CZ309511B6

CZ309511B6 - Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM8865

Info

Publication number: CZ309511B6
Application number: CZ2019-790A
Authority: CZ
Inventors: Josef ValĂk; Josef Rndr. Valík
Original assignee: Teva Czech Industries S.R.O.
Priority date: 2019-12-19
Filing date: 2019-12-19
Publication date: 2023-03-15
Also published as: CZ2019790A3

Abstract

Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM8865 tvořící při parazitickém růstu na obilninách, zejména na žitě nebo triticale a na jejich sterilních analozích, sklerocia s obsahem námelových alkaloidů, zejména α-ergokryptinu a β-ergokryptinu. Kultura z kmene CCM8865, sklerocia z tohoto kmene a použití uvedeného kmene pro výrobu námelových alkaloidů α-ergokryptinu a β-ergokryptinu a jejich polosyntetických derivátů s podstatně vyšší výtěžností ve srovnání s doposud známými kmeny.

Description

Průmyslový produkční kmen mikroorganismu Claviceps putpurea (Fr.) Tul., CCM8865

Oblast techniky

Vynález se obecně týká oboru biotechnologie, mikrobiologie, mykologie a farmaceutického průmyslu, konkrétně se týká průmyslového produkčního kmene mikroorganismu, houby Claviceps putpurea (Fr.) TuL, CCM8865, tvořícího při parazitickém růstu na žitě a jiných obilninách sklerocia s obsahem alkaloidů, zejména α-ergokryptinu a β-ergokryptinu.

Dosavadní stav techniky

Strukturu α-ergokryptinu popsali poprvé Stoll a Hofmann (Helv. Chim. Acta 26, 1570, 1943):

Strukturu β-ergokryptinu popsal poprvé Schlientz a kol. (Experientia 23, 991, 1967):

Každá z těchto sloučenin je významnou léčivou substancí. V humánní medicíně je β-ergokryptin i α-ergokryptin používán v lékových formách ve směsích s jinými účinnými látkami. Lze je využít i jako výchozí látku pro přípravu polosyntetických derivátů námelových alkaloidů se specifickým spektrem účinků, jako jsou např. nicergolin, pergolid nebo cabergolin.

β-ergokryptin i α-ergokryptin může být získáván ze sklerocií houby Claviceps putpurea (Fr.) TuL, kultivované paraziticky v polní kultuře na žitě nebo jiných obilninách. Pro výrobu βergokryptinu byl v ČR dosud využíván kmen popsaný, např. v patentové přihlášce EP 1831347 a uložený v České sbírce mikroorganismů (CCM, Masarykova univerzita, Brno) pod číslem CCM8360. Uvedený kmen při kultivaci na žitě produkoval sklerocia s průměrným obsahem 1,38 % sumy alkaloidů, vztaženo na sušinu biomasy. Vzájemný poměr dvou hlavních alkaloidů α-ergokryptinu ku β-ergokryptinu byl 0,79 : 1. Celkově nízký obsah alkaloidů je hlavní nevýhodou tohoto kmene i ostatních dosud známých kmenů.

- 1 CZ 309511 B6

Dále se ze sklerocií houby Claviceps purpurea (Fr.) TuL, kultivované paraziticky v polní kultuře na žité nebo jiných obilninách, mohou standardními postupy připravit deriváty ergolenu a ergolinu, jako je např. kyselina lysergová, nicergolin, pergolid, cabergolin a další.

kyselina lysergová

Podstata vynálezu

Podstatou předloženého vynálezu je průmyslový kmen mikroorganismu Clavicepsputpurea (Fr.) TuL, CCM8865, uložený v České sbírce mikroorganismů (Masarykova Univerzita, Přírodovědecká fakulta, Kamenice 5, 625 00 Brno), tvořící při parazitickém růstu na obilninách, zejména na žitě (Secale cereale) nebo triticale (křížencích žita (Secale cereale) a pšenice (Triticum aestivum)) a jejich sterilních analozích, sklerocia s obsahem alkaloidů, zejména aergokryptinu a β-ergokryptinu. Tento kmen umožňuje zefektivnit extrakční a izolační postupy při výrobě α-ergokryptinu a β-ergokryptinu a jejich polosyntetických derivátů podstatným zvýšením výtěžnosti těchto postupů. Zvýšená výtěžnost je dána vysokým obsahem α-ergokryptinu a β-ergokryptinu ve sklerociích předmětného kmene ve srovnání s dosud využívaným kmenem CCM8360. Obsah alkaloidů v jednotlivých sklerociích předmětného kmene CCM8865 dosahuje hodnot 1,2 % až 3,9 % hmotn. při průměrném obsahu 2,9 % hmotn. sumy alkaloidů v sušině biomasy v průměrném spektru alkaloidů: 42 % a-ergokryptin, 54 % β-ergokryptin a 4 % ergokornin. Současně došlo u předmětného kmene ke zvýšení výnosů drogy, ve srovnání s ostatními vysokoprodukčními kmeny Claviceps putpurea (Fr.) Tul. (CCM8057(GAL310), CCM8405(GAL404), CCM8178(GAL012), CCM404(GAL130)). Tyto výnosy se pohybují při recentně používané agrotechnice pěstování námele od 0,1 kg/m² (1000 kg/ha) do 0,26 kg/m²(2600 kg/ha), průměrně 0,13 kg/m² (1300 kg/ha).

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

-2 CZ 309511 B6

Příprava kmene CCM8865

Průmyslový kmen mikroorganismu Claviceps purpurea (Fr.) Tul., CCM8865 byl vyšlechtěn z kmene CCM8360. V roce 2013 bylo sklerocium uvedeného kmene převedeno do saprofytické kultury a tato byla vystavena gama záření o dávce 3000 Gy. Ozářené izoláty byly injekčně naočkovány na vymetané klasy žita a narostlá sklerocia byla analyzována na kvalitativní a kvantitativní obsah námelových alkaloidů. Takto vyselektované sklerocium s maximálním obsahem sumy alkaloidů bylo převedeno do saprofytické kultury a tato byla opět vystavena gama záření o dávce 3000 Gy. Ozářené izoláty byly v roce 2014 opět injekčně naočkovány na žito a narostlá sklerocia byla analyzována na kvalitativní a kvantitativní obsah námelových alkaloidů. Tento postup byl opakován i v roce 2015. Nejvýše obsahové sklerocium bylo v následujících letech 2016 až 2017 pasážováno na žitě v měřítku poloprovozních pokusů (cca 10⁴ m² (1 ha) až 10⁶ m² (100 ha)). Nejvýše obsahové sklerocium s maximálním obsahem β-ergokryptinu a αergokryptinu sklizené z těchto ploch bylo převedeno do saprofytické kultury a tato byla uložena v České sbírce mikroorganismů (Masarykova univerzita, Přírodovědecká fakulta, Kamenice 5, 625 00 Brno) pod označením CCM8865. Uvedenými mutačními zásahy došlo u kmene CCM8865 k nárůstu průměrného obsahu námelových alkaloidů ve sklerociích o 110 % proti původnímu kmeni CCM8360. Současně došlo ke zkvalitnění spektra jednotlivých alkaloidů tím, že došlo ke zvýšení obsahu β-ergokryptinu a snížení obsahu ergokorninu. Dále došlo ke zvýšení výnosu námelových sklerocií z 0,1 kg/m² (1000 kg/ha) na 0,13 kg/m² (1300 kg/ha), tj. o 30 %.

Příklad 2

Popis vlastností kmene CCM8865

Při saprofytní kultivaci na sladinovém médiu ztuženém agarem tvoří kmen CCM8865 kolonie z typicky sfaceliového vzdušného mycelia. Mycelium je zpočátku bílé a hladké, po 27 dnech kultivace zvrásněné, světle béžové až hnědé. Mycelium je tvořeno rozvětvenými hyfami a konidiemi oválného tvaru délky přibližně 8 mikrometrů a šířky přibližně 5 mikrometrů.

Při parazitickém růstu na žitě tvoří houba tmavě fialově pigmentovaná sklerocia o průměrné hmotnosti 30 mg. Jednotlivá sklerocia obsahují námelové alkaloidy v množství 1,2 % až 3,9 % hmotn. sušiny biomasy při průměrném obsahu 2,9 % hmotn. sumy alkaloidů s převahou βergokryptinu.

Příklad 3

Příklady využití kmene CCM8865

a) Z potřebného množství trvanlivé suché námeloviny kmene CCM8865, vyrobené postupem podle patentu č. CZ 276530, se připravila vodná suspenze konidií.

Touto suspenzí konidií se pomocí očkovacího stroje naočkovaly klasy žita ve fázi metání tak, že se na plochu 10⁴ m² (1 ha) použilo 3,2 x 10¹¹ klíčivých konidií rozdělených do dvou dávek s odstupem minimálně dvou dní v průběhu metání. V době zrání žita (zasychání klasů), kdy se začínají sklerocia uvolňovat z lůžka, tj. za cca 55 dnů, se provedla sklizeň narostlých sklerocií kombajnem. Z 10⁴ m² (1 ha) bylo takto získáno 1300 kg tmavě fialových sklerocií, obsahujících v průměru 2,9 % hmotn. sumy alkaloidů a tato suma byla tvořena z 96 % β-ergokryptinem a α-ergokryptinem. Získaná droga byla vyextrahována a extrakty byly použity pro výrobu substancí ergotoxinového typu a pro výrobu polosyntetických námelových alkaloidů.

b) Z potřebného množství trvanlivé suché námeloviny kmene CCM8865, vyrobené postupem podle patentu č. CZ 276530, se připravila vodná suspenze konidií. Touto suspenzí konidií se

- 3 CZ 309511 B6 pomocí postřikového stroje naočkovaly klasy žita ve fázi kvetení tak, že se na plochu 104 m²(1 ha) použilo 3,2 x 10¹¹ klíčivých konidií rozdělených do minimálně tří dávek během kvetení. V době zrání žita (zasychání klasů), kdy se začínají sklerocia uvolňovat z lůžka, tj. za cca 55 dnů, se provedla sklizeň narostlých sklerocií kombajnem. Z 104 m² (1 ha) bylo získáno 1600 kg tmavě fialových sklerocií, obsahujících v průměru 2,9 % hmotn. sumy alkaloidů a tato suma byla tvořena z 96 % β-ergokryptinem a α-ergokryptinem. Získaná droga byla vyextrahována, extrakty byly použity pro výrobu substancí ergotoxinového typu a pro výrobu polosyntetických námelových alkaloidů.

c) Při použití triticale a sterilních analogů žita i triticale v experimentech uspořádaných shodně s výše popsanými bylo dosaženo shodných výtěžků alkaloidů, konkrétně β-ergokryptinu a αergokryptinu.

d) Ze sklerocií kmene CCM8865 byly izolovány standardními postupy, které jsou odborníkovi známé, přirozené námelové alkaloidy jako je β-ergokryptin, α-ergokryptin a ergokornin, případně další, které byly dále využity pro přípravu léčivých přípravků ergotoxinového typu, nebo k přípravě kyseliny lysergové a polosyntetických derivátů námelových alkaloidů.

Průmyslová využitelnost

Kmen CCM8865 je využitelný ve farmaceutickém průmyslu jako nový zdroj námelových alkaloidů s vysokým obsahem β-ergokryptinu a α-ergokryptinu pro výrobu jak ergotoxinových substancí a lékových forem, tak pro výrobu polosyntetických derivátů.

Claims

1. Izolovaný kmen houby Clavicepspurpurea (Fr.) Tul., uložený v České sbírce mikroorganismů Masarykovy Univerzity v Brně pod přírůstkovým č. CCM8865.

2. Izolovaný kmen houby podle nároku 1, tvořící při parazitickém růstu na obilninách, zejména žitu, Secale cereale, nebo triticale, kříženci žita a pšenice, Triticum aestivum, a jejich sterilních analozích, sklerocia, která obsahují sumu alkaloidů od 1,2 % hmotn. do 3,9 % hmotn., průměrně 2,9 % hmotn., vztaženo na sušinu biomasy sklerocia.

3. Izolovaný kmen houby podle nároku 2, kde je průměrně 54 % sumy alkaloidů tvořeno βergokryptinem.

4. Izolovaný kmen houby podle nároku 2 nebo 3, kde je průměrně 42 % sumy alkaloidů tvořeno α-ergokryptinem.

5. Kultura z kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 na žitu, jeho kultivarech a genetických liniích, nebo na triticale, jejich dalších křížencích, kultivarech a genetických liniích.

6. Sklerocia kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4.

7. Použití kmene houby podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4 nebo kultury podle nároku 5 nebo sklerocií podle nároku 6 pro výrobu přirozených námelových alkaloidů a/nebo jejich polosyntetických derivátů.

8. Použití podle nároku 7, kde námelové alkaloidy a jejich deriváty jsou vybrány ze skupiny sestávající z α-ergokryptinu, β-ergokryptinu, ergokorninu a kyseliny lysergové.

9. Použití podle nároku 8, kde námelovým alkaloidem je α-ergokryptin.

10. Použití podle nároku 8, kde námelovým alkaloidem je β-ergokryptin.