CZ312296A3 - Angiostatin and its application for angiogenesis inhibition - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká endotheliálních inhibitorů nazývaných angiostatin, které reverzibilnš inhibují proliferaci endotheliálních buněk. Přesněji se předložený vynález týká angiostatinových proteinů, které mohou být izolovány z tělesných kapalín jako je krev nebo moč nebo mohou být syntetizovány rekombinantními, enzymatickými nebo chemickými metodami. Angiostatin je schopen inhibovat choroby spojené s angiogenesí a zmirňovat procesy angiogenese. Dále se předložený vynález týká diagnostických eseji a kitů pro stanovení angiostatinu, histochemických kitů pro lokalizaci angiostatinu, DNA sekvencí, kódujících angiostatin a molekulárních sond pro sledování biosyntézy angiostatinu, protilátek, které jsou specifické pro angiostatin, vývoje peptidových agonistů a antagonistů k angiostatinovému receptorů, agonistů a antaginistů anti-angiostatinový receptor-specifická protilátka a cytotoxických činidel připojených k angiostatinovýra peptidům.

Dosavadní stav techniky

Výraz angiogenese jak je zde použit, znamená vznik nových krevních cév ve tkáni nebo orgánu. Za normálních fyziologických podmínek probíhá u lidí nebo zvířat angiogenese pouze ve velmi specificky omezených podmínkách.Angiogenese je normálně pozorována při hojení ran, fetálníra a embryonálním vývoji a tvorbě corpus luteum, endometria a placenty. Výraz endothelium znamená tenkou

vrstvu plochých epitheliálních buněk, kterými jsou vyloženy serozní dutiny, lymfatické cévy a krevní cévy.

Předpokládá se, že jak kontrolovaná tak nekontrolovaná angiogenese probíhají podobným způsobem. Endotheliální buňky a pericyty, obklopené základní membránou, tvoří kapilární krevní cévy. Angiogenese začíná erozí základní membrány enzymy uvolňovanými endotheliálními buňkami a leukocyty. Endotheliální buňky, která vykládají lumen krevních cév, pak prostupují základní membránou. Angiogenní stimuly vyvolávají migraci endotheliálních buněk erodovanou základní membránou. Migrace buněk tvoří výhon” z rodičovské krevní cévy, kde endotheliální buňky procházejí mitozou a proliferují. Endotheliální výhonky spolu splývají za tvorby kapilárních smyček, vytvářejících nové krevní cévy.

Perzistentní, neregulovaná angiogenese se objevuje u více chorobných stavů, tumorových metastáz a abnormálního růstu endotheliálních buněk a podporuje patologické poškození zřejmé u těchto stavů. Škodlivé patologické stavy, ve kterých je přítomna neregulovaná angiogenese byly rozděleny na angiogenně závislé nebo s angiogenesí spojené choroby.

Hypotéza, že tumorový růst je závislý na angiogenesí, byla prvně zmíněna v roce 1971. (Folkman J., Tumor angiogenesis: Therapeutic implications., N.Engl.Jour.Med. 285:1182 1186, 1971). Nej jednodušeji shrnuto je zde uvedeno: Jakmile bylo objeveno 'ujrautí' tumoru, každému zvýšení populace tumorových buněk musí předcházet zvýšení nových kapilár přeměňujících se na tumor. 'Ujmutím' tumoru je v současnosti míněna indikace prevaskulárni fáze tumorového růstu, ve které populace tumorových buněk obsadila objem několika málo krychlových milimetrů a nepřesáhla několik milionů buněk a může přežít na existujících hostitelových mikrocévách. Expanze tumorového objemu nad tuto fázi vyžaduje indukci nových kapilárních krevních cév. Například plicní mikrometastázy v časné prevaskulární fázi u myši by byly nedetekovatelné s výjimkou velmi citlivé mikroskopie histologických řezů.

Příklady nepřímé evidence, které podporují tento koncept, zahrnují:

(1) Rychlost růstu tumorů implantovaných do subkutánních transparentních komor u myši je pomalá a lineární před neovaskularizací a rychlá a téměř exponenciální po neovaskularizaci (Algire GH, a spol., Vascular reactions of normál and malignant tumors in vivo. I. Vascular reactions of mice to wounds and to normál and neoplastic transplants. J.Natl.Cancer Inst. 6:73-85, 1945).

(2) Růsty tumorů v izolovaných perfundovaných orgánech, kde krevní cévy neproliferují, jsou omezeny na 1-2 mm^, ale rychle expanduji na > lOOOnásobek tohoto objemu, když jsou transplantovány myši a stávají se neovaskularizovanými. (Folkman J. a spol., Tumor behavior in isolated perfused organs: In vitro growth and metastasis of biopsy materiál in rabbit thyroid and cannine intestínal segments. Annals of Surgery 164:491-502, 1966).

(3) Růst tumorů v avaskulárním corneu probíhá pomalu a lineární rychlostí, ale po neovaskularizaci přechází do exponenciálního růstu. (Gimbrone M.A., Jr. a spol., Tumor growth and neovascularization: An experimental model using the rabbit cornea. J.Natl.Cancer Institute 52:41-427, 1974).

(4) Tumory suspendované ve vodné kapalině anteriorní komory králičího oka, zůstávají viditelné, avaskulární a omezené na velikost < 1 mm3. Jakmile jsou implantovány do iris vaskulárního lože, stávají se neovaskularizovanými a rostou rychle, dosahují 16000násobku svého původního objemu během 2 týdnů (Gimbrone MA Jr. a spol., Tumor dormancy in vivo by prevention of neovascularization, J.Exp.Med. 136:261-276).

(5) Jsou-li tumory implantovány do kuřecí emryonální chorioallantoinové membrány, rostou pomalu během avaskulární fáze > 72 hodin, ale nepřesáhnou průměrný průměr 0,93 + 0,29 mm. Rychlá tumorová expanze se objevuje během 24 hodin po začátku neovaskularizace a 7.den tyto vaskularizované tumory dosahují středního průměru 8,0 +2,5 mm. (Knighton D.,

Avascular and vascular phases of tumor growth in the chick embryo, British J.Cancer, 35:347-356, 1977).

(6) Vaskulární výskyt metastáz v králičích játrech vykazuje heterogenitu ve velikosti raetasáz, ale vykazuje relativní jednotnost hranice velikosti, při které je přítomna vaskularizace. Tumory jsou obecně avskulární až do 1 mm v průměru, ale nad tímto průměrem jsou neovaskularizovány.

(Lien W. a spol,, The blood supply of experimental líver metastases. II. A microcirculatory study of normál and tumor vessels of the liver with the use of perfused silicone rubber. Surgery 68:334-340, 1970).

(7) U transgenní myši, která vyvíjí karcinomy v beta buňkách pankreatických ostrůvků, jsou prevaskulární hyperplastické ostrůvky omezeny na velikost < 1 mm. Ve stáří 6-7 týdnů se 410 % ostrůvků stává neovaskularizovanými a z těchto ostrůvků vznikají velké vaskularizované tumory o objemu více než lOOOnásobku objemu prevaskulárních ostrůvků. (Folkman J., a spol., Inductíon of angiogenesis during the transition from hyperplasia to neoplasia, Nátuře 339:58-61, 1989).

(8) Specifické protilátky proti VEGF (vaskulární endotheliální růstový faktor - vascular endothelial growth factor) redukuje mikrocévní hustotu a vyvolává významnou nebo dramatickou inhibici růstu tří lidských tumorů, které se spoléhají na VEGF jako jejich jediný mediátor angiogeneze (u holé myši). Protilátka neinhibuje růst nádorových buněk in vitro. (Kim K.J. a spol., Inhibition of vasculary endothelial growth factor-induced angiogenesis suppresses tumor growth in vivo. Nátuře 362:841-844, 1993).

(9) Anti bFGF monoklonální protilátka působí 70% inhibici růstu myšího tumoru, který je závislý na sekreci bFGF jako svém jediném mediátorů angiogenese. Protilátka neinhibuje růst tumorových buněk in vitro. (Hoři A. a spol., Suppression of solid tumor growth by immunoneutralizing monoclonal antidoby against human basic fibroblast growth factor. Cancer Research, 51:6180-6184, 1991).

(10) Intraperitoneální injekce bFGF zvyšuje růst primárního tumoru a jeho metastáz stimulací růstu kapilárních endotheliálních buněk v tumoru. Tumorové buňky samy postrádají receptory pro bFGF a bFGF není mitogen pro tumorové buňky in vitro. (Gross JL·., a spol. Modulation of solid tumor growth in vivo by bFGF. Proc.Amer.Assoc.Canc.Res. 31:79, 1990).

(11) Specifický angiogenesní inhibitor (AGM-1470) inhibuje tumorový růst a metastázy in vivo, ale je méně aktivní v inhibici proliferace tumorových buněk in vitro. Inhibuje vaskulárni endotheliálni proliferaci z poloviny maxima při 41og nižší koncentraci než která inhibuje proliferaci tumorových buněk. (Ingber D. a spol., Angioinhibins:

Synthetic analogues of fumagillin which inhibit angiogenesis and suppress tumor growth. Nátuře, 48:555-557, 1990). Je zde také nepřímo klinicky zřejmé, že tumorový růst je závislý na angiogenesi.

(12) Lidské retinoblastorny, které jsou metastatické do sklivce, se vyvíjejí do avaskulárních sferoidů, které jsou omezeny na méně než 1 mm³ vzhledem ke skutečnosti, že jsou viditelné a inkorporují ³H-thymidin (jsou-li odstraněny z enukleovaného oka a analyzovány in vitro).

(13) Karcinom vaječnikových metastáz do peritoneální membrány jako drobounká avaskulární bílá semena (1-3 mm³). Tyto implantáty vzácně rostou více dokud se jeden nebo více z nich nestane neovaskularizováným.

(14) Intenzita neovaskularizace v rakovině prsu (Weidner N. a spol., Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasíve breast carcinoma, N.Engl.J.Med. 324:1-8, 1991, a Weidner N. a spol., Tumor angiogenesis: A new significant and independent prognostic indicator in early-stage breast carcinoma, J.Natl.Cancer Inst. 84:1875-1887, 1992) a v rakovině prostaty (Weidner N., Carroll PR, Flax J.,

Blumenfeld W, Folkman J. Tumor angiogenesis correlates with metastasis in invasive prostatě carcinoma. American Journal of Pathology, 143(2):401-409, 1993) je vysoce v souladu s rizikem budoucích metastáz.

Ί (15) Metastázy z lidského kutánního melanomu jsou před neovaskularizací vzácné. Výskyt neovaskularizace vede ke zvýšené tloušťce lézí a zvýšení rizika metastáz. (Srivastava A. a spol., The prognostic significance of tumor vascularitv in íntermediate thickness (0,76-4,0 mm thick) skin melanoma. Amer.J.Pathol. 133:419-423, 1988).

(16) Při rakovině měchýře je hladina angiogenního peptidu, bFGF, v moči citlivějším indikátorem stavu a rozsahu choroby než je cytologie (Nguyen M. a spol., Elevated levels of angiogenic peptide, basic fibroblast growth factor, in urine of bladder cancer patients. J.Natl.Cancer Inst. 85:241-242, 1993).

Je tedy zřejmé, že angiogenese hraje hlavní roli v metastázách rakoviny. Jestliže by tato angiogenní aktivita mohla být potlačena nebo eliminována, pak by tumory, i když jsou přítomny, nemohly růst. V chorobném stavu prevence angiogenese by mohla zabránit poškození způsobenému invazí nového mikrovaskulárního systému. Terapie řízené na kontrolu angiogenních procesů by mohly vést k odstranění nebo zmírnění těchto chorob.

Proto je nezbytná kompozice a způsob, který může inhibovat neočekávaný růst krevních cév, zejména v tumorech. Potřebná je také metoda detekce, měření a lokalizace kompozice. Kompozice by měla být schopna překonat aktivitu endogenních růstových faktorů a zabránit tvorbě kapilár v tumorech a tím inhibovat růst tumorů. Kompozice, fragmenty kompozice a protilátky specifické ke kompozici by měly být také schopny zmírnit tvorbu kapilár v jiných angiogenních procesech, jako je hojení ran a reprodukce. Kompozice a způsob inhibice angiogenese by výhodně neměly být toxické a měly by produkovat málo vedlejších účinků. Potřebný je také způsob detekce, měřeni a lokalizace vazebných míst pro kompozici jakož i míst biosyntézy kompozice. Kompozice a fragm,enty kompozice by měly být schopny být konjugovány k jiným molekulám jak pro účely radioaktivního tak neradioaktivního značení.

Podstata vynálezu

V souladu s předloženým vynálezem jsou poskytnuty kompozice a metody, které jsou účinné pro zmírnění angiogenese a inhibici neočekávané angiogenese, zejména angiogenese spojené s tumorovým růstem. Předložený vynález zahrnuje protein, který byl nazván angiostatin”, definovaný svojí schopností překonávat angiogenní aktivitu endogenních růstových faktorů jako je bFGF in vitro a aminokyselinovou sekvenční homologií a strukturální podobností se vnitřní částí plasminogenu, začínající přibližně u 98. plasminogenové aminokyseliny. Angiostatin zahrnuje protein, mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltonů a 45 kilodaltonů jak stanoveno redukční polyakrylamidovou gelovou ! elektroforézou a mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou sekvenci gragraentu myšího plasminogenu začínající u aminokyseliny číslo 98 intaktní myší plasminogenové molekeuly (SEQ ID N0:2).

Aminokyselinová sekvence angiostatínu se mírně mezi druhy liší. Například v lidském angiostatínu je aminokyselinová sekvence v podstatě podobná sekvenci výše popsaného myšího plasminogenového fragmentu, ačkoliv aktivní lidská angiostatinová sekvence může začít buď na aminokyselině čislo 97 nebo 99 intaktní lidské plasminogenové aminokyselinové sekvence. Dále fragmenty lidského plasminogenu máji podobnou anti-angiogenni aktivitu jak je ukázáno v myšim tumorovém modelu. Je třeba chápat, že počet aminokyselin v aktivni angiostatinové molekule se může měnit a že všechny aminokyselinové sekvence, které máji endotheliáni inhibični aktivitu jsou považovány za zahrnuté v předloženém vynálezu.

Předložený vynález poskytuje metody a kompozice pro léčeni chorob a procesů zprostředkovaných nežádoucí a nekontrolovanou angiogenesi podánim kompozice člověku nebo zviřeti, která obsahuje podstně čištěný angiostatin nebo angiostatinové deriváty v dávce dostatečné pro inhibici angiogenese. Předložený vynález je zvláště vhodný pro léčbu nebo represi růstu tumorů. Podáni angiostatinu člověku nebo zviřeti s prevaskularizovanými metastázovanými tumory bude bránit růstu nebo expanzi těchto tumorů.

Předložený vynález také zahrnuje DNA sekvence, kódujici angiostatin, expresní vektory, obsahujíc! DNA sekvence, kódující angiostatin a buňky, obsahující jeden nebo více vektorů, obsahujících DNA sekvence, kódující angiostatin. Předložený vynález dále zahrnuje metody genové terapaie, kdy jsou DNA sekvence, kódující angiostatin zaváděny do pacienta pro modifikaci in vivo angiostatinových hladin.

Předložený vynález také zahrnuje diagnostické metody a kity pro detekci a měření angiostatinu v biologických kapalinách a tkáních a pro lokalizaci angiostatinu ve tkáních a buňkách. Diagnostická metoda a kit mohou být v jakékoliv konfiguraci dobře známé odborníkům v oboru. Předložený vynález také zahrnuje protilátky specifické pro angiostatinovou molekulu a její části a protilátky, které inhibují vazbu protilátek specifických pro angiostatin. Tyto protilátky mohou být polyklonální protilátky nebo monoklonální protilátky. Protilátky specifické pro angiostatin mohou být použity v diagnostických kitech k detekci přítomnosti a množství angiostatinu, který je diagnostický nebo prognostický pro výskyt nebo znovu objevení se rakoviny nebo jiné choroby spojené s angiogenesí. Protilátky specifické pro angiostatin mohou být také podávány člověku nebo zvířeti pro pasivní imunizaci člověka nebo zvířete proti angiostatinu a redukovat tak angiogenní inhibici.

Předložený vynález také zahrnuje diagnostické metody a křty pro detekci přítomnosti a množství protilátek, které vážou angiostatin, v tělesných kapalinách. Diagnostická metoda a kit mohou být v jakékoliv konfiguraci dobře známé odborníkům v oboru.

Předložený vynález také zahrnuje anti-angiostatin receptor-specifické protilátky, které se vážou k angiostatinovérau receptorů a přenášejí vhodný signál k buňce a působí jako agonisté nebo antagonisté.

Předložený vynález také zahrnuje fragmenty a analogy angiostatinového peptidu, které mohou být značeny isotopicky nebo s jinými molekulami nebo proteiny pro použití v detekci a vizualizaci angiostatinových vazebných míst technikami, zahrnujícími, ale neomezujícími se tak, positronovou emisní tomografii, autoradiografii, tokovou cytometrii, radioreceptorové vazebné eseje a imunohistocheraii.

Tyto angiostatinové peptidy a analogy působí také jako agonisté a antagonisté při angiostatinovém receptorů, čímž zvyšují nebo blokují biologickou aktivitu angiostatinu.

Takové peptidy jsou použity v izolaci angiostatinového receptorů.

Předložený vynález také zahrnuje angiostatin, angiostatinové fragmenty, angiostatinové antisera nebo angiostatin receptor agonisty a angiostatin receptor antagonisty připojené k cytotoxickým činidlům pro terapeutická a výzkumné použití. Ještě dále jsou angiostatin, angiostatinové fragmenty, angiostatinové antisera nebo angiostatin receptor agonisté a angiostatin receptor antagonisté kombinovány s farmaceuticky přijatelnými přísadami a popřípadě udržovaně uvolňujícími sloučeninami nebo kompozicemi, jako jsou biodegradabilni polymery, za «

vzniku terapeutických kompozic.

Předložený vynález zahrnuje molekulární sondy pro ribonukleovou kyselinu a deoxyribonukleovou kyselinu zahrnuté ve transkripci a translaci angiostatinu. Tyto molekulární sondy poskytují prostředky pro detegování a měření angiostatinové biosyntézy ve tkáních a buňkách.

V souladu s tím je objektem předloženého vynálezu poskytnutí kompozice, obsahující angiostatin.

Dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnutí způsobu léčení chorob a procesů, které jsou zprostředkovány angiogenesí.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnutí diagnostické nebo prognostické metody a kitu pro detegování přítomnosti a množství angiostatinu v tělesné kapalině nebo tkáni.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnutí metody a kompozice pro léčení chorob a procesů, které jsou zprostředkovány angiogenesí, zahrnujících,aniž by tak byly omezeny, hemangiora, pevné tumory, krevní tumory, leukémii, metastázy, telangiectasii, psoriasis, skleroderma, pyogenní granulom, rayokardiální angiogenesis, Crohnovu chorobu, plakovou neovaskularizaci, koronární kolateraly, cerebrální kolaterály, arteriovenozní malformace, ischeraickou limbickou angiogenezi, korneální chorobu, rubeosis, neovaskulární glaukora, diabetickou retinopatii, retrolentální fibroplasii, arthritis, diabetickou neovaskularizaci, makulární degeneraci, hojení ran, peptický vřed, choroby spojené s Helicobacter, fraktury, keloidy, vaskulogeneze, heraatopoiesís, ovulace, menstruace, placentace a horečka kočičího škrábnutí.

Dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnutí kompozice pro léčení nebo potlačení růstu rakoviny.

Objektem předloženého vynálezu je poskytnutí sloučenin, které modulují nebo napodobují produkci nebo aktivitu enzymů, které produkují angiostatin in vivo nebo in vitro.

Dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnutí antiostatin nebo anti-angiostatin protilátek přímou injekcí angiostatinové DNA do člověka nebo zvířete v případě potřeby takových angiostatin nebo anti-angiostatin protilátek.

Objektem předloženého vynálezu je poskytnout metodu pro detekci a kvantifikaci přítomnosti protilátek specifických pro angiostatin v tělesné kapalině.

Ještě dalším.objektem předloženého vynálezu je poskytnout kompozici, obsahující protilátky k angiostatinu, které jsou selektivní pro specifické regiony angiostatinové molekuly, které nerozpoznávají plasrainogen.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnout metodu pro detekci nebo prognózu rakoviny.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnout kompozici pro použití ve vizualizaci a kvantifikaci míst vazby angiostatinu in vivo a in vitro.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnout kompozici pro použití při detekci a kvantifikaci biosyntézy angiostatinu.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnout terapii rakoviny s minimálními vedlejšími účinky.

Ještě dalším objektem předloženého vynálezu je poskytnout kompozici, obsahující angiostatin nebo angiostatin peptíd napojený k cytotoxickému činidlu pro léčení nebo represi růstu rakoviny.

Ještě dalším objektem vynálezu je poskytnutí kompozic a metod vhodných pro genovou terapii pro zmírnění angiogeních procesů.

Tyto a další objekty, rysy a výhody předloženého vynálezům budou zřejmé po seznámení se s následujícím podrobným popisem provedení a připojenými nároky.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obrázek 1 představuje SEQ ID NO:1, aminokyselinovou sekvenci celého myšího plasrainogenu.

Obr. 2 představuje začátek sekvence myšího angiostatinu (SEQ ID NO:2) a porovnává myší sekvenci s odpovídající lidskými (SEQ ID NO:3), opičími Rhesus (SEQ ID NO:4), prasečími (SEQ ID NO:5) a hovězími (SEQ ID NO:6) plasminogenovými peptidovými fragmenty. Myší sekvence je uvedena jako první, následuje lidská, Rhesus, prasečí a hovězí.

Obr. 3 představuje BrDU značící index tumorových buněk v plicích za přítomnosti nebo nepřítomnosti primárního tumoru.

Obr. 4 představuje Matrigel analýzu vlivu Lewisova plicního primárního tumoru na bFGF řízenou angiogenesis in vivo.

Obr. 5 představuje křivku dávkové odezvy pro sérum získané z myši, nesoucí Lewisův plicní karcinom (LLC-Low) proti seru z normální myši. Hovězí kaplilární endotheliální buňky byly sledovány v bFGF-řízené 72-hodinové proliferační eseji.

Obr. 6 ukazuje, že jak nízko tak vysoko metastazující tumory obsahují endotheliální mitogenickou aktivitu ve svých ascitech, ale pouze nízko metastazující tumorová linie má endotheliální inhibiční aktivitu v seru.

Obr. 7 představuje profil chromatografie s C4 reverzní fází částečně čištěného sera nebo moči ze zvířat, nesoucích nádor,

Obr.8 představuje povrchové plicní metastázy po 13 dnech léčení myši s intaktní plasmínogenovou molekulou, aktivní frakcí z lysin vazebného místa I přípravku lidského plasminogenu, koncentrované moči z nádor nesoucí myši a koncentrované moči z normální myši.

Obr. 9 představuje hmotnost plic po 13 dnech léčení myši s intaktní plasmínogenovou molekulou lidského plasminogenu, aktivní frakcí z lysin vazebného místa I přípravku, koncentrované moči z tumor nesoucí myši a koncentrované moči z normální myši.

Obr.10 je schematické znázornění pTrcHis vektoru.

Obr.11 představuje imunoblot E.coli exprimovaného lidského angiostatinu z 10L fermentace ve velkém, sondovaný monoklonální protilátkou proti lidskému plasminogenovému kringle regionu 1-3. Šipky ukazují rekombinantní lidský angiostatin. A) představuje rekombinantní angiostatin eluovaný 0,2M aminokaproovou kyselinou; B) ukazuje poslední promytí lysinové kolony s 1 X PBS; a C) ukazuje čištěný lyzát z rozbitých buněk.

Obr. 12 je graf, znázorňující procenta inhibice růstu hovězích kapilárních endotheliálních buněk jako funkcí ředění zásobního roztoku; Al, A2, BI , B2 a E jsou rekombinantní klony, které exprimují lidský angiostatin anti-angiogenesní aktivitu; Cl, C2, Dl a D2 kontroly jsou negativní kontrolní klony, obsahující vektor pouze bez lidské DNA sekvence, kódující angiostatin.

Obr. 13 představuje inhibiční vliv na proliferaci rekombinantního lidského angiostatinu na hovězí kapilární endotheliální buňky in vitro.

Obr. 14 představuje index růstu proliferace a apoptický index po odstranění primárního tumoru a ošetření salinickým roztokem nebo fumagillínovým analogem s antiangiogenní aktivitou.

Obr. 15 představuje inhibici růstu T241 primárního tumoru v myši ošetřením s lidským angiostatinem in vivo s jedinou injekcí 40 mg/kg/den.

Obr. 16 představuje inhibici růstu LLC-LM primárního tumoru u myši při ošetření lidským angiostatinem in vivo ve dvou dávkách 40 mg/kg na dávku (80 mg/kg/den).

Obr. 17 představuje vliv odstranění primárního tumoru Lewisova plicního karcinomu na růst jeho plicních metastáz.

Obr. 18 představuje růst proliferačního a apoptického indexu po resekci tumoru.

Obr, 19 představuje vliv podání angiostatinového proteinu myši, mající implantované T241 fibrosarkornové buňky, na celkový objem tumoru jako funkci času.

Obr. 20 představuje vliv podání angiostatinového proteinu myši, mající implantované buňky Lewisova plicního sarkomu (LM) na celkový objem tumoru jako funkci času.

Obr. 21 představuje vliv podání angiostatinového proteinu myši, mající implantované buňky sarkomu buněk retikula (LM) na celkový objem tumoru jako funkci času.

Obr. 22 představuje vliv podání angiostatinového proteinu imunodeficientní SCDI myši, mající implantované buňky PC-3 karcinomu lidské prostaty na celkový objem tumoru jako funkci času po 24denní periodu.

Obr. 23 představuje vliv podání angiostatinového proteinu imunodeficientní SCID myši, mající implantované buňky MDA-MB lidského karcinomu prsu, na celkový objem tumoru jako funkci času po 24denní periodu.

Obr. 24 představuje schematicky klonování myší DNA sekvence, kódující myší angiostatin protein odvozený z myší plasminogen cDNA. Myši angiostatin zahrnuje myší plasminogen kringle regiony 1-4. PCR znamená polymerasovou řetězovou reakci; PÍ je 5'-konec oligonukleotidového primeru pro PCR; P2 je 3'konec oligonukleotidového primeru pro PCR; SS znamená signální sekvenci; ATG je translační iniciační kodon; TAA je translační stop kodon; HA představuje hemaglutininový epitop tag (YPYDVPDYASL); Kl, K2, K3 a K4 představují myší plasminogen kringle regiony 1, 2, 3 a 4. CMV je cytomegalovírový promotor, T7 je bakteriofágový promotor, PA představuje preaktivační peptidy a SP6 je Sp 6 promotor.

Obr. 25 představuje počet buněk jako funkci dnů pro netransfektované buňky (falešné); buňky transfektované vektorem samotným, bez DNA sekvence, kódující angiostatin (vektor 5) a dva angiostatin exprimující klony (AST 31 a AST 37). Panel (a) představuje výsledky transfekce T241 buněk. Panel (b) představuje výsledky LL2 buněk.

Obr. 26 představuje výsledky kultivačního media získaného z E.coli buněk, obsahujících angiostatin klon na počet buněk. Netransfektované buňky (napodobenina); buňky transfektované se samotným vektorem, bez DNA sekvence, kódující angiostatin (vektor 5) a tři angiostatin exprimující klony (AST 25, AST 31 a AST 37). Panel (a) představuje výsledky inkubace kultivace kontroly (simulace) a všech angiostatin klonů (exprimujících a neexpriraujících) v počtu buněk. Panel (b) představuje výsledky inkubace kultivačního media z kontroly (napodobenina), samotného vektoru (vektor 6) a angiostatinových klonů exprimujících myší angiostatin na počet buněk. Panel (c) představuje výsledky inkubace čištěného kultivačního media z kontroly (simulace) a angiostatinových klonů exprimujících myší angiostatin na počet buněk, přičemž kultivační medium bylo čištěno přes lysin-sepharosovou kolonu za získání lysin vázajících složek.

Obr. 27 představuje vliv celkového objemu tumoru jako funkci času implantovaných T241 fibrosarkoraových buněk do myši, kde fibrosarkornové buňky byly transfektovány vektorem, obsahujícím DNA sekvenci, kódující angiostatinový protein a kde vektor je schopen exprímovat angiostatin protein. Netransfektované představuje nezměněné T241 fibrosarkomové buňky implantované do myši. Vektor 6 představuje T241 fibrosarkomové buňky transfektované pouze vektorem, který neobsahuje DNA sekvenci, kódující angiostatin protein, implantované do myši. Klon 25, klon 31 a klon 37 představují tři angiostatin-produkující klony T241 fibrosarkornových buněk transfektovaných vektorem, obsahujícím DNA sekvenci, kódující angiostatin protein, implantované do myší.

Předložený vynález zahrnuje kompozice a způsoby detekce a léčby chorob a procesů, které jsou zprostředkovány nebo spojeny s angiogenesí. Kompozice je angiostatin, který může být izolován z tělních kapalin zahrnujících, ale takto neomezených, sérum, moč a ascity, nebo syntetizovaných chemickými nebo biologickými metodami (např. buněčnou kulturou, rekombinantní genovou expresí, peptidovou syntézou a in vitro enzymatickou katalýzou plasminogenu nebo plasminu za získáni aktivního angiostatinu. Rekombinantní techniky zahrnují genovou amplifikaci z DNA zdrojů za použití polymerasové řetězové reakce (PCR) a genovou amplifikaci z RNA zdrojů za použití reverzní transkriptasy/PCR. Angiostatin inhibuje růst krevních cév do tkání jako jsou nevaskularizované nebo vaskularizované tumory.

Předložený vynález také zahrnuje kompozici, obsahující vektor, obsahující DNA sekvenci, kódující angiostatin, kde vektor je schopen exprimovat angiostatin, je-li přítomen v buňce, kompozici, zahrnující buňku, obsahující vektor, kde vektor obsahuje DNA sekvenci, kódující angiostatin nebo jeho fragmenty nebo analogy a kde vektor je schopen exprimovat angiostatin, je-li přítomen v buňce a metodu, zahrnující implantaci buňky, obsahující vektor do člověka nebo živočicha, kterým není člověk, kde vektor obsahuje DNA sekvenci, kódující angiostatin a kde vektor je schopen expriraovat angiostatin, je-li přítomen v buňce.

Ještě dále zahrnuje předložený vynález angiostatin, angiostatinové fragmenty, angiostatinové antisera, angiostatin receptor agonisty nebo angiostatin receptor antagonisty, které jsou kombinovány s farmaceuticky přijatelnými přísadami a popřípadě udržovaně uvolňujícími sloučeninami nebo kompozicemi, jako jsou biodegradabilní polymery, za vzniku terapeutických kompozic. Zejména vynález zahrnuje kompozici, obsahující protilátku, která se specificky váže k angiostatinu, přičemž se protilátka neváže k plasminogenu.

Přesněji, předložený vynález zahrnuje protein nazvaný angiostatin, který má molekulovou hmotnost přibližně 38 až 45 kilodaltonů (kD), který je schopen překonat angiogení aktivitu endogenních růstových faktorů jako je bFGF in vitro. Angiostatin je protein, mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltonů a 45 kilodaltonů stanoveno redukční polyakrylamidovou gelovou elektroforézou a mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou aminokyselinové sekvenci myšího plasminogenového fragmentu, začínající u aminokyseliny číslo 98 intaktní myší plasminogenové molekuly. Výraz v podstatě podobnou, je-li použit ve vztahu k angiostatin aminokyselinovým sekvencím, znamená aminokyselinovou sekvenci, mající anti-angiogenní aktivitu a mající molekulovou hmotnost přibližně 38 kD až 45 kD, která také má vysoký stupeň sekvenční homologie k peptidovému fragmentu myšího plasminogenu, začínajícího přibližně u aminokyseliny číslo 98 v myším plasminogenu a o hmotnosti 38 kD až 45 kD. Vysoký stupeň homologie znamená alespoň přibližně 60% aminokyselinovou homologii, žádoucí je alespoň přibližně 70% aminokyselinová horaologie, a nejvíce je žádoucí přibližně 80% aminokyselinová homologie. Výraz endotheliální inhibiční aktivita” jak je zde použit, znamená schopnost molekuly inhibovat angiogenesi obecně a , například, inhibovat růst hovězích kapilárních endotheliálních buněk v kultuře za přítomnosti fibroblastového růstového faktoru.

Aminokyselinová sekvence kompletní myší plasminogenové molekuly je uvedena na obr. 1 a v SEQ ID NO:1. Sekvence pro angiostatin začiná přibližně u aminokyseliny 98. Aktivní lidský angiostatin může začít buď při aminokyselině 97 nebo 99 intaktní lidské plasminogenové molekuly. Aminokyselinová sekvence prvních 339 aminokyselin arigio3tatinu z myši je uvedena na obr. 2 (SEQ ID NO:2) a je porovnána se sekvencemi odpovídajících plasminogen peptidových fragmentů z lidského (SEQ ID NO:3), Rhesus opice (SEQ ID NO:4), prasečího (SEQ ID NO:5) a hovězího (SEQ ID NO: 6) plasminogenu. Protože tyto sekvence jsou shodné z více než 50 % svých aminokyselin, je třeba vzít v úvahu, že aminokyselinová sekvence angiostatinu jev podstatě podobná mnoha druhům, Celkový počet aminokyselin v angiostatinu není přesně znám, ale je definován molekulovou hmotností aktivní molekuly. Aminokyselinová sekvence angiostatinu podle předloženého vynálezu se může měnit podle toho, ze kterých druhů je odvozena plasminogenové molekula. Tak ačkoliv angiostatin podle předloženého vynálezu, který je odvozen od lidského plasminogenu má slabě odlišnou sekvenci než angiostatin odvozený od myši, má antiangiogení aktivitu jak je to ukázáno v modelu myšího tumoru.

Angiostatin se prokázal jako schopný inhibovat růst endotheliálních buněk in vitro. Angiostatin neinhibuje růst buněčných liní odvozených od jiných buněčných typů.

Specificky nemá angiostatin žádný vliv na buněčné linie Lewisova plicního sarkomu, epitel plic norka, 3T3 fibroblasty, buňky hladkých svalů hovězí aorty, hovězí retinální pigmentové epithelium, MDCk buňky (psí renální epithelium), W138 buňky (lidské fetální plicní fibroblasty) EFN buňky (myší fetální fibroblasty) a LM buňky (myší konektivní tkáň). Endogenní angiostatin v myši nesoucí tumor, je účinný při inhibici metastáz při systémové koncentraci přibližně 10 mg angiostatinu/kg tělesné hmotnosti.

Angiostatin má specifickou trojrozměrnou konformaci, která je definována kringle regionem plasminogenové molekuly (Robbins K.C., The plasminogen-plasmin enzyme' systém” Hemostasis and Thrombosis, Basic Principles and Practice, 2.vydání, vyd. Colman R.W a spol., J.B.Lippincott Company , str. 340-357, 1987). Je pět takových kringle oblastí, které jsou konformačně příbuznými motivy a mají podstatnou sekvenční homologii, v NH2 koncové části plasminogenové molekuly. Trojrozměrná kombinace angiostatinu se považuje za zahrnující plasminogen kringle obasti 1 až 3 a část kringle oblasti 4. Každý kringle region plasminogenové molekuly obsahuje přibližně 80 aminokyselin a obsahuje 3 disulfidové vazby. Tento cysteinový motiv je znám jako existující v jiných biologicky aktivních proteinech. Tyto proteiny zahrnují, ale nejsou tak omezeny, prothrombin, hepatocytový růstový faktor, scatter faktor a makrofágy stimulující protein. (Yoshimura T. a spol., Cloning, sequencing and expression of human macrophage stimulating protein (MSP, MSTI) confirms MSP as a meraber of the famíly of kringle proteins and locates the MSP gene on Chromosome 3

J.Biol.Chem. Vol.268, č. 21, str. 15461-15468, 1993). Uvažuje se, že jakýkoliv izolovaný protein nebo peptid, majíci trojrozměrnou preclíku podobnou konformaci nebo cysteinový motiv, který má anti-angiogení aktivitu in vivo, je část předloženého vynálezu.

Předložený vynález také zahrnuje detekci angiostatínu v tělesných kapalinách a tkáních pro účely diagnózy nebo prognózy chorob jako je rakovina. Předložený vynález také tahrnuje detekci angiostatin vazebných míst a receptorů v buňkách a tkáních. Předložený vynález také zahrnuje metody léčení nebo prevence angiogeních chorob a procesů, zahrnujících, aniž by tak byly omezeny, arthritis a tumory, stimulací produkce angiostatínu nebo angiostatin agonistů nebo antagonistů a/nebo angiostatin antisera nebo antisera řízeného proti angiostatin antiseru, pacientovi. Další metody léčení zahrnují podání angiostatínu, angiostatin fragmentů, angiostatin analogů, angiostatin antisera nebo angiostatin receptor agonistů a antagonistů podobných cytotoxickým činidlům. Angiotensin může být živočišného nebo lidského původu. Angiostatin může být také produkován synteticky chemickou reakci nebo rekombinantními technikami ve spojení s expresními systémy. Angiostatin může být také produkován enzymatickým štěpením izolovaného plasminogenu nebo plasminu pro tvorbu peptidů, majících antiangiogení aktivitu. Angiostatin může také být produkován sloučeninami, které napodobují působení endogenních enzymů, které štěpí plasminogen na angiostatin. Produkce angiostatínu může být také zmírněna sloučeninami, které ovlivňují aktivitu plasminogen štěpících enzymů.

Pasivní protilátková terapie za použití protilátek, které specificky vážou angiostatin, může být použita ke zmírnění angiogenně-závislých procesů jako je reprodukce, vývoj, a hojení ran a tkáňové náhrady. Dále antisera řízená k Fab regionům angiostatin protilátek mohou být podávána pro blokování schopnosti andogenního angiostatin antisera vázat angiostatin.

Předložený vynález také zahrnuje genovou terapii, kdy je gen kódující angiostatin regulován v pacientovi. Různé metody přenosu nebo doručení DNA do buněk pro expresi genového produktového proteinu, jinak nazývané jako genová terapie, jsou popsány v Gene Transfer into Mammalian Somatic Cells in vivo, N.Yang. Crit.Rev.Biotechn. 12(4): 335-356 (1992), proce je zde zahrnuta jako odkaz. Genová terapie zahrnuje inkorporaci DNA sekvencí do somatických buněk nebo zárodečných buněčných linií pro použití buď v terapii ex vivo nebo in vivo. Genová terapie-působí nahrazení genů, zvětšení normální nebo abnormální genové funkce a potlačení infekčních chorob a jiných patologií.

Strategie léčby těchto medicínských problémů genovou terapií zahrnuje terapeutické strategie jako je identifikace defektního genu a pak přidání funkčního genu buď k nahrazení funkce defektního genu nebo k posílení slabě funkčního genu; nebo profylaktickou strategii, jako je přidání genu pro produktový protein, který bude léčit stav nebo který učiní tkáň nebo orgán citlivějším k léčebnému režimu. Příkladem profylaktické strategie je, že se gen jako angiostatin může umístit do pacienta a tak bránit výskytu angiogenese; nebo by gen, který činí tumorové buňky citlivější k záření, mohl být inzertován a pak by ozážení tumoru mohlo způsobit zvýšené usmrcení tumorových buněk.

Ntnoho protokolů pro transfer angiostatin DNA nebo angiostatin regulátorových sekvencí bylo použito v tomto vynálezu. Transfekce promotorovými sekvencemi jinými než ty, které byly shledány normálně specificky spojené s angiostatinem nebo jiné sekvence, které by mohly zvyšovat produkci angiostatin proteinu jsou také považovány za metody genové terapie. Příklad této technologie lze nalézt v Transkaryotic Therapies, lne. of Cambridge, Massachusetts, používajících homologní rekombinaci k inzertu genetického obrácení, která obrací erythropoietinový gen do buněk. Viz Genetics Engeneering News, 15.duben 1994. Taková genetická obrácení by mohla být použita k aktivaci angiostatinu (nebo angiostatin receptorů) v buňkách normálně neexprimujících angiostatin (nebo angiostatin receptor).

Genové transfer metody pro genovou terapií spadají do tří širokých kategorií - fyzikální (např. elektroporace, přímý genový transfer a částicové bombardování), chemické (nosiče na bázi lipidů nebo jiné nevirální vektory) a biologické (vektor odvozený od viru a receptorový příjem). Například mohou být použity nevirální vektory, které zahrnují liposomy potažené DNA. Takové komplexy liposom/DNA mohou být přímo injíkovány intravenózně do pacienta. Předpokládá se, že komplexy liposom/DNA jsou koncentrovány v játrech, kde doručují DNA k raakrofágúm a Kupfférovým buňkám. Tyto buňky jsou dlouhožijící a tak poskytují dlouhodobou expresi doručené DNA. Navíc vektory nebo holé DNA genu mohou být přímo injikovány do požadovaného orgánu, tkáně nebo tumoru pro cílené doručení terapeutické DNA.

Metodologie genové terapie může být také popsána mistem doručení. Základní cesta pro doručení genů zahrnují ex vivo genový transfer, in vivo genový transfer a in vitro genový transfer. V ex vivo genovém transferu jsou buňky odejmuty z pacienta a rostou v buněčné kultuře. DNA je transfektována do buněk, transfektované buňky jsou ponechány zvětšit svůj počet a pak jsou znovu implantovány do pacienta. V in vitro genovém transferu jsou transformované buňky buňky rostoucí v kultuře, jako jsou buňky tkáňové kultury a ne jednotlivé buňky z jednotlivého pacienta. Tyto laboratorní buňky jsou transfektovány, trans fektované buňky jsou selektovány a expandovány buď pro implantaci do pacienta nebo pro jiná použití.

In vivo genový transfer zahrnuje zavedení DNA do buněk pacienta, když buňky jsouv pacientovi. Metody zahrnují použití virálně zprostředkovaného genového transferu za použití neinfekčního viru pro doručení genu do pacienta nebo injikováni holé DNA do místa v pacientovi a DNA je přijata procentem buněk, ve kterých je exprimován genový proteinový produkt. Dále zde popsané jiné metody jako je použití genového děla mohou být použity pro in vitro inzerci angiostatin DNA nebo angiostatin regulátorových sekvencí.

Chemické metody genové terapie mohou zahrnovat sloučeniny na bází lipidů, ne nezbytně liposomy, pro převedení DNA přes buněčnou membránu. Lipofektiny nebo cytofektiny, pozitivní ionty na bázi lipidů, které se vážou k negativně nabité DNA, tvoří komplex, který může přecházet buněčnou membránou a poskytovat DNA do vnitřku buňky. Jiná chemická metoda používá na receptoru založenou endocytosu, která zahrnuje vazbu specifického ligandu k buněčnému povrchovému receptoru a jeho obalení a transport přes buněčnou membránu. Lígand se váže k DNA a celý komplex je transportován do buňky. Komplex ligand-gen je injikován do krevního proudu a pak cílové buňky, které mají receptor se budou specificky vázat k ligandu a transportovat komplex ligand-DNA do buňky.

Mnoho metod genové terapie používá virové vektory k inzertování genů do buněk. Například změněné retrovirové vektory byly použity v ex vivo metodách k zavedení genů do periferních a tumor infiltrujících lymfocytů, hepatocytů, epidermálních buněk, myocytů nebo jiných somatických buněk. Tyto změněné buňky se pak zavedou do pacienta pro poskytnutí genového produktu z inzertované DNA.

Virové vektory byly také použity k inzertování genů do buněk za použití in vivo protokolů. K přímé tkáňově specifické expresi cizích genů mohou být použity cis-působící regulátorové prvky nebo promotory, které jsou známy jako tkáňově specifické. Alternativně toho může být dosaženo použitím in šitu doručení DNA nebo virálních vektorů ke specifickým anatomickým místům in vivo. Například genový transfer do krevních cév in vivo byl dosažen implantací in vitro transdukovaných endotheliálních buněk do zvolených míst arteriálních stěn. Virem infikovanaé okolní buňky také exprimují genový produkt. Virální vektor může být doručován přímo do in vivo místa, například katetrem a tak se umožní, že je pouze určitá plocha infikována virem a poskyttne se dlouhodobá, místně specifická genová exprese. In vivo genový transfer za použití retrovirus vektorů byl také demonstrován ve tkáni mléčných žláz a jaterní tkáni injekcí změněného viru do krevních cév, vedoucích k orgánům.

Virální vektory, které byly použity pro protokoly genové terapie, zahrnují, ale nejsou tak omezeny, retroviry, jiné RNA viry jako je poliovirus nebo Sindbis virus, adenovirus, adeno-asociovaný virus, herpes viry, SV 40, vakcinia a jiné DNA viry. Replikačně-defektní myší retrovirální vektory jsou nej šíře použitelné vektory genového transferu. Myší leukemie retroviry jsou složeny z jediného řetězce RNA komplexované s nukleárním jádrovým proteinem a polymerasovými(pol) enzymy, zapouzdřenými proteinovým jádrem (gag) a obklopené glykoproteinovýra obalem (env), který determinuje hostitelovo rozmezi. Genomická struktura retrovirů zahrnuje gag, pol a env geny zakončené na 5' a 3' dlouhými terminálními opakováními (long terminál repeats - LTR). Retrovirální vektorové systémy využívají skutečnost, že minimální vektor, obsahující 5' a 3' LTR a obalový signál jsou dostatečné pro umožnění vektorového balení, infekce a intergrace do cílových buněk za podmínky, že virové strukturální proteiny jsou dodávány in trans do balené buněčné linie. Základní výhody retrovirálních vektorů pro genový transfer zahrnují účinnou infekci a genovou expresi ve většině buněčných typů, přesnou jednokopiovou vektorovou integraci do cílové buněčné chroraosomální DNA a snadnou manipulaci retrovirálního genomu.

Adenovirus je složen z lineární, dvoj řetězcové DNA komplexované s jádrovými proteiny a obklopené kapsidovými proteiny. Výhody v molekulární virologii vedly ke schopnosti využít biologii těchto organismů k vytvoření vektorů, schopných transdukce nových genetických sekvencí do cílových buněk in vivo. Vektory na bázi adenovirů budou exprimovat genové produktové peptidy ve vysokých hladinách. Adenovirové vektory mají vysokou účinnost infekčnosti, i s nízkými titry viru. Navíc je virus plně infekční jako buněk prostý virion takže injekce produkčních buněčných linií není nutná. Jinou potenciální výhodou adenovirových vektorů je schopnost dosáhnout dlouhodobé exprese heterologních virů in vivo.

Mechanické metody DNA doručení zahrnují fuzogenní lipidové vesikly jako liposomy nebo jiné vesikly pro membránovou fúzi, lipidové částice DNA inkorporující kationtové lipidy jako je lipofektin, polylysinem zprostředkovaný transfer DNA, přímou injekci DNA jako je mikroinjekce DNA do zárodku nebo somatických buněk, pneumaticky doručované DNA-potažené částice jako jsou zlaté částice použité v genovém dělu a anorganická chemická řešení jako je transfekce fosforečnanem vápenatým. Jiná metoda, ligandem-zprostředkovaná genová terapie, zahrnuje komplexování DNA se specifickými ligandy za vzniku ligand-DNA konjugátů, k řízení DNA do specifické buňky nebo tkáně.

Bylo nalezeno, že injekce plasmidové DNA do svalových buněk poskytuje vysoké procento buněk, které jsou transfektovány a mají udržovanou expresi markér genů. DNA plasmidu může nebo nemusí integrovat do genomu buněk. Neintegrace transfektované DNA by mohla umožnit transfekci a expresi proteinů genových produktů v koncově diferencionovaných, neproliferativních tkáních po prodlouženou časovou periodu bez obavy z mutačních inzercí, delecí nebo alterací v buněčném nebo mitochondrionálním genomu. Dlouhodobý, ale nezbytně ne permanentní, transfer terapeutických genů do specifických buněk může poskytnout léčení genetických chorob nebo profylaktické použití. DNA by měla být reinjektována periodicky pro udržení hladiny genového produktu bez mutací, objevujících se v genomech příjemcových buněk. Neintegrace exogenních DNA může umožnit přítomnost několika různých exogenních DNA konstruktů v jedné buňce, kde všechny konstrukty exprimují různé genové produkty.

Částicově zprostředkované metody genového transferu byly prvně použity ve transformaci rostlinné tkáně. Se zařízením pro částicové bombardování, nebo *genovým dělem”, je generována pohybová síla pro urychlení DNA-potažených částic s vysokou hustotou (jako je zlato nebo wolfram) na vysokou rychlost, která umožňuje penetraci cílových orgánů, tkání nebo buněk. Částicové bombardování může být použito v in vitro systémech nebo s ex vivo nebo in vivo technikami pro zavedení DNA do buněk, tkání nebo orgánů.

Elektroporace pro genový transfer používá elektrický proud pro přípravu buněk nebo tkání citlivých ke genovému transferu zprostředkovanému elektroporací. Krátký elektrický impulz s danou intenzitou pole se používá ke zvýšení permeability membrány tak, že mohou DNA molekuly penetrovat do buněk. Tato technika může být použita v in vitro systémech nebo s ex vivo nebo in vivo technikami pro zavedení DNA do buněk, tkání nebo orgánů.

Nosičem zprostředkovaný genový transfer in vivo může být použit ke transfekci cizí DNA do buněk. Komplex nosič-DNA může být výhodně zaveden do tělesných kapalin nebo krevního proudu a pak místně specificky řízen k cílovému orgánu nebo tkáni v těle. Mohou být použita jak liposomy tak polykationty jako je polylysin, lipofektiny nebo cytofektiny. Mohou být vyvinuty liposomy, které jsou buněčně specifické nebo orgánově specifické a tak bude cizí DNA nesená liposoramera přijata cílovými buňkami. Injekce imunoliposomů, které jsou cíleny ke specifickému receptoru určitých buněk může býtpoužita jako výhodná metoda pro inzerci DNA do buněk, nesoucích receptor. Jiný nosičový systém, který byl použit, je asialoglykoprotein/polylysin konjugátový systém pro vnesení DNA do hepatocytů pro in vivo genový transfer.

Transfektovaná DNA může být také komplexována s jinými typy nosičů tak, že DNA je nesena k buňkám příjemce a pak se usadí v cytoplasmě nebo nukleoplasmě. DNA může být kopulována k nosičovým nukleárním proteinům ve specificky sestavených vesiklových komplexech a nesena přímo do jádra.

Genová regulace angiostatinu může být uskutečněna podáním .sloučenin, které se vážou k angiostatinovému genu, nebo kontrolním regionům spojeným s angiostatinovým genem, nebo jeho odpovídajícím RNA transkriptem pro modifikaci rychlosti transkripce nebo translace. Dále buňky transfektované DNA sekvencí, kódující angiostatin mohou být podány pacientovi pro poskytnutí in vivo zdroje angiostatinu. Například mohou být buňky transfektovány vektorem, obsahujícím nukleokyselinovou sekvenci, kódující angiostatin.

Výraz vektor” jak je zde použít, znamená nosič, který může obsahovat nebo být spojen se specifickými nukleokyselinovými sekvencemi, který působí transport specifických nukleokyselinových sekvencí do buňky. Příklady vektorů zahrnují plasmidy a neinfekční mikroorganismy jako jsou viry nebo nevirální vektory jako jsou konjugáty ligandDNA, liposoray, komplexy lipid-DNA. Může být žádoucí, aby rekombinantní DNA molekula, obsahující angiostatin DNA sekvenci, byla operativně připojena ke kontrolní sekvenci exprese za vzniku expresního vektoru schopného exprese angiostatinu. Transfektované buňky mohou být buňky získané z normální tkáně pacientů, nemocných tkání pacientů nebo to mohou být buňky, které nejsou od pacientů.

Například tumorové buňky získané z pacienta mohou být transfektovány vektorem schopným exprese angiostatinového proteinu podle předloženého vynálezu a znovu zavedeny do pacienta. Transfektované tumorové buňky produkují angiostatinové hladiny, které inhibují růst tumoru, v pacientovi. Pacienti mohou být lidé nebo živočichové, kterými nejsou lidé. Buňky mohou také být transfektovány ne-vektorem, nebo fyzikálními nebo chemickými metodami známými v oboru jako je elektroporace, ionoporace nebo genovým dělem”. Navíc angiostatin DNA může být přímo injektována, bez potřeby nosiče, do pacienta. Zejména angiostatin DNA může být injektována do kůže, svalu nebo krve.

Protokol genové terapie pro transfekci angiostatinu do pacienta může být buď přes integraci angiostatin DNA do genomu buněk, do minichroraosomů nebo jako separátní replikační nebo neraplikační DNA konstrukt v cytoplasmě nebo nukleoplasmě buňky. Angiostatinové exprese může pokračovat po dlouhé časové období nebo může být provedeno reinjektování periodicky pro udržení požadované hladiny angiostatinového proteinu v buňce nebo orgánu nebo stanovené krevní hladině.

Angiostatin může být izolován na HPLC C4 koloně (viz tabulka 3). Angiostatinový protein je eluován ze 30 až 35 % v acetonitrilovém gradientu. Při natriumdodecylsulfát polyakrylamidové gelové elektroforéze (PAGE) za redukčních podmínek se eluuje proteinový pruh s aktivitou jako jediný pík při přibližně 38 kilodaltonech.

Vynálezci ukázali, že růst primárního tumoru je spojen s uvolněním specifického inhibitoru(ů) endotheliální buněčné proliferace, zahrnujících angiostatin, který může potlačovat angiogenesí s metastázami, do krevního proudu a tím inhibovat růst samotných metastáz. Původ angiostatinu spojeného s primárním tumorem neni znám. Sloučenina může být produkována degradací plasminogenu specifickou proteásou nebo by angiostatin mohl být produkován expresí specifického genu, kódujícího angiostatin.

Angiogenní fenotyp primárního tumoru závisí na produkci angiogennich peptidů v přebytku endotheliálních buněčných inhibitorů, které jsou zpracovány normálními buňkami, ale jsou považovány za potlačované během transformace na neoplasii. Zatímco produkce angiostatinu může být regulována směrem dolů v individuální tumorové buňce vzhledem k produkci jejím rodičovským typem, celkové množství inhibitoru zpracované celým tumorem může být dostačující ke vstupu do oběhu a potlačení endotheliálního růstu na vzdálených místech metastáz. Angiostatin zůstává v oběhu po mnohem delší dobu než angiogenní peptid(y) uvolněný(é) primárním tumorem. Proto se angiogení peptidy jeví jako působící lokálně, zatímco angiostatin působí globálně a cirkuluje v krvi s relativně dlouhým poločasem životnosti. Poločas angiostatinu je přibližně 12 hodin až 5 dnů.

Bez vazby na následující hypotézu se předpokládá, že když se tumor stane angíogenním, uvolňuje jeden nebo více angiogeních peptidů (např. aFGF, bFGF, VEGF, IL-8, GM-CSF atd.), které působí lokálně, cílí endothelium v blízkosti primárního tumoru z extravaskulárního směru a necirkulují (nebo cirkulují s krátkým poločasem). Tyto angiogení peptidy musí být produkovány v množství dostačujícím k překonání působení endotheliálního buněčného inhibitoru (inhibitorů angiogenese) pro primární tumor pro pokračování expanze jejich populace. Jakmile se objeví růst primárního tumoru, pokračuje uvolňování endotheliálních buněk do oběhu. Podle této hypotézy působí tyto inhibitory daleko od primárního tumoru, cílovém kapilárním endotheliu raetastáz z intravaskulárního směru, a pokračuje do,oběhu. Právě v době, kdy mohou metastázy začít iniciovat angiogenesí, může být kapilární endothelium v jeho blízkosti inhibováno přicházejícím angiostatinera.

Jakmile primární tumor dosáhne dostatečné velikosti ke způsobení toho, aby angiostatin byl uvolňován kontinuálně do oběhu, je obtížné pro druhý tumorový implantát (nebo mikrometastázy) iniciovat nebo zvýšit svoji vlastní angiogenesí. Jestliže druhý tumorový implantát (např. do subkutánní mezery, nebo do cornea, nebo intravenozně do plic) se objeví krátce po implantaci primárního tumoru, nebude primární tumor schopen potlačit sekundární tumor (protože angiogenese v sekundárním tumoru bude vždy nedostaečná). Jestliže jsou implantovány dva tumory současně (např. v protilehlých bocích) mohou mít inhibitory ekvivalentní inhibující vzájemný účinek.

Angiostatin podle předloženého vynálezu může být:

(i) podáván tumor nesoucím lidem nebo živočichům jako antiangiogení terapie, (ii) sledován v lidském nebo živočišném seru, moči nebo tkáni jako prognostický markér a (iii) použit jako základ k analýze sera a moči pacientů s rakovinou pro podobné angiostatické molekuly.

Za část předloženého vynálezu je považováno, že angíostatin může být izolován z tělesné kaliny jako je krev nebo moč pacientů nebo angiostatin může být produkován rekombinantnímí DNA metodami nebo chemickými metodami syntézy peptidů, které jsou dobře známé odborníkům v oboru. Metody čištění proteinu jsou dobře v oboru známé a specifický příklad metody čištění angiostatinu a hodnocení aktivity inhibitoru je poskytnut v příkladech uvedených dále. Izolace lidského endogenního angiostatinu se provádí za použití podobných technik.

Jedním z příkladů metody produkce angiostatinu za použití rekombinantních DNA technik zahrnuje stupně (1) identifikace a čištění angiostatinu jak je diskutováno výše a jak bude podrobněji popsáno dále, (2) stanovení N-koncové aminokyselinové sekvence čištěného inhibitoru, (3) syntetickou přípravu 5' a 3' DNA oligonukleotidových primerů pro angiostatinovou sekvenci, (4) amplifikace angiostatinové genové sekvence za použití polymerasy, (5) inzertování amplifikované sekvence do vhodného vektoru jako je expresní vektor, (6) inzertování gen obsahujícího vektoru do mikroorganismu nebo jiného expresního systému schopného exprese inhibitoru genu a (7) izolaci rekombinantně produkovaného inhibitoru. Vhodné vektory zahrnují virální, bakteriální a eukaryotické (jako kvasinkové) expresní vektory. Výše popsané techniky jsou plně popsány v laboratorních manuálech jako je Molecular Cloning: A Laboratory Manual druhé vydání Sambrook a spol., Cold Spring Harbor Press, 1989. DNA sekvence lidského plasrainogenu byla publikována (Browne M.J. a spol., Expression of recorabinant human plasminogen and aglycoplasminogen in HeLa ceils”

Fibrinolysis sv.5(4). 257-260, 1991) a tato práce je zde uvedena jako odkaz.

Gen pro angiostatin může být také izolován z buněk nebo tkáně (jako jsou tumorové buňky), které exprímují vysoké hladiny angiostatinu (1) izolací mediátorové RNA ze tkáně,(2) použitím reverzní trans kriptasy pro vytvořeni odpovídající DNA sekvence a pak (3) použitím polymerasové řetězové reakce (PCR) se vhodnými prímery pro amplifikaci DNA sekvence, kódující aktivní angiostatin aminokyselinovou sekvenci.

Ještě další metoda produkce angiostatinu nebo jeho biologicky aktivních fragmentů, je peptidová syntéza. Jakmile byl biologicky aktivní fragment angiostatinu nalezen za použití zkušebního systému popsanému plně dále, může být sekvencován, například metodami automatizovaného peptidovéhp sekvencování. Alternativně, jakmile jsou gen nebo DNA sekvence, která kóduje angiostatin, izolovány, například metodami popsanými výše, může DNA sekvence být stanovena za použití manuálních nebo automatizovaných sekvenačních metod dobře v oboru známých. Nukleokyselinová sekvence naopak poskytuje informaci o aminokyselinové sekvenci. Tak, je-li generován biologicky aktivní fragment specifickými metodami tako je tryptické štěpení, nebo je-li fragment N-koncově sekvencován, může být zbývající aminokyselinová sekvence stanovena z odpovídající DNA sekvence.

Jakmile je známa minokyselinová sekvence peptidu, může být syntetizován fragment technikami dobře v oboru známými jak jsou například uvedeny například v ”Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach E.Atherton a R.C.Sheppard, IRL Press, Oxford, Anglie. Podobně může být syntetizováno více fragmentů, které jsou následně vzájemně navázány za tvorby velkých fragmentů. Tyto syntetické peptidové fragmenty mohou být také vyrobeny aminokyselinovými substitucemi na specifických místech pro zkoušku aginistické a antagonistické aktivity in vitro a in vivo. Peptidové fragmenty, které vykazují vysokou afinitní vazbu ke tkáním, mohou být použity pro izolací angiostatin receptoru na afinitních kolonách. Izolace a čištění angiostatin receptoru je podstatný stupeň pro vysvětlení mechanismu působení angíostatínu. Izolace angiostatinového receptoru a identifikace angiostatinových agonistů a antagonistů bude usnadňovat vývoj léčiv ke zmírnění aktivity angiostatin receptoru, finální cesty k biologické aktivitě. Izolace receptoru umožňuje konstrukci nukleosidových sond pro sledování umístění a syntézu receptoru, za použití in šitu a roztokové hybridizační technologie. Dále může být izolován gen pro angiostatin receptor, inkorporován do expresního vektoru a transfektován do buněk, jako jsou tumorové buňky pacienta, pro zvýšení schopností buněčného typu, tkáně nebo tumoru vázat angiostatin a inhibovat lokální angiogenesi.

Angiostatin je účinný při léčbě chorob nebo procesů, které jsou zprostředkovány, nebo zahrnují, angiogenesi. Předložený vynález zahrnuje metodu léčení angiogenesi zprostředkované choroby účinným množstvím angiostatinu nebo jeho biologicky aktivního fragmentu, nebo kombinací angiostatinových fragmentů, které společně vykazují antiangiogenní aktivitu nebo angiostatin agonistů a antagonistů. Angiogenesi zprostředkované choroby zahrnují, ale nejsou tak omezeny: pevné tumory, krevní tumory jako jsou leukemie; tumorové raetastázy; benigní tumory, například hemangiomy, akustické neuromy, neurofibromy, trachomy a pyogenní granulomy; reumatoidní arthritida; psoriasis; oční angiogenní choroby, například diabetická retinopatie, retinopatie předčasné, makulární degeneraci, odmítnutí corneálního transplantátu, neovaskulární glaukom, retrolentální fibroplasie, rubeosis; Osler-Webberův syndrom; myokardíální angiogenese; plaková neovaskularizace; telangiectasie; hemofilní klouby; angiofibrom a granulace ran. Angiostatin je vhodný pro léčbu chorob nadměrné nebo abnormální stimulace endotheliálních buněk. Tyto choroby zahrnují, ale nejsou tak omezeny, intestinální adhezí, Crohnovu chorobu, atherosklerosu, skleroderm a hypertrofické škáry tj. keloidy. Angiostatin může být použit jako činidlo kontroly porodu prevencí vaskularizace vyžadované pro implantaci embrya. Angiostatin je vhodný při léčbě chorob, které mají angiogenesi jako patologický následek jako je choroba kočičího poškrábání (Rochele minalia quintosa) a vředy (Helicobacter pylori).

Syntetické peptidové fragmenty angiostatinu mají různá použití. Peptid, který se váže k angiostatinovérau receptorů s vysokou spécifitou a aviditou, je radioaktivně značen a použit pro vizualizaci a kvantifikaci vazebných míst za použití autoradiografických a membránově vazebných technik. Tato aplikace poskytuje důležitý diagnostický a výzkumný nástroj. Znalost vazebných vlastností angiostatinového receptorů usnadňuje hodnocení transdukčních mechanismů navázaných k receptorům.

Navíc značení angiostatinových peptidů isotopy s krátkoů životností umožňují vizualizaci receptorových vazebných míst in vivo za použiti positronové emisní tomografie nebo jinýchj moderních radiografických technik pro lokalizaci tumorů s angiostatinovými vazebnými místy.

Systematická náhrada aminokyselin v těchto syntetizovaných peptidech poskytuje vysoce afinitní peptidové agonisty a antagonisty k angiostatinovým receptorům, které zvyšují nebo snižují angíostatinovou vazbu k jeho receptorům. Takoví agonisté jsou používány k potlačení růstu mikrometastáz, čímž omezují rozšíření rakoviny. Antagonisté k angiostatinu jsou aplikovány v situacích neadekvátní vaskularizace, pro blokování inhibičních účinků angiostatinu a napomáhání angiogenesi. Například toto ošetření může mít terapeutické účinky při napomáhání hojení ran u diabetiků.

Angiostatinové peptidy se používají k vývoji afinitních kolon pro izolaci angiostatinových receptorů z kultivovaných tumorových buněk. Izolace a čištění angiostatinového receptoru je následováno aminokyselinovým sekvenc ováním. Použitím této informace mohou být gen nebo geny, kódujících angiostatinový receptor, identifikovány nebo izolovány. Dále jsou klonované nukleokyselinové sekvence vyvinuty pro inzerci do vektorů schopných exprese receptoru. Tyto techniky jsou dobře známé odborníkům v oboru. Transfekce nukleokyselinové sekvence(í), kódujících angiostatinový receptor do tumorových buněk, a exprese receptoru trans fektovanými tumorovými buňkami zvyšuje odpověď těchto buněk na endogenní nebo exogenní angiostatin a tím snižuje rychlost metastatického růstu.

Cytotoxická činidla jako je ricín, jsou podobná angiostatinu a vysoce afinitním angiostatinovým peptídovým fragmentům, čímž poskytují prostředek pro destrukci buněk, které vážou angiostatin. Tyto buňky mohou být nalezeny ve mnoha místech, zahrnujících, aniž by tak byly omezeny, mikrometastázy a primární tumory. Peptidy připojené k cytotoxickým činidlům jsou infundovány mnoha způsoby pro maximální doručení do požadovaného místa. Například ricinnapojené vysoce afinitní angiostatinové fragmenty jsou doručovány kanylou do cév zásobujících cílové místo nebo přímo do cíle. Taková činidla jsou také doručována řízeným způsobem přes osmotické pumpy spojené s infuzní kanylou. Kombinace angiostatinových antagonistů může být současně aplikována se stimulátory angiogenese pro zvýšení vaskularizace tkáně. Tento léčebný režim poskytuje účinný prostředek destrukce metastatické rakoviny.

Angiostatin může být použit v kombinaci s jinými kompozicemi a postupy pro léčbu chorob. Například tumor může být výhodně ošetřen chirurgicky, ozařováním nebo chemoterapií kombinovanými s angíostatinem a pak může být angiostatin následně podáván pacientovi pro zklidnění mikrometasáz a pro stabilizaci a inhibici růstu jakéhokoliv zbytkového primárního tumoru. Dále jsou angiostatin, angiostatinové fragmenty, angiostatinová antisera, angiostatin receptor agonisté, angiostatin receptor antagonisté nebo jejich kombinace, kombinovány s farmaceuticky přijatelnými přísadami a popřípadě matricí s udržovaným uvolňováním jako jsou biodegradabilní polymery za vzniku terapeutických kompozic.

Matrice s udržovaným uvolňováním, jak je zde použita, je matrice vyrobená z materiálů, obvykle polymerů, které jsou degradabilní enzymatickou nebo kyselou/bázickou hydrolýzou nebo disolucí. Jakmile je inzertována do těla, působí na matrici enzymy a tělesné kapalíny. Matrice s udržovaným

4Í uvolňováním je výhodně zvolena z bio kompatibilních materiálů jako jsou liposomy, polylaktidy (polymléčná kyselina), polyglykolidy (polymer glykolové kyseliny), polylaktid koglykolidy (ko-polymery kyseliny mléčné a kyseliny glykolové) polyanhydridy, póly(ortho)estery, polypeptidy, hyaluronová kyselina, kolagen, chondroitin sulfát, karboxylové kyseliny, mastné kyseliny, fosfolipidy, polysacharidy, nukleové kyseliny, polyaminokyseliny, aminokyseliny jako je fenylalanin, tyrosin, isoleucin, polynukleotidy, polyvinylpropylen, polyvinylpyrrolidon a silikon. Výhodná biodegradabilní matrice je matrice z jednoho bud polylaktidu, polyglykolidu, nebo polylaktid ko-glykolidu (kopolymery kyseliny mléčné a glykolové).

Angiogenesí modulující terapeutická kompozice podle předloženého vynálezu může být pevná, kapalná nebo aerosol a může být podávána jakýmkoliv známým způsobem podání. Příklady pevných terapeutických kompozic zahrnují pilulky, krémy, a implantovatelné dávkové jednotky. Pilulky mohou být podávány orálně, terapeutické krémy mohou být podávány topicky. Implantovatelné dávkové jednotky mohou být podávány lokálně, například na místo tumoru, nebo mohou být implantovány pro systémové uvolňování terapeutické angiogenesí modulující kompozice, například subkutánně. Příklady kapalné kompozice zahrnují formulace upravené pro subkutánní, intravenózní, intraarteriální injekci a formulace pro topické a intraoční podání. Příklady aerosolových formulací zahrnují inhalační formulace pro podání do plic.

Angiostatin podle předloženého vynálezu může být také použit k vyvolání protilátek, které jsou specifické pro inhibitor a jeho receptor. Protilátky mohou být buď polykionální protilátky nebo monoklonální protilátky. Tyto protilátky, které se specificky vážou k angiostatinu nebo angiostatinovým receptorům mohou být použity v diagnostických metodách a kitech, které jsou dobře známé odborníkům v oboru pro detekci nebo kvantifikaci angiostatinu nebo angiostatinových receptorů v tělesné kapalině nebo tkání. Výsledky těchto testů mohou být použity pro diagnózu nebo předpověď výskytu nebo znovu objevení se rakoviny a jiných angiogeně zprostředkovaných chorob.

Angiostatin může být také použit v diagnostické metodě a kitu pro detekci a kvantifikaci protilátek schopných vázat angiostatin. Tyto kity by měly umožnit detekci cirkulujících angiostatin protilátek, které indikují výskyt mikrometastáz za přítomnosti angiostatinu sekretovaného primárními tumory in šitu. Pacienti, kteří mají takové cirkulující antiangiostatin protilátky mohou být s větší pravděpodobností postiženi vývojem násobných tumorů a rakovin a může u nich s větší pravděpodobností docházet k opakovanému výskytu· rakoviny po léčbách nebo periodách remise. Fab fragmenty těchto ani-angiostatin protilátek mohou být použity jako antigeny pro generování aniti-angiostatin Fab-fragment antisera, které může být použito pro neutralizaci antiangiostatin protilátek. Taková metoda by měla redukovat odstranění cirkulujícího angiostatinu anti-angiostatinovými protilátkami a tím účinně snižovat cirkulující angiostatinové hladiny.

Jiným aspektem předloženého vynálezu je metoda blokování působení nadbytku endogenního angiostatinu. Toto může být provedeno pasivní imunizací člověka nebo živočicha s protilátkami specifickými pro nežádoucí angiostatin v systému. Toto léčení může být důležité při léčení abnormální ovulace, menstruace a placentace a vaskulogenese. Poskytuje vhodný prostředek pro hodnocení vlivů odstranění angiostatinu na metastatícké procesy. Fab fragment angiostatinových protilátek obsahuje vazebné místo pro angiostatin. Tento fragment se izoluje z angiostatinových protilátek za použití technik, které jsou známé v oboru. Fab fragmenty angiostatinového antisera se používají jako antigeny ke generování produkce anti-Fab fragment sera. Infuze tohoto antisera proti Fab fragmentům angiostatinu brání angiostatinu ve vazbě k angiostatinovým protilátkám. Terapeutický přínos se získá neutralizací endogenních antiangiostatinových protilátek při blokovýní vazby angiostatinu k Fab fragmentům anti-angiostatinu. Přínosem této léčby je usnadnění schopnosti endogenního cirkulujícího angiostatinu dosáhnout cílových buněk a tím zmenšit rozptyl metastáz.

Je třeba pochopit, že předložený vynález je zamýšlen jako zahrnující jakékoliv deriváty angiostatinu, které mají endotheliální inhibiční aktivitu. Předložený vynález zahrnuje celý angiostatin protein, deriváty angiostatin proteinu a biologicky aktivní fragmenty angiostatin proteinu. Tyto zahrnují proteiny s angiostatinovou aktivitou, které mají aminokyselinové substituce nebo mají k aminokyselinovým funkčním skupinám připojené cukry nebo jiné molekuly. Předložený vynález také zahrnuje geny, které kódují angiostatin a angiostatin receptor a proteiny, které jsou těmito geny exprimovány.

Proteiny a proteinové fragmenty s angiostatinovou aktivitou popsanou výše mohou být poskytnuty jako izolované a v podstatě čištěné proteiny a proteinové fragmenty ve farmaceuticky přijatelných formulacích za použití způsobů formulování známých odborníkům v oboru. Tyto formulace mohou být podávány standardními metodami. Obecně mohou být podávány kombinace topicky, transdermálně, intraperitoneálně, intrakraniálně, intracerebroventrikulárně, intracerebrálně, intravaginálně, intraneurinálně, orálně, rektálně nebo parenterálně (např. intravenózně, intraspinálně, subkutánně nebo intramuskulárně). Dále může být angiostatin inkorporován do biodegradabilních polymerů, umožňujících udržované uvolňování sloučeniny, a polymery jsou implantovány do blízkosti místa, kam je žádoucí doručovat léčivo, například na místo tumoru nebo implantovány tak, že se angiostatin pomalu systémově uvolňuje. Osmotické minipumpy mohou být také použity pro poskytnutí kontrolovaného doručení vysokých koncentrací angiostatin přes kanylu do místa zájmu jaká je přímo do metastatického růstu nebo do vaskulárniho zásobování tumoru. Biodegradabilní polymery a jejich použití je například popsáno podrobně v práci Brema a spol.,

J.Neurosurg. 74:441-446 (1991), který je zde zahrnut jako reference v celém svém rozsahu.

Dávka angiostatinu podle předloženého vynálezu bude záviset na stavu choroby nebo podmínkách, které jsou léčeny a dalších klinických faktorech jako je hmotnost a stav člověka nebo živočicha a způsob podání sloučeniny. Pro léčení lidí nebo živočichů může být podáváno mezi přibližně 0,5 mg/kilogram až 500 mg/kilogram angiostatinu. V závislosti na poločasu životnosti angiostatinu v živočiších nebo lidech, může být angiostatin podáván v intervalech mezi několikrát denně až jednou týdně. Předložený vynález je třeba chápat jako použitelný jak pro humánní i veterinární použití. Metody předloženého vynálezu zahrnují jednotlivá i násobná podání, podávaná buď současně nebo během prodlouženého časového období.

Angiostatinové formulace zahrnují ty, které jsou vhodné pro orální, rektální, oftalmické (zahrnující íntravítreální nebo intrakamerální), nasální, topické (zahrnující bukální a sublinguální), intrauterinární, vaginální a parenterální (zahrnující subkutánní, intraperitoneální, intramuskuiární, intravenózní, intradermální, intrakraniální, intratracheálni a epidurální) podání. Angiostatinové formulace mohou být výhodně provedeny v jednotkové dávkové formě a mohou být připraveny běžnými farmaceutickými technikami. Takové techniky zahrnují stupeň uvedení účinné složky do spojení s farmaceutickým nosičem(nosiči) nebo přísadou (přísadami). Obecně se formulace připraví jednotným a těsným uvedením účinné složky do spojení s kapalnými nosiči nebo jemně dělenými pevnými nosiči nebo oběma a pak, je-li to nutné, tvarováním produktu.

Formulace vhodné pro parenterální podání zahrnují vodné a nevodné sterilní injekční roztoky, které mohou obsahovat antioxidanty, pufry, bakteriostaty a roztoky, které činí formulací ísotoníckou s krví zamýšleného příjemce; a vodné a nevodné sterilní suspenze, které mohou zahrnovat suspendační činidla a zahušťovací činidla. Formulace mohou být obsaženy v jednodávkových nebo vícedávkových kontejnerech, uzavřených ampulích a lahvičkách a mohou být uchovávány ve vymražením sušené (lyofilizovaném) stavu, vyžadujícím pouze přídavek sterilního kapalného nosiče, například vody pro injekce, bezprostředně před použitím. Extemporální injekční roztoky a suspenze mohou být připraveny ze sterilních prášků, granulí a tablet dříve popsaného typu.

Preferované jednotkové dávkové formulace jsou ty, které obsahují denní dávku nebo jednotku, denní sub-dávku, nebo její vhodné frakce, podávané složky. Je třeba mít na zřeteli že navíc ke složkám uvedeným výše mohou formulace podle předloženého vynálezu obsahovat další činidla běžná v oboru podle typu požadované formulace. Popřípadě mohou být cytotoxická činidla inkorporována nebo jinak spojena s angiostatinovými proteiny nebo jejich biologicky funkčními peptidovými fragmenty, pro poskytnutí dvojité terapie pacientovi.

Angiogenesí inhibující peptidy podle předloženého vynálezu mohou být syntetizovány ve standardních raikrochemických zařízeních a čištění ověřeno pomocí HPLC a hmotové spektrofotometrie. Metody peptidové syntézy, HPLC čištění a hmotová spektrofotometrie jsou běžně známé odborníkům v oboru. Angiostatinové peptidy a angiostatin receptorové peptidy jsou také produkovány v rekombinantní E.coli nebo kvasinkových expresních systémech a čištěny sloupcovou chromatografií.

Různé fragmenty intaktní angiostatinové molekuly mohou být syntetizovány pro použití v některých aplikacích, zahrnujících, ale neomezujících se na, následující: jako antígeny pro vývoj specifických antiser, jako agonisty a antagonisty aktivní na angiostatin vazebných místech, jako peptidy připojované nebo použité v kombinaci s cytotoxickými činidly pro cílené usmrcení buněk, které vážou angiostatin. Aminokyselinové sekvence, které obsahují tyto peptidy jsou vybrány na základě jejich polohy v exterior regionech molekuly a jsou dosažitelné pro vazbu k antiseru. Amino a karboxylové konce angiostatinu, jakož i střední region molekuly jsou představovány separátně mnoha fragmenty, které byly syntetizovány.

Tyto peptidové sekvence jsou porovnány se známými sekvencemi za použití proteinových sekvenčních databází jako je GenBank, Brookhaven Protein, SWISS-PROT a PIR pro stanovení potenciálních sekvenčních homologií. Tato informace usnadňuje eliminaci sekvencí, které vykazují vysoký stupeň sekvenční homologie k jiným molekulám, čímž se zvyšuje potenciál pro vysokou specifičnost při vývoji antisera, agonistů a antagonistů k angiostatinu.

Angiostatin a peptidy odvozené od angiostatinu mohou být kopulovány k jiným molekulám za použití standardních metod. Amiňo a karboxylové konce angiostatinu obsahují jak tyrosinové tak lysinové zbytky a jsou ísotopicky a neisotopicky značeny různými technikami, například radioaktivně značeny za použití obvyklých technik (tyrosinové zbytky - chloramin T, jodogen, laktoperoxidasa; lysinové zbytky - Bolton-Hunterovo činidlo). Tyto kopulační techniky jsou v oboru dobře známé. Alternativně se tyrosin nebo lysin adují k fragmentům, které nemají tyto zbytky pro usnadnění značení reaktivních amino a hydroxylových skupin peptidu. Kopulační technika je zvolena podle funkčních skupin dostupných na aminokyselinách, zahrnujících, ale neomezujících se na amino, sulfhydral, karboxyl, amid, fenol a imidazol. Různá činidla použitá k uskutečnění těchto kopulací zahrnují mezi jiným glutaraldehyd, diazotizovaný benzidin, karbodiimid a p-benzochinon.

Angiostatinové peptidy jsou chemicky kopulovány k isotopům, enzymům, nosičovým proteinům, cytotoxickým činidlům, fluorescentním molekulám, chemiluminiscentům, bioluminiscentům a jiným sloučeninám pro různé aplikace. Účinnost kopulační reakce je determinována různými technikami vhodnými pro specifickou reakci. Například radioaktivní značení angiostatin peptidu pomocí se provádí za použití chloraminu T a Na^25i _s vysokou specifickou aktivitou. Reakce se ukončí metabisulfitem sodným a směs se odsolí na jednorázových kolonách. Značený peptid se eluuje z kolony a frakce se shromáždí. Z každé frakce se odeberou podíly a měří se radioaktivita na gama čítači. Tímto způsobem se nezreagovaný Na^I oddělí od značeného angiostatin peptidu. Peptidové frakce s nejvyšší specifickou radioaktivitou se uchovávají pro následné použití jako je analýza schopnosti se vázat k angiostatin antiseru.

Jinou aplikací peptidové konjugace je produkce polyklonálního antisera. Například angiostatin peptidy, obsahující lysinové zbytky jsou navázány k čištěnému hovězímu sérovému albuminu za použití glutaraldehydu. Účinnost reakce je determinována měřením inkorporace radioaktivně značeného peptidu. Nezreagovaný glutaraldehyd a peptid jsou odděleny dialýzou. Konjugát je uchováván pro následné použití.

Může být připraveno antiserum proti angiostatinu, angiostatinovým analogům, peptidovým fragmentům angiostatinu a angiostatin receptoru. Po peptidové syntéze a čištění se jak monoklonálního tak polyklonálního antisera dosáhne použitím technik, které jsou známé odborníkům. Například mohou být polyklonální antisera vyvolána u králíků, ovcí, koz nebo jiných zvířat. Angiostatinové peptidy konjugované k nosičové molekule jako je hovězí sérový albumin, nebo samotný angiostatin, jsou kombinovány se směsí pomocných látek, emulgovány a injektovány subkutánně na více míst zad, krku, boků a někdy paty. V pravidelných intervalech jako jsou 2 až 4 týdny, se podávají boosterové injekce. Krevní vzorky se získají venipunkturou, například za použití marginálních ušních vén po dilataci, přibližně 7 až 10 dnů po každé injekci. Krevní vzorky byly ponechány se srazit při 4 °C přes noc a odstřeďují se přibližně při 2400 x g při 4 °C po asi 30 minut. Sérum se odstraní, odeberou se podíly, a skladuje se při 4 °C pro bezprostřední použití nebo při -20 až 90 °C pro následující analýzu.

Všechny vzorky z přípravy polyklonálního antisera nebo vzorky media z produkce monoklonálního antisera se analyzují pro stanoveni titru protilátek. Titr se stanoví několika způsoby, například použitím tečkových blotů a hustotní analýzy a také srážením radioaktivně značených komplexů peptid-protilátka za použití proteinu A, sekundárního antisera, studeného ethanolu nebo aktivního uhlí-dextranu následovaného měřením aktivity gama čítačem. Antisera s nejvyšáím titrem se také čistí na afinitních kolonách, které jsou komerčně dostupné. Angiostatinové peptidy jsou kopulovány ke gelu v afinitní koloně. Vzorky antisera procházejí kolonou a anti-angiostatin protilátky zůstávají navázané ke koloně. Tyto protilátky jsou následně eluovány, shromážděny a hodnoceny stanovením titru a specifičnosti.

Antiserum s nejvyšším titrem se testuje pro stanovení následujícího: a) optimální antiserové ředění pro nejvyšší specifickou vazbu antigenu a nejnižší nespecifickou vazbu, b) schopnost vázat zvyšující se množství angiostatin peptidu ve standardní vytěsňovací křivce, c) potenciální křížová reaktivita s příbuznými peptidy a proteiny, zahrnujícími plasminogen a také angiostatin příbuzných druhů, d) schopnost detegovat angiostatin peptidy v extraktech plasmy, moči, tkání a v buněčném kultivačním mediu.

Kíty pro měření angíostatínu a angiostatin receptoru, jsou také považovány za část předloženého vynálezu. Antisera, které vykazují nejvyšší titr a specifičnost a mohou detegovat angiostatin peptidy v extraktech plasmy, moče, tkání a v buněčném kultivačním mediu se dále hodnotí pro stanovení snadnosti použití kitů pro rychlé, pohodlné, citlivé a specifické měření a lokalizaci angiostatinu. Tyto zkušeint. kity zahrnují, ale nejsou tak omezeny, následující techniky: kompetitivní a nekompetitivní eseje, radíoímunoeseje, bioluminiscenční a chemiluminiscenční eseje, fluorometrické eseje, sendvičové eseje, imunoradiometrické eseje, tečkové bloty, s enzymy spojené eseje jako je ELISA, mikrotitrační destičky, protilátkou potažené pásky nebo namáčecí pásky pro rychlé monitorování moče nebo krve a imunocytochemii. Pro každý kit se stanoví rozmezí, citlivost, přesnost, pohodlnost, specifičnost a reprodukovatelnost eseje. Intraesejová a interesejová variace je stanovena v bodech, odpovídajících 20 %, 50 % a 80 % standardních křivek vytěsněni nebo aktivity.

Jedním příkladem esejového kitu obvykle používaného ve výzkumu a klinické praxí je radíoimunoesejový (RIA) kit. Angiostatin RIA je ilustrován dále. Po úspěšné radiojodací a čištění angiostatinu nebo angiostatin peptidu se přidá antiserum, -vykazující nej vyšší titr v několika ředěních do zkumavek, obsahujících relativně konstantní množství radioaktivity, jako 10000 cpm, ve vhodném pufrovém systému. Další zkumavky obsahují pufr nebo preimunní sérum pro stanovení nespecifické vazby. Po inkubaci při 4 °C po 24 hodin se přidá protein A a zkumavky se vortexují, inkubujíse pří teplotě místnosti 90 minut a odstřeďují přibližně při 2000 - 2500 x g při 4 °C pro vysrážení komplexů protilátky navázané ke značenému antigenu. Supernatant se odstraní odsátím a radioaktivita pelet se spočte na gama čítači. Ředění antisera, které váže přibližně 10 až 40 % značeného peptidu po odečtení nespecifické vazby, je dále charakterizováno.

Potom se rozmezí ředění (přibližně 0,1 pg až 10 ng) angiostatin peptidu použité pro vývoj antisera hodnotí přídavkem známých množství peptidu do zkumavek, obsahujících radioaktivně značený peptid a antiserum. Po další inkubační periodě, například 24 až 49 hodin, se přidá protein A a zkumavky se odstřeďují, supernatant se odstraní a radioaktivita v peletě se spočte. Vytěsnění vazby radioaktivně značeného angiostatin peptidu neznačeným angiostatin peptidem (standard) poskytne standardní křivku. Určité koncentrace jiných angiostatin peptídových fragmentů, plasminogenu, angiostatínu z jiných druhů, a homologní peptidy se přidávají ke zkušebním zkumavkám pro charakterizací specifíty angíostatinového antisera.

Extrakty různých tkání, zahrnují, ale nejsou tak omezeny, primární a sekundární tumory, Lewísův plicní karcinom, kultury angiostatin produkujících buněk, placenta, děloha a jiné tkáně jako je mozek, játra a intestinum, se připraví použitím technik, které jsou úspěšně použity pro extrakci angiostatínu. Po lyofilizaci nebo Speed Vac tkáňových extraktů, se přidá esejový pufr a různé podíly se umístí do RIA zkumavek. Extrakty známých angiostatin produkujících buněk produkují vytěsňovací křivky, které jsou paralelní se standardní křivkou, zatímco extrakty tkání, které neprodukují angiostatin nevytěsňují radioaktivně značený angiostatin z angiostatinového sera. Navíc extrakty moči, plasmy a cerebrospinální kapalíny z živočichů s Lewisovým plícním karcinomem se přidají do esejových zkumavek) ve zvýšených množstvích. Paralelní vytěsňovací křivky indikují použitelnost angiostatinové eseje pro měření angiostatinu ve tkáních a tělesných kapalinách.

Tkáňové extrakty, které obsahují angiostatin jsou dále charakterizovány tím, že se podíly podrobí HPLC s reverzní fází. Eluované frakce se odeberou, suší ve Speed Vac, rekonstituují v RIA pufru a analyzují v angiostatinové RIA. Maximální množství angiostatinové imunoreaktivity je umístěno ve frakcích, odpovídajících eluční poloze angiostatinu.

Esejový kit poskytuje instrukce, antiserum, angiostatin nebo angiostatin peptid, a popřípadě radioaktivně značený angiostatin a/nebo činidla pro srážení vázaných komplexů angiostatin-angiostatin protilátka. Kit je použitelný pro měření angiostatinu v biologických kapalinách a tkáňových extraktech živočichů a lidí s nebo bez tumorů.

Další kit je použit pro lokalizaci angiostatinu ve tkáních a buňkách. Tento angiostatin imunohistochemický kit poskytuje instrukce, angiostatin antiserum a popřípadě . blokující sérum a sekundární antiserum připojené ke fluorescentní molekule jako je fluorescein isothiokyanát, nebo k některému jinému činidlu použitému pro vizualizaci primárního antisera. Imunohístochemícké techniky jsou dobře i známé odborníkům v oboru. Tento angiostatin i ve tkáňových řezech a kultivovaných buňkách za použití jak světelné tak elektronové mikroskopie. Používá se jak pro výzkumné tak klinické účely. Například se provedou biopsie tumorů nebo se tyto odeberou a tkáně se nařežou mikrotomem pro hodnocení míst produkce angiostatinu. Taková informace je použitelná pro diagnostické a popřípadě terapeutické účely při detekcí a léčbě rakoviny. Další metodou pro vizualizací míst angiostatinové biosyntéza zahrnují radioaktivní značení nukleových kyselin pro použití v in šitu hybridizaci k sondě pro angiostatin messenger RNA. Podobně může být lokalizován angiostatin receptor, vizualizován a kvantifikován imunohistochemickými technikami.

Tento vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které nejsou v žádném případě tento vynález omezující. Naopak je třeba zdůraznit, že je možno uskutečnit různá jiná provedení, modifikace a jejich ekvivalenty, které po přečtení popisu mohou samy o sobě být zřejmé odborníkům v oboru aniž by byla překročena myšlenka tohoto vynálezu a/nebo rozsah připojených nároků.

Příklady provedeni vynálezu

Přiklad 1

Volba zvířecího tumorového systému, ve kterém je růst metastáz inhibován primárním tumorem a je urychlen po odstranění primárního tumoru.

Screeningem různých myších tumorů schopných inhibice svých vlastních metastáz, byl vybrán Lewisův plicní karcinom, ve kterém primární tumor účinně inhibuje plicní metastázy. Syngenní C57B16/J šest týdnů staří samečkové myší byly injikováni (subkutánní dorsum) 1 x 10 ⁶ tumorových buněk. Viditelné tumory se nejprve objevují po 3-4 dnech. Když tumory měly velikost přibližně 1500 mm³, byly myši náhodně rozděleny na dvě skupiny. Primární tumor byl úplně vyříznut v první skupině a ponechán netknut ve druhé skupině po simulované operaci. Ačkoliv tumory od 500 mm³ do 3000 mm³ inhibuji růst metastáz, 1500 mm³ byl největší primární tumor, který mohl být bezpečně resekován s vysokým přežitím a ne lokálním znovu výskytem.

Po 21 dnech byly všechny myši usmrceny a provedena autopsie. V myši s netknutým primárním tumorem bylo čtyři +2 viditelné metastázy, ve srovnání s padesáti +5 metastázami v myši, které byl tumor odstraněn (p < 0,0001). Tyto údaje byly potvrzeny hmotností plic, která je v těsném souladu s tumorovým zatížením, jak bylo dříve demonstrováno. Bylo zde 400% zvýšení ve hmotnosti vlhkých plic u myší, které měly své tumory odstraněny ve srovnání s myšmi, ve kterých tumory zůstaly intaktní (p< 0,0001).

Tento experimentální model poskytl reprodukovatelná data a popsaný pokus je reprodukovatelný. Tento tumor je označen Lewisův plicní karcinom - nízko metastatický (Lewis lung carcinoraa -low metastatic) (LLC-Low). Tumor také potlačuje metastázy téměř shodným způsobem v SCID myších, které jsou deficientní jak v B tak T lymfocytech.

Příklad 2

Izolace varianty Lewisova plicního karcinomu, která je vysoce metastatická, ať je či není primární tumor odstraněn

Vysoce metastatická varianta Lewisova plicního karcinomu vyrostla spontánně z LLC-Low buněčné linie z příkladu 1 v jedné skupině myší a byla izolována podle metod popsaných v příkladu 1 a opakovaně transplantována. Tento tumor (LLCHigh) tvoří více než 30 viditelných metastáz ať je či není přítomen primární tumor.

Příklad 3

Velikost metastáz a proliferační rychlosti tumorových buněk v nich. Vliv primárního tumoru, který inhibuje metastázy (LLCLow)

Ve všech pokusech byly použity myši C57B16/J. Myši byly inokulovány subkutánně LLC-Low buňkami a o 14 dnů později byly odstraněny primární tumory u poloviny myší. 5., 10. a 15.den po odstranění tumoru, myši byly usmrceny. Byly získány hístologické sekce plicních metastáz. Myši s netknutým primárním tumorem měly mikromětastázy v plicích, které nebyly neovaskularizovány. Tyto metastázy byly omezeny na průměrně 12 až 15 buněčné vrstvy a nevykazují významnou velikost zvýšení ani 15 dnů po odstranění tumoru. Naopak, živočichové ze kterých byl primární tumor odstraněn, vykazují velké vaskularizované metastázy již 5 dnů po operaci. Tyto metastázy procházejí dalším 4-násobným zvýšením objemu 15.den po odstranění tumoru (jak je potvrzeno hmotností plic a histologií). Přibližně 50 % zvířat, která měla odstraněna primární tumor, uhynulo před koncem pokusu následkem metastáz. Všechna zvířata s netknutým primárním tumorem přežívají do konce pokusu.

Replikační rychlost tumorových buněk s metastázami byla stanovena spočtením jader vybarvených pomocí Brdu, která byla. předem injektována do myši. Vysoké procento tumorových buněk inkorporujících BrdU do malých, avaskulárních metastáz zvířat s netknutým primárním tumorem bylo ekvivalentní BrdU inkorporaci tumorových buněk do velkých vaskularizovaných metastáz myší, ze kterých byl odstraněn primární tumor (obr. 3). Toto zjištění potvrzuje, že přítomnost primárního tumoru nemá přímý vliv na rychlost replikace tumorových buněk v metastázách.

Na obr.3 levý panel představuje BrdU značící index tumorových buněk v plicích za přítomnosti nebo nepřítomnosti primárního tumoru. Před imunohistochemickým vybarvením byly řezy permeabilizovány s 0,2M HC1 po 10 minut a štěpeny s 1 gg/ml proteinasy K (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim, Německo) v 0,2M Tris-HCl, 2 mM CaCl2 při 37 °C 15 minut. Index značení byl hodnocen spočtením procent pozitivních jader při hodnotě 250 . Pravý panel na obr. 3 znázorňuje analýzu celkové plicní hmotnosti tumorů s primárními tumory netknutými nebo odstraněnými 5., 10. a 15.den po operaci. Zvířata byla usmrcena 6 hodin po intraperitoneální injekci BrdU (0,75 mg/myš).

Příklad 4

Inhibice angiogenese v plicních metastázách za přítomnosti netknutého primárního tumoru

Pro měření stupně vaskularizace v plicních metastázách byly tkáně vybarveny protilátkami proti von Willebrandovu faktoru (endotheliální specifický markér, dostupný od Dako lne. Carpenteria, CA). Metastázy ze zvířat s netknutými tumory tvořící tenký obal (8-12 vrstev tumorových buněk) kolem existujících pulmonárních cév. S výjimkou endotheliálních buněk cévní výstélky nebyly žádné buňky nebo bylo málo buněk pozitivních pro von Willebrandův faktor. Naopak, plicní metastázy zvířat 5.dnů po odstranění primárního tumoru nebyly jen větší, ale byly také infiltrovány s kapilárními výběžky, obsahujícími endotheliání buňky, které jsou vybarveny von Willebrandovým faktorem.

V imunohistochemické analýze za přítomnosti endotheliálních buněk v plicních metastázách, měly plicní metastázy s primárním plicním tumorem netknutým 19 dnů po inokulaci, měl obal tumorových buněk, obklopující již existující mikrocévy v plicích. Metastázy byly limitovány 8 až 12 buněčnými vrstvami. Nebyla zde zřejmá žádná neovaskularizace kolem mikrocév a neobsahují žádné nové mikrocévy. Toto byla typická maximální velikost avaskulárních preangiogenních metastaz.

V imunohistochemické analýze tkáně odebrané pět dnů po resekci primárního tumoru (19 dnů po inokulaci primárního tumoru), obklopují metastázy již existující cévy v plicích. Naopak ve vzorku, kde nebyl primární tumor odejmut, byl tumor neovaskularizován. Netknutý primární tumor tak inhibuje tvorbu nových kapilárních krevních cév v metastázách, ale proliferace tumorových buněk v metastázách není neovlivněna primárním tumorem.

Příklad 5

Primární tumor inhibuje angiogenesi druhého tumoru implantovaného do myšího cornea. Růst tohoto druhého tumoru je inhibován.

0,25 až 0,5 ram2 Lewisova plicního tumoru (LLC-Low) bylo implantováno do myšího cornea v den 0. (Muthukkaruppan Vr., a. spol., Angiogenesis in the mouše cornea. Science 205:1416— 1418, 1979). Primární tumor byl vytvořen inokulaci 1 x 10⁶ LLC-Low buněk subkutánně do dorsa, buď 4. nebo 7.den před corneálním implantem; nebo v den corneálního implantuj nebo 4. nebo 7.den po corneálním implantu. Kontrolní myši dostaly corneální implant ale ne subkutánní tumor. Další kontrolní myši dostaly corneální implant a inokulaci LLC-Hogh tumorových buněk do dorsa 4 dny před corneálním implantem. Cornea byla hodnocena denně stereomikroskopií s klouzavou lampou na růst corneálního tumoru (měřeno očním mikrometrem) a na růst nových kapilárních cév z okraje corneálního limbu.

U kontrolních myší, nenesoucích primární subkutánní tumor většina corneí (6/8) vyvinula neovaskularizaci,' začínající 6. až 7.den po corneální implantaci a pokračující do 10.dne. 10. den dosáhly vaskularizované corneální tumory přibližně čtvrtiny objemu celého oka. Za přítomnosti primárních subkutánních LLC-Low tumorů, corneální implanty se nevaskularízovaly, jestliže primární tumor byl na místě alespoň 4 dny nebo více před corneálním implantem (tabulka 1). Za nepřítomnosti neovaskularizace rostly corneální tumory pomalu jako tenké, bílé, avaskulární disky v corneu.

Nicméně, jestliže nebyl primární tumor implantován do 4 dnů po corneálním implantu, cornea vaskularizovala a 3/3 corneální tumory rostly podobnými rychlostmi jako u tumor nenesoucích kontrol. Za přítomnosti primárního subkutánního LLC-High tumoru většina corneí (2/3) vyvinula neovaskularizaci, začínající 7.den po corneální implantaci a pokračující do 10.dne. 10.den opět vaskularizované corneální tumory dosáhly přibližně čtvrtiny objemu celého oka.

Tabulka 1

Inhibice tumorové angiogenese v corneu primárním subkutánním tumorem. [Všechny primární tumory jsou LLC-Low s výjimkou (*), který je LLC-High].
den očního implantu	0 0	0	0 0	0	0
den implantu primárního tumoru	-7 -4	-4*	0 žádný	+4	+7
počet myší s novými corneálními cévami 10.den	2/10 0/9	2/3	2/3 6/8	3/3	2/2
Bylo by možno očekávat,	že 0/10 corneí	by mohlo vykázat

neovaskularizaci, jestliže byl implantován primární LLC-Low subkutánní tumor 7 dní před iraplantem očního tumoru (t.j. 7). Nicméně 2 z tumorů (2/10) se staly nekrotickými protože byly příliš velké (> 3 cm^).

Příklad 6

Primární netknutý tumor inhibuje angiogenesi indukovanou sekubdárním subkutánním implantem bázického faktoru fibroblastového růstu (basic fibroblast growth factor bFGF).

I když experimenty popsané v příkladech V a VI ukazují, že primární tumor inhibuje angiogenesi v sekundárních metasázách, tyto studie neprozrazují, zda primární tumor: (i) inhibuje endotheliální proliferaci (nebo angiogenesi) přímo, nebo (ii) nepřímo potlačováním angiogenní aktivity metastatických tumorových buněk. Pro rozlišení mezi těmito dvěma možnostmi bylo ohnisko angiogenese indukováno implatem matrigelu, obsahujícího bázický fibroblastový růstový faktor (bFGF). (Passanti A. a spol., A simple, quantitative method for assessing angiogenesis and antí-angiogenic agents using reconstituted basement membrane, heparin and fibroblast growth factor. Lab.Invest. 67:519, 1992).

Matrigel (extrakt základních membránových proteinů), obsahující buď 25 nebo 50 ng/ml bFGF za přítomnosti heparinu, byl injektován subkutánně do ventrálního povrchu normální a tumor nesoucí myši (LLC-Low). Myši byly usmrceny o 4 dny později a koncentrace hemoglobinu v gelu byla měřena pro kvantifikaci tvorby krevních cév. Již dříve bylo zjištěno, že počet nových cév, které vstupují do matrigelu je v souladu s koncentrací hemoglobinu. (Folkman J., Angiogenesis and its inhibitors in Improtant Advances in Oncology 1985, VT DeVita, S. Hellman a S.Rosenberg, vyd., J.B.Lippincott, Philadelphia 1985). Některé gely byly také připraveny pro histologické hodnocení. U normální myši byly úplně červené matrigelové pelety, které obsahují 50 ng/ml bFGF. Byly těžce invadovány novými kapilárními cévami a obsahují 2,4 g/dl hemoglobinu. Matrigel, který postrádá bFGF byl translucentní a šedý a obsahuje pouze 0,4 g/dl hemoglobinu (6-násobný rozdíl). Naopak, matrigel z myši s primárním tumorem obsahuj pouze 0,5 g/dl (obr. 4).

Téměř úplná inhibice angiogeneze v tomto pokuse potvrzuje, že přítomnost Lewisova plicního primárního tumoru může inhibovat přímo bFGF-indukovanou angiogenesi.

Přiklad 7

Transfer sera ze zvířete nesoucího tumor do zvířeti, kterému byl odstraněn primární tumor potlačuje metastázy

Myším byl implantován Lewisův plicní karcinom jak je popsáno výše. Po 15 dnech když tumory byly velikosti přibližně 1500 mm^, byly myši náhodně rozděleny do čtyř skupin, Tři skupiny byly podrobeny kompletnímu chirurgickému vynětí primárního tumoru; v jedné skupině byly tumory ponechány na místě (po similaci chirurgického postupu). Myši ve třech resekčních skupinách pak denně dostávaly intraperitoneální injekce salinického roztoku, sérum z normální tumor nenesoucí myši nebo sérum z myši se 1500 mm^ Lewisovým plicním karcinomem. Skupina myší s tumory ponechány netknutými dostávala salinické injekce. Všechny myši byly ošetřovány 21 dny, pak byla zvířata usmrcena a byly spočteny plicní metastázy (tabulka 2).

Tabulka 2

	odstraněný primární tumor	primární tumor netknutý
léčba	sal. sérum z	sérum z	salinícké
(intraperi-	normální	myši ne-	injekce
toneální	myši	soucí
injekce)		tumor	-
počet	55+5 50+4	7+2	3+1

Tyto výsledky byly potvrzeny hmotností plic. p< 0,0001 pro rozdíl mezi dvěma skupinami [(55&50) vs. (7&3)]. Podobné výsledky byly získány za použití angiostatinu z močí zvířat nesoucích tumor.

Příklad 8

Hovězí kapilární endotheliální (BCE) buněčná esej

BCE buňky se použijí poue mezi pasážemi 9 a 14. V den 0 byly buňky umístěny na plotnu do želatinizované (1,5 % želatiny v PBS při 37 °C, 10 % CO2 po 24 hodin a pak opláchnuty 0,5 ml PBS) 24 jamkových destiček v koncentraci 12500 buněk/jamka. Buňky byly spočteny za použití hemocytometru. Buňky byly umístěny na plotnu v 500 μΐ DMEM s 10 % teplem inaktivovaného (56 °C 20 minut) bovinního telcího sera a 1 % glutamin-pen-strep (GPS). ·

Příklad 8

Bovinní kapilární endotheliální (BCE) buněčná esej

BCE buňky byly použity pouze mezi pasážemi 9 a 14. V den 0 byly buňky BCE umístěny do želatinované (1,5 % želatiny v PBS při 37 °C, 10% CO2 po 24 hodin a pak promyty 0,5 ml PBS) 24jarakových destiček v koncentraci 12500 buněk/jamka. Buňky byly spočteny za použití hemocytometru. Buňky byly umístěny na plotnu v 500 μΐ DMEM s 10 % teplem inaktivovaného (56 °C na 20 min) bovinního telecího sera a 1 % glutamin-pen-strep (GPS).

BCE buňky byly podníceny následovně: Medium se odstraní a nahradí se 250 μΐ DMEM/5% BCS/1 % GPS. Pak se do jamek přidá testovaný vzorek. (Množství se mění v závislosti na testovaném vzorku). Plotny se umístí při 37 °C/10 % CO2 na přibližně 10 minut. 250 μΐ DMEM/5% BCS/1% GPS se 2 ng/ml bFGF se přidá do každé jamky. Konečné medium je 500 μΐ DMEM/5 % BCS/1 % GPS/ s 1 ng/ml bFGF. Plotna se vrátí do 37 °C/10 %

CO2 inkubátoru na 72 hodin.

4.den jsou buňky spočteny odstraněním media a pak tryptinizací všech jamek (0,5 ml trypsinu/EDTA) na 2 až 3 minuty. Suspndované buňky se pak transferují do scintilačních lahviček s 9,5 ml Hemetallu a spočtou za použití Coulter counteru. Jednotka aktivity je množství sera, obsahujícího angiostatin, které je schopné produkovat poloviční maximální inhibici kapilární endotheliální proliferace, jsou-li endotheliální buňky inkubován v bFGF 1 ng/ml po 72 hodin.

Příklad 9

Sérum z myši, nesoucí nízkometastatický Lewisův plicní tumor (LLC-Low) inhibující kapilární endotheliální buněčnou proliferaci in vitro

Hovězí kapilární endotheliální buňky byly stimulovány bázickým fibroblastovým růstovým faktorem (bFGF 1 ng/ml) v 72-hodinové proliferační eseji. Sérum z myší, nesoucích tumor, přidané k těmto kulturám inhibuje endotheliální buněčnou proliferaci dávkově závislým a reverzibilním způsobem. Normální sérum nebylo inhibiční (obr. 5). Endotheliální buněčná proliferace byla inhibována podobným způsobem (vzhledem ke kontrolám) šerem získaným z tumor nesoucích nu/nu myší a SCID myší. Po odstranění primárního tumoru angiostatinové aktivita zmizela ze sera během 3-5 dnů.

Tumor nesoucí sérum také inhibuje bovinní aortické endotheliální buňky a endotheliální buňky získané ze spontánního myšího hemangioendotheliomu. (Obeso a spol., Methods in Laboratory Investigation, A Hemangioendotheliomaderíved cell line; Its use as a Model for the STudy of Endothelial Cell Biology, Lab.Invest., 63(2), str. 259-269, 1990), ale neinhibuje buňky Lewisova plicního tumoru, 3T3, fibroblastů, buňky aortických hladkých svalů, epithelia plic norka nebo fibroblastů W138 plic lidského fetu.

Příklad 10

Sérum z myši, nesoucí Lewisův plicni tumor (LLC-High), které neinhibuje metastazy, neinhibuje kapilární endotheliální buněčnou proliferaci in vitro

Sérum z myši, nesoucí primární tumor LLC-High významně neinhibuje proliferaci bFGF-stimulováných hovězích kapilárních endotheliálních buněk vzhledem ke kontrole. Také, jestliže bylo toto sérum podrobeno prvním dvěma stupňům čištění (heparin-Sepharosová chromatografie a gelová filtrace), nebyla angiostatinová aktivita nalezena v žádných frakcích.

Příklad 11

Ascity z Lewisova plicního karcinomu (nízko metastatická), také generuje angiostatinové sérum

Myši dostaly intraperitoneální injekce buď LLC-Low nebo LLC-High tumorové buňky (10^) a o jeden týden později 1-2 ml byl krevní ascit získán od každé z 10-20 myší. Byl pozorován výsev mesentrického tumoru. Myši byly pak usmrceny. Bylo získáno sérum srdeční punkcí. Sérum bylo také získáno z normální, tumor nenesoucí myši jako kontroly. Sérum a ascity byly odstředěny pro odstranění buněk, a supernatanty byly hodnoceny na hovězí kapilární endotheliální buňky stimulované bFGF (1 ng/ml) (viz příklad IX). Ascity, pocházející jak z tumorových typů stimulujících významně proliferaci kapilárních endotheliálních buněk (např. 100% proliferace) proti kontrole po 72 hodin (obr. 6). naopak sérum z nízkometastatických myší inhibuje endotheliální buněčnou proliferaci (inhibice 79 % kontroly). Sérum z vysokometastatické linie bylo stimulující ze 200 %.

Tato data ukazují, že ascity z nízkometastatické linie obsahují převahu stimulátoru endotheliálního růstu vůči angiostatínu. Tento stav je analogický pevnému primárnímu tumoru. Navíc angiostatinová aktivita se objevuje v seru, jak byla bez stimulační aktivity. Tento způsob je podobný jako u pevného primárního tumoru (LLC-Low). Ascity z vysoce metastatického tumoru (LLC-High) se také jeví jako obsahující převahu endotheliálního buněčného stimulátoru, ale angíostatin nemohl být v seru identifikován.

Příklad 12

Frakcionace angiostatinu ze sera sloupcovou chromatografií a analýza růst inhibujících frakcí pomocí SDS-PAGE

Pro Čištění angiostatinového(ých) ser, bylo spojeno sérum z myší, nesoucích tumor. Inhibiční aktivita, hodnocená podle výše popsané in vitro eseji inhibitorové aktivity, bylo postupně chroraatografovánoza použití heparin-Sepharosy,

Biogel A0,5 ram agarosy a několika cyklů vysokotlakové .· kapalinové chromatografie s C4-reverzní fází (HPLC). SDS-PAGE HPLC frakce, která obsahuje endotheliání inhibitorovou aktivitu, poskytuje oddělený pás o zjevně redukované M_r 38000 Daltonů, který byl Čištěn přibližně 1 milion-násobně (viz tabulka 3) na specifickou aktivitu přibližně 2xl0⁷. V různých stadiích čištění byly spojené frakce testovány se specifickými protilátkami na přítomnost známých endotheliálních inhibitorů. Destičkový faktor-4, thrombospondin, nebo transformační růstový fktor beta, nebyly nalezeny v částečně čištěných nebo čištěných frakcích.

Tabulka 3

sérum	specifická aktivita (jednotky*/mg) 1,69	násobek čištění 1
heparin sepharosa	14,92	8,8
Bio-gel A0,5m	69,96	41,4

HPLC/C4 2χ10⁷ 1,2χ10⁶ *Jednotka aktivity je takové množství sera, obsahujícího angiostatin, které je schopno produkovat polovinu maximální inhibice kapilární endotheliální proliferace, jsou-li endotheliální buňky inkubovány v bFGF 1 ng/ml po 72 hodin.

Příklad 13

Frakcionace angiostatinu z moči sloupcovou chromatografií a analýza růst inhibujících frakcí pomocí SDS-PAGE

Čištění endotheliálního buněčného inhibitoru(ů) ze sera je znesnadněno malým objemem sera, které bylo získáno z každé myši a velkým množstvím proteinu v seru.

Moč z myší, nesoucích tumor, byla analyzována a shledáno, že obsahuje inhibitor endotheliální buněčné proliferace, který není přítomen v moči tumor nennesoucích myší a z myší s LLG-High tumory. Čištění endotheliální buněčné aktivity bylo provedeno stejnou strategií, která byla použita pro čištění sera (popsáno výše)(obr.7).

Obr. 7 představuje chromatografií s C4 reverzní fází částečně čištěného sera nebo moči z tumor nesoucích zvířat. Všechny frakce byly hodnoceny na bovinní kapilární endotheliální buňky s bFGF v eseji 72-hodinové proliferace jak je popsáno v příkladu IX. Oddělený pík inhibice byl zřejmý v obou případech eluujících ve 30 až 35 % acetonitrilu ve frakcí 23. SDS-polyakrylamidová gelové elektroforéza inhibiční frakce ze třetího cyklu chromatografie s C4 reverzní fází sera z tumor nesoucích zvířat ukazuje jediný pás při asi 38000 Daltonech.

Příklad 14

Charakterizace cirkulujícího angiostatinu

Endotheliální inhibice byla studována postupem popsaným v příkladu 9. Angiostatin byl izolován na koloně Synchropak HPLC C4. (Synchrom, lne. Lafayette, IN). Inhibitor byl eluován při 30 až 35% acetonitrilovém gradientu. Při natrium dodecylsulfátové polyakrylamidové geíové elektroforézním (PAGE) gelu za redukčních podmínek (β-merkaptoethanol (5% obj./obj.), proteinové pásy s aktivitou eluují při 38 kilodaltonech. Za neredukujících podmínek eluuje protein s aktivitou při 28 kilodaltonech. Aktivita byla nalezena v podobných bodech, kdy byl počáteční vzorek izolován z močo nebo ze sera. Aktivita nebyl detegována v žádném z jinách pásů.

Aktivita spojená s pásy zmizela při zahřátí (100 °C na 10 minut) nebo zpracování s trypsinem. Když byl pás s aktivitou extrahován směsí voda/chloroform (1:1), byla aktivita nalezena pouze ve vodné fázi.

Příklad 15

Čištění inhibičních fragmentů z lidského plasminogenu

Plasminogenové lysin vazebné místo I bylo získáno od Sigma Chemical Company. Přípravek je čištěný lidský plasminogen po štěpení elastasou. Lysin vazebné místo I získané tímto způsobem je populace peptidů, které obsahují, ve spojení, alespoň tři trojité-smyčkové struktury (čísla 1 až 3) v plasmin A-řetězci (Kringle 1+2+3). (Sotrup-Jensen L., a spol., v Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombolysis, díl.3, 191, Davidson J.F. a spol. vyd. Raven

Press, New York 1978 a Wiraan B. a spol., Biochemica et Biophysica Acta, 579, 142 (1979)). Plasminogenové lysin vazebné místo I (Sigma Chemical Company, St.Louis, MO) bylo resuspendováno ve vodě a naneseno na kolonu s C4-reverzní fází, která byla ekvilibrována s HPLC-grade vodou/0,1 % TFA. Kolona byla eluována gradientem voda/0,1 % TFA až acetonitril/O,1 % TFA a frakce byly odebrány do polypropylenových zkumavek. Podíl každé byl odpařen ve speed vac, resuspendován s vodou a aplikován na BCE v proliferační eseji, tento postup byl opakován dvakrát pro inhibiční frakce za použití podobného gradientu pro eluci. Inhibiční aktivita eluuje při 30-35 % acetonitrilu v konečném průchodu C4 kolonou. SDS-PAGE inhibiční frakce poskytuje tři oddělené pásy zjevně redukované molekulové hmotnosti 40, 42,5 a 45 kd. SDS-PAGE za neredukčních podmínek poskytuje tři pásy molekulové hmotnosti 30, 32,5 a 35 kd.

Příklad 16

Extrakce inhibiční aktivity z SDS-PAGE

Čištěné inhibiční frakce z čištění na bázi lidského plasminogenu byly děleny pomocí SDS-PAGE za nedenaturujících podmínek. Plochy gelu, odpovídající pásům viditelným v sousedních drahách s nanesenými stejnými vzorky při vabarvení stříbrem byly vyříznuty z gelu a inkubovány v 1 ml salinického fosfátového pufru při 4 °C po 12 hodin v polypropylenových zkumavkách. Supernatant byl odstraněn a dialyzován dvakrát proti salinickému roztoku po 6 hodin (MWCO = 6-8000) a dvakrát proti destilované vodě po 6 hodin. Dialyzáty byly odpařeny vakuovým odstředěním. Produkt byl resuspendován v salinickém roztoku a aplikován k bovinním kapilárním endotheliálním buňkám stimulovaným 1 ng/ml bázického fibroblastového růstového faktoru v 72 hodinové eseji. Protein extrahovaný z každého ze tří pásů inhibuje kapilární endotheliální buňky.

Příklad 17 'Studie léčby plasminogenovým fragmentem

Myši byly implantovány Lewisovými plicními karcinomy a podrobeny resekci při velikosti tumorů 1500-2000 mm^. V den operace byly myši náhodně rozděleny na 6 skupin po 6 myších. Myši denně dostávaly intraperitoneální injekce se třemi čištěnými inhibičními fragmenty lidského plasminogenu, celého lidského plasminogenu, moči ze zvířat nesoucích tumor, moči z normálních myší nebo salinický roztok. Jedna skupina zvířat nesoucích tumor, která dostala pouze simulovaný postup,.byla ošetřována saliníckými injekcemi. Ihned po odstranění primárního tumoru myši dostaly intraperitoneální ínekci 24 pg (1,2 mg/kg/den/myš) inhibičních plasminogenových fragmentů jako nástupní dávku. Potom dostávaly denně intraperitoneální injekce 12 pg inhibičního fragmentu (0,6 mg/kg/den/myš) po dobu trvání pokusu. Kontrolní myši dostaly stejnou dávku celé plasminogenové molekuly po odstranění tumoru. Pro ošetření močí se moč od normální nebo tumor nesoucí myši filtruje, dialyzuje intenzivně, lyofilizuje a pak resuspenduje ve sterilní vodě pro získání 250 násobné koncentrace. Myším se podává 0,8 ml dialyzovaného myšího koncentrátu, buď od myší, nesoucích tumor nebo normálních myší, ve dvou intraperitoneálních injekcí v den odstranění tumoru jako nástupní dávce. Tyto potom dostávají denní intraperitoneální injekce 0,4 ml dialyzované a koncentrované moči v průběhu pokusu. V léčení se pokračuje 13 dnů a pak byly myši usmrceny a provedena autopsie.

Výsledky pokusů jsou uvedeny na obr. 8 a 9. Obr. 8 představuje povrch plicních metastáz po 13 dnech léčení. Povrchové plicní metastázy označují počet metasáz, které jsou viditelné v plicích myší při autopsii. Ke stanovení počtu metasáz byl použit stereomikroskop. Obr. 8 představuje •průměrný počet povrchových plicních metasáz, které byly spočteny a byla stanovena standardní chyba měření. Jak je uvedeno, nevykazuje skupina myší s přítomným primárním tumorem metastázy. Myši ve kterých primární tumor byl resektován a byly ošetřeny se salínickým roztokem, vykazují intenzivní metasázy. Myši ošetřené fragmentem lidského plasminogenu nevykazovaly žádné metastázy. Myši ošetřené celým plasminogenem vykazovaly rozsáhlé metatázy indikující, že celá plasminogenové molekula neméla žádnou endotheliální inhibiční aktivitu. Ty myši, které byly ošetřeny dialyzovanou a koncentrovanou močí myší, nesoucích tumor, nevykazovaly žádné metastázy. Myši ošetřené koncentrovanou močí z normální myši vykazovaly rozsáhlé metasázy. Při stanovení hmotnosti plic byly získány podobné výsledky (obr. 9).

Příklad 18

Aminokyselinová sekvence myšího a lidského angiostatinu.

Aminokyselinová sekvence angiostatinu izolovaného z myší moči a angiostatinu izolovaného z přípravku fragmentu lidského lysin vazebného místa, byly stanoveny na Applied Biosystem Model 477A protein sekvenátoru.

Fenylthiohydantoinové aminokyselinové frakce byly identifikovány pomocí on-line ABI Model 120A HPLC.

Aminokyselinová sekvence stanovená od N-terminální sekvence a tryptických digestů myšího a lidského angiostatinu indikuje, že sekvence angiostatinu je podobná sekvenci začínající při aminokyselinové sekvenci 98 myšího plasminogenu. Tedy aminokyselinová sekvence je molekula, obsahující protein, mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamid gelové elektroforézy a mající aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou sekvenci fragmentu myšího plasminogenu začínající při aminokyselině číslo 98 intaktního myšího plasminogenu. Začínající aminokyselinová sekvence myšího angiostatinu (SEQ IN NO: 2) je uvedena na obr. 1. Délka aminokyselinové sekvence může být mírně delší nebo kratší než je uvedeno na obr. 1.

Analýza N terminální aminokyselinové kyseliny a tryptických digestů aktivní frakce lidského lysin vazebného místa I (viz příklad 15) ukazuje, že sekvence frakce začíná při přibližně aminokyselině 97 nebo 99 lidského plasminogenu a lidského angiostatinu je homologní s myším angiostatinem. Začínající aminokyselinová sekvence lidského angiostatinu (start při aminokyselině 98) je uvedena na obr. 2, (SEQ ID NO:3). Aminokyselinová sekvence myšího a lidského angiostatinu je porovnána na obr. 2 s odpovídajícími aminokyselinovými sekvencemi z plasminogenu jiných druhů, zahrnujících prasečí, hovězí a Rhesus opičí plasminogen, a indikuje přítomnost angiostatinu v těchto druzích.

Příklad 19

Exprese lidského angiostatinu v E.coli pTrcHisA vektor (Invitrogen)(obr.10) byl použít k dosažení vysoké hladiny regulované transkripce z trc promotoru pro zvýšenou translační účinnost eukaryotických genů v E.coli. Angiostatin je exprimován fúzovaný k N73 terminálnímu nikl-váza jí čímu polyhistidinovému konci pro jednostupňové čištění využívající pryskyřic s afinitou ke kovům. Enterokinasové štěpící rozpoznávací místo ve fuzním peptidu umožňuje následné odstranění N-terminálního histidinového fuzního peptidu z čištěného rekombinantního proteinu. Rekombinantní lidský angiostatin protein byl zjištěn jako vázající lysin; je křížově reaktivní s monoklonálními protilátkami specifickými pro kringle regiony 1, 2 a 3 a inhibuje bFGF-řízenou endotheliální buněčnou proliferaci in vitro.

Pro konstrukci inzertu se získá genový fraagment, kódující lidský angiostatin z lidské jaterní mRNA, která se reverzně transkribuje a amplifikuje za použití polymerasové řetězové reakce (PCR) a specifických priraerů. Produkt 1131 bázových párů kóduje aminokyseliny 93 až 470 lidského plasminogenu. Amplifikovaný fragment byl klonován do Xhol/KpnI místa pTrcHisA a výsledný konstrukt transformován do XL-1B (dostupný od Stratagene) E.colí hostitelské buňky. Kontrolní klon, obsahující plasmidový vektor pTrcHisA samotný byl transformován také do XL-1B E.coli hostitelských buněk. Tento klon je označován jako vektorový kontrolní klon. Oba klony byly čištěny shodně jak je popsáno dále.

Exprimující kolonie byly zvoleny následujícím způsobem. Kolonie vzniklé z E.coli transformované genem, kódujícím angiostatin rostly na IPTG impregnovaných nitrocelulozových filtrech a převrstveny na LB agarové plotny. Po IPTG vyvolání exprese byly kolonie lyžovány na nitrocelulozových filtrech. Nitrocelulozové přenosy byly blokovány, promyty a sondovány se dvěma monoklonálními protilátkami (mAbs Dcd a Vap;S.G.McCance a F.J.Castellino, University of Notre Dáme), které rozpoznávají specifickou konformaci angiostatinu. Byly selektovány silně exprimující kolonie rozpoznávané mAbs.

K identifikaci optimální doby pro maximální expresi byly buňky odebrány v různých časech před a po vyvolání IPTG a vystaveny opakovaným cyklům zmrazení-tání, následovaným analýzou s SDS-PAGE, imunoblotingem a sondováním s mAbs Dcd a Vap.

Z nich byl selektován pTrcfíisA/HAsH4. Indukce s IPTG byla 4 hodiny, pak byly pelety buněk odebrány a resuspendovány v 50 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, 5% glycerolu a 200 mg/ml lysozymu a míchány 30 min při 4 °C. Kaše byla odstřeďována při 1400 ot./min po 25 min a pelety byly resuspendovány v 50 mM Tris pH 8,0, 2 mM EDTA, 5% glycerolu a 0,1 % DOC. Tato suspenze byla míchána 1 h při 4 °C a pak odstřeďována při 14000 ot./min. 25 min. Supernatantová frakce v tomto stupni obsahuje exprimovaný angiostatin. E.coli exprimovány lidský angiostatin byl zjištěn jako vykazující fyzikální vlastnost nativního angiostatinu, to jest schopnost vázat lysin. E.coli exprimovaný angiostatin byl tak čištěn přes lysin-sepharose (Pharmacia nebo Sigma) kolonu v jediném stupni. Eluce angiostatinu z kolony byla 0,2M epsilon-aminon-kapronovou kyselinou pH 7,5.

Po těchto pokusech byla provedena 101 fermentační vsádka klonu pTrcHisa/HAsA4. Buňky získané z této indukce ve velkém byly peietovány a resuspendovány v 50 mM Tris pH 7,5, rozlámány při 10000 psi, třikrát zchlazen na 10 °C v mezi pasážích. Získaný lyzát byl odstřeďován při 10000 ot/min po 30 min při 4 °C a exprimovaný angiostatin byl izolován přes lysin-sepharosu (obr. 11).

Čištěný E.coli exprimovaný lidský angiostatin byl dialyzován odsáváním proti vodě a lyofilizován. Exprimovaný lidský angiostatin byl resuspendován v mediu (DMEM, 5% BCS,

1% gentamycin/penicilin/streptomycin) k hodnocení koncentrace 3 gg/ml a použít v hovězích kapilárních endotheliálních (BCE) buněčných esejích in vitro, jak je popsáno v příkladu 8. Podobně kontrolní klon, obsahující vektor samotný byl zpracováván stejným způsobem jako klon pTrcHisA/HASH4. Byl indukován shodně s IPTG, a bakteriální lyzát byl použit k vázání lysinu, eluován s 0,2M aminokapronovou kyselinou, dialyzován odsáváním a lyofilizován. Tento kontrolní přípravek byl resuspendován v mediu také při hodnocené koncentraci 3 gg/ml. Vzorky rekombinantního angiostatinu a kontroly byly získány z různých indukčních a fermentačních vsádek jakož i separátních čištění a byly kódovány v EntreMed, Maryland. BCE eseje byly provedeny s těmito kódovanými vzorky ve slepém způsobu v Children's Hospital, Boston.

Výsledky BCE eseji rekombinantního lidského angiostatinu ukazují, že lidský angiostatin exprimovaný v E.coli inhibuje proliferaci BCE buněk díky bFGF (použitý v 1 ng/ml)(obr. 12). Zásobní rekombinantní angiostatin v mediu (asi 3 gg/ral) byl použit v ředění 1:5, 1:10 a 1:20. Procenta inhibice byla vypočtena následovně:

počet buněk s angiostatinem - počet buněk v den 0 1- _ počet buněk s bFGF samotným - počet buněk v den 0

Procenta inhibice BCE buněčné proliferace byla srovnatelná nebo vyšší než z plasminogenu získaného angiostatinu v jiných koncentracích. Výsledky z opakovaných provedení BCE eseje jsou znázorněny na obr. 13, kde pří ředění 1:5 zásobního roztoku poskytuje rekombinantní angiostatin podobná procenta inhibice jako se získají s angiostatinem získaným z plasminogenu. Obr. 13 představuje překvapující výsledek, že lidská rekombinantní angiostatin protein inhibuje více než ze 60 % a i nad 75 % BCE proliferace v kultuře.

Příklad 20

Angiostatin udržuje latentost mikrometasáz při zvýšení rychlosti apoptozy

Následující subkutánní inokulace C57 BL6/J myši s buňkami Lewisova plicního karcinomu (1 x 106), se vyvinuly primární tumory přibližně velikosti 1,5 cm3. Zvířata byla podrobeny buď chirurgickému odstranění primárního tumoru nebo simulovanému chirurgickému zákroku. 5., 10. a 15.den po chirurgickém zákroku byly myši usmrceny a jejich plíce připraveny pro histologické hodnoceni. Zvířata s odejmutými tumory 'vykazují masivní proliferaci mikrometastáz ve srovnání se kontrolami se simulovanou operací (obr. 14). Tyto změny byly spojeny s významným zvýšením hmotnosti plic. Analýza proliferace tumorových buněk, měřeno pdle příjmu bromdeoxyuridinu (BrdU) nevykazuje žádné rozdíly mezi zvířaty s netknutými primárními tumory nebo odňatými tumora 5., 9. a

13. den, což znamená, že zvýšení hmoty tumoru by nemohlo být vysvětleno zvýšenou proliferaci (obr. 15). V souladu s tím byla u těchto zvířat hodnocena buněčná smrt. Apoptosa, proces buněčné smrti je závislá na změnách v genové expresi a podíl na eliminaci buněk během vývoje a v rychle proliferujících tkáních jako je tenké střevo, byl hodnocen imunohistochemicky značenou fragmentovanou DNA technikou terminální deoxynukleotidyl transferasy (TdT). Apoptický index byl stanoven v každém čase usmrcení. Odstranění primárních tumorů působí statisticky významné zvýšení (přibližně 3 až 4krát) indexu apoptozy ve všech hodnocených časech (obr. 15).

Toto je podpořeno ošetřením myši s odstraněnými primárními tumory exogenním supresorem angiogenese. Tato substance, TNP-1470 (O-chloracetylkarbamoyl fumagillol, dříve nazývaný AGM-1470) je analogem fumagillinu s uváděnou antiangiogenní aktivitou. Subkutánní injekce TNP-1470 (30 mg/kg každé dva dny) poskytuje výsledky, které byly velmi podobné výsledkům popsaným výše pro zvířata, která měla netknuté primární tumory. Tato zvířata vykazují menší hmotnost plic, ekvivalentní proliferační index a zvýšený apoptický index ve srovnání se salinickými ijektovanými kontrolami (obr.16).

Tyto hodnoty indikují, že raetasázy zůstávají latentní, je-li proliferace tumorových buněk v rovnováze s ekvivalentní rychlostí buněčné smrti. Odstranění primárního tumoru působí rychlé zvýšení růstu metastáz, pravděpodobně díky odstranění inhibitorů angiogenese (angiostatin), které kontrolují metastatický růst zvýšením apoptozy v tumorových buňkách.

Tyto účinky jsou podobné těm, které je možno pozorovat po odstranění primárních tumorů a podání exogenního inhibitoru angiogenese. Souhrnně, tyto údaje naznačují, že primární tumor uvolňuje angiostatin, který udržuje latentnost mikrometasáz.

Příklad 21

Ošetření primárních tumorů s angiostatinem in vivo

Angiostatin byl čištěn z lidského plasminogenu limitovaným elastasovým štěpením jak je popsáno v příkladu 15 výše. Angiostatin byl resuspendován ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku pro podání šest týdnů starým samcům myší -C57B16/J. Zvířata byla implantována subkutánně 1 x 106 tumorovými buňkami buď Lewisova plicního karcinmu nebo T241 fibrosarkomu. Ošetření angiostatinem započalo po čtyřech dnech, kdy velikost tumorů je 80-160 mm3. Myši dostaly angiostatinové injekce buď v jediné injekci 40 mg/kg nebo dvou 80 mg/kg injekcích íntraperitoneálně (ip) nebo subkutánně (sc). Zvířata byla usmrcena v různých časech po ošetření v rozmezí 19 dnů.

Angiostatin podávaný v denní dávce 40 mg/kg ip, produkuje vysoce významnou inhibici růstu T241 primárních tumorů (obr. 17). Tento inhibiční vliv na růst byl viditelně zřejmý během 2 dnů a zvýšený řádově během časového průběhu studie. 18.den měly myši ošetřené angiostatinem tumory, které činily přibližně 38 % objemu u salinickým roztokem injektovaných kontrol. Tyto rozdíly byly statisticky významné (p < 0,001, Studentův t-test).

Angiostatinové ošetření (celková dávka 80 mg/kg/den, podáno dvakrát denně v dávce 40 mg/kg ip nebo sc) také významně redukuje růstovou rychlost LLC-LM primárních tumorů (obr. 17). Tento inhibiční účinek byl zřejmý po 4 dnech a po celou následující dobu hodnocení byl řádově zvýšen. V poslední den pokusu (19.den) vykazovaly angiostatinem ošetřené myši objem tumoru, který byl pouze 20 % objemu u salinícky injektovaných kontrol, což je významný rozdíl (p< 0,001 Studentův t-test).

V dalších sériích pokusů byl angiostatin podáván (50 mg/kg ql2h) myši s implantovanými buňkami T241 fíbrosarkomu, Lewisova plicního karcinomu (LM) nebo sarkomu retikulárních buněk. Pro každý typ tumorových buněk měly myši, které dostaly angiostatin podstatně redukovanou velikost tumoru. Obr. 19 demonstruje, že pro T241 fibrosarkom angiostatinem ošetřené myši měly objemy tumorů, které činily pouze 15 % objemu u neošetřené myši 24.den. Obr. 20 demonstruje, že pro Lewisův plicní karcinom (LM) angiostatinem ošetřené myši měly průměrné objemy tumorů, které činily pouze 13 % objemu u neošetřené myši 24.den. Obr. 21 demonstruje, že pro sarkom retikula měly angiostatinem ošetřené myši objemy tumorů, které byly pouze 19 % objemů u neošetřených myší ve 24.den. Data představují průměr ze 4 myší v daném časovém bodě.

Tyto výsledky demonstrují, že angiostatin je extrémně potentním inhibitorem růstu tří různých primárních tumorů in vivo.

Příklad 22

Ošetření in vivo angiostatinem myší s primárními tumory získanými z lidských buněk

Byl studován vliv angiostatinu na dvě lidské tumorové buněčné linie, karcinom lidské prostaty PC-3 a lidský karcinom prsu MDA-MB. Imunodeficientním myším SCID byly implantovány lidské tumorové buňky a myši byly ošetřeny 50 mg/kg angiostatinu každých 12 hodin v podstatě jak je popsáno v příkladu 21. Výsledky demonstrují, že angiostatin protein podle předloženého vynálezu je potentní inhibitor růstu lidských nádorových buněk. Obr. 22 ukazuje, že u lidského karcinomu prostaty PC-3 angiostatinem ošetřené myši měly pouze 2 % průměrného objemu tumoru ve srovnání s neošetřenou kontrolou myší 24.den. Obrázek 23 ukazuje, že u karcinomu MDA-MB lidského prsu měly angíostatinem ošetřené myši pouze 8 % průměrného objemu tumoru ve srovnání s neošetřenou ;

kontrolou myší 24.den.

Příklad 23

Genová terapie - Vliv transfekce angiostatin genu na objem tumoru

DNA sekvence o 1380 párech bází pro angiostatin získaný i z myší plasminogenové cDNA (získaná z American Type Culture Collection (ATCC)), kódující myší plasminogenové aminokyseliny 1-460, byla generována za použití PCR a inzertována do expresního vektoru. Expresní vektor byl transfektován do T241 fibrosarkomových buněk a transfektované buňky byly implantovány do myší. Kontrolní myši dostaly buď netransfektované T241 buňky nebo T241 buňky transfektované pouze vektorem (tj. angiostatin neexprímujícírai buňkami). Tři klony buněk enprimujicích angiostatin byly použity v tomto pokuse. V průběhu času byl stanoven průměrný objem tumoru. Výsledky vykazují překvapivou a výraznou redukci průměrného objemu tumoru u myší s buněčnými klony, exprimujícími angiostatin ve srovnání s netransfektovánými a neexpriraujícími kontrolními buňkami.

Myší DNA skvence, kódující myší A protein je získána z myší plasminogenové cDNA. Myší angiostatin zahrnuje myší plasminogen kringle regiony 1-4. Schematická konstrukce tohoto klonu je uvedena na obr. 24.

Myší angiostatin proteinové klony byly transfektovány do T241 fibrosarkomových buněk za použití LIPOFECTIN™ transfekčního systému (dostupný od Life Technologies, Gaithersburg, MD) . LIPOFECTIN™ činidlo je 1:1 (hmotn./hmotn.) liposomový přípravek kationtového lipidu N[1- (2,3-dioleyloxy)propyl]-Ν,Ν,N-trimethylamoniumchlorid (DOTMA) a diolekoyl fosfatidylethanolaminu (DOPE) v membránové filtrované vodě.

Postup přechodné transfekce buněk je následující:

1. T241 buňky rostou v 60 cm² miskách pro tkáňovou kulturu s výsevem « 1-2 χ 10⁵ buněk ve 2 ml vhodného'růstového media doplněného šerem.

2. Buňky se inkubují při 37 °C v CO2 inkubátoru až jsou buňky ze 40-70 % konfluentní, což je obvykle za 18-24 hodin, ale doba se mění podle různých buněčných typů. T241 tumorové buňky byly konfluentní z přibližně 70 %.

3. Připraví se následující roztok ve 12 x 75 mm sterilních zkumavkách:

Roztok A: pro každou transfekci se zředí 5 /tg DNA ve 100 jíl sera prostého OPTI-MEM I Reduced Sérum Medium (dostupné od Life Technologies) (může být také použita deionizovaná voda čistoty pro tkáňovou kulturu).

Roztok B: pro každou transfekci se zředí 30 /tg LIPOFECTINu ve 100 /tl OPTI-MEM media.

4. Spojí se dva roztoky, opatrně promíchají a inkubují se při teplotě místnosti 10-15 min.

5. Buňky se promyjí sera prostým mediem.

6. Pro každou transfekci se přidá 0,8 ml sera prostého media do každé zkumavky, obsahující komplex LIPOFECTIN. činidlo-DNA. Opatrně se promíchá a komplex se převrství na buňky.

7. Buňky se inkubují přibližně při 37 °C v CO2 inkubátoru.

8. DNA obsahující medium se nahradí selekčním mediem, obsahujícím 1 mg/ml sera a buňky se inkubují při 37 °C v CO2 inkubátoru po celkem 48 až 72 h.

9. Buněčné extrakty se hodnotí na genovou aktivitu 48 až 72 hodin po transfekci.

Transfektované buňky byly hodnoceny na expresi angiostatin proteinu za použití angiostatin-specifických protilátek. Alternativně, po asi 10-14 dnech se objevují G418 rezistentní kolonie v CMV-angiostatin transfektovaných T241 buňkách. Také bylo viditelných mnoho klonů v buňkách transfektovaných samotným vektorem ale ne v netransfektovaných klonech. G418 rezistentní buňky byly selektovány na svoji expresi angiostatinu za použití imunofluorescenční metody.

Je zajímavé, že in vitro buněčný růst T241 buněk a Lewisových plicních buněk transfektovaných angiostatinem nebyl inhibován nebo jinak něžádoucím způsobem ovlivněn jak je uvedeno na obr. 25 a 26.

Obr. 27 představuje výsledky transfekčního pokusů. Všechny tři angiostatin-expr linující T241 trans fektované klony produkují průměrné objemy tumorů u myší, které byly podstatně menší vzhledem k tumorovému objemu u kontrolních myší.

Průměrný tumorový objem u myší implantovaných s klonem 37 byl pouze 13 % kontroly zatímco objemy tumoru klonu 31 a klonu 25 byly pouze 21 % a 34 % objemu kontrolních tumorů. Tyto výsledky demonstrují, že DNA sekvence, kódující angiostatin mohou být trans fektovány do buněk, že transfektované DNA sekvence jsou schopné exprimovat angiostatin protein implantovanými buňkami a že expriraovaný angiostatin působí in vivo redukci tumorového růstu.

Příklad 24

Lokalizace in vivo místa exprese angiostatinu

K lokalizaci in vivo místa exprese angiostatin proteinu, celková RNA z různých buněčných typů, buňky Lewisova plicního karcinomu (myši), buňky T241 fibrosarkomu (myši) a buňky Burkittova lymfomu, jak z čerstvého tumoru nebo buněčné kultury po několika pasážích, byly analyzovány pro stanovení přítomnosti angiostatinových transkriptů. Northern analýza vzorků ukazuje nepřítomnost jakéhokoliv signálu, hybridizujicího s thn sekvencí ze všech vzorků s výjimkou normální myší jaterní RNA, vykazující jediný signál při přibližně 2,4 kb, odpovídající myšímu plasminogenu. Northern analýza lidských vzorků vykazuje nepřítomnost jakékoliv signální hybridizace s lidskou angiostatinovou sekvencí ze všech vzorků s výjimkou vzorků normální lidské jaterní RNA, vykazující jediný signál při přibližně 2,4 kb, odpovídající lidskému plasminogenu.

Analýza reverzní transkripční polymerasové řetězové reakce (RT-PCR) ukazuje nepřítomnost jakéhokoliv produktu ze všech vzorků sondovaných se sekvencemi myších angiostatinu s výjimkou normálních myších jater. RT-PCR analýza vykazuje nepřítomnost jakéhokoliv produktu ze všech lidských vzorků sondovaných s lidskými angiostatinovými sekvencemi s výjimkou normálních lidský jater (s výjimkou velikosti 1050 bp pro myší a 1134 bp pro lidský).

Jeví se tak, že myší angiostatin transkripty (za předpokladu shody s aminokyselinami 97 až 450 myšího plasminogenu), nejsou produkovány všemi výše uvedenými myšími vzorky a lidskými angiostatin transkripty (za předpokladu identity a aminokyselinami 93 až 470 lidského plasminogenu), nejsou produkovány výše uvedenými lidskými vzorky. Pozitivní signály získané v normálních myších/lidských játrech jsou z hybridizace s plaminogenem.

Příklad 25

Exprese angiostatinu ve kvasinkách

Genový fragment, kódující aminokyseliny 93 až 470 lidského plasminogenu byl klonován do Xhol/EcoRI místa pHILSI (Invitrogen), což umožnilo sekretovat expresi proteinů za použití PHO1 sekrečního signálu ve kvasince Pichia pastoris. Podobně genový fragment, kódující aminokyseliny 93 až 470 lidskéhoplasminogenu byl klonován do SnaBI/EcoRI místa pPIC9(Invitrogen), což umožnilo sekreční expresi proteinů za použití alfa-faktor sekrečního signálu ve kvasince Pichia pastoris. Exprimované lidské angiostatin proteiny v těchto systémech budou mít mnoho předností oproti těm, které jsou exprimovány v E.coli jako je zpracování proteinu, skládání proteinů a posttranslační modifikace včetně glykosylace.

Exprese genu v P.pastoris: je popsána v práci Sreekrishna K. a spol.(1988) High level expression of heterologous proteins in myelotropic yeast Pichia pastoris.

J.Basic.Microbiol. 29(4): 265-278 a Clarre J.J. a spol. (1991) Production of epidermal growth factor in yeast: Highlevel secretion using Pichia pastoris strains containing multiple gene copies, Gene 105:205-212. Tyto práce jsou zde zahrnuty jako odkazy.

Příklad 26

Exprese angiostatin proteinů ve transgenních zvířatech a rostlinách

Vytvoří se transgenní zvířata druhu hovězího dobytka nebo prasat, která exprimují angiostatin genový transkript. Transgenní zvířata exprimují angiostatin protein například v mléku těchto zvířat. Dále jsou konstruovány poživatelné rostliny, které exprimují angiostatin genový transkript.

Konstrukce transgenních zvířat, která exprimují cizí DNA je popsána v práci Smithe H. Phytochrome transgenic: functional, ecological and biotechnical applications:

Semin.Cell.Biol. 1994 5(5):315-325, práce je zde zahrnuta jako odkaz.

Výše uvedený popis se týká výhodných provedení a tak je také třeba jej chápat a rovněž je třeba si uvědomit, že je možno provést mnoho modifikací nebo změn, aniž by byla překročena myšlenka a rozsah vynálezu, který je dán připojenými nároky.

8<3

Seznam sekvencí (1) Obecná informace:

(i) PřihlaSovatel: THE CHILDREN'S MEDICAL CENTER

CORPORATION (ii) Název vynálezu: Angiostatin a způsob jeho použití (iii) Počet sekvencí: 6 (iv) Korespondenční adresa:

(A) Adresa: Jones & Askew (B) Ulice: .191 Peachstreet, 37 .poschodí (C) Město: Atlanta (D) Stát: Georgia (E) Země: U.S.

(F) ZIP: 30303-1769 (v) Počítačově čtecí forma:

(A) Typ media: Floppy disk (B) Počítač: IBM PC kompatibilní (C) Operační systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln Release #1.0, Version #1,30 (vi) Současné údaje o přihláSce:

(A) PřihláSka číslo: US (B) Datum podání:

(C) Klasifikace:

(vii) Prioritní data:

(A) číslo přihlášky: US 08/248629 (B) Datum podání: 26.duben 1994 (vii) Prioritní data:

(A) Číslo přihlášky: US 08/326785 (B) Datum podání: 20.říjen 1994 (viii) Informace o zástupci/agentovi:

(A) jméno: Johnson James D.

(B) číslo registrace: 31771 (C) Referenční/spisová značka: 05213-0122 (ix) Telekomunikační informace:

(A) telefon: 404-818-3700 (B) telefax: 404-818-3799 (2) Informace o sekvenci SEQ ID NO:1:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 812 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Zdroj původu:

(A) organismus: myš (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO: 1:

Met Asp His 1

Lys

Glu 5

Val

Ile

Leu

Leu Phe Leu Leu Leu Leu Lys Pro

10

15

Gly

Gin

Gly

Asp

Ser

Leu

Asp

Gly

Tyr

Ile

Ser

Thr

Gin

Gly

Ala

Ser

20

25

30

Leu

Phe

Ser

Leu

Thr

Lys

Lys

Gin

Leu

Ala

Ala

Gly

Gly

Val

Ser

Asp

35

40

45

Cys

Leu

Ala

Lys

cys

Glu

Gly

Glu

Thr

Asp

Phe

Val

Cys

Arg

Ser

Phe

50

55

50

Gin

Tyr

His

Ser

Lys

Glu

Gin

Gin

cys

Val

Ile

Met

Ala

Glu

Asn

Ser

55

70

75

80

Lys

Thr

Ser

Ser

Ile

Ile

Arg

Met

Arg

Asp

Val

Ile

Leu

Phe

Glu

Lys

85

90

. ? 7 /

95

Arg

Val

Tyr

Leu

Ser

Glu

Cys

Lys

Thr

Gly

( Ile

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg

100

105

110

Gly

Thr

Met

Ser

Arg

Thr

Lys

Ser

Gly

Val

Ala

cys

Gin

Lys

Trp

Gly

115

120

125

Ala

Thr

Phe

Pro

His

Val

Pro

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Thr

His

Pro

Asn

130

135

140

Glu

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Gin

145

150

155

160

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

155

170

175

Asn

Ile

Pro Glu 180

Cys

Glu Glu Glu

Cys Met Tyr Cys Ser 185

Gly Glu Lys 190

Tyr

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin

Ala

195

200

205

ΓΠν-. χι,ρ

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe

210

215

220

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tyr

Cys

His

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

225

230

235

240

Pro

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys

Arg

Trp

Glu

Tyr

245

250

255

Cys

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr

260

265

270

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

275

280

285

Val

Thr

Val

Ser

Gly

Lys

Thr

cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

290

295

300

His

Arg

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

cys

Lys

Asn

Leu

Glu

305

310

315

320

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

cys

Tyr

325

330

335

Thr

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Glu

Ile

Pro

Ser

cys

340

345

350

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp

Ser

Ser

Val

Pro

Pro

Glu

355

360

365

Glu

Gin

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly

Gin

Ser

370

375

380

Tyr

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly

Lys

Lys

Cys

Gin

Ser

385

390

395

400

Trp

Ala

Ala

Met

Phe

Pro

His

Arg

His

Ser

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

405

410

41S

Pro

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

420

425

430

Lys

Gly

Pro

Trp

cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Ser

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

435

440

445

Cys

Asn

Leu

Lys

Arg

Cys

Ser

Glu

Thr

Gly

Gly

Ser

Val

Val

Glu

Leu

450

455

460

Pro 465	Thr	Val	Ser	Gin	Glu 470	Pro	Ser
Cys	Met:	Tyr	Gly	Asn 485	Gly	Lys	Asp
Ala	Ala	Gly	Thr 500	Pro	Cys	Gin	Gly

Gly	Pro	Ser 475	Asp	Ser	Glu	Thr	Asp 480
Tyr	Arg 490	Gly	Lys	Thr	Ala	Val 495	Thr
Trp 505	Ala	Ala	Gin	Glu	Pro 510	His	Arg

His

Ser.Ile Phe 515

Thr Pro. Gin

Thr 520

Asn

Pro Arg

Ala

Asp 525

Leu

Glu

Lys

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Asp

,Val

Asn

Gly

Pro

Trp

Cys

Tyr

•

530

535

540

Thr

Thr

Asn

Pro

Arg

Lys

Leu

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

Ile

Pro

Leu

Cys

545

550

555

560

Ala

Ser

Ala

Ser

Ser

Phe

Glu

Cys

Gly

Lys

Pro

Gin

Val

Glu

Pro

Lys

565

570

575

Lys

Cys

Pro

Gly

Arg

Val

Val

Gly

Gly

Cys

Val

Ala

Asn

Pro

His

Ser

580

585

590

Trp

Pro

Trp

Gin

Ile

Ser

Leu

Arg

Thr

Arg

Phe

Thr

Gly

Gin

His

Phe

595

600

605

Cys

Gly

Gly

Thr

Leu

Ile

Ala

Pro

Glu

Trp

Val

Leu

Thr

Ala

Ala

His

610

615

620

Cys

Leu

Glu

Lys

Ser

Ser

Arg

Pro

Glu

Phe

Tyr

Lys

Val

Ile

Leu

Gly

625

630

635

640

Ala

His

Glu

Glu

Tyr

Ile

Arg

Gly

Leu

Asp

Val

Gin

Glu

Ile

Ser

Val

645

650

655

Ala

Lys

Leu

Ile

Leu

Glu

Pro γ

A,«-n

Asn

Arg

Asp

Ile

Ala

Leu

Leu

Lys

660

665

670

Leu

Ser

Arg

Pro

Ala

Thr

Hel

Thr

Asp

Lys

Val

Ile

Pro

Ala

cys

Leu

675

f |

680

635

Pro

Ser

Pro

Asn

Tyr

Met

Val

Ala

Asp

Arg

Thr

Ile

cys

Tyr

Ile

Thr

690

695 >

700

Gly

Trp

Gly

Glu

Thr

Gin

Gly

Thr

Phe

Gly

Ala

Gly

Arg

Leu

Lys

Glu

•

705

710

715

720

Ala

Gin

Leu

Pro

Val

Ile

Glu

Asn

Lys

Val

Cys

Asn

Arg

Val

Glu

Tyr

725 730 735

Leu Asn Asn Arg Val Lys Ser Thr Glu Leu Cys Ala Gly Gin Leu Ala 740 745 750

Gly

Gly

Val

Asp

Ser

Cys

Gin

Gly

Asp

Ser

Gly

Gly

Pro

Leu

Val

Cys

755

760

765

Phe

Glu

Lys

Asp

Lys

Tyr

Ile

Leu

Gin

Gly

Val

Thr

Ser

Trp

Gly

Leu

770

775

780

Gly

Cys

Ala

Arg

Pro

Asn

Lys

Pro

Gly

Val

Tyr

Val

Arg

Val

Ser

Arg

785

790

795

800

Phe

Val

Asp

Trp

Ile

Glu

Arg

Glu

Met

Arg

Asn

Asn

805 810 (2) Informace o SEQ ID NO:2:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 339 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Zdroj původu:

(A) organismus: myš (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:2:

Val

Tyr

Leu

Ser

Glu

Cys

Lys

Thr

Gly

Ile

Gly

Asn

Gly

Tyr

Arg

Gly

1

5

10

15

Thr

Met

Ser

Arg

Thr

Lys

Ser

Gly

Val

Ala

Cys

Gin

Lys

Trp

Gly

Ala

20

25

30

l

Thr

Phe

Pro

His

Val

Pro

Asn

Tyr

Ser

Pro

Ser

Thr

His

Pro

Asn

Glu

1 í

35

40

45

1

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Gin

Gly

>

50

55

60

Pro

Trp

cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asn

65

70

75

80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Glu

Glu

Cys

Met

Tyr

Cys

Ser

Gly

Glu

Lys

Tyr

85

90

95

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Asp

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ala

Lys

Phe

Pro

115

120

125

PCT/US95/05107

Ser

Lys 130

Asn

Leu

Lys

Met

Asn 135

Tyr

Cys

His

Asn

Pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg 145

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr 150

Thr

Asp

Pro

Thr

Lys 155

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys 165

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro 170

Pro

Pro

Ser

Pro

Thr 175

Tyr

Gin

Cys

Leu

Lys 180

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn 185

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val 190

Ser

Val

Thr

Val

Ser 195

Gly

Lys

Thr

Cys

Gin 200

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin 205

Thr

Pro

His

Arg

His 210

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu 215

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys 220

Asn

Leu

Glu

Glu

Asn 225

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro 230

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala 235

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr 240

Thr

Asp

Ser

Gin

Leu 245

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys 250

Glu

Ile

Pro

Ser

Cys 255

Glu

Ser

Ser

Ala

Ser 260

Pro

Asp

Gin

Ser

Asp 265

Ser

Ser

Val

Pro

Pro 270

Glu

Glu

Gin

Thr

Pro 275

Val

Val

Gin

Glu

Cys 280

Tyr

Gin

Ser

Asp

Gly 285

Gin

Ser

Tyr

Arg

Gly 290

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr 295

Ile

Thr

Gly

Lys

Lys 300

Cys

Gin

Ser

Trp

Ala 305

Ala

Met

Phe

Pro

His 310

Arg

His

Ser

Lys

Thr 315

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro 320

Asp

Ala

Gly

Leu

Glu

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp Gly

Asp

Lys

325 330 335

Gly Pro Trp (2) INFORMATION FOR SEQ ID NO:3:

(i) SEQUENCE CHARACTERISTICS:

(A) LENGTH: 339 amino acids (B) TYPE: amino acid (C) STRANDEDNESS:

(D) TOPOLOGY: linear (ii) MOLECULE TYPE: protein (iii) HYPOTHETICAL: NO (VÍ) ORIGINÁL SOURCE:

(A) ORGANISM: Homo sapiens (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:^:

Val

. Tyr

• Lev

i Ser

• Glu

i Cys

Lys

: Thr

Gly

Asn Gly

Lys

t Asn

. Tyr

Arg

Gly

1

5

10

15

Thr

• Met

Ser

Lys

Thr

Lys

Asn

Gly

Ile

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Ser

2*0

25

30

Thr

Ser

Pro

His

Arg

Pro

Arg

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

Glu

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Pro

Gin

Gly

50

55

60

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Glu

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

65

70

75

80

Ile

Leu

Glu

Cys

Glu

<xl u

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90

95

Asp

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Glu

Cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Lys

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Arg

Glu

Leu

130

135

140

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

Cys

145

150

155

160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

Gin

Cvs

Leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asn

Val

Ala

Val

180

185

190

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

His

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

Thr

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

210

215

220

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Lys

Arg

Ala

Pro

Trp

Cys

His

Thr

225

230

235

240

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

Asp

245

250

2*55

Ser

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Gin

Leu

Ala

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

Glu

260

265

27 0

Leu

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Asp

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

275 280 285

Arg Gly

Thr

Ser Ser Thr

Thr Thr Thr Gly Lys Lys

Cys Gin Ser

Trp

290

295

300

Ser

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Gin

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr

Pro

305

310

315

320

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Mat

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp

Lys

325

330

335

Gly Pro Trp (2) Informace o SEQ ID NO:4:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 339 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetézec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Zdr o j původu:

(A) organismus: opice Rhesus (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:4:

Val Tyr 1

Leu Ser

Ser Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg Gly

10

15

Thr

Met

X Lys 20 l 1

Thr

Arg

Thr

Gly

Ile 25

Thr

Cys

Gin

Lys

Trp 30

Ser

Ser

Thr

Ser

Pro

Hi4

Arg

Pro

Thr

Phe

Ser

Pro

Ala

Thr

His

Pro

Ser

Glu

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Glů

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Gly

Gin

Gly

50

55

60

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Glu

Glu

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp

65

70

75

80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Asp

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90

95

Asp

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Leu

Glu

cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

Asp

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Ile

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

Asn Lys 130

Asn

Leu Lys

Lys

Asn Tyr 135

Cys

Arg Asn

Pro 140

Asp

Gly

Glu

Pro

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Leu

Cys

145

ISO

155

160

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Pro

Thr

Tyr

165

170

175

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Asp

Val

Ala

Val

180

185

190

Thr

Val

Ser

Gly

His

Thr

cys

His

Gly

Trp

Ser

Ala

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

Thr

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Pne

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Asp

Glu

210

215

220

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

Thr

Asn

Ser

Gin

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

Glu

245

250

255

Ser

Ser

Pro

Val

Ser

Thr

Glu

Pro

Leu

Asp

Pro

Thr

Ala

Pro

Pro

Glu

260

265

270

Leu

Thr

Pro

Val

Val

Gin

Glu

Cys

Tyr

His

Gly

Asp

Gly

Gin

Ser

Tyr

275

280

285

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Thr

Thr

Gly

Lys

Lys

cys

Gin

Ser

Trp

290

295

300

Ser

Ser

Met

Thr

Pro

His

Trp

His

Glu

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

305

310

315

320

,?x

Asn Ala Gly Leu Thr Met Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp'í	<la Asp Lys
325	330	. 335

Gly Pro Trp (2) Informace o SEQ ID NO:5:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Délka: 339 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) Řetězec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Zdroj původu:

(A) organismus: prase (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:5:

Ile 1

Ty x*

Leu Ser

Glu Cys 5

Lys

Thr

Gly Asn Gly Lys Asn Tyr Arg

Gly

10

15

Thr

Thr

Ser

Lys

Thr

Lys

Ser

Gly

Val

Ile

Cys

Gin

Lys

Trp

Ser

Val

20

25

30

Ser

Ser

Pro

His

Ile

Pro

Lys

Tyr

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe

Pro

Leu

Ala

35

40

45

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Lys

Gly

50

55

60

-

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Glu

Thr

Arg

Phe

Asp

Tyr

Cys

Asp

65

70

75

80*

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Asp

Glu

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

His

Tyr

85

90

95

Glu

Gly

Lys

Ile

Ser

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Ile

Glu

Cys

Gin

Ser

Trp

100

105

110

Gly

Ser

Gin

Ser

Pro

His

Ala

His

Gly

Tyr

Leu

Pro

Ser

Lys

Phe

Pro

115

120

125

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

Asn

Tya:

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

Arg

Pro

Trp

cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Asn

Lys

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys

145

150

155

160

. ? Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Thr

Ser

Gly

Pro

Thr

Tyr

l (

165

170

175

'•Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Arg

Gly

Glu

Asn

Tyr

Arg

Gly

Thr

Val

Ser

Val

;i8o

185

190

Thr

Ala

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Ala

Gin

Ser

Pro

His

>

195

200

205

Lys

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

210

215

220

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Thr

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

Thr

Asp

Ser,

Glu

Val

Arg

Trp

Asp

Tyr

Cys

Lys

Ile

Pro

Ser

Cys

Gly

245

250

255

Ser

Ser

Thr

Thr

Ser

Thr

Glu

His

Leu

Asp

Ala

Pro

Val

Pro

Pro

Glu.

260

265

270

Gin

Thr

Pro 275

Val

Ala

Gin Asp

cys 280

Tyr

Arg

Gly

Asn

Gly 235

Glu

Ser

Tyr

Arg

Gly 290

Thr

Ser

Ser

Thr Thr 295

Ile

Thr

Gly

Arg

Lys 300

Cys

Gin

Ser

Trp

Val 30’5

Ser

Met

Thr

Pro

His Arg 310

His

Glu

Lys

Thr 315

Pro

Gly

Asn

Phe

Pro 320

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr 325

Met Asn

Tyr

Cys

Arg 330

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp 335

Lys

Ser Pro Trp (2) Informace o SEQ ID NO:6:

(i) Charakteristiky sekvence:

(A) Dálka: 339 aminokyselin (B) Typ: aminokyselina (C) ŘetSzec:

(D) Topologie: lineární (ii) Typ molekuly: protein (iii) Hypotetická: ne (vi) Zdroj původu:

(A) organismus: hovězí (xi) Popis sekvence: SEQ ID NO:6:

Ile 1 Thr

Tyr Leu Leu Glu Cys Lys Thr Gly Asn Gly^ln Thr Tyr Arg Gly

Thr Ala

Glu 20

5

Val 25

10 Thr

-f Cys

Gin

15

Thr

Lys

Ser

Gly

Lys

Trp 30

Ser

Ala

Thr

Ser

Pro

His

Val

Pro

Lys

Phe

Ser

Pro

Glu

Lys

Phe

Pro

Leu

Ala

35

40

>

45

Gly

Leu

Glu

Glu

Asn

Tyr

cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Asn

Asp

Glu

Asn

Gly

50

55

60

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

Thr

Asp

Pro

Asp

Lys

Arg

Tyr

Asp

Tyr

Cys

Asp

65

70

75

80

Ile

Pro

Glu

Cys

Glu

Asp

Lys

Cys

Met

His

Cys

Ser

Gly

Glu

Asn

Tyr

85

90

95

Glu

Gly

Lys

Ile

Ala

Lys

Thr

Met

Ser

Gly

Arg

Asp

cys

Gin

Ala

Trp

100

105

110

Asp Ser Gin Ser Pro Kis Ala His Gly Tyr Ile Pro Ser Lys Phe Pro

115

120

125

Asn

Lys

Asn

Leu

Lys

Met

. Asn

. Tyr

Cys

Arg

' Asn

Pro

• Asp

Gly

Glu

Pro

130

135

140

Arg

Pro

Trp

Cys

Phe

Thr

Thr

Asp

Pro

Gin

Lys

Arg

Trp

Glu

Phe

Cys

145

150

155

150

Asp

Ile

Pro

Arg

Cys

Thr

Thr

Pro

Pro

Pro

Ser

Ser

Gly

Pro

Lys

Tyr

-

155

170

175

Gin

Cys

Leu

Lys

Gly

Thr

Gly

Lys

Asn

Tyr

Gly

Gly

Thr

Val

Ala

Val

180

185

190

Thr

Glu

Ser

Gly

His

Thr

Cys

Gin

Arg

Trp

Ser

Glu

Gin

Thr

Pro

His

195

200

205

Lys

His

Asn

Arg

Thr

Pro

Glu

Asn

Phe

Pro

Cys

Lys

Asn

Leu

Glu

Glu

210

215

220

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Gly

Glu

Lys

Ala

Pro

Trp

Cys

Tyr

Thr

225

230

235

240

Thr

Asn

Ser

Glu

Val

Arg

Trp

Glu

Tyr

Cys

Thr

Ile

Pro

Ser

cys

Glu

245

250

255

Ser

Ser

Pro

Leu

Ser

Thr

Glu

Arg

Met

Asp

Val

Pro

Val

Pro

Pro

Glu

250

265

270

Gin

Thr

Pro

Val

Pro

Gin

Asp

cys

Tyr

His

Gly

Asn

Gly

Gin

Ser

Tyr

275

280

285

Arg

Gly

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Ile

Thr

Gly

Arg

Lys

Cys

Gin

Ser

Trp

290

295

300

Ser

Ser

Met

Thr

Pro

His

Arg

His

Leu

Lys

Thr

Pro

Glu

Asn

Tyr

Pro

305

310

315

320

Asn

Ala

Gly

Leu

Thr

Met

Asn

Tyr

Cys

Arg

Asn

Pro

Asp

Ala

Asp

Lys

325

330

335

Ser Pro Trp

náhradní list

Claims (1)

1. PATENTOVÉ

   N A mající proliferaci '

   1. Izolovaný angiostatin, kde angiostatin' je aktivitu, inhibující endotheliální buněčnou mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamidovou gelovou elektroforézou.

   2. Angiostatin aminokyselinovou plasminogenového podle nároku 1, angiostatin dále má v podstatě podobnou sekvenci myšího fragmentu, začínajícího přibližně u aminokyseliny číslo 98 molekuly myšího plasminogenu.

   3. Angiostatin podle nároku 2, kde aminokyselinová sekvence je plasminogenový fragment získaný z lidského plasminogenu, myšího plasminogenu, hovězího plasminogenu, Rhesus plasminogenu nebo prasečího plasminogenu.

   4. Angiostatin podle nároku 2, kde vybrána ze skupiny, zahrnující SEQ NO:4, SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6.

   aminokyselinová sekvence je ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID

   5. Angiostatin podle inhibice angiogenese. nároku 1, kde angiostatin je schopen 6. Angiostatin podle inhibice s angiogenezí nároku 1, kde angiostatin spojených chorob. je schopen 7 .Angiostatin podle nároku 6, kde chorobou spojenou s

   angiogenezí je rakovina.

   8. Izolovaný angiostatin, kde angiostatin je protein, mající aktivitu inhibující proliferaci endotheliálních buněk a mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony podle stanovení polyakrylamid gelovou elektroforézou, protein je schopný vázat lysin a protein je schopný inhibice angiogenese.

   \

   9. Způsob diagnózy choroby nebo stanovení prognózy choroby zprostředkované s angiogenezí,prováděné in vitro, v y z n a č u jící se tím, že zahrnuje stupeň stanovení koncentrace angiostatinu, kde angiostatin je protein, mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony podle stanovení polyakrylamid gelovou elektroforézou.

   1G. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že angiostatin dále má aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou sekvenci myšího plasminogenového fragmentu, začínající u aminokyseliny číslo 98 molekuly myšího plasminogenu.

   11. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že chorobou je rakovina.

   12. Izolovaný angiostatin, kde angiostatin je protein, mající aktivitu, inhibující endotheliální buněčnou proliferaci a mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamid gelovou elektroforézou pro použití jako léčivo.

   13. Angiostatin pro použití jako léčivo podle nároku 12, kde angiostatin dále má aminokyselinovou v podstatě podobnou sekvenci myšího plasminogenového fragmentu, začínajícího přibližně u aminokyseliny číslo 98 molekuly myšího plasminogenu.

   14. Angiostatin pro použití jako léčivo podle nároku 13, kde aminokyselinová sekvence, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny, zahrnující SEQ ID N0:2, SEQ ID N0:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6.

   15. Použití angiostatinu, kde angiostatin je protein, mající aktivitu, inhibující endotheliální buněčnou proliferaci a mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamid gelovou elektroforézou pro výrobu léčiva pro léčení lidí nebo zvířat angiogenně zprostředkovanou chorobou.

   16. Použití angiostatinu podle nároku 15, kde angiostatin dále má aminokyselinovou v podstatě podobnou sekvenci myšího plasminogenového fragmentu, začínajícího přibližně u aminokyseliny číslo 98 molekuly myšího plasminogenu.

   17. Použití podle nároku 16, kde aminokyselinová sekvence je plasminogenový fragment získaný lidského plasminogenu, myšího plasminogenu, hovězího plasminogenu, Rhesus plasminogenu nebo prasečího plasminogenu.

   18. Použití podle nároku 16, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny, zahrnující SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6.

   19.,Použití podle nároku 15, kde angiogenní choroba je vybrána ze skupiny, zahrnující rakovinu, arthritis, makulární degeneraci a diabetickou retinopatii.

   20. Kompozice, obsahující izolovanou DNA sekvenci, která kóduje angiostatin, kde angiostatin je protein, mající aktivitu, inhibující endotheliální buněčnou proliferaci a mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamid gelovou elektroforézou.

   21. Kompozice podle nároku 20, kde angiostatin dále má aminokyselinovou v podstatě podobnou sekvenci myšího plasminogenového fragmentu, začínajícího přibližně u aminokyseliny číslo 98 molekuly myšího plasminogenu.

   22. Kompozice podle nároku 21, kde DNA sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, zahrnující SEQ ID N0:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID N0:4, SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6.

   100

   23. Kompozice podle nároku 20, obsahující dále vektor obsahující DNA- sekvenci, kódující angiostatin, kde vektor je schopen exprimovat angiostatin, je-li přítomen v buňce.

   24. Kompozice podle nároku 23, v jednobuněčném organismu schopném exprese angiostatinu.

   25. Použití DNA sekvence kódující angiostatin, kde angiostatin je protein, mající aktivitu, inhibující endotheliálni buněčnou proliferaci a mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční ' polyakrylámid gelovou elektroforézou pro přípravu léčiva na léčení s angiogenesi spojených chorob u lidí a zvířat.

   26. Způsob podle nároku 25, vyznačující se tím, že angiostatin má dále aminokyselinovou sekvenci v podstatě podobnou sekvenci fragmentu myšího plasminogenu, začínající přibližně při aminokyselině číslo 98 molekuly myšího plasminogenu.

   27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že, DNA sekvence kóduje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny, zahrnující SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5 a SEQ ID NO:6.

   28. Kompozice, obsahující farmaceuticky přijatelnou přísadu a angiostatin, kde angiostatin je protein, mající aktivitu, inhibující endotheliálni buněčnou proliferaci a mající molekulovou hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamid gelovou elektroforézou.

   29. Kompozice podle nároku 28, obsahující dále matrici s udržovaným uvolňováním.

   30. Kompozice, obsahující protilátku, která se specificky váže k angiostatinu, kde angiostatin je protein, mající molekulovou

   101 hmotnost mezi přibližně 38 kilodaltony a 45 kilodaltony jak je stanoveno redukční polyakrylamid gelovou elektroforézou.

   '/^Ί

   Obrázek 1

   Myší plasminogenová sekvence

   mec asp his pro gly gin ala ser leu val ser asp cys arg ser mec ala glu val ile leu gly ile gly gly val ala asn cyr ser cyr cys arg chr chr asp cys glu glu lys ile ser ser gin ser ser lys asn pro arg pro cyr cys asp pro chr cyr chr val ser glu gin chr cys lys asn chr ala pro cyr cys glu ser asp ser glu cys Cyr chr chr ile pro his arg

   leu glu met trp cys cyr lys val mec ala arg his glu lys crp cys ile pro gin val val ala arg phe leu chr cys chr his leu pro asp pro cys chr pro arg ile leu pro lys gly phe cys phe asn phe asn cys pro asn pro glu lys pro leu trp ile gin val pro leu crp ile ser gin chr his asn chr arg cys ser gin Cyr gly ala gly glu pro arg glu ala crp glu gly pro chr ser asn cyr leu glu asn chr val phe leu asn ile glu asp ser leu gin ser glu gly gin ser pro asp cys chr his lys cys pro cys chr his glu cys pro val ser gly ser cyr chr ser glu asn chr ile cyr chr cys pro pro gly leu cyr asp asn val ser leu ala cyr lys lys cyr lys chr asp lys mec mec ala mec phe arg leu val arg glu cyr ser pro asp lys lys cys asp glu pro gly pro phe cys chr ala lys his gin chr lys val arg asp

   S _₍ !Ν 1SVIA . QM 3Λ0'S XW-jcld , a-./yo

   ile leu leu phe leu leu leu leu lys leu asp gly cyr ile ser chr gin gly Chr lys lys gin leu ala ala gly gly lys cys glu gly glu thr asp phe val his ser lys glu gin gin cys val ile Chr ser ser ile ile arg met arg asp arg val tyr leu ser glu cys lys thr arg gly thr met ser arg thr lys ser Crp gly ala chr phe pro his val pro his pro asn glu gly leu glu glu asn asn asp glu gin gly pro crp cys tyr arg cyr asp tyr cys asn ile pro glu cyr cys ser gly glu lys tyr glu gly ser gly leu asp cys gin ala trp asp his gly tyr ile pro ala lys phe pro asn tyr cys his asn pro asp gly glu chr thr asp pro thr lys arg Crp glu cys chr thr pro pro pro pro pro ser lys gly arg gly glu asn cyr arg gly ser gly lys thr cys gin arg crp ser his asn arg chr pro glu asn phe pro asn Cyr cys arg asn pro asp gly glu Chr thr asp ser gin leu arg cr? glu cys glu ser. wwfr ala ser pro asp gin pro glu glu-?gln thr pro val val gin gly gin ser(tyr arg gly chr ser ser lys cys gin i ser crp ala ala mec phe thr pro glu t asn phe pro asp ala gly arg asn pro'asp gly asp lys gly pro pro ser val arg crp glu tyr cys asn chr gly gly’ser val val glu leu pro ser gly pro ser asp ser glu chr asp lys asp tyr arg gly lys thr ala val cys gin gly crp ala ala gin glu pro Chr pro gin thr asn pro arg ala asp arg asn pro asp gly asp val asn gly asn pro arg lys leu cyr asp cyr cys ser ala ser ser phe glu cys gly Lys Lys cys pro gly arg val val gly giy ser crp pro crp gin ile ser Leu arg his phe cys gly gly chr leu L 1 β aLa aLa aLa his cys leu glu lys ser ser val ile leu gly ala his gLu 5 * v r gLn glu ile ser val ala lys Le- o asp ile ala leu leu lys leu ser arg lys val ile pro ala cys L stí P r o ser

   * 7

   pro asn tyr met val ala asp arg thr ile cys tyr ile thr gly -trp gly glu thr. gin gly thr phe gly ala gly arg leu lys glu ala gin leu pro val ile glu asn lys val cys asn arg val glu tyr leu asn asn arg val lys ser thr glu leu cys ala gly gin leu ala gly gly val asp ser cys gin gly asp ser gly gly pro leu val cys phe glu lys asp lys tyr ile leu gin gly val thr ser trp gly leu gly cys ala arg pro ash lys pro gly val tyr val arg val ser arg phe val asp trp iíe glu arg glu met arg asn asn

   .tS*

   -( i

   7

   Obrázek 2 myš člověk opice Rhesus prase hovězí dobytek

   val tyr leu ser glu cys lys thr gly ile gly asn gly tyr arg gly val tyr leu ser glu cys lys thr gly asn gly lys asn tyr arg gly val tyr leu ser glu cys lys thr gly asn gly lys asn tyr arg gly xle tyr leu ser glu cys lys thr gly asn gly lys asn tyr arg gly ile tyr leu leu glu cys lys thr gly asn gly gin thr tyr arg gly thr met ser arg thr lys ser gly val ala cys gin lys trp gly ala thr met ser lys thr lys asn gly ile thr cys gin lys trp ser ser thr met ser lys thr arg thr gly ile thr cys gin lys trp ser ser thr thr ser lys thr lys ser gly val ile cys gin lys trp ser val thr thr ala glu thr lys ser gly val thr cys gin lys trp ser ala thr phe pro his val pro asn tyr .ser pro ser thr his pro asn glu thr ser pro his arg pro arg phe ser pro ala thr his pro ser glu thr ser pro his arg pro thr phe ser pro ala thr his pro ser glu ser ser pro his ile pro lys tyr ser pro glu lys phe pro leu ala thr ser pro his val pro lys phe ser pro glu lys phe pro leu ala gly leu glu glu asn tyr cys arg asn pro asp asn asp glu gin gly gly leu glu glu asn tyr cys arg, .$sSh pro asp asn asp pro gin gly gly leu glu glu asn tyr cys ar^-í 'asn pro asp asn asp gly gin gly gly leu glu glu asn tyr cys arg i asn pro asp asn asp glu lys gly gly leu glu glu asn tyr cys arg. asn pro asp asn asp glu asn gly pro trp cys tyr thr thr asp 1 pro' asp lys arg tyr asp tyr cys asn pro trp cys tyr thr thr asp pro glu lys arg tyr asp tyr cys asp pro trp cys tyr thr thr asp pro’ glu glu arg phe asp tyr cys asp pro trp cys tyr thr thr asp pro glu thr arg phe asp cyr cys asp pro trp cys tyr thr thr asp pro asp lys arg tyr asp tyr cys asp ile pro glu cys glu glu glu cys met tyr cys ser gly glu lys tyr ile leu glu cys glu glu glu cys met his cys ser gly . glu asn tyr ile pro gLu cys glu asp glu cys met his cys ser gly glu asn tyr ile pro glu cys glu asp glu cys met his cys ser gly gLu his tyr ile pro glu cys glu asp lys cys met his cys ser gly glu asn tyr glu gly lys i le ser lys thr met ser gly leu asp cys gin ala trp asp gly lys ile ser lys thr met ser gly leu gLu cys gin ala trp asp gly lys ile ser lys thr met ser gly leu glu cys gin ala trp glu gly lys ile ser lys thr met ser gly ile glu cys gin ser trp glu gly lys ile ala Lys thr met ser gly arg asp cys gin ala trp

   asp ser gin ser pro his ala his gly cyr ile pro ala lys phe pro asp ser gin ser pro his ala his gly tyr ile pro ser lys phe pro asp ser gin ser pro his ala his gly tyr ile pro ser lys phe pré gly ser gin ser pro his ala his gly tyr leu pro ser lys phe prO asp ser gin ser pro his ala his gly tyr ile pro ser lys phe pro

   ser lys asn leu lys met asn tyr cys his asn pro asp gly glu pro asn lys asn leu lys lys asn tyr cys arg asn pro asp arg glu leu asn lys asn leu lys lys asn tyr cys arg asn pro asp gly glu pro asn lys asn leu lys mec asn tyr cys arg asn pro asp gly glu pro asn lys asn leu lys met asn tyr cys arg asn pro asp gly glu pro arg pro trp cys phe thr thr asp pro thr lys arg trp glu tyr cys arg pro trp cys phe thr thr asp pro asn lys arg trp glu leu cys arg pro trp cys phe thr thr asp pro asn lys arg trp glu leu cys arg pro crp cys phe thr thr asp pro asn lys arg trp glu phe cys arg pro trp cys phe thr thr asp pro gin lys arg trp glu phe cys asp ile pro arg cys thr thr pro pro pro pro pro ser pro -thr tyr asp ile pro arg cys thr thr pro pro pro ser ser gly pro thr tyr asp ile pro arg cys thr thr pro pro pro ser ser gly pro thr tyr asp ile pro arg cys thr thr pro pro pro thr ser gly pro thr tyr asp ile pro arg cys thr thr pro pro pro ser ser gly pro lys tyr gin cys leu lys gly arg gly glu asn tyr arg gly thr val ser ^: val gin cys leu lys gly thr gly glu asn tyr arg gly asn val ala val gin cys leu lys gly thr gly glu asn tyr arg gly asp val ala val gin cys leu lys gly arg gly glu asn tyr arg gly thr val ser val gin cys leu lys gly thr gly lys asn tyr gly gly thr val ala val thr val ser gly lys thr cys gin arg trp ser glu gin thr pro his thr val ser gly his thr cys gin his trp ser ala gin thr pro his thr val ser gly his thr cys his gly trp ser ala gin thr pro his thr ala ser gly his thr cys gin arg trp ser ala gin ser pro his thr glu ser gly his thr cys gin arg trp ser glu gin thr pro his arg his asn arg thr pro glu asn phe pro cys lys asn leu glu glu thr his asn arg thr pro glu asn phe pro cys lys asn leu asp glu thr his asn arg thr pro glu asn phe pro cys lys asn leu asp glu lys his asn arg thr pro glu asn phe pro cys lys asn leu glu glu lys his asn arg thr pro glu asn phe pro cys lys asn leu glu glu asn tyr cys arg asn pro asp gly glu thr ala pro trp cys tyr thr asn tyr cys arg asn pro asp giy lys arg ala pro trp cys his thr asn tyr cys arg asn pro asp gly glu lys ala pro trp cys tyr *· V* ·· •asn tyr cys arg asn pro asp gly glu thr ala pro trp cys tyr chr asn tyr cys arg asn pro asp gly glu lys ala pro trp cys tyr u »·

   chr asp ser gin leu arg crp glu cyr cys glu iie pro ser cys glu thr asn ser gin val arg Crp glu tyr cys lys ile pro ser cys asp chr asn ser gin val arg crp glu cyr cys lys ile pro ser cys glu thr asp ser glu val arg crp asp tyr cys lys ile pro ser cys gly thr asn ser glu val arg crp glu cyr cys chr ile pro ser cys glu ser ser ala ser pro asp gin ser asp ser' * ser val pro pro glu glu ser ser pro val ser Chr glu gin leu ala 'pro •Chr ala pro pro glu ser ser pro val ser chr glu pro leu asp pro chr ala pro pro glu ser ser chr Chr ser chr glu his leu asp ala pro val pro pro glu ser ser pro leu ser chr glu arg mec asp val pro val pro pro glu gin chr pro val val gin glu cys cyr gin ser asp gly gin ser cyr leu chr pro val val gin asp cys cyr his gly asp gly gin ser tyr leu thr pro val val gin glu cys tyr his gly asp gly gin ser cyr gin chr pro val ala gin asp cys Cyr arg gly asn gly glu ser tyr gin chr pro val pro gin asp cys cyr his gly asn gly gin ser tyr arg gly chr ser ser chr chr ile thr gly lys lys cys gin ser crp arg gly chr ser ser chr chr Chr chr gly lys lys cys gin ser crp arg gly chr ser ser chr chr Chr chr gly lys lys cys gin ser crp arg gly Chr ser ser chr chr ile chr gly arg lys cys gin ser crp arg gly Chr ser ser chr chr ile thr gly arg lys cys gin ser crp ala ala mec phe pro his arg his ser lys thr pro glu asn phe pro ser ser mec chr pro his arg his gin lys chr pro glu asn cyr pro ser ser mec chr pro his crp his glu lys chr pro glu asn phe pro val ser mec chr pro his arg his glu lys chr pro gly asn phe pro ser ser mec chr pro h^s^rg his leu lys thr pro glu asn cyr pro asp ala gly leu glu -r mec asn cyr cys arg asn pro asp gly asp lys asn ala gly leu chr mec asn cyr cys arg asn pro asp ala asp lys asn ala gly leu chr m^c asn cyr cys arg asn pro asp ala asp lys asn ala gly leu chr mec asn Cyr cys arg asn pro asp ala asp lys asn ala gly leu chr mec asn cyr cys arg asn pro asp ala asp lys gly pro crp y gly pro crp gly pro crp ser pro crp ser pro crp

   intaktjní tumo:

   resek.tumor - dny po operaci

   Obrázek 3A

   Obrázek 3B hemoglobin (g/dl)

   3.0H ng/ml 50 ng/ml bFGF

   Obrázek 4

   SUBSTITUTE SHEET (RULt 26)

   jC o c 44 w XD Xtí C r—| 3 •H XI r—1 a x: it o 44 M c Φ r—1 O xti (0 Ή n r-1 Φ Φ ΨΗ x: •H -U r-H 0 0 Ό w C a Φ

   přidané serum/jamka (mikrolitry)

   Obrázek 5 o

   H

   U

   CJ o

   -H •U

   O

   H

   0« nízko metastatický vysoce metastatický υ

   -í *4 β

   O.

   ϋ

   JÍ

   T>

   j a

   -<

   -j

   -t i

   XI)

   -a

   Δ

   O s

   rH xe

   H r—1

   Φ

   Δ •u

   O

   Ό α

   φ ascity sérum z myši s ascity sérum z normální myši objem vzorku (/il) objem vzorku (/tl)

   Obrázek 6A

   Obrázek 6B

   SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

   Obrázek 7A

   Obrázek 7B hí χΰ t>

   m ιϋ

   4J

   Φ

   <tí ϋ Λ Ή >, C Λ ϋ ϋ •Η r-4 Ή a c JC Ό Η 0 <0 'S Ό g C «J JZ 4J Ό 0) M > +1 0 a Μ 4J XD ε Φ •3 K> Μ 0 a CU *—·

   intaktní ΤΐΙΓΤΙΟΓ odstraněný

   Obrázek 8

   Vy hmotnost plic (mg) (průměr ± standardní chyba) šalin, šalin, plasminogen plasminogen LLC-LM moč normální moč fragment

   Tumor intaktní

   Tumor odstraněný .fy

   -i

   Obrázek 9

   SUBSTITUTE SHEET (RULE 25) ι^3Ί . ? AV2.4.140105M ·/ ι

   ι

   Obrázek ίο

   SUBSTITUTE SHEET (RULE 26) iilxi ’ Obrázek 11

   -J ΐ2)ζη

   Al rekombinantní HAS A2 xekombinantní HAS inhibicé

   Obrázek 12

   Al rekombinantní HAS Bl rekombinantní HAS E rekombinantní HAS

   Dl kontrola Cl kontrola inhibice ředění

   Obrázek 13

   SU3S7Í7UTE SHEET (RULE 26, iy/ίΊ primární tumor odstraněn

   Primární tumor Ptknut

   Obrázek 14

   0.6··« 0.4 - r^· •· I 0.2 - — 0.0 --, 5 9 00 ---- «·« pí 13 ao 60 5 9 JDJ 13

   9 13

   Oays

   SÚ5S.;7'JTE SHEET (RULE 26;

   hmotnost plic (g)

   1 5 ««· Λ lili 9 13 O 5 i r 9 13

   •Z * ³i ··

   9 13

   Oays

   SUBSTiTUTE SHEET (RULE 2C) λ:

   o •Η

   C •Η «-Η (Ο ω

   /7/^7 c:

   α w

   ο σ>

   c „ « . Ο • β » <χ)

   Μ

   C

   Φ r- Ν) «Μ ? ,. ζ

   Obrázek 17 (2 ^ωω) _ηιοωη3 uxsCqo

   SU8ST! ι¹j, z SHEET (AULE 25) objem tumoru

   I

   Obrázek 19

   SUBSTITUTE SHEET (RULE 25) <^27

   Lewisův plicní karcinom(LM)

   LO

   CM

   O

   CM

   IO

   O «Ο

   O den léčení o

   CN feurtu), niouing uieCqo

   SUBSTITUTE SHEET (RULE 26)

   Z

   Pily li .2 O O) sarkom retikulárních buněk