CZ306149B6 - Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové - Google Patents
Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové Download PDFInfo
- Publication number
- CZ306149B6 CZ306149B6 CZ2014-662A CZ2014662A CZ306149B6 CZ 306149 B6 CZ306149 B6 CZ 306149B6 CZ 2014662 A CZ2014662 A CZ 2014662A CZ 306149 B6 CZ306149 B6 CZ 306149B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- production
- japonochytrium
- production strain
- fatty acids
- docosahexaenoic acid
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 241000003482 Japonochytrium Species 0.000 title abstract description 18
- DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCCC=CC=CC=CC=CC=CC=CC(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 4
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 18
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims abstract description 14
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 9
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 8
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims abstract description 5
- 239000003921 oil Substances 0.000 claims abstract description 5
- 235000020777 polyunsaturated fatty acids Nutrition 0.000 claims abstract description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 5
- MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N all-cis-docosa-4,7,10,13,16,19-hexaenoic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCC(O)=O MBMBGCFOFBJSGT-KUBAVDMBSA-N 0.000 claims description 57
- 235000020669 docosahexaenoic acid Nutrition 0.000 claims description 30
- 229940090949 docosahexaenoic acid Drugs 0.000 claims description 29
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 8
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 3
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 claims description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 abstract description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 12
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 12
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 12
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 11
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 235000020660 omega-3 fatty acid Nutrition 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 229940012843 omega-3 fatty acid Drugs 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000006014 omega-3 oil Substances 0.000 description 5
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 4
- 150000004670 unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 4
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 3
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 3
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 235000021323 fish oil Nutrition 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 2
- -1 DHA unsaturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241000598397 Schizochytrium sp. Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 2
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 2
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 2
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 2
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 2
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 239000013535 sea water Substances 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N (2e,4e,6e,8e,10e,12e)-docosa-2,4,6,8,10,12-hexaenoic acid Chemical compound CCCCCCCCC\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C=C\C(O)=O DVSZKTAMJJTWFG-SKCDLICFSA-N 0.000 description 1
- 229910019614 (NH4)6 Mo7 O24.4H2 O Inorganic materials 0.000 description 1
- GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 6-Ketone, O18-Me-Ussuriedine Natural products CC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCC=CCCCC(O)=O GZJLLYHBALOKEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000024827 Alzheimer disease Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 241001474374 Blennius Species 0.000 description 1
- 241000199912 Crypthecodinium cohnii Species 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 206010053759 Growth retardation Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 241000907999 Mortierella alpina Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 241000091642 Odontella aurita Species 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 240000002044 Rhizophora apiculata Species 0.000 description 1
- 241001298226 Ulkenia sp. Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- FIXLYHHVMHXSCP-UHFFFAOYSA-H azane;dihydroxy(dioxo)molybdenum;trioxomolybdenum;tetrahydrate Chemical compound N.N.N.N.N.N.O.O.O.O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O=[Mo](=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O.O[Mo](O)(=O)=O FIXLYHHVMHXSCP-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 230000004641 brain development Effects 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000000378 dietary effect Effects 0.000 description 1
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N docosahexaenoic acid (DHA) Natural products COC(=O)C(C)NOCC1=CC=CC=C1 KAUVQQXNCKESLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 230000004373 eye development Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 235000013376 functional food Nutrition 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 231100000001 growth retardation Toxicity 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000008821 health effect Effects 0.000 description 1
- 238000009655 industrial fermentation Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 1
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002417 nutraceutical Substances 0.000 description 1
- 235000021436 nutraceutical agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000020665 omega-6 fatty acid Nutrition 0.000 description 1
- 229940033080 omega-6 fatty acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 150000003071 polychlorinated biphenyls Chemical class 0.000 description 1
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001228 trophic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Vynález se týká produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10, produkujícího oleje s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, uloženého ve Sbírce mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM), vedené Vysokou školou chemicko-technologickou, Ústavem biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 166 28 Praha 6, pod přírůstkovým číslem DBM 509. Používá se pro výrobu kyseliny dokosahexaenové. Způsob její výroby spočívá v tom, že produkční kmen podle nároku 1 se kultivuje v kapalném médiu obsahujícím organický uhlík, načež po kultivaci se oddělí biomasa a/nebo lipidy obsahující kyselinu dokosahexaenovou a/nebo volná kyselina dokosahexaenová.
Description
Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové
Oblast techniky
Vynález se týká produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsobu produkce kyseliny dokosahexaenové.
Dosavadní stav techniky
Z nutričního hlediska jsou vysoce ceněné nenasycené mastné kyseliny s dlouhými řetězci (s obsahem C > 18), které nejsou vyšší rostliny schopné syntetizovat, jako jsou kyseliny ARA (struktura 20:4 omega 6,9,12,15), DHA (struktura 22:6 omega 3,6,9,12,15,18) a EPA (struktura 22:5 omega 3,6,9,12,15), které jsou nepostradatelné jako korektory vývoje mozku a očí u dětí, resp. jako doplňky pro kardiovaskulární péči u dospělých. Klinické studie potvrzují též účinky při léčbě aterosklerózy, rakoviny, revmatoidní artritidy a degenerativních onemocnění spojených s věkem, jako makulámí degenerace či Alzheimerovy choroby (Simopoulos, A. P., R. R. Kifer, R. E. Martin, and S. M. Barlaw (eds.), Health Effects of ω -3 Polyunsaturated Fatty Acids, S. Karger AG, Basel, Switzerland, 1991; Nettleton, A.J. (ed.), Omega-3 Fatty Acids and Health, Chapman and Hall, New York, 1995; Drevon, C. A., I. Baksaas, and Η. E. Krokan (eds.), Omega-3 Fatty Acids: Metabolism and Biological Effects, Birkhauser Verlag, Basel, Switzerland, 1993).
Průmyslově využívaným zdrojem omega-3 mastných kyselin je rybí olej, obsahující až 30% EPA a DHA (Galii, C, and A. P. Simopoulos (eds.), Dietary ω3 and ω6 Fatty Acids: Biological Effects and Nutritional Essentiality, Plenum Press, New York. 1989). Využití rybího oleje je však spojeno s řadou problémů, zejména nepříjemnou chutí a vůni, problémy se stabilitou produktu, vysokými náklady na izolaci ze směsi s jinými mastnými kyselinami. V neposlední řadě hrají významnou roli faktory environmentální, riziko kontaminace rybích tuků toxickými látkami, např. PCB a snižování stavu populací mořských ryb.
Tyto faktory, spolu s faktem, že ryby získávají nenasycené mastné kyseliny konzumací primárních producentů - zooplanktonu - vedly k intenzivnímu výzkumu možností produkce nenasycených mastných kyselin pomocí mořských mikroorganismů, zejména jednobuněčných řas (Yongmanitchai, W., and O. P. Ward, Omega-3 Fatty Acids: Alternativě Sources of Production, Process Biochem. 24:117-125 (1989). US 6 582 941 popisuje způsob přípravy olejů s vysokým obsahem DHA a DPA a nízkým obsahem (nejvýše 2 % hmotn.) EPA kultivací kmene Schizochytrium sp. SR21(FERM BP-5034) v médiu obsahujícím zdroj uhlíku a dusíku. Způsob zvyšování obsahu olejů/tuků v mikrořasách metodami mutageneze tj. ozařováním v exponenciální fázi růstu za specifických podmínek popisuje CN 103952394.
Při kultivaci mikroorganismů jsou užívány zejména techniky heterotrofní kultivace na glukóze jako zdroji uhlíku, např. v procesu firmy Martek Biosciences využívající fermentaci mikroorganismu Crypthecodinium cohnii (Radmer, R. J., and T. C. Fisher, Large Scale Production of Docosahexaenoic Acid (DHA), in Proceedings of Seventh International Conference, Opportunities from Micro- and Macro-algae, International Association of Applied Algology, Knysna, South Africa, 1996, p. 60). Mezi další průmyslově využitelné procesy a organismy patří např. heterotrofní kultivace mikroorganismu Schizochytrium sp., kmene Ulkenia sp. (např. proces výroby DHActive společnosti Lonza) či Odontella aurita. Pro produkci ARA bylo realizováno několik technologií využívající zejména kultivaci plísně Mortierella alpíne. WO 2014/060973 popisuje nové kmeny řas, připravené kultivací v médiu a následnou mutagenezí, izolací, fúzí protoplastů a následnou kultivací. Tyto kmeny lze rovněž využívat pro výrobu PUFA (DHA).
- 1 CZ 306149 B6
Podstata vynálezu
Úlohou vynálezu je odstranit shora popsané nevýhody při produkci nenasycených mastných kyselin DHA.
Tento úkol se vyřeší s pomocí produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10, produkujícího oleje s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, uloženého ve Sbírce mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM), vedené Vysokou školou chemickotechnologickou, Ústavem biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 166 28 Praha 6., pod přírůst10 kovým číslem DBM 509. Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10 si dlouhodobě udržuje produktivitu biomasy a nenasycených mastných kyselin až o 87 % vyšší, nežli má původní mikroorganismus. Je tolerantní k velkému rozmezí kultivačních teplot v rozsahu cca 15 až 35 °C, nárazově až 38 °C.
Produkční kmen podle vynálezu se s výhodou používá pro výrobu kyseliny dokosahexaenové. Způsob produkce kyseliny dokosahexaenové přitom spočívá v tom, že produkční kmen podle vynálezu se kultivuje v kapalném médiu obsahujícím organický uhlík, načež po kultivaci se oddělí biomasa a/nebo lipidy obsahující kyselinu dokosahexaenovou a/nebo volná kyselina dokosahexaenová. Kultivace kultury Japonochytrium sp. AN4-10 se přitom může provádět ve 20 fermentorech na uhlíkatém substrátu. Jako zdroj organického uhlíku kapalné médium u způsobu podle vynálezu může obsahovat alespoň jednu látku ze skupiny obsahující glukózu, glycerol, surový glycerol z výroby biopaliv, kyselinu octovou či její estery nebo etanol. Vypěstovanou biomasu je možno využít přímo vlhkou (např. jako krmné aditivum pro ryby, drůbež či hospodářská zvířata), popř. po odvodnění (např. vysušením na sprejové sušárně). Suchou biomasu je 25 možno s výhodou použít jako zdroj DHA pro výrobu nutraceutik a doplňků stravy i krmiv.
Výroba kyseliny dokosahexaenové podle vynálezu dále může pokračovat separací lipidů obsahují jících DHA či volné DHA z kultivačního média nebo vlhké či suché biomasy pomocí fyzikálněchemických separačních metod, jako je lisování, extrakce rozpouštědly, suprakritická extrakce >3θ CO2, působení ultrazvuku a/nebo mikrovlnného záření, extrakce spojená s chemickou reakcí atd.
Takto extrahované lipidy či frakce lipidů mohou být dále rafinovány s cílem oddělení jiných mastných kyselin a získání DHA o vyšší čistotě. Takovýto produkt pak může být s výhodou využit jako surovina ve speciálních potravinářských, farmaceutických a kosmetických aplikacích.
Po extrakci lipidů z biomasy může být zbytek biomasy po částečném či úplném odstranění lipidů s výhodou využit jako doplněk krmivá pro zvířata, neboť obsahuje vysoké množství proteinů a dále významné obsahy pigmentů s antioxidačními účinky, zejména karotenoidů.
Objasnění výkresů
Vynález je dále blíže objasněn na příkladech svého provedení pomocí výkresů, kde znázorňuje:
Obr. 1 klastr buněk Japonochytrium sp. AN-4 obarvených Nile red se zářícími globulemi lipidů v UV mikroskopii,
Obr. 2 uvolňující se zoospory Japonochytrium sp. AN^J, obarveno Nile red, UV mikroskopie,
Obr. 3 růstové křivky kmenů AN 1-5 (vyjádřené jako OD450) v mikrotitrační destičce,
Obr. 4 vliv počáteční koncentrace substrátu (glukosy) na koncentraci buněk v suspenzi (vyjádřené jako OD450) po 3 dnech kultivace kmene AN4 v 250ml Erlenmayerových baňkách na třepačce,
-2CZ 306149 B6
Obr. 5 srovnání růstových charakteristik původního kmene AN4 a dvaceti vybraných mutantů,
Obr. 6 profil mastných kyselin obsažených v biomase kmenů Japonochytrium sp. AN4, AN410aAN4-20,
Obr. 7 srovnání růstové křivky původního kmene AN4 a produkčního kmene AN4-10,
Obr. 8 složení mastných kyselin obsažených v biomase produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10.
Příklady uskutečnění vynálezu
Výroba kyseliny dokosahexaenové podle vynálezu dále může pokračovat separací lipidů obsahu15 jících DHA či volné DHA z kultivačního média nebo vlhké či suché biomasy pomocí fyzikálně— chemických separačních metod, jako je lisování, extrakce rozpouštědly, suprakritická extrakce CO2, působení ultrazvuku a/nebo mikrovlnného záření, extrakce spojená s chemickou reakcí atd. Takto extrahované lipidy či frakce lipidů mohou být dále rafinovány s cílem oddělení jiných mastných kyselin a získání DHA o vyšší čistotě. Takovýto produkt pak může být s výhodou 20 využit jako surovina ve speciálních potravinářských, farmaceutických a kosmetických aplikacích.
Po extrakci lipidů z biomasy může být zbytek biomasy po částečném či úplném odstranění lipidů s výhodou využit jako doplněk krmivá pro zvířata, neboť obsahuje vysoké množství proteinů a 25 dále významné obsahy pigmentů s antioxidačními účinky, zejména karotenoidů.
Příklad I
V mangrovníkové oblasti poloostrova Ancon, Kuba byl proveden sběr spadaného mengrovníkového listí z mořské vody z hloubky cca 10 až 100 cm pod hladinou. Z listů byly sterilně odebrány sekce o rozměrech cca 10 x 25 mm, 3 x promyty 15% sterilní mořskou vodou doplněnou 0,3 g/1 penicilinu a 0,3 g/1 streptomycinu pro potlačení bakteriálního růstu. Poté byly umístěny na agar, obsahující kvasničný extrakt, pepton, mořskou sůl a antibiotika. Byly izolovány morfo35 logicky odlišné kmeny, označované jako AN-1, AN-2, AN-3, AN-4, AN-5, AN-6. Metodou 18sRNA byly kmeny identifikovány jako Japonochytrium sp., řád Traustochytriales. Tyto organismy se primárně vyskytují v mořských biotopech, na povrchu řas či rostlin a v organickém detritu. Trofickou fázi tvoří nepohyblivé, pouze po substrátu se pohybující vegetativní buňky, většinou kulovité ale i vejčité či elipsoidní, viz obr. 1. Dochází k vytváření tzv. ektoplazmatic40 kých výběžků, které se spojují v síťovité útvary, označované u tohoto řádu (ve starší literatuře) jako rhizoidy. Jsou produkovány pomocí botrozomů, které se nachází na povrchu buněk. Pomocí těchto výběžků jsou ukotveny k substrátu. Vegetativní buňky se dělí, čímž vzniká útvar, který se zde označuje jako sporangium (jedná se o shluk, sorus buněk), viz obr. 2. Zástupci tohoto řádu netvoří typické kolonie, ale jejich růst se projevuje zvětšováním buňky a následnou přeměnou ve sporangia. Sporangium je obaleno vícevrstvou stěnou, složenou ze šupinek. Uvnitř dochází k dělení a vznikají poměrně malé zoospory (jedná se o mitospory) se 2 bičíky. Po čase přisednou k substrátu, ztratí bičíky a dorůstají.
Příklad 2
Předběžná kultivace všech kmenů prokázala dobrý růst na glukose a glycerolu jako substrátu, a to při počátečních koncentracích substrátu v širokém rozmezí 5 až 170 g/1. Koncentrace substrátu > 100 g/1 vykazují již zpomalení růstu, či delší lag-fázi (viz obr. 4). V souladu s literárními 55 údaji vykazují horší růst na disacharidech (laktosa), nežli monosacharidech (glukosa). Růstová
-3CZ 306149 B6 rychlost na glycerolu odpovídá glukose. Stacionární fáze dosahují za cca 3 až 4 dny růstu. Optimální salinita se jeví kolem 9 až 18 g/1. Obsah DHA se pohybuje až kolem 12 až 16 % v sušině, resp. 46 až 56 % podílu mastných kyselin, což odpovídá nejlepším literárním údajům a z kmenů činí kandidáty na průmyslovou kultivaci. Z kultivačních testů na médiu o složení 20 g/1 glukosa, 5 10 g/1 kvasniční extrakt, 18 g/1 NaCl při pH média 7 a teplotě 28 °C plyne, že vysokou růstovou rychlostí a obsahem DHA vyniká kmen, označený pracovně jako Japonochytrium sp. AN-4 (viz obr. 3). Proto byl zvolen pro následnou mutagenezi.
i o Příklad 3
K vyvolání mutací buněk bylo použito UV záření. Buňky v suspenzi o koncentraci 5,8 x 104 b/ml byly vystavovány záření o vlnové délce 360 nm na vzdálenost 18,5 cm po dobu 10 s, kdy docházelo k přežívání 1,5 x 102 b/ml. Byl sledován vliv osvitu na růst buněk a fenotypové 15 vlastnosti kolonií. Mutageneze byla provedena ve tmě, naředění, vyočkování a následná kultivace rovněž. Po 48 h byly nejrychleji rostoucí kolonie vyočkovány. Mutagenezi byla získána řada fenotypově odlišných klonů, které se lišily od původních kmenů vzhledem kolonií a rychlostí růstu. U 20 mutantů (současně s původním kmenem AN 4) byla sledována rychlost růstu měřením OD ve zkumavkách (Obr. 5). Je zřejmé, že kmeny AN4-10, AN4-16 a AN4-20 vykazovali 20 o cca 30 % vyšší výtěžek biomasy. U kmenů AN4, AN4-10 a AN4-20 byla sušina analyzována na obsah PUFA. Z výsledků analýz (Obr. 6) plyne, že vysoký podíl DHA v profilu mastných kyselin vykazuje kmen AN4-10, a to 48,65 % mastných kyselin. Z analýzy také plyne, že u tohoto kmene došlo ke snížení obsahu z nutričního hlediska nežádoucí nasycené mastné kyseliny palmitové, a to z 30 na 16 % oproti obsahu v původním kmenu AN4. U kmene AN-20 naproti 25 tomu obsah nasycených kyselin mírně vzrostl a obsah DHA se mírně snížil. Jako produkční byl proto zvolen kmen AN4-10, vyznačující se výrazně zvýšenou produktivitou biomasy i DHA. Tato mutace je dlouhodobě stabilní.
Příklad 4
Byla provedena ověřovací kultivace na glycerolu, kdy z Petriho misky byly buňky původního kmene Japonochytrium sp. AN4 a produkčního kmene Japonochytrium sp. AN4-10 asepticky převedeny do 100 ml sterilního komplexního media (KM) s pH 7, které obsahovalo: glycerol (20 35 g.l1), kvasničný extrakt (10 g.F1), chlorid sodný (18 g.l1), mikroelementy (v mg Γ1: 40 FeNaEDTA, 88 CaCl2, 0.83 H3BO3, 0,95 CuSO4.5H2O, 3,3 MnCI2.4H2O, 0,17 (NH4)6Mo7O24.4H2O, 2,7 ZnSO4.7H2O, 0,6 CoSO4.7H2O, a 0,014 NH4VO3) a destilované vody. Kultury v Erlenmeyerově baňce byly umístěny do třepačky (130 rpm) při 23 °C a po dobu 120 h probíhala kultivace. Srovnáním růstových křivek, stanovených měřením optické hustoty suspenze (OD) bylo zjiště40 no, že Japonochytrium sp. AN4-10 dosáhlo o 87% vyššího nárůstu biomasy nežli původní kmen, konkrétně 5. den kultivace bylo u kmene Japonochytrium sp. AN4—10 dosaženo koncentrace sušiny 8,3 g.F1. Analýza ukázala, že Japonochytrium sp. AN4-10 obsahovalo 344,58 g mastných kyselin na I kg suché váhy. Podíl DHA byl 163,19 g.kg 1 sušiny (resp. 47 % obsahu mastných kyselin) a podíl EPA 1,35 g.kg 1 sušiny. Profil mastných kyselin uvádí obr. 8.
Průmyslová využitelnost
Vynález je využitelný v biotechnologickém průmyslu. Způsob výroby podle vynálezu je možno 50 realizovat jak s využitím stávajících průmyslových fermentačních kapacit. Vyrobená biomasa mikroorganismů představuje cennou surovinu pro řadu žádaných produktů v oblasti potravinářského a farmaceutického průmyslu, v kosmetice, zejména jako součást funkčních potravin, potravinových doplňků a krmiv s obsahem nenasycených omega-3 mastných kyselin.
Claims (4)
1. Produkční kmen Japonochy triům sp. AN4-10, produkující oleje s vysokým obsahem polynenasycených mastných kyselin, uložený ve Sbírce mikroorganismů ústavu biochemie a mikrobiologie VŠCHT (DBM), vedené Vysokou školou chemicko-technologickou, Ústavem biochemie a mikrobiologie, Technická 5, 166 28 Praha 6, pod přírůstkovým číslem DBM 509.
2. Použití produkčního kmene podle nároku 1 pro výrobu kyseliny dokosahexaenové.
3. Způsob produkce kyseliny dokosahexaenové, vyznačující se tím, že produkční kmen podle nároku 1 se kultivuje v kapalném médiu obsahujícím organický uhlík, načež po kultivaci se oddělí biomasa a/nebo lipidy obsahující kyselinu dokosahexaenovou a/nebo volná kyselina dokosahexaenová.
4. Způsob podle nároku 5, vyznačující se tím, že kapalné médium obsahuje jako zdroj organického uhlíku alespoň jednu látku ze skupiny obsahující glukózu, glycerol, surový glycerol z výroby biopaliv, kyselinu octovou či její estery nebo etanol.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-662A CZ306149B6 (cs) | 2014-09-25 | 2014-09-25 | Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-662A CZ306149B6 (cs) | 2014-09-25 | 2014-09-25 | Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2014662A3 CZ2014662A3 (cs) | 2016-08-24 |
| CZ306149B6 true CZ306149B6 (cs) | 2016-08-24 |
Family
ID=56885645
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2014-662A CZ306149B6 (cs) | 2014-09-25 | 2014-09-25 | Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ306149B6 (cs) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6582941B1 (en) * | 1995-04-17 | 2003-06-24 | Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology | Microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms |
| WO2014060973A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Indian Oil Corporation Limited | Improved microalgae strains and use thereof |
| CN103952394A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-07-30 | 上海大学 | 一种提高微藻油脂含量的诱变方法 |
-
2014
- 2014-09-25 CZ CZ2014-662A patent/CZ306149B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6582941B1 (en) * | 1995-04-17 | 2003-06-24 | Japan As Represented By Director-General Of Agency Of Industrial Science And Technology | Microorganisms capable of producing highly unsaturated fatty acids and process for producing highly unsaturated fatty acids by using the microorganisms |
| WO2014060973A1 (en) * | 2012-10-19 | 2014-04-24 | Indian Oil Corporation Limited | Improved microalgae strains and use thereof |
| CN103952394A (zh) * | 2014-04-22 | 2014-07-30 | 上海大学 | 一种提高微藻油脂含量的诱变方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2014662A3 (cs) | 2016-08-24 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102202287B1 (ko) | 미세조류 시조카이트리움 만그로베이의 바이오매스 및 이의 제조 방법 | |
| US8541210B2 (en) | Producing eicosapentaenoic acid (EPA) from biodiesel-derived crude glycerol | |
| WO2017094804A1 (ja) | ドコサヘキサエン酸含有油及びその製造方法 | |
| US20220372430A1 (en) | Protists enriched with lipids rich in polyunsaturated fatty acids | |
| US20130217084A1 (en) | Production of omega-3 fatty acids from crude glycerol | |
| JP2014515935A (ja) | 混合栄養培養方式でＥＰＡ及びＤＨＡを生産するためのオドンテラ（Ｏｄｏｎｔｅｌｌａ）属の新規微細藻類株 | |
| JP6406978B2 (ja) | 脂肪酸混合物 | |
| JP6888035B2 (ja) | フィチウム種からのオメガ−３脂肪酸の生産 | |
| KR102452966B1 (ko) | 카로티노이드 계열의 항산화 색소 및 불포화지방산의 생산성이 높은 나노클로롭시스 속 g1-5 균주 및 이의 용도 | |
| JP2016089025A (ja) | 微生物由来の奇数脂肪酸又は高度不飽和脂肪酸含有するトリグリセリドの製造方法 | |
| JP5371750B2 (ja) | 微生物発酵によるｄｈａ含有リン脂質の製造方法 | |
| CZ306149B6 (cs) | Produkční kmen Japonochytrium sp. AN4-10, jeho použití a způsob produkce kyseliny dokosahexaenové | |
| WO2015016720A1 (en) | Methods for the production of diatom biomass | |
| KR101692695B1 (ko) | 고 함량의 다중불포화지방산을 함유하는 트라우스토키트리대 속 돌연변이 균주 ga 및 이의 용도 | |
| RU2661116C1 (ru) | Штамм одноклеточной микроводоросли Eustigmatos magnus - продуцент эйкозапентаеновой кислоты | |
| TWI842054B (zh) | 易於萃取細胞中之油的新穎裂殖壺菌屬物種（Schizochytrium sp.）品系及使用其生產含ω-3之油的方法 | |
| Hien et al. | OPTIMIZATION OF CULTIVATION CONDITIONS OF THE HETEROTROPHIC MARINE MICROALGA Thraustochytrium aureum BT6 ORIENTED TO EXPLOIT BIOACTIVE COMPOUNDS. | |
| Şahin | Effects of co-culturing Schizochytrium sp. and Escherichia coli cells on biomass and Docosahexaenoic acid (DHA) production | |
| JP2025027253A (ja) | 新規シリンドロテカ フシホルミス株 | |
| Hien et al. | Optimization of cultivation conditions of the heterotrophic marine microalga\(\textit {Thraustochytrium aureum}\) BT6 oriented to exploit bioactive compounds | |
| Masurkar et al. | Genetic manipulation of some bacterial strains for improvement of PUFA production | |
| GB2571506A (en) | Microorganism | |
| NZ613593B (en) | Methods for the production of diatom biomass |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20210925 |