CZ308863B6 - Způsob separace spermií s neporušenou intaktní hlavičkou od spermií s poškozenou hlavičkou a somatických buněk - Google Patents
Způsob separace spermií s neporušenou intaktní hlavičkou od spermií s poškozenou hlavičkou a somatických buněk Download PDFInfo
- Publication number
- CZ308863B6 CZ308863B6 CZ2020223A CZ2020223A CZ308863B6 CZ 308863 B6 CZ308863 B6 CZ 308863B6 CZ 2020223 A CZ2020223 A CZ 2020223A CZ 2020223 A CZ2020223 A CZ 2020223A CZ 308863 B6 CZ308863 B6 CZ 308863B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- sperm
- antibody
- heads
- sample
- carrier
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 55
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 116
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 16
- 210000003128 head Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 26
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 14
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 11
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 11
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 claims description 9
- 239000000969 carrier Substances 0.000 claims description 8
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 6
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 5
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 2
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 claims description 2
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 claims description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000003860 storage Methods 0.000 abstract description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 abstract description 6
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 65
- 102100039373 Membrane cofactor protein Human genes 0.000 description 41
- 101000961414 Homo sapiens Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 40
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 230000004720 fertilization Effects 0.000 description 8
- 230000009027 insemination Effects 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 102000001708 Protein Isoforms Human genes 0.000 description 6
- 108010029485 Protein Isoforms Proteins 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 5
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 5
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000894007 species Species 0.000 description 5
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011587 new zealand white rabbit Methods 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 2
- 241001147386 Bos sp. Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 241000282896 Sus sp. Species 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 2
- 201000010063 epididymitis Diseases 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 2
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 2
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 108010011170 Ala-Trp-Arg-His-Pro-Gln-Phe-Gly-Gly Proteins 0.000 description 1
- 239000012103 Alexa Fluor 488 Substances 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101150026353 CD46 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 241000282467 Canis sp. Species 0.000 description 1
- 241000252212 Danio rerio Species 0.000 description 1
- 241000283074 Equus asinus Species 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 241000201862 Equus sp. Species 0.000 description 1
- 241000283070 Equus zebra Species 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 206010019196 Head injury Diseases 0.000 description 1
- 102000049556 Jagged-1 Human genes 0.000 description 1
- 108700003486 Jagged-1 Proteins 0.000 description 1
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101710146216 Membrane cofactor protein Proteins 0.000 description 1
- 101000889461 Mus musculus Trefoil factor 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 101100168995 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100438748 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) cyt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108700037966 Protein jagged-1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 241000611306 Taeniopygia guttata Species 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 208000021267 infertility disease Diseases 0.000 description 1
- 230000006662 intracellular pathway Effects 0.000 description 1
- -1 iodoacetyl groups Chemical group 0.000 description 1
- 108010045069 keyhole-limpet hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 239000002122 magnetic nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000002826 magnetic-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 210000003794 male germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 101150023613 mev-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000004899 motility Effects 0.000 description 1
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 1
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 1
- 102000054765 polymorphisms of proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 231100000469 sperm hypomotility Toxicity 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/689—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids related to pregnancy or the gonads
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D57/00—Separation, other than separation of solids, not fully covered by a single other group or subclass, e.g. B03C
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/061—Sperm cells, spermatogonia
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Gynecology & Obstetrics (AREA)
- Pregnancy & Childbirth (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Předkládané řešení poskytuje způsob separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk v buněčném vzorku získaném ze zvířete, který zahrnuje kroky: - uvedení buněčného vzorku do kontaktu s protilátkou proti CD46 navázanou k nosiči a/nebo ke značce, přičemž se buňky prezentující CD46 a/nebo zbytky buněk z buněčného vzorku navážou na protilátku proti CD46; - odstranění buněk prezentujících CD46 vázaných prostřednictvím protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce, čímž se získá buněčný vzorek prostý buněk prezentujících CD46, přičemž buňky prezentující CD46 zahrnují spermie s poškozenými hlavičkami, somatické buňky a zbytky buněk. Tato technologie je určena k oddělení spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami pro další použití při asistované reprodukci a v medicíně, zejména šlechtitelských programech a veterinární medicíně, nebo za účelem skladování či výzkumu.
Description
Předkládaný vynález se týká způsobu separace spermií s neporušenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami, jakož i od somatických buněk a buněčných zbytků, v buněčných vzorcích získaných ze zvířat, jako je ejakulát nebo vzorek spermatu. Tento způsob umožňuje takto získané spermie s neporušenými intaktními hlavičkami použít při asistované reprodukci, ve šlechtitelských programech a veterinární medicíně a zvýšit tak úspěšnost oplození.
Dosavadní stav techniky
V léčbě poruch plodnosti pomocí metod asistované reprodukce, stejně jako ve šlechtitelských programech a veterinární medicíně, je umělé oplození široce používaná metoda. Ve všech aplikacích metod umělého oplození má kvalita spermií zásadní význam pro dosažení vysoké míry úspěšnosti oplození. Z tohoto důvodu je kladen velký důraz na vývoj technologií pro zlepšení kvality spermií. Některé z dostupných metod, které se používají pro zlepšení kvality spermatu samců, jsou založeny na zdravé životosprávě. Další metody se zaměřují na zlepšení kvality spermatu navýšením počtu zdravých spermií ve vzorku. Představitelem takové metody je způsob popsaný v US 2017/0191029, ve kterém je vzorek spermatu uveden do kontaktu s nerozpustným nosičem, který je navázán na indikátor narušené integrity membrány spermií nebo snížené motility spermií. V tomto dokumentu však byly testovány pouze komerčně dostupné separační kuličky; některé z nich umožnily dosáhnout zvýšení motility přibližně o 20 %, přičemž např. použití protilátek proti králičímu IgG přispělo ke zvýšení poměru zdravých spermií.
CD46 (membránový kofaktorový protein) je s membránou asociovaný glykoprotein, přítomný na buňkách lidí a jiných savců včetně spermií. Na povrchu somatických buněk CD46 hraje klíčovou roli při ochraně hostitelských buněk proti komplementu, složce nespecifické imunity, jako mechanismus, který používají také nádorové buňky. Další úlohou proteinu CD46 je aktivace několika intracelulámích drah v různých typech buněk, včetně T-lymfocytů.
Několik patogenů jej využívá jako receptor, který jim umožňuje vstoupit do buňky. Ve spermiích je CD46 lokalizován na hlavičce, konkrétně v akrozómu, a na povrch spermie se dostává až po tzv. akrozomální reakci. Akrozóm může být patologicky poškozen, zdeformován nebo narušen. Pokud se tak stane, spermie nemohou proniknout extracelulámími obaly vajíčka a ztratí tak schopnost vajíčko oplodnit. Přítomnost poškozených spermií i somatických buněk jakéhokoli druhu ve spermatu není pro úspěšné oplození žádoucí.
Úloha CD46 v procesu oplození již byla prokázána pomocí monoklonálních protilátek proti první ektodoméně proteinu CD46 s krátkou konsenzuální repeticí (short consensus repeat, SCR1). Použití těchto protilátek mělo v podmínkách in vitro za následek blokování na komplementu nezávislé interakce lidských spermií s vajíčky po odstranění jejich obalu tzv. zóna pellucida. Nedávný objev nového ligandu pro CD46 nazvaného Jagged-1, který je bohatě přítomen (exprimován) na lidských vajíčkách dokládá, že CD46 hraje roh v počátečních stádiích interakce spermie s plazmatickou membránou vajíčka. Cdló^ deficientní myší samci vykazují vyšší míru výskytu spontánní akrozomální reakce ve srovnání s kontrolními samci. Toto zjištění vedlo k vytvoření teorie, že CD46 hraje roli při stabilizaci akrozomální membrány, a tudíž celé akrozomální oblasti hlavičky spermie. Rovněž je známo, že CD46 je přítomen v menší míře na spermiích u mužů trpících neplodností z neznámých příčin tzv. idiopatickou neplodností.
U lidí je CD46 exprimován ve všech buňkách kromě erytrocytů a převážně se vyskytuje ve čtyřech různých izoformách. Tyto izoformy jsou produkty alternativního sestřihu jednoho genu. Skládají
- 1 CZ 308863 B6 se ze čtyř extracelulámích domén na aminovém konci nazývaných krátké konsenzuální repetice (SCR), oblasti bohaté na serin-threonin-prolin (STP), transmembránové domény (TM), intracytoplazmatické kotvy ajedné ze dvou forem cytoplazmatického konce (CYT-1 obsahující 16 aminokyselin nebo CYT-2 obsahující 23 aminokyselin), které vznikají alternativním sestřihem na karboxylovém konci. Domény SCR1, 2 a 4 jsou místa N-glykosylace. Oblast STP je místem rozsáhlé O-glykosylace, a je složena ze 14 nebo 29 aminokyselin. Velikost oblasti STP závisí na přítomnosti exonu B STP, který lze případně sestřihnout. Absence exonu B STP vede k izoformám proteinu CD46 s nižší molekulovou hmotností, zatímco jeho přítomnost vede k izoformám CD46 s vyšší molekulovou hmotností. Hypoglykosylovaná izoforma CD46 s nižší molekulovou hmotností je exprimována v savčích spermiích. U lidí byly polymorfismy genu CD46 detekovány u zdravých jedinců s oběma restrikčními enzymy, HindlII a EcoRI.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je nový způsob selekce a separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami, který využívá toho, že spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami na svém povrchu neprezentují CD46, na rozdíl od spermií s poškozenými hlavičkami nebo většiny somatických buněk a zbytků buněk, na jejichž povrchu je CD46 prezentován. Vynález je založen na novém konceptu využití CD46 proteinu jako nástroje pro selekci spermií pomocí jednoduché, rychlé a efektivní metody.
Předkládaný vynález poskytuje způsob separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk v buněčných vzorcích získaných ze zvířat, přičemž uvedený způsob zahrnuje kroky:
- poskytnutí protilátky proti CD46 vázané k nosiči a/nebo ke značce (tag);
- uvedení buněčného vzorku do kontaktu s protilátkou proti CD46 vázanou k nosiči a/nebo ke značce, přičemž se buňky prezentující CD46, což jsou spermie s poškozenými hlavičkami a/nebo somatické buňky a/nebo zbytky buněk, navážou z buněčného vzorku na protilátku proti CD46;
- odstranění buněk prezentujících CD46 a vázaných prostřednictvím protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce, čímž se získá buněčný vzorek prostý buněk prezentujících CD46, přičemž buňky prezentující CD46 zahrnují spermie s poškozenými hlavičkami, somatické buňky a zbytky buněk.
Tento vynález je založen na využití toho, že molekula CD46 (oficiální název dle výboru pro nomenklaturu HGNC - HUGO Gene Nomenclature; http://www.genenames.org/cgibin/gene_symbol_report?match=CD46 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/4179) není prezentována na povrchu nepoškozených (neporušených, intaktních) spermií. Naopak spermie s poškozenými hlavičkami (zejména akrozómy), somatické buňky a zbytky buněk na svém povrchu molekuly CD46 prezentují. Použitím protilátky proti CD46 jako selekčního markéru lze tedy nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami oddělit od spermií vyvázaných na selekční marker na základě poškození hlavičky (konkrétně akrozómu), a rovněž od somatických buněk a zbytků buněk, které mohou být přítomné ve vzorcích spermatu, jako je například ejakulát nebo jakýkoliv jiný vzorek obsahující sperma. To umožňuje separovat neporušené spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami pro další použití při asistované reprodukci a odstranit ze vzorku spermatu poškozené spermie s poškozenými hlavičkami, somatické buňky a zbytky buněk.
Předkládaný vynález tedy ve výhodném provedení představuje způsob separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk ze vzorku spermatu získaného ze zvířete, přičemž uvedený způsob zahrnuje následující kroky:
- poskytnutí protilátky proti CD46 vázané k nosiči a/nebo ke značce,
-2 CZ 308863 B6
- uvedení vzorku spermatu do kontaktu s protilátkou proti CD46 navázanou k nosiči a/nebo ke značce, přičemž se buňky prezentující CD46 a/nebo zbytky buněk ze vzorku spermatu navážou na protilátku proti CD46,
- odstranění buněk prezentujících CD46 a zbytků buněk vázaných prostřednictvím protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce, čímž se získá vzorek spermatu se spermiemi s nepoškozenými intaktními hlavičkami.
Zvířetem je míněn zejména obratlovec, jako třeba savec nebo pták. S výhodou se zvířetem myslí zvíře jiné než člověk, obratlovec jiný než člověk nebo savec jiný než člověk.
Výrazy „poškozené spermie“, „spermie s poškozenými hlavičkami“, „spermie s porušenými hlavičkami“ v tomto popisu značí spermie s poškozenými hlavičkami, takže CD46 je prezentován na povrchu těchto spermií a/nebo je přístupný pro protilátku proti CD46.
Termín „spermie“ označuje spermatickou buňku nebo samčí pohlavní buňku nebo samčí gametu.
Termín „spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami“ nebo „nepoškozené spermie“ nebo „neporušené spermie“ nebo „spermie s nepoškozenými hlavičkami“ nebo „spermie s neporušenými hlavičkami“ označuje spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami, u kterých CD46 není prezentován na povrchu těchto spermií a/nebo není přístupný pro protilátku proti CD46.
Termín „zbytky buněk“ označuje buněčné komponenty a fragmenty mrtvých nebo poškozených buněk nebo tkání.
Termín „vzorek buněk“ nebo „buněčný vzorek“ zahrnuje jakýkoliv vzorek obsahující směs buněk. Zejména je buněčným vzorkem myšlen vzorek spermatu.
Termín „vzorek spermatu“ zahrnuje jakýkolivv vzorek obsahující spermie, jako je ejakulát nebo vzorek spermií nebo předem ošetřený vzorek spermií nebo předem ošetřený vzorek spermatu.
Termíny „vazba“, „vázaný“ a „navázaný“ zahrnují zejména konjugaci, kovalentní vazbu nebo nekovalentní vazbu.
Vynález umožňuje oddělit spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií značených protilátkou proti CD46, která se váže na poškozené hlavičky (jmenovitě poškozený akrozóm), a rovněž i od somatických buněk a zbytků buněk, které jsou ve vzorku přítomné. Vzorkem může být ejakulát nebo vzorek spermatu nebo předem ošetřený ejakulát nebo předem ošetřený vzorek spermatu (nebo spermií). Předošetření (ošetření předem) může zahrnovat odstranění semenné plazmy a/nebo tkání a/nebo zbytků buněk z ejakulátu nebo ze vzorku spermatu nebo z čerstvého nebo konzervovaného spermatu, např. odstředěním v hustotním gradientu nebo metodou vyplaváním (swim-up) nebo jiným vhodným způsobem.
Vzorek obsahující pouze spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami může být dále použit v technikách asistované reprodukce, včetně oplodnění in vitro, intracytoplazmatické injekce spermií atd., ve šlechtitelských programech a/ nebo ve veterinární medicíně.
Způsob podle předkládaného vynálezu může v některých provedeních obsahovat následující kroky:
navržení alespoň jednoho imunizačního peptidu pro produkci protilátky proti CD46;
přípravu protilátky proti CD46;
vazbu protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo značce;
uvedení protilátky proti CD46 vázané k nosiči a/nebo značce do kontaktu s buněčným vzorkem, přičemž se buňky prezentující CD46 navážou na protilátku, přičemž buňky
-3 CZ 308863 B6 prezentující CD46 zahrnují spermie s poškozenými hlavičkami a/nebo somatické buňky a/nebo zbytky buněk;
separaci spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk, vázaných k nosiči a/nebo ke značce prostřednictvím protilátky proti CD46, z buněčného vzorku;
čímž se získají dvě frakce: 1) spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami a 2) spermie s poškozenými hlavičkami a/nebo somatické buňky a/nebo zbytky buněk.
Způsob tedy vede k selekci a separaci spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk z frakce vzorku, která neprezentuje CD46.
Termíny „frakce vzorku neprezentující CD46“ nebo „buněčný vzorek prostý buněk prezentujících CD46“ se zde používají jako synonyma. Tato frakce vzorku může zahrnovat spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami a/nebo nebuněčné složky vzorku a/nebo červené krvinky. Pokud je počátečním buněčným vzorkem vzorek spermatu, obsahuje frakce vzorku neprezentující CD46 spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami a nebuněčné složky vzorku.
Jakoukoli získanou frakci, tj. frakci vzorku neprezentující CD46, nebo frakci buněk prezentujících CD46 vázaných k nosiči a/nebo ke značce, lze podle potřeby použít pro další zpracování, například v technologiích umělého oplodnění, v programech šlechtění zvířat, v lékařských aplikacích, či pro účely uchovávání vzorku nebo ve výzkumu.
CD46 peptidy pro produkci protilátek proti CD46 mohou představovat celé CD46 (molekulu / protein / peptid / receptor) nebo jeho modifikace, izoformy a varianty transkriptu (synteticky připravené látky, které obsahují / začleňují část sekvence molekuly) a deriváty (synteticky připravené látky, které tvoří nefunkční podjednotku molekuly).
Protilátkou proti CD46 může být komerčně dostupná protilátka nebo protilátka vyrobená známými způsoby. Protilátky mohou být monoklonální nebo polyklonální, konjugované nebo nekonjugované, přímo nebo nepřímo připravené protilátky proti CD46. Protilátky proti CD46 mohou být připraveny jakýmkoli vhodným způsobem, včetně například proteomické syntézy, technologie hybridomové buněčné linie a imunizace zvířat, tkání a/nebo buněk pomocí celého proteinu, jeho extracelulámí části nebo peptidů s/bez posttranslačních modifikací. Protilátky proti CD46 mohou také být nebo zahrnovat syntetické protilátky nebo deriváty syntetických protilátek.
Protilátka proti CD46 může být například připravena způsobem zahrnujícím imunizaci zvířat a/nebo buněk pomocí imunizačních peptidů, které jsou odvozeny od jednotlivých druhů. V některých provedeních může být imunizačním peptidem peptid PFEAMELKGTPKLY (SEQ. ID NO. 1).
Nosičem může být látka nebo zařízení schopné vázat protilátku proti CD46 nebo její část. Nosiče mohou být s výhodou v pevné formě, ve formě roztoku nebo ve formě gelu. Příklady vhodných nosičů zahrnují: kuličky, magnetické kuličky, polymemí substráty (např. polyakrylamid, polystyren, polykarbonát), celulózové substráty (např. agaróza, sefaróza), kovové substráty, magnetické nebo magnetizovatelné nosiče. Nosiče jsou typicky materiály schopné kovalentní nebo nekovalentní, specifické nebo nespecifické, přímé nebo nepřímé vazby k protilátce proti CD46, a to v jednom nebo více krocích. Nosiče mohou být nanášeny jako povlak nebo imobilizovány na povrch materiálů nebo zařízení. V některých provedeních mohou být nosiče nebo protilátky naneseny jako povlak nebo imobilizovány na vnitřním povrchu nádoby, jako je jamka, destička, kádinka, kapilára nebo zkumavka (pokud jsou protilátky naneseny jako povlak nebo imobilizovány na vnitřním povrchu nádoby, pak je nádoba nosičem).
-4 CZ 308863 B6
Krok, kdy se protilátka proti CD46 uvede do kontaktu s nosičem, se s výhodou provádí při pokojové teplotě ve fyziologickém pufiru (jako je fosfátový pufir, fýziologický roztok). Protilátka (protilátky) proti CD46 vázaná na nosič tvoří komplex protilátka proti CD46-nosič.
Komplex protilátka proti CD46-nosič umožňuje selekci a separaci spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk od spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami z ejakulátu nebo ze vzorku spermatu obecně. Selekce a separace je založena na přítomnosti nebo nepřítomnosti značení CD46 (tzn. absenci značení CD46 na povrchu spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami).
Značka navázaná na protilátku proti CD46 může být vybrána z fluoroforů, chromoforů, oligonukleotidů, magnetických nanočástic (nanočástice o velikosti od 1 do 1000 nm, s výhodou od 1 do 500 nm nebo od 1 do 200 nm), magnetických mikročástic (mikročástice o velikosti od 1 do 1000 pm, s výhodou od 1 do 5 pm), His-tagu, MBP-tagu, GST-tagu, CBP-tagu a Strep-tagu. Způsoby značení (tagování) protilátek jsou v oboru známy.
V případě použití protilátky proti CD46 navázané na nosič (rovněž nazýváno dále „komplex protilátka proti CD46-nosič“) je odstranění buněk prezentujících CD46 obvykle založeno na odstranění nosiče, ke kterému jsou buňky prezentující CD46 vázány prostřednictvím protilátky proti CD46. V případě použití značené protilátky proti CD46 (tzn. protilátky proti CD46 vázané ke značce, dále rovněž nazýváno „komplex protilátka proti CD46-značka“) je odstranění buněk prezentujících CD46 obvykle založeno na třídění buněk na základě přítomnosti nebo nepřítomnosti značky.
Techniky separace nosiče nebo separační techniky založené na přítomnosti nebo nepřítomnosti značky zahrnují metody schopné separovat nosič vázající protilátku proti CD46 s nebo bez buněk prezentujících CD46 a metody schopné oddělit označené (tagované) buňky od neoznačených buněk. Způsob může být přímý / nepřímý, pasivní / aktivní, gradientový, biologický, biochemický, fýzikální, chemický, enzymatický, neenzymatický, mechanický. Metoda může být s výhodou vybrána z centrifůgace, sedimentace, průtokové separační metody, jako je průtoková cytometric FACS, kapilární průtokové separační metody, separace na čipech, nebo metod využívajících magnetickou sílu v případě magnetických nebo magnetizovatelných nosičů a/nebo značek, například magneticky aktivované třídění MACS nebo magnetická separace. Krok odstranění může být také proveden odebráním frakce vzorku obsahující nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami, například když je nosičem nádoba.
Způsob podle předkládaného vynálezu může být prováděn v podmínkách in vitro nebo ex vivo.
Objasnění výkresů
Obrázek 1: Schematický model spermie: (A) spermie s nepoškozenou intaktní hlavičkou a lokalizací CD46 uvnitř intaktní hlavičky, která není pro protilátku přístupná. (B, C) spermie s poškozenou hlavičkou, kde CD46 může být detekován druhově specifickou protilátkou. (B) částečné poškození membrány. (C) značné poškození hlavičky se ztrátou akrozómu.
Obrázek 2: Myší epididymální spermie značené protilátkou proti CD46 a jádro značené pomocí Hoechst barvení. Levý panel: bílý signál (šipka) ukazuje poškozené spermie značené protilátkou proti CD46; žádný signál (křížek) ukazuje nepoškozené spermie bez označení. Pravý panel: bílý signál ukazuje všechny spermie na obrázku díky použití značení jádra. (Fotodokumentace myši je reprezentativní pro technologii použitou u všech zvířat.)
Obrázek 3: Obrázek akrozómu spermie potkana s poškozenou hlavičkou, značený protilátkou proti CD46.
- 5 CZ 308863 B6
Obrázek 4: Obrázek akrozómu spermie zebřičky s poškozenou hlavičkou, značenou protilátkou proti CD46. Hvězdička označuje jádro spermie.
Příklady uskutečnění vynálezu
Příklad 1: Rozlišení mezi spermiemi s nepoškozenými intaktními hlavičkami a spermiemi s poškozenými hlavičkami
Jádro myších epididymálních spermií bylo označeno pomocí Hoechstového barvení, a pro detekci integrity hlavičky byla použita primární protilátka proti CD46 (klon MM 10, HM1118, Hycult Biotech, Uden, Nizozemsko). Primární protilátka byla dále vizualizována pomocí sekundární protilátky s navázaným fluoroforem (oslí protilátka proti potkanímu IgG Alexa Fluor 488, Molecular Probes, Praha, Česká republika). Barvení Hoechstem vizualizovalo všechny buňky přítomné ve vzorku, zatímco barvení protilátkou proti CD46 značilo pouze spermie s poškozenými hlavičkami.
Obrázek 2 je obrázek získaný ze vzorku - v levém panelu značení protilátkou proti CD46 ukazuje poškozené hlavičky spermií. V pravém panelu jsou pomocí barvení Hoechstem označeny všechny buňky přítomné na obrázku. Pro lepší orientaci čtenářů je na levém panelu poloha spermie s nepoškozenou intaktní hlavičkou označena křížkem.
Protokol 1
Polyklonální protilátka proti CD46 použitelná pro řadu živočišných druhů byla připravena následujícím způsobem:
Polyklonální protilátka byla připravena na požádání komerčním poskytovatelem za použití imunizace samce králíka Novozélandského bílého (NZW). Imunizační peptid byl PFEAMELKGTPKLY (SEQ. ID NO. 1). Pro přípravu primární injekce bylo přidáno 0,75 ml Freundova nekompletního adjuvans (FIA) (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) do 0,75 ml roztoku peptidu-KLH (rozpuštěného ve sterilním PBS; KLH = keyhole limpet hemocyanin) o koncentraci 800 pg/ml. Směs byla sonikována na ledu, dokud se nevytvořila hustá stabilní emulze, která se nerozptýlila na povrchu vody. Králík NZW byl na čtyřech subkutánních místech injikován celkem 1 ml směsi peptidu-KLH adjuvans (400 pg). Během následujících čtyř měsíců mu bylo podáno pět posilovačích injekcí. Posilovači injekce sestávaly z 1 ml směsi 140 pg/ml peptidu-KLH adjuvans a byly injikované do čtyř subkutánních míst.
Z okrajové ušní žíly králíka NZW bylo extrahováno 20 ml krve při odběru preimunního séra (den 0) a při každém testovacím odběru (dny 39, 46, 53, 68, 81 a 103). Během terminálního vykrvácení bylo extrahováno 80 ml (den 112). Ze stěny univerzální zkumavky byla odstraněna krevní sraženina a byla inkubována při 37 °C po dobu 1 hodiny. Univerzální zkumavka byla centrifugována při 7500 g po dobu 10 minut a sérum bylo odebráno. Tento krok se opakoval dvakrát. Za účelem inaktivace tepelně labilních složek komplementu bylo sérum inkubováno při 56 °C po dobu 30 minut. Sérum bylo skladováno při -80 °C. Králičí preimunní sérum (den 0) a králičí peptidové polyklonální antisérum proti CD46 (den 112) byly afinitně vyčištěny od nekonjugovaného peptidu imobilizovaného pomocí soupravy SulfoLink (Perbio Science, Cramlington, Velká Británie) podle přiloženého protokolu. Přibližně 0,5 mg volného peptidu bylo imobilizováno na nosiči na agarózovém gelu reakcí mezi jodacetylovými skupinami na vazebném gelu a/V-koncovým cysteinovým zbytkem na peptidu. Kolona byla promyta a nespecifická vazebná místa na gelu byla blokována inkubací s L-cysteinem. Přebytek /.-cysteinu byl eluován promytím. Kolona byla inkubována se sérem a promyta, aby se odstranily nevázané sérové proteiny. Navázané proteiny byly eluovány za použití lOOmM glycinového pufiru (pH 2,5 až 3,0) (Sigma-Aldrich, Dorset, UK) a byly odebrány Iml frakce. Koncentrace afinitně čištěného séra byla zjištěna absorbancí při 280 nm (molámí extinkční koeficient 1,4).
-6CZ 308863 B6
Protokol 2
Materiál: Suspenze buněčného vzorku (vzorek ejakulátu nebo spermatu), primární druhově specifická protilátka proti CD46 konjugovaná k nosiči nebo navázaná na značku.
Metoda: Po zkapalnění ejakulátu nebo vzorku spermatu, v závislosti na druhu zvířete, a bez použití jakékoli separační metody, se vzorek ejakulátu nebo spermatu inkuboval ve fyziologickém pufiru (PBS, fosfátový pufr) po dobu cca 30 minut (byly testovány i jiné časy, obvykle v rozmezí 30 až 60 minut) při pokojové teplotě s protilátkou proti CD46 konjugovanou k nosiči nebo konjugovanou se značkou. Pro navázání protilátky na nosič nebo ke značce byly použity standardní postupy a materiály. Po inkubaci komplexu protilátka proti CD46-nosič nebo protilátka proti CD46-značka s ejakulátem nebo se vzorkem spermatu následovalo oddělení nosiče nebo značky s konjugovanou protilátkou proti CD46, na kterou byly navázány buňky prezentující CD46. Zbývající nenavázaná frakce spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami byla převedena do nové nádoby a připravena pro další použití např. při metodách asistované reprodukce (umělého oplodnění), jako je intrauterinní inseminace (IUI), in vitro oplodnění (IVF) nebo metoda intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI), nebo pro další uchování, při léčbě nebo jakékoli jiné technice či výzkumu.
Protokol 3
Materiál: Kryokonzervovaný vzorek (vzorek zvířecího ejakulátu nebo zvířecího spermatu), primární druhově specifická protilátka proti CD46 konjugovaná k nosiči.
Metoda: Po rozmražení byl vzorek inkubován ve fyziologickém pufru (PBS, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) po dobu 30 minut (byly testovány i jiné časy, obvykle v rozmezí 30 až 60 minut) při pokojové teplotě s protilátkou proti CD46 konjugovanou k nosiči; následovalo oddělení nosiče s konjugovanou protilátkou proti CD46, na kterou byly navázány buňky prezentující CD46. Zbývající nenavázaná frakce spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami byla převedena do nové nádoby pro další použití, např. při asistované reprodukci (umělém oplození), jako je intrauterinní inseminace (IUI), in vitro oplození (IVF) nebo metoda intracytoplazmatické injekce spermie (ICSI), za účelem dalšího uchování, léčby nebo jakékoli jiné techniky nebo výzkumu.
Příklad 2: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami ze vzorku spermatu myši (Mus musculus sp.)
Protilátka proti myšímu CD46 (klon MM 10, HM1118, Hycult Biotech, Uden, Nizozemsko) byla ve fyziologickém pufru (fosfátový pufr) při pokojové teplotě navázána na magnetické kuličky sloužící jako nosič, tím vznikl komplex protilátka proti CD46-nosič. Komplex byl přidán do vzorku spermatu myši, postupovalo se dle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46-nosič a dále magnetickým polem separovány pomocí magnetického stojanu. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Stejný postup byl opakován s polyklonální protilátkou proti CD46 produkovanou podle protokolu 1. Také s touto protilátkou byly všechny buňky prezentující CD46 (spermie s poškozenými hlavičkami a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk) navázány na nosič přes protilátku a odstraněny ze vzorku magnetickým polem. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Příklad 3: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami ze vzorku spermatu potkana (Ratus sp.)
-7 CZ 308863 B6
Protilátka proti potkanímu CD46 (klon MM10, HM1118, Hycult Biotech, Uden, Nizozemsko) byla ve fyziologickém pufiru (PBS, fosfátem pufrovaný fyziologický roztok) při pokojové teplotě navázána na agarózové kuličky sloužící jako nosič. Byl dodržen postup podle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, se navázaly na komplex protilátka proti CD46-nosič a dále byly separovány centrifugací. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Stejný postup byl opakován s polyklonální protilátkou proti CD46 produkovanou podle protokolu 1. Také s touto protilátkou byly všechny buňky prezentující CD46 (spermie s poškozenými hlavičkami a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk) vázány na nosič přes protilátku a odstraněny ze vzorku odstředěním. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Příklad 4: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami z ejakulátu prasete (Sus sp.)
Protilátka proti prasečímu CD46 (klon JM6C11, MCA2262GA, Βίο-Rad Laboratories, Hercules, CA) byla navázána na stěny mikrocentrifůgační zkumavky předem potažené nosičem. Byl dodržen postup podle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, se navázaly na komplex protilátka proti CD46-nosič. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi, která byla přenesena do nové nádoby, připravené k dalšímu použití.
Příklad 5: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami z ejakulátu býka (Bos sp.)
Protilátka proti býčímu CD46 (klon MEM-258, ABIN94152, Antibodies Online, Aachen, Německo) byla navázána na magnetické kuličky sloužící jako nosič. Byl dodržen postup podle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46nosič a dále magnetickým polem separovány pomocí magnetického stojanu. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Příklad 6: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami z koňského ejakulátu (Equus sp.)
Protilátka proti koňskému CD46 (ab231984, Abeam, Cambridge, Velká Británie) byla navázána na polyakrylamidové kuličky. Byl dodržen postup podle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46-nosič a dále separovány centrifugací. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Příklad 7: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami z psího ejakulátu (Canis sp.)
Protilátka proti CD46 (E4.3, Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA) byla navázána na magnetické kuličky jako nosič. Byl dodržen postup podle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46-nosič a dále odděleny magnetickým polem. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi.
Příklad 8: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami ze vzorku spermií prasete (Sus sp.) po kry opře zervaci
- 8 CZ 308863 B6
Postupovalo se podle protokolu 3 s použitím protilátky a nosiče popsaných v příkladu 4. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46-nosič. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi, která byla přenesena do jiné nádoby, a připravena k použití pro krátkodobé nebo dlouhodobé uchovávání za jakýchkoli podmínek a v jakýchkoli médiích, např. pro kryokonzervaci nebo jakýkolivv jiný druh uchování vzorku.
Příklad 9: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami ze vzorku spermií býka (Bos sp.) po kryoprezervaci
Postupovalo se podle protokolu 3, za použití protilátky a nosiče uvedených v příkladu 5. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46-nosič a dále odděleny magnetickým polem. Nenavázané spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami zůstaly v suspenzi a byly tak připraveny k použití pro krátkodobé nebo dlouhodobé uchovávání za jakýchkoli podmínek a v jakýchkoli médiích, např. pro kryokonzervaci nebo jakýkoliv jiný druh uchování vzorku.
Příklad 10: Separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami ze vzorku zebřičky (Taeniopygia guttata)
Polyklonální protilátka produkovaná podle protokolu 1 byla navázána na magnetické kuličky a byla použita podle protokolu 2. Všechny spermie s poškozenými hlavičkami prezentující CD46 a všechny somatické buňky, zejména bílé krvinky a zbytky buněk, byly navázány na komplex protilátka proti CD46-nosič a dále odděleny magnetickým polem pomocí magnetického stojanu.
Průmyslová využitelnost
Předkládaný vynález je technologie pro selekci a separaci buněk a buněčných zbytků prezentujících CD46 od buněk, které CD46 neprezentují, v buněčných vzorcích získaných od zvířete. Buňky, které neprezentují CD46, jsou spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami. Tato technologie slouží k oddělení spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami, jakož i od somatických buněk a zbytků buněk ze vzorků spermatu. Tato technologie je určena k oddělení spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami pro další použití při asistované reprodukci a léčbě (zejména šlechtitelských programech a veterinární medicíně) a ve výzkumu. Vynález zvyšuje kvalitu spermií ataké umožňuje oddělení somatických buněk a/nebo zbytků buněk ze vzorků obsahujících spermie. Použití takto přečištěných spermií zvyšuje úspěšnost oplození, anebo je využitelné v medicíně a výzkumu. Použití vynálezu také vede ve výsledku ke zvýšené kvalitě vzorku spermií pro dlouhodobé nebo krátkodobé uchovávání za účelem např. kryokonzervace. Navíc se může díky využívání tohoto vynálezu také ušetřit velké množství kryoprotektiv a plastů, neboť se uchovává jen menší objem předem separovaného kvalitního vzorku spermií.
Claims (9)
1. Způsob separace spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk v buněčném vzorku získaném ze zvířete, vyznačující se tím, že zahrnuje kroky:
- uvedení buněčného vzorku do kontaktu s protilátkou proti CD46 navázanou k nosiči a/nebo ke značce, přičemž se buňky prezentující CD46 a/nebo zbytky buněk z buněčného vzorku navážou na protilátku proti CD46;
- odstranění buněk prezentujících CD46 vázaných prostřednictvím protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce, čímž se získá buněčný vzorek prostý buněk prezentujících CD46, přičemž buňky prezentující CD46 zahrnují spermie s poškozenými hlavičkami, somatické buňky a zbytky buněk.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že výchozím buněčným vzorkem je vzorek spermatu, přičemž buněčný vzorek prostý buněk prezentujících CD46 je sperma obsahující pouze spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami.
3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že výchozí buněčný vzorek je ejakulát nebo předem ošetřený ejakulát nebo vzorek spermatu nebo předem ošetřený vzorek spermatu, přičemž předošetření vzorku zahrnuje s výhodou odstranění semenné plazmy a/nebo tkání a/nebo zbytků buněk z ejakulátu.
4. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že obsahuje následující kroky:
- přípravu protilátky proti CD46 metodou imunizace imunizačním peptidem;
- navázání protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce;
- uvedení buněčného vzorku do kontaktu s protilátkou proti CD46 vázanou k nosiči a/nebo ke značce, přičemž buňky prezentující CD46, což zahrnuje spermie s poškozenými hlavičkami a/nebo somatické buňky a/nebo zbytky buněk, se navážou na protilátku proti CD46;
- oddělení spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk vázaných prostřednictvím protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce, z buněčného vzorku;
čímž se získají dvě frakce: 1) spermie s nepoškozenými intaktními hlavičkami a 2) spermie s poškozenými hlavičkami a/nebo somatické buňky a/nebo zbytky buněk.
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že protilátka proti CD46 se produkuje imunizací zvířete imunizačním peptidem o sekvenci PFEAMELKGTPKLY (SEQ. ID NO. 1).
6. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že nosič je vybrán ze skupiny zahrnující kuličky, magnetické kuličky, polymemí substráty, celulózové substráty, kovové substráty, magnetické nebo magnetizovatelné nosiče.
7. Způsob podle kteréhokoli z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že nosičem je nádoba, kterou je jamka, destička, kádinka, kapilára nebo zkumavka, přičemž protilátka proti CD46 je nanesena jako povlak nebo imobilizována na vnitřním povrchu nádoby; nebo je nosič nanesen jako povlak nebo imobilizován na vnitřním povrchu nádoby, kterou je jamka, destička, kádinka, kapilára nebo zkumavka.
8. Způsob podle kteréhokoli z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že odstranění buněk prezentujících CD46 vázaných prostřednictvím protilátky proti CD46 k nosiči a/nebo ke značce se provede metodou vybranou z centrifůgace, sedimentace, průtokových separačních metod, kapilárních průtokových separačních metod, separace na čipech, nebo metod využívajících magnetickou sílu v případě magnetických nebo magnetizovatelných nosičů a/nebo značek.
- 10CZ 308863 B6
9. Použití protilátky proti CD46 pro in vitro separaci spermií s nepoškozenými intaktními hlavičkami od spermií s poškozenými hlavičkami a/nebo somatických buněk a/nebo zbytků buněk z buněčného vzorku, s výhodou ze vzorku spermatu nebo spermií, získaného ze zvířete.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP20152470.9 | 2020-01-17 | ||
| EP20152470.9A EP3851852A1 (en) | 2020-01-17 | 2020-01-17 | Method for separation of sperm with undamaged intact heads from sperm with damaged heads and somatic cells |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ308863B6 true CZ308863B6 (cs) | 2021-07-21 |
| CZ2020223A3 CZ2020223A3 (cs) | 2021-07-21 |
Family
ID=69177104
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2020223A CZ2020223A3 (cs) | 2020-01-17 | 2020-04-17 | Způsob separace spermií s neporušenou intaktní hlavičkou od spermií s poškozenou hlavičkou a somatických buněk |
Country Status (5)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (2) | EP3851852A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2020223A3 (cs) |
| ES (1) | ES3019611T3 (cs) |
| PL (1) | PL4090971T3 (cs) |
| WO (1) | WO2021143958A1 (cs) |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170191029A1 (en) * | 2016-01-04 | 2017-07-06 | University Of Tennessee Research Foundation | Methods for improvement of semen quality |
-
2020
- 2020-01-17 EP EP20152470.9A patent/EP3851852A1/en not_active Withdrawn
- 2020-04-17 CZ CZ2020223A patent/CZ2020223A3/cs unknown
-
2021
- 2021-01-17 ES ES21703812T patent/ES3019611T3/es active Active
- 2021-01-17 EP EP21703812.4A patent/EP4090971B1/en active Active
- 2021-01-17 WO PCT/CZ2021/050004 patent/WO2021143958A1/en not_active Ceased
- 2021-01-17 PL PL21703812.4T patent/PL4090971T3/pl unknown
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20170191029A1 (en) * | 2016-01-04 | 2017-07-06 | University Of Tennessee Research Foundation | Methods for improvement of semen quality |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| FARINI V. L. et al.: „Improvement of bovine semen quality by removal of membrane damaged sperm cells with DNA aptamers and magnetic nanoparticles," Journal of Biotechnology, vol. 229, 2016, str. 33 – 41, ISSN 0168-1656 * |
| FROLÍKOVÁ M. et al.: „Role of complement regulatory proteins CD46, CD55 and CD59 in reproduction," Jounal of Vertebrate Biology, vol. 61, no. 1, 2012, str. 84 – 94, ISSN 2694-7684 * |
| MUÑOZ-FUENTES V. et al.: „Single-layer centrifugation separates spermatozoa from diploid cells in epididymal samples from grey wolves, Canis lupus (L.)," Theriogenology, vol. 82, no. 5, 2014, str. 773 – 776, ISSN 0093-691X * |
| RODRIGUEZ-MARTINEZ H. et al.: „Evaluation of sperm damage and techniques for sperm clean-up," Reproduction, Fertility and Development, vol. 9, no. 3, 1997, str. 297 – 308, ISSN 1031-3613 * |
| SUH T. K. et al.: „High pressure flow cytometric sorting damages sperm," Theriogenology, vol. 64, no. 5, 2014, str. 1035 – 1048, ISSN 0093-691X * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL4090971T3 (pl) | 2025-04-22 |
| EP4090971C0 (en) | 2025-02-26 |
| WO2021143958A1 (en) | 2021-07-22 |
| CZ2020223A3 (cs) | 2021-07-21 |
| EP3851852A1 (en) | 2021-07-21 |
| EP4090971B1 (en) | 2025-02-26 |
| EP4090971A1 (en) | 2022-11-23 |
| ES3019611T3 (en) | 2025-05-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hunnicutt et al. | Analysis of the process of localization of fertilin to the sperm posterior head plasma membrane domain during sperm maturation in the epididymis | |
| US7833147B2 (en) | Process for enriching a population of sperm cells | |
| EP1590667A2 (en) | Magnetic separator | |
| AU2020294293A1 (en) | Antibody for skewing sex ratio and methods of use thereof | |
| Zhao et al. | Human OVGP1 enhances tyrosine phosphorylation of proteins in the fibrous sheath involving AKAP3 and increases sperm-zona binding | |
| US20050114915A1 (en) | Method for sex biasing spermatozoa | |
| US20240210383A1 (en) | Rapid real time multipoint procedure for optimizing sperm state for use in assisted reproductive technologies | |
| CZ308863B6 (cs) | Způsob separace spermií s neporušenou intaktní hlavičkou od spermií s poškozenou hlavičkou a somatických buněk | |
| CZ308864B6 (cs) | Způsob separace spermií s neporušenou intaktní hlavičkou od spermií s poškozenou hlavičkou a somatických buněk | |
| US11760793B2 (en) | Antibody for skewing sex ratio and methods of use thereof | |
| Ichikawa et al. | Possible involvement of annexin A6 in preferential sperm penetration in the germinal disk region | |
| US20090305270A1 (en) | Antigenic surface structure of sperm cells associated with the y chromosome | |
| Trummel et al. | Fertility of rainbow trout males relative to differences in the proportion of sperm that binds to a specific antibody | |
| CN104520425A (zh) | 用于评价哺乳动物精子的结合的方法和试剂 | |
| NZ722893B2 (en) | Antibody for skewing sex ratio and methods of use thereof | |
| BAWEJA | DEVELOPMENT OF IMMUNOPROBES FOR SEXING SPERMATOZOA OF DAIRY CATTLE AND BUFFALO | |
| JPWO2018194134A1 (ja) | 抗ペリオスチン抗体固定化担体、ペリオスチン測定試薬、及び抗ペリオスチン抗体固定化担体における抗体の安定化方法 |