CZ310511B6

CZ310511B6 - Koordinační sloučeniny osmia pro použití pro léčbu plicních nádorových onemocnění

Info

Publication number: CZ310511B6
Application number: CZ2023-360A
Authority: CZ
Inventors: Ivan NEMEC; Nemec Ivan Ing., Ph.D.; Pavel Ĺ tarha; Štarha Pavel doc. Mgr., Ph.D.; Jan Hošek; Hošek Jan doc. RNDr., Ph.D.
Original assignee: Univerzita Palackého v Olomouci; Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i.
Priority date: 2023-09-18
Filing date: 2023-09-18
Publication date: 2025-09-10
Also published as: WO2025061216A1; CZ2023360A3

Abstract

Iontové polosendvičové komplexní sloučeniny osmia v oxidačním stavu +II s deriváty ethan-1,2-diaminu substituovanými dvěma polyaromatickými substituenty vzorce I, jejich použití pro léčbu nádorových onemocnění, zejména rakoviny plic. Způsob přípravy těchto sloučenin a farmaceutický přípravek s jejich obsahem.

Description

Koordinační sloučeniny osmia pro použití pro léčbu plicních nádorových onemocnění

Oblast techniky

Vynález spadá do oblasti protinádorových léčiv na bázi osmia, a týká se polosendvičových koordinačních sloučenin obsahujících komplexní kationt obecného vzorce [Os(p⁶-pcym)Cl(L)]⁺, kde L představuje W-donorový bidentátní alifatický ligand na bázi ethan- 1,2-diaminu substituovaného dvěma polyaromatickými substituenty, a jejich využití k přípravě léčiv pro léčbu plicních nádorových onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Rakovina je genetické onemocnění, které je způsobené poškozením nebo chybnou opravou DNA. V současnosti je rakovina jednou z hlavních příčin úmrtí ve světě. V posledních letech je pak jedním z nej nebezpečnějších typů nádorových onemocnění rakovina plic, která je jedním z nejčastěji nově diagnostikovaných onkologických onemocnění a současně nejčastější příčinou úmrtí na rakovinu (cca. 20 % všech úmrtí souvisejících s rakovinou). Je tedy evidentní, že konvenční protinádorové terapie nejsou vůči rakovině plic zcela účinné a v této oblasti je nezbytné hledat nové možnosti.

Z pohledu kategorizace nádorových onemocnění se rozlišují dva hlavní typy rakoviny plic malobuněčný karcinom plic (SCLC) a nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC). V onkologické praxi je (často i kvůli pozdní diagnostice tohoto onemocnění) zejména NSCLC jedním z nej problematičtějších a nejobtížněji léčitelných nádorů k léčbě. I nadále je chemoterapie nedílnou součástí léčby rakoviny plic, prováděné většinou v kombinaci s chirurgickým zákrokem a/nebo radioterapií. Z historického pohledu je jedním z prvních schválených protinádorových léků cisplatina (vzorec A), která vykazuje klinickou aktivitu proti širokému spektru solidních nádorů, včetně karcinomu plic. Kombinovaná terapie rakoviny plic obsahující léčiva na bázi platiny (např. cisplatina) poskytuje lepší odpověď a celkovou míru přežití než režimy bez léčiv na bázi platiny. Problémem u pacientů léčených léčivy na bázi platiny pak je, vedle negativních vedlejších účinků (např. nefrotoxicita nebo myelosuprese), také vznik rezistence vůči takové chemoterapii.

Již nedlouho po objevu antineoplastických účinků cisplatiny byly pro svoji biologickou aktivitu studovány také sloučeniny jiných d-prvků, jako jsou platinové kovy palladium, rhodium nebo ruthenium. Ve vztahu k předmětným sloučeninám byly prvními sloučeninami ruthenia, které byly studované pro svoji biologickou aktivitu, ruthenité koordinační sloučeniny [RuCljNHsjXOHjjCl a ýac-fRuClsjNHsjs], přičemž druhá jmenovaná sloučenina vykazovala aktivitu podobnou cisplatině, když indukovala růst filamentů u E. coli (Durig et al., Chem.-Biol. Interact. 13 (1976) 287). Později několik koordinačních sloučenin na bázi ruthenia dosáhlo fáze klinických studií pro léčbu různých typů nádorů, včetně rakoviny plic, na lidských onkologických pacientech. Těmito sloučeninami byly tetrachlor-bis(indazol)ruthenitý komplex (pod různými označeními - KP1019, NKP-1339, IT-139; vzorec B; Burris et al., ESMO Open 1 (2016) e000154) a strukturně podobný tetrachlor-(dimethylsulfoxid)(imidazol)ruthenitý komplex (NÁMI-A; vzorec C; Leijen et al.. Invest. New Drugs 33 (2015) 201).

Ve stavu techniky bylo navrženo několik polosendvičových iontových chloro-(η⁶-1-methyl-4-(1methylethyl)benzen)-ruthenatých a chloro-(p⁶-1 -methyl-4-( 1 -methylethyl)benzen)-osemnatých koordinačních sloučenin. Koordinační sloučeniny tohoto typu byly doposud publikovány ve dvou pracích. V první práci byly popsány jejich katalytické účinky na konverzi epoxidů a CO2 na cyklické deriváty (Ulusoy et al., Appl. Organometal. Chem. 23 (2009) 68). Druhá práce popsala syntézu a biologickou a katalytickou aktivitu ruthenatých koordinačních sloučenin tohoto typu obsahujících W'-bis{(/'.')-|4-( l-mcthylcthyl)fcnyl|mcthylcn[ethan-1.2-diamin (L^a) a A,A-bis(lpyrenylmethylen)ethan-l,2-diamin (L^b) (Gopalakrishnan et al., Appl. Organometal. Chem. 33 (2019) e4756). U obou sloučenin byla testována in vitro protinádorová aktivita vůči buněčným liniím lidského prsního adenokarcinomu (MCF-7) a lidského hepatocelulámího karcinomu (HepG2). Sloučenina [Ru(r|⁶-pcym)Cl(L^a)]PFe vykazovala pouze nízkou in vitro cytotoxicitu na uvedených lidských buněčných liniích (IC50 = 74,9 resp. 115,5 μΜ), zatímco [Ru(p⁶pcym)Cl(L^b)]PF6 byla na použitých lidských buněčných liniích v testovaném koncentračním rozsahu neaktivní (IC50 > 200 μΜ).

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu jsou iontové polosendvičové koordinační sloučeniny osmia v oxidačním stupni +II obecného vzorce I

(I), kde:

- centrální atom M je osmium;

každý substituent R je póly cyklický aryl, který je nezávisle vybrán ze skupiny naftyl, anthracenyl, fenantrenyl nebo pyrenyl;

popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelných solvátů.

-2CZ 310511 B6

Farmaceuticky přijatelné solváty jsou zejména solváty s rozpouštědly vybranými ze skupiny voda, primární alkohol, sekundární alkohol, dichlormethan, aceton, w-hexan, diethylether, a jejich směsi. Typicky se tvoří solváty s jednou až čtyřmi molekulami rozpouštědla. Látky obecného vzorce I tvoří i solváty ve formě krystalosolvátů.

Koordinační sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou kationtové, tedy budou se vyskytovat ve sloučeninách s protiiontem. Protiiontem je farmaceuticky přijatelný aniont, s výhodou vybraný ze skupiny acetát, aspartát, benzensulfonát, benzoát, besylát, bikarbonát, bitartrát, bromid, kamsylát, karbonát, chlorid, citrát, dekanoát, edetát, esylát, fumarát, gluceptát, glukonát, glutamát, glykolát, hexanoát, hexafluorofosforečnan, hydroxynaftoát, jodid, isethionát, laktát, laktobionát, malát, maleát, mandelát, mesylát, methylsulfonát, napsylát, nitrát, oktanoát, oleát, pamoát, pantothenát, fosfát, polygalakturonát, propionát, salicylát, stearát, sukcinát, sulfát, tartrát, teoklát, tosylát.

Ve výhodném provedení je každý substituent R nezávisle vybrán ze skupiny 2-naftyl, 9anthracenyl, 9-fenantrenyl a 1-pyrenyl.

Předmětem předkládaného vynálezu jsou iontové polosendvičové koordinační sloučeniny osmia v oxidačním stupni +11 obecného vzorce I (I), kde:

- centrální atom M je osmium;

popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelných solvátů;

pro použití v medicíně, zejména pro použití v léčbě nádorových onemocnění, a to především pro použití v léčbě rakoviny plic. Látky obecného vzorce I snižují viabilitu nádorových buněk.

Předmětem předkládaného vynálezu je také příprava iontových polosendvičových koordinačních sloučenin osmia v oxidačním stupni +11 obecného vzorce I, a to postupem, který vychází z dvojjademé koordinační sloučeniny [Os(p-Cl)(p⁶-pcym)ClE, která reaguje s deriváty N,N'dimethylidenethan-l,2-diaminu Has hexafluorofosforečnanem amonným nebo draselným za vzniku finálních koordinačních sloučenin obecného vzorce I s aniontem PFe , které lze převést na sloučeniny s libovolným farmaceuticky přijatelným aniontem obecně známými postupy pro přípravu solí koordinačních sloučenin.

- 3 CZ 310511 B6

(Π)

Reakce přípravy koordinačních sloučenin obecného vzorce I se s výhodou provádí v mikrovlnném reaktoru při teplotě 100 °C po dobu 1 min.

Reakce se s výhodou provádí v prostředí rozpouštědla vybraného ze skupiny: primární alkohol, dichlormethan, a jejich směsi.

Ve výhodném provedení se produkt (koordinační sloučenina obecného vzorce I ve formě soli s PF„ aniontem) vysráží nebo vykrystalizuje, a oddělí se od matečného louhu filtrací nebo centrifugách Následně se oddělený produkt může s výhodou promýt vodou a rozpouštědlem vybraným ze skupiny: voda, primární alkohol, sekundární alkohol, dichlormethan, aceton, nhexan, diethylether, a jejich směsi. Izolovaný produkt lze následně vysušit v exikátoru nebo pod infralampou.

Organické sloučeniny II se připraví Schiffovou reakcí ethan- 1,2-diaminu s aldehydy příslušných polycyklických aromatických uhlovodíků v methanolu v mikrovlnném reaktoru při teplotě 60 °C po dobu 3 min.

Předmětem vynálezu je dále farmaceutický přípravek obsahující terapeuticky účinné množství iontové polosendvičové koordinační sloučeniny osmia v oxidačním stupni +11 obecného vzorce I, a alespoň jednu pomocnou látku. Pomocnými látkami mohou být zejména plniva, pojivá, rozpouštědla, kluzné látky, rozvolňovadla, stabilizátory, a/nebo chuťová a čichová korigencia. Farmaceutický přípravek je s výhodou kapalný, například ve formě injekčního nebo infúzního roztoku či přípravku pro perorální podání.

Objasnění výkresů

Obr. 1 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(Ll)]PF6 (1); LI = N,N'bis[naftalen-2-yhnethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 2 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(L2)]PFe (2); L2 = N,N'bis[anthracen-9-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 3 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(L3)]PFe (3); L3 = N,N'bis[fenanthren-9-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 4 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(L4)]PFe (4); L4 = N,N'bis[pyren-l-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 5 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Os(p⁶-pcym)Cl(Ll)]PF6 (5); LI = N,N'bis[naftalen-2-yhnethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 6 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Os(p⁶-pcym)Cl(L2)]PFe (6); L2 = N,N'bis[anthracen-9-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 7 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Os(p⁶-pcym)Cl(L3)]PFe (7); L3 = N,N'bis[fenanthren-9-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

-4CZ 310511 B6

Obr. 8 je HPLC chromatogram koordinační sloučeniny [Os(p⁶-pcym)Cl(L4)]PFe (8); L4 = N,N'bis[pyren-l-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (rozpuštěna v acetonitrilu).

Obr. 9 je molekulová struktura koordinační sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(L3)]PFe (3); L3 = N,N'bis[fenanthren-9-yhnethyliden]ethan-l,2-diamin. Vodíkové atomy nejsou zobrazeny.

Příklady uskutečnění vynálezu

V příkladech jsou uvedeny sloučeniny ruthenia a osmia, přičemž sloučeniny ruthenia jsou srovnávací látky a nejsou předmětem ochrany. Předmětem vynálezu jsou sloučeniny osmia.

V níže uvedených příkladech byly připravené koordinační sloučeniny ruthenia a osmia charakterizovány těmito analytickými technikami metodami:

• elementární analýza (Flash 2000 CHNS).

• nukleární magnetická rezonance (NMR; Varian-400 spektrometr) - byly provedeny 'H a Ή-Ή gs-COSY experimenty při teplotě 298 K. Studované sloučeniny byly rozpuštěny v DMSO-ri₆ (1 až 8) nebo CDCL (LI až L4) výsledná Ή NMR spektra byla referencována na residuální signály použitého rozpouštědla (2,50 ppm pro DMSO-óL a 7,26 ppm pro CDCL). Multiplety v ’H NMR spektrech jsou definovány následovně: s = singlet, d = dublet, t = triplet, sep = septet, bs = široký signál a m = multiplet.

• hmotnostní spektra byla zaznamenána po ionizaci elektrosprejem v pozitivním módu (ESI+) na přístroji LCQ Fleet. Studované sloučeniny pro ESI+ MS experimenty byly rozpuštěny v methanolu.

• vysokoúčinná kapalinová chromatografie na reverzní fázi (RP-HPLC) byla provedena na přístroji UHPLC-MS (Dionex/Thermo Fisher Scientific) za použití kolony Acclaim 120 (C18 stacionární fáze, 5 pm velikost částic, 120 Á velikost pórů, 2,1 * 50 mm). Mobilní fází byla směs acetonitrilu (A) a 0,1% kyseliny mravenčí ve vodě (B), ato s gradienty 20 % A (/ = 0 min), 80 % A (í = 15 min), 80 % A (í = 15 min), 20 % A (í = 21 min) a 20 % A (í = 30 min) v průběhu 30 min měření. Průtok mobilní fáze byl 0,4 mL min ¹ a detekovanou vlnovou délkou bylo 254 run.

• monokrystalová rentgenová strukturní analýza - monokrystalový difraktometr Stoe StadiVari, Pilatus3R 300K HPAD detektor, mikrofokusovaný zdroj rentgenového záření Xenocs Genix3D Cu HF, při teplotě 100 K. Pozn.: Pro potřeby monokrystalové rentgenové strukturní analýzy byly připraveny krystaly sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(L3)]PF6 (3). Rentgenová difrakce umožnila určit, že krystaly sloučeniny 3 jsou triklinické s prostorovou grupou a následovnými parametry Bravaisovy mřížky: a = 10,9952(2) Á, b = 11,5215(3) Á, c = 14,7761(3) Á, a = 95,418(2)°, β = 103,378(2)°, γ = 93,942(2)°, V = 1804,98(7) Á³. Difrakce na monokrystalu prokázala, že krystalová struktura sloučeniny 3 se skládá z komplexních kationtů [Ru(p⁶-pcym)Cl(L3)]⁺, které jsou nábojově kompenzovány PF„ anionty. Geometrie koordinačního polyedru komplexní částice je tzv. „piano stool“ typu spcym ligandem poskytujícím šest Ru-C vazeb (2,16 až 2,24 Á). Vazba Ru-Cl je nejdelší (2,3994(7) Á), zatímco Ru-N vazby s ligandem L3 jsou nejkratší (2,097(2) a 2,125(2) Á).

• Zkratka „RT“ ve schématech znamená laboratorní teplotu.

Příklad 1

- 5 CZ 310511 B6

Přípravy a charakterizace koordinačních sloučenin vzorce 1 až 8

Pro syntézu koordinačních sloučenin 1 až 8 byly využity komerčně dostupné soli RuCLxILO (CAS No. 14898-67-0), OsC1₃xH₂O (CAS No. 14996-60-2), NH4PF6 (CAS No. 16941-11-0) a MgSO4 (CAS No. 7487-88-9), a organické sloučeniny 1 -methyl-4-(propan-2-yl)cyklohexa-1,3dien (α-terpinen; CAS No. 99-86-5), ethan- 1,2-diamin (CAS No. 107-15-3), naftalen-2karbaldehyd (CAS No. 66-99-9), anthracen-9-karbaldehyd (CAS No. 642-31-9), fenanthren-9karbaldehyd (CAS No. 4707-71-5), pyren-l-karbaldehyd (CAS No. 3029-19-4), které byly zakoupeny od společností Merck Life Science spol. s r.o. (Praha, Česká republika), VWR International s. r. o. (Stříbrná Skalice, Česka republika) a Lach-Ner, s.r.o. (Neratovice, Česka republika). Použitá rozpouštědla (methanol, diethylether, dichlormethan, n-hexan, kyselina octová) byla zakoupena od stejných dodavatelů. Deuterovaná rozpouštědla byla zakoupena od Merck Life Science spol. s r.o. (Praha, Česka republika) a Chemstar Czech Republic, s r.o. (Plzeň, Česka republika).

Výchozí koordinační sloučeniny [Ru(p-Cl)(p⁶-pcym)Cl]2 (Bennett et al., Inorg. Synth. 21 (1982) 74) a [Os(p-Cl)(p⁶-pcym)Cl]2 (Arthur & Stephenson et al., J. Organomet. Chern. 208 (1981) 369) byly připraveny v mikrovlnném reaktoru Monowave 300 (Anton Paar GmbH, Rakousko), jak bylo popsáno dříve (Tónnemann et al., Eur. J. Inorg. Chem. 2013 (2013) 4558; Coverdale et al., Chem. Eur. J. 21 (2015) 8043).

Organické sloučeniny obecného vzorce II: W'-bis|naftalcn-2-ylmethyliden]ethan- 1,2-diamin (LI), A(N'-bis[anthracen-9-ylmethyliden]ethan-l,2-diamin (L2), W'-bis|fcnanthrcn-9ylmethyliden]ethan-1,2-diamin (L3) a W'-bis|pyrcn-l-ylmcthylidcn|cthan-l.2-diamin (L4, L^b) se připraví analogickými syntézami (schéma 1). Deriváty LI (Srivastava & Mishra, J. Ind. Chem. Soc. 72 (1995) 719), L2 (Johnson et al., WO9623010 A2 (1996)) a L4 (Paulus et al., DE19650789 Al (1998)) byly již dříve publikovány. Derivát L3 je nový.

+ 2 _O^_R methanol

CH₃COOH °C, 3 min

(MW = mikrovlnný reaktor)

Schéma 1

Ethan-1,2-diamin (1 mmol) se přidá do suspenze stechiometrického množství (2 mmol) aldehydu příslušného polycyklického aromatického uhlovodíku v 10 ml metanolu. Reakční směs se okyselí čtyřmi kapkami konc. kyseliny octové a poté reaguje v mikrovlnném reaktoru při teplotě 60 °C po dobu 3 min. Vzniklé organické sloučeniny (LI až L4) se odfiltrují, promyjí metanolem a vysuší v sušárně (50 °C). Strukturní vzorce sloučenin LI až L4 jsou uvedeny zde níže:

-6CZ 310511 B6

Sloučenina N,N'-bis(2-naftyhnethylen)ethan-l,2-diamin (LI): Bílá pevná látka. Výtěžek: 85 %. Elementární analýza: vypočítané pro C24H20N2: C, 85,7; H, 6,0; N, 8,3 %; zjištěné: C, 86,1; H, 6,2; N, 8,2 %. Ή NMR (400 MHz, CDCI3, 298 K, ppm): δ 8,46 (s, 2H), 7,97 (m, 4H), 7,84 (m, 6H), 7,49 (m, 4H), 4,08 (s, 4H).

Sloučenina W'-bis(9-anthraccnylmcthylcn)cthan-l.2-diamin (L2): Světle žlutá pevná látka. Výtěžek: 80 %. Elementární analýza: vypočítané pro C32H24N2: C, 88,0; H, 5,5; N, 6,4 %; zjištěné: C, 87,7; H, 5,4; N, 6,5 %. Ή NMR (400 MHz, CDCI3, 298 K, ppm): δ 9,50 (s, 2H), 8,44 (m, 6H), 7,96 (d, J= 8,2 Hz, 4H), 7,36 (t, J= 7,4 Hz, 4H), 7,12 (t, J= 7,6 Hz, 4H), 4,52 (s, 4H).

Sloučenina VN'-bis(9-fcnantrcnylmcthylcn)cthan-l.2-diamin (L3): Světle žlutá pevná látka. Výtěžek: 90 %. Elementární analýza: vypočítané pro C32H24N2: C, 88,0; H, 5,5; N, 6,4 %; zjištěné: C, 87,9; H, 5,3; N, 6,2 %. Ή NMR (400 MHz, CDCI3, 298 K, ppm): δ 8,99 (s, 2H), 8,92 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 8,67 (m, 4H), 8,08 (s, 2H), 7,88 (d, J= 7,8 Hz, 2H), 7,68 (d, J= Hz, 2H), 7,59 (q, J= 8,3 Hz, 4H), 7,40 (t, J= 7,6 Hz, 2H), 4,26 (s, 4H).

Sloučenina NN'-bis(l-pyrcnylmcthylcn)cthan-l.2-diamin (L4): Světle žlutá pevná látka. Výtěžek: 85 %. Elementární analýza: vypočítané pro C36H24N2: C, 89,2; H, 5,0; N, 5,8 %; zjištěné: C, 89,0; H, 5,3; N, 5,6 %. Ή NMR (400 MHz, CDCI3, 298 K, ppm): δ 9,33 (s, 2H), 8,68 (d, J= 9,4 Hz, 2H), 8,52 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 8,16 (d, J= 8,2 Hz, 4H), 8,01 (m, 8H), 7,79 (d, J= 9,4 Hz, 2H), 4,36 (s, 4H).

Koordinační sloučeniny [Ru(p⁶-pcym)Cl(Ll)]PFe (1), [Ru(p⁶-pcym)Cl(L2)]PFe (2), [Ru(p⁶pcym)Cl(L3)]PF6 (3), [Ru(p⁶-pcym)Cl(L4)]PFe (4) (sloučeniny 1 až 4 jsou srovnávací látky), [Os(p⁶-pcym)Cl(Ll)]PF6 (5), [Os(p⁶-pcym)Cl(L2)]PFe (6), [Os(p⁶-pcym)Cl(L3)]PFe (7) a [Os(p⁶pcym)Cl(L4)]PF6 (8) obsahující deriváty ethan- 1,2-diaminu LI až L4, byly připraveny syntetickým postupem (schéma 2), na jehož počátku byla výchozí koordinační sloučenina [Ru(pCl)(p⁶-pcym)Cl]2 (30,6 mg; 0,05 mmol; pro sloučeniny 1 až 4) nebo [Os(p-Cl)(p⁶-pcym)Cl]2 (39,5 mg; 0,05 mmol; pro sloučeniny 5 až 8) smíchána s organickými sloučeninami obecného vzorce II, kterými jsou ligandy LI až L4 (0,15 mmol; 50,5 mg pro LI, 65,5 mg pro L2 a L3, a 72,7 mg pro L4) v 5 ml metanolu. Reakční směs byla zahřáta na 100 °C po dobu 1 min v mikrovlnném reaktoru Monowave 300. Po ochlazení na laboratorní teplotu (cca. 22 °C) byla vzniklá směs přefiltrována a byl do ní přidán nadbytek NH4PF6 (40,8 mg; 0,25 mmol). Směs byla míchána po dobu 15 min. Následně byl snížen objem rozpouštědla na 1 až 2 ml. Vzniklý pevný produkt byl odfiltrován a opětovně rozpuštěn ve 3 ml dichlormethanu. K tomuto roztoku byl přidán stejný objem vody a vzniklá směs byla důkladně protřepána. Po oddělení dichlormethanové fáze byl tento roztok vysušen přidáním MgSO4 a po následné filtraci byl filtrát zahuštěn (plynný dusík) na cca. 1 ml objemu. Následným přídavkem n-hexanu (5 ml) byl získán

-7 CZ 310511 B6 pevný produkt, který byl odfiltrován a opakovaně promyt diethyletherem (3x2 ml). Produkty byly vysušeny v sušárně (50 °C).

N sRu nebo Os MW = mikrovlnný reaktor

methanol

a) 100 C, 1 min, MW b) NH₄PF₆,15 min, RT

Í1-S)

Schéma 2

Alternativně lze koordinační sloučeniny 1 až 8 připravit podle schématu 3. Výchozí koordinační sloučeniny [Ru(p-Cl)(p⁶-pcym)Cl]2 (30,6 mg; 0,05 mmol; pro sloučeniny 1 až 4) nebo [Os(pCl)(p⁶-pcym)Cl]2 (39,5 mg; 0,05 mmol; pro sloučeniny 5 až 8) byly smíchány s organickými sloučeninami obecného vzorce II, kterými jsou ligandy LI až L4 (0,15 mmol; 50,5 mg pro LI, 65,5 mg pro L2 a L3, a 72,7 mg pro L4) v 5 ml metanolu. Reakční směs byla míchána za pokojové teploty po dobu 24 h. Poté byla vzniklá směs přefiltrována a do filtrátu byl přidán NPLPFe (40,8 mg; 0,25 mmol). Vzniklý pevný produkt byl odfiltrován a opětovně rozpuštěn ve 3 ml dichlormethanu. K tomuto roztoku byl přidán stejný objem vody a vzniklá směs byla důkladně protřepána. Po oddělení dichlormethanové fáze byl tento roztok vysušen přidáním MgSO4 a po následné filtraci byl filtrát zahuštěn (plynný dusík) na cca. 1 ml objemu. Následným přídavkem n-hexanu (5 ml) byl získán pevný produkt, který byl odfiltrován a opakovaně promyt diethyletherem (3x2 ml). Produkty byly vysušeny v sušárně (50 °C).

M » Ru ft&bc Oš

s) 24 N RT

RT

Schéma 3

Koordinační sloučenina 4 byla již dříve publikována (Gopalakrishnan et al., Appl. Organometal. Chem. 33 (2019) e4756).

Sloučenina [Ru(p⁶-pcym)Cl(Ll)]PF6 (1): Oranžovo-červená pevná látka. Výtěžek: 85 %. Elementární analýza: vypočítané pro C34H34N2CIF6PRU: C, 54,3; H, 4,6; N, 3,7 %; zjištěné: C, 54,1; H, 4,3; N, 3,6 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-í/₆, 298 K, ppm): δ 9,37 (s, 2H), 8,77 (s, 2H), 8,48 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 8,21 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 8,10 (m, 4H), 7,72 (m, 4H), 4,89 (d, J= 6,1 Hz, 2H), 4,68 (d, J= 6,1 Hz, 2H), 4,07 (m, 2H), 3,74 (m, 2H), 2,63 (sep, J= 6,9 Hz, 1H), 2,07 (s, 3H), 1,04 (d, J = 6,9 Hz, 6H). ESI+ MS (MeOH, m/z)'. 571,2 (vypočteno pro {[Ru(Ll)(pcym)]H⁺}⁺: 571,2; 50 %), 607,2 (vypočteno pro [RuCl(Ll)(pcym)]⁺: 607,1; 100 %).

-8CZ 310511 B6

Sloučenina [Ru(p⁶-pcym)Cl(L2)]PFe (2): Žlutá pevná látka. Výtěžek: 70 %. Elementární analýza: vypočítané pro C42H₃₈N2C1F₆PRu: C, 59,2; H, 4,5; N, 3,3 %; zjištěné: C, 58,8; H, 4,4; N, 3,0 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-d_Ř 298 K, ppm): δ 9,78 (s, 2H), 9,01 (m, 6H), 8,45 (bs, 2H), 8,07 (d, J= 7,8 Hz, 2H), 7,87 (m, 8H), 4,34 (bs, 4H), 4,24 (bs, 2H), 3,91 (bs, 2H), 2,39 (sep, J= Ίβ Hz, 1H), 1,76 (s, 3H), 0,78 (d, J = 6,9 Hz, 6H). ESI+ MS (MeOH, m/z): 707,4 (vypočteno pro [RuCl(L2)(pcym)]⁺: 707,2; 100 %).

(2)

Sloučenina [Ru(p⁶-pcym)Cl(L3)]PF6 (3): Žlutá pevná látka. Výtěžek: 75 %. Elementární analýza: vypočítané pro C42H₃₈N2C1F₆PRu: C, 59,2; H, 4,5; N, 3,3 %; zjištěné: C, 59,1; H, 4,2; N, 2,9 %.

Ή NMR (400 MHz, DMSO-íL. 298 K, ppm): δ 10,14 (s, 2H), 8,93 (bs, 2H), 8,47 (d, J= 8,6 Hz,

1H), 8,37 (d, J= 8,6 Hz, 1H), 8,22 (m, 6H), 7,65 (m, 8H), 4,35 (bs, 4H), 4,11 (d, J= 6,3 Hz, 1H), 3,63 (d, J= 6,3 Hz, 1H), 2,29 (d, J= 5,9 Hz, 1H), 1,97 (d, J= 5,9 Hz, 1H), 1,86/1,49 (2 x sep, J = 6,8 Hz, 1H), 1,60/1,23 (2 x s, 3H), 0,58/-0,06 (2 x d, J= 6,6 Hz, 6H). ESI+ MS (MeOH, m/z): 671,0 (vypočteno pro {[Ru(L3)(pcym)]-H⁺}⁺: 671,2; 10 %), 707,0 (vypočteno pro

[RuCl(L3)(pcym)]⁺: 707,2; 100 %).

-9CZ 310511 B6

(3)

Sloučenina [Ru(p⁶-pcym)Cl(L4)]PFe (4): Žlutá pevná látka. Výtěžek: 80 %. Elementární analýza: vypočítané pro C46H₃₈N2C1F₆PRu: C, 61,4; H, 4,3; N, 3,1 %; zjištěné: C, 61,1; H, 4,0; N, 2,9 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-íL. 298 K, ppm): δ 10,12 (s, 2H), 9,20 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 8,71 (d, J = 9,2 Hz, 2H), 8,45 (m, 12H), 8,20 (t, J= 9,2 Hz, 2H), 4,40 (m, 4H), 4,10 (bs, 2H), 4,00 (m, 2H), 2,51 (s, 1H), 1,91 (s, 3H), 0,85 (d, J= 6,9 Hz, 6H). ESI+ MS (MeOH, m/z)·. 719,3 (vypočteno pro {[Ru(L4)(pcym)]-H⁺}⁺: 719,3; 10 %), 755,4 (vypočteno pro [RuCl(L4)(pcym)]⁺: 755,2; 100 %).

(4)

Sloučenina [Os(p⁶-pcym)Cl(Ll)]PF6 (5): Červená pevná látka. Výtěžek: 90 %. Elementární analýza: vypočítané pro C34H34N2CIF6OSP: C, 48,5; H, 4,1; N, 3,3 %; zjištěné: C, 48,2; H, 4,5; N, 3,0 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-0/4. 298 K, ppm): δ 9,38 (s, 2H), 8,69 (s, 2H), 8,35 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 8,17 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 8,08 (d, J= 8,2 Hz, 4H), 7,71 (m, 4H), 5,14 (d, J= 5,6 Hz, 2H), 4,83 (d, J= 5,6 Hz, 2H), 4,05 (bs, 2H), 3,86 (bs, 2H), 2,54 (sep, J = 6,9 Hz, 1H), 2,08 (s, 3H), 1,04 (d, J = 6,9 Hz, 6H). ESI+ MS (MeOH, m z): 661,2 (vypočteno pro {[Os(Ll)(pcym)]H⁺}⁺: 661,2; 25 %), 697,1 (vypočteno pro [OsCl(Ll)(pcym)]⁺: 697,2; 100 %).

(5)

- 10 CZ 310511 B6

Sloučenina [Os(p⁶-pcym)Cl(L2)]PF6 (6): Červená pevná látka. Výtěžek: 85 %. Elementární analýza: vypočítané pro C42H38N2CIF6OSP: C, 53,6; H, 4,1; N, 3,0 %; zjištěné: C, 53,9; H, 3,7; N, 2,9 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-d_Ř 298 K, ppm): δ 9,78 (s, 2H), 9,04 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 8,97 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 8,87 (s, 2H), 8,38 (m, 2H), 8,04 (d, J= 8,0 Hz, 2H), 7,85 (m, 8H), 4,34 (bs, 4H), 4,05 (m, 4H), 2,34 (bs, 1H), 1,80 (s, 3H), 0,78 (d, J = 6,9 Hz, 6H). ESI+ MS (MeOH, m/z)·. 797,2 (vypočteno pro [OsCl(L2)(pcym)]⁺: 797,2; 100 %).

Sloučenina [Os(p⁶-pcym)Cl(L3)]PF6 (7): Oranžovo-červená pevná látka. Výtěžek: 75 %. Elementární analýza: vypočítané pro C42H38N2CIF6OSO: C, 53,6; H, 4,1; N, 3,0 %; zjištěné: C, 53,7; H, 3,9; N, 2,8 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 298 K, ppm): δ 10,24 (s, 2H), 8,92 (bs, 2H), 8,40 (d, J= 8,6 Hz, 2H), 8,27 (m, 4H), 8,16 (t, J= 8,8 Hz, 2H), 7,64 (m, 8H), 4,45 (m, 5H), 3,96 (d, J= 9,4 Hz, 1H), 2,20 (d, J= 9,4 Hz, 1H), 1,88/1,34 (2 x bs, 1H), 1,80 (d, J= 14,8 Hz, 1H), 0,61 (m, 6H), -0,03 (bs, 3H). ESI+ MS (MeOH, m/z)·. 761,2 (vypočteno pro {[Os(L3)(pcym)]-H⁺}⁺: 761,3; 25 %), 797,2 (vypočteno pro [OsCl(L3)(pcym)]⁺: 797,2; 100 %).

Sloučenina [Os(p⁶-pcym)Cl(L4)]PF6 (8): Oranžovo-červená pevná látka. Výtěžek: 70 %. Elementární analýza: vypočítané pro C46H38N2CIF6OSP: C, 58,8; H, 3,9; N, 2,8 %; zjištěné: C, 58,9; H, 3,7; N, 2,5 %. Ή NMR (400 MHz, DMSO-d₆, 298 K, ppm): δ 10,12 (s), 10,06 (s), 9,18 (d, J= 8,2 Hz), 9,08 (d, J= 7,8 Hz), 8,66 (d, J= 9,0 Hz), 8,40 (m), 5,79 (d, J= 5,5 Hz), 5,46 (d, J = 5,5 Hz), 5,31 (d, J= 5,5 Hz), 5,04 (d, J= 5,5 Hz), 4,65 (bs), 4,41 (bs), 4,28 (bs), 4,13 (bs), 4,00 (bs), 3,66 (bs), 2,78 (sep, J= 6,7 Hz), 3,18 (s), 1,97 (s), 1,23 (d, J= 7,0 Hz), 0,88 (d, J= 6,7 Hz). ESI+ MS (MeOH, m/z)·. 809,3 (vypočteno pro {[Os(L4)(pcym)]-H⁺}⁺: 809,3; 20 %), 845,2 (vypočteno pro [OsCl(L4)(pcym)]⁺: 845,2; 100 %).

- 11 CZ 310511 B6

(8)

Příklad 2

In vitro cytotoxicita sloučenin vzorce 1 až 8 vůči buněčným liniím odvozených z nádorů plic

Pro stanovení in vitro cytotoxicity koordinačních sloučenin vzorce 1 až 8 vůči lidským buněčným liniím odvozených z plicních nádorů A549, MOR a MOR/CPR byla použita mikrotitrační kolorimetrická analýza využívající 2-(2-methoxy-4-nitrofenyl)-3-(4-nitrofenyl)-5-(2,4disulfofenyl)-2H-tetrazolium sodný (CCK-8). Testem je spektrofotometricky stanovena absorbance oranžového barviva (tj. zredukovaného CCK-8), které odpovídá počtu metabolicky aktivních (tj. životaschopných) buněk, které, na rozdíl od buněk mrtvých, enzymaticky redukují použité CCK-8 barvivo na jeho oranžový formazán.

Lidská buněčná linie A549 je adherentní linie pořízená od společnosti European Collection of Authenticated Cell Cultures (katalogové číslo 86012804). Byla odvozena z plicního karcinomu 581etého bělocha. Funkčně se jedná o epiteliální buňky.

Lidská buněčná linie MOR je adherentní linie pořízená od společnosti European Collection of Authenticated Cell Cultures (katalogové číslo 84112312). Byla odvozena z plicního adenokarcinomu. Jedná se o buňky podobné epiteliálním, které rostou v koloniích.

Buněčná linie MOR/CPR byla pořízena od společnosti European Collection of Authenticated Cell Cultures (katalogové číslo 96042333). Je odvozena od linie MOR (ECACC katalogové číslo 84112312) a vyznačuje se rezistencí kcisplatině. Roste adherentně v koloniích a jako agregáty v suspenzi.

Buňky A549 byly pěstovány v DMEM médiu s vyšším obsahem glukosy (4,5 g/1) s přídavkem 10 % fetálního bovinního séra, 2 mM L-glutaminu a 1 % antibiotik penicilin-streptomycin. Buňky MOR a MOR/CPR se kultivovaly v RPMI 1640 médiu s přídavkem 10 % fetálního bovinního séra, 2 mM L-glutaminu a 1 % antibiotik penicilin-streptomycin. Médium pro MOR/CPR buňky navíc obsahovalo cisplatinu o koncentraci 1 pg/ml. Všechny linie byly kultivovány v inkubátoru při 37 °C, 100% vlhkosti a atmosféře 5% CO2.

Testované koordinační sloučeniny 1 až 8 byly rozpuštěny v W'-dimcthylformamidu (DMF) pro přípravu 20,0 mM zásobního roztoku. Pro vlastní experiment byl zásobní roztok ředěn médiem do koncentrací 20 μΜ, 10 pM, 5 pM, 2,5 pM, 1,25 pM, 0,63 pM, 0,31 pM a 0,16 pM. Koncentrace DMF byla ve všech testovaných koncentracích konstantní, a to 0,1 % (v/v).

Suspenze buněk A549, MOR a MOR/CPR byly pipetovány do 96jamkové mikrotitrační destičky v objemu 100 pl a množství PI0⁴ buněk na jamku. Následně se buňky ponechaly přisednout 16 h, poté byly nepřisednuté buňky odsáty společně s kultivačním mediem. Do čerstvého média

- 12 CZ 310511 B6 (pozn. médium pro MOR/CPR v této fázi testování neobsahovalo cisplatinu) byly k buňkám přidány koordinační sloučeniny 1 až 8 v koncentracích 20 μΜ, 10 μΜ, 5 μΜ, 2,5 μΜ, 1,25 μΜ, 0,63 μΜ, 0,31 μΜ a 0,16 μΜ. Jako negativní kontrola sloužily buňky, které byly ovlivněny pouze 0,1% (v/v) DMF. Ovlivněné buňky byly následně kultivovány 72 h (37 °C, 100% vlhkost, 5% CO2). Po expozici bylo k buňkám přidáno činidlo CCK-8 a následovala inkubace 45 min (37 °C, 100% vlhkost, 5% CO2). Poté byla provedena spektrofotometrická analýza přístrojem BioTek ELx800 při vlnové délce 450 a 630 nm. Pro každou koordinační sloučeninu a každou její koncentraci bylo změřeno pozadí, což bylo čisté kultivační médium pouze s obsahem dané sloučeniny v dané koncentraci. Následně byla vypočtena viabilita (životaschopnost) buněk podle vzorce:

viabilita. (%)

[,4_45o(vzorku) — A₆₃₀ (vzorku)] — M_+so(pozadí vzorku) — A₆₃₀(pozadí vzorku)} — __________;_________ ~____________2_______________I______________________________________________________,_________________________________ 0 0 i^4so(^.k.)- Á₆₃₀(n. k.)] — M₄5o(pozadí n. k.) — j4₆₃₀(pozadí n.k,)] kde A450 je absorbance při 450 nm, Aeso je absorbance při 630 nm a n.k. je negativní kontrola ovlivněná pouze 0,1% (v/v) DMF.

Viabilita buněk byla vypočítána pro všechny koncentrace testovaných koordinačních sloučenin 1 až 8. Byly provedeny tři nezávislé experimenty (každý z nich v tripletu) vždy z nově pasážovaných buněk. Inhibiční koncentrace (IC50) testovaných sloučenin, která odpovídá koncentraci testovaných látek potřebné k inhibici růstu 50 % vložených nádorových buněk, byla vypočítaná z dávkových křivek a je uvedená v Tabulce 1.

Tabulka 1: Výsledky testování in vitro cytotoxicity koordinačních sloučenin 1 až 8 vůči lidským nádorovým liniím A549, MOR a MOR/CPR stanovené za využití CCK-8 testu. Výsledky jsou vyjádřeny v hodnotách inhibiční koncentrace IC50 ± standardní chyba průměru (SEM).


A549	MOR	MOR/CPR
1	6,0 ± 1,1 μΜ	7,2 ± 1,3 μΜ	2,1 ± 1,1 μΜ
2	3,3 ± 1,2 μΜ	6,6 ± 1,1 μΜ	3,0 ± 1,1 μΜ
3	3,9 ± 1,1 μΜ	5,2 ± 1,1 μΜ	2,0 ± 1,0 μΜ
4	3,0 ± 1,2 μΜ	3,3 ± 1,1 μΜ	2,6 ± 1,1 μΜ
5	1,2 ± 1,2 μΜ	1,7 ± 1,1 μΜ	0,5 ± 1,1 μΜ
6	3,4 ± 1,1 μΜ	5,4 ± 1,0 μΜ	2,9 ± 1,0 μΜ
7	1,5 ± 1,2 μΜ	2,8 ± 1,1 μΜ	2,0 ± 1,1 μΜ
8	2,2 ± 1,2 μΜ	4,2 ± 1,2 μΜ	2,2 ± 1,1 μΜ
Cisplatina	15,6 ± 1,1 μΜ	6,3 ± 1,1 μΜ	20 μΜ <

Claims

1. Iontové koordinační sloučeniny obecného vzorce I

(I), kde:

- centrální atom M je osmium;

- každý substituent Rje polycyklický aryl, který je nezávisle vybrán ze skupiny 2-naftyl, 9anthracenyl, 9-fenantrenyl nebo 1-pyrenyl;

popřípadě ve formě farmaceuticky přijatelných solvátů.

2. Iontové koordinační sloučeniny podle nároku 1 pro použití jako léčivo.

3. Iontové koordinační sloučeniny podle nároku 1 pro použití pro léčení nádorových onemocnění.

4. Iontové koordinační sloučeniny pro použití podle nároku 3, kde nádorovým onemocněním je rakovina plic.

5. Iontové koordinační sloučeniny podle nároku 1 nebo koordinační sloučeniny pro použití podle kteréhokoliv z nároků 2 až 4, kde farmaceuticky přijatelný solvát je solvát s molekulou rozpouštědla vybranou ze skupiny voda, primární alkohol, sekundární alkohol, dichlormethan, aceton, w-hexan, diethylether, a jejich směsi; a počet molekul rozpouštědla na molekulu koordinační sloučeniny je v rozmezí 1 až 4.

6. Způsob přípravy iontové koordinační sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že vychází ze sloučeniny [Os(p-Cl)(p⁶-pcym)Cl]2, kde pcym je para-cymen, která se nechá reagovat s ekvimolámím množstvím derivátu Λζ/V'-dimethylidenethan-1,2-diaminu obecného vzorce II (II), kde každý substituent Rje polycyklický aryl, který je nezávisle vybrán ze skupiny 2-naftyl, 9anthracenyl, 9-fenantrenyl nebo 1-pyrenyl;

a s nadbytkem hexafluorfbsforečnanu.

7. Způsob podle nároku 6, vyznačující se tím, že

- reakce přípravy iontové koordinační sloučeniny obecného vzorce I definované v nároku 1 se provádí v mikrovlnném reaktoru při zvýšené teplotě a tlaku, s výhodou při teplotě 100 °C po dobu 1 min, a/nebo

- 14CZ 310511 B6

- reakce přípravy iontové koordinační sloučeniny obecného vzorce I se provádí v prostředí rozpouštědla vybraného ze skupiny: voda, primární alkohol, dichlormethan a jejich směsi.

8. Farmaceutický přípravek, vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství alespoň jedné iontové koordinační sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 a alespoň jednu

5 pomocnou látku.