CZ310708B6 - Zalévací média pro elektronovou mikroskopii s vyšší odolností vůči poškození elektronovým svazkem a způsob přípravy vzorků pro elektronovou mikroskopii - Google Patents

Abstract

Zalévací médium pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii, které obsahuje od 85 do 95 % hmotn epoxidové a/nebo, akrylátové zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 15 % hmotn. stabilizačního činidla. Způsob přípravy média a jeho použití pro přípravu vzorku.

Description

Zalévací média pro elektronovou mikroskopii s vyšší odolností vůči poškození elektronovým svazkem a způsob přípravy vzorků pro elektronovou mikroskopii

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových zalévacích médií a způsobu přípravy vzorků pro elektronovou mikroskopii tak, aby připravené vzorky vykazovaly vyšší odolnost vůči nabíjení při interakci s elektronovým svazkem, čímž se principiálně umožní nebo podstatně vylepší zobrazení zalévaných preparátů (omezí se artefakty související s nabíjením a zvýší se kontrast).

Dosavadní stav techniky

Trojrozměrné (3D) zobrazování biologických objektů je nej výraznějším trendem biologické elektronové mikroskopie v posledních letech. Důvodem je skutečnost, že trojrozměrné zobrazování přináší možnost studovat 3D architekturu biologických systémů a jejich vzájemné interakce na úrovni buněk, buněčných organel i vybraných makromolekulámích komplexů. Současná skenovací elektronová mikroskopie (dále SEM) nabízí tři metody 3D zobrazování (3DSEM) v závislosti na velikosti analyzované oblasti: FIB-SEM (focused ion beam SEM; SEM metoda fokusovaného iontového svazku), SBF-SEM (serial block face SEM; SEM metoda sériového snímání čelní plochy bloku) a AT-SEM (array tomography SEM; někdy též microarray tomography SEM; SEM metoda tomografie sériových řezů).

Metoda FIB-SEM je založena na odprašování vybrané oblasti pomocí svazku fokusovaných iontů (nejčastěji Ga) a nasnímání nově odhaleného povrchu vzorku pomocí svazku elektronů (Heymann JAW et al. 2006: J. Struct. Biol. 155, 63 až 73). Metoda FIB-SEM je poměrně univerzální a použitelná pro širokou škálu materiálů, ale je vhodná jen pro 3D vizualizaci menších částí buněk nebo izolovaných buněčných organel.

Metoda SBF-SEM spočívá v odkrajování ultratenkých řezů s tloušťkou od 20 nm pomocí malého ultramikrotomu přímo v komoře SEM mikroskopu. Vybrané oblasti na nově odhaleném povrchu pryskyřičného bloku se zalitým vzorkem jsou poté snímány a použity k následné 3D rekonstrukci dané oblasti (Denk W et al. 2004: PLoSBiol. 2, 329). Metodu SBF-SEM lze použít - ve srovnání s metodou FIB-SEM - pro 3D zobrazování větších částí buněk, celých buněk i buněčných tkání.

Metoda AT-SEM (Micheva KD et al. 2007: Neuron 55, 25 až 36) je založena na sériových řezech, které jsou krájeny pomocí ultramikrotomu mimo komoru SEM mikroskopu. Pásky řezů jsou pak posbírány na křemíkovou podložku (Si wafer) a pozorovány ve vysokorozlišujícím SEM, kde jsou vybrané oblasti postupně nasnímány na každém řezu. Tato metoda umožňuje 3D rekonstrukci největších objektů v SEM, jako jsou celé buňky, větší oblasti tkání nebo malé organismy.

Každá z výše popsaných metod vykazuje určité výhody a nevýhody, nicméně všechny jsou založeny na principu sériových řezů biologickými preparáty. Proto se pro všechny uvedené metody používá stejný protokol přípravy biologických vzorků, včetně nutnosti zpevnit vzorky před vlastním krájením zalitím do vhodné pryskyřice (Kizilyaprak C. et al., 2015: J. Struc. Biol. 189, 135 až 146). Pro tvorbu obrazu se v SEM používá signál zpětně odražených elektronů (BSE), což v kombinaci s použitím nízkého urychlovacího napětí (u SBF obvykle do 3 kV) vede k nutnosti přidávat do vzorku během fixace a dehydratace větší množství těžkých kovů, aby se zvýšil výsledný obrazový kontrast.

Hlavním problémem 3D aplikací v SEM, které používají preparát zalitý do epoxidové pryskyřice, je nedostatečná elektrická vodivost vzorku, což při ozáření primárními elektrony vede kjeho nabíjení. Důsledkem jsou obrazové defekty a významné snížení rozlišovací schopnosti. Problému lze v zásadě čelit dvěma způsoby: (a) úpravou SEM mikroskopu a/nebo podmínek v komoře

- 1 CZ 310708 B6

SEM při sběru dat a (b) úpravou preparátů tak, aby byly odolnější vůči nabíjení v důsledku interakce s elektronovým svazkem.

Pokud jde o první skupinu řešení (omezení nabíjení vzorku pomocí úpravy SEM mikroskopu a/nebo podmínek snímání v SEM), bylo navrženo několik možností: (i) Technicky nejjednodušší je použití již existujícího nízkovakuového módu SEM, kdy tlak v preparátové komoře může dosáhnout až stovek Pa (Stokes DJ 2001: Adv. Eng. Mat. 3, 126 až 130). Důsledkem přítomnosti větších množství plynu v preparátové komoře je však zhoršení poměru signál/šum a významná ztráta rozlišení kvůli interakcím elektronů s molekulami plynu předtím, než elektrony dorazí k detektoru, (ii) Další možné řešení je, analogicky jako při standardním postupu přípravy biologického preparátu pro SEM, použít pokovování vzorku tenkou vrstvou vodivého kovu. Lze tedy použít speciální pokovovací zařízení pro SBF-SEM metodu umožňující přímé pokovení bločku pro odříznutí ultratenkého řezu v preparátové komoře SEM (Tietz B and Denk W 2013: J. Microscopy, 250, 101 až 110). (iii) Se zajímavým řešením přišla firma ZEISS (patent US 10 115 558 B2). Je založeno na lokální kompenzaci náboje prostřednictvím injektáže nepatrného množství vhodného plynu do oblasti vzorku ozařovaného primárními elektrony. Nevýhodou posledních dvou řešení je nutnost pořídit si speciální SEM mikroskop, či výrazně modifikovat stávající stroj, pokud je to možné.

Pokud jde o druhou skupinu řešení (omezení nabíjení vzorku pomocí chemických modifikací samotného preparátu), i zde se zkoušela řada možností, (i) Bylo ukázáno, že intenzivní kontrastování těžkými kovy u některých typů vzorků, např. nervových tkání, vede ke snížení nabíjení (Deerinck TJ 2010: Microsc. Microanal. 16, 1138 až 1139, Hua et al. 2015: Nature Com. 6, 7923). Nicméně toto řešení nefunguje pro vzorky obsahující velké oblasti vyplněné čistou pryskyřicí, např. plicní nebo ledvinová tkáň, nebo tkáně s nízkým obsahem lipidů jako jsou kosti, svaly nebo rostlinné tkáně, případně i suspenze izolovaných buněk, (ii) Jiným pokusem bylo zvýšit vodivost zalévacích médií přidáním stříbrných koloidních částic (Wanner et al. 2016: Nat. Neurosci. 19, 816 až 825), nebo uhlíkových nanočástic (Nguyen et al., 2016: Sci. Rep. 6, 23721). Značnou nevýhodou zde bylo snížení schopnosti penetrace pryskyřice do vzorků nebo její zčernání, což vede k problémům s nalezením zalitého preparátu, (iii) Další pokus o zvýšení vodivosti spočíval v tom, že do pryskyřic byly zabudovány různé polovodivé či vodivé složky (patent US 2016/0163505 Al), což byly jednak větší organické molekuly sp²-konjugovaného typu (koronannulen, perylen, hemoglobin) nebo polovodivé či vodivé nanočástice (vícevrstvé uhlíkové nanotrubičky, bílkovinné komplexy obsahující kovy). Komplikaci zde ovšem představovala náročná dispergace konjugovaných molekul nebo nanočástic, které nemají vysokou rozpustnost v použitých pryskyřicích. Jejich agregace snižuje kvalitu získaných snímků, (iv) V roce 2021 byl patentován přídavek polyetylenglykolu (PEG) do epoxidových pryskyřic v rozsahu 2 až 20 % s cílem zvýšit jejich vodivost při SBF SEM analýze prováděné při urychlovacím napětí pod 3 kV (patent US 2021/0333177 Al). (v) Polyethylenglykol nebo podobné molekuly spolu se solemi alkalických kovů byly klíčovou složkou také ve starším patentu (JP H03122165A), který v roce 1989 získala firma Japan Carlit Co. Ltd. Tyto příměsi zlepšily vodivost, ale zároveň značně zhoršily mechanické a kráječi vlastnosti zalévacích pryskyřic, (vi) Šetrnější modifikace využívala zamíchání vodivých organických iontových kapalin do zalévací pryskyřice (US 2014/212913A1 B2). Zhoršení kráječích a mechanických vlastností bylo mírnější než v předchozím případu, pro dobrou vodivost však stále bylo potřebné značné množství přísady iontové kapaliny. V souhrnu lze konstatovat, že ani jedno z navržených řešení se v praxi plně neosvědčilo.

Nabíjení vzorku je v oblasti elektronové mikroskopie zřejmě nejzávažnější u nových metod trojrozměrného zobrazování pomocí rastrovací elektronové mikroskopie (3D-SEM), jak je popsáno výše. Nicméně problémy s nabíjením zalitých preparátů se dosti často vyskytují i při zobrazování pomocí standardních metod dvojrozměrné SEM a TEM mikroskopie (Sabbatini L and De Giglio E 2022: Polymer Surface Characterization, chapter 7, str. 239 až 279). Proto jsou níže popsaná zalévací média, která jsou navíc dostatečně jednoduchá a vhodná pro všechny typy mikroskopie využívající zalévání preparátů do různých médií, významným praktickým přínosem

-2 CZ 310708 B6 pro všechny relevantní mikroskopické laboratoře.

Podstata vynálezu

Výše popsané problémy při zobrazování vzorků v elektronové mikroskopii řeší předkládaný vynález, který se týká nových zalévacích médií pro všechny typy mikroskopie, které využívají zalévání preparátů. Řešení popsané v tomto vynálezu vychází ze skutečnosti, že plyny v komoře elektronového mikroskopu mohou odnášet nadbytečný náboj ze vzorku ozařovaného svazkem elektronů, a to i při nízkých koncentracích. Vlastní technika řešení spočívá v tom, že zalévací pryskyřice (zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii jsou odborníkovi v oboru dobře známé, jedná se o nejběžněji používané epoxidové a akrylátové pryskyřice) je modifikována přimíšením malého množství (5 až 15 % hmota.) stabilizačního činidla, které se dobře mísí s danou pryskyřicí, je stabilní za laboratorních podmínek, avšak v důsledku přenosu energie, ke kterému dochází nárazem urychlených elektronů na povrch preparátu, se stabilizační činidlo rozpadá na nízkomolekulámí fragmenty, z nichž alespoň některé jsou dostatečně těkavé. Tyto fragmenty vznikající in sítu přímo pod elektronovým svazkem jsou schopny se ionizovat a odvádět elektrický náboj ke stěnám komory mikroskopu.

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy zalévací médium pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii, které obsahuje od 85 do 95 % hmota, epoxidové a/nebo akrylátové zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 15 % hmota, stabilizačního činidla. Stabilizační činidlo se při interakci s elektronovým svazkem v elektronovém mikroskopu, kdy je energie elektronů ve svazku v rozmezí 1 až 300 keV a celková dávka elektronů dopadajících na vzorek v rozmezí 0,5 až 250 e/nm², rozpadne na fragmenty, z nichž nejméně jeden je dostatečně těkavý vtom smyslu, že má molekulovou hmotnost nižší než 160 g/mol a jeho bod varu nebo sublimace při 1 atm (1 atm je 101,325 kPa) je nižší než 150 °C.

Obecně jsou jako stabilizační činidla vhodné zejména sloučeniny, které splňují následující podmínky: (i) dobrá mísitelnost s danou zalévací pryskyřicí, (ii) dobrá stabilita za běžných laboratorních podmínek (25 °C, 1 atm), (iii) dostatečná stabilita za podmínek vytvrzování zalévací pryskyřice (činidlo snese 1 h až 48 h vystavení teplotě 25 až 70 °C, respektive 0,5 až 20 min ozáření ultrafialovým zářením), (iv) rozpad na fragmenty při teplotách v rozmezí od 50 do 200 °C nebo při působení elektronového svazku v SEM mikroskopu (energie elektronů ve svazku v rozmezí 1 až 300 keV a celková dávka elektronů dopadajících na vzorek v rozmezí 0,5 až 250 e/nm²), z nichž alespoň některé fragmenty mají molekulovou hmotnost nižší než 160 g/mol a jsou dostatečně těkavé (kde dostatečnou těkavostí rozumíme, že za běžných laboratorních podmínek (25 °C, 1 atm) se jedná o látky s bodem varu nebo sublimace nižším než 150 °C) a (v) dobré vlastnosti z hlediska bezpečnosti práce a interakce se vzorkem (tj. látky, které při správném zacházení neničí vzorek, mikroskop ani zdraví obsluhy). Patří sem zejména sloučeniny uvolňující molekulární dusík (N2), karbonylové sloučeniny schopné uvolňovat CO2 nebo CO jakož i strukturou a některými vlastnostmi příbuzné dusitanové estery schopné uvolňovat NO, geminální dioly a strukturně blízce příbuzné látky (včetně boronových kyselin) uvolňující nízkomolekulámí fragmenty (např. vodu) a Diels-Alderovy adukty rozpadající se na menší organické molekuly s nenasycenými vazbami. Tato stabilizační činidla se všechna vyznačují tím, že při překročení kritické teploty mezi 50 a 200 °C dochází k jejich rychlému rozpadu na fragmenty, z nichž alespoň některé jsou dostatečně těkavé, a tudíž schopné odvádět elektrický náboj. Uvedená stabilizační činidla splňují podmínku dostatečné mísitelnosti se zalévacími pryskyřicemi pro elektronovou mikroskopii (díky svému organickému charakteru), dostatečné stability za laboratorních podmínek, jakož i za podmínek vytvrzování zalévací pryskyřice, ale při zvýšené teplotě nebo při interakci s elektronovým svazkem se rozpadají a uvolňují těkavé nízkomolekulámí fragmenty jako dusík (azosloučeniny nebo podobné sloučeniny s vazbami N-N vyjmenované výše), oxid uhličitý nebo uhelnatý (vybrané karbonylové sloučeniny), oxid dusný (karbonylovým sloučeninám příbuzné dusitanové estery), vodu nebo příbuzné drobné molekuly (geminální dioly a strukturně příbuzné látky), organické molekuly

-3 CZ 310708 B6 s nenasycenými vazbami (reverzibilní Diels-Alderovy adukty) případně i další nízkomolekulámí fragmenty, které jsou schopny odvádět náboj a zvyšovat tak odolnost vzorku vůči nabíjení a poškození elektronovým svazkem. Navíc tato stabilizační činidla nemají negativní vliv na homogenitu a řezatelnost modifikovaných zalévacích médií.

Zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii je komerčně dostupná a je vybraná ze skupiny zahrnující epoxidové pryskyřice a akrylátové pryskyřice. Jako konkrétní příklady běžných zalévacích pryskyřic je možno uvést komerčně dostupné pryskyřice (Hard Plus Resin 812, typ: epoxidová pryskyřice, dodavatel: Electron Microscopy Sciences; Durcupan Resin, typ: epoxidová pryskyřice, dodavatel: Fluka; LR White Resin, typ: akrylátová pryskyřice, dodavatel: Sigma-Aldrich).

Stabilizační činidlo je vybrané ze skupiny zahrnující:

organické azosloučeniny obecného vzorce R¹-(X)₂C-N=N-C(X)2-R², kde X je nezávisle vodík, Ci až Ce alkyl nebo amid vzorce -C(O)NR2, kde R je nezávisle vodík nebo alkylová nebo cykloalkylová skupina o počtu uhlíkových atomů od 1 do 6; a skupiny R¹ a R² jsou nezávisle Ci až Ce alkyl a/nebo C3 až Ce cykloalkyl; azosloučeniny obecného vzorce R³-N=N-R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě C3 až C10 cykloalkyl, který může být dále substituovaný alespoň jednou nitrilovou skupinou;

organické peroxouhličitany obecného vzorce R⁵-O-C(=O)-OO-R⁶, kde R⁵ a R⁶ jsou nezávisle Ci až Cis alkyl a/nebo C3 až C12 cykloalkyl;

geminální dioly obecného vzorce R⁷-C(OH)2-R⁸, kde R⁷ a R⁸ jsou nezávisle vodík, Ci až Ce alkyl, halogenovaný Ci až Ce alkyl, C3 až C12 cykloalkyl, halogenovaný C3 až C12 cykloalkyl, Ce až C12 aryl;

boronové kyseliny obecného vzorce R⁹-B(OH)2, kde R⁹ je Ci až Cis alkyl, C3 až C12 cykloalkyl a/nebo Ce až C12 aryl; a sloučeniny obecného vzorce la,

O (la), kde X je O a současně Y je O, NH nebo N-CH2CH3.

Ve výhodném provedení je stabilizační činidlo vybrané ze skupiny zahrnující l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril), chloralhydrát (2,2,2-trichlorethan-l,l-diol), 2.2'-azobis(A'butyl-2-methylpropionamid), terc-butyl peroxy 2-ethylhexyl karbonát, 1,1,1,3,3,3hexafluoropropan-2,2-diol, kyselinu fenylboronovou a sloučeninu obecného vzorce la, kde X je O a současně Y je N-CH2CH3.

V nej výhodnějším provedení je stabilizační činidlo vybrané z 1,1'azobis(cyklohexankarbonitrilu) a 2,2,2-trichlorethan-l,l-diolu.

V některých provedeních zalévací médium pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii obsahuje od 90 do 95 % hmoto, zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 10 % hmota, stabilizačního činidla, nejvýhodněji 95 % hmota, zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a 5 % hmota, stabilizačního činidla.

Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob přípravy vzorku pro elektronovou mikroskopii, kdy se připraví zalévací médium definované výše (obsahující od 85 do 95 % hmota.

-4 CZ 310708 B6 zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 15 % hmota, stabilizačního činidla), následně se zkoumaný vzorek zalije do výše popsaného zalévacího média, systém se následně vytvrdí, s výhodou po dobu alespoň 48 hodin při teplotě minimálně 50 °C, za vzniku vytvrzeného pryskyřičného bloku, který se následně použije jako preparát pro elektronovou mikroskopii, zejména pro metody 3D-SEM mikroskopie (FIB-SEM, SBF-SEM a AT-SEM), dále pro další metody standardní SEM mikroskopie, popřípadě po nakrájení na ultratenké řezy o tloušťce v rozmezí od 20 do 200 nm i pro metody transmisní elektronové mikroskopie (STEM a TEM).

Předmětem předkládaného vynálezu je dále použití výše popsaných zalévacích médií pro přípravu vzorků pro elektronovou mikroskopii.

Definice:

Alkyl je nasycený lineární nebo rozvětvený uhlovodíkový zbytek, vzniklý odtržením jednoho vodíkového atomu.

Cykloalkyl je nasycený cyklický uhlovodíkový zbytek vzniklý odtržením jednoho vodíkového atomu z cyklu. V některých provedeních jsou všechny uhlíkové atomy cykloalkylu součástí cyklu. V některých provedeních jsou některé uhlíkové atomy cykloalkylu součástí cyklu a některé uhlíkové atomy cykloalkylu tvoří lineární nebo rozvětvený řetězec vázaný k cyklu. Cykloalkyl může obsahovat jeden nebo více cyklů.

Aryl (aromatická skupina) je aromatický cyklický uhlovodík obsahující jeden nebo více cyklů, vzniklý odtržením jednoho vodíkového atomu z aromatického cyklu. Aryl může být například fenyl, naftyl, bifenyl. V některých provedeních jsou všechny uhlíkové atomy arylu součástí cyklu. V některých provedeních jsou některé uhlíkové atomy arylu součástí cyklu a některé uhlíkové atomy arylu tvoří lineární nebo rozvětvený řetězec vázaný k cyklu.

Arylalkyl (arylalkylová skupina) je alkyl, jehož alespoň jeden atom vodíku je nahrazený arylem. Příkladem arylalkylu je benzyl.

Cykloalkyl-alkyl je alkyl, jehož alespoň jeden atom vodíku je nahrazený cykloalkylem. Příkladem cykloalkyl-alkylu je cyklohexylmethyl.

Alifatická skupina je lineární nebo rozvětvený nasycený (alkyl) nebo nenasycený (alkenyl, alkynyl) uhlovodíkový zbytek, vzniklý odtržením jednoho vodíkového atomu.

Cykloalifatická skupina je nasycený (cykloalkyl) nebo nenasycený (cykloalkenyl, cykloalkynyl) cyklický uhlovodíkový zbytek vzniklý odtržením jednoho vodíkového atomu z cyklu. V některých provedeních jsou všechny uhlíkové atomy cykloalifatické skupiny součástí cyklu. V některých provedeních jsou některé uhlíkové atomy cykloalifatické skupiny součástí cyklu a některé uhlíkové atomy cykloalifatické skupiny tvoří lineární nebo rozvětvený řetězec vázaný k cyklu. Cykloalifatická skupina může obsahovat jeden nebo více cyklů. Příkladem cykloalifatické skupiny je cyklopentenyl, cyklopentadienyl, cyklohexanyl, 3methylcyklohexanyl.

Silyl je skupina -S1Y3 kde Y je nezávisle na sobě atom vodíku, alkyl, cykloalkyl, arylalkyl nebo aryl. Příkladem silylové skupiny je trimethylsilyl nebo trifenylsilyl.

Alkoxy (alkyloxy) je skupina -O-alkyl. Příkladem alkoxy skupiny je methoxy nebo ethoxy. Alkylthio je skupina-S-alkyl.

Alkylamido je skupina -C(O)-N(H)-alkyl.

Dialkylamido je skupina - C(O)-NR.2, kde substituenty R mohou být stejné nebo různé o počta

-5 CZ 310708 B6 uhlíků od 1 do 120 a jsou nezávisle na sobě alifatická, cykloalifatická, aromatická, arylalkylová nebo cykloalkyl-alkylová skupina.

Halogenovaný alkyl je alkyl, ve kterém byl alespoň jeden atom vodíku nahrazen halogenem (F, Cl, Br, I). Příkladem halogenovaného alkylu je trichlormethyl, trifluormethyl, difluormethyl. Karboxyl je skupina -C(O)OH.

Esterifikovaný karboxyl je skupina -C(O)O-R, kde Rje alifatická, cykloalifatická, arylalkylová nebo aromatická skupina.

Acyl je skupina -C(O)-R, kde Rje alifatická, arylalkylová nebo aromatická skupina.

Hydroxyalkylamid je skupina -C(O)-N(H)-alkyl-OH.

Alkylester je skupina -C(O)-O-alkyl.

SEM = scanning electron microscopy = rastrovací elektronová mikroskopie.

3D-SEM = three dimensional SEM = třírozměrná rastrovací elektronová mikroskopie.

STEM = scanning transmission electron microscopy = rastrovací transmisní elektronová mikroskopie.

TEM = transmission electron microscopy = transmisní elektronová mikroskopie.

Objasnění výkresů

Obrázek 1. SEM/BSE mikrofotografie ukazující testovací biologický preparát z příkladu 2. Horní řada obrázků (a až c) ukazuje vzorek v pryskyřici modifikované přídavkem 5 % hmota, stabilizačního činidla l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril)-u, dolní řada obrázků (d až f) ukazuje kontrolní vzorky zalité do nemodifikované pryskyřice. Mikrofotografie pocházejí z třech různých mikroskopů: (a, d) JSM IT800 (JEOL, Japonsko), (b, e) MAIA3 (TESCAN, Česká Republika) a (c, f) Apreo (Thermo Fisher Scientific, Česká Republika).

Obrázek 2. SEM/BF mikrofotografie z Příkladu 3 ukazující magnetické polymemí mikrokuličky zalité v pryskyřicích: (a, b) Hard Plus Resin 812, (c, d) Durcupan Resin, (e, f) LR White Resin. Obrázky v horní řadě (a až c) jsou nemodifikované pryskyřice, obrázky v dolní řadě jsou pryskyřice modifikované podle vynálezu (přídavek 5 % hmota. 1,1'azobis(cyklohexankarbonitrilu)).

Obrázek 3. SEM/BF mikrofotografie ukazující biologický preparát (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³) dle Příkladu 4 zalitý v komerční pryskyřici Hard Plus Resin 812 modifikované za použití 5 % hmota, tří různých stabilizačních činidel: (a) l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril), (b) dibenzoylperoxid (není předmětem vynálezu) a (c) 2,2,2trichlorethan-l,l-diol. Obrázek (d) ukazuje kontrolní vzorek v nemodifikované zalévací pryskyřici.

Obrázek 4. SEM/BF mikrofotografie ukazující magnetické polymemí mikrokuličky (polymemí částice plněné magnetickými nanočásticemi FC3O4) z Příkladu 5, zalité: (a) do nemodifikované pryskyřice LR White Resin a (b) do pryskyřice LR White Resin modifikované přídavkem 5 % hmota. 1,1 '-azobis(cyklohexankarbonitrilu).

Obrázek 5. SEM/BF mikrofotografie ukazující magnetické polymemí mikrokuličky (polymemí částice plněné magnetickými nanočásticemi FC3O4) z příkladu 5, zalité: (a) do nemodifikované

-6 CZ 310708 B6 pryskyřice Spurr Resin a (b) do pryskyřice Spurr Resin modifikované přídavkem 5 % hmota, stabilizačního činidla 2,2,2-trichlorethan-l,l-diolu.

Obrázek 6. SEM/BF mikrofotografie ukazující biologický preparát z příkladu 6 (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³) zalitý: (a) do nemodifikované komerční epoxidové pryskyřice Spurr Resin a (b) do pryskyřice Spurr Resin modifikované přídavkem 5 % hmota. l,l'-azobis(cyklohexankarbonitrilu).

Obrázek 7. SEM/BF mikrofotografie ukazující biologický preparát z příkladu 6 (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³) zalitý: (a) do nemodifikované komerční epoxidové pryskyřice SERVA Resin a (b) do pryskyřice SERVA Resin modifikované přídavkem 5 % hmota. l,l'-azobis(cyklohexankarbonitrilu).

Obrázek 8. SEM/BF mikrofotografie ukazující biologický preparát z příkladu 6 (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³) zalitý: (a) do nemodifikované komerční akrylátové pryskyřice LR White Resin a (b) do pryskyřice LR White Resin modifikované přídavkem 5 % hmota. 2,2,2-trichlorethan-l,l-diolu.

Obrázek 9. Mikromechanické vlastnosti komerční zalévací pryskyřice z Příkladu 7 (Hard Plus Resin 812; dodáváte: Electron Microscopy Sciences), nemodifikované a modifikované přídavkem 5 % hmota, různých typů stabilizačních činidel. Samotná pryskyřice je v popiscích označena jako HardPlus. Modifikační činidla jsou v popiscích obrázku označena pomocí jednopísmenných zkratek následovně: A = l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril), B = dibenzoylperoxid (není součástí vynálezu) a C = 2,2,2-trichlorethan-l,l-diol. Měřené mechanické vlastnosti zahrnovaly indentační modul (Eit) a indentační tvrdost (Hit).

Obrázek 10. Mikromechanické vlastnosti tří různých typů komerčních zalévacích pryskyřic z příkladu 7 (Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences; Durcupan Resin, dodavatel: Fluka; LR White Resin, dodavatel: Electron Microscopy Sciences), které byly nemodifikované (tmavé sloupce) a modifikované (světlé sloupce) přídavkem 5 % hmota. 1,1'azobis(cyklohexankarbonitrilu). Měřené mechanické vlastnosti zahrnovaly: indentační modul (Eit) a indentační tvrdost (Hu ).

Obrázek 11. Interakce elektronového svazku se zalévacími pryskyřicemi z příkladu 8 v závislosti na modifikaci: (a, b) STEM/BF mikrofotografie a (c, d) semi-kvantitativní vyhodnocení úbytku hmoty při opakovaném průchodu elektronového svazku vybranými čtvercovými oblastmi na každém vzorku. Obrázky (a, c) odpovídají nemodifikované komerční pryskyřici Hard Plus Resin 812, obrázky (b, d) odpovídají stejné pryskyřici modifikované přídavkem 5 % hmota. 1,1'azobis(cyklohexankarbonitrilu). Svazek postupně procházel přes oblasti vyznačené na STEM mikrofotografiích (a, b) v pořadí odpovídajícím číslicím na obrázku, tj. od oblasti (1) do oblasti (9). Experimenty byly provedeny na mikroskopu Magellan 400/L s detektorem prošlých elektronů STEM3+ (FEI; Česká republika).

Příklady uskutečnění vynálezu

Nová zalévací média byla ve všech níže uvedených příkladech připravena a použita pro zalévání vzorků následujícím obecným postupem: (i) základem zalévacího média byla standardní komerčně dostupná zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii (pryskyřice může být jednosložková nebo vícesložková, z chemického hlediska epoxidová či akrylátová nebo jiná, ale v každém případě jde o viskózní tekutou látku), (ii) do pryskyřice bylo přidáno stabilizační činidlo (zpravidla ve formě prášku nebo mikrokrystalků) a směs se důkladně promísila pomocí magnetického míchadla, (iii), do vzniklého tekutého zalévacího média, sestávajícího ze základní pryskyřice (85 až 99,5 % hmota.) a stabilizačního činidla (0,5 až 15 % hmota.), se vložil zkoumaný preparát (pro testování jsme používali zpravidla biologickou tkáň po příslušných

-7 CZ 310708 B6 úpravách zahrnujících její kontrastování, odvodnění a prosycení základní pryskyřicí nebo polymemí mikročástice v podobě mikroprášku) a (iv) v posledním kroku se celý preparát vytvrdil v laboratorní horkovzdušné sušárně (zpravidla se vytvrzuje po dobu nejméně 48 h při teplotě 60 °C, ale podmínky se mohou mírně lišit podle typu základní pryskyřice). Takto připravený vzorek bylo možno dále zpracovat (zpravidla seříznutím pomocí ultramikrotomu) a pozorovat různými metodami elektronové mikroskopie.

Příklad 1

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na epoxidovou zalévací pryskyřici (komerční pryskyřice Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences), do které bylo před vytvrzením přidáno 5 % hmoto, stabilizačního činidla (l,T-azobis(cyklohexankarbonitril), který se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadá za vzniku molekul N2), takže výsledné médium obsahovalo 95 % hmota, pryskyřice a 5 % hmota, stabilizačního činidla. Do takto modifikované pryskyřice byl zalit testovací biologický preparát (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³). Vytvrzení všech vzorků bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 hodin při teplotě 60 °C). Po vytvrzení byly připraveny řezné plochy pomocí ultramikrotomu (řezání při pokojové teplotě, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Tímto způsobem bylo připraveno 32 vzorků se stabilizačním činidlem a 31 kontrolních vzorků bez stabilizačního činidla. Nabíjení bylo vyhodnoceno při pozorování vzorků na dvou různých rastrovacích elektronových mikroskopech (JSM ΕΓ800, JEOL, Japonsko a MAIA3, Tescan, Česká Republika) při energii dopadajících elektronů 3 keV a třech předem definovaných, typických radiačních dávkách (1, 20 a 200 e/nm²), které odpovídaly třem typickým způsobům zobrazování biologických preparátů v rastrovacích mikroskopech (rychle snímané přehledové zvětšení, typické střední zvětšení a vysoké zvětšení s pomalým snímáním). Každý vzorek byl při každé dávce vyhodnocen na semikvantitativní škále (0 = žádné nabíjení, 1 = částečné nabíjení, které snížilo kvalita obrazu, ale neznemožnilo pozorování, 2 = silné nabíjení, které zcela zničilo výsledný obraz). Takto bylo vyhodnoceno všech 63 vzorků a každý z nich na několika místech, aby získané výsledky, vyhodnocované v této sérii experimentů jako procentuální podíl vzorků s žádným, částečným a silným nabíjením, byly co nejpřesnější. Nabíjení se totiž může lišit nejen mezi jednotlivými vzorky, ale dokonce i mezi jednotlivými místy na témž vzorku: místa obsahující více testované tkáně (v našem případě částečně vodivá mozková tkáň) se nabíjejí méně než místa obsahující více zalévací pryskyřice (nevodivý syntetický polymer). Výsledky experimentů z prvního mikroskopu jsou shrnuty v tabulce 1, výsledky z druhého mikroskopu v tabulce 2.

Tabulka 1. Nabíjení testovacích biologických vzorků (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši) zalitých v komerční pryskyřici Hard Plus Resin 812 s přídavkem 5 % hmota, stabilizačního činidla podle vynálezu (zalévací činidlo: l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril); celkem 32 vzorků). Kontrolní vzorky byly připraveny bez přídavku stabilizačního činidla (celkem 30 vzorků). Všechny vzorky byly pozorovány na rastrovacím elektronovém mikroskopu JSM IT800 (JEOL, Japonsko) při urychlovacím napětí 3 kV.

Vzorek a radiační dávka	Nabíjení při BSE zobrazení	Kvalita obrazu
Typ pryskyřice			Částečné			Špatná
Čistá	1 e/nm2	3% (1)	33% (10)	64% (19)	36%	64%
Se stabilizátorem	1 e/nm2	15% (5)	41% i 13i	44% (14)	56%	44%
Čistá	20 e/nm2	17% (5)	23% (7)	60% (18)	40%	60%
Se stabilizátorem	20 e/nm2	9% (3)	63% (20)	28% (9)	72%	28%
Čistá	200 e/nm2	13% (4)	43,5%(13)	43,5%(13)	57%	44%
Se stabilizátorem	200 e/nm2	47% (15)	44% (14)	9% (3)	91%	9%

-8CZ 310708 B6

Tabulka 2. Nabíjení testovacích biologických vzorků (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši) zalitých v komerční pryskyřici Hard Plus Resin 812 s přídavkem 5 % hmota, stabilizačního činidla podle vynálezu (zalévací činidlo: l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril); celkem 32 vzorků). Kontrolní vzorky byly připraveny bez přídavku stabilizačního činidla (celkem 30 vzorků). Všechny vzorky byly pozorovány na rastrovacím elektronovém mikroskopu MAIA3 (TESCAN, Česká Republika) při urychlovacím napětí 3 kV.

Vzorek a radiační dávka	Nabíjení při BSE zobrazení	Kvalita obrazu
Typ pryskyřice	Dávka	Žádné	Částecne		Přijatelná	Špatná
Čistá	1 e/nm2	4% (1)	33% (10)	63% (19)	37%	63%
Se stabilizátorem	1 e/nm2	0% (0)	81% (26)	19% (6)	81%	19%
Čistá	20 e/nm	23% (7)	17% (5)	60% (18)	40%	60%
Se stabilizátorem	20 e/nm2	46% (15)	41% (13)	13% (4)	87%	13%
Čistá	200 e/nm2	30% (9)	17% (5)	53% (16)	47%	53%
Se stabilizátorem	200 e/nm2	53% (17)	28% (9)	19% (6)	81%	19%

U obou mikroskopů se vzorky zalité do modifikované pryskyřice nabíjely výrazně méně než vzorky zalité do nemodifikované pryskyřice. Výsledky naznačují, že rozdíl se mírně zvyšuje ve prospěch modifikovaných vzorků s narůstající elektronovou dávkou, což lze přičíst vyššímu uvolňování těkavých nízkomolekulámích fragmentů v důsledku vyššího množství interakcí s vyšším množstvím s dopadajících primárních elektronů. Většina pozorování biologických preparátů se v praxi provádí při středních dávkách kolem 20 e/nm², při kterém je zvýšená odolnost a stabilita pryskyřic modifikovaných podle vynálezu jasně patrná.

Příklad 2

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován analogicky jako v příkladu 1 (95 % hmota, epoxidové pryskyřice Hard Plus Resin 812 s přídavkem 5 % hmota, stabilizačního činidla 1,1'azobis(cyklohexankarbonitril), do takto modifikované pryskyřice byl zalit testovací biologický preparát (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši), vytvrzení 48 h při teplotě 60 °C). Bylo připraveno 5 nových vzorků. Pro každý vzorek byly připraveny hladké řezné plochy pomocí ultramikrotomu (řezání za pokojové teploty, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Takto připravené vzorky byly zobrazeny na třech nezávislých rastrovacích elektronových mikroskopech v režimu zpětně odražených elektronů při urychlovacím napětí 3 kV (energie dopadajících elektronů 3 ke V). Z porovnání byly vyloučeny ty vzorky nebo jejich části, u kterých nabíjení zcela zničilo obraz. U zbývajících mikrofotografií byla porovnána kvalita obrazu u všech tří mikroskopů a zlepšení kontrastu po přídavku stabilizačního činidla. Reprezentativní výsledky jsou shrnuty na obrázku 1. Kvalita mikrofotografií (tj. ostrost struktur, nepřítomnost zobrazovacích artefaktů) u všech tří mikroskopů pro vzorky s přídavkem stabilizačního činidla (obr. la až c) byla velmi dobrá a zcela srovnatelná pro všechny tři stroje tím jsme doložili, že způsob modifikace dává kvalitní výstupy nezávisle na použitém zařízení. Kontrast mikrofotografií (tj. rozlišení světlých a tmavých částí) byl u všech tří mikroskopů nižší pro vzorky bez stabilizačního činidla (obr. Id až f) - tím jsme doložili, že stabilizační činidlo nejen zamezuje celkovému nabíjení preparátů, ale i zlepšuje kvalitu obrazu, což lze vysvětlit lepším odvodem náboje z povrchu vzorku. Vzorky zalité v nemodifikované pryskyřici vykazovaly buď částečné nabíjení a nižší kontrast (šedé plochy na obrázku Id, If) nebo dokonce silné nabíjení (bílé plochy na obrázku le).

Příklad 3

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na tři různé typy zalévacích pryskyřic - dva různé typy epoxidových pryskyřic a jeden typ akrylátové pryskyřice (první epoxidová pryskyřice Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences; druhá epoxidová pryskyřice

-9CZ 310708 B6

Durcupan Resin, dodavatel: Fluka; třetí akrylátová pryskyřice LR White Resin, dodavatel: Sigma-Aldrich). Do všech tří typů pryskyřic bylo před vytvrzením přidáno 0, 1, 5, 10, 15 % hmota. stabilizačního činidla uvolňujícího dusík (systematický název: 1,1'azobis(cyklohexankarbonitril)). Do všech takto modifikovaných pryskyřic byl zalit testovací preparát z oblasti materiálové chemie - magnetické polymemí mikrokuličky - tj. sférické polymemí částice obsahující magnetické nanočástice Fc;O₄. Vytvrzení bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 hodin při teplotě 60 °C). Ze zalitých vzorků byly připraveny ultratenké řezy (tloušťka ca 60 nm), které byly zobrazeny pomocí transmisní elektronové mikroskopie (TEM) při energii procházejících elektronů 120 keV. Na základě TEM mikrofotografri byla posouzena homogenita zalévací pryskyřice, která by neměla obsahovat viditelné oblasti fázově separovaného stabilizačního činidla. Vybrané výsledky jsou ukázány na obrázku a kompletní výsledky jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3. Rozpouštění stabilizačního činidla (l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril)) v různých typech komerčních zalévacích pryskyřic.

Množství stabilizačního činidla	Pryskyřice Hard Plus Resin 812	Pryskyřice Durcupan Resin	Pryskyřice LR White Resin
1 % hmota.	rozpuštěno	rozpuštěno	rozpuštěno
5 % hmota.	rozpuštěno	rozpuštěno	rozpuštěno
10 % hmota.	rozpuštěno za vyšší teploty*	rozpuštěno za vyšší teploty*	nerozpuštěno
15 % hmota.	rozpuštěno za vyšší teploty*	nerozpuštěno	nerozpuštěno

* Vyšší teplota = 40 °C po dobu 10 až 20 minut před vytvrzením

Homogenní pozadí na TEM mikrofotografrich prokazuje, že zvolené stabilizační činidlo je spolehlivě rozpustné ve všech testovaných pryskyřicích při koncentracích do 5 % hmota., která zpravidla dostačuje k odvedení náboje (jak je doloženo v předchozích příkladech 1 a 2). Tabulka 3 pak ukazuje, že pří použití mírně zvýšených teplot před vytvrzením (zahřátí směsi na 40 °C po dobu 10 až 20 min) lze stabilizační činidlo v některých typech zalévacích pryskyřic rozpustit až do koncentrace 15 % hmota. Obrázek 2 potvrzuje, že modifikační činidlo nepodléhá fázové separaci a zalévací pryskyřice je ve všech případech homogenní.

Příklad 4

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na epoxidovou zalévací pryskyřici (komerční pryskyřice Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences), do které bylo před vytvrzením přidáno 5 % hmota, stabilizačního činidla. V této sérii experimentů byly testovány tři typy činidel: l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril), dibenzoylperoxid (není součástí vynálezu; při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² se rozpadá za vzniku molekul CO2) a 2,2,2trichlorethan-l,l-diol (který se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadá za vzniku molekul H2O). Kontrolní vzorky byly ponechány bez přídavku stabilizačního činidla. Do všech čtyř vzorků byl zalit testovací biologický preparát (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³). Každý vzorek byl připraven třikrát pro získání reprezentativnějších výsledků. Vytvrzení všech vzorků bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 hodin při teplotě 60 °C). Po vytvrzení byly připraveny řezné plochy pomocí ultramikrotomu (řezání při pokojové teplotě, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Řezné plochy byly zobrazeny na vysokorozlišujícím rastrovacím elektronovém mikroskopu (MAIA3, Tescan, Česká Republika) pomocí detektoru zpětně odražených elektronů při urychlovacím napětí 3 kV (energie dopadajících elektronů 3 ke V). Reprezentativní výsledky jsou shrnuty na obrázku 3. Zatímco všechny tři vzorky s přídavkem

- 10CZ 310708 B6 stabilizačního činidla vykazovaly na většině míst dobrý obraz bez nabíjení (obrázek 3a až c), kontrolní vzorek bez použití stabilizačního činidla se na mnoha místech nabíjel (obrázek 3d - bílé plochy bez jasně zřetelné struktury jsou známky silného nabíjení). Tím jsme ověřili výsledky z Příkladu 1 a navíc ukázali, že zvýšené odolnosti zalévacích pryskyřic vůči nabíjení lze dosáhnout s různými typy stabilizačních činidel podle vynálezu.

Příklad 5

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na akrylátovou zalévací pryskyřici (komerční pryskyřice LR White Resin; dodavatel Electron Microscopy Sciences), do které bylo přidáno 5 % hmota, stabilizačního činidla. V této sérii experimentů byly testovány dva typy stabilizačních činidel: l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril) a 2,2,2-trichlorethan-l,l-diol. Kontrolní vzorky byly ponechány bez stabilizačního činidla. Každý vzorek byl připraven třikrát pro získání reprezentativnějších výsledků. Do všech připravených pryskyřic byl zalit testovací preparát z oblasti materiálové chemie - magnetické polymemí mikrokuličky - tj. sférické polymemí částice obsahující magnetické nanočástice FesCh. Vytvrzení všech vzorků bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 hodin při teplotě 60 °C). Po vytvrzení byly připraveny řezné plochy pomocí ultramikrotomu (řezání při pokojové teplotě, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Řezné plochy byly zobrazeny na vysokorozlišujícím rastrovacím elektronovém mikroskopu (MAIA3, Tescan, Česká Republika) pomocí detektoru zpětně odražených elektronů při urychlovacím napětí 3 kV (energie dopadajících elektronů 3 ke V). Každý vzorek byl připraven třikrát a pozorován na více místech. Reprezentativní výsledky jsou shrnuty na obrázku 4 a 5. Zatímco kontrolní vzorky bez přídavku stabilizačního činidla se na většině míst nabíjely (obrázek 4a a 5a), vzorky s přídavkem stabilizačního činidla na většině míst vykazovaly dobrý obraz s žádným či minimálním nabíjením (obrázek 4b a 5b). Tím jsme prokázali, že stabilizační činidla podle vynálezu lze použít nejen pro zalévací pryskyřice na bázi epoxidů (jako v příkladech 1 až 4 výše), ale i pro jiné typy zalévacích pryskyřic (jako akrylátová pryskyřice v tomto příkladu).

Příklad 6

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na tři různé typy zalévacích pryskyřic (epoxidovou komerční pryskyřici Spurr Resin, dodavatel: Electron Microscopy Sciences; nízkoviskózní epoxidovou komerční pryskyřici Glycid Ether 100 Resin, dodavatel: SERVA; akrylátovou komerční pryskyřici LR White Resin, dodavatel: Sigma-Aldrich), do kterých bylo před vytvrzením přidáno 5 % hmota, stabilizačního činidla. V této sérii experimentů byly testovány dva typy stabilizačních činidel: l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril) a 2,2,2trichlorethan-l,l-diol. Kontrolní vzorky byly ponechány bez stabilizačního činidla. Každý vzorek byl připraven třikrát pro získání reprezentativnějších výsledků. Do všech vzorků byl zalit testovací biologický preparát (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³). Vytvrzení všech vzorků bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 h při teplotě 60 °C pro pryskyřice Glycid Ether 100 Resin a LR White Resin; 24 h při 70 °C pro pryskyřici Spurr Resin). Po vytvrzení byly připraveny řezné plochy pomocí ultramikrotomu (řezání při pokojové teplotě, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Řezné plochy byly zobrazeny na rastrovacím elektronovém mikroskopu (MAIA3, Tescan, Česká Republika) pomocí detektoru zpětně odražených elektronů při urychlovacím napětí 3 kV (energie dopadajících elektronů 3 ke V). Každý vzorek byl připraven třikrát a sledován na více místech. Reprezentativní výsledky jsou shrnuty na obrázcích 6 až 8. Ve všech studovaných případech vykazovaly vzorky bez přídavku stabilizačního činidla na SEM mikrofotografiích v průměru vyšší nabíjení a horší kontrast, zatímco vzorky s přídavkem stabilizačního činidla podle vynálezu vykazovaly nižší nabíjení, lepší kontrast a celkově lepší kvalitu SEM mikrofotografií. Tím jsme prokázali, že způsob modifikace zalévacích pryskyřic podle vynálezu zvyšuje odolnost vůči poškození elektronovým svazkem i pro další kombinace pryskyřic, stabilizačních činidel a vzorků z biologické oblasti.

- 11 CZ 310708 B6

Příklad 7

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na tři různé typy zalévacích pryskyřic (epoxidovou pryskyřici Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences; epoxidovou pryskyřici Durcupan Resin, dodavatel: Fluka; akrylátovou pryskyřici LR White Resin, dodavatel: Electron Microscopy Sciences), do kterých bylo před vytvrzením přidáno 5 % stabilizačního činidla. V této sérii experimentů byly testovány tři typy stabilizačních činidel: 1,1'azobis(cyklohexankarbonitril), dibenzoylperoxid (není součástí vynálezu) a 2,2,2-trichlorethan1,1-diol. Kontrolní vzorky byly ponechány bez stabilizačního činidla. Do testovaných materiálů nebyl zalit žádný preparát, protože cílem bylo kvalitativní porovnání řezatelnosti (tj. snadnosti přípravy ultratenkých řezů pomocí ultramikrotomie) a kvantitativní porovnání mikromechanických vlastností (tj. porovnání výsledků mikroindentačních měření). Vytvrzení bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 hodin při teplotě 60 °C). Z hlediska přípravy ultratenkých řezů pomocí ultramikrotomie nebyly mezi vzorky nalezeny žádné významné rozdíly. Modifikované pryskyřice se na ultramikrotomu (řezání za pokojové teploty, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko) řezaly stejně snadno jako kontrolní, nemodifikované vzorky. Výsledky měření mikromechanických vlastností (microindentation hardness testing, mikroindentor MHT, Anton Paar, Švýcarsko) jsou shrnuty na Obrázcích 9 a 10. Přídavek stabilizačního činidla mírně snížil tuhost (indentační modul, Ait) a tvrdost zalévacích pryskyřic (indentační tvrdost, Hu). navíc mírně ovlivnil i další elasto-viskoplastické vlastnosti (indentační creep, Cit a elastickou část indentační práce, ηιτ). Změny mikromechanických vlastností u modifikovaných pryskyřic nebyly nijak zásadní, což bylo v souladu se skutečností, že ani v řezatelnosti pryskyřic nebyly pozorovatelné rozdíly. Tím jsme prokázali, že přídavek stabilizačních činidel podle vynálezu nemá negativní vliv jejich další mechanické zpracování při přípravě vzorků pro elektronovou mikroskopii.

Příklad 8

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na tři různé typy zalévacích pryskyřic (epoxidovou pryskyřici Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences; epoxidovou pryskyřici Durcupan Resin, dodavatel: Fluka; akrylátovou pryskyřici LR White Resin, dodavatel: Electron Microscopy Sciences), do kterých bylo před vytvrzením přidáno 5 % hmota, stabilizačního činidla. V této sérii experimentů byly testovány tři typy stabilizačních činidel: l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril), dibenzoylperoxid (není součástí vynálezu) a 2,2,2trichlorethan-l,l-diol. Kontrolní vzorky byly ponechány bez stabilizačního činidla. Do testovaných materiálů nebyl zalit žádný preparát, protože cílem bylo podrobnější studium interakce pryskyřic s elektronovým svazkem. Vytvrzení bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 h při teplotě 60 °C). Po vytvrzení byly připraveny ultratenké řezy pomocí ultramikrotomu (řezání při pokojové teplotě, nominální tloušťka řezů 60 nm, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Interakce všech vzorků s elektronovým svazkem byla studována pomocí rastrovací transmisní elektronové mikroskopie (STEM; Magellan 400/L, FEI, Česká Republika). Při všech experimentech byl záměrně použit velmi intenzivní svazek při urychlovacím napětí 30 kV (energie procházejících elektronů 30 ke V), přičemž bylo sledováno, jak tento svazek při opakovaném rastrování téhož místa na vzorku interaguje s daným vzorkem. Typické výsledky experimentu shrnuje Obrázek 11, který ukazuje výsledky pro komerční zalévací pryskyřici Hard Plus Resin 812 modifikovanou pomocí činidla l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril). Pro všechny ostatní systémy v tomto přikladu byly výsledky obdobné. Obrázky 11a a 11b ukazují, že modifikovaná i nemodifikovaná zalévací pryskyřice reagují s intenzivním procházejícím elektronovým svazkem obdobně (tj. výrazně se neničí ani nekroutí, ale po vícenásobném průchodu svazku vzorek tzv. propálí, takže v něm vznikne díra), zatímco obrázky 11c a lid ukazují, že modifikovaná pryskyřice se při opakovaném průchodu elektronového svazku o něco rychleji ztenčuje. Ze STEM mikrofotografií i vyhodnocení úbytku hmoty (obrázek 11) je patrné, že pryskyřice modifikovaná podle vynálezu interagovala se svazkem silněji, což lze vysvětlit vyšším uvolňováním těkavých látek (zde především molekul N2), které mohou odvádět náboj ke stěnám mikroskopu a tím snižovat

- 12CZ 310708 B6 nabíjení preparátů, jak je popsáno výše v kapitole Podstata vynálezu.

Příklad 9

Způsob modifikace podle vynálezu byl aplikován na epoxidovou zalévací pryskyřici (komerční pryskyřice Hard Plus Resin 812, dodavatel: Electron Microscopy Sciences), do které bylo před vytvrzením přidáno 5 % hmoto, stabilizačního činidla. V této sérii experimentů byla testována další vybraná stabilizační činidla různých chemických typů popsaných v sekci Podstata vynálezu. Konkrétně šlo o 2.2'-azobis(A-butyl-2-mcthylpropionamid) (který se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadá za vzniku molekul N2), terc-butylperoxy 2-ethylhexyl karbonát (který se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadá za vzniku molekul CO2), 1,1,1,3,3,3hexafluoropropan-2,2-diol (který se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadá za vzniku molekul H2O), kyselinu fenylboronovou (která se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadne za vzniku molekuly H2O) a adukt fůrami a /V-ethyhnaleimidu (který se při interakci s elektronovým svazkem o energii v rozmezí 1 až 300 keV a dávce dopadajících elektronů v rozmezí od 0,5 do 250 e/nm² rozpadne na molekuly fůrami a /V-ethylmaleimidu). Kontrolní vzorky byly ponechány bez přídavku stabilizačního činidla. Do všech vzorků byl zalit testovací biologický preparát (fixované a odvodněné části mozkové tkáně laboratorní myši o objemu cca 1 mm³). Každý vzorek byl připraven třikrát pro získání reprezentativnějších výsledků. Vytvrzení všech vzorků bylo provedeno standardním způsobem (laboratorní horkovzdušná sušárna, 48 hodin při teplotě 60 °C). Po vytvrzení byly připraveny řezné plochy pomocí ultramikrotomu (řezání při pokojové teplotě, ultramikrotom Ultracut EM UC7; Leica, Rakousko). Řezné plochy byly zobrazeny na vysokorozlišujícím rastrovacím elektronovém mikroskopu (MAIA3, Tescan, Česká Republika) pomocí detektoru zpětně odražených elektronů při urychlovacím napětí 3 kV (energie dopadajících elektronů 3 keV). Výsledné mikrofotografie byly srovnány stejným způsobem jako v příkladu 4, přičemž výsledky byly obdobné - vzorky se stabilizačními činidly se vyznačovaly vyšší odolností vůči elektronovému svazku, tj. nižším nabíjením a vyšším kontrastem. Tím jsme dále ověřili výsledky z příkladů 1 a 4 a navíc ukázali, že zvýšené odolnosti zalévacích pryskyřic vůči nabíjení lze dosáhnout s různými typy stabilizačních činidel podle vynálezu.

Průmyslová využitelnost

Zalévací média podle předkládaného vynálezu jsou určena pro zvýšení efektivity při přípravě a zobrazování vzorků pro elektronovou mikroskopii. Modifikované zalévací pryskyřice vykazují vyšší odolnost vůči poškození elektronovým svazkem, nižší nabíjení a následně lepší kontrast u zobrazovaných preparátů. Způsob modifikace je vhodný zejména pro přípravu vzorků pro metody 3D SEM (třírozměrné zobrazování pomocí rastrovací elektronové mikroskopie), ale uplatní se i při všech ostatních metodách elektronové mikroskopie, které využívají zalévání vzorků do různých druhů pryskyřic.

Claims (5)

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Zalévací médium pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii, vyznačené tím, že obsahuje od 85 do 95 % hmota, epoxidové a/nebo akrylátové zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 15 % hmota, stabilizačního činidla, přičemž stabilizační činidlo je vybrané ze skupiny zahrnující:

- organické azosloučeniny obecného vzorce R¹-(X)₂C-N=N-C(X)2-R², kde X je nezávisle vodík, Ci až Ce alkyl nebo amid vzorce -C(O)NR2, kde R je nezávisle vodík nebo alkylová nebo cykloalkylová skupina o počtu uhlíkových atomů od 1 do 6; a skupiny R¹ a R²jsou nezávisle Ci až Ce alkyl a/nebo C3 až Ce cykloalkyl;

- azosloučeniny obecného vzorce R³-N=N-R⁴, kde R³ a R⁴ jsou nezávisle na sobě C3 až C10 cykloalkyl, který může být dále substituovaný alespoň jednou nitrilovou skupinou;

- organické peroxouhličitany obecného vzorce R⁵-O-C(=O)-OO-R⁶, kde R⁵ a R⁶jsou nezávisle Ci až Cis alkyl a/nebo C3 až C12 cykloalkyl;

- geminální dioly obecného vzorce R⁷-C(OH)2-R⁸, kde R⁷ a R⁸ jsou nezávisle vodík, Ci až Ce alkyl, halogenovaný Ci až Ce alkyl, C3 až Ci2 cykloalkyl, halogenovaný C3 až C12 cykloalkyl, Ce až C12 aryl;

- boronové kyseliny obecného vzorce R⁹-B(OH)2, kde R⁹ je Ci až Cis alkyl, C3 až C12 cykloalkyl a/nebo Ce až C12 aryl;

- a sloučeniny obecného vzorce la,

kde X je O a současně Y je O, NH nebo N-CH2CH3.

2. Zalévací médium podle nároku 1, vyznačené tím, že stabilizační činidlo je vybrané ze skupiny zahrnující l,l'-azobis(cyklohexankarbonitril), chloralhydrát, 2.2'-azobis(A'-butyl-2methylpropionamid), tert-butylperoxy 2-ethylhexyl karbonát, l,l,l,3,3,3-hexafluoropropan-2,2diol, kyselinu fenylboronovou a sloučenina obecného vzorce (la), kde X je O a současně Y je NCH2CH3; nejvýhodněji je stabilizační činidlo vybrané z l,l'-azobis(cyklohexankarbonitrilu), a 2,2,2-trichlorethan-1,1 -diolu.

3. Zalévací médium podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 nebo 2, vyznačené tím, že obsahuje od 90 do 95 % hmota, zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 10 % hmota, stabilizačního činidla.

4. Způsob přípravy vzorku pro elektronovou mikroskopii, vyznačený tím, že se nejprve připraví zalévací médium podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3, následně se zkoumaný vzorek zalije do připraveného zalévacího média, které se poté vytvrzením převede na tuhý pryskyřičný blok, který se následně použije jako preparát pro elektronovou mikroskopii, výhodně pro metody 3DSEM, SEM, STEM a TEM mikroskopie.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačený tím, že zalévací médium pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii podle kteréhokoliv z nároků 1 až 2 se připraví smícháním od 85 do 95 %

- 14 CZ 310708 B6 hmoto, zalévací pryskyřice pro elektronovou mikroskopii a od 5 do 15 % hmota, stabilizačního činidla při teplotě v rozmezí od 20 do 50 °C.

6. Způsob podle nároku 4 nebo 5, vyznačený tím, že krok vytvrzení zalévacího média pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii se provede při teplotě alespoň 50 °C po dobu alespoň 48 hodin.

5 7. Použití zalévacího média podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 pro přípravu vzorku pro elektronovou mikroskopii.