CZ308138B6 - Nosič pro kultivaci buněk a způsob jeho přípravy - Google Patents
Nosič pro kultivaci buněk a způsob jeho přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308138B6 CZ308138B6 CZ2017-256A CZ2017256A CZ308138B6 CZ 308138 B6 CZ308138 B6 CZ 308138B6 CZ 2017256 A CZ2017256 A CZ 2017256A CZ 308138 B6 CZ308138 B6 CZ 308138B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- layer
- collagen
- wells
- plate
- porous substrate
- Prior art date
Links
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims abstract description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 141
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 84
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims abstract description 17
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims abstract description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 16
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims abstract description 12
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims abstract description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 claims description 101
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 claims description 101
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 claims description 101
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 40
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 18
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 claims description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 10
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 8
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 claims description 7
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 claims description 7
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 7
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 7
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 7
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 7
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 7
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 claims description 7
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 claims description 7
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims description 6
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 claims description 5
- 108010022355 Fibroins Proteins 0.000 claims description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 5
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 claims description 5
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 claims description 5
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 5
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 5
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 5
- -1 SiO2 metals Chemical class 0.000 claims description 4
- 229920001400 block copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 4
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 claims description 4
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 4
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 claims description 4
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 claims description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 4
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 claims description 4
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 claims description 4
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 4
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 3
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 claims description 2
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 claims description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920000331 Polyhydroxybutyrate Polymers 0.000 claims description 2
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 claims description 2
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 2
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 229910052681 coesite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052906 cristobalite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 claims description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000002082 metal nanoparticle Substances 0.000 claims description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 claims description 2
- 239000002071 nanotube Substances 0.000 claims description 2
- 239000013110 organic ligand Substances 0.000 claims description 2
- 239000011224 oxide ceramic Substances 0.000 claims description 2
- 229910052574 oxide ceramic Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 claims description 2
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 claims description 2
- 239000005015 poly(hydroxybutyrate) Substances 0.000 claims description 2
- 229920002635 polyurethane Polymers 0.000 claims description 2
- 239000004814 polyurethane Substances 0.000 claims description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052709 silver Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000008107 starch Substances 0.000 claims description 2
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 claims description 2
- 229910052682 stishovite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 229910052905 tridymite Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims 1
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 claims 1
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 71
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 71
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 39
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 39
- 239000012456 homogeneous solution Substances 0.000 description 28
- 229940096423 bovine collagen type i Drugs 0.000 description 24
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 19
- 238000010603 microCT Methods 0.000 description 19
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 18
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 18
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 17
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 6
- 239000002121 nanofiber Substances 0.000 description 6
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 229920002201 Oxidized cellulose Polymers 0.000 description 3
- NTECHUXHORNEGZ-UHFFFAOYSA-N acetyloxymethyl 3',6'-bis(acetyloxymethoxy)-2',7'-bis[3-(acetyloxymethoxy)-3-oxopropyl]-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-5-carboxylate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(C(=O)OCOC(C)=O)=CC=C2C21C1=CC(CCC(=O)OCOC(C)=O)=C(OCOC(C)=O)C=C1OC1=C2C=C(CCC(=O)OCOC(=O)C)C(OCOC(C)=O)=C1 NTECHUXHORNEGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 229940107304 oxidized cellulose Drugs 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 229920001222 biopolymer Polymers 0.000 description 2
- 210000003855 cell nucleus Anatomy 0.000 description 2
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001878 scanning electron micrograph Methods 0.000 description 2
- 238000012604 3D cell culture Methods 0.000 description 1
- 229920000569 Gum karaya Polymers 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 102000004067 Osteocalcin Human genes 0.000 description 1
- 108090000573 Osteocalcin Proteins 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 239000005313 bioactive glass Substances 0.000 description 1
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000001218 confocal laser scanning microscopy Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001523 electrospinning Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 235000010494 karaya gum Nutrition 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
- C12M23/02—Form or structure of the vessel
- C12M23/12—Well or multiwell plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
- C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
- C12M25/06—Plates; Walls; Drawers; Multilayer plates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0062—General methods for three-dimensional culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0068—General culture methods using substrates
- C12N5/0075—General culture methods using substrates using microcarriers
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Sustainable Development (AREA)
- Immunology (AREA)
- Clinical Laboratory Science (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje nosič pro kultivaci buněk, který obsahuje vícejamkovou destičku, přičemž v jamkách jsou umístěny porézní substráty, s výhodou s porozitou ≥ 90 %, upravené pro kultivaci buněk, adherující k povrchu jamek. Tento nosič lze reprodukovatelně připravit způsobem, který zahrnuje následující kroky:- nanesení vrstvy rozpouštědla do alespoň jedné jamky vícejamkové destičky a její zmražení;- nanesení do uvedené alespoň jedné jamky alespoň jedné vrstvy materiálu porézního substrátu, po nanesení každé vrstvy je materiál zmražen;- nanesení krycí vrstvy rozpouštědla do uvedené alespoň jedné jamky, její zmražení; a- lyofilizaci po nanesení každé vrstvy nebo po nanesení všech vrstev.
Description
Oblast techniky
Vynález se týká pevného nosiče obsahujícího porézní 3D substrát vhodný k růstu a testování vlastností jakýchkoliv buněk, a způsobu jeho přípravy.
Dosavadní stav techniky
Většina studií buněčných kultur se provádí na površích plošných substrátů, jako jsou např. kultivační mikrodesky, destičky pro tkáňové kultury, lahve pro kultivaci, Petriho misky atd. Zejména kultivační mikrodestičky, které obsahují velké množství malých identických jamek, jsou široce využívány, protože jsou ideální pro studium nízkého počtu buněk na velkém množství buněčných testů. Tyto desky jsou standardní jak pro analytický výzkum, tak i pro klinické diagnostické testy. Jejich nevýhoda však spočívá v omezení na 2-D kultury, kdy jsou buňky nuceny se přizpůsobit rovnému a tvrdému podkladu, který je zcela odlišný od jejich přirozeného prostředí vtkaních či orgánech in-vivo. Výhody použití troj-dimenzionálního (3D) substrátu, který by simuloval extracelulámí matrix (ECM) tkání či orgánů, byly již mnohokrát popsány v odborné literatuře. 3D substrát především umožní lepší adhezi buněk, jejich migraci, proliferaci a diferenciaci, a to především proto, že imituje přirozené mezibuněčné mikroprostředí včetně signálních cest fungujících na základě různých imunochemických interakcí.
Doposud bylo v odborné literatuře popsáno velké množství 3D nosičů buněk, které se liší jak chemickým složením, tak i jejich přípravou. Byly připraveny nosiče z polymerů a biopolymerů, z biokeramiky, bioaktivního skla, kovů kolonizovatelných buňkami i z kompozitu připravených kombinací anorganického a organického materiálu. Pro dosažení požadovaných biologických funkcí byly nosiče dále modifikovány přídavkem různých přírodních i syntetických bioaktivních látek, růstových faktorů, krevních derivátů, funkčních proteinů a dalších tak, aby co nejlépe podpořily růst nebo diferenciaci použitých buněk specifické tkáně nebo orgánu.
Biologické experimenty, diagnostika či lékařský výzkum na buněčných kulturách jsou charakterizovány velkým rozptylem získaných výsledků, což je dáno jednak adaptabilitou zkoumaných buněk na prostředí, ve kterém rostou a jednak velmi malou reprodukovatelností postupů přípravy 3D substrátů. Především velmi nízká reprodukovatelnost 3D struktury substrátů připravených z biopolymerů (kolagen, celulóza, fibroin atd.) omezuje významně spolehlivost buněčných eseji jak v tkáňovém inženýrství, tak ve výzkumu mechanismů nádorových onemocnění a způsobuje neefektivní využívání moderních analytických přístrojů schopných automaticky zpracovávat velká množství vzorků. Tato omezení je možno významným způsobem minimalizovat nalezením metody přípravy porézních substrátů s vysoce reprodukovatelnou 3D strukturou na makro-, mikro- i nano škále přímo v jamce standardizované buněčné kultivační destičky.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je 3D nosič pro kultivaci buněk, který obsahuje vícejamkovou destičku, přičemž v jamkách jsou umístěny porézní substráty upravené pro kultivaci buněk, adherující k povrchu jamek. Porézní substráty jsou trojrozměrné (3D), nikoliv plošné, tj. mají tloušťku/výšku alespoň 10 mikrometrů, a umožňují kultivaci buněk v prostoru, nikoliv jen v ploše. Porézní substráty jsou upravené pro kultivaci buněk díky konektivitě pórů. Velikost a konektivita pórů pro jednotlivé typy kultivovaných buněk odpovídá parametrům extracelulámí matrix příslušných tvrdých či měkkých tkání a orgánů, a tedy simuluje prostředí extracelulámí matrix, jejíž buňky
- 1 CZ 308138 B6 budou kultivovány. Velikost a konektivita pórů cílové tkáně i porézních substrátu jsou měřeny a vzájemně porovnávány známými metodami.
Více-jamková destička obsahuje alespoň 2 jamky, s výhodou alespoň 4 jamky, výhodněji alespoň 12 jamek. Horní hranice počtu jamek je dána technickými možnostmi, s výhodou je 10 000 jamek, výhodněji 2000 jamek. Jamky mohou mít kruhový nebo nekruhový průřez.
Porézní substrát může být umístěn v alespoň jedné jamce vícejamkové destičky, s výhodou alespoň ve čtvrtině jamek vícejamkové destičky, výhodněji alespoň v polovině jamek vícejamkové destičky, nebo ve všech jamkách vícejamkové destičky.
Vícejamková destička je s výhodou z materiálu vybraného ze skupiny zahrnující plasty, sklo, kovy, keramiku, a kombinace těchto materiálů.
Je výhodné, jestliže je distribuce velikostí pórů v porézních substrátech ve všech jamkách nosiče stejná. Je také výhodné, když jsou póry v substrátu vzájemně propojené (konektivní). S výhodou mají substráty porozitu > 90 %. Výhodněji mají substráty porozitu 95 až 99,5 %, ještě výhodněji 97 až 99,5 %.
Porézní substráty mohou sestávat z jedné nebo více vrstev. S výhodou jsou porézní substráty složeny alespoň ze dvou vrstev, lišících se porozitou, velikostí pórů a jejich konektivitou, materiálovým složením, přítomností a/nebo složením aditiv.
Velikost pórů porézního substrátu je v rozmezí 0,1 až 1000 pm, s výhodou v rozmezí 5 až 1000 pm nebo v rozmezí 100 až 2000 run nebo v rozmezí 50 až 600 pm.
Materiál porézního substrátu je s výhodou vybrán ze skupiny zahrnující proteiny extracelulámí matrix (ECM); strukturní proteiny jako je kolagen, fibrin, silk fibroin, elastin či želatina; polysacharidy jako kyselina hyaluronová a její deriváty, chitosan a jeho deriváty, škrob, pryskyřičné gumy, celulóza a deriváty celulózy; pryskyřice; syntetické biokompatibilní polymery, jako je kyselina polymléčná, polyglykolová, polyethylenglykol a jejich blokové kopolymery, polykaprolakton, polyhydroxybutyrát, polyurethany; keramické přírodní nanotrubky (např. Halloyzit); a směsi těchto materiálů. Polymery (vč. proteinů, polysacharidů a syntetických polymerů) mohou být s výhodou zesítěné. Materiál porézního substrátu může být například ve formě porézní xerogelové pěny, porézního hydrogelu, částic, vláken či nanovláken. Materiál porézního substrátu může dále obsahovat jako aditiva proteiny (zejména bioaktivní proteiny), jejich fragmenty či směsi, fosfáty či organické nebo anorganické nanočástice, např. hydroxyapatit, alfa- nebo beta-trikalcium fosfát, oxidové keramiky, např. S1O2, kovy, např. Ag, Au, Mg, zejména ve formě nanočástic, či nanočástice kovů s kovalentně či fyzikálně vázanými organickými ligandy. Za nanočástice jsou obecně považovány částice s velikostí v rozmezí 1 až 1000 nm. Aditiv může být až 50 % hmota., vztaženo na sušinu materiálu porézního substrátu, s výhodou až 30 % hmota., nebo až 20 % hmota., nebo až 10 % hmota., nebo 0,1 až 5 % hmota..
Materiály porézního substrátu jsou s výhodou vybrány ze skupiny zahrnující zejména kolagen, kolagen zesítěný EDC/NHS, polymery a kopolymery polymléčné kyseliny, polyglykolové kyseliny a/nebo polyethylenglykolu, polykaprolakton, polysacharidy (zejména chitosan a/nebo želatinu), gumy-karayi, silkilbroinu. Zvláknitelné materiály mohou být ve formě nanovláken. S výhodou obsahuje materiál porézního substrátu jako aditivum hydroxyapatit, oxidovanou celulózu, bovinní krevní destičky, bioaktivní proteiny kolagenní tkáně, kyselinu hyaluronovou, polykaprolaktuon, želatinu, růstové faktory, haloisit.
Porézní substrát má s výhodou tloušťku (výšku) alespoň 10 mikrometrů, s výhodou alespoň 100 mikrometrů, výhodněji alespoň 0,5 mm, nejvýhodněji 1 až 10 mm.
-2CZ 308138 B6
Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob přípravy nosiče pro kultivaci buněk, zahrnující následující po sobě jdoucí kroky:
- nanesení vrstvy rozpouštědla do alespoň jedné jamky vícejamkové destičky a její zmražení,
- nanesení do uvedené alespoň jedné jamky alespoň jedné vrstvy materiálu porézního substrátu, po nanesení každé vrstvy je materiál zmražen,
- nanesení krycí vrstvy rozpouštědla do uvedené alespoň jedné jamky, její zmražení, a
- lyofilizaci po nanesení každé vrstvy nebo po nanesení všech vrstev.
Materiál porézního substrátu se s výhodou nanese ve formě roztoku, suspenze, aerogelu, emulze, hydrogelu, mikročástic nebo nanovláken.
Přítomnost rozpouštědla ve spodní a horní vrstvě dovoluje řídit homogenitu povrchu substrátu v procesu lyofilizace. V konečném produktu tyto vrstvy rozpouštědla nejsou přítomny, jelikož jsou odstraněny v procesu lyofilizace.
Rozpouštědlem je s výhodou voda, výhodněji ultračistá voda. Rovnoměrné a řízené velikosti a distribuce velikostí pórů se výhodně dosahuje umístěním materiálu porézního substrátu na vrstvu zmrzlé vody umístěnou na dně jamky, následným zmražením nanesené vrstvy roztoku či gelu materiálu zamýšleného porézního substrátu. Proces je ukončen umístěním svrchní vrstvy vody na povrch takto připraveného a zmraženého vrstevnatého systému a jeho následným konečným zmražením. Zmražení může probíhat různými rychlostmi, přičemž volba této rychlosti ovlivňuje velikost, distribuci velikostí a konektivitu pórů.
Zejména v případě použití ultračisté vody jako rozpouštědla se mražení s výhodou provádí ve dvou krocích, nejprve zmražením na teplotu mezi -5 až -40 °C, a potom zmražením na teplotu mezi -20 až -60 °C.
Lyofilizace se s výhodou provádí při teplotě nižší než -70 °C, s výhodou za tlaku nižšího, než je atmosférický, výhodněji za tlaku 1000 Pa a méně. Při použití vody jako rozpouštědla probíhá proces lyofilizace, kdy led uvnitř kapilár a pórů materiálu sublimuje do plynné fáze, při teplotě a tlaku nižším, než jsou podmínky odpovídající trojnému bodu vody (kritický bod: kritická teplota Tk = 373,95 °C a kritický tlak ρκ = 22,06 MPa).
Materiál porézního substrátu může být v průběhu přípravy zesítěn pomocí síťovacích činidel vhodných pro daný materiál. Odborník v oboru bude mít dostatečné znalosti o vhodných síťovacích činidlech pro daný polymemí materiál. Například pro kolagen je jedním z vhodných síťovacích činidel EDC/NHS.
Tento způsob přípravy zajišťuje, že substrát je porézní s rovnoměrnou velikostí, distribucí velikostí pórů a jejich konektivitou reprodukovanou ve všech jamkách nosiče s tloušťkou od 10 pm po rozměr odpovídající výšce jamky. Zároveň tento způsob umožňuje reprodukovatelně řídit porozitu, velikost a distribuci velikostí pórů a konektivitu pórů. Nosiče podle vynálezu s reprodukovatelnou a ve všech jamkách, kde je substrát, stejnou průměrnou velikostí, distribucí velikostí a konektivitou pórů substrátu umožňují okamžité osazení substrátu buněčným materiálem, a tím poskytují podmínky pro získání vysoce opakovatelných a spolehlivých výsledků v biologickém a medicínském výzkumu, v tkáňovém inženýrství a v procedurách regenerativní medicíny či v diagnostice.
Způsob přípravy porézního substrátu zahrnuje vysoce kontrolovaný a reprodukovatelný proces vrstvení pro buňky netoxických polymer-kompozitních materiálů, poskytujících substráty s vysokou porozitou (> 90 %) a navzájem propojenými póry o kontrolované velikosti umožňujícími transport kyslíku a živin nezbytných pro růst buněk v celém objemu. Takový substrát se dosud nepodařilo stávajícími metodami připravit. Nosič jeví dlouhodobou skladovatelnost při uchovávání při pokojové teplotě bez významného poklesu užitných vlastností
-3 CZ 308138 B6 substrátu. Kombinace substrátu s nosičem umožňuje snadnou ruční či automatizovanou laboratorní i klinickou manipulaci.
Předkládaný vynález dále zahrnuje použití nosiče podle vynálezu pro osazení buněčným materiálem, jeho kultivaci a popřípadě následnou analýzu.
Objasnění výkresů
Obr. 1 SEM snímky povrchu porézní 3D struktury kolagenního substrátu. Vlevo dle příkladu 1 (0,5 % kolagenu) a vpravo dle příkladu 2 (kombinace 0,5 a 2% kolagenové vrstvy).
Obr. 2 Závislost střední velikosti pórů na složení materiál 3D kolagenního substrátu (vlevo) Vliv koncentrace kolagenu při konstantní koncentraci kolagenu, (vpravo) Vliv koncentrace nHAP při konstantní koncentraci kolagenu.
Obr. 3 NanoCT sken porézní struktury substrátu dle Příkladu 3 (šedivá plocha) a jeho 3D kolonizace buňkami rakoviny plic (tmavošedé kruhové objekty).
Obr. 4 Fluorescenční konfokální mikroskopie diferencovaných mesenchymálních kmenových buněk na 3D substrátu v příkladu 1. Životaschopnost buněk je dokumentována obarvením pomocí BCECF-AM/propidiumjodidu 28 dní po osazení substrátu obsahujícího 0,5 % kolagenu a (a) 50% nHAP, (b) 70% nHAP a (c) obsahující 2 % kolagenu a 50% nHAP. Immunofluorescenční detekce osteokalcinu 28 dní po osazení stejných substrátů.
Obr. 5 SEM snímky 3D substrátu dle Příkladu 6 (vlevo) obsahující kyselinu hyaluronovou a dle příkladu 7 (vpravo) obsahující jako modifikační složku chitosan.
Obr. 6 Fluorescenční konfoální mikroskopie diferencovaných buněk na 3D substrátu v příkladu 8 (vlevo) a 9 (vpravo). Životaschopnost buněk je dokumentována obarvením cytoplazmy pomocí BCECF-AM/propidiumjodidu a červeně jader buněk propidium jodidem.
Obr. 7 Fluorescenční konfoální mikroskopie diferencovaných buněk na 3D substrátu v příkladu 10 (vlevo) a 11 (vpravo). Životaschopnost buněk je dokumentována obarvením cytoplazmy zeleně pomocí BCECF-AM/propidiumiodidem) a červeně jader buněk propidium jodidem.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1
Jamky kultivační destičky obsahující 48 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,3 až 3 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), á nakonec byla vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C a tlaku nižším než 1000 Pa do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným
-4CZ 308138 B6 způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující homogenní porézní kolagenní skafold s řízenou velikostí pórů v rozsahu 250 až 450 mikronů (dáno teplotou mražení a koncentrací kolagenní hmoty) a výškou 5 mm adherující ke stěnám destičky, který po navlhčení zůstává u dna destičky a neplave (viz. Obr. 1). Porozita byla úměrná koncentraci kolagenu a ležela v intervalu od 99,5 % pro 0,3 % hmota, koncentraci po 97 % pro koncentraci 3 % hmota, kolagenu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografů (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Materiál byl již podroben in-vitro i in-vivo testům
Příklad 2
Jamky kultivační destičky obsahující 48 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 2 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o celkové výšce 6 mm s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (póry o průměrné, velikosti 100 mikronů) tloušťky 3 mm, tak i v horní části materiálu (póry o velikosti 250 až 450 mikronů) tloušťky 3 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Materiál byl již podroben in-vitro i in-vivo testům z hlediska optimalizace porozity a velikosti pórů pro jednotlivé typy buněk (Obr. 2). Porozita byla 98,5 % pro 2 % hmota, koncentraci po 99 % pro koncentraci 0,5 % hmota, kolagenu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografů (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty.
Příklad 3
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II) - zmražení
2. Nanovlákna z polykaprolaktonu a želatiny připravené elektrospinováním na přístroji Nanospider (Elmarco) - průměr vláken 120 až 280 nm
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih) a v posledním kroku na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o celkové tloušťce 3 mm s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (50 pm) o tloušťce 0,5 mm, tak i v horní části materiálu (póry o průměrné velikosti 400 mikronu) tloušťky 2,5 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Kolonizace připraveného 3D substrátu dle příkladu 3 buňkami v celém jeho objemu je doložena Obr. 3. Porozita v nanovlákenné části byla 45 % a 99,3 % pro vrstvu o koncentraci 0,5 % hmota, kolagenu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty.
Příklad 4
Jamky kultivační destičky obsahující 48 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 50 nebo 70 % nano hydroxyapatitu (nHAP) na kolagenovou sušinu v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o tloušťce 5 mm s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní části materiálu (průměrná velikost 350 mikronů) tloušťky 3 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Materiál byl podroben in-vitro i in-vivo testům (Obr. 4 až a,b,d,e). Porozita byla úměrná složení vrstev a byla 99,5 % pro 0,5 % hmota, koncentraci kolagenu v první vrstvě a podle obsahu hydroxyapatitu byla 97 až 98 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty.
-6CZ 308138 B6
Příklad 5
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 2 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 50 % hmota, nano hydroxyapatitu (nHAP) na kolagenovou sušinu v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o tloušťce 4 mm s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (100 mikronů) tloušťky 1 mm, tak i v horní části materiálu (350 mikronů) tloušťky 3 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Materiál byl již podroben in-vitro i in-vivo testům (Obr. 4 až c,f). Porozita byla 98,5 % pro první vrstvu a podle obsahu hydroxyapatitu byla 97 až 98 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty.
Příklad 6
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 10 % hmota, kyseliny hyaluronové na kolagenovou sušinu v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih) a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold s celkovou výškou 4 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů) o tloušťce 3 mm, tak i v horní části materiálu (520 mikronů) o tloušťce 1 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. (Obr. 5a). Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 98,5 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané
-7CZ 308138 B6 pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 7
Jamky kultivační destičky obsahující 48 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 2 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 20 % hmota, chitosanu na kolagenovou sušinu v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih) a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold s celkovou tloušťkou 8 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (100 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní části materiálu (600 mikronů) tloušťky 6 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. (Obr. 5b). Porozita byla 98,5 % pro první vrstvu a 98 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografů (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 8
Jamky kultivační destičky obsahující 24 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 30 % hmota, oxidované celulózy na kolagenovou sušinu v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o celkové tloušťce 10 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů) tloušťky 4 mm, tak i v horní části materiálu (350 mikronů) tloušťky 6 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich
- 8 CZ 308138 B6 sledování. (Obr. 6a). Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 98,3 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografii (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 9
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 15 % hmota, lyzátu bovinních krevních destiček na kolagenovou sušinu v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold tloušťky 6 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů), tak i v horní části materiálu (420 mikronů). Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. (Obr. 6b). Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 99 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 10
Jamky kultivační destičky obsahující 24 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, a 20 % hmota, chitosanu a 10 % hmota, lyzátu bovinních krevních destiček na kolagenovou sušinu ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold tloušťky 10 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů) tloušťky 3 mm, tak i v horní
-9CZ 308138 B6 části materiálu (380 mikronů) tloušťky 7 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. (Obr. 7a). Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 98,5 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 11
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota., s přídavkem 20 % hmota, oxidované celulózy a 10 % hmota, lyzátu bovinních krevních destiček, vztaženo na kolagenovou sušinu, v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih) a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je vzorek kolagenu kovalentně zesíťován pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušen stejným způsobem, jak je popsáno výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o tloušťce 6 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní části materiálu (250 mikronů) tloušťky 4 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. (Obr. 7b). Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 98 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 12
Jamky kultivační destičky obsahující 24 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (heterogenní suspenze, decelularizované kolagenní tkáně obsahující původní bioaktivní proteiny, koncentrace 0,7 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (heterogenní suspenze decelularizované kolagenní tkáně obsahující původní bioaktivní proteiny, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o celkové tloušťce 10 mm s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části
- 10 CZ 308138 B6 materiálu (300 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní části materiálu (400 mikronů) tloušťky 8 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita byla 88,5 % pro první vrstvu a 91 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografů (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 13
Jamky kultivační destičky obsahující 24 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (heterogenní suspenze decelularizované kolagenní tkáně obsahující původní bioaktivní proteiny, koncentrace 0,7 % hmota, ultračisté vodě)
3. Kolagenní hmota (heterogenní suspenze decelularizované kolagenní tkáně obsahující původní bioaktivní proteiny, koncentrace 0,5 % hmota, a obohacená 2 mikro pg růstového faktoru TGF-β v ultračisté vodě)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold o tloušťce 10 mm a s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (300 mikronů) tloušťky 5 mm, tak i v horní části materiálu (400 mikronů) tloušťky 5 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita byla 88,5 % pro první vrstvu a 91 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 14
Jamky kultivační destičky obsahující 24 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Zelatinová nanovlákna modifikovaná haloisitem (vrstva náhodně orientovaných nanovláken průměru 180 nm, plošná koncentrace 20 % hmota.)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je první vrstva kolagenu kovalentně zesíťována pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušena stejným způsobem, jak je popsáno
- 11 CZ 308138 B6 výše a poté je nanesena vrstva želatinových nanovláken obsahujících 1 % hmota, haloisitu. Výsledkem je destička obsahující laminovaný porézní kolagenní skafold s řízenou velikostí pórů jak ve spodní vrstvě materiálu (400 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní vrstvě materiálu (50 mikronů) tloušťky 2 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita v nanovlákenné části byla 75 % a 99,3 % pro vrstvu o koncentraci 0,5 % hmota, kolagenu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty.
Příklad 15
Jamky kultivační destičky obsahující 48 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Blokový kopolymer PLA-PGA-PEG (micelámí gel, koncentrace 1 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Chitosan (homogenní roztok chitosanu, koncentrace 2 % hmota.)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení první vrstvy blokového kopolymeru je nanesena vrstva chitosanová. Výsledkem je destička obsahující laminovaný porézní kolagenní skafold s řízenou velikostí pórů jak ve spodní vrstvě materiálu (400 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní vrstvě materiálu (380 mikronů) tloušťky 2 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita byla 98,2 % pro první vrstvu a 98,8 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 16
Jamky kultivační destičky obsahující 48 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (heterogenní suspenze decelularizované kolagenní tkáně obsahující původní bioaktivní proteiny, koncentrace 0,7 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Zelatinová nanovlákna modifikovaná haloisitem (vrstva náhodně orientovaných nanovláken průměru 180 nm, plošná koncentrace 20 % hmota.)
4. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
5. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
- 12 CZ 308138 B6
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih) a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení první vrstvy decelularizované tkáně tloušťky 2 mm je nanesena vrstva nanovláken tloušťky 0,5 mm a následně vrstva homogenního roztoku kolagenu tloušťky 2 mm. Po vysušení je horní vrstva kolagenu kovalentně zesíťována pomocí EDC/NHS přímo v destičce a opět vysušena stejným způsobem, jak je popsáno výše Výsledkem je destička obsahující laminovaný porézní kolagenní skafold s řízenou velikostí pórů jak ve spodní vrstvě materiálu (380 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní vrstvě materiálu (400 mikronů) tloušťky 2 mm. Obě vrstvy jsou odděleny nanovlákennou membránou spory o velikosti cca 80 pm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita v nanovlákenné části byla 75 %, vrstva decelularizované kolagenní hmoty měla porozitu 90 % a 99,3 % pro vrstvu o koncentraci 0,5 % hmota, kolagenu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky. Standardní odchylka průměrných hodnot porozity byla menší než 10 % této hodnoty.
Příklad 17
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Chitosanová hmota (homogenní roztok chitosanu, koncentrace 2 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Modifikovaná gum-karaya (vrstva hydrogelu gum karayi obsahující oxidovanou celulózu, koncentrace 20 % hmota, celulózy na sušinu gum-karayi, koncentrace gum karayi 2 % hmota.)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení první vrstvy je nanesena vrstva hydrogelu na bázi modifikované gum karayi. Výsledkem je destička obsahující laminovaný porézní skafold s řízenou velikostí pórů jak ve spodní vrstvě materiálu (380 mikronů) tloušťky 2 mm, tak i v horní vrstvě materiálu (150 mikronů) tloušťky 2 mm. Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita byla 98,5 % pro první vrstvu a 98 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 18
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Chitosan (homogenní roztok chitosanu, koncentrace 2 % hmota.)
- 13 CZ 308138 B6
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je první vrstva kolagenu kovalentně zesíťována pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušena stejným způsobem, jak je popsáno výše a poté je nanesena vrstva chitosanová, která je opět vysušena způsobem popsaným výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold tloušťky 5 mm s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů), tak i v horní části materiálu (380 mikronů). Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 98 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografii (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
Příklad 19
Jamky kultivační destičky obsahující 96 jamek byly sendvičově (vrstva po vrstvě) vyplněny netoxickým materiálem v pořadí:
1. Ultračistá voda (Milipore, čistota II)
2. Kolagenní hmota (homogenní roztok bovinního kolagenu typu I, koncentrace 0,5 % hmota, v ultračisté vodě)
3. Silk fibroin (vodní suspenze, koncentrace 2 % hmota.)
4. Ultračistá voda (Milipore, čistota II).
Destička s netoxickým materiálem byla kontrolovaným způsobem po každém kroku vrstvení zmražena nejprve na -18 °C (Ih), poté na -35 °C (Ih), a nakonec vysušena při teplotě kondenzátoru -95 °C do konstantní hmotnosti. Po vysušení je první vrstva kolagenu tloušťky 2,5 mm kovalentně zesíťována pomocí EDC/NHS přímo v destičce, opět vysušena stejným způsobem, jak je popsáno výše a poté je nanesena vrstva suspenze silk fibroinu tloušťky 1,5 mm, která je opět vysušena způsobem popsaným výše. Výsledkem je destička obsahující heterogenní porézní kolagenní skafold s řízenou velikostí pórů jak ve spodní části materiálu (400 mikronů), tak i v horní části materiálu (380 mikronů). Po navlhčení zůstává substrát u dna destičky a neplave. Je proto velmi vhodným materiálem pro osazení různými buňkami a jejich sledování. Porozita byla 99,5 % pro první vrstvu a 97,6 % pro horní vrstvu. Porozita byla určována na základě analýzy zobrazení 3D struktury lyofilizovaného materiálu získané pomocí mikroCT počítačového tomografu (například Nano3DX Rigaku, Japan). Uváděné hodnoty jsou průměrem měření na materiálech z 5 náhodně vybraných jamek destičky.
PATENTOVÉ NÁROKY
Claims (13)
1. Nosič pro kultivaci buněk, vyznačený tím, že obsahuje vícejamkovou destičku, přičemž v jamkách jsou umístěny porézní substráty, s výhodou s porozitou > 90 %, upravené pro kultivaci buněk, adherující k povrchu jamek.
2. Nosič podle nároku 1, vyznačený tím, že porézní substrát je umístěn v alespoň jedné jamce vícejamkové destičky, s výhodou jsou porézní substráty umístěny alespoň ve čtvrtině jamek
- 14 CZ 308138 B6 vícejamkové destičky, výhodněji alespoň v polovině jamek vícejamkové destičky, nebo ve všech jamkách vícejamkové destičky.
3. Nosič podle nároku 1 nebo 2, vyznačený tím, že vícejamková destička je z materiálu vybraného ze skupiny zahrnující plasty, sklo, kovy, keramiku, a kombinace těchto materiálů.
4. Nosič podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že je porézní substrát složen alespoň ze dvou vrstev, lišících se materiálovým složením, přítomností a/nebo složením aditiv, a/nebo porozitou.
5. Nosič podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že velikost pórů porézního substrátu je v rozmezí 0,1 až 1000 pm, s výhodou v rozmezí 5 až 1000 pm nebo v rozmezí 100 až 2000 nm nebo v rozmezí 50 až 600 pm.
6. Nosič podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že materiál porézního substrátu je vybrán ze skupiny zahrnující proteiny extracelulámí matrix; strukturní proteiny jako je kolagen, fibrin, silk fibroin, elastin či želatina; decelularizovanou kolagenní tkáň; polysacharidy jako kyselina hyaluronová a její deriváty, chitosan a jeho deriváty, škrob, pryskyřičné gumy, celulóza a deriváty celulózy; pryskyřice; syntetické biokompatibilní polymery, jako je kyselina polymléčná, polyglykolová, polyethylenglykol a jejich blokové kopolymery, polykaprolakton, polyhydroxybutyrát, polyurethany; keramické přírodní nanotrubky; a směsi těchto materiálů; přičemž materiál porézního substrátu může být volitelně zesíťovaný, a/nebo materiál porézního substrátu může volitelně obsahovat jako aditiva bioaktivní proteiny, jejich fragmenty či směsi, fosfáty či organické nebo anorganické nanočástice, např. hydroxyapatit, alfa- nebo beta-trikalcium fosfát, oxidové keramiky, např. SiO2 kovy, např. Ag, Au, Mg, či nanočástice kovů s kovalentně či fyzikálně vázanými organickými ligandy.
7. Nosič podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že porézní substrát má nejmenší rozměr alespoň 10 mikrometrů, s výhodou alespoň 100 mikrometrů, výhodněji alespoň 0,5 mm, nejvýhodněji 1 až 10 mm.
8. Způsob přípravy nosiče pro kultivaci buněk, vyznačený tím, že zahrnuje následující kroky:
- nanesení vrstvy rozpouštědla do alespoň jedné jamky vícejamkové destičky a její zmražení,
- nanesení do uvedené alespoň jedné jamky alespoň jedné vrstvy materiálu porézního substrátu, po nanesení každé vrstvy je materiál zmražen,
- nanesení krycí vrstvy rozpouštědla do uvedené alespoň jedné jamky, její zmražení, a
- lyofilizaci po nanesení každé vrstvy nebo po nanesení všech vrstev.
9. Způsob podle nároku 8, vyznačený tím, že zmražení se provádí dvoukrokově, nejprve zmražením na teplotu mezi -5 až -40 °C, a potom zmražením na teplotu mezi -20 až -60 °C.
10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačený tím, že lyofilizace se provádí při teplotě nižší než -70 °C, s výhodou nižšího než atmosférického tlaku, výhodněji za tlaku 1000 Pa a méně.
11. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 10, vyznačený tím, že materiál porézního substrátu se nanáší ve formě roztoku v rozpouštědle, suspenze, aerogelu, emulze, hydrogelu, mikročástic nebo nanovláken.
12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 8 až 11, vyznačený tím, že materiál porézního substrátu se zesíťuje síťovacím činidlem.
13. Použití nosiče podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 pro osazení buněčným materiálem, jeho kultivaci a popřípadě následnou analýzu.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-256A CZ308138B6 (cs) | 2017-05-04 | 2017-05-04 | Nosič pro kultivaci buněk a způsob jeho přípravy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2017-256A CZ308138B6 (cs) | 2017-05-04 | 2017-05-04 | Nosič pro kultivaci buněk a způsob jeho přípravy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2017256A3 CZ2017256A3 (cs) | 2018-11-14 |
| CZ308138B6 true CZ308138B6 (cs) | 2020-01-22 |
Family
ID=69160517
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2017-256A CZ308138B6 (cs) | 2017-05-04 | 2017-05-04 | Nosič pro kultivaci buněk a způsob jeho přípravy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ308138B6 (cs) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025031525A1 (en) * | 2023-08-07 | 2025-02-13 | Prumyslove Pravni Strategie, Spol. S R.O. | A method for the elimination of carbon dioxide |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022112364A2 (en) * | 2020-11-24 | 2022-06-02 | Helmholtz Zentrum Muenchen - Deutsches Forschungszentrum Für Gesundheit Und Umwelt (Gmbh) | Biocompatible composite membrane, method for fabricating the membrane, bioreactor and method for investigating cells attached to the biocompatible composite membrane |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009127647A2 (de) * | 2008-04-15 | 2009-10-22 | Technische Universität Ilmenau | Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion |
| US20120052565A1 (en) * | 2010-08-27 | 2012-03-01 | Derosa Michael Edward | Porous and Non-Porous Cell Culture Substrate |
| WO2014202199A1 (en) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Baer Hans U | Matrix and implant for tissue engineering |
| CZ30686U1 (cs) * | 2016-04-15 | 2017-05-18 | Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. | Variabilní kit pro kultivaci buněčných struktur v kultivačních destičkách |
-
2017
- 2017-05-04 CZ CZ2017-256A patent/CZ308138B6/cs not_active IP Right Cessation
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2009127647A2 (de) * | 2008-04-15 | 2009-10-22 | Technische Universität Ilmenau | Teilaktives mikrofluidisches system für die 3d-zellkultivierung sowie verfahren zu dessen perfusion |
| US20120052565A1 (en) * | 2010-08-27 | 2012-03-01 | Derosa Michael Edward | Porous and Non-Porous Cell Culture Substrate |
| WO2014202199A1 (en) * | 2013-06-17 | 2014-12-24 | Baer Hans U | Matrix and implant for tissue engineering |
| CZ30686U1 (cs) * | 2016-04-15 | 2017-05-18 | Ústav experimentální medicíny AV ČR, v. v. i. | Variabilní kit pro kultivaci buněčných struktur v kultivačních destičkách |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHENG, Ke; LAI, Yinzhi; KISAALITA, William S. Three-dimensional polymer scaffolds for high throughput cell-based assay systems. Biomaterials, 2008, 29.18: 2802-2812. ISSN: 0142-9612 * |
| SERAS-FRANZOSO, Joaquin, et al. Functionalization of 3D scaffolds with protein-releasing biomaterials for intracellular delivery. Journal of controlled release, 2013, 171.1: 63-72; ISSN: 0168-3659 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2025031525A1 (en) * | 2023-08-07 | 2025-02-13 | Prumyslove Pravni Strategie, Spol. S R.O. | A method for the elimination of carbon dioxide |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ2017256A3 (cs) | 2018-11-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Vorwald et al. | Tunable fibrin-alginate interpenetrating network hydrogels to support cell spreading and network formation | |
| Lazzari et al. | Multicellular spheroid based on a triple co-culture: A novel 3D model to mimic pancreatic tumor complexity | |
| He et al. | Macrophage involvement affects matrix stiffness-related influences on cell osteogenesis under three-dimensional culture conditions | |
| Kolan et al. | Bioprinting with human stem cell-laden alginate-gelatin bioink and bioactive glass for tissue engineering | |
| Sadeghi-Ataabadi et al. | Fabrication and characterization of platelet-rich plasma scaffolds for tissue engineering applications | |
| Addario et al. | Microfluidic bioprinting towards a renal in vitro model | |
| Liu et al. | Nano tantalum-coated 3D printed porous polylactic acid/beta-tricalcium phosphate scaffolds with enhanced biological properties for guided bone regeneration | |
| Sharma et al. | Three‐dimensional supermacroporous carrageenan‐gelatin cryogel matrix for tissue engineering applications | |
| Fu et al. | Skin tissue repair materials from bacterial cellulose by a multilayer fermentation method | |
| JP4971981B2 (ja) | 組織等価物の細胞非依存的製造 | |
| Godoy-Gallardo et al. | Multi-layered polydopamine coatings for the immobilization of growth factors onto highly-interconnected and bimodal PCL/HA-based scaffolds | |
| Liu et al. | 3D bioprinting of cell-laden nano-attapulgite/gelatin methacrylate composite hydrogel scaffolds for bone tissue repair | |
| Han et al. | Effect of pore sizes of silk scaffolds for cartilage tissue engineering | |
| Yang et al. | Nerve conduits based on immobilization of nerve growth factor onto modified chitosan by using genipin as a crosslinking agent | |
| CN112823204A (zh) | 培养材料及其用途 | |
| JP2025098278A (ja) | 細胞構造体及びその製造方法並びに被験物質の肝毒性の評価方法 | |
| Lu et al. | Silk/agarose scaffolds with tunable properties via SDS assisted rapid gelation | |
| WO2021079931A1 (ja) | 細胞培養用基材及び細胞付き細胞培養用基材 | |
| JPWO2005014774A1 (ja) | 動物細胞の培養担体と、該培養担体を用いた動物細胞の培養方法および移植方法 | |
| Santos et al. | Human protein‐based porous scaffolds as platforms for xeno‐free 3D cell culture | |
| Shi et al. | Elasticity of cardiac cells on the polymer substrates with different stiffness: an atomic force microscopy study | |
| Badekila et al. | Engineering alginate/carboxymethylcellulose scaffolds to establish liver cancer spheroids: Evaluation of molecular variances between 2D and 3D models | |
| JP5937070B2 (ja) | ３ｄ細胞培養に用いる改良された架橋ヒアルロナンヒドロゲル | |
| EP4674952A1 (en) | Three-dimensional mammary gland model and method for producing same | |
| Pele et al. | Novel hydrogel-based cancer-on-a-chip models for growth of 3D multi-cellular structures and investigation of early angiogenesis in pancreatic ductal adenocarcinoma |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20220504 |