CZ307792B6 - Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití - Google Patents
Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307792B6 CZ307792B6 CZ2017-483A CZ2017483A CZ307792B6 CZ 307792 B6 CZ307792 B6 CZ 307792B6 CZ 2017483 A CZ2017483 A CZ 2017483A CZ 307792 B6 CZ307792 B6 CZ 307792B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- analyte
- electrode
- liquid sample
- immobilized
- redox
- Prior art date
Links
- 239000012491 analyte Substances 0.000 title claims abstract description 74
- 239000007788 liquid Substances 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 34
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims abstract description 33
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 24
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 22
- 230000003993 interaction Effects 0.000 claims abstract description 22
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 230000008859 change Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims abstract description 7
- 230000000153 supplemental effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 15
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 12
- 241000589972 Borrelia sp. Species 0.000 claims description 9
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 239000010931 gold Substances 0.000 claims description 5
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000004082 amperometric method Methods 0.000 claims description 4
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 claims description 4
- 238000004832 voltammetry Methods 0.000 claims description 4
- BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N Silver Chemical compound [Ag] BQCADISMDOOEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- -1 aminoferocene Chemical compound 0.000 claims description 3
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000010949 copper Substances 0.000 claims description 3
- KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N ferrocene Chemical compound [Fe+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 KTWOOEGAPBSYNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000004313 potentiometry Methods 0.000 claims description 3
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000004332 silver Substances 0.000 claims description 3
- AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(6+);hexacyanide Chemical group [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+6].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] AWDBHOZBRXWRKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 2
- ILZSSCVGGYJLOG-UHFFFAOYSA-N cobaltocene Chemical compound [Co+2].C=1C=C[CH-]C=1.C=1C=C[CH-]C=1 ILZSSCVGGYJLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 15
- LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide Chemical compound CCN=C=NCCCN(C)C LMDZBCPBFSXMTL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229920000729 poly(L-lysine) polymer Polymers 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid group Chemical group C(CC(O)(C(=O)O)CC(=O)O)(=O)O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 7
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 6
- 230000001301 anti-borrelial effect Effects 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 238000002847 impedance measurement Methods 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 3
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 238000007650 screen-printing Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 2
- KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N Palladium Chemical compound [Pd] KDLHZDBZIXYQEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000000835 electrochemical detection Methods 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 2
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 108091023037 Aptamer Proteins 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 208000006877 Insect Bites and Stings Diseases 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000607149 Salmonella sp. Species 0.000 description 1
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 150000001735 carboxylic acids Chemical group 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000009713 electroplating Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N ferricyanide Chemical compound [Fe+3].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] YAGKRVSRTSUGEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004907 flux Effects 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 229910000510 noble metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229910052763 palladium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 238000000206 photolithography Methods 0.000 description 1
- 239000004584 polyacrylic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000276 potassium ferrocyanide Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- VVNRQZDDMYBBJY-UHFFFAOYSA-M sodium 1-[(1-sulfonaphthalen-2-yl)diazenyl]naphthalen-2-olate Chemical compound [Na+].C1=CC=CC2=C(S([O-])(=O)=O)C(N=NC3=C4C=CC=CC4=CC=C3O)=CC=C21 VVNRQZDDMYBBJY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N tetrapotassium;iron(2+);hexacyanide Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[Fe+2].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-].N#[C-] XOGGUFAVLNCTRS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 1
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/28—Electrolytic cell components
- G01N27/30—Electrodes, e.g. test electrodes; Half-cells
- G01N27/327—Biochemical electrodes, e.g. electrical or mechanical details for in vitro measurements
- G01N27/3275—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction
- G01N27/3276—Sensing specific biomolecules, e.g. nucleic acid strands, based on an electrode surface reaction being a hybridisation with immobilised receptors
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/403—Cells and electrode assemblies
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
- G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
- G01N33/549—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic with antigen or antibody entrapped within the carrier
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Spectroscopy & Molecular Physics (AREA)
- Investigating Or Analyzing Materials By The Use Of Electric Means (AREA)
Abstract
Předkládané řešení se týká způsobu stanovení přítomnosti analytu, který je vybraný ze skupiny sestávající z protilátky antigenu, v kapalném vzorku, který obsahuje kroky: (i) stanoví se hodnota elektrochemického parametru, vybraného z odporu, impedance, napětí a proudu, roztoku redoxní látky, která má opačný náboj než stanovený analyt; (ii) povrch pracovní elektrody obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem se inkubuje se vzorkem, přičemž v případě, že vzorek obsahuje stanovovaný analyt, se tento analyt naváže na imobilizované částice na povrchu elektrody za vzniku imobilizovaného komplexu analyt-imobilizovaná částice na povrchu elektrody; (iii) pracovní elektroda s imobilizovaným komplexem analyt-imobilizovaná částice se uvede do kontaktu s roztokem redoxní látky, která má opačný náboj než stanovovaný analyt; (iv) změří se elektrochemický parametr na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku; (v) z naměřené hodnoty elektrochemického parametru se vyhodnotí jeho změna oproti hodnotě stanovené v kroku (i), přičemž platí, že přítomnost analytu ve vzorku vede k poklesu hodnoty odporu, impedance, napětí, a k nárůstu proudu na rozhraní povrchu elektrody a roztoku redoxní látky; ze změny elektrochemického parametru se kvalitativně a/nebo semikvantitativně a/nebo kvantitativně stanoví přítomnost analytu v kapalném vzorku.
Description
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká způsobu stanovení, přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití zejména pro stanovení bakteriálních antigenů či odpovídajících protilátek v tělních tekutinách testovaných jedinců s podezřením na onemocnění, např. stanovení protilátek proti bakteriím kmene Borelia sp. v krevním séru.
Dosavadní stav techniky
Většina současných komerčních imunosenzorů vychází z imunochemických testů na bázi laterálního toku (lateral flow imunoassay, LFIA) s vizuální či optickou detekcí. Elektrochemické metody detekce pro imunosenzory nejsou rozšířené.
Dříve byly afinitní elektrochemické imunosenzory založeny na značení jednoho z interagujících partnerů dvojice antigen-protilátka. Jakožto značky mohly být použity enzymy či jiné redoxní látky, např. ferrocen (Okochi, Ohta, Tanaka, Matsunaga, Biotechnol Bioeng 90 (2005) 14). Dnešní přístupy nejčastěji využívají sledování změny elektrochemické impedance senzoru v závislosti na proběhlé afinitní interakci rekogniční složky s analytem.
Afinitní interakce sledované pomocí elektrochemické impedance využívají vznik komplexu mezi různými molekulami. Mohou to být interakce např. mezi aptamery a adenosinem (Zayats, Huang, Gill, Ma, Willner, J Am Chem Soc 128 (2006) 13666) nebo protilátkami a antigeny (Susmel, Guilbault, O'Sullivan, Bosens Bioelectron 18 (2003) 881). Susmel a spol. měřili pokles difuzního koeficientu redoxní próby při zachycení bakterií (potravinových patogenů) na povrch elektrody.
Na povrchu biosenzorů založených na imunoafinitních interakcích dochází k nárůstu hmoty, proto je nejčastější variantou detekce měření nárůstu impedance (míra odporu prostupu nabitých látek skrz tuto vrstvu biomolekul). Měření nárůstu impedance bylo použito také při detekci bakterií kmene Salmonella sp. (Kim, Moon, Hahm, Morgan, Bhunia, Om, Food Sci Biotechnol 18 (2009) 89) či Escherichia coli (Yang, Li, Erf, Anal Chem 76 (2004) 1107, Maalouf, FournierWírth, Coste, Chebib, Saílkali, Vittori, Errachid, Cloarec, Claude Martelet, Jaffrezic-Renault, Anal Chem 79 (2007) 4879). Stanovení Escherichia coli bylo založeno na vysrážení nevodivé vrstvy, přičemž množství precipitátu stínícího elektroaktivní povrch bylo přímo úměrné množství navázané bakterie (Ruan, Zang, Li, Anal Chem 74 (2002) 4814). Signál - nárůst impedance - byl tak zesílen.
Nanomateriály pro afinitní diagnostiku jsou velmi rozšířené (Wang, Analyst 130 (2005) 421), ale používají se především jako značky pro zesílení signálu (Wan, Su, Zhu, Liu, Fan, Biosens Bioelectron 47 (2013) 1; Mwilu, Aluoch, Miller, Wong, Sadik, Fatah, Arcilesi, Anal Chem 81 (2009) 7561).
Principem impedančního stanovení imunoreakcí ze stavu techniky je blokace či zaizolování povrchu elektrody při detekční reakci mezi specificky modifikovanou elektrodou a analytem. Prostup redoxní značky skrz modifikační vrstvu na povrchu detekční elektrody je snížen vytvořeným afinitním párem (např. protilátka-antigen, receptor-ligand či jinou kombinací komplementárních biomolekul), čímž dojde k tzv. difúzní limitaci velikosti faradaického proudu generovaného elektrochemickou reakcí redoxní značky na elektrodě (sníží se prostup redoxní značky proteinovou/modifikační vrstvou na elektrodě). V některých případech se tento princip zesiluje pomocí různých prostředků. Mohou to být membrány, např. vytvořené pomocí aluminiové matrice (Koh, Agarwal, Cheow, Toh, Electrochim Acta 53 (2007) 803), kdy detekční princip využíval blokaci póru, jehož stěny byly modifikovány jedním z partnerů imunoreakce.
- 1 CZ 307792 B6
Pro elektrochemická měření byly použity litograficky připravené elektrody s následnou galvanizací především pro běžný způsob měření v nastavení: Au pracovní, resp. pomocná elektroda a Ag referenční elektroda (La Belle, Shah, Reed, Nandakumar, Alford, Wilson, Nickerson, Joshi, Electroanalysis 21 (2009) 2267; La Belle, Gerlach, Svárovsky, Joshi, Anal. Chem. 79 (2007) 6959; Bhavsar, Fairchild, Alonas, Bishop, La Belle, Sweeney, Alford, Joshi, Biosensor. Bioelectron. 25 (2009) 506). Elektrochemické měření pak bylo prováděno obvyklým způsobem, kdy se na pracovní elektrodě nastavuje potenciál proti hodnotě potenciálu referenční elektrody. Nejčastěji použité měřicí elektrochemické metody jsou impedanční a voltametrická měření.
Nemoc lymská borelióza je způsobena infekcí bakterií kmene Borrelia sp. V Evropě je převažující infekce druhy B. afzelii a B. garinii a v Severní Americe je to B. burgdorferi. Tato bakteriální infekce je v současné době nejčastěji diagnostikována pomocí metody ELISA, kdy čas pro diagnózu je několik hodin. Přesnějšími metodami jsou Western blot či PCR, kde minimální čas pro diagnózu je 14-ti hodinová analýza. V tomto časovém úseku však není zohledněno odebrání vzorku, transport, zpracování vzorku, dále komunikace a interpretace výsledků. Jelikož se stanovení provádí pouze ve specializovaných laboratořích, udává se doba jedné analýzy minimálně 3 dny. I přes existující diagnostický systém pro odhalení infekce bakteriemi kmene Borelia sp. chybí možnost rychlého a levného stanovení v domácích podmínkách nebo u praktického lékaře, ke kterému by nebylo zapotřebí analyzovat vzorek ve speciálně vybavené laboratoři.
Zdlouhavost, komplikovanost a finanční náročnost stanovení analytu, zejména protilátek proti lymské borelióze, dle stavu techniky řeší předkládaný vynález, který umožňuje udělat si předběžný screening u lékaře nebo doma (při podezření na infekci, např. v prvotní fázi imunitní odpovědi organismu po přisátí infikovaného klíštěte či poštípání hmyzem), který doposud na trhu chybí.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku, který obsahuje následující kroky:
(i) stanoví se hodnota elektrochemického parametru, vybraného ze skupiny sestávající z odporu, impedance, napětí a proudu, systému, tvořeného povrchem pracovní elektrody, obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, ponořené v roztoku redoxní látky, která má opačný náboj než stanovovaný analyt, přičemž rozpouštědlem redoxní látky je s výhodou voda, vodný roztok pufiru, s výhodou o pH 4 až 9, nebo fyziologický roztok, a přičemž s výhodou je koncentrace redoxní látky v roztoku v rozmezí od 1 M do 1 M, s výhodou od 1 do 20 mM; případně se povrch pracovní elektrody omyje, s výhodou destilovanou vodou nebo fyziologickým roztokem, a následně se zbaví přebytečné kapaliny;
(ii) povrch pracovní elektrody obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, vybrané ze skupiny sestávající z protilátky a antigenu, přičemž pokud je imobilizovanou částicí protilátka, je analytem antigen a více versa, se inkubuje s kapalným vzorkem, přičemž v případě, že vzorek obsahuje stanovovaný analyt, se tento analyt naváže na imobilizované částice, s výhodou antigen nebo protilátku, na povrchu elektrody za vzniku afinitního komplexu analytimobilizovaná částice na povrchu elektrody; doba inkubace je s výhodou v rozmezí od 5 do 120 minut při teplotě od 10 do 40 °C a pH 4 až 9, případně se povrch pracovní elektrody s imobilizováným afinitním komplexem analyt-imobilizovaná částice omyje, s výhodou destilovanou vodou nebo lyziologickým roztokem a následně se zbaví přebytečné kapaliny;
(iii) pracovní elektroda s imobilizovaným afinitním komplexem analyt-imobilizovaná částice se uvede do kontaktu se stejně koncentrovaným roztokem téže redoxní látky jako v kroku (i), která má opačný náboj než stanovovaný analyt, přičemž rozpouštědlem redoxní látky je s výhodou
-2CZ 307792 B6 voda, vodný roztok pufru, s výhodou o pH 4 až 9, nebo fyziologický roztok, přičemž koncentrace redoxní látky v roztoku je v rozmezí od 1 EM do 1 M, s výhodou od 1 do 20 mM;
(iv) stanoví se hodnota elektrochemického parametru, vybraného ze stejnosměrného proudu, stejnosměrného napětí, odporu, střídavého proudu, střídavého napětí, impedance, na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku, přičemž redoxní látka má opačný náboj než stanovovaný analyt, s výhodou je měřeným elektrochemickým parametrem elektrický proud nebo napětí, ze kterých se následně stanoví impedance systému;
(v) z hodnoty stanoveného elektrochemického parametru v kroku iv) se určí změna elektrochemického parametru vůči elektrochemickému parametru roztoku redoxní látky stanovenému v kroku i), přičemž platí, že přítomnost analytu ve vzorku vede k poklesu odporu, impedance a napětí, a k nárůstu proudu. Ze změny elektrochemického parametru, s výhodou impedance, se kvalitativně a/nebo semikvantitativně a/nebo kvantitativně stanoví přítomnost analytu v kapalném vzorku.
Uvedeným způsobem lze stanovit analyt v rozmezí koncentrací v kapalném vzorku od jednotek ng/ml do jednotek mg/ml.
Pro stanovení elektrochemického parametru lze použít metody potenciometrie, voltametrie, amperometrie nebo biamperometrie, s výhodou biamperometrie, a jim příslušné elektrodové uspořádání. Odborník znalý oboru by byl bez vynaložení vynálezecké činnosti schopen určit vhodné elektrodové uspořádání, typy a počet elektrod.
S výhodou se kapalný vzorek nakápne přímo na pracovní elektrodu, v případě biamperometrie na elektrodový systém, a měření probíhá v nakápnutém vzorku. Tentýž vzorek se nakápne rovněž na doplňkovou/referenční elektrodu, aby byly elektrody vodivě spojeny měřeným vzorkem. Snižuje se tím instrumentální náročnost tohoto způsobu stanovení i chyba měření, která by mohla vzniknout např. při převádění vzorku do měřicí nádoby, oplachu elektrody apod. Kapalným vzorkem se rozumí např. vzorek krevního séra nebo krve subjektu.
Optimální (nejcitlivější) detekční technikou je stanovení změny impedance pracovní elektrody či v případě biamperometrie elektrodového systému v roztoku redoxní značky před a po inkubaci s kapalným vzorkem. Nejvýhodnější je měření impedance při nižších hodnotách frekvence (nejčastěji v rozmezí do 1000 Hz), kdy se uplatňuje jak vliv analytu na střídavou, tak i na stejnosměrnou složku budicího signálu, resp. stanovované impedance. Měření probíhá tak, že se mezi dvě elektrody v roztoku vloží střídavé napětí a měří se prošlý proud - velikost a jeho fázové posunutí proti vloženému napětí, z čehož se následně dopočítá hodnota impedance. Měří se výstupní signál, resp. impedance, čímž se rozumí vliv reakce imobilizované částice s analytem na budicí signál. Střídavá složka budicího signálu je ovlivněna obousměrným pohybem iontů směrem k elektrodě a od elektrody; stejnosměrná složka je ovlivněna jednosměrným tokem iontů k elektrodě nebo od elektrody. Jako detekční elektrochemickou metodu lze použít rovněž jiné než impedanční techniky, jako např. různé voltametrické či amperometrické metody sledující průchodnost iontů modifikační vrstvou nebo změny napětí generované ne/přítomností nabitých protilátek.
Další možností měření je také způsob, kdy se vzorek nanese na elektrodový systém, kde je přítomna imobilizovaná částice (komplementární partner imunoreakce) a současně i redoxní látka v pevné formě. Tento elektrodový systém (při použití biamperometrie) nebo pracovní elektroda (při použití ostatních výše uvedených metod stanovení) se připraví tak, že se pracovní elektroda, případně elektrodový systém, obsahující imobilizované částice pro afinitní reakci s analytem, uvede do kontaktu s roztokem redoxní látky a stanoví se elektrochemický parametr (krok i)). Následně se pracovní elektroda / elektrodový systém ponechá na vzduchu zaschnout, čímž dojde k adsorpci redoxní látky na povrch pracovní elektrody / elektrodového systému. Přídavkem kapalného vzorku s analytem dojde současně k interakci analytu s modifikovaným povrchem (krok ii)) a k rozpuštění redoxní látky (krok iii)), v jejímž roztoku poté proběhne měření
-3CZ 307792 B6 elektrochemické veličiny. Jelikož dojde ke změně elektrochemického parametru povrchu pracovní elektrody / elektrodového systému navázáním analytu, dojde současně i ke změně signálu redoxní látky, z čehož lze v následujících krocích iv) a v) stanovit přítomnost a případně rovněž koncentraci analytu ve vzorku. Celá procedura stanovení je tak uskutečněna bez potřeby oplachu elektrody a výsledek je znám v minimálním čase po odběru vzorku. Aby byla dodržena podmínka stejné koncentrace redoxní látky v kroku (i) a kroku (iii), musí být objem vzorku, který se nakápne na elektrodový systém v kroku (ii), stejný jako objem roztoku redoxní látky v kroku (i), který byl po změření elektrochemického parametru ponechán zaschnout na elektrodovém systému. Například pokud bylo v kroku (i) nakápnuto na elektrodu / elektrodový systém 5 uf roztoku redoxní látky známé koncentrace, byla změřena elektrochemická veličina a kapka se následně vysušila (čímž došlo k adsorpci redoxní látky na povrch elektrody), musí se pro vlastní měření nakápnout na elektrodu rovněž 5 Ti kapalného vzorku. Tím vznikne stejná koncentrace redoxní látky v kapalném vzorku, potenciálně obsahujícím stanovovaný analyt.
Ve výhodném provedení je imobilizovanou částicí pro afmitní interakci s analytem na povrchu pracovní elektrody celobuněčný antigen bakterie kmene Borrelia sp. a analytem je protilátka proti bakteriím kmene Borrelia sp.
V jednom provedení je redoxní látkou záporně nabitý hexakyanoželeznatan draselný a hexakyanoželezitan draselný. Je možné použít i jiné typy redoxaktivních látek přednostně nesoucí kladný či záporný náboj. Mezi látky skladným nábojem patří např. hexaaminruthenium(II/III) chlorid, kobaltocen, ferrocen či aminoferocen, látky se záporným nábojem např. r/L či ferocenkarboxylová kyselina.
V jednom provedení měření elektrochemického parametru pro stanovení impedance na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku v kroku (iv) je měření elektrického proudu a/nebo elektrického napětí pomocí amperometrie, biamperometrie, potenciometrie a/nebo voltametrie, nej výhodnější je použití biamperometrie.
S výhodou měření elektrického proudu a/nebo elektrického napětí proběhne při hodnotách frekvence střídavého proudu/napětí v rozmezí od jednotek Hz do stovek kHz. Výhodné je omezit měření na jednu či dvě frekvence, čímž se výrazně zjednoduší, zrychlí a zlevní celé stanovení, což je vhodné zejména pro nízkonákladové detekce.
Ve výhodném provedení proběhne měření elektrochemického parametru v kroku (iv) biamperometrickou metodou za použití dvou stejných pracovních elektrod s imobilizovanými částicemi pro afmitní interakci s analytem. V případě použití biamperometrie jsou pracovní elektrody modifikovány stejně (stejný povrch o stejné velikosti je i stejně modifikovaný potenciál mezi těmito elektrodami je tudíž nulový), tudíž mají stejné elektrochemické vlastnosti a měření může probíhat při vloženém nulovém potenciálu, což zjednodušuje analýzu. Dalším faktorem zvýhodňujícím použité měřicí uspořádání je fakt, že bez použití biamperometrie, kdy je impedanční měření (vložení střídavého budicího signálu o amplitudě 5 až 10 mV) prováděno při nulovém offsetu stejnosměrné složky napětí, by nebylo možné měřit malé rozdíly ve změně rozložení náboje na rozhraní elektroda/roztok. Při měření v klasickém uspořádání s pracovní a referenční elektrodou je vložen buď potenciál vhodný pro měření redoxního mediátoru, čímž se systém vychýlí z rovnováhy vzhledem k potenciálovému rozdílu systému dvou elektrod vložených do roztoku (elektroda/roztok-roztok/elektroda), nebo v druhém případě, kdy systém není vychýlen vzhledem k rozdílu potenciálu elektroda/roztok-roztok/elektroda, je systém vychýlen vzhledem k redoxnímu potenciálu redoxního páru mediátoru. Tyto rozdíly v aplikovaném potenciálu offsetu při měření biamparometrií nenastávají.
Pracovní elektrodou pro detekci analytu v kapalném vzorku je s výhodou elektroda vybraná ze skupiny zahrnující kovovou a uhlíkovou elektrodu, s výhodou je elektroda vybraná ze skupiny obsahující měděnou, stříbrnou, platinovou, zlatou, nerezovou a kompozitní uhlíkovou elektrodu,
-4CZ 307792 B6 a na povrchu obsahuje imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, s výhodou jsou imobilizovanými částicemi antigen nebo protilátka. S výhodou lze pracovní elektrodu připravit sítotiskem nebo fotolitograficky dle obecně známých postupů (patent 291411 a La Belle, Gerlach, Svárovsky, Joshi, Analytical Chemistry 79 (2007) 6959). Imobilizované částice pro interakci s analytem jsou navázané, s výhodou kovalentně, na polymemí vrstvě nesoucí aktivovatelné funkční skupiny. Tato polymemí vrstva je adherovaná na povrchu pracovní elektrody. Polymemí vrstvou může být například poly-L-lysin, polyallylamin, polyethylenimin, chitosan, polyakrylová kyselina a jiné.
Ve výhodném provedení je pracovní elektrodou pro detekci analytu v kapalném vzorku kovová nebo uhlíková elektroda, která na svém povrchu obsahuje adsorbovaný poly-L-lysin a/nebo polyallylamin a/nebo polyethylenimin, ke kterému jsou kovalentně navázány částice pro afinitní interakci s analytem, s výhodou antigen nebo protilátka. Nejvýhodněji je pracovní elektroda zlatá nebo platinová, potažená vrstvou poly-L-lysinu o tloušťce 20 až 50 nm (Colville, Tompkins, Rutenberg, Jericho, Langmuir 2010 26 (4), 2639) s kovalentně navázaným celobuněčným antigenem bakterie kmene Borrelia sp.
Způsob přípravy pracovní elektrody pro detekci analytu v kapalném vzorku způsobem podle předkládaného vynálezu obsahuje následující kroky:
(i) kovová nebo uhlíková elektroda se inkubuje s kladně nabitým polymemím nosičem nesoucím volné/konjugovatelné aminoskupiny (tj. polymemí nosič se vyznačuje takovým zastoupení aminoskupin ve své struktuře, že má celkový náboj kladný při fyziologickém pH, což znamená, že hodnota pí takovéhoto nosiče je nad hodnotou pH 7,4), zejména s poly-L-lysinem a/nebo polyallylaminem a/nebo polyethyleniminem, s výhodou o molekulové hmotnosti od 30 do 70 kDa, po dobu alespoň 30 minut; následně se opláchne vodou či pufrem, případně se přebytek oplachovacího roztoku odfoukne v proudu stlačeného vzduchu.
(ii) výsledná elektroda potažená vrstvou kladně nabitého polymemího nosiče obsahujícího volné aminoskupiny, s výhodou potažená vrstvou poly-L-lysinu a/nebo polyallylaminu a/nebo polyethyleniminu, se inkubuje s roztokem nízkomolekulámí látky o molekulové hmotnosti do 1000 kDa, nesoucí alespoň dvě karboxylové skupiny, z nichž alespoň jedna je aktivovaná pro konjugaci s aminoskupinami polymemího nosiče, s výhodou j e touto nízkomolekulámí látkou kyselina citrónová s EDC/NHS aktivovanou alespoň jednou COOH skupinou, po dobu alespoň 15 minut za vzniku karboxylem modifikovaného povrchu ve formě monovrstvy, karboxylové skupiny pro vazbu k poly-L-lysinu a/nebo polyallylaminu a/nebo polyethyleniminu se aktivují pomocí karbodiimidu, s výhodou EDC (l-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) karbodiimid), za vzniku kovalentní vazby mezi karboxylovou skupinou nízkomolekulámí látky nesoucí alespoň dvě karboxylové skupiny a aminovou skupinou poly-L-lysinu a/nebo polyallylaminu a/nebo polyethyleniminu.
(iii) pro vazbu k částicím pro afinitní interakci se zbývající volné karboxylové skupiny na povrchu elektrody aktivují pomocí karbodiimidu, s výhodou EDC (l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimid), a N-hydroxysukcinimidu po dobu alespoň 20 minut za vzniku aktivních esterů na povrchu polymemí (s výhodou poly-L-lysinové) vrstvy;
(iv) částice pro afinitní interakci s analytem reagují s N-hydroxysukcinimidem aktivovanými karboxylovými skupinami na povrchu polymemího nosiče během alespoň 30 minut inkubace za vzniku kovalentní vazby mezi polymemím nosičem, kterým je potažen povrch elektrody, a částicí pro afinitní reakci s analytem.
S výhodou je kladně nabitým polymemím nosičem poly-L-lysin, nízkomolekulámí látkou nesoucí alespoň dvě karboxylové skupiny je kyselina citrónová a částicí pro afinitní reakci s analytem je celobuněčný antigen bakterie kmene Borrelia sp.
Elektrodu lze vyrobit s vynaložením jen nízkých nákladů použitím metody sítotisku (výroba sítotiskových elektrod) nebo fotolitografických metod (metoda tvorby desek plošných spojů). Litograficky generované tvary (nejčastěji měděné) pak mohou být modifikovány, např.
-5CZ 307792 B6 galvanickým pokovením, kdy jako materiály vylučované na litograficky generované měděné struktury jsou použity nejčastěji ušlechtilé kovy jako zlato, platina, stříbro, paladium či jejich kombinace (směs či různé pokrytí různých elektrod). Použity mohou být i elektrody vyrobené jiným způsobem (např. pastové uhlíkové). Díky nízkým nákladům je možné celou elektrodu použít pouze pro jediné měření, odpadá tak problém s infekčností vzorku.
Výstupní signál může být zobrazený na obrazovce připojeného počítače, integrovaného displeje nebo formou signalizace svitu světlo emitující diody při nastavené určité hraniční hodnotě signálu. Při nastavení hraniční hodnoty signálu mezi pozitivní a negativní hodnotou analytu ve vzorku lze signalizaci zjednodušit na pouhý svit LED - např. negativní signál - svítí zelená barva, pozitivní signál - svítí červená barva.
Řídicí jednotkou může být například mobilní telefon, který slouží jako napájecí zdroj a/nebo jako měřicí přístroj pro měření a zobrazování signálu impedance, popřípadě prostřednictvím vestavěného modulu fotoaparátu kvantitativně odečíst intenzitu svitu indikační světelné diody.
Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití způsobu stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku podle předkládaného vynálezu pro kvalitativní a/nebo kvantitativní a/nebo semikvantitativní detekci přítomnosti protilátky a/nebo antigenu a/nebo bakterií v kapalném vzorku.
Ve výhodném provedení je použití pro detekci přítomnosti protilátek proti bakteriím kmene Borrelia sp. v kapalném vzorku.
Předkládaný vynález umožňuje rychlé stanovení analytu v kapalném vzorku prostřednictvím afinitní interakce mezi specificky modifikovaným povrchem elektrody a detekovanou látkou, analytem. Principem je detekce imunoafinitní interakce, kdy vazba například protilátky na antigenem modifikovaný povrch způsobí pokles impedance v prostředí negativně nabité redoxní látky, přičemž míra poklesu impedance odpovídá množství navázaného analytu (např. protilátky) na povrch elektrody, resp. koncentraci protilátky ve vzorku. Podmínkou pro správnou funkci je kombinace opačně nabité redoxní značky a analytu vázajícího se na detekční povrch, např. záporně nabitá redoxní značky a pozitivně nabitý analyt (protein) za daného pH (např. za fyziologického pH 7,4 nebo nižšího pH).
Tento princip stanovení je odlišný od stavu techniky, kde při detekci imunoafinitních interakcí dochází k nárůstu impedance při navázání proteinu na povrch - vrstva proteinu způsobí snížení propustnosti modifikační vrstvy elektrody prostupujícím látkám, což má za následek zvýšení odporu přenosu hmoty a tím i nárůst odporu/impedance.
Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku podle předkládaného vynálezu je proveden metodou přímého stanovení (není použit měřicí přístup kompetice apod.) a měření je provedeno bez použití značky (ve smyslu značky jakožto signální molekuly konjugované s jedním partnerem z detekční afinitní interakce).
Objasnění výkresů
Obr. 1: Blokové schéma impedančního analyzátoru sestávající z počítače 1, USB převodníku 2, mikrokontroléru 3, zesilovače 4, senzoru 5, EU převodníku 6 a uživatelského rozhraní 7. Vztahová značka 8 označuje vlastní impedanční analyzátor.
Obr. 2: Stanovení analytu, anti-HSA protilátek (HSA, lidský sérová albumin), v prostředí 1 mg/ml balastního proteinu BSA (hovězí sérový albumin) ověřenou metodou. Znázornění hodnot reálné složky impedance měřené při frekvenci 2 Hz, amplituda 10 mV v prostředí 5 mM ferri/ferrokyanidu.
-6CZ 307792 B6
Obr. 3: Příklad změny reálné složky elektrochemické impedance pro negativní a pozitivní vzorek přítomnosti anti-Borelie protilátek v krevním séru. Zobrazena je reálná složka impedance pro celé proměřované frekvenční spektrum 6 stejných litograficky připravených elektrod - elektrody se stejnými výchozími vlastnostmi. Tři byly inkubovány s pozitivním a tři byly inkubovány s negativním vzorkem krevního séra.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Konstrukce elektrody, zapojení měřicího přístroje a stanovení koncentrace modelového analytu protilátky anti-HSA ve vzorku
Měření impedance je možné uskutečnit jakýmkoli měřicím přístrojem vhodným pro měření impedance. S výhodou lze použít miniaturizovaný impedanční analyzátor (blokové schéma na obr. 1).
Modifikace elektrod byla provedena kombinací poly-L-lysinu s následnou vazbou antigenu (lidský sérový albumin, HSA) skrze citrát aktivovaný EDC (karbodiimid). Takto modifikovaný povrch byl následně inkubován se vzorkem analytu (anti-HSA protilátky). Nakonec byla elektroda ponořena do roztoku redoxní látky (ferri/ferrokyanid) a byla změřena její elektrochemická impedance v tomto roztoku. Ze změn impedance byla stanovena koncentrace analytu (anti-HSA) ve vzorku. S klesající impedancí roste koncentrace protilátky ve vzorku (obr. 2).
Detailní popis metodiky:
- Elektrody byly pokryty vrstvou poly-L-lysinu po 30 min inkubaci v roztoku 50 g/ml polyL-lysin, 50 mM PBS pH 7,4 (30 až 70 kDa).
- Aktivace povrchu pomocí 50 mM kyseliny citrónové s 150 mM EDC/NHS v prostředí 500 mM MES pufru pH 5,6 po dobu 30 min. Aktivované molekuly s karboxylovými skupinami umožní následnou vazbu molekul proteinu.
- Bezprostředně po předchozím kroku inkubace 60 min s 1 mg/ml HSA/100 mM MES pH 5,6, třepáno 150 rpm. Tímto dojde k navázání proteinu na povrch elektrod.
- 30 až 45 min inkubace s protilátkou anti-HSA v prostředí 1 mg/ml BSA, 50 mM PBS pH 7,4, třepáno 150 rpm, 4 I 1
- Každý krok je následován oplachem destilovanou vodou a osušení v proudu stlačeného vzduchu.
- Měření impedance elektrod v prostředí 2,5 mM ferrikyanidu a 2,5 mM ferrokyanidu v 50 mM PBS pufru, pH 7,4.
Na obr. 2 je znázorněno stanovení třech koncentrací anti-HSA (0, 50, 200 I g/nil) v roztoku proteinu BSA (hovězí sérový albumin) o koncentraci 1 mg/ml, který představuje velké množství balastních specificky neinteragujících proteinů přítomných v reálných vzorcích, tzn. signál pozadí vzorku. Každá hodnota koncentrace byla stanovena ve čtyřech opakováních - každá hodnota představuje jeden separátní elektrodový systém modifikovaný a měřený dle popisu metodiky.
Příklad 2: Stanovení koncentrace protilátky anti-Borrelie ve vzorku
Stejným způsobem jako v Příkladu 1 bylo stanoveno množství (přítomnost) anti-Borelie protilátek ve vzorku krevního séra. V tomto případě se postupovalo stejně jako v Příkladu 1, jen místo proteinu HSA se navázal celobuněčný antigen Borrelie (koncentrace 0,1 mg/ml v 100 mM MES pufru o pH 5,6). Po modifikaci antigenem je elektroda inkubována se zředěným vzorkem séra, které potencionálně obsahuje anti-Borrelia protilátky. Ze změn impedance měřených v
-7 CZ 307792 B6 roztoku ferri/ferrokyanidu lze stanovit přítomnost těchto protilátek v séru (obr. 3). Dva vzorky lidských sér (jeden pozitivní, druhý negativní z pohledu přítomnosti anti-Borelie protilátek) byly měřeny šesti různými elektrodovými systémy připravenými dle popisu. Křivky v obr. 3 jsou záznamy měření impedance jednotlivých elektrod při různých frekvencích (rozpětí od 2 Hz do 100 000 Hz). Data jsou ve formě Nyquistova grafu. Pozitivní vzorek obsahuje 3,04 IP protilátek, což je množství protilátek vyjádřených v indexu pozitivity stanovené metodou ELIS A (index pozitivity je poměr optické denzity vzorku k optické denzitě hraniční kontroly). Negativní sérum neobsahuje žádné protilátky anti-Borelie.
Průmyslová využitelnost
Vynález je zejména vhodný k rychlému a levnému stanovení bakteriálních antigenů či odpovídajících protilátek v tělních tekutinách testovaných jedinců s podezřením na onemocnění, např. stanovení protilátek proti bakteriím kmene Borelia sp. v krevním séru. Vynález lze použít pro jakákoli serologická stanovení - stanovují se protilátky vytvářené proti patogenu, toxinu či jiné cizorodé látce.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (8)
1. Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku, vyznačený tím, že obsahuje následující kroky:
(i) stanoví se hodnota elektrochemického parametru, vybraného ze skupiny sestávající z odporu, impedance, napětí a proudu, roztoku redoxní látky, která má opačný náboj než stanovovaný analyt, přičemž analytem je protilátka nebo antigen;
(ii) povrch pracovní elektrody obsahující imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem, vybrané ze skupiny sestávající z protilátky a antigenů, přičemž pokud je imobilizovanou částicí protilátka, je analytem antigen a více versa, se inkubuje s kapalným vzorkem, přičemž v případě, že vzorek obsahuje stanovovaný analyt, se tento analyt naváže na imobilizované částice na povrchu elektrody za vzniku imobilizovaného komplexu analyt-imobilizovaná částice na povrchu elektrody;
(iii) pracovní elektroda s imobilizovaným komplexem analyt-imobilizovaná částice se uvede do kontaktu s roztokem redoxní látky, která má opačný náboj než stanovovaný analyt;
(iv) stanoví se hodnota elektrochemického parametru na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k doplňkové elektrodě přítomné v kapalném vzorku;
(v) z hodnoty stanoveného elektrochemického parametru se určí změna elektrochemického parametru vůči elektrochemickému parametru roztoku redoxní látky stanovenému v kroku i), přičemž platí, že přítomnost analytu ve vzorku vede k poklesu odporu, impedance a napětí, a k nárůstu proudu; ze změny elektrochemického parametru se kvalitativně a/nebo semikvantitativně a/nebo kvantitativně stanoví přítomnost analytu v kapalném vzorku.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se kroky ii) a iii) provedou současně ve vzorku nakápnutém na pracovní elektrodu, která obsahuje imobilizované částice pro interakci s analytem a současně rovněž adsorbovanou redoxní látku.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že imobilizovanou částicí pro afinitní interakci s analytem na povrchu pracovní elektrody je celobuněčný antigen bakterie kmene Borrelia sp. a analytem je protilátka proti bakteriím kmene Borrelia sp.
4. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačený tím, že redoxní látka je vybraná ze skupiny obsahující hexakyanoželeznatan draselný, hexakyanoželezitan draselný, hexaaminruthenium(IEIII) chlorid, kobaltocen, ferrocen, aminoferocen, I7L , ferocenkarboxylová kyselina.
-8CZ 307792 B6
5. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačený tím, že měření elektrochemického parametru pro stanovení impedance na rozhraní povrchu pracovní elektrody a roztoku redoxní látky ve vztahu k referenční elektrodě přítomné v kapalném vzorku v kroku (iv) je měření elektrického proudu a/nebo elektrického napětí pomocí amperometrie, biamperometrie, potenciometrie, a/nebo voltametrie, nejvýhodněji pomocí biamperometrie za použití dvou stejných pracovních elektrod s imobilizovanými částicemi pro afinitní interakci s analytem.
6. Způsob podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačený tím, že pracovní elektroda pro detekci analytu v kapalném vzorkuje vybraná ze skupiny zahrnující kovovou a uhlíkovou elektrodu, s výhodou je elektroda vybraná ze skupiny obsahující měděnou, stříbrnou, platinovou, zlatou, nerezovou a kompozitní uhlíkovou elektrodu, obsahující na povrchu imobilizované částice pro afinitní interakci s analytem.
7. Použití způsobu stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 6 pro kvalitativní a/nebo kvantitativní a/nebo semikvantitativní detekci přítomnosti protilátky a/nebo antigenu a/nebo bakterií v kapalném vzorku.
8. Použití podle nároku 7 pro detekci přítomnosti protilátek bakterií kmene Borrelia sp. v kapalném vzorku.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-483A CZ307792B6 (cs) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-483A CZ307792B6 (cs) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017483A3 CZ2017483A3 (cs) | 2019-03-06 |
| CZ307792B6 true CZ307792B6 (cs) | 2019-05-09 |
Family
ID=66344458
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-483A CZ307792B6 (cs) | 2017-08-23 | 2017-08-23 | Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307792B6 (cs) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0142301A2 (en) * | 1983-10-25 | 1985-05-22 | Serono Diagnostics Limited | Methods of assay |
| EP0668502A2 (en) * | 1994-02-22 | 1995-08-23 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Electrobiochemical method, system and electrodes for determination of a member of a recognition pair |
| US20010006825A1 (en) * | 1998-11-18 | 2001-07-05 | Fumihiko Hoshino | Method for detecting or assaying target substance by utilizing oxygen electrode |
| WO2009148406A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Agency For Science Technology And Research | Immunoassay |
| RO129261A2 (ro) * | 2011-07-04 | 2014-02-28 | Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Tehnologii Izotopice Şi Moleculare | Procedeu de realizare a unui electrod de cărbune sticlos modificat cu un ansamblu nanostructurat pe bază de nanoparticule de aur şi l-cisteină |
| US20160061834A1 (en) * | 2014-09-02 | 2016-03-03 | Gwangju Institute Of Science And Technology | Norovirus detection sensor and electrochemical sensing method using the same |
| WO2017063074A1 (en) * | 2015-10-14 | 2017-04-20 | University Health Network (Uhn) | Electrochemical assay for a protein analyte |
-
2017
- 2017-08-23 CZ CZ2017-483A patent/CZ307792B6/cs unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0142301A2 (en) * | 1983-10-25 | 1985-05-22 | Serono Diagnostics Limited | Methods of assay |
| EP0668502A2 (en) * | 1994-02-22 | 1995-08-23 | Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem | Electrobiochemical method, system and electrodes for determination of a member of a recognition pair |
| US20010006825A1 (en) * | 1998-11-18 | 2001-07-05 | Fumihiko Hoshino | Method for detecting or assaying target substance by utilizing oxygen electrode |
| WO2009148406A1 (en) * | 2008-06-06 | 2009-12-10 | Agency For Science Technology And Research | Immunoassay |
| RO129261A2 (ro) * | 2011-07-04 | 2014-02-28 | Institutul Naţional De Cercetare-Dezvoltare Pentru Tehnologii Izotopice Şi Moleculare | Procedeu de realizare a unui electrod de cărbune sticlos modificat cu un ansamblu nanostructurat pe bază de nanoparticule de aur şi l-cisteină |
| US20160061834A1 (en) * | 2014-09-02 | 2016-03-03 | Gwangju Institute Of Science And Technology | Norovirus detection sensor and electrochemical sensing method using the same |
| WO2017063074A1 (en) * | 2015-10-14 | 2017-04-20 | University Health Network (Uhn) | Electrochemical assay for a protein analyte |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2017483A3 (cs) | 2019-03-06 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Boonkaew et al. | Electrochemical paper-based analytical device for multiplexed, point-of-care detection of cardiovascular disease biomarkers | |
| Rahmati et al. | An electrochemical immunosensor using SARS-CoV-2 spike protein-nickel hydroxide nanoparticles bio-conjugate modified SPCE for ultrasensitive detection of SARS‐CoV‐2 antibodies | |
| Boonyasit et al. | A multiplexed three-dimensional paper-based electrochemical impedance device for simultaneous label-free affinity sensing of total and glycated haemoglobin: The potential of using a specific single-frequency value for analysis | |
| Li et al. | Disposable immunochips for the detection of Legionella pneumophila using electrochemical impedance spectroscopy | |
| Akkapinyo et al. | Development of a multiplex immunochromatographic strip test and ultrasensitive electrochemical immunosensor for hepatitis B virus screening | |
| WO2007116811A1 (ja) | 被検物質の測定方法 | |
| Gogola et al. | Label-free electrochemical immunosensor for quick detection of anti-hantavirus antibody | |
| Wang et al. | Electrochemical biosensor based on interdigitated electrodes for determination of thyroid stimulating hormone | |
| Li et al. | A renewable potentiometric immunosensor based on Fe3O4 nanoparticles immobilized anti‐IgG | |
| US20180011054A1 (en) | Metal ion detection method, test substance detection method | |
| US20210172944A1 (en) | Apparatus for analyzing and detecting interactions and reactions of molecules | |
| Liu et al. | A renewable electrochemical magnetic immunosensor based on gold nanoparticle labels | |
| JP6486065B2 (ja) | 被検物質の検出方法 | |
| Li et al. | Cross-talk-free multiplexed immunoassay using a disposable electrochemiluminescent immunosensor array coupled with a non-array detector | |
| WO1998037409A1 (en) | Method of electrochemical detection of immunoactive macromolecules | |
| Truong et al. | Development of label-free impedimetric Hcg-immunosensor using screen-printed electrode | |
| Wang et al. | Potentiometric sensing of glycoprotein: targeting alpha-fetoprotein detection | |
| US20230184753A1 (en) | Lifetime prediction/detection of biomarker sensor | |
| Saad et al. | A disposable, portable electrochemical immunosensor for rapid in situ detection of bovine tuberculosis | |
| Ni et al. | A one-step potentiometric immunoassay for plasma cardiac troponin I using an antibody-functionalized bis-MPA–COOH dendrimer as a competitor with improved sensitivity | |
| CN105158469A (zh) | 一种基于生物素化氨基化Fe3O4与链霉亲和素的免疫传感器的制备方法及应用 | |
| CZ307792B6 (cs) | Způsob stanovení přítomnosti analytu v kapalném vzorku a jeho použití | |
| EP4667924A1 (en) | Electrochemical analysis kit, electrochemical analysis system, and electrochemical analysis method | |
| JPH09184842A (ja) | 生理活性物質を固定化した導電性磁気ビーズ | |
| Tyas et al. | Reduced graphene oxide-gold/methylene blue composite on miniaturized electrochemical immunosensor for the label-free voltammetric determination of hepatitis B surface antigen |