 žen a 43 mužů) z Rakouska, Německa, Itálie, Španělska a Francie.
Od Sigma Aidrich (St. Louis, US) se získaly přečištěné proteiny a kaseinové frakce. Rekombinantní proteiny a rekombinantní fragmenty BSA se exprimovaly v E.coli, jak je popsáno (Vrtala a kol., 1997). AlfaSl-kaseinové peptidy se syntetizovaly na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems Model 433A jak je popsáno (Focke et al., 2001).
Humanizované krysí buňky bazofilové leukemie (RBL) (klon RBL-703/21) se inkubovaly v mikrotitračních destičkách přes noc při 37 °C (7% CO2, 95% vlhkost) s 50 μΐ lidského séra, zředěného 1:10. Poté se buňky promyly a vystavily se mléčným složkám, se zředěním na 0,3 pg/ml proteinu v Tyrodovém pufru obsahujícím 50% D2O a 0,1% BSA/HAS po dobu 1 hodiny při 37 °C (7% CO2, 95% vlhkost). Sledovalo se také spontánní uvolňování z buněk. Nakonec se supematanty buněk inkubovaly s 50 μΐ reakčního roztoku (0,1 M kyseliny citrónové nebo citrátu sodného, pH 4,5, 160 μΜ 4-methylumbeliferyl-N-acetyl-P-D-glukosaminidu) v nových mikrotitračních destičkách při 37°C (7% CO2, 95% vlhkost) po dobu 1 h. Reakce se zastavila přídavkem 100 μΐ glycinového pufru na jamku a měřila se fluorescence při λ^: 360 a λ^: 465 s použitím fluorescenční čtečky mikrodestiček. Specifické uvolnění hexosaminidázy u každého vzorku se vypočetlo s použitím vzorce: [(FIS - FIsp) : (FIZ - FISp)] x 100 (kde FIS je fluorescence vzorku; FIsp je fluorescence spontánního uvolnění a FIZ je fluorescence celkového uvolnění).
Příklad 3: Detekce proteinů a/nebo peptidů s alergenní aktivitou nebo bez alergenní aktivity ve vzorku mléka a mléčných produktech hmotnostní spektrometrií.
Sekvenční databáze alergenních mléčných proteinů a peptidů vytvořená kombinací reaktivity IgE a alergenní aktivity může poskytnout základ pro vývoj spolehlivé, reprodukovatelné analytické metody pro stanovení a předpovědi alergenicity vzorků mléka a mléčných produktů. K detekci potenciálně alergenních složek v komplexu mléčných vzorků se použila hmotnostní spektrometrie. Jako příklad se pro analýzu komerčně dostupné, do značné míry hydrolyzované hypoalergenní mléčné formulace použila hmotnostní spektrometrie v kombinaci s protisměrnou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií (HPLC). Analýza chromatogramu uvedená na obrázku 5 a extrahované hmotnostní spektrum prokázalo, že všechny proteiny byly hydrolyzovány na malé peptidy s maximální délkou 14 aminokyselin.
Přesněji, obrázek 5 ukazuje separaci hydrolyzované mléčné formulace s použitím nano kapalinové chromatografíe s následnou MS (electrosprej ionizace). Prezentace celkového iontového chromatogramu 1 pg hydrolyzovaného vzorku s mlékem. Retenční časy jsou uvedeny na ose x a intenzita signálu v cps (počet za sekundu) je uvedena na ose y.
Vyhledávání v databázi s použitím algoritmu MASCOT Search vedla k detekci několika malých peptidů, z nichž tři byly detekovány jako alergeny odvozené od mléka, přesněji beta-kasein (Bos
-17CZ 305786 B6 d 8 beta, obrázek 6). Na obrázku 6 je uvedeno vyhledávání pomocí algoritmu Mascot a detekce peptidu odvozeného od beta-kaseinu u hydrolyzovaného kravského mléka. Beta-kasein nahoře, jediný detekovaný mléčný alergen hmotnostní spektrometrií, je uveden s molekulovou hmotností a vypočteným pí. Níže jsou uvedeny vyhledávací parametry a získané sekvenční pokrytí betakaseinu. Dole je uvedena sekvence beta-kaseinu s odpovídajícími peptidy vytištěna tučně. Alergen beta-kaseinu se detekoval podle odpovídajících peptidů: HQPHQPLPPT (vypočtená hmotnost 1,25 kDa, odpovídající aa 160-170 beta-kaseinu), VYPFPGPIPN (vypočtená hmotnost 1,19 kDa, odpovídající aa 74-84 beta-kaseinu), SSSEE (vypočtená hmotnost 0,65 kDa, odpovídající aa 31 -36 beta-kaseinu), a PVVVPP (vypočtená hmotnost 0,87 kDa, odpovídající aa 96-103 beta-kaseinu). Na obrázku 7 je uvedena reaktivita IgE při testování těchto peptidů (tabulka 1 : cas b-1, 2, 3 a 4; obrázek 7). Detekované peptidy v hydrolyzovaném kravském mléce odvozené od beta-kaseinu nejsou IgE-reaktivní. IgE-reaktivita skvrn kravského mléka (CM) na nitrocelulóze, rekombinantního beta-kaseinu (rBC), syntetických peptidů odvozených od beta-kaseinu (cas b-1, cas b-2, cas b-3, cas b-4) a rekombinantního alfaSl-kasein (rASIC) byla analyzována stanovením dot blot. Mléčné složky navázané na nitrocelulózu se inkubovaly se sérem tří pacientů alergických na kravské mléko (linie 1, 2 a 3) a nealergického jedince (linka C). Detekovala se vazba protilátek IgE pomocí anti-IgE protilátek značených 125I. Tento obrázek a výsledky ukazují, že představují nealergenní peptidy, to znamená, že jsou příliš krátké pro vazbu protilátek IgE a mohou být proto odlišeny od alergenních a IgE-reaktivních peptidů podle definice v databázi IgE reaktivních a alergeních peptidů/proteinů odvozených od kravského mléka. Navíc se liší od publikovaných hlavních IgE vazebných oblastí beta-kaseinu (aa 1-16, aa 83-92, aa 135-144; Chatchatee 2001). Žádný z jiných IgE-reaktivních mléčných alergenů a alergenových fragmentů získaných screeningem expresní knihovny cDNA (obrázek 1) nebyl detekován v hydrolyzovaném vzorku mléka, proto mohl být vyhodnocen jako nealergenní výrobek. Jak bylo prokázáno s použitím značně hydrolyzovaného mléka - analýzu LC-MS je možné použít k detekci nealergenních mléčných přípravků/vzorků.
Tabulka 1. A) Syntetické peptidy aSl-kaseinu a fragmentů BSA. Uvádí se názvy peptidů, jejich aminokyselinová sekvence, délka, pí a molekulová hmotnost v kDa.
- 18CZ 305786 B6
| ' peptid | ... . . . sekvence ! | délka (·*) | ( ι* | MW (kDa) |
| Cas1 | RPKHPIKHQGLPQEVLNENLLRFFVAPF PEVC i | Í 32 | 8.22 I | 13.75 j |
| Cas2 | FGKEKVNELSKDIGSESTEDQAMEDIK QMEAES | 33 | 4.18 | [ 3.70 ‘Í J j............: |
| Cas3 | r ISSSEEIVPNSVEQKHIQKEDVPSERYL GYEQILRC | 36 | 4.80 | 4.21 j |
| Cas4 | HAQQKE | 34 * | 8.14 । | ^3.96 |
| . Cas5 Cas6 | CPMIGVNQELAYFYPELFRQFYQLDAY . PSGAWYYV | 35 | j 4.14 | {4.24 j j.................... |
| PLGTQYTDAPSFSDIPNPIGSENSEKTT MPLWC | 33 | 3.92 | 3.60 | |
| Í i ' BSAF1 L_ | MRGVFRRDTHKSEIAHRFKDLGEEHFK GLVUAFSQYLQQCPFDEHVKLWELTE FAKTCVAOESHAGCEKSLHTLFGDELC KVASLRETYGDMADCCEKQEPERNEC | ....... í 190 I | 5.95 I--------------------- | ! 23.9 J |
| peptid | sekvence | I ; délka ι(>·1 | pi | ....................'I MW (kDa) |
| FLSHKDDSPDLPKLKPDPNTLCDEFKA I DEKKFWGKYLYEIARRHPYFYAPELLY YANKYNGVFQECCQAEOKGACLLPKIE TMREKVLTSSHHHHHH__ | i | } I t | i | |
| BSAF2 i..... I | MARQRLRCASIQKFGERALKAWSVAR LSQKFPKAEFVEVTKLVTDLTKVHKEC CHGDLLECADDRADLAKYICDNQDTIS SKLKECCDKPLLEKSHCIAEVEKDAIPE NLPPLTADFAEDKDVCKNYQEAKOAFL GSFLYEYSRRHPEYAVSVLLRLAKEYE ATLEECCAKDDPHACYSTVFDKLKHLV DEHHHHHH .................... ...... _ | 189 | j 5.94 I I í | 22.6 Í |
| I i I ’ 1 Í |bSAF3 I I i I i | MPQNLIKQNCDQFEKLGEYGFQNALIV RYTRKVPQVSTPTLVEVSRSLGKVGTR CCTKPESERMPCTEDYLSLILNRLCVLH EKTPVSEKVTKCCTESLVNRRPCFSAL TPDETYVPKAFOEKLFTFHADICTLPOT EKQIKKQTALVELLKHKPKATEEQLKTV ' MENFVAFVDKCCAADDKEACFAVEGP KLWSTQTALAHHHHHH | .........·. . ·. ·. .·... j 200 | 7.54 : | 23.4 j i 1 |
-19CZ 305786 B6
B) Syntetické peptidy β-kaseinu. Uvádí se názvy peptidů, jejich aminokyselinová sekvence, délka, pí a molekulová hmotnost v kDa.
| peptid | sekvence | { délka (»a) | p* ! | MW j (kDa) 5 » |
| cas b-1 | HQPHQPLPPTV | 11 | i 6.92 | | ; 1.25 ' |
| casb-2 | VYPFPGPIPNS..... | 11 | 5.49 ; 1............ ...........: | 1J9 1 |
| casb-3 | LSSSEE | : 4.24 ; ' 1 | 065 l ' i | |
| cas b-4 _______________________ | PVWPPFL | ί 8 | '5.96 j | 0.87 J |
Experimentální protokol:
Hydrolyzované mléčná formule se analyzovala HPLC s reverzní fází s použitím nano kapalinové chromatografíe (Ultimate, LC Packings Dionex, The Netherlands) spojené s nanosprejovým rozhraním hmotnostního spektrometru HCT-Ultra (Bruker Daltontk, Germany). Získaná hmotnostní spektra se vyhledávala v proteinové databance SwissProts použitím softwarového vyhledávajícího algoritmu MASCOT (Matrix Science, London, United Kingdom). Pro dot blot analýzu se 1 gg proteinu umístil na nitrocelulózu a inkuboval se se sérem pacienta alergického na mléko zředěním 1:20 v PBST (PBS, 0,5% v/v Tween 20). Vazba IgE protilátek se detekovala pomocí lidských anti-IgE protilátek značených l25I (IBL, Germany) ve zředění 1:15.
Příklad 4: Mapování epitopu hovězího alfa-laktalbuminu (ALA) k identifikaci IgE-reaktivních ALA-odvozených peptidů
Metody
Syntéza peptidů odvozených od ALA: peptidy odvozené od ALA (Lacl-Lac8) uvedené v tabulce I se syntetizovaly s použitím metody Fmoc (9-fluorenylmethoxykarbonyl) aktivací pomocí HBTU [(2-(l/7-Benzotriazol-l-yl)l,l,3,3-tetramethyluronium hexafluorofosfát] (0,1 mmol, cykly malého měřítka) na peptidovém syntetizátoru Applied Biosystems, Model 433A (Foster City, CA) a přečistili se, jak je popsáno (Focke a kol., Faseb J 15:2042-2044).
Testování IgE-reaktivity na ALA-odvozené peptidy: reaktivita IgE ALA-odvozených peptidů se stanovila mikroanalýzou, jak je popsáno (Schulmeister et af, J.Immunol. 182(1 1):7019-29). Stručně, složky mléka se nakapaly na membránu s kapilárním tokem běžného mikroskopického sklíčka a inkubovaly se s 25 gl pacientova séra.
Vazba IgE protilátek se detekovala fluorescenčně-konjugovanou IgE protilátkou při vlnové délce 670 nm. Konečné množství se nastavilo u každého pacienta jako dvojnásobná hodnota hodnoty získané s lidským sérovým albuminem jedince.
Výsledky
Detekce ALA epitopů, které jsou reaktivní s IgE protilátkami.
Za účelem detekce IgE reaktivních epitopů ALA bylo syntetizováno 8 peptidů s klíčovou ALA sekvencí (tabulka 2). 8 peptidů mělo délku 19-20 aminokyselin spřekryvem 5 aminokyselin. IgE-reaktivita 8 překiývajících se peptidů se vyhodnotila mikroanalýzou s použitím séra od 36 pacientů vykazujících IgE-reaktivitu k ALA: Bylo zjištěno, že 30,6 % pacientů reagovalo na Lacl, 33,3 % na Lac2, 5,6 % na Lac4, 2,8 % na Lac5, Lac6 a Lac7, a 11,1 % na Lac 8 (tabulka
-20CZ 305786 B6
3). Celkem 19 z 36 pacientů s IgE-reaktivitou na rALA reagovalo nejméně s jedním syntetickým peptidem odvozeným od ALA.
Tabulka 2. Syntetické ALA-odvozené peptidy3.
| [ peptid | sekvence | délka | (aa)pl MW(kDa) |
| Lad | EQLTKCEVFRELKDLKGYG | í 19 | 6 34 2 26 | |
| Lac2 | LKGYGGVSLPEWVCTTFHTS | i20 | ; 6.74 i 2.18 i |
| Lac3 | TFHTSGYDTQAIVQNNDSTE | 20 | i 4.31 i 2.23 1_______; . |
| Lac4 , | : NDSTEYGLFQINNKIWCKDD | 20 | J 4.4212.40 |
| !Lac5 | WČKĎDQNPHŠSNIČNISCOk | 20 | |5~30|2.31 |
| Lac6 | ÍSCOkFLDOOLTTOIMČVKK | 20 | ! 4.11! 2.32 „____L____L___—. .. |
| |Lac7 | MCVKKILDKVGINYWLAHKA | 20 | i 9.52 i 2.33 ....... 4__„„J „___j |
| |Lac8 | LAHKALCSEKLDQWLCEKL | P........... | 674 2 23 i ...................? U |
“Zkratky použité v tabulce: Lacl-Lac8, peptidy 1-8 odvozené od ALA; aa, aminokyseliny; pí, 10 izoelektrický bod; MW molekulová hmotnost; kDa, kiloDalton.
Tabulka 3. IgE vazebná kapacita peptidů odvozených od alfa-laktalbuminu testovaných pomocí sér 36 pacientů s IgE-reaktivitou k rALA.
| n=36 | ; Vazba IgE (% pacientů) | |
| Rekombinantní ALA | rALA j 100.0 | |
| j synthetic ALA peptides | Lad | ?30.6 š |
| f | Lac2 | 33 3 ; |
| Lac3 | 0 : | |
| Lac4 | 5.6 ......’ j | |
| Lac5 | 2.8 | |
| ................................................... | Lac6 | 2 8 |
| Lac7 | _______________________________________________ 28 | |
| Lac8 | 11.1 |
Claims (7)
1. Způsob detekce alergenních kravských mléčných alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinových proteinů a/nebo peptidů zahrnujících kroky:
a) opatření nejméně jedné expresní knihovny obsahující DNA nebo cDNA odvozenou od tkáně mléčné žlázy kojící krávy,
b) expresi nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu kódovaného uvedenou expresní knihovnou,
c) stanovení vazebné kapacity uvedeného nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappakaseinového proteinu nebo peptidů k IgE nejméně jednoho séra jedince citlivého na kravské mléko,
d) kontakt nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu vykazujícího IgE vazebnou kapacitu podle stanovení v kroku c) s bazofily nebo mastocyty a
e) detekci nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidu jako alergenního, pokud uvedené bazofily nebo mastocyty po kontaktu s nejméně jedním alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinovým proteinem nebo peptidem z kroku d) uvolňují nejméně jeden mediátor.
2. Způsob podle nároku 1, který dále zahrnuje krok stanovení aminokyselinové sekvence nejméně jednoho alfaS 1 -, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinového proteinu nebo peptidů detekovaného v kroku e).
3. Způsob podle nároku 1, ve kterém se přítomnost nejméně jednoho alfaSl-, alfaS2-, betanebo kappa-kaseinového proteinu a/nebo peptidů stanoví hmotnostní spektrometrií.
4. Způsob podle nároku 3, ve kterém se alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinové proteiny a/nebo peptidy přítomné ve vzorku před hmotnostní spektrometrií izolují.
5. Způsob podle nároku 4, ve kterém se alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinové proteiny a peptidy izolují elektroforetickou metodou.
6. Způsob podle nároku 5, kdy elektroforetickou metodou je dvojdimenzionální elektroforéza.
7. Způsob podle nároku 4, ve kterém se alfaSl-, alfaS2-, beta- nebo kappa-kaseinové proteiny a peptidy izolují vysoko účinnou kapalinovou chromatografií.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US19641608P | 2008-10-17 | 2008-10-17 | |
| PCT/EP2009/063696 WO2010043724A1 (en) | 2008-10-17 | 2009-10-19 | Method for identifying allergenic proteins and peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2011223A3 CZ2011223A3 (cs) | 2012-03-21 |
| CZ305786B6 true CZ305786B6 (cs) | 2016-03-16 |
Family
ID=41480083
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2011-223A CZ305786B6 (cs) | 2008-10-17 | 2009-10-19 | Způsob detekce alergenních proteinů a peptidů |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US8859210B2 (cs) |
| EP (1) | EP2347264B1 (cs) |
| CN (1) | CN102187226B (cs) |
| BR (1) | BRPI0919789A2 (cs) |
| CA (1) | CA2740255A1 (cs) |
| CO (1) | CO6351822A2 (cs) |
| CZ (1) | CZ305786B6 (cs) |
| ES (1) | ES2445869T3 (cs) |
| MX (1) | MX2011002975A (cs) |
| MY (1) | MY153980A (cs) |
| NO (1) | NO342293B1 (cs) |
| PE (1) | PE20110709A1 (cs) |
| PL (1) | PL2347264T3 (cs) |
| RU (1) | RU2519674C2 (cs) |
| TW (1) | TWI471565B (cs) |
| WO (1) | WO2010043724A1 (cs) |
Families Citing this family (23)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8859210B2 (en) * | 2008-10-17 | 2014-10-14 | Mead Johnson Nutrition Company | Method for identifying allergenic proteins and peptides |
| PL2332428T3 (pl) * | 2009-12-04 | 2015-02-27 | Mjn Us Holdings Llc | Formulacja odżywcza zawierająca hydrolizat zawierający peptydy mleka krowiego i/lub pochodzące z niego peptydy do indukowania tolerancji |
| US9345727B2 (en) * | 2013-03-15 | 2016-05-24 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional compositions containing a peptide component and uses thereof |
| US9345741B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-24 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional composition containing a peptide component with adiponectin simulating properties and uses thereof |
| US9289461B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-03-22 | Mead Johnson Nutrition Company | Reducing the risk of autoimmune disease |
| US8889633B2 (en) | 2013-03-15 | 2014-11-18 | Mead Johnson Nutrition Company | Nutritional compositions containing a peptide component with anti-inflammatory properties and uses thereof |
| US9352020B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-05-31 | Mead Johnson Nutrition Company | Reducing proinflammatory response |
| US9138455B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-09-22 | Mead Johnson Nutrition Company | Activating adiponectin by casein hydrolysate |
| CN106662578B (zh) | 2014-04-03 | 2021-11-12 | 艾勒詹尼斯有限责任公司 | 用于检测食物变态反应的肽、试剂和方法 |
| WO2016164920A1 (en) * | 2015-04-09 | 2016-10-13 | Cornell University | Gene therapy to prevent reactions to allergens |
| CN104807988B (zh) * | 2015-04-29 | 2017-02-01 | 何韶衡 | 一种嗜碱性粒细胞的特异性免疫识别方法 |
| CN104777303B (zh) * | 2015-04-29 | 2017-02-01 | 何韶衡 | 一种嗜碱性粒细胞激活、脱颗粒的鉴定方法 |
| RU2666254C1 (ru) * | 2017-05-11 | 2018-09-06 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации (ФГБОУ ВО СПбГПМУ Минздрава России) | Способ диагностики пищевой аллергии у детей |
| CN107817311B (zh) * | 2017-09-27 | 2019-08-23 | 绿城农科检测技术有限公司 | 一种液质联用检测配方奶粉中酪蛋白磷酸肽含量的方法 |
| US11408895B1 (en) | 2018-04-09 | 2022-08-09 | Hob Biotech Group Corp., Ltd. | Allergen characterization, potent allergen product formulation, comprehensive allergen reagent, and allergy assay |
| CN111766324B (zh) * | 2020-07-10 | 2022-12-06 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽组合及方法 |
| US20230251269A1 (en) * | 2020-07-15 | 2023-08-10 | The Johns Hopkins University | Comprehensive analysis of anti-allergen antibodies using phage display |
| JP7796376B2 (ja) * | 2021-03-31 | 2026-01-09 | 学校法人藤田学園 | 牛乳アレルギーの新規抗原 |
| CN114437238B (zh) * | 2022-01-26 | 2024-03-26 | 浙江工业大学 | 胶原蛋白肽-牛乳铁蛋白肽融合蛋白、基因及其表达方法 |
| EP4689130A2 (en) * | 2023-03-31 | 2026-02-11 | Mozza Foods Inc. | Methods and compositions for enhanced expression of exogenous caseins in transgenic plants |
| CN116355895B (zh) * | 2023-04-10 | 2025-07-29 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种利用噬菌体展示文库筛选β-乳球蛋白特异性结合多肽方法 |
| CN119320439B (zh) * | 2023-07-06 | 2026-03-17 | 中国科学院大连化学物理研究所 | 一种牛乳内源性抗菌肽及其应用 |
| WO2025181553A2 (en) * | 2024-02-27 | 2025-09-04 | Bon Vivant | Compositions comprising truncated casein polypeptides |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2347264B1 (en) * | 2008-10-17 | 2013-11-27 | Mead Johnson Nutrition Company | Method for identifying allergenic proteins and peptides |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6849427B1 (en) * | 1993-03-12 | 2005-02-01 | Immulogic Pharmaceutical Corp. | Nucleic acids encoding a house dust mite allergen, Der p VII, and uses therefor |
| ES2383002T3 (es) * | 1998-01-30 | 2012-06-15 | Allertein Therapeutics, Llc | Prueba pronóstica de alergia |
| US6799121B2 (en) * | 2000-03-30 | 2004-09-28 | York University | Sequencing of peptides by mass spectrometry |
| RU2187817C2 (ru) * | 2000-05-15 | 2002-08-20 | Московский НИИ педиатрии и детской хирургии | Способ прогнозирования развития аллергических реакций у детей раннего возраста |
| CN101178406A (zh) * | 2007-12-05 | 2008-05-14 | 杭州浙大生物基因工程有限公司 | 过敏原特异性抗体IgE ELISA检测试剂盒及其制备方法 |
-
2009
- 2009-10-16 US US12/581,108 patent/US8859210B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2009-10-19 RU RU2011119613/15A patent/RU2519674C2/ru not_active IP Right Cessation
- 2009-10-19 CN CN200980140631.0A patent/CN102187226B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2009-10-19 WO PCT/EP2009/063696 patent/WO2010043724A1/en not_active Ceased
- 2009-10-19 CA CA2740255A patent/CA2740255A1/en not_active Abandoned
- 2009-10-19 TW TW98135260A patent/TWI471565B/zh not_active IP Right Cessation
- 2009-10-19 PE PE2011000911A patent/PE20110709A1/es not_active Application Discontinuation
- 2009-10-19 MX MX2011002975A patent/MX2011002975A/es active IP Right Grant
- 2009-10-19 BR BRPI0919789A patent/BRPI0919789A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2009-10-19 PL PL09748734T patent/PL2347264T3/pl unknown
- 2009-10-19 MY MYPI2011001121A patent/MY153980A/en unknown
- 2009-10-19 CZ CZ2011-223A patent/CZ305786B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2009-10-19 ES ES09748734.2T patent/ES2445869T3/es active Active
- 2009-10-19 EP EP09748734.2A patent/EP2347264B1/en not_active Not-in-force
-
2011
- 2011-03-14 CO CO11030983A patent/CO6351822A2/es not_active Application Discontinuation
- 2011-03-21 NO NO20110426A patent/NO342293B1/no not_active IP Right Cessation
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP2347264B1 (en) * | 2008-10-17 | 2013-11-27 | Mead Johnson Nutrition Company | Method for identifying allergenic proteins and peptides |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| BLANC FANY ET AL: "Update on optimized purification and characterization of natural milk allergens" MOLECULAR NUTRITION & FOOD RESEARCH, vol. 52, no. Suppl. 2, 26 May 2008 (2008-05-26), pages S166-S175 * |
| NATALE MASSIMO ET AL: "Cow's milk allergens identification by two-dimensional immunoblotting and mass spectrometry" MOLECULAR NUTRITION & FOOD RESEARCH, vol. 48, no. 5, October 2004 (2004-10), pages 363-369 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CO6351822A2 (es) | 2011-12-20 |
| EP2347264A1 (en) | 2011-07-27 |
| CA2740255A1 (en) | 2010-04-22 |
| RU2519674C2 (ru) | 2014-06-20 |
| NO342293B1 (no) | 2018-04-30 |
| US8859210B2 (en) | 2014-10-14 |
| MY153980A (en) | 2015-04-30 |
| PL2347264T3 (pl) | 2014-06-30 |
| TW201030341A (en) | 2010-08-16 |
| NO20110426A1 (no) | 2011-04-28 |
| CN102187226A (zh) | 2011-09-14 |
| CN102187226B (zh) | 2014-05-14 |
| ES2445869T3 (es) | 2014-03-05 |
| HK1161913A1 (en) | 2012-08-10 |
| US20100143262A1 (en) | 2010-06-10 |
| WO2010043724A1 (en) | 2010-04-22 |
| RU2011119613A (ru) | 2012-11-27 |
| MX2011002975A (es) | 2011-04-11 |
| CZ2011223A3 (cs) | 2012-03-21 |
| PE20110709A1 (es) | 2011-11-13 |
| BRPI0919789A2 (pt) | 2016-05-03 |
| TWI471565B (zh) | 2015-02-01 |
| EP2347264B1 (en) | 2013-11-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ305786B6 (cs) | Způsob detekce alergenních proteinů a peptidů | |
| US6451368B1 (en) | Method of selecting non-diabetogenic milk or milk products and milk or milk products so selected | |
| Saarelainen et al. | Assessment of recombinant dog allergens Can f 1 and Can f 2 for the diagnosis of dog allergy | |
| US8211658B2 (en) | Complex of a chaperone with β-amyloid and methods employing this complex | |
| Botros et al. | Biochemical characterization and surfactant properties of horse allergens | |
| JPH11514852A (ja) | 後天性副甲状腺機能低下症患者における自己抗体およびその測定方法 | |
| Chow et al. | Purification and structural analysis of the novel glycoprotein allergen Cyn d 24, a pathogenesis‐related protein PR‐1, from Bermuda grass pollen | |
| US11759498B2 (en) | Composition for diagnosing allergies to mites, method of diagnosing allergies to mites, and composition for preventing or treating allergies to mites | |
| JP5229789B2 (ja) | 新規ストレスバイオマーカー及びその用途 | |
| HK1161913B (en) | Method for identifying allergenic proteins and peptides | |
| RU2592674C2 (ru) | Аллергены, полученные рекомбинантными способами | |
| EP1711604B1 (en) | Diabetogenic epitopes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20161019 |