CZ308097A3 - Systém podmínění exprese - Google Patents

Systém podmínění exprese Download PDF

Info

Publication number
CZ308097A3
CZ308097A3 CZ973080A CZ308097A CZ308097A3 CZ 308097 A3 CZ308097 A3 CZ 308097A3 CZ 973080 A CZ973080 A CZ 973080A CZ 308097 A CZ308097 A CZ 308097A CZ 308097 A3 CZ308097 A3 CZ 308097A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
molecule
region
transactivator
protein
sequence
Prior art date
Application number
CZ973080A
Other languages
English (en)
Inventor
Laurent Bracco
Fabien Schweighoffer
Bruno Tocque
Original Assignee
Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhone-Poulenc Rorer S.A. filed Critical Rhone-Poulenc Rorer S.A.
Publication of CZ308097A3 publication Critical patent/CZ308097A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/82—Translation products from oncogenes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/635—Externally inducible repressor mediated regulation of gene expression, e.g. tetR inducible by tetracyline
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/13011—Gammaretrovirus, e.g. murine leukeamia virus
    • C12N2740/13041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/13043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
    • C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
    • C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
    • C12N2830/003—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor tet inducible

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Vynález se týká nového systému pro podmíněnou expresi genů. Vynález se rovněž týká použití tohoto systému v genové nebo buněčné terapii pro dosažení velmi selektivní exprese zainteresovaného genu.
Dosavadní stav techniky
Genová a buněčná terapie spočívá v korekci nedostatečnosti nebo anomálie (mutace, aberantní exprese a podobně) nebo v zajištění exprese terapeutického zainteresovaného proteinu zavedením genetické informace do léčeného orgánu nebo do léčené buňky. Tato genetická informace může být zavedena buá ex vivo do buňky izolované z orgánu, přičemž tato buňka, která byla. takto modifikována, se potom zavede zpět do organismu (buněčná terapie), nebo přímo in vivo do příslušné tkáně (genová terapie).
Pro provedení přenosu genů existují různé techniky, ze kterých lze zejména uvést různé techniky transfekce, při kterých nachází uplatnění přírodní nebo syntetické, chemické, nebo biochemické vektory, jakými jsou například komplexy DNA a DEAE-dextranu (Pagano a kol., J.Virol. 1 (1967)891),
DNA a jádrových proteinů (Kaneda a kol., Science 243(1989) 375), DNA a lipidů (Felgner a kol., PNAS 84 (1987)7413), použití liposomů (Fraley a kol., J.Biol.Chem. 255(1980 ) 1 043 1 ) , jakož i kationtových lipidů, a podobně. Jiná transfekční — technika spočívá v použití virů jakožto vektorů pro přenos genů. V tomto ohledu byly testovány různé viry za účelem stanovení jejich schopnosti infikovat určité buněčné populace. Zejména se jedná o retroviry (RSV, HMS, MMS a podobně), vir HSV, adeno-přisružené viry a adenoviry.
Jednou z hlavních obtíží, které se vyskytuji při rozvohi genové a buněčné terapie, je však selektivita léčení.
V závislosti na dané aplikaci a na přenášeném genu je velmi
- 2 důležité mít možnost zacílit některé tkáně nebo pouze některé části organismu a to za účelem zaostření terapeutického účinku pouze na tyto tkáně nebo části organismu o omezení rozptylu tohoto účinku a sekundárních nežádoucích účinků.
Takové zacílení terapeutického účinku může být provedeno za použití vektorů, které vykazuji potřebnou danou buněčnou specifičnost, tj. vektorů, které jsou selektivně specifické pouze pro zainteresované buňky.
Jiný přístup k řešení uvedeného problému spočívá v použití specifických expresních signálů některých buněčných typů. V tomto ohledu byly v literatuře popsány tak zvané specifické promotory, jakými jsou například promotory genů kódujících pyruvat-kinazu, villin, GFAP, promotor intestinální vazby mastných kyselin, promotor aktinu alfa buněk hladkého svalu nebo promotor genů apo-AI, apo-AII, lidský albumin a podobně. Tyto promotory však mají některé nedostatky a zejména vykazují určitý transkripční šum, který může být nepříjemný při expresi toxických genů. Použití těchto promotorů je tedy omezeno pouze na některé buňky a nemohou být tedy použity pro jakoukoliv aplikaci.
Podstata vynálezu
Vynález nyní popisuje nový systém podmíněné exprese genů, který je obzvláště selektivní a účinný. Výhodným znakem tohoto systému podle vynálezu je jeho schopnost exprimovát gen nikoliv v závislosti na buněčném typu, nýbrž v' závislosti na přítomnosti specifického buněčného prvku nebo specifické fyziologické situace. Tento systém se ve skutečnosti týká chimérických bispecifických molekul obsahujících oblast, která je schopna selektivně vázat definovanou sekvenci DNA, a detekční oblast, která je schopna specificky vázat transaktivátor nebo transaktivační komplex.
První znak vynálezu spočívá ve vytvoření a expresi ·· ···· '·» « * • · · · · · ·· ·· ·· ··· ··· ·· ·
- 3 chimérických bispecifických molekul obsahujících oblast, která je schopna selektivně vázat definovanou sekvenci DNA, a oblast, která je schopna specificky vázat transaktivátor nebo transrepresor nebo transaktivační nebo transrepresorový komplex.
Další znak vynálezu spočívá v sekvenci nukleové kyseliny kódující výše definovanou chimérickou molekulu, jakož i v každém expresním vektoru, který obsahuje uvedenou nukleovou sekvenci.
Další znak vynálezu spočívá v systém podmíněné exprese genů, zahrnujícím i) výše definovanou chimérickou molekulu a ii) expresní kazetu obsahující regulační sekvenci, minimální promotor (jehož aktivita závisí na přítomnosti transaktivátoru) a uvedený gen.
Další znak vynálezu spočívá rovněž v expresním vektoru zahrnujícím
- nukleovou sekvenci kódující výše definovanou chimérickou molekulu a
- uvedenou expresní kazetu.
Systém podmíněné exprese podle vynálezu je obzvláště ' vhodný pro použití v genové nebo buněčné terapii k dosažení velmi selektivní exprese zainteresovaných genů.
Jedna ze složek systému podle vynálezu je tedy tvořena chimérickými bispecifickými molekulami obsahujícími oblast, která je schopna selektivně vázat definovanou sekvenci- DNA, a oblast, která je schopna selektivně vázat trans- '' ' aktivátor nebo transaktivační komplex. Bispecifičnost molekul podle vynálezu spočívá jednak v jejich schopnosti vázat definovanou sekvenci DNA (která je obvykle označována jako regulační nebo operační sekvence) a jednak v jejich schopnosti specificky tvořit transaktivační nebo transrepresní proteinovou oblast, která umožňuje indukovat nebo potlačit expresi genů.
Vynález spočívá ve vytvoření chimérických bispecifických molekul umožňujících získání každého transkripčního faktoru, jehož aktivace nebo inaktivace vede k fyziopatologické situaci. Chimérické bispecifické molekuly podle vynálezu takto umožňují selektivní získání specifických transkripčních transaktivátorů fyziopatologického stavu, fixování těchto transkripčních faktorů k promotorům prostřednictvím vazby těchto molekul k definovaným sekvencím DNA lokalizovaným u těchto promotorů (regulační nebo operační sekvence) a takto i dosažení podmíněné exprese genů (obr.1).
Vynález se rovněž týká chimérických bispecifických molekul umožňujících vytvoření nikoliv molekuly nesoucí transaktivační oblast, avšak transkripčního transaktivačního komplexu, tj. komplexu vytvořeného mezi cílovou molekulou přítomnou v buňce a molekulou nesoucí transaktivační oblast (obr.2). V tomto případě, je transaktivační komplex výhodně vytvořen pomocí druhé chimérické bispecifické molekuly obsahující transaktivační oblast a oblast selektivní vazby k uvedené buněčné molekule. Fixování této druhé molekuly umožňuje vytvoření transkripčního transaktivačního binárního komplexu, přičemž tento komplex je takto tvořen detekčním systémem podle vynálezu. Fixování tohoto ternárního komplexu v blízkosti promotorů takto umožňuje regulovanou expresi genů. Tento typ konstrukce výhodně umožňuje rozšířit oblast použití systému podle vynálezu na detekci libovolné intracelulární molekuly zbavené transaktivační oblasti a to at se již jedná o endogenní molekulu nebo například o molekulu infekčního původu.......
Systém podle vynálezu takto díky velmi selektivnímu detekčními systému (senzor) umožňuje aktivovat výlučně expresi zainteresovaných genů v přítomnosti cílových proteinů. Může se jednat o stranskripční faktory vyskytujících se v rámci fyziologických nebo fyziopatologických situací nebo o libovolnou endogenní molekulu nebo například o molekulu infekčního původu.
V rámci vynálezu výraz transaktivátor označuje každý transaktivační faktor transkripce nebo každý protein zahrnující transkripční transaktivační oblast. Výraz transaktivační komplex označuje komplex vytvořený mezi molekulou přítomnou v buňce a bispecifickou molekulou podle vynálezu obsahující transaktivační oblast a oblast specifické vazby k uvedené molekule.
Expresní systém podle vynálezu může být použit pro získání libovolného transaktivačního proteinu nebo proteinu * nesoucího transaktivační oblast a zejména libovolného proteinu virálního, parazitního nebo mykobakteriálního původu, jakož i buněčného původu, majícího transkripční transaktivační účinnost.
Z transkripčních faktorů virálního původu lze uvést zejména protein Tat viru HIV, proteiny E6/E7 viru papilomu nebo také protein EBNA viru Epsteina a Barrové. Tyto proteiny mají transkripční transaktivační oblast a jsou přítomny výlučně v buňkách infikovaných těmito viry, tj. za specifických fyziopatologických podmínek. System podmíněné exprese podle vynálezu výhodně umožňuje detekci takové fyziologické situace (výskyt uvedených specifických transaktivátorů virální infekce) a indukci selelektivní exprese daného genu nebo daných genů.
Z buněčných proteinů lze výhodně uvést mutovaný nebo divoký protein p53. Tento protein p53 je tvořen 393 aminokys’ selinami. Ve své divoké formě je tento protein supresorem nádorů schopným negativně regulovat růst a dělení buněk. Tato účinnost je spojena s přítomností transkripční transaktivační oblasti ve struktuře proteinu p53, lokalizované v Nterminální oblasti proteinu (asi zbytky 1 až 100). V některých situacích je divoký protein p53 rovněž schopen indukovat apoptózu (Yonish-Rouach a kol., Nátuře, 352, 345-347,1991). Tyto vlastnosti se projevují ve stresových situacích, kdy je ohrožena integrita buněční DNA a protein p53 je takto pokládán za strážce genomu. Přítomnost mutovaných proteinů p53
99 9
99 9 • ·
• «
v asi 40 % lidských nádorů všech typů posiluje tuto hypotézu a podtrhuje pravděpodobně klíčovou úlohu, kterou hrají mutace tohoto genu při rozvoji nádorů (o tom viz: Montenarh, Oncogene, 7, 1673-1680, 1992; Oren, FASEB J., 6, 3169— 3176, 1992; Zambetti a Levine, FASEB J., 7, 855-865, 1993).
V rámci vynálezu je možné selektivně rekrutovat transaktivační oblast proteinu p53 a takto indukovat regulovanou expresi genu nebo genů výlučně v buňkách obsahujících tento protein. Podle vynálezu je obzvláště zajímavé specificky rekrutovat mutované formy proteinu p53, které se, jak již bylo uvedeno výše, vyskytují ve fyziopatologických situacích buněčné proliferace (rakovinového typu). Takovéto zacílení může být výhodně provedeno pomocí oblasti specifické vazby k mutovaným formám proteinu p53. Nicméně existuje zde specifičnost spojená s akumulací mutovaných forem, které mají poločas života výrazně delší oproti dikové formě.
Systém podle vynálezu může být rovněž použit pro indukování selektivní exprese genu nebo genů detekcí každé cílové molekuly přítomné v buňce. Detekovaným proteinem je výhodně protein vyskytující se v buňce při abnormálních situacích (infekce, hyperproliferace, a podobně). Může se zejména jednat o virální proteiny, jakými jsou například strukturní nebo funkční proteiny viru a zejména viru HIV, hepatitidy, herpes, a podobně. Může se rovněž jednat o specidické proteiny buněčného hyperproliferačního stavu, jakými jsou zejména proteiny myc, fos, jun, cykliny a podobně.
Jedna z. vlastností chimérických molekul podle vynálezu spočívá tedy v jejich schopnosti vázat se na specifické oblasti DNA (regulační nebo operační oblasti). Tato vazba umožňuje přivést transaktivační oblast do blízkosti promotoru a tímto způsobem aktivovat expresi genu vloženého pod kontrolu uvedeného promotoru.
Oblast schopná selektivně vázat definovanou sekvenci
DNA přítomná v molekulách podle vynálezu je v podstatě protei·· 4944 nového původu. Výhodněji je tato oblast odvozena od prokaryiotického nebo eukariotického proteinu schopného interakce se sekvencemi DNA. Četné genetické a strukturální studie dnes již umožňují přesně definovat v proteinech vstupujících v interakci se sekvencemi dvouvláknové DNA oblasti, které jsou zodpovědné za tyto interakce.
Z prokaryiotických proteinů vstupujících do interakce /A τ t<m i τ r Ί a V-γ
Ó ηΚΓΛ Ί
K-tVOUAVO-LAJVlAOVO ΙΊΠ a_ X, CC u vcb i
Z’ represory a výhodněji tetracyklinový represor odvozený z E.Coli a represor Cro odvozený od bakteriofágu Lambda.
Uvedený tetracyklinový represor (tetR) od E.Coli je proteinem s asi 210 aminokyselinami. V E.coli tento tetracyklinový supresor tetR negativně reguluje transkripci genů mediujících rezistenci k tomuto antibiotiku v operonu tet. V nepřítomnosti tetracyklinu se represor tetR fixuje k DNA v úrovni specifické sekvence (která je označována jako operační sekvence nebo Tetop) a potlačuje transkripci rezistenčního genu. Naopak v přítomnosti tetracyklinu se represor tetR již nefixuje k operátoru tetop umožňujíce tak konstituční transkripci uvedeného genu (Hillen.W a Wissmann A. (1989) v Protein-Nucleic Acid Interaction. Topics in Molecular and Structural Biology, ed.,Saenger W. a Heinemann U. (Macmillan, Londýn), sv.10, str. 143-162). Sekvence tetracyklinového supresoru tetR již byla publikována (je uvedena zejména v patentovém dokumentu WO94/04682). Sekvence dvouvláknové DNA, která je specifická pro vazbu tetracyklinového supresoru tetR k DNA (Tetop) je tvořena následujícím motivem:
TCTCTATCACTGATAGGGA (SEQ IĎ n°1).
Tento mofif může být opakován několikrát za účelem zvýšení afinity a účinnosti systému. Rehulační sekvence může takto obsahovat a 10 uvedených motivů, přičemž výhodně obsahuje dva motivy (Tetop2) nebo sedm motivů (Tetop7)(viz obr.3).
Protein Cro byl definován původně jako regulátor expre• ·
se represoru CI (Eisen H. a kol.(1970)PNAS 66, str.855). Klonování geni cro umožnilo identifikaci proteinu s 66 aminokyselinami (SEQ ID n°2 1 ; Roberts T. a kol.(1977), Nátuře 270, str.274). Cro vykonává svou fyziologickou úlohu tím, že se přednostně fixuje na operátor OR^ odvozený od bakteriofágu Lambda.
Sekvence dvouvláknové DNA specifická pro vazbu Cro k DNA (oblast označovaná jako OR3) je tvořena následujícími bázemi:
TATCACCGCAAGGGATA (SEQ ID n°2).
Tato oblast může být opakována několikrát za účelem dosažení zvýšené afinity a účinnosti systému (viz obr.4).
Z eukaryotických proteinů vstupujících v interakci se sekvencemi dvouvláknové DNA se pro konstrukci molekul podle vynálezu výhodně používají proteiny nebo oblasti odvozené od proteinů STÁT, p53 nebo NFkB (Inoue a kol., PNAS 89(1992) 4333). Pokud jde o protein p53, je jeho vazevná oblast k DNA lokalizována v centrální oblasti proteinu, přesněji v oblasti mezi aminokyselinami 102 až 292 (Pavletich a kol., Genes and Dev.7(1993)2556).
Jak již bylo uvedeno výše, je oblast schopná selektivně vázat definovanou sekvenci DNA přítomná v molekulách podle vynálezu výhodně odvozena od prokaryotického nebo eukaryotického proteinu schopného vstoupit v interakci s oblastí dvouvláknové DNA. Oblast použitá .pro .konstrukci molekul, podle vynálezu může být tvořena celým proteinem nebo jeho částí obsahující oblast interakce s DNA. Tato oblast byla indentifikována v případě různých proteinů a zejména v případě TetR (viz například Berens a kol., J.Biol.Chem. 267( 1 992 ) 1 945) .
Tato oblast může být rovněž tvořena derivátem tohoto proteinu nebo jeho fragmentem, který si zachoval schopnost vazby k DNA. Takovými deriváty jsou zejména proteiny s modifikací jedné nebo několika aminokyselin, například za účelem umožnění jejich fuze s ostatními oblastmi molekul podle vynálezu, které mohou být připraveny klasickými technikami molekulární biologie. Tak například takové deriváty proteinů TetR a Cro byly již popsány v liretatuře, přičemž tyto deriváty mají lokálně přesné mutace nebo/a delece (Hecht a kol., J. Bact.175(1993), str.1206; Altschmied a kol., EMBO J 7 (1988) / 1 ΟΟΉ 1 CO . -X \ i y y z. / ι υ a f nanocn a.
J.Biol.Chem.262(1987)14030 ) . Schopnost těchto derivátů vázat se k definované sekvenci DNA může být potom testována inkubací připraveného derivátu s regulační sekvencí a detekcí vytvořených komplexů. Kromě toho uvedenými deriváty mohou být rovněž proteiny mající zlepšenou schopnost vazby k DNA (specifičnost, afinita a podobně).
Podle výhodné formy provedení je oblast schopná selektivně vázat definovanou sekvenci DNA přítomná v molekulách podle vynálezu odvozena od prokaryotického proteinu. Tento typ konstrukce je obzvláště výhodný vzhledem k tomu, že tyto proteiny nelidského původu rozpoznávají dvouvláknové DNA s alespoň 14 nukleotidy. Pravděpodobnost nalezení stejné sekvence v lidském genomu je téměř nulová a získaný expresní systém je takto ještě selektivnější.
V rámci jiné výhodné formy provedení je oblast schopná selektivně vázat definovanou sekvenci DNA přítomná v molekulách podle vynálezu odvozena od proteinů tetR nebo Cro.
Je obzvláště výhodné použít proteiny tetR nebo Cro (SEQ ID n?.2J,).„v_kompletnínu,stav,u-..Oblast schopná specificky vázat transkripční transaktivátor nebo transkripční transaktivační komplex přítomná v molekulách podle vynálezu může být oblastí různého typu. Zejména se může jednat o oligomerizační oblast v případě, kdy transaktivátor nebo transaktivační komplex, který má být zacílen, takovou oblast rovněž obsahuje. Může se rovněž jednat o každou syntetickou nebo přírodní oblast, o které je známo, • · · ·
- 10 že vstupuje v interakci s uvedeným transaktivátorem nebo transaktivačním komplexem. Může se také jednat o protilátku nebo o fragment nebo derivát protilátky řízené proti uvedenému transaktivátoru nebo transaktivačnímu komplexu.
Z oligomeračních oblastí použitelných v rámci vynálezu lze zejména jmenovat leucinové zipy, například oblasti SH2 nebo oblasti SH3. Leucinové zipy jsou alfa-amfipatickými helixy, které obsahují 4 nebo 5 leucinů každých 7 aminokyselin. Tato periodičnost umožňuje lokalizaci leucinů téměř ve stejné poloze na helixu alfa. Dimerace je podmíněna hydrofobními interakcemi mezi bočními řetězci leucinů dvou přilehhlých zipových oblastí (Vogt a kol., Trend In Bioch.Science 14(1989). O oblastech SH2 je známo, že vstupují v interakci s fosforylovanými specifickými peptidovými oblastmi v tyrosinu. Oblasti SH3 mohou být použity pro vytvoření oligomeru s každým transaktivátorem nebo transaktivačním komplexem, který obsahuje odpovídající peptid bohatý na prolin (Pawson a kol., Current Biology 3 (1993)434). Rověž mohou být použity oblasti proteinů, o kterých je známo, že indukují oligomeraci, jakými jsou zejména C-terminální oblast proteinu p53. Použití této oblasti umožňuje rekrutovat selektivním způsobem proteiny p53 přítomné v buňce. V rámci vynálezu se výhodně používá oblast p53 obsažená mezi aminokyselinami 320-393 (SEQ ID n°3). 302-360 nebo 302-390.
Ze syntetických nebo přírodních oblastí, o kterých j známo, že vstupují v interakci s molekulou obsahující cílový transaktivační prvek, lze například uvést oblast pro- . teinu MDM2 vstupující v interakci s proteinem p53. Tento typ konstrukce takto umožňuje rekrutovat jako transaktivátor divoký nebo mutovaný protein p53.
Výhodnou oblastí specifické vazby k transkripčnímu transaktivátoru podle vynálezu je protilátka nebo fragment nebo nebo derivát protilátky. Fragmenty nebo deriváty protilátky jsou například fragmenty Fab nebo F(ab)'2, oblasti VH nebo VL protilátky s jednoduchým řetězcem (ScFv) obsahující oblast VH spojenou s oblastí VL ramenem. Tento typ oblasti je obzvláště výhodný vzhledem k tomu, že může být řízen proti celé molekule.
Protilátky tvořené molekulami skupiny imunoglobulinů jsou tvořené různými řetězci (2 těžké (H) a 2 lehké (L)), přičemž tyto řetězce jsou zase tvořeny různými oblastmi (variabilní oblast (V), připojovací oblast (J) a podobně).
Oblast vazby k transaktivátoru nebo k transaktivačnímu komplexu přítomná v molekulách podle vynálezu je výhodně tvořena fragmentem nebo derivátem protilátky obsahujícím alespoň vazevné místo zodpovědné za vazbu k antigenu. Tento fragment může být buď variabilní oblastí lehkého řetězce (V^) nebo těžkého řetězce (V ), případně ve formě fragmentu Fab nebo F(ab )2 nebo výhodně ve formě protilátky s jednoduchým řetězcem (jednořetězcová protilátka) (ScFv). Jednořetězcové protilátky použité pro konstrukci molekul podle vynálezu jsou tvořené peptidem odpovídajícím vazebnému místu variabilní oblasti lehkého řetězce protilátky a připojeným peptidovým ramenem k peptidu odpovídajícímu vazebnému místu variabilní oblasti těžkého řetězce protilátky. Konstrukce sekvencí nukleových kyselin kódujících takové modifikované protilátky podle vynálezu byla například popsána v patentovém dokumentu US 4,946,778 nebo v patentových přihláškách W094/02610 a WO94/29446. Tato konstrukce je ilustrována v dále zařazených příkladech.
Výhodná konstrukce podle vynálezu zahrnuje oblast vazby k proteinu p53. Výhodně se jedná o derivát protilátky ří’ zený proti proteinu p53. Výhodnou formou této oblasti je jednořetězcová protilátka řízená proti p53. Jako ilustrační příklad je možné uvést použití ScFv se sekvencí SEQ ID n°4, jehož konstrukce je popsána v příkladech provedení.
Oblast vazby k DNA a oblast vazby k transaktivátoru jsou vzájemně spojené prostřednictvím ramene. Toto rameno je obecně tvořeno peptidem zajištujícím celému komplexu dosta- 12 ·· 9999 • · ·
9 9
999 · » · · » 9 ·
999 · tečnou flexibilitu, nezbytnou k tomu, aby ově uvedené oblasti molekul podle vynálezu mohly být funkční autonomním způsobem. Tento peptid je obecně tvořen nezatíženými aminokyselinami, které neinterferují s aktivitou molekul podle vynálezu a kterými jsou například glycin, serin, tryptofan, lysin nebo prolin. Toto rameno obsahuje obecně 5 až 30 aminokyselin, výhodně 5 až 20 aminokyselin. Příklady peptidových ramen použitelných pro konstrukci molekul podle vynálezu jsou například:
-GGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID n°5),
-PKPSTPPGSS (SEQ ID n°6), jehož kódující sekvence je
CCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCA (SEQ ID n°6) .
Výhodnými příklady molekul podle vynálezu jsou zejména následující molekuly:
a) ScFv-tag-Hinge-TET nebo Cro (obr.5A).
Tento typ molekuly zahrnuje:
- oblast vazby k transaktivátoru tvořenou jednořetězcovou protilátkou,
- peptidovou sekvenci tag poznatelnou monoklonální protilátkou umožňující imunologickou detekci molekuly. Touto sekvencí může být například epitop VSV sekvence MNRLGK (SEQ ID n°7), jejíž kódující sekvencí je ATGAACCGGCTGGGCAAG (SEQ ID n°7), nebo epitop myc se sekvencí EQKLISEEDLN (SEQ ID n°8), jehož kódující sekvencí je GAACAAAAACTCATCTCAGAAGAGGATCTGAAT (SEQ
ID n°8) a který je rozpoznatelný protilátkou 9E10.
- peptidové rameno se sekvencí SEQ ID n°6 (Hinge) a ’J ™
- oblast vazby k DNA tvořenou proteinem TET nebo Cro.
ScFv je výhodně řízen proti proteinu p53.
b) ScFv-Hinge-TET nebo Cro (obr.5B)
Tento typ molekuly obsahuje stejné prvky jako molekula
a) s výjimkou spočívající v tom, že je zde nepřítomna sekven·· ···· ·· ···· » · · < ·· ··
- 13 ce tag.
c) ScFv-TET nebo Cro (obr.5V)
Tento zjednodušený typ molekuly obsahuje pouze oblast vazby k transaktivátoru tvořenou jednořetězcovou protilátkou a oblast vazby k DNA tvořenou proteinem TET nebo Cro. Tato molekula neobsahuje ani rameno ani sekvenci tag. V této konstrukci je oblast vazby k transaktivátoru lokalizována v Nterminální části molekuly a oblast vazby k DNA se nachází v C -terminální části molekuly.
d) TET nebo Cro-ScFv (obr.5D)
Tento typ molekuly je podobný výše uvedenému typu c). Jediný rozdíl spočívá v podstatě v uspořádání oblastí: oblast vazby k transaktivátoru je nyní lokalizována v C-terminální části molekuly a oblast vazby DNA se nychází v N-terminální oblasti molekuly.
e) TET nebo Cro-Hinge-ScFv (obr.5E)
Tento typ molekuly obsahuje stejné prvky jako výše uvedený typ b) molekuly. Rozdíl spočívá v podstatě v uspořádání oblastí: oblast vazby k transaktivátoru je nyní lokalizována v C-terminální části molekuly, zatímco oblast vazby k DNA se v tomto případě nachází v N-terminální části molekuly.
f) Oligom-tag-Hinge-TET nebo Cro (obr.5A) __ _ _ ___ __
Tento typ molekuly je podobný výše uvedenému typu a) a výjimkou spočívající v tom, že oblast vazby k transaktivátoru je nahrazena oblastí oligomerace s proteinem p53 se sekvencí SEQ ID n°3. Tato molekula umožňuje rekrutovat mutované proteiny p53 vyskytující se v nádorových buňkách.
g)01igom-Hinge-TET nebo Cro (obr.5B) • ••4
Tento typ molekuly je podobný výše uvedenému typu b) s výjimkou spočívající v tom, že oblast vazby k transaktivátoru je v tomto případě nahrazena oblastí oligomerace s proteinem p53 se sekvencí SEQ ID n°3.
h) 01igom-TET nebo Cro (obr.5C)
Tento typ molekuly je podobný výše uvedenému typu c) s výjimkou spočívající v tom, že oblast vazby k transaktivátoru je v tomto případě nahrazena oblastí oligomerace s proteinem p53 se sekvencí SEQ ID n°3.
i) TET nebo Cro-Oligom (obr.5D)
Tento typ molekuly je podobný výše uvedenému typu d) s výjimkou spočívající v tom, že oblast vazby k transaktivátoru je zde nahrazena oblastí oligomerace s proteinem p53 se sekvencí SEQ ID n°3.
j) TET nebo Cro-Hinge-Oligom (obr.5E)
Tento typ molekuly je podobný výše uvedenému typu e) s výjimkou spočívající v tom, že oblast vazby k transaktivátoru je zde nahrazena oblastí oligomerace s proteinem p53 se sekvencí SEQ ID n°3.
Jinak může být v každé z těchto molekul peptidové rameno snadno nahrazeno sekvencí (G4S)3 (SEQ ID n°5) .
Dalším předmětem vynálezu je sekvence nukleové. kyseliny ..... kódující výše definovanou chimérickou molekulu. Výhodně se jedná o sekvenci DNA, zejména DNAc. Může se rovněž jednat o RNA. Tyto sekvence podle vynálezu se obecně konstruují sestavením v klonovacím vektoru sekvencí kódujících různé oblasti technikami molekulární biologie. Uvedené sekvence nukleových kyselin podle vynálezu mohou být případně modifikovány chemickou, enzymatickou nebo genetickou cestou za účelem generování stabilizovaných oblastí nebo/a multifunkčních
• · • 9 oblastí nebo/a oblastí s redukovanou délkou nebo/a za účelem příznivého ovlivnění jejich lokalizace v tom či onom intracelulárním úseku. Sekvence nukleových kyselin podle vynálezu mohou takto obsahovat sekvence kódující peptidy jádrové lokalizace (NLS). Zejména je možné provést fúzi sekvencí podle vynálezu se sekvencí kódující NLS viru SV40, který má následující peptidovou sekvenci:
PKKKRKV (SEQ ID n°9 ) (Kalderon a kol., Cell 39(1984)499).
Nukleové sekvence podle vynálezu tvoří výhodně část expresního vektoru, který může mít plasmidový nebo virální charakter.
Dalším předmětem vynálezu je fúzní protein obsahující transkripční transaktivátorovou oblast a oblast specifické vazby k dané molekule, kteréžto oblasti jsou případně spojené peptidovým ramenem , jakož i libovolnou sekvenci nukleové kyseliny kódující takovou fúzi. Transaktivační oblast může pocházet z libovolného transkripčního transaktivačního proteinu, jakým je například p53, VP16, EBNA, E6/E7, Tat a podobně.
Dalším předmětem vynálezu je systém podmíněné exprese genů zahrnující:
- výše definovanou chimérickou molekulu a
- expresní kazetu obsahující regulační sekvenci, minimální transkripční promotor a uvedený gen.
Uvedená expresní kazeta obsahuje prvky nezbytné k aktiva ci exprese genu tranaktivátorem nebo transaktivačním komplexem rekrutovaným bispecifickou molekulou. Regulační sekvence je takto vazebnou sekvenci zodpovědnou za vazbu k DNA exprimované chimérické molekuly. V případě, že oblast vazby k DNA chimérické molekuly je reprezentována celkem nebo částí tetracyklinového supresoru TetR, potom regulační sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID n°1 nebo její derivát, opakovanou případně několikrát. Výhodně se jedná o sekvenci op2 (obsahující ·· ···· « • · ·» *
·· ···· motivů Tetop, které se opakují tak, jak je to popsáno například Weinmannem a kol. v The Plant Journal 5(1994)559). Stejně tak,kdyžje oblast vazby k DNA chimérické molekuly reprezentována celkem nebo částí Cro, obsahuje regulační sekvence sekvenci SEQ ID n°2 nebo její derivát, které jsou případně několikrát opakovány. Výhodně se jedná o sekvenci 0R3. Deriváty sekvencí SEQ ID n°1 a n°2 mohou být tvořeny každou sekvencí získanou modifikací genetického charakteru (mutace, delece, adice, repetice a podobně), která zachovává schopnost derivátu specificky vázat protein. Takové deriváty byly popsány v literatuře (Baumeister a kol.(již citován výše), Tovar a kol., Mol.Gen.Genet.215(1988)76,WO94/04672 ) .
Pokud jde o minimální transkripční promotor, jedná se o promotor, jehož aktivita závisí na přítomnosti transaktivátoru. Vzhledem k tomu je promotor v nepřítomnosti chimérické molekuly neaktivní a nedochází k expresi genu nebo dochází pouze k velmi omezené expresi tohoto genu. Naopak v přítomnosti chimérické molekuly umožňuje rekrutovaný transaktivator nebo transaktivační komplex indukovat aktivitu minimálního promotoru a tudíž i expresi zainteresovaného genu.
Uvedený minimální promotor je obecně tvořen boxem TATA nebo INR. Tyto prvky jsou ve skutečnosti minimálnímě potřebnými prvky pro expresi genu v přítomnosti transaktivátoru. Tento minimální promotor může být připraven z každého promotoru genetickou modifikací. Jako příklad výhodného promotorového kandidáta lze uvést promotor genu thymidin-kinázy. Zajímavých výsledků bylo dosaženo s „minimálním .promotorem- odvozeným od promotoru TK tvořeného nukleotidy -37 až +19. Uvedený minimální promotor může být rovněž odvozen od lidského CMV. Zejména může být tvořen fragmenty obsaženými mezi nukleotidy -53 až +75 nebo -31 až +75 viru CMV. Nicméně může být použit každý konvenční promotor, jakým je například promotor genů kódujících enzymy chloramfenikolacetyl-transferázu, betagalaktosidázu nebo také luciferázu.
Expresní kazeta je výhodně tvořena následujícími prvky:
- regulační sekvence: sekvence zahrnující sekvenci SEQ ID n°1 nebo n°2 nebo její derivát, které jsou případně několikrát opakovány,
- minimální promotor: promotor odvozený od promotoru genu thymidin-kinázy (TK),
- zainteresovaná kódující sekvence.
Ještě výhodněji je minimální promotor tvořen oblastí -37 až +19 promotoru genu thymidin-kinázy.
Výhodně je expresní kazeta zvolena z množiny zahrnující strukturní kazety Tetop2.TK-Gen, Tetop7.TK-Gen a 0R3.TKGen.
Dalším znakem vynálezu je expresní vektor obsahující sekvenci nukleových kyselin kódující chimérickou molekulu a výše definovanou expresní kazetu. Do vektorů podle vynálezu mohou být sekvence nukleových kyselin kódující chimérickou molekulu a expresní kazeta vloženy ve stejné orientaci nebo v opačných orientacích. Jinak uvedený vektor může mít plasmidovou nebo virální povahu.
Z virálních vektorů lze uvést výhodněji adenoviry, retroviry, herpesviry nebo také adeno-přidružené viry. Viry podle vynálezu jsou defektními viry, t.zn. viry, které nejsou schopné replikovat se autonomním způsobem v cílové buěce.
™Obecně„je tedy genom defektních -virů-použitých v rámci vyná- -lezu zbaven alespoň sekvencí nezbytných pro replikaci uvedeného viru v infikované buňce. Tyto oblasti mohou být buď eliminovány (zcela nebo částečně), nebo učiněny nefunkčními, nebo nahrazeny jinými sekvencemi a zejména sekvencemi podle vynálezu. Výhodně si defektní vir nicméně zachovává ty sekvence svého genomu, které jsou nezbytné pro inkapsidaci virových částic.
Pokud jde o adenoviry, byly již charakterizovány růz- 18 né sérotypy, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Z těchto sérotypů je výhodné použít v rámci vynálezu lidské adenoviry typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenoviry zvířecího původu (viz přihláška WO94/26914). Z adenovirů zvířecího původu použitelných v rámci vynálezu lze uvést adenoviry psího, bovinního, murinního (příklad: Mav1, Beard a kol., Virology 75(1990)81), ovčího, prasečího, ptačího ne+ a V- cs C'
C7\v\ kjfi V / V % i tr aucnuviicm zvířecího původu psí adenovir, zejména adenovir CAV2 /kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800), například/. Výhodně se v rámci vynálezu použijí adenoviry lidského nebo psího původu anebo smíšeného původu.
Výhodně genom rekombinantních adenovirů podle vynálezu obsahuje alespoň sekvence ITR a inkapsidační oblast adenovirů a sekvenci nukleových kyselin kódující chimérickou molekulu, jakož i výše definovanou expresní kazetu. Výhodně je v genomu je adenovirů podle vynálezu nefunkční alespoň oblast E1. Uvažovaný virální gen může být učiněn nefunkčním libovolnou o sobě známou technikou a zejména celkovou supresí, substitucí (například sekvencemi podle vynálezu), částečnou delecí nebo adicí jedné nebo několika bází v uvažovaném genu nebo v uvažovaných genech. Takových modifikací může být dosaženo in vitro (na izolované DNA) nebo in šitu, například za použití technik genového inženýrství nebo také působením mutagenních činidel. Rovněž ostatní oblasti mohou být modifikované a zejména oblast E3 (WO95/02697), oblast E2 (WO9428938), oblast E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a oblast L5 (WO95/02697). ’ — - — — V rámci výhodné formy provedení obsahuje adenovir podle vynálezu deleci v oblastech E1 a E4. V rámci jiné výhodné formy provedení tento adenovir obsahuje deleci v oblasti
E1, v jejíž úrovni jsou vloženy oblast E4 a sekvence podle vynálezu (viz FR 9413355).
Defektní rekombinantní adenoviry podle vynálezu mohou být připraveny libovolnou o sobě známou technikou (Levrero a kol., Gene 101(1991)195, EP185573, Graham, EMBO J. 3(1984) 2917). Tyto adenoviry mohou být zejména připraveny homologní rekombinaci mezi adenovirem a plasmidem nesoucím, mimo jiné sekvence DNA podle vynálezu (sekvence kódující chimérickou molekulu + expresní kazetu). Uvedená homologní rekombinace se provádí po ko-tranfekci uvedených adenovirů a plasmidu do příslušné buněčné řady. Použitelná buněčná řada musí výhodně 1) být transformovatelná uvedenými prvky a 2) musí obsahovat sekvence schopné komplementovat část genomu defektního adenovirů, výhodně v integrované formě za účelem zamezení rekombinačních rizik. Jakožto příklad takové buněčné řady lze uvést lidskou embryonální renální řadu 293 (Graham a kol.,
J.Gen.Virol.36 (1977)59), která obsahuje zejména ve formě integrovaném ve svém genomu levou část genomu adenovirů Ad5 (12 %) nebo řady schopné komplementovat funkce E1 a E4, které byly zejména popsané v přihláškách WO94/26914 a WO95/02697.
Následně se multiplikované a izolované adenoviry purifikují klasickými technikami molekulární biologie, které jsou ilustrány v dále zařazených příkladech provedení.
Pokud jde o adeno-přidružené viry (AAV), jedná se o viry s DNA mající relativně redukovanou velikost a integrující s’e do genomu buněk, které infikují, stabilním a místně specifickým způsobem. Tyto viry jsou schopné infikovat široké spektrum buněk, aniž by indukovali jakýkoliv účinek ovlivňující růst, morfologii nebo dělení buněk. Jinak se nezdá, že by tyto viry by ly implikovány do - lidských patologi í-. Genom“ · —·— — adeno-přidružených virů již byl konován, sekvencován a charakterizován. Zahrnuje asi 4700 bází a obsahuje na každém konci oblast obrácené repetice (ITR) s asi 145 bázemi, sloužící jako počátek replikace viru. Zbytek genomu je rozdělen do dvou hlavních oblastí nesoucích inkapsidační funkce: levá část genomu, která obsahuje gen rep implikovaný při virální replikaci a expresi virálních genů, a pravá část genomu, která •· ββββ obsahuje gen cap kódující proteiny kapsidy viru.
Použití vektorů adeno-přidružených virů (AAV) pro přenos genů in vitro a in vivo již byl popsán v literatuře (viz zejména WO91/18088, WO93/09239, US 4,797,368, US 5,139,941,
EP 488 528). V těchto přihláškách jsou popsané různé konstrukc odvozené od adeno-přidružených virů AAV, ve kterých jsou geny rep nebo/a cap eliminovány delecemi a nahrazeny zainteresovaným genem, jakož i jejich použití pro přenos in vitro (na buňkách v buněčné kultuře) nebo in vivo (přímo do organismu) zainteresovaného genu. Defektní rekombinantní adenopřidružené viry AAV mohou být připraveny ko-transfekcí do buněčné řady infikované pomocným virem lidského původu (například adenovirem) plasmidu obsahujícího nukleové sekvence podle vynálezu (sekvence kódující chimérickou molekulu + expresní kazetu) lemované dvěma oblastmi obrácené repetice (ITR) odvozenými od adeno-přidružených virů a plasmidu nesoucího inkapsidační geny (geny rep a cap) odvozené z adeno-přidružených virů AAV. Produkované rekombinantní AAV se potom purifikují klasickými technikami.
Pokud jde o herpresviry a retroviry, byla konstrukce rekombinantních vektorů v široké míře popsána v literatuře.
tom viz zejména: Breakfield a kol., New Biologist 3 (1991) 203, EP 453242, EP178220, Bernstein a kol. Genet.Eng.7(1985) 235, McCormick, BioTechnology 3 (1985)689 a podobně.
Retroviry jsou integrativními viry, které selektivně infikují buňky ve stádiu jejich dělení. Tyto viry takto tvoří žádané vektory při· rakovinových aplikacích. Genom retrovirů v podstatě obsahuje dvě sekvence LTR, inkapsidační sekvenci a tři kódující oblasti (gag, pol a env). V rekombinantních vektorech odvozených od retrovirů jsou geny gag, pol a env obecně eliminovány delecí a to zcela nebo částečně a nahrazeny zainteresovanou heterologní sekvencí nukleové kyseliny. Tyto vektory mohou být získány z různých typů retrovirů, jakými jsou zejména MoMuLV (vir murinní Maloneyovy leukemie, ···· také označován jako MoMLV), MSV (vir murinního Maloneyova sarkomu), HaSV (vir Harveyova sarkomu), SNV (vir slezinné nekrózy), RSV (vir Rousova sarkomu) nebo také Friendův vir.
Za účelem konstrukce rekombinantních retrovirů podle vynálezu se obecně sestrojí plasmid obsahující zejména sekvence LTR, inkapsidační sekvenci a sekvence podle vynálezu > (sekvence kódující chimérickou molekulu + expresní kazetu, který se potom použije pro transfekování tak zvané inkapsidační buněčné řady, schopné přinést do polohy trans retrovirální funkce, které jsou v plasmidu deficitní. Obecně jsou inkapsidační řady tedy schopné exprimovat geny gag, pol a env. Takové inkapsidační řady byly popsané v rámci dosavadního stavu techniky a jsou jimi zejména řady PA3 1 7 (US 4,861,719), PsiCRIP (W090/02806) a GP+envAm-12 (WO89/07150). Jinak mohou rekombinantní retroviry zahrnovat modifikace v úrovni sekvencí LTR provedené za účelem potlačení transkripční aktivity, jakož i rozložené inkapsidační sekvence zahrnující část genu gag (Bender a kol., J.Virol.61(1987)1639). Produkované rekombinantní retroviry se potom purifikují klasickými technikami.
Příklad konstrukce defektního rekombinantního viru podle vynálezu (retrovir) je popsán na obr.8. Z tohoto obrázku je zřejmá druhá výhoda konstrukcí podle vynálezu, která spočívá v absenci exprese zainteresovaného genu v inkapsidačních řadách. Vzhledem k tomu, že v těchto řadách není přítomen transaktivátor nebo transaktivační komplex rekrutovaný _systémem podle vynájeju, je promotor neaktivní . nodp:c.ház.í_=_ _. M tak k expresi genu v produkční buňce (obr.8A). K tomu dochází pouze v případě, kdy vir účinně infikoval cílovou buňku, tj. buňku, ve které je přítomen transaktivátor nebo transaktivační komplex rekrutovaný systémem podle vynálezu, a kdy dochází k účinné expresi genu (obr.8B). To je obzvláště výhodné pro konstrukci viru obsahujícího geny, jejichž exprese by byla pro buňky toxická (geny Grb3-3, IL-2, difterický toxin a podobně ) .
• ·
V rámci realizace vynálezu je obzvláště výhodné použít defektní rekombinantní adenovir nebo retrovir. Tyto vektory mají ve skutečnosti vlastnosti, které jsou mimořádně zajímavé pro přenos genů do nádorových buněk.
V rámci vynálezu mohou být rovněž použity různé typy nevirálních vektorů. Systém podmíněné exprese podle vynáleS· zu může být ve skutečnosti zabudován do nevirálního činidla schopného podporovat přenos a expresi nukleových kyselin # do eukaryotických buněk. Chemické nebo biochemické vektory představují zajímavou alternativu přírodních virů a to zejména vzhledem ke snadné manipulaci, ke zvýšené bezpečnosti a vzhledem k tomu, že zde neexistuje teoretická mez týkající se velikosti DNA, která má být transfekována.
Tyto syntetické vektory mají dvě základní funkce, a sice zhutňovat transfekovanou nukleovou kyselinu a podporovat její buněčnou fixaci, jakož i její průchod skrze plasmovou membránu, a případně skrze obě jádrové membrány. Aby se čelilo polyaniontovému charakteru nukleových kyselin, mají nevirální vektory ve všech případech polykationtové náboje.
Z vyvinutých syntetických vektorů jsou nejvýhodnější kationtové polymery typu polylysinu, (LKLK)n, (LKKL)n, polyethylenimin a DEAE-dextran nebo také kationtové a lipofektantní lipidy. Tyto vektory mají schopnost zhutnit DNA a podporovat jení sdružení s buněčnou membránou. Z těchto posledně uvedených lze uvést lipopolyaminy (lipofektamin, transfektam _ =_____a podobně) arůzné kationtové nebo neutrální lipidy(DOTMA,
DOGS, DOPE a podobně). V nedávné době byl vyvinut systém cílené transfekce, mediované receptorem, který využívá princip kondenzace DNA díky kationtovému polymeru řídíce fixování komplexu k membráně v důsledku chemické kopulace mezi kationtovým polymerem a ligandem membránového receptoru přítomného na povrchu buněčného typu, který má být roubován.
Bylo již popsáno zacílení receptoru transferinu, insulinu nebo receptoru asialoglykoproteinů hepatocytů.
Předmětem vynálezu je také jakákoliv farmaceutická kompozice, která obsahuje výše uvedený vektor. Tyto kompozice mohou být formulovány s ohledem na topické, perorální, parenterální, intranasální, íntravenózní, intramuskulární, subkutánní, intraokulární a podobné podání. Výhodně kompozice podle vynálezu obsahuje farmaceuticky přijatelné nosiše pro injikovatelné formulace. Může se zejména jednat o roztoky solí (dihydrogenfosforecnan sodný, hydrogenfosforecnan sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý nebo chlorid hořečnatý, a podobně, nebo směsi takových solí) ve sterilní a izotonickém stavu nebo o suché kompozice, zejména lyofilizované kompozice, které po přidání sterilizované vody nebo fyziologického roztoku umožňují rekonstituci injikovatelných tekutin. Pokud jde o retroviry, může být výhod né přímo použít inkapsidační buňky nebo buňky infikované ex vivo a reimplantované in vivo, případně ve formě neoorgánu.
Dávky vektoru použité pro injekci mohou být uzpůsobeny v závislosti na různých parametrech a zejména v závislosti na použitém způsobu podání, na léčené patologii nebo také na požadované době léčení. Obecně jsou rekombinantní viry podle vynálezu jsou formulovány a podávány ve formě dávek pohy4 14 - , „ bujících se mezi 10 a 10 pfu/ml. V případe adeno-pridružených virů (AAV) a adenovirů mohou být rovněž použity dávky pohybující se mezi 10θ a 1010 pfu/ml. Výraz pfu (plaque forming unit) odpovídá infekční potenci suspenze virionů a je stanovena infekcí příslušné buněčné kultury a vyhodnocením (obvykle po 48 hodinách) počtu infikovaných buněčných plaků. Techniky stanovení titru pfu’ virálního’roztoku jsou v široké míře dokumentovány v literatuře.
Expresní systém podle vynálezu a odpovídající vektory jsou obzvláště vhodné pro regulaci exprese zainteresovaných genů v rámci buněčných a genových terapií. Tyto vektory mohou být také použity pro regulaci exprece jakékoliv zainteresované kódující sekvence a zejména sekvence kódující terapeutický • · produkt, kterým může být peptid, polypeptid, protein ribonukleová kyselina a podobně. Genem je sekvence DNA (DNAc, DNAg, syntetická, lidská, zvířecí, rostlinná a obdobná DNA) kódující proteinové produktv, jakými jsou například enzymy, krevní deriváty, hormony, lymfokiny: interleukiny, interferony,
TNF a podobně (FR 9203120), růstové faktory, neurotransmitory nebo jejich prekurzory nebo syntézní enzymy, trofické faktory: BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, aFGF, bFGF, NT3, NT5 a podobně, apolipoproteiny: ApoAI, ApoAIV, ApoE a podobně (FR 93 05125), dystrofin nebo minidystrofin (FR 9111947), nádorosupresorové geny: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev a podobně (FR 93 04745), geny kódující faktory implikované v koagulaci: faktory VII, VIII, IX a podobně nebo také celek nebo část přírodního nebo umělého imunoglobulinu (Fab, ScFv a podobně), RNA-ligand (WO91/19813) a podobně.
Zainteresovaným genem může být také antimediátotová sekvence, jejíž exprese v cílové buňce umožňuje regulovat expresi genů nebo transkripci buněčných RNAm. Takové sekvence mohou být například přepsány do cílové buňky jako komplementární RNA buněčných RNAm a mohou takto blokovat jejich translaci na protein technikou popsanou v patentovém dokumentu EP 140 308.
Vynález.je obzvláště vhodný pro expresi sekvencí kódujících toxické faktory. Zejména se může jednat o buněčné jedy (difterický toxin, toxin pseudomonas, ricin A a podobně a o produkty indukující senzibilitu na vnější činidlo — (sebevražedné geny: thymidin-kináza, cytosin-deamináza a po- “ dobně) nebo také o vražedné geny schopné indukovat buněčnou smrt (Grb3-3 (PCT/FR94/00542), ScFv anti-ras (WO94/29446) a podobně. Systém podle vynálezu ve skutečnosti umožňuje produkovat zejména virální vektory obsahující tyto sekvence a to bez rizika otravy produkční buňky a potom indukovat expresi těchto toxických molekul a to selektivně v cílových buňkách majících požadovaný transaktivátor nebo transaktivační komplex. Tento typ konstrukce je tedy obzvláště vhodný pro pro-
tinádorové terapeutické strategie, jejich cílem je například selektivně zničit napadené buňky. Tento systém je rovněž obzvláště zajímavý pro expresi cytokinů, interferonů, TNF,
TGF, jejichž neregulovaná produkce by mohla mít výrazné vedlejší účinky.
Stručný popis obrázků
V následující části popisu bude vynález detailněji popsán pomocí příkladů jeho konkrétního provedení, přičemž tyto příklady mají pouze ilustrační charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně definován definicí patentových nároků.
Na připojených výkresech:
obr.1 znázorňuje zobrazení systému podmíněné exprese podle vynálezu umožňující selektivní rekrutování transaktivátoru pomocí oligomerační oblasti (A) nebo ScFv (Β) , obr.2 znázorňuje zobrazení systému podmíněné exprese podle vynálezu umožňující selektivní rekrutování transaktivačního komplexu, obr.3 znázorňuje expresní kazetu podle vynálezu zahrnující regulační sekvenci Tetop7, minimální promotor (box TATA) a gen (CAT), s obr.4 znázorňuje zobrazení expresní kazety podle vynálezu zahrnující regulační sekvenci 0R3, minimální «’ ......... ' ~ promotor (box TÁTA) a gen (CAT) , = ' obr.5 znázorňuje bispecifické chimérické molekuly podle vynálezu, obr.6 znázorňuje sekvence DNA kódující bispecifické chimérické molekuly podle vynálezu, obr.7 znázorňuje chimérické kontrolní konstrukce, obr.8 znázorňuje strukturu a funkci virálního vekto-
ru (retrovir) podle vynálezu, obr.9 znázorňuje studii interakce mezi hybridními molekulami podle vynálezu a regulační sekvencí, obr.10 znázorňuje studii interakce mezi hybridními molekulami podle vynálezu a různými formami proteinu p53, obr.11 znázorňuje prokázání aktivace kazety Tet-Luc v buňkách SAOS-2, obr.12 znázorňuje prokázání aktivace kazety Tet-Luc v buňkách H358.
Obecné techniky molekulární biologie
Klasické metody molekulární biologie, mezi které patří zejména odstředění plasmidové DNA v systému chlorid cesnýethidiumbromid, digesce restrikčními enzymy, elektroforéza na gelu, transformace v E.coli, precipitace nukleových kyselin a podobně, jsou popsané v literatuře (Maniatis a kol.,
989 ) .
Enzymy byly poskytnuty firmou New-England Biolabs (Beverly, MA). Za účelem ligaci jsou fragmenty DNA separovány podle jejich velikosti na 0,8 až 1,5% agarosovém gelu, purifikovány metodou GeneClean (BIO101, LaJolla CA) a inkubovány přes noc při teplotě 14 °C v pufru Tris-HCl, pH 7,4,50mM, MgCl2 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM, v přítomnosti DNA-ligázy fágu T4.
Amplifikace reakcí PCR (Polymerase Chain Reaction) byla rovněž provedena podle Maniatis-e a kol (1989) při dodržení následujících podmínek:
- koncentrace MgCl2 upravena na 8mM,
- denaturační teplota 95 °C, hybridizační teplota 55 °C, alongační teplota 72 °C. Tento cyklus byl opakován 25 krát v zařízení PE9600 Thermalcycler (Perkin Elmer, Norwalk CO).
Oligonukleotidy se syntetizují za použití chemie fos• · foramiditů chráněných v poloze beta kyanoethylovou skupinou (Sinha a kol.,1984, Giles 1985) a automatického syntetizéru DNA Applied Biosystem model 394 (Applied Biosystem, Foster City CA) při dodržení doporučení výrobce.
Sekvenování bylo provedeno na dvoukláknových matricích metodou terminace řetězců za použití fluorescenčních značkovacích činidel. Zde byla použita sekvencovací souprava Taq Sye Primer Kit dostupná u firmy Applied Biosystem (Applied Biosystem, Foster City CA) při dodržení pokynů výrobce .
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Konstrukce expresní kazety zahrnující regulační sekvenci, minimální transkripční promotor a gen
1.1 Konstrukce plasmidu pTETop7/CAT
Plasmid pTETop7/CAT obsahuje následující prvky (obr.3):
- regulační sekvenci tvořenou sekvencí interakce s tetracyklinovým supresorem tetR sestávající ze sedmi opakovanými motivy Tetop (SEQ ID n°1),
- minimální promotor odvozený od promotoru genu thymidin-kinázy (oblast -37 až + 19 nesoucí box TATA),
-...sekvenci _ kódu j_íc í chloramfenicolacetyl-transferá zu______ (CAT) pod kontrolou uvedeného minimálního promotoru.
Tento plasmid byl konstruován klonováním fragmentu Smal-BglII plasmidu pUHD10-7 (WO 94/29442) v plasmidu pKK232-8 (Pharmacia), který byl předběžně digerován restrikčními enzymů Smál a BamHI.
1.2. Konstrukce plasmidu pOR^/CAT
Plasmid pOR3/CAT obsahuje následující prvky (obr.4):
• · · • · 4 ·· ··
- regulační sekvenci tvořenou sekvencí 0R3 interakce s represorem Cro (SEQ ID n°2 ) ,
- minimální promotor odvozený od promotoru genu thymidin-kinázy (oblast -37 až 19 nesoucí box TATA),
- sekvence kódující chloramfenikolacetyl-transferázu (CAT) pod kontrolou uvedeného minimálního promotoru.
Tento plasmid byl konstruován následujícím způsobem: sekvence 0R3 interakce s represorem Cro byla syntetizována uměle. Za tím účelem byly syntetizovány dva následující oligonukleotidy:
Oligo 5533 (SEQ ID n°22): 5' -GAT.CCTATCACCGCAAGGGATAA-3 ’
Oligo 5534 (SEQ ID n°23): 3'-GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA-5'.
Oba tyto olígonukleotidy byly potom hybridizovány za účelem rekonstituování dvouvláknové sekvence 0R3 lemované sekvencemi umožňujícími její klonování orientované následujícím způsobem:
CATCCTATCAGCGCAAGGGATAA
GATAGTGGCGTTCCCTATTTCGA.
1.3. Konstrukce expresní kazety toxických genů
Expresní kazety toxických genů se získají z výše popsaných plasmidů (1.1. a 1.2.) nahrazením sekvence CAT sekvencí kódující toxický produkt, výhodně gen Grb3-3 (PCT/FR94/00542), gen thymidin-kinázy, gen kódující difterický toxin nebo pseudomonas, a podobně.
Příklad 2
Konstrukce specifických jednovláknových protilátek pro p53
Tato jednovláknová protilátka se konstruuje podle následujícího protokolu:
DNAc kódující oblasti VH a VL byly získány z hybridomu ·· ···· ·· ···«
Λ ·
- zy pAb421 produkujícího prorilátku anti-p53. Za tímto účelem byly totální RNA uvedeného hybridomu extrahovány a podrobeny inverzní transkripční reakci za použití nahodilých hexamerů ve funkci zárodečných subjektů. Použití tohoto typu zárodečného subjektu umožňuje vyvarovat se použití specifických zárodečných subjektů imunoglobulinů. Získané klony DNAc ma dostatčnou délku pro klonování oblastí V. Nicméně v případě, že představují malou frakci z přítomných totálních DNAc, potom musí být provedena předběžná amplifikační reakce za účelem produkování množství DNA dostatečného pro klonování. Za tím účelem se DNAc kódující oblasti VH a VL aplifikují odděleně. Použitými zárodečnými subjekty jsou oligonukleotidy hybridizující v úrovni opačných konců variabilních oblastí každého řetězce (H a L). Amplifikačním produktem užívajícím specifické zárodečné subjekty těžkých řetězců je fragment obsahující asi 340 párů bází. Amplifikační produkt používající specifické zárodečné subjekty lehkých řetězců je tvořen fragmentem obsahujícím asi 325 párů bází.
Po purifikaci se DNAc kódující oblasti VH a VL protilátky sestaví do jediného řetězce pomocí nukleotidového ramene (L). Toto nukleotidové rameno je konstruováno takovým způsobem, že jeden z konců se váže na konec 3' DNAc kódující oblast VH a druhý konec se váže na konec 5' DNAc kódující oblast VL. Sekvence ramene kóduje peptid SEQ ID n°5. Sestavená sekvence s asi 700 páry bází obsahuje ve formě fragmentu »* Ncol-Notl, řetězec VH-L-VL, jehož sekvence je reprezentována sekvencí SEQ ID n°4 (aminokyseliny 9 až 241). Tato sekvence ff rovněž zahrnuje na konci Č sekvenci tag odvozenou od myc (zbytky 256 až 266).
Příklad 3
Konstrukce sekvencí nukleových kyselin kódujících bispecifické chimérické molekuly obsahující oblast vazby k transaktivátoru tvořenou jednovláknovou protilátkou (ScFv)
3.1. Konstrukce plasmidu obsahujícího sekvenci ScFv-mycHinge-TetR nebo Cro (obr.5A a obr.6)
Nejdříve byl fragment Ncol-Notl obsahující DNAc kódující ScFv anti-p53 klonován v plasmidu typu pUC19. Potom se za tento fragment vloží sekvence kódující epitop VSV (SEQ ID n°7) nebo myc (SEQ ID n°8 ) .
Sekvence kódující proteiny TetR a Cro se potom získají následujícím způsobem:
- Sekvence kódující TetR byla získána amplifikací z matečného plasmidu nesoucího sekvenci tetR za použití následujících oligonukleotidů:
Oligo 5474 (SEQ ID n°10):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGTCCAGATTAGATAAAAGTAAAG
Oligo 5475 (SEQ ID n°11):
CGTACGGAATTCGGGCCCTTACTCGAGGGACCCACTTTCACATTT
AAGTTG
Tyto oligomery rovněž přinášejí sekvenci kódující pepti dové rameno Hinge spojující obě funkční oblasti molekul.
Amplifikovaný fragment tedy obsahuje sekvenci kódující peptidové rameno a oblast vazby k DNAtetR. Tento fragment se klonuje do míst Xbal-EcoRI získaného plasmidu za účelem generování plasmidu obsahujícího sekvenci kódující molekulu ScFv-myc-Hinge-TetR (obr.6).
- Sekvence kódující Cro byla získána amplifikací na DNA-matrici bakteriofágu Lambda za použití následujících oligonukleotidů :
Oligo 5531 (SEQ ID n°12):
GGCTCTAGACCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAACGCG
TGGATCCATGGAACAACGCATAACCCTGAAAG
Oligo 5532 (SEQ ID n°13):
ACTCGG
Tyto oligonukleotidy přináší rovněž sekvenci kódující peptidové rameno Hinge spojující obě funkční oblasti molekuly
Amplifikovaný fragment tedy obsahuje sekvenci kódující peptidové rameno a oblast vazby s DNA Cro. Tento fragment byl klonován do míst Xbal-EcoRI výše uvedeného získaného plas midu za účelem generování plasmidu obsahujícího sekvenci kódující molekulu ScFv-myc-Hinge-Cro (obr.6).
3.2. Konstrukce plasmidu obsahujícího sekvenci ScFv-HingeTetR nebo Cro (obr.5B)
Tento příklad popisuje konstrukci plasmidů nesoucích sekvenci kódující bispecifickou chimérickou molekulu podle vynálezu zbavenou sekvence tag
Tyto plasmidy byly získány z plasmidů popsaných v 3.1. digescí enzymy Notl a Xbal. Tato digesce umožňuje vyštípnout fragment.nesoucí oblast kódu jící tag myc. = ~·· ·
3.3 Konstrukce plasmidu zahrnujícího sekvenci ScFv-TetR nebo Cro (obr.5C)
Tento příklad popisuje konstrukci plasmidů nesoucích sekvenci kódující bispecifickou chimérickou molekulu podle vynálezu nemající rameno a sekvenci tag.
·· ···· z plasmidů popsaných v Tato digesce umožňuje vy- 32 Tyto plasmidy byly získány
3.1. digescí enzymy Notl a BamHI.
štípnout fragment nesoucí oblast kódující tag myc a peptidové rameno Hinge.
Příklad 4 ·/ Konstrukce sekvencí nukleových kyselin kódujících bispecifické chimérické molekuly obsahující oblast vazby k transaktiváf toru tvořenou oligomerační oblastí
4.1. Klonování oligomerační oblasti proteinu p53 (fragment
320-393)
DNAc kódující oligomerační oblast proteinu p53 (SEQ ID n°3) byla získána amplifikaci reakcí PCR na plasmidu nesoucím DNAc divokého lidského p53 za použití následujících oligonukleotidů:
Oligo 5,535 (SEQ ID n°14):
CAGG£QAI££CATGAAGAAACCACTGGATGGAGAA (podtržená část představuje místo Ncol)
Oligo 5536 (SEQ ID n°15):
i' *'
........... CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCGTGTGAGTCAGGCCCTTC „ (podtržená část: místo BamHI; dvakrát podtržená část: místo Xbal; tučně napsaná část: Notl).
4.2. Plasmidy p53 320/393-myc-Hinge-TetR nebo Cro (obr.SA) byly získány klonováním výše uvedeného amplifikovaného fragmentu ve formě fragmentu Ncol-Notl do míst odpovídajících « ··· plasmidům popsaným v příkladu 3.1. v náhradu za oblast kódující ScFv.
4.3. Plasmidy p53 320/393-Hinge-TetR nebo Cro (obr.5B) byly získány klonováním aplifikovaného fragmentu z 4.1. ve formě fragmentu Ncol-Xbal do míst odpovídajících plasmidům popsaným v 3.1 v náhradu za oblast kódující ScFv a tag.
4.4. Plasmidy p53 320/393-TetR nebo Cro (obr.5C) byly získány klonováním fragmentu amplifikovaného v 4.1. ve formě fragmentu NcoI-BamHI do míst odpovídajících plasmidům popsaným v příkladu 3.1 v náhradu za oblast kódující ScFv, tah a Hinge.
4.5. Plasmidy tetR nebo Cro- p53 320/393 (obr.5D) nebo tetR nebo Cro-Hinge-p53 320/393 (obr.5E) byly získány klonováním fragmentů amplifikováných reakcí PCR na plasmidu nesoucím DNAc divokého lidského p53 za použití oligo 5537/5539 nebo 5538/5539 digerovaných Xhol/EcoRI do plasmidu popsaných v 3.1, předběžně digerovaných enzymy Xhol/EcoRI.
Oligo 5537 (SEQ ID n°16):
CAGGCTCGAGAAGAAACCACTGGATGGAGAA
Oligo 5538 (SEQ ID n°17):
CAGGCTCGAGCCCAAGCCCAGTACCCCCCCAGGTTCTTCAAAGA AACCACTGGATGGAGAA ~ - ·” 4·—
Oligo 5539 (SEQ ID n°18):
GGTCGAATTCGGGCCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTTC
Příklad 5 ·· 9999 ·· 9 9 9 9 ·· e
Příklad 5
Konstrukce kontrolního plasmidu nesoucího sekvenci kódující chimérickou molekulu zahrnující oblast vazby k DNA (TetR nebo Cro) a transaktivátorovou oblast proteinu p53 (oblast 173)
Plasmidy p53 1/73-TetR nebo Cro s nebo bez tag (myc nebo VSV) a Hinge (obr.7A, 7B a 7C) byly získány klonováním fragmentů aplifikovaných reakci PCR z plasmidu nesoucího DNAc divokého lidského p53 za použití oligo 5661/5662 a potom digerovaných enzymy Ncol/Notl, Ncol/Xbal, NcoI/BamHI do plasmidů popsaných v 3.1, předběžně digerovaných enzymy Ncol/Notl, Ncol/Xbal nebo NcoI/BamHI.
Oligo 5661 (SEQ ID n°19):
CAGGCCATGGAGGAGCCGCAGTCAGATCC
Oligo 5662 (SEQ ID n°20):
CGTCGGATCCTCTAGATGCGGCCGCCACGGGGGGAGCAGCCTC
TGG
Příklad 6
Konstrukce expresních plasmidů různých hybridních molekul po« dle vynálezu — - -.. - —. -.....· -·— = . ----- .
Plasmidy použité pro expresi hybridních molekul byly získány klonováním fragmentů obsahujících DNAc kódující tyto molekuly do míst NcoI/EcoRI eukaryotického expresního vektoru pcDNA3 (invitrogen). Takto byly provedeny různé následující konstrukce:
-ScFv 421: SEQ ID n°4, ··
-TET19: hybridní protein obsahující řetězec ScFv421-VSVHinge-TetR popsaný na obr.6 podle příkladu 3.1,
-TET02: hybridní protein obsahující řetězec p53(320/393)VSV-Hinge-TetR popsaný na obr.5A podle příkladu 4.3,
-TET03: hybridní protein obsahující řetězec p53(320/393)Hinge-TetR popsaný na obr.5B podle příkladu 4.4,
-TET04: hybridní protein obsahující řetězec p53(320/393)-TetR popsaný na obr.5C podle příkladu 4.4,
-TET07: hybridní protein obsahující řetězec p53(1/73)-VSVHinge-TetR popsaný na obr.7A podle příkladu 5.
Příklad 7
Rozpoznání dvouvláknových sekvencí DNA hybridními molekulami podle vynálezu
7.1. Produkce hybridních molekul
Různé molekuly použité v tomto experimentu byly získané translací in vitro v lyzátu retikulocytů molekul popsaných v příkladu 6 za použití soupravy TNT Coupled Reticulocyte lysáte Systems (Promega) a podle experimentálního protokolu popsaného dodavatelem pro celkový reakční objem 50 mikrolitrů.
7.2. Konstrukce specifické dvouvláknové sekvence DNA
Specifická dvouvláknové sekvence DNA použitá v tomto experomentu je tvořena dvěma syntézními oligonukleotidy majícími následující sekvence:
Oligo 5997 (SEQ ID n°24):
G ATCCG ACTTTC ACTTTTCTCTATC ACTG ATAGTG AGTGGT AAACTC A • · ···· o r __ · · * · *· · ·
J u ♦ · ♦· ······ <-· «
Oligo 5998 (SEQ ID n°25):
AGCTTGAGTTTACCACTCCCTATCAGTGATAGAGAAAAGTGAAAGTCG
Oba tyto syntézní olígonukleotidy byly označeny fosforem 33 inkubací následující směsi po dobu 30 minut při teplotě 37 °C a za použití 10 pmolů každého z oligonukleotidů:
Tris-HCl pH 7,6 50 mM
MgClg 10 mM
dithiothreitol 5 mM
Spermidin 100 /UM
EDTA 100 ,uM
ATP-gama-3 3P(Amersham) 50 / /UCi (1000-3000 Ci/mmol)
T4-kináza (Boehringerú 10 U.
Potom se oba takto označené olígonukleotidy hybridizují v přítomnosti 400 mM NaCl za účelem rekonstituce následující dvouvláknové sekvence TetO (SEQ ID n°26):
GATCCGACTTTCACTTTTCTCTATCACTGATAGTGAGTGGTAAACTCA
CTAGGCTCAAAGTGAAAAGAGATAGTGACTATCACTCACCATTTGAGT
7.3. Rozpoznání dvouvláknové sekvence TetO různými hybridními molekulami podle vynálezu
Vazebná reakce k DNA se provádí v 50/Ul reakční směsi (Tris-HCl pH 7,4 10 mM, MgClg 10 mM, KCL 10 mM,.....beta-merkattoethanol 6 mM, EDTA 0,1 mM, BSA 0,5 mg/ml) přidáním sekvence
TetO (10 1θΜ) připravené v příkladu 7.2, 10 ,ul translačního / _ 8 produktu připraveného podle příkladu 7.1 a 10 M chladného kompetičního oligonukleotidů AP2 (Promega) použitého pro eliminaci nespecifické vazby. Specifičnost interakce ověří posunutím rovnováhy přidáním 1O^uM (Sigma) tetracyklinu k reakční směsi. Reakční směsi se potom inkubují po dobu 15 minut při teplotě 20 °C, načež se k ní přidá 10/Ul 50% glycerolu a finální směsi se podrobí nativní elektroforéze na 5% polyakrylamidovém gelu, přičemž se migrace provádí při 200 V a 16 °C. Gel se potom vysuší a podrobí autoradiografii.
Výsledek tohoto experimentu provedeného s hybridními molekulami TET19, TET02 a TET07 je zobrazen na obr.9. Za těchto podmínek lze pozorovat vazbu těchto třech molekul ke specifické dvouvláknové DNA-sekvenci Teto vzhledem k migračnímu zpoždění takto vázaných molekul, přičemž specifičnost této interakce je prokázána inhibicí uvedeného migračního zpoždění přidáním tetracyklinu.
Tento výsledek takto potvrzuje skutečnost, že hybridní molekuly podle vynálezu jsou schopné vázat se specifickým způsobem k nukleotidové sekvenci TetO.
Příklad 8
Specifická vazba hybridních molekul podle vynálezu k molekule mající transkripční transaktivační oblast
8.1. Produkce hybridních molekul podle vynálezu a molekul majících nebo nemajících transkripční transaktivační oblast
Pro účel tohoto experimentu byly hybridní molekuly podle vynálezu ScFv 421, TET19 a TET02 podle příkladu 6 produkovány^ translací in vitro za použití experimentálního, protokolu podle příkladu 7.1 v přítomnosti 44/UCi ^^S-methioninu (Amersham)(1175 Ci/mmol), přičemž se získají radioaktivně zna čené hybridní molekuly.
DNAc molekul majících nebo nemajících transkripční transaktivační oblast byly klonovány ve vektoru pBlueBacIII (Invitrogen) v místě BamHI. Z těchto vektorů byly produkovány a purifikovány rekombinantní baculoviry podle instrukcí výrobce. Uvedené molekuly se produkují infekcí rekombinantním
·· ···· «· « baculovirem hmyzích buněk sf9 podle experimentálního protokolu výrobce. Připraví se proteinové extrakty s finální koncentrací proteinu 10 mg/ml podle protokolu popsaného K-Ory-m a kol. (K. Ory, EMBO J., 13, 3496-3504, 1994). Těmito molekulami jsou:
- p53(1/393): divoký protein p53,
- p53(1/320): divoký protein p53 omezený na aminokyselinovou sekvenci 1 až 320 a tedy zbavenou oligomerační oblasti a oblasti rozpoznatelné monoklonální protilátky pAb421.
8.2. Vazba hybridních molekul podle vynálezu k molekulám majícím nebo nemajícím transkripční transaktivační oblast
5/Ul každého z translačních produktů připravených podle příkladu 8.1 se inkubuje s 5/Ul extraktu baculoviru připraveného podle příkladu 8.1 a 2^ug monoklonální protilátky DO1 (Oncogene Sciences), která rozpoznává N-terminální část proteinu p53, po dobu 16 hodin při teplotě 4 °C ve 100/Ul modifikovaného pufru RIPA ((K.Ory, EMBO J., 13, 3496-3504,
1994). Imunoprecipitace se provede postupem popsaným K.Ory-m a kol. (K.Ory, EMBO J., 1 3,3496-3504,1 994 ) . Komplexy zadržené protilátkou se eluují 10 minutovou inkubací při teplotě 80 °C v přítomnosti 30/Ul migračního pufru (Laemmli U.K., Nátuře, 227, 680-685, 1970) a podrobí elektroforéze na 10% polyakrylamidovém gelu v denaturačním prostředí při 200 V podle výše = popsaného protokolu (Laemmli U.Κ.,Nátuře,227, 680-685,1970). Gel se potom vysuší a vyvolá pomocí instantního zobrazovače (Packard Instruments), který umožňuje kvantitativně stanovit množství hybridních molekul majících nebo nemajících transkripční transaktivační oblast. Výsledky tohoto pokusu jsou zobrazeny na obr.10.
Za těchto podmínek se jasně ukazuje, že hybridní molekula mající ScFv 421 (TET19) rozpoznává molekulu p53(1/393 stejně dobře jako samotný ScFv 421 a že hybridní molekula mající oblast 320/393 (TET02) vykazuje stejné vlastnosti, • ·· · · < · · ····
avšak má výraznější schopnost retence proteinu p53(1/393). Kromě toho nepřítomnost signálu pozorovaného při inkubaci s molekulou p53(1/320) ukazuje, že tyto interakce jsou skutečně specifické a jsou medíované C-terminální částí proteinu p53 (aminokyseliny 320 až 393), jak bylo očekáváno.
Tyto výsledky tedy potvrzují skutečnost, že hybridní molekuly podle vynálezu jsou opravdu schopné rekrutovat transkripční transaktivační oblast nesenou molekulou, jejíž jsou specifickými partnery.
Příklad 9
Funkční rekrutování transkripční transaktivační oblastí hybridními molekulami podle vynálezu
Funkční rekrutování transkripční transaktivační oblasti hybridními molekulami podle vynálezu bylo vyhodnoceno v transaktivačním systému in vivo v buňkách SAOS-2 (lidský osteosarkom) s deficitem obou alel proteinu p53 v nádorové buněčné řadě s deficitem obou alel proteinu p53 (Maxwell a Roth, Oncogene 8, 3421, 1993) a v nádorové řadě HT29 s deficitem jedné z obou alel proteinu p53 a s jednou mutovanou alelou (mutace H273). Tento systém je založen na použití reportérového genu, který je stanovitelný enzymaticky a vložen pod kontrolu promotoru obsahujícího nukleotidové motivy specificky rozpoznatelné represorem Tet (operátor Tet).
V tomto testu se reportérovy gen LUC (luciferáza) — vloží pod kontrolu operátoru Tet a je obsažen v plasmidů pUHC13-3 (Gossen M. a Bujard H., Proč.Nati.Acad.Sci.USA,89 , 5547-5551, 1992).
9.1 Použité buněčné řady a kultivační podmínky
Buněčné řady použité v těchto experimentech, jakož i jejich genotyp připojený k proteinu p53 a použité kultivační podmínky pro jejich růst jsou uvedeny v následující tabulce:
Tabulka
Buněčné řady
Řada p53 Kultivační prostředí č.ATCC
SAOS-2 -/- Prostředí DMEM (Gibco BRL) obohacené 10 % fetálního telecího séra (Gibco BRL) HTB 8 5
H358 -/- Prostředí RPMI1640 (Gibco BRL) obohacené 10 % fetálního telecího séra (Gibco BRL)
HT29 -/H237 Prostředí DMEM (Gibco BRL) obohacené 10 % fetálního telecího séra (Gibco BRL)
9.2. Expresní plasmidy molekul majících transkripční trans
aktivační oblast
Molekulami s transkripční tranaktivátorovou oblastí „„ __ použitými při tomto experimentu jsou divoký protein p5 3 (Wt) s > z a mutanty G281 a H175 tohoto proteinu. DNAc kódující tyto tři proteiny byly vloženy do míst BamHI vektoru pcDNA3 (íntro gen) .
9.3. Intracelulární exprese hybridních molekul podle vynálezu
Hybridní molekuly podle vynálezu se exprimují v buňkách buněčné kultury dočasnou transfekcí za použití následu·♦ ····
jícího protokolu:
Buňky (3,5.10 ) se zaočkují do šesti jamkových titračních ploten obsahujících v jamce po 2 ml kultivačního prostředí a kultivují přes noc v inkubátoru při teplotě 37 °C s atmosférou obsahující 5 % oxidu uhličitého. Transfekují se potom jednotlivé konstrukce za použití lipofekAMINu (Gibco BRL) ve funkci transfekčního činidla a to následujícím způsobem:
1,5/Ug totálního plasmidu se inkubuje (z toho je 0,25/g reportérového plasmidu) s 5/Ul lipofekAMINu po dobu 30 minut se 2 ml kultivačního prostředí (transfekční směs). V průběhu této doby se buňky dvakrát promyjou PBS a potom inkubují po dobu 4 hodin při teplotě 37 °C s tranfekční směsí, načež se tranfekční směs odsaje a nahradí 2 ml kultivačního prostředí obohaceného 10 % fetálního telecího séra ínaktívovaného teplem a buňky se kultivují po dobu 48 hodin při teplotě 37 °C.
9.4 Detekce aktivace transkripce
Aktivace transkripce spojená s funkčním rekrutováním transkripčního transaktivátoru se detekuje a kvantitativně vyhodnotí změřením aktivity luciferázy kódované genem LUC za použití soupravy Luciferase Assay System (Promega) podle protokolu dodaného výrobcem.
9.5. Funkční rekrutování transkripční transaktivační oblasti molekulami podle vynálezu
Tento experiment byl provede za použití molekul TETO2, TET03 a TET07 podle příkladu 6. Při tomto experimentu slouží molekula TET07 jako pozitivní kontrolní subjekt vzhledem k tomu, že má svou vlastní transkripční transaktivátorovou oblast.
Získané výsledky v buňkách SAOS-2, které jsou uvedeny na obr.11, ukazují, že molekula TET07 je opravdu samotná schop na aktivovat transkripci genu LUC vloženého pod kontrolu oprrátoru Tet a to na rozdíl od konstrukce TET02. To je v souladu se skutečností, že tato buněčná řada neobsahuje endogenní
Β *
- 42 protein ρ53, který takto tedy nemůže být rekrutován molekulou TET02. Naopak zavedení divokého proteinu p53 nebo jeho mutantu, které samy o sobě neprodukují signál, je schopné generovat transkripční aktivitu v přítomnosti molekul TETO2. Takový výsledek nelze pozorovat u mutantu H175, který je v li teratuře popsán jako mutant mající nefunkční transkripční transaktivační oblast.
Tento výsledek získaný u buněčné řady SAOS-2 s molekulou TETO2 mohl být reprodukován u nádorové .buněčné řady také neobsahující endogenní p53 (buňky H358) a mohl být rozšířen i na molekuly TET03 a TET04 (obr.12).
Za účelem potvrzení těchto výsledků v kontextu různých buněčných řad byly molekula TET02, jakož i pozitivní kontrolní subjekt TET07 exprimovány v buňkách HT29, které mají mutantní endogenní protein p53 (H273), zatímco negativní kontrolní subjekt tohoto experimentu spočívá v transfekci prázdného vektoru pcDNA3. Výsledek tohoto experimentu, uvedený v dále zařazené tabulce, ukazuje, že molekula TET02 je opravdu schopna rekrutovat transkripční transktivační oblast endogenního proteinu p53.
Tabulka
Transkripční aktivace hybridních molekul podle vynálezu v buň kách HT29
pcDNA3 TET07 TET02
1 59 10
Soubor uvedených experimentů ukazuje, že hybridní molekuly podle vynálezu jsou opravdu schopné vázat jak sekven·· ···· ·· ··· · ce dvouvláknové DNA specifického charakteru, tak i proteiny mající transkripční transaktivační oblast a že tyto molekuly jsou schopné podmíněně indukovat expresi zainteresovaných genů .
Seznam sekvencí

Claims (26)

1 . Bispecifická chimérická molekula obsahující oblast schopnou selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci a detekční oblast schopnou specificky vázat transaktivátor nebo transrepresor nebo transaktivátorový nebo transrepresorový komplex, který je charakteristický pro fyziologický nebo fyziopatologický stav.
2. Molekula podle nároku 1 , v y z n a č e n á tím, že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je odvozena od proteinu schopného interakce s uvedenou DNA.
3. Molekula podle nároku 2,vyznačená tím, že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je odvozena od eukaryotického proteinu.
4. Molekula podle nároku 3,vyznačená tím, že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je odvozena od proteinů p53, STÁT nebo NFkB.
5. Molekula podle nároku 2,vyznačená tím, že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je odvozena od prokaryotického proteinu.
6. Molekula podle nároku 5, vyznačená tím, že prokaryotickým proteinem je bakteriální represor.
• · · · · · • ·
7. Molekula podle nároku 6,vyznačena tím že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je odvozena od proteinu tetR.
8. Molekula podle nároku 6,vyznačená tím že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvencí je odvozena od proteinu Cro.
9. Molekula podle některého z nároků 2 až 8, v y z n a č e n á t i m , že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci obsahuje oblast interakce s DNA uvedeného proteinu.
10. Molekula podle některého z nároků 2 až 8, vyznačená tím, že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je tvořena úplným proteinem.
11. Molekula podle nároku 10,vyznačená tím, že oblast schopná selektivně vázat definovanou DNA-sekvenci je tvořena proteinem tetR.
12. Molekula podle nároku 10,vyznačená tím, že oblast_s_chopná selektivně vázat definpyanou, DNA-sekvenci je tvořena proteinem Cro.
13. Molekula podle nároku 1,vyznačená tím, že oblast schopná specificky vázat transaktivátor neno transre.presor nebo tranaktivátorový nebo transrepresorový komplex je oligomerační oblastí.
•9 999·
14. Molekula podle nároku 13,vyznačená tím, oligomerační oblastí je leucinový zip, oblast SH3 nebo oblast SH2.
15. Molekula podle nároku 13, vyznačená tím, že oligomerační oblast schopná specificky vázat transaktivátor je tvořena C-terminální částí proteinu p53.
16. Molekula podle nároku 15,vyznačená tím, že oligomerační oblast je tvořena C-terminální částí proteinu p53 počínaje zbytkem 320 a konče zbytkem 393 (SEQ ID n°3), nebo počínaje zbytkem 302 a konče zbytkem 360 anebo počínaje zbytkem 302 a konče zbytkem 390.
17. Molekula podle nároku 1,vyznačená tím, že oblast schopná specificky vázat transaktivátor nebo transrepresor nebo transaktivátorový nebo transrepresorový komplex je syntetickou nebo přírodní oblastí, o které je známo, že vstupuje v interakcí s uvedeným transaktivátorem nebo transrepresorem nebo transaktivátorovým nebo transrepresorovým komplexem.
18. Molekula podle nároku 1,vyznačená tím, že oblast schopná specificky vázat transaktivátor nebo transrepresor nebo transaktivátorový nebo transrepresorový komplex je protilátkou nebo fragmentem nebo derivátem protilátky, které jsou řízeny proti uvedenému transaktivátoru nebo transrepresoru nebo transaktivátorovému nebo tranrepresorovému komplexu.
19. Molekula podle nároku 18, vyznačená tím, že oblast schopná specificky vázat transaktivátor nebo transaktivátorový komplex je tvořena fragmentem Fab nebo F(ab)'2 r* ·· ···· protilátky nebo oblastí VH nebo VL protilátky.
20. Molekula podle nároku 18,vyznačená tím, že oblast schopná specificky vázat transaktivátor nebo transaktivátorový komplex je tvořena jednovláknovou protilátkou (ScFv) obsahující oblast VH spojenou s oblastí VL ramenem.
21. Molekula podle nároku 1,vyznačená tím, že oblast vazby k DNA a oblast vazby k transaktivátoru jsou vzájemně spojené prostřednictvím ramene.
22. Molekula podle nároku 21,vyznačená tím, že rameno je tvořeno peptidem obsahujícím 5 až 30 aminokyselin, výhodně 5 až 20 aminokyselin.
23. Molekula podle nároku 22,vyznačená tím, že rameno je zvoleno z množiny zahrnující peptidy se sekvencemi SEQ ID n°5 a SEQ ID n°6.
24. Molekula podle některého z předcházejících nároků, vyznačená tím, že oblast vazby k DNA je situována v N-terminální poloze, zatímco oblast vazby k transaktivátoru je situována v C-terminální poloze.
25. Molekula podle některého z nároků 1 až 23, v y z n ačená tím, že oblast vazby k DNA je situována v C-terminální poloze, zatímco oblast vazby k transaktivátoru je situována v N-terminální poloze.
26. Bispecifická chimérická molekula mající strukturu
ScFv-VSV/myc-Hinge-TET nebo Cro (obr.5A).
·· ···· • · · • · · • · · • · · · • · · · • 4 • · · · 4 · 4 4 · · 4 4 44· 44· • · ··· · • · · • · · • · · · • · • · · - 58 - 27. ScFv Bispefifická chimérická molekula -Hinge-TET nebo Cro (obr.5B). mající strukturu 28. TET Bispecifická chimérická molekula nebo Cro (obr.5C). mající strukturu ScFv- 29. TET Bispecifická chimérická molekula nebo Cro-ScFv (obr.5D). mající strukturu 30. TET Bispecifická chimérická molekula nebo Cro-Hinge-ScFv (obr.5E). mající strukturu 31 . Bispecifická chimérická molekula mající strukturu Oli-
gom-VSV/myc-Hínge-TET nebo Cro (obr.5A), Oligom-Hinge-TET nebo Cro (obr.5B) nebo Oligom-TET nebo Cro (obr.5C).
32. Sekvence nukleové kyseliny kódující chimérickou molekulu podle některého z nároků 1 až 31.
33. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 32, vyznačená t í m , že se jedná o sekvenci DNA.
34. Sekvence nukleové kyseliny podle nároku 32 nebo 33, vyznačená tím, že tvoří součást vektoru.
35. Systém podmíněné exprese genů zahrnující:
- chimérickou molekulu definovanou v nárocích 1 až 31 a
- expresní kazetu obsahující regulační sekvenci, minimální transkripční promotor a uvedený gen.
36. Systém podmíněné exprese podle nároku 35, vy z n ačený tím, že oblast vazby k DNA chimérické molekuly je tvořena celkem nebo částí TetR a regulační sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID n°1 nebo derivát této sekvence, které še případně několikrát opakují.
37. Systém podmíněné exprese podle nároku 35, v y z n a čený tím, že oblast vazby k DNA chimérické molekuly je tvořena celkem nebo částí Cro a regulační sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID n°2 nebo její derivát, které se případně několikrát opakují.
38. Systém podmíněné exprese podle některého z nároků 35 až 37,vyznačený tím, že minimální promotor obsahuje box TATA nebo INR.
39. Systém podmíněné exprese podle nároku 38, v y z n a čený tím, že minimální promotor je odvozen od promotoru genu thymidin-kinázy.
40. Systém podmíněné exprese podle nároku 39, v y z n a čený tím, že minimální promotor je tvořen nukleotidy -37 až +19 promotoru genu thymidin-kinázy.
41. Vektor obsahující:
- sekvenci nukleové kyseliny kódující chimérickou molekulu podle některého z nároků 1 až 31 a
- expresní kazetu obsahující regulační sekvenci, minimální transkripční promotor a zainteresovanou kódující sekvenci.
42.
Vektor podle nároku 41, vyznačený tím, ·· ···· ·· ····
- 60 že minimální transkripční promotor je definován v nárocích 38 až 40.
43. Vektor podle nároku 41, vyznačený tím, že oblast vazby k DNA chimérické molekuly je tvořena celkem nebo částí TetR a regulační sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID n°1 nebo její derivát, které se případně několikrát opakují.
44. Vektor podle nároku 41, vyznačený tím, že oblast vazby k DNA chimérické molekuly je tvořena celkem nebo částí Cro a regulační sekvence obsahuje sekvenci SEQ ID n°2 nebo její derivát, které se případně několikrát opakují.
45. Vektor podle některého z nároků 41 až 44, vy z n ačený tím, že zainteresovanou kódující sekvencí je sekvence DNA kódující terapeutický produkt.
46. Vektor podle nároku 45, vyznačený tím, že terapeutickým produktem je toxický peptid nebo polypeptid.
47. Vektor podle nároku 46,vyznačený tím, že toxický terapeutický produkt je zvolen z množiny zahrnují= cí - dif terický toxin, toxin pseudomonas, ricin A, ’ thymid i.n- ' ” kinázu, cytosin-deaminázu, protein Grb3 a ScFv Y28.
48. Vektor podle některého z nároků 41 až 47, vyznačený t í m , že se jedná o plasmidový vektor.
Vektor podle některého z nároků 41 až 47, vyzná49.
·· «·· · čený tím, že se jedná o virální vektor.
50. Vektor podle nároku 49,vyznačený tím, že se jedná o defektní rekombinantní adenovir.
51. Vektor podle nároku 49, vyznačený tím, že se jedná o rekombinantní defektní retrovir.
52. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje alespoň jeden vektor podle některého z nároků 41 až 51 .
53. Nukleová kyselina obsahující sekvenci SEQ ID n°4.
54. Molekula podle nároku 1,vyznačená tím, že transaktivátorem charakteristickým pro fyziologický nebo fyziopatologický stav je protein virálního, parazitního, mykobakteriálního nebo buněčného původu mající transkripční transaktivační aktivitu.
55. Molekula podle nároku 54,vyznačená tím, že transaktivátorem je virální protein zvolený z množiny zahrnující protein Tat viru HIV, proteiny E6/EZ viru papilomu a protein EBNA viru Epsteina a Barrové.
56. Molekula podle nároku 54,vyznačený tím, že transaktivátorem je buněčný protein, výhodně mutovaný nebo divoký protein p53.
57. Molekula podle nároku 1,vyznačená tím, transaktivátorem nebo transaktivátorovým komplexem charakteristickým pro fyziologický nebo fyziopatologický stav je protein vyskytující se v infikované nebo hyperproliferační buňce.
Zastupuje :
CZ973080A 1995-03-31 1996-03-29 Systém podmínění exprese CZ308097A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9503841A FR2732348B1 (fr) 1995-03-31 1995-03-31 Systeme d'expression conditionnel

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ308097A3 true CZ308097A3 (cs) 1998-01-14

Family

ID=9477639

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ973080A CZ308097A3 (cs) 1995-03-31 1996-03-29 Systém podmínění exprese

Country Status (15)

Country Link
EP (1) EP0817845A1 (cs)
JP (1) JPH11503011A (cs)
KR (1) KR19980703439A (cs)
AU (1) AU716748B2 (cs)
BR (1) BR9607928A (cs)
CA (1) CA2214451A1 (cs)
CZ (1) CZ308097A3 (cs)
FR (1) FR2732348B1 (cs)
HU (1) HUP9801221A3 (cs)
IL (1) IL117713A0 (cs)
NO (1) NO974449D0 (cs)
SK (1) SK131197A3 (cs)
TW (1) TW496873B (cs)
WO (1) WO1996030512A1 (cs)
ZA (1) ZA962506B (cs)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0878546A1 (en) * 1997-04-15 1998-11-18 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or apoptin
EP0872552A1 (en) * 1997-04-15 1998-10-21 Leadd B.V. A gene delivery vehicle expressing the apoptosis-inducing proteins VP2 and/or Apoptin
US6881571B1 (en) 1998-03-11 2005-04-19 Exonhit Therapeutics S.A. Qualitative differential screening
FR2775984B1 (fr) 1998-03-11 2006-09-15 Bioscreen Therapeutics Sa Criblage differentiel qualitatif
FR2755144B1 (fr) * 1996-10-29 1998-11-27 Rhone Poulenc Rorer Sa Fragments d'anticorps a chaine unique anti-p53 et utilisation
US6852703B1 (en) * 1997-06-04 2005-02-08 Oxford Biomedica (Uk) Limited Tumor targeted vector
US7276488B2 (en) 1997-06-04 2007-10-02 Oxford Biomedica (Uk) Limited Vector system
US6479653B1 (en) * 1997-08-26 2002-11-12 Ariad Gene Therapeutics, Inc. Compositions and method for regulation of transcription
WO1999028502A1 (en) * 1997-11-28 1999-06-10 Invitrogen Corporation Single chain monoclonal antibody fusion reagents that regulate transcription in vivo
FR2782732A1 (fr) * 1998-08-28 2000-03-03 Transgene Sa Systeme d'expression inductible
US7691370B2 (en) 1998-10-15 2010-04-06 Canji, Inc. Selectivity replicating viral vector
JP2003515323A (ja) 1999-11-18 2003-05-07 オックスフォード バイオメディカ（ユーケイ）リミテッド 抗 体
GB0015090D0 (en) * 2000-06-20 2000-08-09 Implyx Ltd Gene-activating conjugates
AU2002349204A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-10 University Health Network Self-assembling p53 peptides as gene delivery vehicles
AU2003229998A1 (en) 2002-05-10 2003-11-11 Medical Research Council Activation induced deaminase (aid)

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1990007936A1 (en) * 1989-01-23 1990-07-26 Chiron Corporation Recombinant therapies for infection and hyperproliferative disorders
WO1994004672A1 (en) * 1992-08-26 1994-03-03 Dnx Corp. Tetracycline repressor-mediated binary regulation system for control of gene expression in transgenic animals
GB9224784D0 (en) * 1992-11-26 1993-01-13 Univ Dundee Cellular protein
US5866755A (en) * 1993-06-14 1999-02-02 Basf Aktiengellschaft Animals transgenic for a tetracycline-regulated transcriptional inhibitor
JPH09500526A (ja) * 1993-06-14 1997-01-21 ベーアーエスエフ アクツィエンゲゼルシャフト テトラサイクリン反応性プロモーターによる真核細胞の遺伝子発現の厳密な制御
FR2710074B1 (fr) * 1993-09-15 1995-12-08 Rhone Poulenc Rorer Sa Gène GRB3-3, ses variants et leurs utilisations.

Also Published As

Publication number Publication date
IL117713A0 (en) 1996-07-23
MX9706928A (es) 1997-11-29
KR19980703439A (ko) 1998-11-05
NO974449L (no) 1997-09-26
BR9607928A (pt) 1998-06-09
TW496873B (en) 2002-08-01
EP0817845A1 (fr) 1998-01-14
NO974449D0 (no) 1997-09-26
AU716748B2 (en) 2000-03-02
ZA962506B (en) 1996-10-01
FR2732348A1 (fr) 1996-10-04
HUP9801221A3 (en) 1999-09-28
SK131197A3 (en) 1998-05-06
AU5402096A (en) 1996-10-16
FR2732348B1 (fr) 1997-04-30
JPH11503011A (ja) 1999-03-23
HUP9801221A2 (hu) 1998-08-28
WO1996030512A1 (fr) 1996-10-03
CA2214451A1 (fr) 1996-10-03

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ308097A3 (cs) Systém podmínění exprese
AU752129B2 (en) Chimeric transcriptional activators and compositions and uses related thereto
CZ298806B6 (cs) Použití slouceniny schopné alespon cástecne inhibovat onkogenní aktivitu, virální vektor obsahujícísekvenci nukleové kyseliny kódující tuto slouceninu a farmaceutická kompozice obsahující tuto slouceninu
KR19980703454A (ko) 바이러스 벡터 및 과다증식성 질환, 특히 재발협착증을치료하기 위한 이의 용도
KR100501881B1 (ko) 피53단백질변이체및이의치료적용도
US20050233963A1 (en) Heat shock response and virus replication
US20030143731A1 (en) Use of heterologous transcription factors in gene therapy
Gitlin et al. Transcriptional activation of the human T-lymphotropic virus type I long terminal repeat by functional interaction of Tax1 and Ets1
WO1997011972A1 (en) Chimeric dna-binding/dna methyltransferase nucleic acid and polypeptide and uses thereof
WO1997011972A9 (en) Chimeric dna-binding/dna methyltransferase nucleic acid and polypeptide and uses thereof
US6759231B2 (en) Phage with nuclear localization signal
CZ145599A3 (cs) Způsob obnovení translační aktivity závislé na p53 v buňkách, jednořetězcové protilátky proti p53 a DNA, které je kódují, jejich použití a prostředky, které je obsahují
KR20020057975A (ko) 유전자 도입 방법
SK56198A3 (en) Use of protein gax for treating cancer
CN114729021B (zh) 能破坏细胞的氨基酸序列及相关核苷酸序列和相关的应用
MXPA97006928A (es) Sistema de expresion condicional
US6432701B1 (en) Derived tyrosine hydroxylase gene expression system
SK51199A3 (en) Polypeptides comprising gax protein domains, involved in repressing transcription and/or interacting with other proteins, corresponding nucleic acids and their use
AU2003245342A1 (en) Control sequences of the human corin gene
CZ291533B6 (cs) Deriváty proteinu p62, nukleové kyseliny kódující tyto deriváty a farmaceutické kompozice, které je obsahují
CA2293733A1 (en) Mycardium-and skeletal muscle-specific nucleic acid, its preparation and use
Ghattas Footprinting in vivo of the Rous sarcoma virus transcription control region
Song Vitamin D binding protein gene: Transcriptional regulation and physical mapping of its multigene locus

Legal Events

Date Code Title Description
PD00 Pending as of 2000-06-30 in czech republic