CZ307525B6

CZ307525B6 - Způsob identifikace evropských sladkovodních ryb a hybridů v biologických materiálech metodou S7iCAPS

Info

Publication number: CZ307525B6
Application number: CZ2015-957A
Authority: CZ
Inventors: Jan Mendel; Karel HalaÄŤka; Lukáš Vetešník
Original assignee: Ăšstav biologie obratlovcĹŻ AV ÄŚR, v. v. i.
Priority date: 2015-12-31
Filing date: 2015-12-31
Publication date: 2018-11-07
Also published as: PL3199643T3; EP3199643B1; CZ2015957A3; EP3199643A1

Abstract

Způsob identifikace druhů/linií evropských sladkovodních ryb v biologických materiálech a rybích výrobcích metodou naštěpené amplifikované polymorfní sekvence intronu S7 - S7iCAPS, která je založena na unikátní délce JGM oblastí a/nebo specifických restrikčních vzorech částečné genomové sekvence 1. intronu S7 genu. Způsob spočívá v použití rodově či skupinově-specifických sad primerů, unikátního kombinovaného designu variabilní délky JGM oblastí a/nebo InDel-CAPS a/nebo SNP-CAPS markerů a je kvalitativní. Vzorek DNA z biologického materiálu nebo rybího výrobku se podrobí PCR analýze za použití druhově nebo skupinově specifických párů primerů, které vymezuji částečnou druhově/linijně specifickou sekvenci 1. intronu S7 genu, nazvanou diagnostická oblast J. G. Mendela (JGM), přičemž diagnostické oblasti JGM jsou konkrétně vymezeny pro ten který druh a mají svoji specifickou délku, načež se na základě délky PCR produktů provede identifikace druhu nebo hybrida. Po PCR analýze se PCR produkty štěpí pomocí druhově/linijně specifických restriktáz ve specifickém štěpicím místě vyskytujícím se v diagnostické oblasti JGM.

Description

Způsob identifikace evropských sladkovodních ryb a hybridů v biologických materiálech metodou S7ÍCAPS

Oblast techniky

Vynález spočívá ve způsobu identifikace evropských sladkovodních ryb a jejich hybridů v biologických materiálech a rybích výrobcích metodou S7ÍCAPS a dále se týká nového příměrového designu, diagnostických JGM oblastí a jejich unikátních délek, specifických restrikčních vzorů a identifikačních souprav.

Dosavadní stav techniky

Vzhledem k rostoucímu celosvětovému úsilí zmapovat a chránit reálnou diverzitu sladkovodních ryb, včetně vymezení jejich nativního areálu, je zapotřebí zdokonalovat současné identifikační metody nebo vyvíjet zcela nové. Poznání a pochopení reálné biodiverzity a její ochrana je důležitým tématem mezinárodní i národní politiky většiny států. Jednoznačná identifikace je důležitá z hlediska ochrany původního genofondu ryb každého státu a k nastavení správného managementu. Významnou skupinou ryb jsou chráněné druhy, které nařízením Evropské unie (Směrnice rady č. 92/43/EEC) vyžadují různý ochranářský režim a pro které byla vymezena chráněná území Evropské unie - Natura 2000 a soustavy SMARAGD Bemské úmluvy s permanentním periodickým monitoringem. V případě hrozby vymizení populací některého z kriticky ohrožených' druhuje zahajován záchranný program, v kterém genetická identifikace je kardinální záležitostí. Ministerstvem zemědělství ČR je realizován program na podporu „Vysazování zvláště ohrožených druhů živočichů do volné přírody, ovšem ve většině případů stále bez respektování ochrany genetické diverzity.

Jednoznačná identifikace ryb má význam rovněž i z hlediska poměrně častých hybridizací. V literatuře byly již popsány hybridizační události u >95 čeledí ryb (Schwartz, F. J. 1981. World literature to fish hybrids with an analysis by family, species, and hybrid: Supplement 1. NOAA Technical Report NMFS SSRF-750, 507 p.; Schwartz, F. J. 2001. Freshwater and marine fish family hybrids: A worldwide changing scene revealed by the scientific literature. Journal of the Elisha Mitchell Scientific Society, 117(1), 62-65; Scribner, K. T., Page, K. D., Bartron, M. L. 2001. Hybridization in freshwater fishes: a review of case studies and cytonuclear methods of biological inference. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10, 293-323; Bartley D. M., Rana K.., Immink A. J. 2001. The use of inter-specific hybrids in aquaculture and fisheries. Reviews in Fish Biology and Fisheries 10, 325-337). Ό některých produkčních ryb je přímo vyžadována (síhové, sivěni, atd.). U jiných je naopak nežádoucí, což platí i o dovozech a vysazování nepůvodních linií a druhů pro tu kterou geografickou oblast. Bez včasné genetické identifikace se hybridizace mohou stát jednou z příčin destrukce původní vnitrodruhové a mezidruhové diverzity.

Spolehlivá genetická determinace jednotlivých linií a plemen je také nezbytná v intenzivních chovech pro zachování čistoty chovu, pro zvýšení a zefektivnění produkce, pro uchování odolnosti vůči chorobám i různým stresovým faktorům a pro nastavení správného chovného managementu obecně. Ministerstvo zemědělství ČR od roku 1996 provozuje Národní program konzervace a využívání genetických zdrojů zvířat a finančně podporuje registrované chovatele v péči o uchování genetických zdrojů hospodářských a dalších užitkových zvířat, tedy i ryb.

Nezanedbatelná je i oblast prevence falšování rybích produktů, jiker, plůdku a násadového materiálu, kdy dochází k druhovým záměnám rozdílné kvality a ceny. Nařízení Evropské unie 104/2000 obsahuje povinnost uvádět v označení rybích výrobků mimo jiné i druhový název, geografický původ, atd.

- 1 CZ 307525 B6

Ve světě je známo několik metod a postupů druhového/linijního určení ryb. Metody založené na morfologické identifikaci jsou využívány pro druhové určení celých, popř. mírně upravených ryb (Kottelat, M., Freyhof, J. 2007. Handbook of European freshwater fishes. Kottelat, Comol,

Switzerland and Freyhof, Berlin, Germany). Ovšem při ztrátě či chybění vnějších determinačních znaků je tato metoda obtížně použitelná. Navíc patří mezi metody silně invazivní.

Dále je využíváno při identifikaci ryb metod založených na analýze proteinů extrahovaných ze svaloviny, jater, atd. jako například alozymová analýza (Lusková, V., Šlechtová, V., Povž, M„ Šlechta, V. Lusk, S. 1997. Genetic variability of Chondrostoma nasus population in rivers of the Black Sea and the Baltic Sea drainage systems. Folia Zoologica 46 (Suppl. 1), 27-36), izoelektrická fokusace (Ataman. C, Celik, U., Rehbein, H., 2006. Identification of some Aegean Fish by native isoelectric focusing. European Food Research and Technology, 222, 99-104) nebo imunologické techniky (Dominquez, E„ Perez, M. D., Puyol, P., Calvo, M. 1997. Use of imunological techniques for detecting species substitution in raw and smoked fish. Zeitschrift fur Lebensmitteluntersuchung und -Forschung A, 204/4, 279-281). Jejich hlavními omezeními je rychlá degradace proteinů při vyšších teplotách, vysoký risk vzájemné reaktivity či problémy spojené s tkáňovou specifitou, značně limitovaná úroveň polymorfismu, vyšší míra subjektivního vyhodnocení a silně invazivní charakter.

V současnosti pro determinaci širokého spektra ryb jsou stále častěji používány molekulárněgenetické metody založené na analýze DNA. Tyto metody mají mnoho výhod při srovnání s metodami využívající analýzy proteinů. DNA je obsažena ve všech živočišných tkáních, tedy ve většině případů nezávisí na zdroji vzorku a lze ji izolovat ze všech životních stádií organismu. Pomaleji degraduje a díky polymerázové řetězové reakci postačí i jen nepatrné množství. Neinvazivní metodologie, silná informativnost a možnost volby kodominantního markéru jsou ve většině případů stěžejní záležitostí.

Klasické Sangerovo sekvenování představuje pro svoji přesnost významný přínos v identifikačních studiích evropských ryb. Tato metoda je často využívána jako konfirmační pro ověření výsledků získaných jinými metodami. Pro identifikaci rybích druhů se používá různých jaderných markérů s rozličným stupněm variability. Při exon-sekvenování jsou to např. RAG1 (recombination activating gene 1), velká ribosomální podjednotka 28S, rhodopsin (Choleva, M., Musilova, Z., Kohoutova-Sediva, A., Pačes, J., Rab, P., Janko, K., 2014. Distinguishing between Incomplete Lineage Sorting and Genomic Introgressions: Complete Fixation of Allospecific Mitochondrial DNA in a Sexually Reproducing Fish (Cobitis; Teleostei), despite Clonal Reproduction of Hybrids. PLoS ONE 9(6): e80641). Automatická sekvenace jaderných kódujících regionů (Li Ch., Ortí G., Zhang G., Lu G. 2007. A practical approach to phylogenomics: the phylogeny of ray-finned fish (Actinopterygii) as a case study. BMC Evolutionary Biology 7, 44) často vykazuje sníženou variabilitu a tedy nízkou determinační schopnost. U intron-sekvenování se používá např. intron genu pro beta podjednotku adenosin trifosfát syntázy (Atp-β) a druhý intron genu pro aktin (Act-2) (Touriya A, M. Rami, G. Cattaneo-Berrebi, C. Ibanez, S. Augros, E. Boissin, A. Dakkak, and P. Berrebi. 2003. Primers for EPIC amplification of intron sequences for fish and other vertebrate population genetic studies. BioTechniques 35:676-682). Rovněž je využíván i první nebo druhý intron ribozomálního S7 rproteinu (RPS7) (Perea, S., Bohme,M., Zupančič, P., Freyhof, J., Šanda, R., Ózulug, M., Abdoli, A., Doadrio, I. 2010. Phylogenetic relationships and biogeographical patterns in CircumMediterranean subfamily Leuciscinae (Teleostei, Cyprinidae) inferred from both mitochondrial and nuclear data. BMC Evolutionary Biology, 10, 265). S7 r-proteinje jedním z proteinů hrající důležitou roli v interakci templářů a 40S podjednotky (Mundus, D. A., Bulygin, K. N., Ven'yaminova, A. G., Vladimirov, S. N., Vratskikh, L. V., Řepková, Μ. N., Yamkovoi, V. S., Karpova, G. G. 1993. Human placenta 40S ribosomal subunit affinity modification by oligoribonucleotide derivatives containing the AUG codon. Ribosomal proteins composing the codon-anticodon interaction site. Molecular Biology, 27,91-95). Jaderný marker RPS7 se skládá ze 7 exonů a 6 intronů a právě architektura 1. intronu se ukázala významně diagnostická u některých druhů sladkovodních ryb (Annilo, T„ Laan, M., Stáhl, J„ Metspalu, A. 1995. The

-2 CZ 307525 B6 human ribosomal protein S7-encoding gene: Isolation, structure and localization in 2p25. Gene, 165, 297-302; Mendel, J., Lusk, S., Vasileva, E. D. et al. 2008. Molecular phylogeny ofthe genus Gobio Cuvier, 1816 (Teleostei: Cyprinidae) and its contribution to taxonomy. Mol. Phylogenet. Evol., 47, 1061-1075). PCR primerové páry pro amplifikaci tohoto markéru byly popsány autory Chow, S., Hazama, K. 1998. Universal PCR primers for S7 ribosomal protein gene introns in fish. Molecular ekology, 7, 1255-1256. Tyto primerové sety však velmi často poskytovaly neuspokojivé výsledky, které však byly pochopitelné, neboť autoři navrhovali příměrový design pouze na třech rybích taxonech (Oncorhynchus keta, Thunnus spp., Fugu rubripes), geneticky i geograficky velmi vzdálených od druhů evropské sladkovodní ichtyofauny. Navíc existence častých indelů způsobující posun čtecích rámců, neexistence platformy referenčních homozygotních sekvencí a obecně markerová roztříštěnost v genetických databázích působí značné obtíže při využívání intronových markérů.

Sekvenační technika - DNA barcoding, využívající mitochondriálního markéru COI (cytochrome c oxidase I) jako společného identifikačního čárového kódu, má již vytvořenou informačnědatabázovou determinační platformu (BoLD) a standardizovanou metodiku. Řeší uspokojivě i problém markerové roztříštěnosti a ztíženého vzájemného porovnávání. Má však svá velká omezení - neumožňuje korektně identifikovat hybridy a nabízí nedostatečný jednogenomový (materiální) pohled na zkoumaný objekt, neboť za fenotypový projev jsou zodpovědné především jaderné geny.

Fingerprintové techniky, jako PCR-RFLP (délkový polymorfismus restrikčních fragmentů), AFLP (délkový polymorfismus amplifikovaných fragmentů) představují rovněž přínos v determinačních studiích některých druhů sladkovodních ryb a jejich hybridů (Campbell, D., Bernatchez, L. 2004. Generic scan using AFLP markers as a means to assess the role of directional selection in the divergence of sympatric whitefish ecotypes. Mol. Biol. Evol 21(5), 945-956). STR analýza je používána především v populační biologii, při odhadech populačních parametrů, patemitních studií, atd (Baker, A. J. 2000. Molecular methods in ekology. Blackwell science Ltd., Oxford). Ovšem vzhledem k velké citlivosti je v identifikačních studiích používána jako technika 2. kroku, zpravidla po DNA sekvenaci. Navíc překážkou bývá i vysoká specifita primerů, která brání jednoduchému použití při determinačních studiích velkých skupin různých taxonomických úrovní.

SPInDel koncept využívá inzerce a delece pro druhovou identifikaci různých skupin eukaryot, tedy i některých rybích druhů. Tento přístup je ale limitován svým designem, který je založen pouze na sekvenční variabilitě mitochondriálních rRNA genů (Carneiro J., Pereira F., Amorium A. 2012. SPInDel: a multifunctional workbench for species identification using insertion/deletion variants. Molecular Ecology Resources 12, 1190-1195; Pereira F., Carneiro J., Matthiesen R.. Van Asch B., Pinto N., Gusmao L., Amorim A. 2010. Identification of species by multiplex analysis of variable-length sequences. Nucleic Acids Research 38, e203).

V současné době se začínají objevovat sekvenační techniky II. generace (next-generation sequencing, NGS) různých platforem (pyrosekvenování, sekvenační technologie Illumina, SOLID, Ion Torrent, atd.). Tyto přístupy však vyžadují náročného hardwarové a softwarové vybavení pro zpracovávání obrovského množství dat. Orientují se především na kompletaci celých genomů. Představují velkou investici, nákladný provoz a drahé reagencie.

Další molekulární přístupy identifikace živočišných druhů využívají techniky biočipů (Cheng J., Sheldon E. L., Wu, L., Uribe, A., Gerrue, L. O., Heller, M. J. and O'Connell, J. P. 1998, Preparation and hybridization analysis of DNA/RNA from E. coli on microfabricated bioelectronic chips. Nature Biotechnology 16: 541-546). Tato technika je ovšem spojována především s komerční oblastí produkce a distribuce kosmetických produktů, potravin a krmiv určených ke konzumaci člověkem a zvířaty. Ověřuje obecně přítomnost/nepřítomnost živočišných přísad ve směsi bez druhové konkretizace. Obdobného charakteru je metoda realtime PCR pro detekci a kvantifikaci několika málo druhů ryb.

-3 CZ 307525 B6

Podstata vynálezu

Nevýhody determinací sladkovodních evropských ryb z biologických materiálů a rybích výrobků pomocí metod založených na identifikaci proteinů, přímého sekvenování a genotypizování mitochondriálních genů a nejnovějších kvalitativních a kvantitativních technik odstraňuje způsob identifikace sladkovodních ryb v biologických materiálech a rybích výrobcích metodou S7ÍCAPS (S7 intron cleaved amplified polymorphic sequence; naštěpená amplifikovaná polymorfní sekvence intronu S7), podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že identifikace taxonů evropské ichtyofauny a jejich hybridů je prováděna konvenční PCR s druhově nebo skupinověspecifickými pritnery, které vymezují částečnou druhově/linijně unikátní jadernou sekvenci 1. intronu S7 genu, nazvanou identifikační oblast Johanna Gregora Mendela (JGM oblast). Sekvence jednotlivých primerů jsou uvedeny v Tabulce 1, přičemž získané amplikony jsou v případě rodů s více druhy/liniemi buď dostatečně délkově polymorfní (díky přítomnosti indelů; Tabulka 2) a/nebo jsou dále štěpeny specifickými restrikčními endonukleázami (Tabulka 3), u kterých je využito CAPS designu, kdy restrikční místa se vyskytují přímo v druhově/linijně unikátních indelových pozicích (InDel-CAPS marker) a/nebo ve specifických bodových mutacích - SNPs (single nucleotide polymorphism; SNP-CAPS marker) jak je uvedeno v Tabulce 2.

-4CZ 307525 B6

Tab. 1, Primerový design a konkrétní Ta teplota u identifikovaných rodů a druhů_________________________

Čeleď Rod Druh a linie Zkratka Sekvence 5'-» 3' Teplota Orientační primeru annealingu délka^aJGM _______________________ (’C) oblasti (bp)

Acipenseridae Acipenser, Huso A. baeri, A. ruthenus, A. stellatus, A. ^AcS7F TGGYDTTTCCCGTACTGTR 60 440 gueldenstaedtii, A. sturio, H. huso AcS7R CTGGTRCTGAACATGGCCTAT Nemacheilidae Barbatula B. barbatula - 3 linie BaS7F TGCCCAGCTATAAGGA 60 435 (dříve Balitoridae) BaS7R TTTATCTTAATMGTCGATGAG Centrarchidae L. gibbosus, M. salmoides, M. dolomieu CeS7F GTTGTTTAATRTTTGCGTTTG 60 660 Lepomis, Micropterus CeS7R GGTACTGAACATGGCCTRTG

LO τ—< LO	o LO LO	475	420
							sř
							kD
o			O		o		ra
ω			ω		kD		#
							o
							k£>
ar CD CD £	CD (j < o o		O O < O	O E 0	CD < a:	fACCTT	GACCC
< < o ω ω	< < < cd < o < < o <		í O o < o o o o HO	o u < H < < 1— < <	o a: CD E a: H < 1— CD	TTAAMGCTCG>	ATCTTYGCGTG
CD	cj 1— í o		H < < O »-	< ω o <	CD H	AGAGT	GTTTA
U-	cr		u_	a:	u.	02	LL.
Dl	l/l		cn	ΜΊ	cn	MÍS7	LH
O O	o O		_Q f0 (✓1	-Q CD cn	5	Co
	g	G
	•2 G	ύΓ
	c _x	V)
	Oj qj	c					*'
	O O	Qj					OJ
	u.	u.			•
	□	Ί 8 5					- 2 Hn
	G o a? c ° o .Jí	o U °* o . ·	g ‘E O		7^ E §		ilopus
	1 ÍS	-c u o G Oj v -C 8 Eí	o		«2.		, C. poec
	I 8'	a			S		bio
	Cn ·£	o					o
	C o	c					Ol
	O O Qj						G
	g	E	,o
			§		to □
			,ω				to o
íq o			’a? c		□ Cn		o
o			o -Q O		§		G
			bn
OJ ra -D							(U ra
+-·
3 o o							Cot

microstomus CoS7R TGAACATGGCCGTTGTGTC

-5CZ 307525 B6

Pokračování tabulky 1

3 bQ ni . 00 v? E S S . * ^:= 2

1 1 ^S g. $ * ΰ £ Q. 2 g S. £. * Q. O δ J -g έ * tf J _R' * & C x O o q cc

Qj h? ° O C . x

. p · °C Ό n 3 ? .se 00 · §

x q x oe o* . 2 2 o ΰ x °* c

S C ? O -> O

£ oA 3 § g á o 0^0^⁰.¾^

LO . O * ⁰⁰ . g ^x <* ‘^c

t |O &“ g|

Q O tn · tn Cn¹?; T³

cr> Q ^c

-6CZ 307525 B6 >o

4-* c OJ ω LH

ZJ ω E ’uQ.

tn Ln ο CD

OČ cn <

οο σ»m laco tn

ΓΜ

ω 'c .c 3 ΙΟ

Ό Ο 00

Τ3 (U

QJ

Τ3 δ □

•ο ιη D ω —I

PsS7R CGCGCTGGTACTGAAC

rn Φ in ra p % Φ e ε rsi q.

o oc

in	O	o	m	O
ID		ID	σ»	Ol
	co	ID	in

Φ 03

Ί3 Ό o ω

LU

- xR O O in

LD

ΙΑ 3 4-i o p c G tn λ co O

Φ tn O

Φ tn ra in in in CD Σ o o in ra ω

Φ ra to 25 o

Qj <X φ ω 'Φ -Q O TJ ο

cn

Ť ίη ω υ C φ ω on

Lφ Ε 'C ο.

to _*ί (Β rsj •σ φ to ο

φ TO

TJ

Ο u φ

Q.

σ» α:

(Λ >Ο

LL.

ΟΟ

Φ

Q.

Φ

LL ron Κι or δ Μ

U.

CO 0J 00

LIϋΟ □ X

TO on

LO ίη αί tn iň

Orientační délka = zaokrouhlená a zprůměrovaná hodnota

Φ E 00 (O

Tab. 2. S7ÍCAPS identifikační klíč - přesná délka JGM regionu, specifické Indel-CAPS a SNP-CAPS markéry pro selektované dnihy/linie a jejich heterozygoty a hybridy_____________________________________________________________________________

X

^x

X

81

IO

co CM

<N

62

24

ω

m

ID

00 co

CO

O CM

L40,

co

(0

σΓ

Si

X

σι

co

(M

co

49j

m

00

CM co

5-836,

Ch co 04

C ^z6£Z

354

478/

CM in

CO

co

o

X

_Q-

7x

$

5

rr^-

CO

□0

<

Σ

^n

<

o 04

O

6“

00

ID

§

in

LD

kD

ID

04

O'

m

cn

CM

o

tn

co

ID

CD

00

in

r*

00 K

oo ri

in rH

σ» co %, in

O co tn

3/39

ri CO

00 co 00

CO σι tn

4,10

835

co cm

in co O

l< σι m tn

CO 04 CO

00 co'

σι 2

tn CM

00 o

88

in

co 04

CO

r—1 in o co

CD

ο co

IN

24

co

to

49

5? m

to

m CO

ID co

J

ri rH

in

rH

ID

CM

HO

CO

co 00

CM

04

26€

04

m

ΙΛ

m

•Λ

in

tn

co

CL

a

CL

Cl

CL

□

O

_

u

fD

(Λ

in

m

in

tn

in

c

C

Π

H

Η

Π

Q

>

Σ

CD

X

σι

TT

co

00

04

ΓΜ

rH

m

cn

in

m

in

ID

O

m

ID

CO

00

rd

cn

CO

CM

00

in

CD

co

CO

νΉ

04

σι

00

m

lO

co 00 tn

rn

σ

00

m

in

00

tn

m

in

oo tn

00 m

00

co 1

<

CD

in □

<

CD

<

CD

ω

Φ

To

Φ

φ

Φ

75

in

ΙΛ

’c

Έ

jz

’c

c

‘c

c

=3

|

Q-

_

c

C

in

tn

Φ

1

^—1 <n

“1 </)

c Q

Jx

^Q.

D

in

ro

co £

—

co

fO

Φ

co

a

m

CO

co

Φ

m

tn

co

CD

Σ3 C ^Q.

c c o

lZ) 5

izi 1

S/fl

C φ -σ

c i; Ό

Π3

inops

in

Z3 co n

Squal

igel zingel

Φ

O

□ CL O

ora p

CX CD O

CO <Λ □ C φ

Μιη 3 C *Φ >

M- </) Σ3 C *Φ >

tn To c -*c o >4—

tn 35 c

fontinalis

ucaspius

mba vimt

mba mele

vimba

CL O c. Π3 Φ E

Φ tn □ 3

d Vimba/:

igel streb

ittus gobi

ittus poec

eudorasb

JO m co δ □ Φ

Ίϋ

Π3

tu

φ

CT

o

Q

m

in

GO

uS

GO

_>

—1

>

GO

1_

04

Μ

o

O

Q.

Q-

10CZ 307525 B6

Pokračování tabulky

OJ

C4 'Φ O '03 Q

CD '03 Q

Druh/linie/heterozygot/hybrid JGM marker 1 fragmentu marker 2 fragmentu marker fragmentu marker fragmentu oblast 3 4 (bp) ____________________________________________________________________________________________________________

Neogobius melanostomus 481 Alul 333,148 Kpn2l 481 Ddel 481 x x Pontícola kessleri 484 Alul 484 Kpn2l 484 Ddel 484 x x Neogobius gymnotrachelus 485 Alul 485 Kpn2l 422,63 Ddel 485 x x Neogobius fluviatilis 482 Alul 334,148 Kpn2l 482 Ddel 277,205 x x 165-154,143, 92, Proterorhinus semilunaris 465-485 Csel 465-485 Dral 76 x x x x Proterorhinus semipellucidus 483 Csel 416,67 Dral 315,92,76 x x x x Proterorhinus marmoratus 484 Csel 484 Dral 392,92 x x x x Gymnocephalus cernua 602 EcoT22l 525,77 Psil 602 Msll 405, 197 x x Gymnocephalus schraetser 603 EcoT22l 603 Psil 448,155 Msll 400,203 x x Gymnocephalus baloni 606 EcoT22l 606 Psil 606 Msll 240,201,165 x x 194,171,129, Lepomis gibbosus 661 BseMII 423,238 Taal 474,187 Ddel 100,53,14 x x Micropterus salmoides 641 BseMII 439,202 Taal 310,188,143 Ddel 332,160,96,53 x x Micropterus dolomieu 638 BseMII 638 Taal 312,145,135,46 Ddel 334,251,53 x x Barbatula barbatulajinie A 436 Sspl 436 NhaXI 390,46 x x x x Barbatula barbatulajinie B 436 Sspl 230,206 NhaXI 390,46 x x x x Barbatula barbatulajinie C 433 Sspl 230,203 NhaXI 433 x x x x

Sander volgensis 482 Ball 482 BsuRI 318, 144,20

Sander lucioperca_________________482_______Ball_________278, 204________BsuRI 184,144,134, 20

Perca fluviatilis 498 Tasí 443,55 Mphll03l 498

Perca flavescens_________________483_______Tasí__________483________Mphll03l______252, 231

Pokračování tabulky 2

□

X X

X

X X

X

X X

X

nj -X 'Φ Q

c φ E 00 ra w—

φ

-x

<

X

O

E

.

CD

ID

vo!

σι

CD

CD o’ t—1 ώ O

CD ι

ra -X •Φ Q

c Φ E 00 ra *4—

X

315, 15

CM CD

Ž

463

r—1 Ó

gj! σι j Co : :

m Q< O

marker

m

X

Pad

u ro Q.

Ό ro Q.

Pad

Ή ro X

Q. ro X CD O ΓΝ ώ o rsi o' O ID rn CD in

5. ra X

m

ld

ra

c CD

148

pN

LD

CD

660

rH σι rM

12,1

CM zrx

CD oo rH

56

200

σι

8 σι

co

00

σι o σι ri O LD

'Φ Q

b 00 ra

359/

m

rH LQ

<—1 Lfl

656-

σι σΓ

σι σΓ co

50, 1«

in σι σι

in σι

Id σι

ID

(d σι

46

8 00

σι

ΓΜ

CD

k_

δ

OJ -X ro E

<

Afll

Taq

Pfel

Pfe

Pfel

Dra

Aval

t-4

D 4-» C Φ E 00 ro <4—

o

σι

ra _x 'OJ a

507

00 00 σΓ σι Μ·

co CM CO σι

516

656-660

LD CM r\i co m

341, 226, 9

337,150

s

322,159

CO CD in 00 00

5

3 vl CD vl m

319,144

04-610, 20

o σι

ID O op 04 o 00

r1 v—1 00

σι

ID

<—I

m

řň

rň

m

<Z)

t

o

O

o

—

—_

_

Q_

CD

r-H

tH

o

ra

Έ

ra

e

c

—

< O

kro

phl

-C CL

-C

phl

_Q

í

qiAi

4Λ ce

ω a:

<Λ cc

ωχ

E X

Xm

□0

Ίλ CD

ΙΛ co

E

5

Σ

E ^xra

V) ra

o

LD

ID

660

cn

659

r—1

Id

m

00

CD O op r\i O co

_x

o

rH

t—1

1

m

I

ω

co

00

s

Id

LD

r-f

c

CD —»

15 O

«£2

m

LH

LD

LD LQ

ld

LO

ID o

00

D

“a

ω

CM

LD

00

k_

rxT

X

-Q

CJ

r—1

u_

.12

_C

c

£

15

ro

<

cd

U

O

c Φ

φ

Φ

o E

o

=s

ro Έ

ro ‘c

nia

ro c

C

ro c ‘o. tn O In o 00 o c ra E o a:

00 NI O Φ Φ JZ Φ 'c □

obitis elongatoides

obitis strumicae

ra c Φ ra ιΛ 15 o

obitis tanaitica

inca tincajinie East

ιΛ CD § Φ c ^—1 ra _c ra c

lH Φ 5 Φ c ^—1 ra c ra

lypophthalmichthys

tenopharyngodon ic

hoxinus lumaireul

“1 </» D C X O _c CL ΙΛ □ C X o -C

~l □ C X O _c CL (Λ □ c X o

hoxinus phoxinusji

omanogobio - skupi

'>· ZJ o CL o »φ

'5 □ -X <Λ o 15 o 00 o ro E o

Φ ΙΛ ΙΛ Φ _x

□ o o -C □ o “O

Q

o

i-

rn

P—

t/?

X

o

CL

Q_

Q.

DC

-Q

a:

12CZ 307525 B6 _________________________Pokračování tabulky 2________________________________________________ Unikátní CAPS Délka CAPS Délka CAPS Délka CAPS Délka

Druh/linie/heterozygot/hybrid JGM marker 1 fragmentu marker 2 fragmentu marker fragmentu marker fragmentu oblast 3 4 _______________________________________(bp) ____________________________________________________________________

Romanogobio belingi 806 Vspl 417,389 Dral 806 x x x x Romanogobio vladykovi 808 Vspl 808 Dral 808 x x x x Romanogobio albipinnatus 817 Vspl 817 Dral 469,348 x x x x Romanogobio kesslerii 802 Seal 672,130 x x x x x x Romanogobio banaticus 806 Seal 806 x x x x x x Cyprinus carpio 596 Dral 596 Acll 596 x x x x Carassius carassius 588 Dral 444,144 Acll 588 x x x x Carassius gibelio 568 Dral 568 Acll 425,143 x x x x Carassius auratus 579 Dral 579 Acll 378, 139,62 x x x x Carassius carassiusjinie A 588 BsuRI 397,118,73 BstNI 523,65 x x x x Carassius carassiusjinie B 588 BsuRI 459,118 BstNI 588 x x x x Misgurnus fossilis 474 Pstl 398,76 BstZ17l 474 x x x x Misgurnus nikolskyi 485 Pstl 245,240 BstZ17l 434,51 x x x x Alburnoides rossicus 461 Aflll 461 Seal 297,164 x x x x Alburnoides maculatus 460 Aflll 309,151 Seal 460 x x x x Alburnoides strymonicus 459 Pvull 323,136 Alw26l 194,175,90 BseDI 459 x x Alburnoides sp. Sperchios 463 Pvull 463 Alw26l 373,90 BseDI 463 x x Alburnoides thessalicus 459 Pvull 459 Alw26l 194,175,90 BseDI 324,135 x x

Alburnoides fasciatus 463 Aflll 463 Alw26l 198,175,90

Alburnoides kubanicus 461 Aflll 310,151 Alw26l 371,90

Alburnoides eichwaldii 466 Aflll 466 Alw26l 196,175,95

Alburnoides sp. 5_________________462 Aflll__462_________Alw26l_________367, 95

- 13 CZ 307525 B6

CM ____________________________________________________Pokračování tabulky 2___________________________________________________ Unikátní CAPS Délka CAPS Délka CAPS Délka CAPS Délka

Druh/linie/heterozygot/hybrid JGM marker 1 fragmentu marker 2 fragmentu marker fragmentu marker fragmentu tn ca

-Q O

-Q

X

X X

X

XXX

X

*

X

O

m

in

m

145

173

tn

CM cn

δ ID rd

in

m

in

<n

rd

m

CM

tn

b*

rd

<n

co'

*

a.

3

co

tn

·»

rd

X

σ

CM

sj-

CN

co

CM

00

co

3

co

rd

00

CO

σ

co

CM

ΓΜ

IN

rq

CM

tn

to

rd

cn O tn

3

46

tn

to' to

in

čň

<n

tn

42

to

to *4—

42

5

rd

X

cr to

σtu 1-

___ S’ h-

ω

CD

CQ

CD

CL tn

Q. tn

CL </)

1-

X

CD

in

tn

tN

<0

m

ID

CD

ID

00

rH

rd

in

dt

ID ID st in m rd

id' tn

St ID

o CM ID

3 rd

3' rd

s' rd

X

833

00 σ

m m 00

813

832

in rd CM

0, 49

cm' rd CM

837

00 rd cd

2,18

rd

00

m

rd

tn

m

tn o

co rd

fM

δ

«

00 rd

to

rd rd

in CM

ID

ID <n

CM

in

tN

φ T3

ω •a

Φ “□

Φ n

Φ a

Φ Ό

χ

ndlll

c

Ό c

lidí

CL

del

Φ 13

Q. tn

Tn

Q

X

CD

co

Q

in

tn

in

CD

o

ID

CM

σ

o 00

σι

o 00 rd

tn

00

234

00

in

σ s'

tn

80

00

rd to tn

to

5/18

in rd

tn

fS*

fM

σ

CM

tn 00

CM

tn

83

KO

ID

83

tn co

rd

od ID

st CM

CO

σ m

δ

σ σι

w tn

s

ID

St

m

<n

in on

tj

(j

(_)

O

u

(J

□

D

o {—

o

u

φ

Φ

φ

in

cl

Q.

CL

O-

CL

cl

<

X

u X

X

d

tn O

σ>

R

σ

δ

tn

m

427

m

δ

in

tn

CM

tn

to

00

IN

ID

δ <H

co

3

tn

m

tn

to

rn

CM

m

st

St

st

443

00

oo

00

co

00

oo

co

00

o

ΙΛ □ C φ

ΙΛ =J 4-» to

denstaedtii

)/A. ruthenus)

scus

lus

scusjinie A

scusjinie B

lus_linie A

lusjinie B

nusjinie A

CD Φ 'c c

nusjinie C

tn D ra -C Cl Φ in tn D C □ -Q 03 <

’k_ σι φ ω c

-c 4-1 □ Φ tn C

4-* tn u_ QJ tn C

ΰ. Φ to JD LΦ ΙΛ c

φ 3 00 φ </) C

o tn Z5 -C

r (H. husc

icus leuci

un □ T3 □ y

tn D CL 1/) ra 1/1

ius cepha

>cus leuci

scus leuci

iuscepha

ius cepha

□ -Q co c

L_ D _Q to tn 3 C

nus albur

ω CL

Φ CL U

Φ CL

Φ a

<L> Q.

o ΙΛ

ste

ucis

2 Ξ

ual

UCÍ!

ucii

ual

□

□ n

D D

Ό

U

u

tl

φ

a>

Φ

tn

CT

Φ

cr

<

X

CD

—1

-j

<

uo

_j

—1

m

<n

<

tn CD

Π3

E to jO

VO

E to _Q <

ID rusballerus 460 Aanl 262,68,66,64 Alul 234,156,70 Hindi 460 Bsu (U

CD

- 14 CZ 307525 B6

____Pokračování tabulky 2__________________________________________________ Unikátní CAPS Délka CAPS Délka CAPS Délka CAPS Délka

Druh/linie/heterozygot/hybrid JGM marker 1 fragmentu marker 2 fragmentu marker fragmentu marker fragmentu

Scardinius erythrophthalmus 472 Afllll 444,28 Bspl43l 472 Rsal 285,98,66,23

Scardinius hesperidicus 472 Afllll 472 Bspl43l 397,75 Rsal 285,98,66,23

- 15 CZ 307525 B6

c

X o < z t o < z o

OJ (D Ό TJ Q Q

O O O O H

ID tr fN C CL

fN CM H O

LU

O < Z t φ TJ Q ω TJ

ΙΟ z u <

- 16CZ 307525 B6 oT

LU ne

ti αΓ U1 Φ (Y)

LU

O Π3 CL

Q ω U1

CO co ω co m

Q. ul

CO ex UI

CO m

r—I ex ul CO

Pokračování tabulky 3 '07 in ω c ’M in ω oc a? UI ω

LU ne σ ο a:

CM (3 rsi CM o (J LU ra

-Q

O O < O <

Ϊ S 5 S 5 < < t ω μ ω o μ o μ

Z O b <3 ru F· ra ΙΟ m CO rH a co ra

LH

LD rsl

J

LD CM $

O)

WFo ω O z z < Fo <

ω UI ro ω

UI CO ω

UI

Ft=

u.

Q a: 3 in CO <3 t

4-* m

Q_ ω b (3 3

Fo

CL

F“ o Ια UI

CL o in CL ř <5

ω □ υι

Ό 3 Φ

Squalius cephalus - 2 linie Hindi GTYRAC Ddel CTNAG

Alburnusalburnus-3linie Csel GACGCNNNNN Sspl AATATT Taql TCGA

A. alburnus/S. cephalus hybrid Ssil CCGC Bsll CCNNNNNNNGG Hhal GCGC ___________________________________________________Pokračování tabulky 3___________________________________________________

Rod RE esej Restrikční RE esej Restrikční RE esej Restrikční RE esej Restrikční

CM

I< CD m r—I ZJ i/> co ř

CD hO hm r-l □ CO

CO cd ř o

CD O r4 □ ω

CO cd ř o m

D ΙΛ CO ř

cd

CJ H tn

CQ cd o o o cjcj o cd cd cdcd < < < <<

c c c c c ra ra ra ra ra < < < < <

E ra U-Q <

cr σ cr σ ra ra ra ra Η Η H hQ. Q. Q. Q. tn tn tn vn > > > >

tn *4^ □

MUM—

CD	CD	CD	CD
CD	CD	CD	CD
Z	z	Z	z
z	z	z	z
z	z	z	z
z	z	z	z
z	z	z	z
z	z	z	z
z	z	z	z
o	o	o	o
o		o	o

ω σ» υη m CO CO CO CO b b b b b b o cd cd cd cd cd <<<<<<

D D D D D D <<<<<<

o α u o o o <<<<<<

ίH í0 O

O O < <

CD O <

ra ra ra ra ra ra

I- H ř- I- I- h-

Scardinius________________________________Afllll_________ACRYGT Bspl43l________GATC__________Rsal________GTAC

18CZ 307525 B6

Tab. 4. Druhy sivenů detekovatelné metodou S7ÍCAPS

Český název	Latinský název	Původ
Sivěn arktický	Salvelinus alpinus	Dánsko, Německo
Sivěn americký	Salvelinus fontinalis	Česko, Slovensko
Sivěn alsaský	Salvelinus alpinus/Salvelinus fontinalis	Česko

Tab. 5. Druhová a linijní identifikace sivenů z biologického materiálu z intenzivních chovů

Výsledky_________	Sa	SfA	SfB	SfA/SfB	SalsH2A	SalsH2B
Deklarace	No.
Sa	20	20
Sf	42		21	4	10	6	1
Sals	34	1			1	22	10

Způsob podle vynálezu umožňuje zjišťování příslušného druhu/linie ve vzorcích čerstvých, zmražených, fixovaných a ve všech vzorcích potravin, krmiv a obecně výrobků obsahujících rybí maso.

Součástí vynálezu jsou rovněž identifikační soupravy pro druhové/Unijní zjišťování sladkovodních evropských ryb způsobem podle vynálezu. Identifikační soupravy obsahují druhově specifické primery a specifické restrikční endonukleázy vytvářející druhově/linijně specifické restrikční vzory, kterými se provádí determinace homozygotních (čistých), heterozygotních i hybridních jedinců v biologických materiálech a rybích výrobcích. V některých případech postačí k identifikaci i jen prosté elektroforetické vzory (bez restrikčního štěpení) vizualizující délkový polymorfismus získaných amplikonů - JGM oblastí, které jsou rovněž podstatou vynálezu.

Způsob podle vynálezu se týká konvenční PCR se specifickými primery, vymezujícími druhověunikátní intronické JGM oblasti a generujícími buď délkově polymorfní amplikony, anebo specifické restrikční vzory při součinnosti se štěpením specifickými restriktázami s designem do indelových pozic a/nebo pozic SNPs. Metoda nazvaná S7ÍCAPS (S7 intron cleaved amplified polymorphic sequence), která je také podstatou vynálezu, byla odvozena z následné konverze unikátních indelů a SNPs do druhově/linijně specifických CAPS markéru (cleaved amplified polymorphic sequence). Metoda S7ÍCAPS byla designována pro rutinní použití v laboratoři k identifikaci níže zmiňovaných taxonů evropské ichtyofauny. Vychází z amplifikace částečných sekvencí 1. intronu genu S7 r-protein (S7).

Identifikační metoda S7ÍCAPS využívá kombinace buď: 1) diagnostické délky PCR produktů (díky přítomnosti dostatečně dlouhých indelů) a specifického SNP-CAPS nebo InDel-CAPS markéru anebo 2) dvou InDel-CAPS nebo SNP-CAPS markérů popřípadě jejich kombinace.

Nově byl navržen primerový design pro evropské druhy či skupiny druhů cílený do konzervativních oblastí a vymezující hypervariabilní druhově/linijně specifické části S7 intronické sekvence, tzv. JGM oblasti. Byla rovněž provedena optimalizace všech komponent, kroků a teplotních profilů.

Jedinečnou výhodou způsobu podle vynálezu je, že vyvinuté uspořádání konstruované na biparentálním způsobu dědičnosti S7 alel a jejich možné alelické rekombinovatelnosti dovoluje detekovat historické hybridizační události vznikající sexuální i asexuální reprodukcí ryb.

- 19CZ 307525 B6

Další výhodou je, že teplotní profil pro všechny monoplexní PCR je univerzální a liší se jen v několika málo případech pouze v anealingové teplotě. Rovněž i chemické reagencie byly vyladěny do jednotného mastermixového konceptu. To je výhodné při zpracování velkého množství vzorků, kdy v jednom experimentu lze souběžně analyzovat druhově/linijně rozdílné vzorky, čímž dochází k významné úspoře finančních nákladů a času.

Další výhodou je, že náklady na CAPS stanovení jsou obecně nízké, protože je použito levných a běžně dostupných restrikčních enzymů.

Vznikající PCR produkty jsou specifické a není potřeba ověřovat jejich specifitu dalšími metodami. Přesto v případě potřeby je možné výše uváděné primery použít i jako primery sekvenační pro snadnou a rychlou konfirmaci, která je finančně nenáročná z důvodu aplikace pouze jednoho páru primem, tedy dvou běhů na běžném genetickém analyzátoru.

Další výhodou je, že délka diagnostického regionu J. G. Mendela je designována v rozmezí cca 450 až 850 bp, což je postačující pro snadno rozpoznatelný restrikční vzorná agarózovém gelu.

Spolehlivost a robustnost navrženého uspořádání byla ověřena na vzorcích z rozličných geografických oblastí (různých umoří a povodí) a rovněž i na různých cyclerech a mastermixech od rozličných firem.

S7ÍCAPS identifikační klíč je designován dvoustupňové a v některých případech i třístupňové. Tzn., že všechny vzorky se mohou analyzovat pomocí minimálně dvou různých restriktáz s designem do indel a/nebo SNPs pozic. V některých případech může být jedna z nich nahrazována již diagnostickým délkovým polymorfismem amplikonů, což poskytuje dostatečnou spolehlivost určení.

Hlavní výhodou metody S7ÍCAPS je snadná opakovatelnost a aplikovatelnost (možnost provedení v různých laboratořích s běžným přístrojovým vybavením bez nutnosti další optimalizace), časová nenáročnost a nízké finanční náklady ve srovnání se sekvenačními technologiemi II. generace. Způsob podle vynálezu nevyžaduje použití komerčních referenčních standardů, jako je tomu u metod založených na analýze proteinů.

Způsob podle vynálezu má význam zejména v oblasti mapování druhové pestrosti a reálné vnitrodruhové (genetické) diverzity ichtyofaun, z hlediska ochrany původního genofondu ryb v různých státech, z hlediska posouzení introdukčních a reintrodukčních snah a jako nástroj prevence před devastačními hrozbami a zdravotními riziky dovozů nepůvodních druhů/linií ryb. Dále v oblasti genetické determinace jednotlivých linií a plemen v intenzivních chovech v rámci chovného managementu, pro zachování čistoty chovu, pro zvýšení a zefektivnění produkce, pro uchování odolnosti vůči chorobám i různým stresovým faktorům. Nezanedbatelná je i oblast prevence falšování jiker, plůdku, násadového materiálu a výrobků s rybím obsahem, kdy dochází k druhovým záměnám rozdílné kvality a ceny.

Následující příklad provedení způsob podle vynálezu dokládá, aniž by ho jakkoli omezoval.

Objasnění výkresů

Obr. 1 - specifické JGM oblasti a Tasí stanovení s restrikčními vzory u čistých druhů sivenů, jejich vnitrodruhových heterozygotů a mezidruhových hybridů . Unikátní JGM oblast

M = Marker (155 až 970 bp) = S. alpinus (524 bp) = S. fontinalis varianta A (583 bp)

-20CZ 307525 B6 = S. fontinalis varianta B (589 bp) = heterozygót S. fontinalis A/B (583/589 bp) = hybrid S. alpinus/S. fontinalis varianta A (524/583 bp) = hybrid S. alpinus/S. fontinalis varianta B (524/589 bp) = negativní kontrola

Μ = Marker (155-970 bp) . Tasí stanovení (Tasí esej)

M = Marker (155 až 970 bp) = S. alpinus (diagnostický fragment 243 bp) = S. fontinalis varianta A (diagnostický fragment 305 bp) = S. fontinalis varianta B (diagnostický fragment 394 bp) = heterozygót S. fontinalis A/B (305/394 bp) = hybrid S. alpinus/S. fontinalis varianta A (243/305 bp) = hybrid S. alpinus/S. fontinalis varianta B (243/394 bp) M = Marker (155 až 970 bp)

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava materiálu i reagencií a konvenční metodologie

DNA materiál. K ověření nové identifikační metody S7ÍCAPS v rutinní analýze byly použity DNA templáty získané z 96 vzorků sivenů dvou českých chovných zařízení s původem od šesti českých i zahraničních dodavatelů (Tabulka 4). Konkrétně se jednalo o části ploutví uchovávaných v etanolu. Jako pozitivní kontrola sloužily vzorky sivenů s certifikací od dodavatele a navíc morfologicky i geneticky předtestované.

Vzorkování. Od každého zdroje bylo odebráno 10 až 55 vzorků ploutevní tkáně na PCR analýzu.

Izolace DNA. Izolace byla provedena ZR Genomic DNA-Tissue MiniPrep kitem (Zymo Research, USA) podle návodu výrobce. Pro izolaci DNA bylo použito výchozí množství 25 mg tkáně. Koncentrace a čistota DNA izolátu byla změřena přístrojem Helios γ (Thermo Spectronic, VB).

Návrh primerů. Příměrový set pro hypervariabilní oblast jaderné sekvence 1. intronu S7 genu (JGM region) byl navržen programem Oligo (Molecular Biology Insights, USA), Tabulka 1).

Monoplexní PCR systém. Reagencie pro monoplexní PCR byly optimalizovány, včetně teplotních podmínek PCR protokolu. Optimalizovaná reakční směs obsahovala 12,5 μΐ PPP Master Mixu (Top-Bio, Česká republika), 20 pmol primerů SalS7F a SalS7R, 3 μΐ vyizolované DNA v celkovém objemu 25 μΐ. PCR amplifikace probíhala v termocykleru Mastercycler pro (Eppendorf, Německo) za následujících podmínek: úvodní denaturace 2 min 95 °C, poté 30 cyklů po 30 s při 95 °C, 45 s při 60 °C, 1 min při 72 °C a na závěr finální elongace 10 min při 72 °C.

Separace a vizualizace fragmentů. Produkty PCR amplifikace a restrikčního štěpení byly oddělovány v 1,7% agarózovém gelu na horizontální elektroforéze za použití SB pufru a Midori Green Advance barvení při napětí 10V/cm po dobu 45 až 50 minut. Jako velikostní standard byl použit DNA marker 155 až 970 (Top-Bio, Česká republika). Jednotlivé fragmenty byly vizualizovány pomocí gelového dokumentačního a analytického systému GeneGenius Match (Trigon-plus, Česká republika).

-21 CZ 307525 B6

Příklad 2

Vlastní způsob identifikace

Metoda S7ÍCAPS. Identifikační metoda S7ÍCAPS využívá u sivenů kombinovaného ampliconSNP-CAPS designu, tzn. přítomnosti dvou indelů poskytující rozdílné délky PCR produktů variabilní části 1. intronu a také i cíleného štěpení do pozice druhově/linijně specifického SNP. Jako nástroje CAPS designu pro výpočetní konverzi SNPs do CAPS markérů byly použity dva programy CAPS Designér (http://solgenomics.net/tools/caps_designer/caps_input.pl) a SNP2CAPS (Thiel, T„ Kota, R., Grosse, 1., Stein, N., Graner, A. 2004. SNP2CAPS: a SNP and INDEL analysis tool for CAPS marker development. Nucleic acid research 32(1), e5). Bylo nalezeno 64 CAPS kandidátů, z nichž jako nejvhodnější byl vybrán Tasí (Tabulka 3).

Délka JGM oblastí. Délky amplifikovaných PCR produktů jsou druhově/linijně specifické a pro druh Salvelinus alpinus (Sa) je 524 bp, pro Salvelinus fontinalis linie A (SfA) 583 bp a pro Salvelinus fontinalis linie B (SfB) 589 bp. Pro detekci sivěna alsaského (mezidruhového hybrida - Salvelinus fontinalislSalvelinus alpinus) typu SalsH2A je 524/583 a pro hybrida typu SalsH2B 524/589 (Tab. 2).

Zajišťovací SNP-CAPS marker Tas I. Amplifikovaný PCR produkt je následně štěpen (podle protokolu výrobce) druhově/linijně specifickou restriktázou Tasí se štěpícím místem 7AATT vyskytující se v primery vymezené oblasti. Tento SNP-CAPS marker (Tasí assay nebo-li Tasí esej) jednak potvrzuje správné druhové určení, a rovněž i spolehlivěji odlišuje obě linie Salvelinus fontinalis od sebe. Diagnostický restrikční fragment pro Salvelinus alpinus je dlouhý 243 bp, pro Salvelinus fontinalis linii A 305 bp a pro linii B 394 bp (Tabulka 2, Obrázek 1).

Citlivější rozlišení heterozygotů a mezidruhových hybridů. Rozlišovací schopnost Tasí eseje je rovněž využita pro jednoznačné rozlišení vnitrodruhových heterozygotů sivěna amerického i mezidruhových hybridů sivěna alsaského. Specifický Tasí restrikční vzor pro rozlišení vnitrodruhového heterozygota A/B sivěna amerického je 305/394, pro mezidruhového hybrida sivěna alsaského typu A je 243/305 a typu Bje 243/394.

Ověření heterozygótních jaderných haplotypů. Pro spolehlivou identifikaci jednotlivých S7 haplotypů byly výsledné PCR produkty nakloňovány a osekvenovány. Navíc všechny heterozygotní genotypy byly rozfázovány při srovnání s homozygotními haplotypy a byly potvrzeny metodou Phase implementovanou v programu DnaSP (Librado, P., Rozas, J. 2009. DNASP v5: A software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data. Bioinformatics, 25, 1451-1452).

Interlaboratomi test. Spolehlivost metody S7ÍCAPS byla testována na základě interlaboratomích testů neurčených vzorků. Vzorky byly odeslány na vyšetření metodou klonování a následného sekvenování do univerzitní laboratoře. Stejné slepé vzorky byly analyzovány komerční laboratoří metodou sekvenování.

Zamezení kontaminace. Metoda PCR se vyznačuje vysokou citlivostí, proto je nezbytné dodržovat striktní pravidla dobré laboratorní praxe. Extrakce DNA, příprava mastermixů s přídavkem templátu byly prostorově odděleny. Všechny nástroje a pipety byly před použitím sterilizovány v přístroji UV crosslinker BLX-254 (Vilber Lourmat, Francie) a veškerý plast byl sterilizován v parním sterilizátoru Vaposteri/P (BMT, Česká republika). Při manipulaci byly použity špičky s filtry. Při každé amplifikaci byla použita negativní kontrola (PCR HjO) pro vyloučení kontaminace použitých reagencií a plastů.

-22CZ 307525 B6

Příklad 3

Ověření spolehlivosti metody S7ÍCAPS na komerčních vzorcích

Spolehlivost příměrového designu. Navržené primery byly testovány pro spolehlivou PCR amplifikaci jednotlivých taxonů a také pro jejich vhodnost k sekvenační analýze. Bylo laboratorně ověřeno, že příměrový pár správně amplifikoval i sekvenoval analyzované druhy, včetně hybrida.

Specifita délek JGM oblastí. Byly testovány specifické délky unikátních JGM oblastí u zkoumaných taxonů a jejich diagnostický charakter byl jednoznačně prokázán (Obr. 1).

Specifita Tasí eseje. Byla testována specifita Tasí eseje a podmínky proveditelnosti navržené výrobcem. Diagnostický charakter restrikčních vzorů i funkčnost navržených podmínek byl prokázán (Obr. 1)

Výsledky vyšetření. Metoda S7ÍCAPS byla testována pro dva komerční chovy vyšetřením 96 vzorků od různých tuzemských i zahraničních dodavatelů.

Z celkových 96 testovaných vzorků, bylo 42 vzorků deklarovaných, jako čistý sivěn americký bez dalšího Unijního dělení a u 35 vzorků (83 %) to bylo potvrzeno a navíc dále došlo k jemnějšímu roztřídění na dvě různé linie ”A” a ”B”. Linie A byla rozlišena u 21 vzorků, linie B u 4 vzorků a mezilinijní heterozygót (A/B) byl prokázán u 10 vzorků. V 7 vzorcích (17 %) byl detekován zcela jiný druh sivěna, a to sivěn alsaský, který vzniká cílenou hybridizací sivěna arktického se sivenem americkým. Dvacet vzorků bylo deklarováno jako sivěn arktický ze dvou odlišných zdrojů a u všech dvaceti (100 %) byla potvrzena druhová příslušnost k sivěnu arktickému, avšak pouze z jednoho zdroje. Třicet čtyři vzorků bylo označeno jako sivěn alsaský, přičemž 32 vzorků (94 %) bylo takto potvrzeno. Navíc došlo k jemnější klasifikaci sivěna alsaského na 22 kříženců s druhovou participací sivěna amerického linie ”A” (H2A) a 10 kříženců s druhovou participací sivěna amerického linie ”B” (H2B). U dvou vzorků (6 %) byl detekován zcela jiný druh sivěna, a to čistý sivěn arktický a v druhém případě byl detekován vnitrodruhový heterozygot A/B sivěna amerického (Tabulka 5).

Spolehlivost vyvinutého způsobu identifikace podle vynálezu byla testována na základě analýzy slepých vzorků připravených původci. Porovnávací vzorky byly odeslány na vyšetření metodami klonování a sekvenování klonů do univerzitní laboratoře. Stejné slepé vzorky byly analyzovány zahraniční komerční laboratoří metodou přímého sekvenování. Obdržené výsledky byly porovnávány s výsledky, jež získali původci vynálezu, a nebyl zjištěn mezi nimi žádný rozdíl.

Průmyslová využitelnost

Způsob identifikace taxonů evropské ichtyofauny je určen pro rutinní genetickou identifikaci sladkovodních ryb a jejich hybridů v biologických materiálech a rybích výrobcích. Důležitým předpokladem jeho úspěšného použití je izolace vysoce kvalitní DNA a správné zacházení se selektovanými restriktázami dle pokynů výrobce. Vyvinutá metoda S7ÍCAPS byla v praxi vyzkoušena na vzorcích uvedených druhů a rodů z různých geografických oblastí. Uvedený způsob obsahuje konvenční PCR metodiku, která zahrnuje složení PCR mastermixu a podílu jednotlivých složek, teplotní PCR protokol a analýzu jednotlivých restrikčních vzorů, popř. délkového polymorfismu diagnostických JGM oblastí. Navržené uspořádání je využitelné pro státní i soukromé genetické laboratoře, výzkumné ústavy, rybochovná zařízení (rybnikářství, rybářství, atd.), povodí, rybářské svazy a místní organizace, agenturu ochrany přírody a jednotlivé správy CHKO, vysoké školy zemědělského a přírodovědného zaměření, potravinovou a celní inspekci, ministerstva se zaměřením na zemědělství a životní prostředí, národní muzea, atd., a to v rámci i mimo ČR.

-23 CZ 307525 B6

Uvedený způsob obsahuje S7ÍCAPS metodiku, která zahrnuje složení PCR mastermixu se specifickými primery a podílem ostatních složek, teplotně-specifický PCR protokol a analýzu výsledků konkrétních druhů/linií specifickými CAPS markéry, popřípadě unikátními délkami amplikonů pokud jsou stanoveny.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob identifikace sladkovodních evropských ryb v biologických materiálech a rybích výrobcích metodou naštěpené amplifikované polymorfní sekvence intronu S7 -S7ÍCAPS, vyznačující se tím, že se vzorek DNA z biologického materiálu nebo rybího výrobku podrobí PCR analýze za použití druhově nebo skupinově specifických párů primerů uvedených v Tabulce 1, které vymezují částečnou druhově/linijně specifickou sekvenci 1. intronu S7 genu, nazvanou diagnostická oblast J. G. Mendela (JGM), přičemž diagnostické oblasti JGM jsou konkrétně vymezeny pro ten který druh a mají svoji specifickou délku uvedenou v Tabulce 2, načež se na základě délky PCR produktů provede identifikace druhu nebo hybrida, přičemž Tabulka 1 a Tabulka 2 jsou následující: