CZ307834B6 - Způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů a zařízení pro provádění tohoto způsobu - Google Patents
Způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů a zařízení pro provádění tohoto způsobu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ307834B6 CZ307834B6 CZ2017-445A CZ2017445A CZ307834B6 CZ 307834 B6 CZ307834 B6 CZ 307834B6 CZ 2017445 A CZ2017445 A CZ 2017445A CZ 307834 B6 CZ307834 B6 CZ 307834B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- radiator body
- secondary packaging
- cooled
- sealing
- temperature
- Prior art date
Links
- 239000012520 frozen sample Substances 0.000 title claims abstract description 31
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 30
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims abstract description 10
- 238000009517 secondary packaging Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000007774 longterm Effects 0.000 claims abstract description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 13
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 claims description 6
- 239000002826 coolant Substances 0.000 claims description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 claims description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 claims description 2
- 229910001092 metal group alloy Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000012815 thermoplastic material Substances 0.000 claims description 2
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 claims 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 29
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 5
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 5
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- 229920001169 thermoplastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004416 thermosoftening plastic Substances 0.000 description 2
- 238000004017 vitrification Methods 0.000 description 2
- DKWHHTWSTXZKDW-UHFFFAOYSA-N 1-[2-[2-[2-(2-butoxyethoxy)ethoxymethoxy]ethoxy]ethoxy]butane Chemical compound CCCCOCCOCCOCOCCOCCOCCCC DKWHHTWSTXZKDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 235000011089 carbon dioxide Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000012864 cross contamination Methods 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 230000003670 easy-to-clean Effects 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000006261 foam material Substances 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 239000005060 rubber Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/14—Mechanical aspects of preservation; Apparatus or containers therefor
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/14—Mechanical aspects of preservation; Apparatus or containers therefor
- A01N1/142—Apparatus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
- A01N1/00—Preservation of bodies of humans or animals, or parts thereof
- A01N1/10—Preservation of living parts
- A01N1/14—Mechanical aspects of preservation; Apparatus or containers therefor
- A01N1/146—Non-refrigerated containers specially adapted for transporting or storing living parts whilst preserving
- A01N1/147—Carriers for immersion in cryogenic fluid for slow freezing or vitrification
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Dentistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Při způsobu úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů pro dlouhodobé uchování, se zmrazený vzorek (8) v primárním obalu vloží do sekundárního obalu (6), který se nejméně polovinou své vnější plochy uvede do styku s chlazenou plochou (3) tělesa chladiče (2) mající teplotu nižší než je teplota okolí, provede se utěsnění sekundárního obalu (6), a zmrazený vzorek (8) v utěsněném sekundárním obalu (6) se odebere ze styku s chladičem (2). Zařízení na utěsňování sekundárního obalu (6) zahrnuje chladič (2), v jehož tělese je vytvořena alespoň jedna chlazená plocha (3), uzpůsobená pro uvedení do styku a přidržování alespoň jednoho sekundárního obalu (6) obsahujícího zmrazený vzorek (8) v primárním obalu, a dále zahrnuje přípravek (5) pro vytváření spoje (7) k utěsnění sekundárního obalu (6).
Description
Oblast techniky
Vynález se týká způsobu úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů pro dlouhodobé uchování, při kterém se biologický materiál uložený v primárním obalu zmrazuje a poté se opatřuje sekundárním obalem. Dále se vynález týká zařízení na utěsňování sekundárního obalu pro dlouhodobé uchování zmrazených vzorků biologických materiálů.
Dosavadní stav techniky
Vzorky biologické povahy (buňky, tkáně, orgány, protilátky apod.) jsou pro dlouhodobé skladování kontrolované mrazeny na teplotu přibližně -60 až -80 °C a dlouhodobě uchovávány hluboce zmrazené, nejčastěji v tekutém dusíku či jeho parách, kde je teplota okolo -196 °C a pohyb molekul výrazně zpomalen.
Pro zamezení křížové kontaminace či bakteriální kontaminace vzorků se ve farmaceutickém průmyslu používají sekundární obaly kryozkumavek a jiných primárních obalů.
Například mesenchymální kmenové buňky (MSC) jsou často mrazeny spolu s objemově 7,5% dimethylsulfoxidem (DMSO). DMSO v mrazicím médiu chrání buňky před tvorbou nebezpečných krystalů a zvyšuje tak viabilitu buněk obsažených ve vzorku po rozmražení. Zároveň je DMSO v kapalném stavu pro buňky toxické. Jak uvádí Xin Wang a kolektiv (Cryobiology, 2007), viabilita buněk při běžné teplotě okolí v roztoku obsahujícím DMSO klesá. Proto je nutné tuto fázi eliminovat na co možná nejkratší dobu. Je tedy výhodné aplikovat sekundární obal na kryozkumavky až v momentě, kdy je DMSO v pevném skupenství, tedy na vzorek zmrazený. Pro mrazení biologických vzorků může být alternativně použito také dalších médií s obsahem kryoprezervačních molekul jiných než DMSO, nicméně velmi často také cytotoxických při běžné teplotě okolí.
Optimalizované a kontrolované mrazení buněk zajišťují různá zařízení. Jsou to například: CoolCell® (Biocision), IceCube (SYLAB), Mr. Frosty™ (Thermo Fisher Scientific). Tato zařízení nejsou kompatibilní s žádným běžně používaným sekundárním obalem kryozkumavek.
Proto je nutné aplikovat sekundární obal na kryozkumavku až po zamrazení vzorku na požadovanou teplotu. Nicméně jakákoliv manipulace s kryozkumavkou mimo mrazicí box výrazně zvyšuje teplotu vzorku, což přímo ovlivňuje jeho finální kvalitu. Výkyvy teplot akcelerují tvorbu nežádoucích krystalů a snižují viabilitu a kvalitu následně rozmražených buněk.
Způsob balení vzorků do termoplastického obalu popisuje patentová přihláška (US 4501108) z roku 1985. Obdobně také přístroj popsaný v patentu US 2006/137824 popisuje krytí kryozkumavek termoplastickým filmem. Po zahřátí obalu dojde k jeho smrštění a zatažení.
V patentové přihlášce US 2008220507 je popsán proces vitrifikace a aplikace přidružených obalů vzorku ve formě plastických stébel.
Také patentová přihláška US 2011196358 popisuje proces vitrifikace oocytů, spermií a embryí v křemíkové mikrokapiláře obalené ochranným sekundárním obalem. Sekundární obal chrání vzorky před kontaminaci z tekutého dusíku. Samotná vitrifikace probíhá přímo v sekundárním obalu a jeho zatavení probíhá po evaporaci tekutého dusíku. Nicméně v tomto případě hrozí riziko kontaminace právě v kroku mrazení vzorku.
- 1 CZ 307834 B6
Tato řešení, ač efektivní, vyžadují relativně složité technologické zázemí a specificky kvalifikovaný personál s ohledem na rizika spojená s manipulací v přímém kontaktu s tekutým dusíkem. Popsaná řešení nezohledňují možné výkyvy teplot v průběhu aplikace sekundárního obalu.
Podstata vynálezu
Výše uvedené nedostatky odstraňuje nový způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů, při kterém se biologický materiál uložený v primárním obalu zmrazuje a poté se opatřuje sekundárním obalem před uložením do nízkých teplot. Tento nový způsob udržuje vzorky v požadované teplotě a umožňuje aplikaci sekundárního obalu na již zmrazené vzorky v kryozkumavkách nebo v jiných primárních obalech. Vynález zamezuje nežádoucím fluktuacím teploty při aplikaci sekundárního obalu.
Způsob úpravy zmrazených vzorků podle vynálezu se provádí přímo v chladicí části zařízení na utěsňování sekundárního obalu podle vynálezu. Chladicí část zahrnuje chladič, který má alespoň jednu chlazenou plochu. Zmrazený vzorek v primárním obalu se vloží do sekundárního obalu, který se nejméně polovinou své vnější plochy (což odpovídá polovině délky v případě, že sekundární obal je trubice válcovitého tvaru) uvede do styku s chlazenou plochou tělesa chladiče mající teplotu nižší, než je teplota okolí, s výhodou -60 až -80 °C, provede se utěsnění sekundárního obalu a zmrazený vzorek v utěsněném sekundárním obalu se odebere ze styku s chladičem.
Sekundární obal, zachycený na obrázcích 2 a 3 jako průhledná část, může být z termoplastického materiálu, například polyethylenová trubice. Utěsnění sekundárního obalu se provádí vytvořením spojů, například zatavením jednoho nebo obou konců sekundárního obalu v místě, kde není ve styku s chlazenou plochou chladiče. Ve výhodném provedení zařízení podle vynálezu obsahuje tavící lišty pro vytvoření spoje sekundárního obalu zatavením.
Ve výhodném provedení vynálezu je chladicí část tvořena chladičem, který má pasivně chlazené těleso vytvořené z materiálu schopného vychlazení na teplotu -60 až -80 °C, s tepelnou kapacitou dostatečnou pro uchování chladu alespoň po dobu nezbytnou k vytvoření spoje sekundárního obalu. Před vložením zmrazených vzorků se chladič uloží do mrazáku na nejméně 2 hodiny při teplotě -60 až -80 °C.
V jiných provedeních vynálezu má chladič pasivně chlazené těleso vytvořené z materiálu schopného vychlazení na teplotu nižší než -30 °C. Vychlazení pasivně chlazeného tělesa chladiče může být provedeno jiným než výše uvedeným postupem, v jiných časových a teplotních rozmezích, například za použití suchého ledu nebo tekutého dusíku a jeho par.
Chladič může být monolitický chladicí blok opatřený otvory, které vytvářejí chlazenou plochu pro styk s vkládanými vzorky, nebo ve výhodném provedení může chladič obsahovat alespoň dva oddělitelné díly pro snadnější vkládání vzorků. Spojení dílů může být zajištěno například panty, drážkami či hroty. Chladicí plocha chladiče pro styk se zmrazenými vzorky je s výhodou komplementární tvaru a velikosti použitého primárního obalu, například kryozkumavek. Výhodné provedení zařízení podle vynálezu zahrnuje množství otvorů pro vkládání vzorků, což umožňuje utěsňovat sekundární obaly většího počtu zmrazených vzorků současně, přičemž mezi chladičem a primárním obalem vzorku (například kryozkumavkou) je jen minimální prostor, což umožňuje udržet požadovanou teplotu vzorku po nezbytně dlouhou dobu.
Pro výrobu tělesa chladiče je možné použít různé slitiny kovů, keramiku, gelovou náplň a jiné materiály s vysokou tepelnou kapacitou. Vnější povrch chladiče může být chráněn například plastem, gumou či pěnovým materiálem pro lepší a bezpečnější manipulaci.
-2CZ 307834 B6
V dalších provedeních vynálezu je chladicí část tvořena aktivně chlazeným chladičem. Aktivní chlazení zajišťuje například mrazicí jednotka cirkulací chladicího média skrze kanálky uvnitř tělesa chladiče, přičemž tato jednotka může být součástí provedení.
Ve zvláště výhodných provedeních zařízení podle vynálezu obsahuje kromě komponent uvedených ve výše popsaných provedeních také další komponenty, jako například teplotní čidlo, časovač či zapisovací jednotku průběhu teploty. Zařízení podle vynálezu může zahrnovat i další komponenty, které nemění princip popisovaného způsobu řešení technického problému. Jedná se například o komponentu pro hlasové ovládání apod.
Zařízení podle vynálezu se s výhodou skládá z komponent, které je možné umístit do čistých prostor farmaceutické výroby léčivých přípravků. Všechny jeho části jsou jednoduše sanitovatelné. Cistitelnosti, dezinfikovatelnosti, zamezení zachycování nečistot a průniku nežádoucích částic se dosahuje použitím vhodných materiálů, povrchových úprav, postupů výroby a stanovením režimů zacházení s jednotlivými částmi zařízení podle vynálezu.
Způsob a zařízení podle vynálezu je možné využít nejen pro vzorky biologické povahy, ale pro jakýkoli termolabilní materiál, který je třeba upravovat, například opatřovat obalem, při zajištění minimální fluktuace teploty.
Objasnění výkresů
Na připojených vyobrazeních jsou nákresy zařízení podle vynálezu a výsledky testování vynálezu.
Obrázky ilustrují:
obr. 1 schematické znázornění výhodného provedení zařízení podle vynálezu, obr. 2 schematické znázornění chladiče vč. vzorků a sekundárního obalu, obr. 3 schematické znázornění chladiče v podélném řezu vč. vzorků a sekundárního obalu, obr. 4 diagram průběhu teplot vzorků při utěsňování sekundárního obalu za použití vynálezu a bez jeho použití.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Kultivace a mrazení MSCs z kostní dřeně (BM-MSCs)
Kultivace buněk byla prováděna při teplotě 37 ± 0,5 °C. V průběhu kultivace buněk byla prováděna průběžná výměna kompletního kultivačního média s případným oplachem buněk pomocí 10 ml pufiru PBS na jednu láhev o kultivační ploše 75 cm2. Dle množství rostoucích buněk bylo prováděno jejich pasážování, tedy řízené enzymatické odloučení adherujících buněk a jejich přenesení na větší kultivační plochu. Optimální pro růst kultury bylo dosažení 80 až 90 % pokrytí buněk kultivačního dna. Pro pasážování byl použit roztok enzymu TrypLE Select CTS.
Po trypsinizaci byla suspenze buněk promíchána jemným nasátím a vysátím z pipety a promyta pufirem PBS a centrifůgována (230 g, 5 minut). Konečná peleta buněk byla resuspendována v pufiru PBS a smíchána v poměru 1:1 s vychlazeným roztokem obsahujícím 10 % objemových lidského sérového albuminu, 15 % objemových DMSO a fyziologický roztok. Takto připravená směs byla řízené zamrazená v kryozkumavkách Nunc™ (Thermo Fisher Scientific) o objemu 1,5 ml pomocí zařízení CoolCell® (Biocision) dle protokolu výrobce. Obsah mrazených
-3 CZ 307834 B6 kmenových buněk byl zpravidla 5 x 105 až 1 x 107 MSCs/ml. Při postupu mrazení buněk byla přidána do každého zmrazeného vzorku 8 v primárním obalu, do kryozkumavky, teplotní sonda (termočlánek typu K) . Teplota vzorků byla paralelně monitorována pomocí dataloggeru TM947SD (Lutron). Vzorky 8 byly zamrazeny na teplotu -63 °C. Následně byly z mrazáku přeneseny a opatřeny sekundárním obalem 6 Cryoflex™ (Thermo Fisher Scientific) při běžné teplotě okolí (průběh 21 teploty vzorků při utěsňování sekundárního obalu bez použití vynálezu). Druhá skupina vzorků byla opatřena sekundárním obalem 6 za použití pasivně chlazeného kovového chladiče 2 dle vynálezu (průběh 22 teploty vzorků při utěsňování sekundárního obalu za použití vynálezu).
Výsledek šesti nezávislých měření pomocí šesti sond je zachycen na obrázku 4. Tento diagram zahrnuje tři černé křivky (průběh 22 teploty vzorků) zobrazující průměrné hodnoty teplot uvnitř vzorků 8 při aplikaci sekundárního obalu 6 za použití vynálezu. Šedé křivky (průběh 21 teploty vzorků) zobrazují průměrné hodnoty teplot uvnitř vzorků 8 při aplikaci sekundárního obalu 6 bez použití vynálezu.
Pro utěsňování sekundárního obalu 6 pro uchování zmrazených vzorků 8 biologických materiálů při provádění vynalezeného způsobu bylo vyvinuto zařízení, které zahrnuje chladič 2, v jehož tělese je vytvořena alespoň jedna chlazená plocha 3, uzpůsobená pro uvedení do styku a přidržování alespoň jednoho sekundárního obalu 6 obsahujícího zmrazený vzorek 3 v primárním obalu, a dále zahrnuje přípravek 5 pro vytváření spoje 7 k utěsnění sekundárního obalu 6.
Dvoudílný chladič 2, který byl použit v tomto příkladu provedení vynálezu, měl celkové rozměry 250 x 60 x 50 mm (d x v x š) a byl vysoustružený z ploché ocelové tyče tažené za studená (EN 10278, úchylka hll, rozměr 50x30; Ferona). Velikost vysoustružených otvorů, chlazených ploch 3 pro uložení zmrazených vzorků 8 v primárních obalech, v kryozkumavkách, chráněných sekundárním obalem 6, byla 15 mm.
Dvoudílný chladič 2 podle příkladu provedení má čtyři chlazené plochy 3. Utěsnění sekundárního obalu 6 se provádí zatavením obou konců sekundárního obalu 6 v místě, kde není ve styku s chlazenou plochou 3, to znamená v místech kde jsou po zatavení vytvořeny spoje 7 k utěsnění sekundárního obalu 6, jak je nejlépe vidět na obr. 3.
Použití chladiče 2 dle vynálezu při aplikaci sekundárního obalu 6 zamezilo prudkému nárůstu teploty uvnitř vzorku 8. Naopak u vzorků, kde vynálezu použito nebylo, došlo ke skokovému nárůstu teploty. Po opatření vzorků 8 sekundárním obalem 6 byly všechny zmrazené vzorky 8 uloženy do -196 °C (viz obrázek 4).
Příklad 2: Porovnání kvality mrazených buněk
Buňky byly připraveny dle příkladu 1 a mrazeny na teplotu -63 °C. Celkem bylo připraveno osm vzorků. Paralelně byly zamrazeny dva sety po čtyřech zmrazených vzorcích 8 v primárních obalech, ve zkumavkách. Jeden set vzorků byl z mrazáku přenesen a jednotlivé vzorky 8 opatřeny sekundárním obalem 6 při běžné teplotě okolí (set A). Druhý set (set B) vzorků 8 byl opatřen sekundárním obalem 6 za použití pasivně chlazeného kovového chladiče 2 dle vynálezu. Právě opatření sekundárním obalem 6 za použití chladiče 2 dle vynálezu zamezilo prudkému nárůstu teploty uvnitř vzorku 8 (viz příklad 1). Po opatření vzorků 8 sekundárním obalem 6 byly všechny vzorky 8 uloženy do Dewarovy nádoby s tekutým dusíkem o teplotě -196 °C. Po nejméně 48 hodinovém uskladnění vzorků při konstantní teplotě -196 °C byly vzorky 8 rozmraženy ve vodní lázni o teplotě 37 °C. Suspenze buněk byla dále analyzována pomocí průtokové cytometrie a také následnou kultivací buněk.
100 μΐ suspenze buněk bylo smícháno s 5 μΐ propidium jodidu a kultivováno chráněné před světlem po dobu 10 minut. Následně byla směs analyzována pomocí průtokového cytometru FACSCanto II (Beckton Dickinson). Procento buněk, které jsou negativní při barvení propidium
-4CZ 307834 B6 jodidem, je vyjádřeno v tabulce č. 1. Viabilita stanovená barvením propidium jodidem odráží životaschopnost jednotlivých buněk v suspenzi. Propidium jodid je látka, která neprostupuje membránou živých buněk. U poškozených a neživotaschopných buněk se propidium jodid váže na DNA a buňky jsou vyhodnoceny jako pozitivní.
Tabulka č. 1, životaschopnost rozmražených buněk
| í Sžt A i | % živých (propidium jodid negativních) buněk |
| ! | 74,S |
| 76,7 | |
| ......... | 77,S |
| IV. | 78,4 |
| průmě-r | 76,9 |
| směrsdetná odchylka | 1,5 i |
I % živých (propidium jcdid negativních) buněk
| ř í, | 87,1 |
| Ěi. | 86,3 |
| í-1. | 85,3 |
| V 8S/1 | |
| průměr | SS,Ů |
| směrodatná odchylka | 0,8 í |
Z uvedených výsledků vyplývá, že životaschopnost rozmražených buněk obsažených ve vzorcích 8, které byly opatřeny sekundárním obalem 6 za použití vynálezu, je průměrně o 9, 1 % vyšší než při úpravě vzorků 8 bez použití vynálezu (76,9 % vs. 86,0 %).
Výsledky z následné kultivace buněk po rozmražení všech vzorků 8 jsou shrnuty v tabulce č. 2.
Tabulka č. 2, adherované buňky po rozmražení i počet adherovaných buněk
| L i 143000 | |
| li. ! | 143500 |
| lil. j 109500 | |
| iV. 1 | 127500 |
| průměr ; | 130S75 |
| směrodatná ΐ odchylka 1 | 13917 |
| | Set B i 1 i | počet adherovaných b | uněfc i |
| L L. L | 171000 | i i |
| í ·!. í | 144000 | |
| í ili· i | 146000 | í 1 |
| i iV. | 153000 | |
| i průměr | 3.53500 | i |
| i směrodatná i odchylka ; | 10642 | I t I t |
Adherence na kultivační plastik je základní vitální vlastností použitých mesenchymálních kmenových buněk. Po rozmražení byla část suspenze testovaných buněk nasazena na kultivační lahve o ploše 25 cm2. Po 24 hodinové kultivaci byla buněčná kultura enzymaticky odloučena a suspenze buněk analyzována automatickou počítačkou buněk Luna II™ (Logos Biosystems). Výsledné počty shrnuté v tabulce č. 2 ukazují převahu množství adherentních buněk zamrazených postupem využívajícím vynález (průměrně o 22625 více adherovaných buněk). Tato metoda se shoduje s trendem měření uvedeným v tabulce č. 1.
Z uvedených výsledků vyplývá, že kvalita vzorků 8 (viabilita a schopnost adherence následně rozmražených buněk) je přímo ovlivněna způsobem úpravy zmrazených vzorků 8. Popisovaný vynález zvýšil kvalitu vzorků 8 o přibližně 15 %.
Průmyslová využitelnost
Způsob úpravy zmrazených vzorků podle vynálezu a popsané zařízení na provádění tohoto způsobu mohou být využity zejména tam, kde je vyžadována trvale nízká teplota zmrazených vzorků a kde, byť jen krátká manipulace se vzorky například při běžné teplotě okolí, nebo při vyšších teplotách spojených s úpravou vzorků, může způsobit významné zhoršení jeho kvality, například snížení následné viability buněk po rozmražení.
Předložený vynález není omezen na zde popsaná konkrétní provedení, ale může být využit i k jiným účelům, v jiných odvětvích průmyslu.
Způsob a zařízení podle vynálezu poskytují levné, jednoduché, pro personál bezpečné a účinné řešení výše popsaného technického problému.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (18)
1. Způsob úpravy zmrazených vzorků (8) biologických materiálů pro dlouhodobé uchování, při kterém se biologický materiál uložený v primárním obalu zmrazuje a zmrazený vzorek (8) v primárním obalu se poté opatřuje sekundárním obalem (6), vyznačující se tím, že zmrazený vzorek (8) v primárním obalu se vloží do sekundárního obalu (6), který se nejméně polovinou své vnější plochy uvede do styku s chlazenou plochou (3) tělesa chladiče (2) mající teplotu nižší než je teplota okolí, provede se utěsnění sekundárního obalu (6), a zmrazený vzorek (8) v utěsněném sekundárním obalu (6) se odebere ze styku s chladičem (2).
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že sekundární obal (6) je z termoplastického materiálu.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že utěsnění sekundárního obalu (6) se provádí zatavením.
4. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že sekundární obal (6) má tvar trubice, přičemž při uvedení do styku s chlazenou plochou (3) se nejméně polovinou své délky uvede do styku s komplementárně vytvořenou chlazenou plochou (3).
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že utěsnění sekundárního obalu (6) se provádí zatavením jednoho nebo obou konců sekundárního obalu (6) v místě nacházejícím se mimo styk s chlazenou plochou (3).
6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) se ochlazuje na teplotu nižší, než je teplota okolí, pasivně, umístěním do prostředí nízké teploty po dobu dostatečnou k vychlazení tělesa chladiče (2).
7. Způsob podle některého z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) se ochlazuje na teplotu nižší, než je teplota okolí, aktivně, cirkulací chladicího média skrze kanálky uvnitř tělesa chladiče (2).
8. Způsob podle některého z nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že předtím, než se sekundární obal (6) uvede do styku s chlazenou plochou (3), se těleso chladiče (2) ochlazuje na teplotu nižší než -30 °C, s výhodou na teplotu -60 až -80 °C.
-6CZ 307834 B6
9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že při utěsňování sekundárního obalu (6) je zmrazený vzorek (8) se sekundárním obalem (6) přidržován pouze chlazenou plochou (3) a po utěsnění sekundárního obalu (6) se od chlazené plochy (3) uvolní.
10. Zařízení pro provádění způsobu podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje chladič (2), v jehož tělese je vytvořena alespoň jedna chlazená plocha (3), uzpůsobená pro uvedení do styku s nejméně polovinou vnější plochy alespoň jednoho sekundárního obalu (6) obsahujícího zmrazený vzorek (8) v primárním obalu a pro přidržování tohoto sekundárního obalu (6), a dále zahrnuje přípravek (5) pro vytváření spoje (7) k utěsnění sekundárního obalu (6).
11. Zařízení podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvnitř tělesa chladiče (2) jsou kanálky pro cirkulaci chladicího média, přičemž zařízení dále zahrnuje mrazicí jednotku uspořádanou pro chlazení cirkulujícího chladicího média.
12. Zařízení podle nároku 10, vyznačující se tím, že chladič (2) má pasivně chlazené těleso vytvořené z materiálu schopného vychlazení na teplotu nižší než -30 °C, s výhodou na teplotu 60 až -80 °C, s tepelnou kapacitou dostatečnou pro uchování chladu alespoň po dobu nezbytnou k vytvoření spoje (7) k utěsnění sekundárního obalu (6).
13. Zařízení podle některého z nároků 10 až 12, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) zahrnuje jeden monolitický blok opatřený uvedenou alespoň jednou chlazenou plochou (3), nebo zahrnuje alespoň dva oddělitelné díly (4), mezi nimiž je uvedená alespoň jedna chlazená plocha (3) uzavřena.
14. Zařízení podle nároku 13, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) zahrnuje dva oddělitelné díly (4), které jsou otočně nebo tvarově oddělitelně spojeny.
15. Zařízení podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) zahrnuje dva oddělitelné díly (4), mezi nimiž je uzavřena více než jedna chlazená plocha (3) komplementárně uzpůsobená pro více než jeden sekundární obal (6) tvaru trubice obsahující zmrazený vzorek (8) v kryozkumavce válcovitého tvaru.
16. Zařízení podle nároku 13 nebo 14, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) zahrnuje dva oddělitelné díly (4), mezi nimiž je uzavřena více než jedna chlazená plocha (3) komplementárně uzpůsobená pro více než jeden sekundární obal (6) tvaru trubice obsahující zmrazený vzorek (8) v kryozkumavce kónického tvaru.
17. Zařízení podle některého z nároků 10 až 16, vyznačující se tím, že těleso chladiče (2) je vyrobeno z kovu nebo kovové slitiny, přičemž vnější povrch tělesa chladiče (2) je s výhodou potažen ochranným povlakem, s výhodou plastem.
18. Zařízení podle některého z nároků 10 až 17, vyznačující se tím, že přípravek (5) pro vytváření spoje (7) k utěsnění sekundárního obalu (6) je tavící lišta pro vytváření spojů zatavením.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-445A CZ307834B6 (cs) | 2017-08-02 | 2017-08-02 | Způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů a zařízení pro provádění tohoto způsobu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-445A CZ307834B6 (cs) | 2017-08-02 | 2017-08-02 | Způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů a zařízení pro provádění tohoto způsobu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017445A3 CZ2017445A3 (cs) | 2019-02-13 |
| CZ307834B6 true CZ307834B6 (cs) | 2019-06-12 |
Family
ID=66700732
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-445A CZ307834B6 (cs) | 2017-08-02 | 2017-08-02 | Způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů a zařízení pro provádění tohoto způsobu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ307834B6 (cs) |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0181235A2 (en) * | 1984-11-09 | 1986-05-14 | Cryologic Pty. Ltd. | Cryosystem for biological material |
| DE102004027792A1 (de) * | 2004-06-08 | 2006-01-05 | Basf Ag | Vorrichtung und Verfahren zur beschleunigten Durchführung von Korrosionstests |
| EP1774852A2 (de) * | 2005-09-30 | 2007-04-18 | Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research | Zahn-Einfrier-Behälter |
| EP2156735A1 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-24 | Dr. H. Zech GmbH | Method and instrument for vitrification and storing of biological specimen |
| US20110196358A1 (en) * | 2010-02-09 | 2011-08-11 | Enrique Criado Scholz | Closed ultra-rapid cell vitrification device and sealing procedure of the device |
| KR101254950B1 (ko) * | 2010-09-29 | 2013-04-16 | 경상북도 (관련부서:경상북도축산기술연구소장) | 수정란 동결 보관 스트로우용 플러그 |
| WO2014001819A1 (en) * | 2012-06-29 | 2014-01-03 | Cryogatt Systems Limited | Rfid tag for cryogenic straws |
-
2017
- 2017-08-02 CZ CZ2017-445A patent/CZ307834B6/cs unknown
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0181235A2 (en) * | 1984-11-09 | 1986-05-14 | Cryologic Pty. Ltd. | Cryosystem for biological material |
| DE102004027792A1 (de) * | 2004-06-08 | 2006-01-05 | Basf Ag | Vorrichtung und Verfahren zur beschleunigten Durchführung von Korrosionstests |
| EP1774852A2 (de) * | 2005-09-30 | 2007-04-18 | Stiftung Caesar Center of Advanced European Studies and Research | Zahn-Einfrier-Behälter |
| EP2156735A1 (en) * | 2008-08-13 | 2010-02-24 | Dr. H. Zech GmbH | Method and instrument for vitrification and storing of biological specimen |
| US20110196358A1 (en) * | 2010-02-09 | 2011-08-11 | Enrique Criado Scholz | Closed ultra-rapid cell vitrification device and sealing procedure of the device |
| KR101254950B1 (ko) * | 2010-09-29 | 2013-04-16 | 경상북도 (관련부서:경상북도축산기술연구소장) | 수정란 동결 보관 스트로우용 플러그 |
| WO2014001819A1 (en) * | 2012-06-29 | 2014-01-03 | Cryogatt Systems Limited | Rfid tag for cryogenic straws |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| L.L. KULESHOVA: "A strategy for rapid cooling of mouse embryos within a double straw to eliminate the risk of contamination during storage in liquid nitrogen", HUMAN REPRODUCTION, PUBLISHED FOR THE EUROPEAN SOCIETY OF HUMAN REPRODUCTION AND EMBRYOLOGY BY IRL PRESS, vol. 15, no. 12, 1 December 2000 (2000-12-01), pages 2604 - 2609, XP055008217, ISSN: 02681161, DOI: 10.1093/humrep/15.12.2604 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2017445A3 (cs) | 2019-02-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hunt | Technical considerations in the freezing, low-temperature storage and thawing of stem cells for cellular therapies | |
| Baust et al. | Best practices for cryopreserving, thawing, recovering, and assessing cells | |
| RU2416197C1 (ru) | Способ криоконсервирования гемопоэтических стволовых клеток пуповинной крови | |
| Bai et al. | Cryopreservation in the era of cell therapy: revisiting fundamental concepts to enable future technologies | |
| AU2007203958A1 (en) | Cryoprotective compositions and methods of using same | |
| US10834917B2 (en) | Methods for cryopreservation of biological materials | |
| US20150313211A1 (en) | A Method of Vitrification | |
| CA2893102C (en) | Method of freezing making use of a mineral nucleator | |
| Fuller et al. | Applications and optimization of cryopreservation technologies to cellular therapeutics | |
| Gandhi et al. | Appendix A: Cryotech® vitrification thawing | |
| Haack-Sørensen et al. | Cryopreservation and revival of mesenchymal stromal cells | |
| CZ307834B6 (cs) | Způsob úpravy zmrazených vzorků biologických materiálů a zařízení pro provádění tohoto způsobu | |
| US20150024487A1 (en) | Cryopreservation storage device for cell collection bag, and using method thereof | |
| Rey | Studies on the action of liquid nitrogen on cultures in vitro of fibroblasts | |
| Buriak et al. | Preservation and storage of cells for therapy: fundamental aspects of low temperature science | |
| Hori et al. | A simple and static preservation system for shipping retinal pigment epithelium cell sheets | |
| CA2809571A1 (en) | Method for cryopreservation of human spermatozoa free from seminal plasma using a fast and simple aseptic vitrification-devitrification process; portable kit for carrying out the method; and use of the same for treatment of disorders related to reproductive failures | |
| RU2123044C1 (ru) | Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных. | |
| JP2002204690A (ja) | 細胞付細胞培養器，その製造方法及びその使用方法 | |
| US20220408718A1 (en) | Aqueous solution for cell preservation | |
| Desai et al. | 16 Semen Samples and Individual Sperm | |
| Reinhoud et al. | Vitrification of plant cell suspensions | |
| Agarwal et al. | Resuscitation of frozen cell lines | |
| Samples | Cryopreservation of Sperm for IVF | |
| CN111194743A (zh) | 一种精子冷冻载体系统以及超快速冷冻精子方法 |