CZ314999A3 - Způsoby pro vyhledávání nových antivirových činidel - Google Patents

Description

Způsoby pro vyhledávání nových antivirových činidel

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nových způsobů pro identifikaci antivirových činidel, která selektivně interferují s virovými proteiny, které potlačují interferonem (IFN)-indukované buněčné obranné mechanismy proti virové infekci. Přesněji se předkládaný vynález týká vyhledávacích testů, které identifikují činidla, která selektivně inhibují interakce mezi virovými proteiny obsahujícími region určující sensitivitu na interferon (ISDR) a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou. Předkládaný vynález přesněji týká vyhledávacích testů, které identifikují činidla, která selektivně inhibují interakce mezi nestrukturálním 5A proteinem (NS5A) viru hepatitidy C (HCV) a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou. Interakce mezi virovým ISDR a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou vedou k potlačení interferonem (IFN)-indukovaných buněčných obranných mechanismů působících proti virové infekci. Proto jsou činidla identifikovaná pomocí testů podle předkládaného vynálezu použitelná jako protivirová činidla.

Dosavadní stav techniky

2.1. Terapie virových infekcí interferonem

Interferony jsou extracelulární signální proteiny, které mají různé účinky, včetně stimulace imunitního systému, inhibice nádorů a redukce dělení buněk. Interferon indukuje v cílové buňce produkci mnoha genových produktů, včetně Mx proteinů,

2'-5¹oligoadenylat syntetazy a RNasy L. (viz Sen et al., 1992, J. Biol. Chem. 267: 5017-5020; Sen et al., 1993, Adv. Virus Res. 42:57). Kromě toho, PKR, cAMP-independentní serin/threonin kinasa, je jedním z více než 30 genových produktů indukovaných

IFN (Meurs et al., 1990, Cell 62: 379-590). Bylo prokázáno, že s tyto proteiny mají ochranný účinek proti virovým infekcím, což způsobuje příznivé účinky terapie IFN v léčbě virových infekcí.

•

Existuje mnoho mechanismů, kterými genové produkty indukované IFN způsobují protektivní účinek proti virovým infekcím. Například, IFN-indukovaný enzym dependentní na dvoj řetězcové RNA, 2'-5'oligoadenylat syntetaza, aktivuje RNAsu, která štěpí buněčnou avirovou RNA, čímž je inaktivována replikace viru, například replikace picornaviru (Kumar et al., 1988, J. Virol.

62: 3175-3181). IFN-indukovaná proteinkinasa dependentní na dvoj řetězcové RNA inhibuje syntézu proteinů viru a hostitelské buňky pomocí fosforylace a inaktivace α-podjednotky translačního iniciačního faktoru eIF-2a. IFN má také inhibiční účinky na virus v různých fázích životního cyklu viru. IFN inhibuje odstraňování obalu virů hepatitidy B, což inhibuje replikaci viru. IFN inhibuje penetraci viru vesikulární stomatitidy do buněk (Whitaker-Dowling et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. 80: 1083-1086). IFN také inhibuje fůzi buněk způsobenou viry, jako je Sendai virus (Tomita et al., 1981, J. Gen. Virol. 55: 289-295).

Pro obranu proti působení IFN-indukovaných buněčných obraných mechanismů se u mnoha eukaryotických virů vyvinuly mechanismy blokující aktivitu proteinů indukovaných IFN. Mnoho virů λ produkuje RNA, která potlačuje inhibici translace indukovanou v hostitelské buňce IFN, například adenoviru produkuje VAI RNA molekulu, virus lidské imunodeficience (HIV) TAR region, a virus Epstein-Barrové produkuje EBER-1 RNA molekulu (Katz et al., 1987, Embo J. 6: 689-697; McMillan et al., 1995, Virology 213: 413-424; Carroll et al., 1993, Beattie et al., 1995, Virology 210:

254-263; Beattie et al., 1991, Virology 183: 419-422). Mnoho virů, jako je virus vakcinie, má K3L protein, který se váže na a inhibuje PKR-proteinkinasu indukovanou IFN (Gale Jr. et al., • 0 • · · ·· · · · • · · · · · · · · · · ·· 0 0 0 0·· • · 0 · · 0···· • · 0 0 0 00·« 0000 000 00 000 ·· ··

1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). Virus chřipky využívá , růstové faktory, jako je P58, které se váží na a blokují PKR proteinkinasu (Lee et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. 87:

. 6208-6212; Lee et al., 1994, Mol. Cell. Biol. 14: 2331-2342).

2.2. Virus hepatitidy C

Infekce virem hepatitidy C (HCV) je významným klinickým problémem v celém světě. V samotných Spojených Státech Amerických se uvádí 4000000 jedinců chronicky infikovaných HCV. HCV, hlavní etiologické agens hepatitidy non~A, non-B, se přenáší primárně transfusí infikované krve a krevních přípravků (Cuthbert et al., 1994, Clin. Microbiol. Rev. 7: 505-532; Mansell et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15: 15-32) . Před zavedením vyšetřování na anti-HCV v polovině 90-let způsoboval HCV 80-90% případů posttransfusní hepatitidy ve Spojených Státech Amerických. V současnosti je nejvýznamnějším rizikovým faktorem pro infekci HCV injekční aplikace drog, kdy přibližně 80% této populace je seropozitivní na HCV. Vysoké procento infekce HCV je také pozorováno u jedinců s krvácivými chorobami nebo chronickým renálním selháním, kteří dostávají často krev a krevní přípravky.

Akutní infekce HCV vede k persistenci virové replikace a progresí do chronické hepatitidy v přibližně 90% případů. U mnoha ? pacientů vede chronická infekce HCV k progredujícímu poškození jater a ke vzniku cirhosy. U pacientů s agresivní infekcí se může ^v cirhosa vyvinout již po dvou letech, ačkoliv obvyklejší doba vzniku cirhosy je 10-20 let. U 30-50% pacientů s chronickou HCV infekcí může z poškození jater vzniknout hepatocelulární karcinom. Obyčejně je hepatocelulární karcinom pozdním následkem a vzniká za více než 30 let (Bisceglie et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15: 64-69) . Relativní vliv virových nebo vlastních faktorů na progresi onemocnění není jasný.

HCV je obalený virus obsahující pozitivní kódující » jednořetězcový RNA genom velikosti přibližně 9,5 kb. Podle organizace genomu a vlastností virionu byl HCV klasifikován jako • zvláštní rod v čeledi Flaviviridae, kde tato čeleď také zahrnuje pestiviry a flaviviry (Alter, 1995, Semin. Liver Dis. 15: 5-14).

Virový genom se skládá z delšího 5'-netranslatovaného regionu (UTR), dlouhého otevřeného čtecího rámce kódujícího polyproteinový prekursor o přibližně 3011 aminokyselinách a krátkého 3'-UTR. 5'-UTR je nejvíce konzervovanou částí HCV genomu a je důležitý pro iniciaci a kontrolu translace polyproteinu. Translace HCV genomu je iniciována mechanismem nezávislým na čepičce, který je známý jako vnitřní ribosomový vstup. Tento mechanismus obsahuje vazbu ribosomů na RNA sekvenci známou jako vnitřní ribosomové vstupní místo (IRES). Nedávno bylo určeno, že RNA pseudosmyčková struktura je základním strukturálním prvkem HCV IRES. Ačkoliv nebyl spolehliý tkáňový kultivační systém umožňující replikaci HCV dosud vyvinut, byly virové proteiny identifikovány různými technikami, včetně použití rekombinantních konstruktů viru vakcinie a transkripčních/translančích systémů. Polyproteinový prekursor je štěpen jak virovými, tak hostitelskými proteasami a vznikají tak zralé virové strukturální a nestrukturální proteiny. Mezi virové strukturální proteiny patří nukleokapsidový jaderný protein (C) a dva glykoproteiny obalu, El a E2. HCV také kóduje dvě proteinasy, metalloproteinasu ^f dependentní na zinku kodovanou NS2-NS3 regionem a serinovou proteinasu kodovanou v NS3 regionu. Tyto proteinasy jsou nutné pro štěpení specifických regionů prekursorového polyproteinu na zralé peptidy. Karboxy-polovina nestrukturálního proteinu 5,

NS5B, obsahuje RNA-dependentní RNA polymerasu. Funkce zbývajících nestrukturálních proteinů, NS4A a NS4B, a NS5A (Amino-poloviny nestrukturálního proteinu 5), zůstává neznámá.

Pokrok v pochopení replikace a patogenese HCV je vážně » ·

zpomalen chyběním buněčného kultivačního systému. V důsledku toho nebyly dosud vyvinuty účinné antivirové strategie proti infekci HCV. Léčba interferonem-α jev současné době jedinou terapií chronické infekce HCV. Nicméně, méně než 50% pacientů má při takové terapii dlouhodobou remisi, s eradikací HCV (Hoofnagle et al., 1994, Lino et al., 1994, Intervirology 37: 87-100). Jak bylo uvedeno výše, existuje korelace mezi genotypem HCV a odpovědí na interferon (Enomoto et al., 1996, N. Engl. J. Med. 334: 77-81; Enomoto et al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 224-230). Například, odpověď u pacientů infikovaných HCV-lb je přítomna v méně než 40%. Podobně nízká odpověď byla také popsána u pacientů infikovaných HCV-la, který je prototypem genotypu v USA (Hoofnagle et al., 1994, Lino et al., 1994, Intervirology 37: 87-100) . Naopak, odpověď u pacientů infikovaných HCV genotypu 2 je téměř 80% (Fried et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15: 82-91).

Bylo zjištěno, že aminokyselinová sekvence určitého regionu NS5A proteinu genotypu lb koreluje se sensitivitou na interferon (Enomoto et al., 1996; Enomoto et al., 1995). Tento region, nazvaný region určující sensitivitu na interferon (ISDR) je v rozsahu aminokyselinových zbytků 237-276 NS5A (aminokyseliny 2209 až 2248 polyproteinu; číslování podle HCV-J, HCV-lb kmenu, u kterého byla stanovena kompletní genomová sekvence (Enomoto et al., 1995). Kmeny resistentní na interferon (t.j. kmeny, které byly přítomné před terapií interferonem, stejně jako šest měsíců po terapii interferonem) mají stejnou ISDR sekvenci jako základní HCV-lb kmen (Enomoto et al., 1996). Naopak, kmeny citlivé na interferon (t.j. kmeny HCV, které byly přítomné před terapii interferonem, ale které nebyly přítomné šest měsíců po terapii interferonem) , mají mnohočetné aminokyselinové substituce v ISDR. V této studii byla zjištěna u pacientů infikovaných izoláty HCV obsahujícími 4-11 aminokyselinových změn v ISDR kompletní odpověď na terapii interferonem. Naopak, u pacientů infikovaných HCV

izoláty obsahujícími základní ISDR sekvenci (a 87% z pacientů infikovaných HCV izoláty obsahujícími 1-3 aminokyselinové změny v

ISDR) nebyla pozorována odpověď na terapii interferonem.

Mechanismus, kterým ISDR HCV-lb ovlivňuje odpověď na ínterferon, není znám.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká nových způsobů pro identifikaci antivirových činidel, která selektivně interferují s virovými proteiny, které potlačují interferonem (IFN)-indukované buněčné obranné mechanismy proti virové infekci. Přesněji se předkládaný vynález týká vyhledávacích testů, které identifikují činidla, která selektivně inhibují interakce mezi virovými proteiny exprimujícími ISDR a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou. Předkládaný vynález přesněji týká vyhledávacích testů, které identifikují činidla, která selektivně inhibují interakce mezi nestrukturálním 5A proteinem (NS5A) HCV a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou. V jednom provedení se předkládaný vynález týká vyhledávacích testů, které identifikují činidla, která selektivně inhibují virové proteiny, které brání dimerizaci PKR. Předkládaný vynález se dále týká skríningových testů pro identifikaci nových exogenních nebo endogenních činidel, které indukují expresi IFN v takovém množství, že vede k potlačení NS5A inhibice PKR proteinkinasy. Interakce mezi virovými proteiny obsahujícími ISDR a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou vedou k potlačení interferonem (IFN)-indukovaných buněčných obranných mechanismů působících proti virové infekci a proto jsou činidla, která interferují s touto interakcí použitelná jako protivirová činidla.

Vynález je částečně založen na objevu, že (1) HCV protein NS5A přímo interaguje s a inhibuje IFN-indukovanou PKR proteinkinasu;

• · a (2) že pro interakci NS5A s a inhibici PKR proteinkinasy je nutný ISDR.

Předkládaný vynález dále obsahuje nová činidla identifikovaná v popsaných skriningových testech. Vynález se týká terapeutických způsobů a farmaceutických prostředků pro léčbu virových infekci za použití proteinů obsahujících ISDR jako cílů pro léčebný zásah. Přesněji se vynález se týká terapeutických způsobů a farmaceutických prostředků pro léčbu infekce HCV pomocí ovlivnění NS5A a jeho interakcí s IFN-indukovanou PKR proteinkinasou.

Takové léky by měly být účinější než současné léky, protože budou mít tu výhodu, že nebudou interferovat s buněčnými procesy, ale budou blokovat virovou inhibici buněčných obranných mechanismů proti virové infekci. Tyto léky budou mít minimální vedlejší účinky, protože budou působit na virové proteiny, které nemají buněčné homologní proteiny, a proto nebudou škodlivé pro hostitelskou buňku. Proto umožní jejich minimální nežádoucí účinky jejich použití ve vyšších dávkách.

Předkládaný vynález se také týká použití antivirových činidel identifikovaných v předkládaném vynálezu v kombinované terapii s jinými známými antivirovými činidly pro inhibici replikace viru. Činidla identifikovaná ve vyhledávacích testech podle předkládaného vynálezu jsou také použitelná pro snížení resistence viru na IFN a proto mohou být použita pro zvýšení účinnosti současné terapie IFN v léčbě infekce HCV.

3.1. Definice

Jak je zde použit, označuje termín ISDR neboli region určující sensitivitu na interferon doménu proteinu mající « · • · « ·

• ♦ · · • · · · ♦ · · · ·· *« aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. IA, nebo jakýkoliv derivát uvedené sekvence, nebo fragmenty nebo peptidy obsahující tuto sekvenci, která způsobuje resistenci vůči IFN nebo která se váže na IFN-indukovanou PKR proteinkinasu.

Jak je zde použit, označuje termín PKR nebo IFN-indukovaná PKR proteinkinasa proteinkinasu hostitelské buňky, která je aktivována interferonem, která ja také známá jako p68 kinasa, Pl, DAI, dsl nebo elF-l kinasa, a jakýkoliv derivát PKR, nebo fragmenty nebo peptidy mající aminokyselinovou sekvenci odpovídající PKR.

Jak je zde použit, označuje termín skríning nebo vyhledávání proces, ve kterém je velké množství potenciálně užitečných činidel zpracováno způsobem podle předkládaného vynálezu.

Jak je zde použit, označuje termín ovlivnění inhibici, blokování nebo prevenci genové exprese, enzymatické aktivity nebo interakce s jinými buněčnými nebo vírovými faktory.

Jak je zde použit, označuje termín léčba nebo prevence HCV infekce inhibici přenosu HCV, nebo prevenci uchycení HCV v hostiteli a zmírnění nebo zeslabení příznaků onemocnění způsobeného infekcí HCV. Léčba je považována za terapeutickou, pokud vede ke snížení počtu viru v těle, nebo ke snížení mortality nebo morbidity.

Jak je zde použit, označuje termín farmaceuticky přijatelný nosič nosič, který neinterferuje s účinnou biologickou aktivitou aktivní složky, který je chemicky inertní a který je netoxický pro pacienta, kterému je podán.

• · • ·

Jak je zde použit, označuje termín terapeutické činidlo jakoukoliv molekulu, sloučeninu nebo léčbu, výhodně antivirovou, která napomáhá v léčbě virové infekce nebo onemocnění způsobeného touto infekcí.

Popis obrázků na připojených výkresech

Obr. 1 (A) Horní část, srovnání aminokyselinové sekvence prototypu ISDR NS5A z IFN-resistentního kmene HCV - J a odpovídajícího regionu NS5A HCV kmene la a lb, které byly použity v této studii. Dolní část je strukturální znázornění HCV NS5A představující 447 aminokyselinový protein HCV-la a lb obsaženého v našich NS5A konstruktech. ISDR je uveden černě a je deletován z ISDR konstruktu odvozeného z HCV la. Aminokyselinové pozice v NS5A jsou uvedeny tučně, pozice odpovídající pozicím v HCV polyproteinu jsou uvedeny normálně.

(B) Strukturální znázornění PKR. Pozice dvou dsRNA.

i·' , .'^! vazebných motivů v regulační doméně jsou uvedeny černě.

Katalytická doména je v rozsahu aminokyselin 265-551 a obsahuje 11 konzervovaných regionů katalytické domény proteinkinasy (Hanks et al., 1988, Science 241: 42-52), které jsou označeny římskými číslicemi. Regiony interakcí s PKR-inhibičními molekulami adenoviru VAI RNA, vaccinia viru K3L a p58^IE>K jsou označeny (Katze et al., 1987, Embo J. 6: 689-697, Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). Také je označen NS5A vazebný region.

Obr. 2. In vitro vazebná analýza. Obr. 2 ukazuje autoradiogram [^3sS]-methioninem značené PKR in vitro translačních produktů samotných (dráhy 1, 4 a 7) nebo selektovaných vazbou na GST nebo SGT-NS5A v surových E. coli extraktech, jak je uvedeno nad každou dráhou. Navázané komplexy obsahující PKR aminokyseliny 1-5S1 (dráhy 2 a 3), 1-242 (dríhy 5 a 6) nebo 244-551 (dráhy 8 a 9)

44 * · · 4 » · · 4 byly získány selekcí na glutathion-agarose. Navázané translační produkty byly eluovány v SDS vzorkovém pufru a byly separovány 12,5% akrylamidovou SDS-PAGE. Šipka vpravo ukazuje pozici PKR aminokyselin 244-251, které migrují pod proužkem pozadí viditelným v dráhách 8 a 9. Pozice standardů molekulové hmotnosti jsou uvedeny v kDa (vlevo).

Obr. 3. Kvasinková 2-hybridní analýza. NS5A z HCV-lb interaguje s PKR in vivo. Kompletní přirozený NS5A z HCV-lb byl fúzován na GAL4 transkripční aktivační doménu (AD) a byl exprivován v kvasince současně s GAL4 DNA vazebnou doménou (BD) (pozice 2) nebo BD-PKR fúzními konstrukty BD-PKR K296R a BD-PKR 98-551 (pozice 4 a 8, v příslušném pořadí. Současná exprese kontrolních GAL4 konstruktů pro 2-hybridní test obsahovala AD-vektor/BD-vektor (pozice 1), AD-vektor/BD-PKR K296R (pozice 3) , AD-P58^ie’^k/BD-PKR 98-551 (pozice 7) . Transfektováné kvasinky byly umístěny do +His (horní obr.) a -His (dolní obr.) media.

Růst na -His ukazuje na 2-hybridní proteinovou interakci.

Obr. 4. NS5A z HCV-la interaguje s katalytickou doménou PKR proteinkinasy. Kvasinky exprimující bud' BD samotný (BD-vektor), nebo BD-NS5A fúsní protein z HCV-la (BD-NS5A) byly současně transfektovány plasmidy exprimujícími uvedené AD-PKR fúsní konstrukty nebo kontrolní AD-vektor (dolní řádek), byly umístěny do +His (vlevo) nebo -His (vpravo) media a byl sledován jejich růst.

Obr. 5. Rekombinantní NS5A inhibuje aktivitu PKR in vitro. Přečištěná nativní PKR (1,8 pmol) byla předem inkubována s pufrem (dráha 1) nebo se zvyšujícím se množstvím rekombinantního ; přečištěného GST-NS5A (HCV-la, dráhy 2-5) nebo GST (dráhy 6-9) a byla sledována in vitro kinasová aktivita za přítomnosti histonového H2a substrátu. Po dokončení kinasové reakce byly ·· 9 99 9 99 • · · · 9 9 99 · · 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 fosforylované produkty separovány na 12,5% SDS-PAGE a byly vizualizovány pomocí autoradiografie suchých gelů. Šipky ukazují pozice PKR a histonů. Vstupní molární množství GST-NS5A a nebo

GST proteinů byly 0,2 pmol (dráhy 2 a 6), 0,4 pmol (dráhy 3 a 7),

0,8 pmol (dráhy 4 a 8) a 1,2 pmol (dráhy 5 a 9).

Obr. 6. NS5A potlačuje PKR-zprostředkovanou supresi růstu u kvasinek. Kvasinkový kmen RY1-1 byl transfektován 2m kvasinkovými expresními konstrukty pYES2-NS5A (NS5A; z HCV-la), pEMBLYex4K3L (virus vakcinie K3L, pozitivní kontrola) nebo negativními kontrolními vektory pEMBLYex4 (pYex) a pYes2 (pYes).

Transfektanty byly umístěny do minimálního syntetického media obsahujícího 2% dextrosu (SD, vlevo), nebo 10% galaktosu/2% raffinosu (SGAL, vpravo) jako zdroj uhlíku a byl sledován jejich růst. SGAL plotna ukazuje 5 denní růst.

Obr. 7. Analýza eIF-2a fosforylace. Byly připraveny extrakty z kvasinkových kmenů uvedených výše a byly podrobeny isoelektrickému fokusování a imunoblotové analýze, jak je popsána. Proteiny (20 mg) byly nejprve separovány isoelektrickým fokusováním a potom byly přeneseny na nitrocelulosovou membránu, která byla potom sondována antisérem specifickým pro kvasinkový eIF-2a. Šipky ukazují pozice bazálně fosforylováného eIF-2a (dolní proužek) a eIF-2o! fosforylováného na Ser 51, místě fosforylace PKR (horní proužek). Hladiny bazálně fosforylovaného eIF-2a relativní k celkovému eIF-2a byly kvantifikovány skenováním laserovou densitometrií a jsou: vektor, 0,9% (dráha 1); NS5A, 9,8% (dráha 2); a K3L, 11,7% (dráha 3).

Obr. 9. NS5A narušuje dimerizaci PKR. AG1688 E. coli byly současně transformovány kombinací expresních plasmidů kódujících CI-PKR K296R a GST (sloupec 1), GST-NS5A lb-wt (sloupec 2), GST-K3L (sloupec 3), nebo GST-NS1 (sloupec 4), byly smíseny

9 9 9 9 * 9 · 9 9

999 9 9 9 9 9 99 ·

9 99 9999

999 9 999 99 9

9 999 9999

9999 999 99 999 99 99 s uvedeným ředěním lambdaKH54 fágu a byly umístěny na plotny obsahující agarové medium. Sloupec 5 obsahuje E. coli nesoucí

Cl-rop a GST-NS5A lb-wt expresní plasmidy (kontrola). Dimerizace

Cl-fušního proteinu se projeví tvorbou kolonií.

Obr. 10. PKR-vazebná doména NS5A. Obr. 10A: Strukturální znázornění GAL4 DNA vazebné domény NS5A fúsních konstruktů. Deleční mutanty byly připraveny z NS5A lb-wt, s výjimkou ~ISDR konstruktu, který byl připraven z NS5A la-wt. ISDR a PKR-vazebný region jsou uvedeny jako bílé a černé obdélníky, v příslušném pořadí. Jsou uvedeny koncové aminokyselinové pozice, s počítáním podle prototypu HCV J polyproteinové sekvence. Obr. 10B: Kvasinkový 2-hybridní test. Hf7c kvasinky nesoucí AD-PKR K296R byly' současně transformovány uvedenými BD-NS5A delečními konstrukty. Je uvedena -His plotna inkubovaná po dobu 3 dnů při 30 °C. Růst na -His mediu ukazuje na 2-hybridní proteinovou interakci. Obr. 10C: Imunoblotová analýza. Extrakty připravené z kvasinkových kmenů byly separovány SDS-PAGE a byly podrobeny imunoblotové analýze za použití anti-NS5A (dráhy 1-6) nebo anti-BD (dráhy 7-9) monoklonální protilátky. Dráhy 1 a 7 obsahují extrakty připravené z kmenů nesoucích pGBT9 BD-vektor (kontrola). Extrakty jsou označeny označením konstruktu nad každou příslušnou dráhou. BD-NS5A konstrukt 1973-2419 byl použit jako pozitivní kontrola pro blot uvedený vpravo. Pozice proteinových standardů jsou uvedeny v kDa.

Obr. 11. Vliv ISDR mutací na NS5A-PKR interakce. Obr. 11A. Kvasinkový 2-hybridní test. Hf7c kvasinkové kmeny nesoucí pGAD425 kódující AD-PKR K296R (AD-PKR) nebo AD samotný (AD-vektor) byly současně transformovány pGBT9 kódujícím BD samotný (vektor), BD-NS5A la-wt, BD-NS5A- ISDR, nebo isogenní sadu BD-NS5A lb-wt konstruktů obsahujících ISDR sekvenci uvedenou v tabulce 1. Růst na -His mediu ukazuje na 2-hybridní proteinovou interakci. Obr.

• · «

♦ ···

	• « • •	• •	♦ • · •	• · • · * ♦	•
	•	•	•	• ·	•
	··		···

11B. Imunoblotová analýza. Extrakty připravené z kmenů uvedených v A byly podrobeny imunoblotové analýze za použití anti-AD (levý panel) nebo anti-BD monoklonální protilátky (pravý panel) . Dráhy 1 a 2 ukazují expresi AD vektoru (v, kontrola) a AD-PKR (PKR; šipka), v příslušném pořadí. Dráhy 3-9 ukazují expresi BD vektoru (v, dráha 3), DB-NS5A ISDR ( , dráha 4), BD-NS5A ía-wt (wt, dráha 5), BD-NS5A lb-wt (wt, dráha 6), BD-NS5A lb-2 (2, dráha 7), BD-NS5A lb-4 (4, dráha 8), a BD-NS5A lb-5 (5, dráha 9). Šipky vpravo ukazují pozice ISDR a kompletních BD-NS5A konstruktů. Pozice proteinových standardů jsou uvedeny v kDa.

Obr. 12. ISDR mutace ruší funkci NS5A. Obr. 12A. Kvasinkový růstový test. Buněčné ekvivalenty RY1-1 kvasinek nesoucích galaktosou indukovatelné URA3 expresní plasmidy pYes-NS5A lb-wt (lb-wt), pYes-NS5A lb-2 (lb-2), pYes-NS5A lb-4 (lb-4), pYes-NS5A lb-5 (lb-5) nebo pYes kontrolu (vektor) byly sériově ředěny a byly umístěny na medium obsahující dextrosu (SD) nebo galaktosu (SGAL). Panely ukazují tvorbu kolonií po 5 dnech růstu při 30 °C. Obr. 12B. Imunoblotová analýza proteinových extraktů připravených z kvasinek uvedených v A. Jsou uvedeny výsledky získané ze stejné skvrny, která byla postupně sondována anti-PKR, anti-NS5A nebo anti-aktinovou (kontrolní) monoklonální protilátkou. Šipky vpravo označují pozici PKR, NS5A a aktinu. Každá dráha představuje 50 /zg celkového proteinu.

Obr. 13. eIF-2a fosforylace. Detekce eIF-2a byla usnadněna sondováním blotu antisérem proti kvasinkovému eIF-2oí. Každá dráha představuje 20 /zg proteinu připraveného z Ryl-1 kmenů nesoucích pYes (V, dráha 1), pYes-NS5A lb-wt (lb-wt, dráha 2), pYes-NS5A lb-2 (lb-2, dráha 3), pYes-NS5A lb-4 (lb-4, dráha 4), pYes-NS5A lb-5 (lb-5, dráha 5) nebo pYes-PKR A295-300 (PKR A295-300 (kontrola). Šipky vpravo ukazují pozice hypofosforylováného eIF-2a (dolní) a hyperfosforylovaného eIF-2a, který je ·· 00 · · « 0 ·

0 · • 0

0

0 •

000» fosforylován PKR na šeřinu 51.

Obr. 14. ISDR mutace narušují asociaci NS5A-PKR v savčích buňkách. Cos-I buňky byly současně transfektovány CMV expresním plasmidem kódujícím PKR K296R a NS5A nebo PKR K296R a kontrolním vektorem. Byly připraveny extrakty a byly smíseny s anti-NS5A monoklonální protilátkou (A) nebo s anti-FLAG pryskyřicí (B).

Obr. 14A. Anti-NS5A imunokomplexy připravené z extraktů nesoucích PKR K296R a kontrolní vektor (neo, dráha 1) nebo NS5A la-wt (la-wt) a vstupní extrakty (IP-input, dráhy 3 a 4) byly separovány SDS-PAGE a byla provedena imunoblotová analýza za použití anti-PKR (dráhy 1-3) nebo anti-NS5A (dráha 4) monoklonálních protilátek. Dráhy 3 a 4 představují výchozí materiál z imunoprecipitační reakce uvedené v dráze 2. Vertikální čára vlevo ukazuje široký proužek odpovídající těžkému řetězci imunoglobulinu (Ig). Pozice proteinových standardů jsou uvedeny v kDa. Obr. 14B. Imunoblotová analýza vstupního proteinu (dráhy 1-3) nebo proteinových komplexů (dráhy 4-6) získaných smísením extraktů obsahujících PKR K296R S’-vektorem samotným (neo, dráhy 1 a 4), FLAG-NS5A lb-wt (lb-wt, dráhy 2 a 5) nebo FLAG-NS5A lb-5 (lb-5, dráhy 3 a 6) s anti-FLAG pryskyřicí. Bloty byly sondovány monoklonální protilátkou specifickou k lidské PKR. Šipky ukazují PKR proužek.

Obr. 15. Exprese NS5A v buněčných liniích a nádorech. Imunobloty extraktů připravených z NIH3T3 buněčných linií neo 5-10 (neo, dráha 1) a NS5A 5C6 (5C6, dráha 2), nebo in vivo získaných NS5A 5C6 nádorových linií (nádor, dráha 3) byly sondovány anti-NS5A monoklonální protilátkou. Šipky ukazují pozice NS5A. Pozice proteinových standardů jsou uvedeny v kDa.

5. Předkládaný vynález se týká nových způsobů pro identifikaci antivirových činidel, která interferují s virovou inhibici IFN-indukovaných buněčných obranných mechanismů. Předkládaný vynález se týká způsobů pro vyhledávání antivirových činidel, která působí na interakce mezi virovými proteiny obsahujícími ISDR doménu a buněčnou PKR proteinkinasou. Předkládaný vynález se přesněji týká způsobů pro vyhledávání nových antivirových činidel, která působí na interakce mezi HCV NS5A a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou. V jiném provedení se předkládaný vynález týká vyhledávacích testů, které identifikují Činidla, která působí na HCVNS5A inhibici dimerizace PKR.

Vynález je částečně založen na objevu, že (1) ISDR region NS5A funkčně přispívá k IFN-resistentnímu fenotypu HCV; (2) další sekvence obklopující ISDR jsou nutné pro interakce mezi NS5A a PKR; (3) NS5A potlačuje IFN-indukovanou PKR přímou interakcí s katalytickou doménou proteinkinasy, konkrétně s aminokyselinami 244-296; (4) aminokyseliny 244-296 PKR jsou dímerízační doménou a vazba NS5A na tuto doménu narušuje dimerizaci PKR; (5) ISDR region je zásadní pro interakci NS5A a PKR a proto pro inhibici proteinkinasy.

Předkládaný vynález se týká nových způsobů pro identifikaci antivirových činidel, která ovlivňují interakci mezi virovými proteiny exprimujícími ISDR a IFN-indukovanými buněčnými proteiny, jako je PKR proteinkinasa. Předkládaný vynález se dále týká vyhledávacích testů pro identifikaci nových exogenních nebo endogenních činidel, které indukují expresi IFN v takovém, množství, že vede k potlačení NS5A inhibice PKR proteinkinasy. Interakce mezi ISDR a IFN-indukovanou PKR proteinkinasou vedou k potlačení interferonem (IFN)-indukovaných buněčných obranných mechanismů, například inhibici dimerizace PKR, a proto mohou být testy podle předkládaného vynálezu, které identifikují t ·

9 • 9 sloučeniny, které interferují s interakcemi mezi virovými proteiny obsahujícími ISDR a PKR, použity pro identifikaci léků, které inhibují potlačení buněčné vypnutí trnslace virem. Dále, při identifikaci sloučenin, které inhibují virové proteiny obsahující ISDR v interakci s buněčnou PKR budou testy podle předkládaného vynálezu také identifikovat činidla, která inhibují vznik malignit spojených s virovou infekcí. Pro vyhledávání činidel, která interferují a/nebo inhibují interakci mezi ISDR virem exprimovaných proteinů a IFN-indukovanou PKR mohou být použity různé protokoly a techniky. Taková identifikovaná činidla jsou užitečná pro léčbu hostitelů infikovaných virem a výhodně mohou být účinná proti virům resistentním na IFN.

Předkládaný vynález dále obsahuje farmaceutické prostředky obsahující nová činidla identifikovaná skríningovými testy uvedenými výše. Vynález obsahuje terapeutické způsoby a farmaceutické prostředky pro léčbu virových infekcí za použití proteinů obsahujících ISDR jako cílů pro intervenci. Přesněji se předkládaný vynález týká terapeutických způsobů a farmaceutických prostředků pro léčbu HCV infekce pomocí NS5A a jeho interakcí s IFN-indukovanou PKR. Taková terapeutická činidla jsou také výhodná pro zvýšení citlivosti HCV na interferon a proto mají význam pro kombinovanou léčbu s IFN.

Terapeutické způsoby podle předkládaného vynálezu dále zahrnují kombinované terapeutické způsoby, ve kterých jsou činidlo, které interferuje s interakcí mezi NS5A a IFN-indukovanou PKR, nebo činidlo, které indukuje takové hladiny exprese IFN, které potlačují NS5A inhibicí PKR, a alespoň jedno další terapeutické činidlo, podány buď současně, například ve směsi, separátně, ale simultáně nebo současně; nebo postupně, včetně cyklické terapie. Cyklická terapie obsahuje podávání prvního antivirového činidla po určité období a opakování tohoto

44

4 *

4 4

4 4 • · 4 4 • 4 44

4- 4

4 4

4 4 4 4

podávání, t.j. cyklu, pro redukci vzniku resistence na jeden typ terapie.

Nové antivirové kombinace podle předkládaného vynálezu poskytují léčbu, které nejen snižuje účinnou dávku jednoho z léků, která je nutná pro jeho protivirové působení, což snižuje toxicitu, ale může také zlepšovat absolutní antivirové účinky v důsledku působení na virus prostřednictvím více mechanismů účinku. Obdobně, nové antivirové kombinace mohou bránit vzniku resistence viru na monoterapii, což umožní účinější klinickou léčbu. Mezi terapeutická činidla, která mohou být použita v kombinaci s činidly, které působí na interakce mezi NS5A a PKR, patří řada známých léků, včetně a-IFN.

5.1 Úloha interace mezi HCV NS5A a IFN-indukovanou PKR při infekci HCV

Předkládaný vynález je částečně založen na objevu, že (1) ISDR region NS5A funkčně přispívá k IFN-resistentnímu fenotypu HCV;

(2) NS5A potlačuje IFN-indukovanou PKR přímou interakcí s katalytickou doménou proteinkinasy; a (3) jak inhibice PKR, tak interakce mezi NS5A a PKR vyžaduje ISDR. Tyto objevy jsou doloženy v sekcích 6, 7, 8 a 9, dále, které popisují kombinace biochemických a genetických strategií ukazujících, že NS5A potlačuje PKR přímou interakcí.

Pracovní příklad popsaný dále ukazuje přímou interakci mezi NS5A a PKR pomocí in vitro GST vazebných testů a in vivo kvasinkového dvouhybridního testu a ukazuje, že NS5A přímo interaguje s karboxylovou, katalytickou částí proteinkinasy, t.j. s PKR dimerizační doménou, t.j. aminokyselinami 244-296. Bylo prokázáno, že rekombinantní přečištěný NS5A inhibuje PKR kinasovou aktivitu in vitro. Studie současné transfekce na ··«» · 9 *· ···· ·· · · · ···· • · · · · ·«···« • · · · · ···* ···· ··· ·· *·· ·<* ♦» savčích buňkách ukázaly, že NS5A inhibuje dimerizaci PKR in vivo, což vede k potlačení funkce PKR a k inhibici PKR-zprostředkované eIF-2a fosforylace. Dále bylo prokázáno, že při expresi v kvasinkách inhibuje NS5A fenotyp s pomalým růstem indukovaný PKR a redukuje fosforylaci přirozeného substrátu PKR, eIF-2a.

Významné je, že NS5A deleční mutanty bez ISDR nebyly schopné interagovat s PKR nebo inhibovat aktivitu proteinkinasy. Dále, vložení mnohotných mutací ISDR, které je zjišťováno u kmenů HCV-lb citlivých na ínterferon, rušilo schopnost vazby NS5A na PKR v savčích buňkách. Zajímavé je, že jediná bodová mutace OSDR byla dostatečná pro narušení PKRR regulační funkce NS5A, za zachování schopnosti vazby na PKR. Pracovní příklad dále ukazuje, že buněčné linie nadměrně exprimující NS5A se maligně transformovaly a způsobily nádory u holých myší. Tyto výsledky poprvé ukazují, že inaktivace PKR genovým produktem NS5A je jedním mechanismem, kterým se HCV brání protivirovým účinkům IFN, a proto ukazují, že tato interakce je významným cílem pro vývoj anti-HCV činidel a činidel pro léčbu malignit vzniklých v důsledků HCV infekce.

5.2. Produkce HCV NS5A a PKR jako složek pro vyhledávací testy

Předkládaný vynález se týká vyhledávacích testů pro identifikaci sloučenin, které ovlivňují interakce mezi NS5A a PKR, přesněji interakce mezi ISDR a katalytickou doménou PKR. v jednom provedení vynálezu jsou významnou složkou vyhledávacích testů podle předkládaného vynálezu nukleotidové kódující sekvence kódující virové NS5A a buněčné PKR proteiny, polypeptidy a peptidy. Konkrétně obsahuje předkládaný vynález nukleotidové kódující sekvence kódující peptidové fragmenty odpovídající ISDR a katalytické doméně PKR proteinkinasy. Předkldáaný vynález dále obsahuje (a) DNA vektory, které obsahují jakoukoli z výše uvedených NS5A nebo PKR kódujících sekvencí a/nebo jejich · 90 · ·» 99 • 0 00 · 0 ·· 999« • 9 099 0999 • 9900 909 90 9 • 0 099 9000

0000 000 00 000 09 90 komplementární sekvence; (b) DNA expresní vektory, které obsahují jakoukoli z výše uvedených NS5A nebo PKR kódujících sekvencí, která je operativně navázaná na regulační element, který řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce; a (c) geneticky upravené hostitelské buňky, které obsahují jakoukoli z výše uvedených NS5A nebo PKR kódujících sekvencí, která je operativně navázaná na regulační element, který řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce.

5.2.1. NS5A a PKR kódující sekvence

Předkládaný vynález obsahuje nukleotidové kódující sekvence, které kódují NS5A proteiny, peptidové fragmenty NS5A proteinu a NS5A fúsní proteiny. Ve výhodném provedení předkládaný vynález obsahuje nukleotidové kódující sekvence, které kódují ISDR aminokyselinové sekvence, jak jsou uvedeny na obr. IA, peptidové fragmenty a fúsní proteiny obsahující tyto aminokyselinové sekvence. Ve jiném výhodném provedení předkládaný vynález obsahuje nukleotidové kódující sekvence, které kódují sekvence na karboxylové části ISDR, které jsou také nutné pro interakce s PKR, a peptidové fragmenty a fúsní proteiny obsahující tyto aminokyselinové sekvence kódované těmito nukleotidovými sekvencemi. V dalším provedení obsahuje předkládaný vynález nukleotidové sekvence, které kódují vícečetné mutace ISDR, které jsou nacházeny v kmenech HCV citlivých na IFN a peptidové fragmenty a fúsní proteiny obsahující tyto ISDR mutanty.

Předkládaný vynález dále obsahuje nukleotidové kódující sekvence, které kódují PKR proteinkinasu, peptidové fragmenty PKR proteinkinasy a PKR proteinkinasové fúsní proteiny. Ve výhodném provedení předkládaný vynález obsahuje nukleotidové kódující sekvence kódující katalytickou doménu PKR a fúsní proteiny obsahující katalytickou doménu PKR. V jiném výhodném provedení

44 předkládaný vynález obsahuje nukleotidová kódující sekvence obsahující PKR dimerizační doménu, aminokyseliny 244 až 246, a peptidové fragmenty a fúsní proteiny obsahující PKR aminokyseliny

244-296.

• 4 4 44

4 44 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4444 444 44 444

Nukleotidy kódující fúsní proteiny mohou zahrnovat, ale nejsou omezeny na, kompletní NSDR nebo PKR, zkrácené proteiny nebo peptidové fragmenty NSDR nebo PKR fúsované na nepříbuzný protein nebo peptid, jako je například ISDR fúsovaný na GST nebo na enzym nebo na fluorescentní protein.

Předkládaný vynález také obsahuje: (a) DNA vektory, které obsahují jakoukoliv z výše uvedených sekvencí kódujících NS5A nebo PKR proteinkinasu a/nebo jejich komplementární sekvence (t.j. protismyslné sekvence); (b) DNA expresní vektory obsahující jakoukoliv z výše uvedených sekvencí kódujících NS5A nebo PKR proteinkinasu, která je operativně navázaná na regulační element, který řídí expresi kódujících sekvencí; a (c) geneticky upravené hostitelské buňky, které obsahují jakoukoli z výše uvedených sekvencí kódujících NS5A nebo PKR proteinkinasu, která je operativně navázaná na regulační element, který řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. Jak je zde použit, označuje termín regulační element indukovatelné nebo neindukovatelné promotory, zesilovače transkripce, operátory a jiné elementy o kterých je známo, že řídí a regulují expresi. Takové regulační elementy zahrnují, ale nejsou omezeny na, indukovatelné promotory, jako jsou promotory teplotního šoku, galaktosou indukovatelné promotory, virové promotory, jako je promotor viru tabákové mozaiky (TMV), cytomegalovirový hCMV okamžitý časný gen, časné nebo pozdní promotory SV40 adenoviru, lac systém, trp systém, TAC systém, TRC systém, hlavní operátor a promotorové regiony fágu A, kontrolní regiony fd obalového proteinu, promotor pro 3-fosfoglycerat-kinasu, promotory kyselé ·· · ·· » 09 90 • · ·· 9 9 0« 9 9 9 9 • · 0·· ·0·9 • 9000 090 99 9 • · 099 9990 ••00 ··· 00 900 09 00 fosfatasy a promotory kvasinkových α-sexuálních faktorů.

5.2.2. NS5A a PKR proteiny a polypeptidy

NS5A a PKR proteiny, polypeptidy, peptidové fragmenty, mutované, zkrácené nebo deletované formy NS5A a PKR proteinů a fúsní proteiny obsahující ISDR nebo katalytickou doménu PKR mohou být připraveny pro různé použití, včetně přípravy protilátek, identifikace jiných faktorů obsažených v překonání

IFN-indukovaných buněčných obranných mechanismů virem.

V kódujících sekvencích NS5A a PKR mohou být vyrobeny mutace a tak mohou být připraveny proteiny a peptidy, které jsou vhodnější pro expresi, výrobu atd. ve vybraných hostitelských buňkách.

Peptidy odpovídající jedné nebo více doménám cílového, zkráceného nebo deletovaného NS5A nebo PKR proteinu obsahující ISDR a katalytickou doménu PKR, stejně jako fúsní proteiny, ve kterých je kompletní NS5A nebo pKR fušován na nepříbuzný protein, spadají také do rozsahu předkládaného vynálezu. Takové fúsní proteiny zahrnují, ale nejsou omezeny na, IgFc fúse, které stabilizují NS5A nebo PKR protein nebo peptid a prodlužují jeho poločas in vivo; GST fúse na jakoukoliv aminokyselinovou sekvenci, která umožňuje zachycení fúsního proteinu na pevném nosiči, nebo která umožňuje vystavení ISDR na stabilním povrchu; nebo fúse na enzym, fluorescentní protein nebo luminiscentní protein, který bude působit jako markér.

Ačkoliv mohou být polypeptidy a peptidy podle předkládaného vynálezu syntetizovány chemicky (viz například Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., N.Y.), mohou být velké polypeptidy odvozené od NS5A a PKR kódujících sekvencí výhodně připraveny technologií rekombinantní

4 4« • 4 44 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4444 444 44 Φ·· •4 44

4 4 « • 4 4 4 • 4 4 4

4 4 4 ·«.

DNA za použití technik dobře známých v oboru určených pro expresi nukleovych kyselin obsahujících sekvence kódující NS5A a PKR. Takové metody mohou být použity pro výrobu expresních vektorů obsahujících nukleotidové sekvence popsané v části 2.1. a vhodné transkripční a translační kontrolní signály. Mezi tyto techniky patří, například, in vitro techniky rekombinantní DNA, syntetické techniky a genetické rekombinace. Viz například techniky popsané v Sambrook et al.., 1989. výše, a Ausubel et al., 1989. výše. Alternativně může být chemicky syntetizována RNA schopná kódování NS5A nebo PKR nukleotidových sekvencí, například za použití syntezátorů. Viz například techniky popsané v Oligonucleotide Synthesis, 1984, Gaid, M.J. ed., IRL Press, Oxford, která je zde uvedena jako odkaz ve své úplnosti.

Pro expresi nukleotidových sekvencí podle předkládaného vynálezu mohou být použity různé systémy hostitel-expresní vektor.

Způsoby dobře známé odborníkům v oboru mohou být použity pro konstrukci expresních vektorů obsahujících sekvence kódující NS5A a PKR a vhodné transkripční/translační kontrolní signály. Tyto metody zahrnují in vitro rekombinantní DNA techniky, syntetické techniky a in vivo rekombinaci/genetickou rekombinaci. viz například techniky popsané v Maniatis et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. a Ausubel et al., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y.

Pro expresi sekvencí kódujících NS5A a PKR mohou být použity různé systémy hostitel-expresní vektor. Mezi ně patří, bez omezení, mikroorganismy, jako jsou bakterie, transformované rekombinantní bakteriofágovou DNA, plasmidové DNA nebo kosmidové DNA expresní vektory obsahující sekvence kódující NS5A a PKR;

·<· · ·» · • · ·· · · ·· • · · · · • · · · · · • · · · · ···· ··· ·· »,« ·· ·· • · · 9 • · · · • · · · · • · · · ·· ·· expresními kvasinky transformované rekombinantními kvasinkovými vektory obsahujícími sekvence kódující NS5A a PKR; hmyzí buněčné systémy infikované rekombinantními virovými expresními vektory (například baculovirem) obsahujícími sekvence kódující NS5A a PKR; NS5A a PKR buněčné systémy infikované rekombinantními virovými expresními vektory (například virem květákové mozaiky, CaMV; virem tabákové mozaiky, TMV) nebo transformované rekombinantními plasmidovými expresními vektory (například Ti plasmidem) obsahujícími sekvence kódující NS5A a PKR; nebo zvířecí buněčné systémy infikované rekombinantními virovými expresními vektory (například adenovirem, virem vakcinie).

Expresní elementy těchto systémů se mohou lišit v účinnosti a specificitách. V závislosti na použitém systému hostitel/vektor může být v expresních vektorech použito mnoho vhodných transkripčních a translačních elementů, včetně konstitutivních a indukovatelných promotorů. Například, při klonování v bakteriálních systémech mohou být použity indukovatelné promotory jako je pL bakteriofágu lambda, plac, ptrp, ptač (ptrp-lac hybridní promotor) a podobně; při klonování ve hmyzích buněčných systémech mohou být použity promotory jako je baculovirový polyhedrinový promotor; při klonování v rostlinných buněčných systémech mohou být použity promotory získané z genomu rostlinných buněk (například promotory teplotního šoku; promotor pro malou podjednotku RUBISCO; promotor pro chlorofylový a/b vazebný protein) nebo promotory získané z rostlinných vírů (například 35S RNA promotor CaMV; promotor obalového proteinu TMV); při klonování v savčích buněčných systémech mohou být použity promotory získané z genomu savčích buněk (například metallothioneinový promotor) nebo promotory získané ze savčích virů (například adenovirový pozdní promotor; 7,5K promotor viru vakcinie); při výrobě buněčných linií obsahujících vícečetné kopie NS5A nebo PKR DNA mohou být SV-40-, BPV- a EBV-vektory

použity s vhodným selektovatelným markérem.

V bakteriálních systémech mohou být expresní vektory vybrány na základě zamýšleného použití exprimovaného NS5A nebo PKR. Například, když jsou velká množství NS5A nebo PKR produkována pro přípravu protilátek nebo pro vyšetřování peptidových knihoven, tak jsou žádoucí vektory řídící expresi velkého množství fúsních proteinových produktů, které mohou být snadno přečištěny. Takové vektory zahrnují, ale nejsou omezeny na, E. coli expresní vektor pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO J. 2: 1791), ve kterém může být sekvence kódující NS5A nebo PKR ligována do vektoru v rámci s lac Z kódujícím regionem tak, že je produkován hybridní NS5A nebo PKR lac Z protein; pIN vektory (Inouye and Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke and Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 264: 5503-5509); a podobně. pGEX vektory mohou být také použity pro expresi cizorodých polypeptidů jako fúsních proteinů s glutathion S-transferasou (GST). Obecně jsou fúsní proteiny solubilní a mohou být snadno přečištěny z lyžovaných buněk adsorpcí na glutathion-agarosové korálky, po které následuje eluce za přítomnosti volného glutathionu. pGEX vektory jsou navrženy tak, že obsahují štěpící místa pro trombin nebo faktor Xa proteasy, takže vybraný klonovaný polypeptid může být uvolněn z GST skupiny.

V kvasinkách může být použito mnoho vektorů obsahujících konstitutivní a indukovatelné promotory. Pro přehled viz Ausubel et al., 1988, Current Protocols in Molecular Biology, svazek 2, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., kap. 13; Grant et al., 1987, Expression and Secretion Vectors for Yeasts, v Methods in Enzymology, Ed. Wu and Grossman, 1987, Acad. Press, N.Y. svazek 153, str. 516-544; Glover, 1986, DNA Cloning, svazek II, IRL Press, Wash. D.C., kap. 3; a Bitter, 1987, Heterologous Gene Expression in Yeasts, Methods in Enzymology, • ·

Ed. Berger and Kimmel, Acad. Press, N.Y. svazek 152, str.

673-684; a The Molecular Biology of Yeast Saccharomyces, 1982,

Ed. Strathern et al., Cold Spring Harbor Press, svazky I a II.

Pro dlouhodobou, vysoce účinnou produkci rekombinantních proteinů je upřednostňována stabilní exprese. Mohou být připraveny například buněčné linie, které stabilně exprimují NS5A nebo PKR. Ve výhodném provedení předkládaného vynálezu jsou připraveny kvasinky, které stabilně exprimují NS5A nebo PKR. Takové buněčné linie mohou sloužit jako in vivo systém pro vyhledávání inhibitorů NS5A inhibice PKR. Spíše než expresními vektory obsahujícími virové elementy rozpoznávající počátek replikace mohou být hostitelské kvasinky transformovány NS5A nebo PKR DNA kontrolovanými vhodnými expresními kontrolními elementy (například promotorem, zesilovačem transkripce, sekvencemi, transkripčními terminátory, polyadenylačními místy a podobně) a selektovatelným markérem. Kromě toho mohou být takové hostitelské buňky transformovány DNA kódující reporterový gen, jehož exprese je zvýšena v reakci na aktivaci PKR kinasy. Příkladem takového reporterového genu je GCN4 promotor fúsovaný na β-gaaktosový reporterový gen. Po vložení cizorodé DNA mohou být upravené buňky kultivována po dobu 1-2 dnů v obohaceném mediu a potom mohou být přeneseny do selektivního media. Selektovatelný markér v rekombinaním plasmidu způsobuje resistenci na selekci a umožňuje stabilní integraci plasmidu do chromosomů buněk a růst buněk, který vytvoří ložiska, která mohou být potom klonována a expandována do buněčných linií. Tento způsob může být výhodně použit pro zpracování buněčných linií, které exprimují NS5A gen. PKR gen a dále reporterový gen, jehož exprese je zvýšena v reakci na aktivaci PKR kinasy. Takové geneticky upravené buněčné linie jsou užitečné při vyhledávání inhibitorů NS5A.

Může být použito velké množství selekčních systémů, včetně,

ale bez omezení, genů thymidin kinasy viru herpes simplex (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), hypoxantin-guanin fosforibosyltransferasy (Szybalska and Szybalski, 1962, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 48: 2026), a adenin-fosforibosyltransferasy (Lowy et al., 1980, Cell 22: 817), které mohou být použity v Tk“, hgprt^- nebo aprt^- buňkách, v příslušném pořadí. Také resistence na antimetabolity může být použita jako základ pro selekci pomocí genu dhfr, který způsobuje resistenci na methotrexat (Wigler et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77: 3567; O'Hare et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 1527); gpt, který způsobuje resistenci na kyselinu mykofenolovou (Mulligan and Berg., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, který způsobuje resistenci na aminoglykosid G-418 (Colberre-Garapin et al.,

1981, J. Mol. Biol. 150: 1); a hygro, který způsobuje resistenci na hygromycin (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Nově byly popsány další selektovatelné geny, jmenovitě trpB, který umožňuje buňkám využívat indol namísto tryptofanu; hisD, který umožňuje buňkám, využívat histinol namísto histidinu (Hartman and Mulligan, 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 8047; a ODC (ornitindekarboxylasa), která způsobuje resistenci na inhibitor ornitindekarboxylasy, 2-(difluormethy)-DL-ornitin, DFMO (McConlogue L., 1987, v: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory ed.). Předkládaný vynález také obsahuje: (a) DNA vektory, které obsahují jakoukoliv z výše uvedených kódujících sekvencí a/nebo jejich komplementární sekvence (t.j. protismyslné sekvence); (b) DNA expresní vektory obsahující jakoukoliv z výše uvedených kódujících sekvencí, která je operativně navázaná na regulační element, který řídí expresi kódujících sekvencí; a (c) geneticky upravené hostitelské buňky, které obsahují jakoukoli z výše uvedených kódujících sekvencí, která je operativně navázaná na regulační element, který řídí expresi kódující sekvence v hostitelské buňce. Jak je zde použit, označuje termín regulační element indukovatelné nebo • · neindukovatelné promotory, zesilovače transkripce, operátory a jiné elementy o kterých je známo, že řídí a regulují expresi.

Dále, dříve neznámé genové sekvence obsahující ISDR mohou být izolovány pomocí PCR za použití dvou souborů degenerovaných oligonukleotidových primerů navržených na základě aminokyselinové sekvence v požadovaném genu nebo za použití PCR primerů popsaných v části 6.1. Templátem pro reakci může být cDNA získaná reversní transkripcí mRNA připravené z buněčných linií nebo tkání infikovaných viry, o kterých je známo nebo o kterých se předpokládá, že exprimují proteiny obsahující ISDR.

Produkt PCR může být subklonován a sekvencován pro zaj ištění toho, že amplifikovaná sekvence představuje sekvenci nukleové kyseliny NS5A nebo ISDR. PCR fragment může být potom použit pro izolaci kompletního cDNA klonu pomocí různých technik. Například může být amplifikovaný fragment označen a použit pro vyšetřování bakteriofágové cDNA knihovny. Alternativně může být označený fragment použit pro vyhledávání genomové knihovny.

PCR technika může být také použita pro izolaci úplných cDNA sekvencí. Například může být standardními technikami izolována RNA, z vhodného buněčného nebo tkáňového zdroje. Na RNA může být provedena reversní transkripce za použití oligonukleotidového primerů specifického pro obvykle 5¹-konec amplifikovaného fragmentu pro nastartování syntézy prvního řetězce. Vzniklý RNA/DNA hybrid může být potom označkován guaniny pomocí standardní terminální transferasové reakce, hybrid může být tráven RNAsou H a potom může být zahájena syntéza druhého řetězce pomocí poly-C primerů. Tak může být snadno izolována cDNA sekvence nad amplifikovaným fragmentem. Pro přehled klonovacích strategií, které mohou být použity, viz například Sambrook et al., 1989, výše.

V případech, že identifikovaná ISDR sekvence je normální, nebo přirozená, může být tento gen použit pro izolaci mutantních alel tohoto genu. Mutantní alely mohou být izolovány z virů, o kterých je známo nebo o kterých se předpokládá, že mají fenotyp resistentní na IFN, který přispívá k jejich infekčnosti. Mutantní alely a produkty mutantních alel mohou být potom použity ve vývoji in vitro testů, expresních systémů a vyhledávacích testů popsaných dále.

cDNA mutantního genu může být izolována, například, pomocí PCR, což je technika, která je v oboru dobře známá. V tomto případě může být první cDNA řetězec syntetizován hybridizací oligo-dT oligonukleotidu na mRNA izolovanou ze tkáně o které je známo nebo o které se předpokládá, že je exprimována u jedince nesoucího mutantní alelu, a tvorbou nového řetězce pomocí reversní transkriptasy. Potom je syntetizován druhý řetězec cDNA za použití oligonukleotidu, který specificky hybridizuje na 5’ konec normálního genu. Za použití těchto dvou primerů je produkt potom amplifikován PCR, je klonován do vhodného vektoru a je podroben analýze DNA sekvence za použití technik dobře známých v oboru. Srovnáním DNA sekvence mutantního genu se sekvencí normáního genu mohou být identifikovány mutace odpovědné za ztrátu nebo alteraci funkce produktu mutantního genu.

Alternativně může být konstruována genomová nebo cDNA knihovna a ta může být vyšetřována za použití DNA nebo RNA, v příslušném pořadí, z buněk infikovaných virem, který je resistentní na IFN a proto se předpokládá, že exprimuje gen obsahující ISDR nebo jeho mutantn. Normání gen nebo jakýkoliv jeho fragment může být potom označen a může být použit jako sonda pro identifikaci odpovídajících mutantních alel v knihovně. Klon obsahující tento gen může být potom přečištěn a může být provedena analýza jeho sekvence za použití v oboru dobře známých metod.

• · · ·

Dále mohou být vytvořeny expresní knihovny využívající DNA izolované z buněk nebo cDNA syntetizované z buněk nebo tkání infikovaných virem resistentním na IFN o kterém se předpokládá, že exprimuje vybraný gen u jedince, u kterého je známo nebo u kterého se předpokládá, že nese mutantní alelu. V tomto způsobu může být genový produkt tvořený domnělou mutantní tkání exprimován a vyšetřován za použití standardních protilátkových vyšetřovacích technik spolu s protilátkami namířenými proti produktu normálního genu, jak je popsáno dále v části 5.3. (Pro vyšetřovací techniky viz například Harlow, E. and Lané, ed.,

1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor). V případech, že mutace vedou ke vzniku genového produktu s alterovanou funkcí (například v důsledku mutace měnící smysl kodonu), je pravděpodobné, že polyklonální sada protilátek bude zkříženě reagovat s produktem mutantního genu. Klony knihovny detekované podle jejich reakce s takovými značenými protilátkami mohou být potom přečištěny a může být provedena analýza jejich sekvence za použití v oboru dobře známých metod.

5.2.3. Hostitelské buňky a expresní systémy

Hostitelské buňky, které obsahují NS5A a PKR kódující sekvence a které exprimují biologicky aktivní genový produkt mohou být identifikovány nejméně čtyřmi postupy: (a) DNA-DNA nebo DNA-RNA hybridizací; (b) přítomností nebo nepřítomností funkcí márkerového genu; (c) hodnocením úrovně transkripce jak je měřena expresí NS5A a PKR mRNA transkriptů v hostitelské buňce; a (d) detekcí genového produktu a jeho stanovení imunotestem nebo stanovením jeho biologické aktivity.

V prvním přístupu může být přítomnost sekvence kódující NS5A a PKR insertované v expresní vektoru detekována DNA-DNA nebo

DNA-RNA hybridizací za použití sond obsahujících nukleotidové sekvence, které jsou homologní se sekvencemi kódujícími NS5A nebo

PKR nebo jejich částmi nebo deriváty.

Ve druhém přístupu může být identifikován systém rekombinantní expresní vektor/hostitel a může být selektován na základě přítomnosti nebo nepřítomností určitých funkcí markerového genu (například thymidinové aktivity, resistence na antibiotika, resistence na methotrexat, transformačního fenotypu, tvorby oklusních tělísek u bakuloviru atd.). Například, pokud je sekvence kódující NS5A nebo PKR uvnitř sekvence markerového genu ve vektoru, tak mohou být rekombinantny obsahující sekvence kódující NS5A a PKR identifikovány podle absence funkce markerového genu. Alternativně může být markerový gen umístěn v tandemu se sekvencí kódující NS5A a PKR pod kontroloou stejného nebo jiného promotoru použitého pro kontrolu exprese sekvence kódující NS5A nebo PKR. Exprese markéru v odpovědi na indukci nebo selekci ukazuje na expresi sekvence kódující NS5A nebo PKR.

Ve třetím přístupu může být transkripční aktivita regionu kódujícího NS5A a PKR hodnocena hybridizačními testy. Například může být izolována RNA a může být analyzována Northern blot analýzou za použití sondy homologní k sekvenci kódující NS5A a PKR nebo její části. Alternativně může být extrahována celková nukleová kyselina hostitelské buňky a může být testována na hybridizací s takovými sondami.

Ve čtvrtém přístupu může být exprese NS5A a PKR proteinu hodnocena imunologicky, například Western blot analýzou, imunotesty jako je rádio-imunoprecipitace, enzymový imunotest a podobně. Definitivní test úspěšnosti expresního systému vyžaduje, nicméně, detekci biologicky aktivního produktu NS5A a PKR genu. Pokud hostitelská buňka secernuje genový produkt, může být

buněčné medium neobsahující buňky získané z kultivovaných transfektováných hostitelských buněk testováno na NS5A a PKR aktivitu. Pokud není genový produkt secernován, mohou být na takovou aktivitu testovány buněčné lyzáty. V každém případě mohou být pro detekci NS5A a PKR aktivity použity různé testy, včetně následujícího testu: cyklooxygenasová aktivita může být stanovena v kultivačním mediu přidáním exogenního substrátu tvořeného kyselinou arachidonovou (30 μΜ na 15 min při 37 °C), po čemž následuje přeměna prostaglandinu E₂ na methyloximatovou formu. Tento bicyklický derivát může být potom kvantifikován radioimunotestem (kit od Amersham Corp.).

Požadované NS5A a PKR buňky mohou být připraveny vložením zde popsaných genových konstruktů do různých typů NS5A a PKR buněk, včetně například buněk tkáňové kultury, savčích buněk, kvasinek, tkáňových nebo orgánových explantátů, embryí i celých zvířat. V provedení podle předkládaného vynález je uravený materiál selektován nebo vyšetřován na transformanty (t.j. ty, které mají inkorporovaný nebo integrovaný vložený genový konstrukt) za použití přístupů a způsobů uvedených dále.

Transformované buňky, tkáně nebo zvířata mohou být identifikovány a izolovány pomocí selekce nebo vyšetřování geneticky upraveného materiálu na charakteristiky kódované markerovými geny přítomnými ve transformující DNA. Například může být selekce provedena kultivací geneticky upravených buněk v mediu obsahujícím inhibiční množství antibiotika, vůči kterému vyvolává transformační markerový genový konstrukt resistenci. Dále, transformované buňky mohou být také identifikovány vyšetřováním na aktivity jakýchkoliv viditelných markerových genů (například β-glukuronidasy, luciferasy, B nebo Cl genů), které mohou být přítomné v rekombinantních nukleokyselinových konstruktech podle předkládaného vynálezu. Takové selekční a • ♦ ♦ • 4 ·

4 4 4 4 4 • 4·· 4 * · 4

4 4 · · • »444 4

4 4 · 4 *444 444 4 4 444

4« · · 4 4 vyšetřovací techniky jsou v oboru dobře známé.

Fyzikální a biochemické techniky mohou být také použity pro identifikaci buněčných transformantů obsahujících genové konstrukty podle předkládaného vynálezu. Tyto metody zahrnují, ale nejsou omezeny na: (1) Southern analýzu nebo PCR amplifikaci pro detekci a stanovení struktury rekombinantního DNA insertu;

(2) Northern blot, S-l RNAsové chránění, primerovou extensi nebo reversní transkriptasovou-PCR amplifikaci pro ribozomovou aktivitu, kde jsou takové genové produkty kódované genovými konstrukty; (4) gelovou elektroforesou proteinů, technikami western blottingu, imunoprecipitací, nebo ELISA, pokud jsou produkty genového konstruktu proteiny; (5) biochemickým stanovením sloučenin produkovaných v důsledku exprese vložených genových konstruktů. Další techniky, jako je hybridizace in šitu, enzymové barvení a imunobarvení, mohou být také použity pro detekci přítomnosti nebo exprese rekombinantních konstruktů ve specifických buňkách, orgánech a tkáních. Techniky pro provádění všech těchto testů jsou v oboru dobře známé.

5.2.4. Přečištění produktů NS5A nebo PKR genů

Jakmile je identifikována buňka produkující vysoké hladiny biologicky aktivního NS5A nebo PKR, může být tato buňka použita pro klonální expansi a produkci větších množstí těchto proteinů. Genové produkty mohou být přečištěny pomocí technik dobře známých v oboru, včetně například imunoafinitního přečištění, chromatografických metod včetně vysokoúčinné kapalinové chromatografie a podobně. Pokud je genový produkt secernován kultivovanými buňkami, tak mohou být NS5A nebo PKR polypeptidy snadno získány z kultivačního media.

Pokud byly sekvence kódující NS5A nebo PKR geneticky upraveny • 9 90 9 · · 0 9*0«

9 9 9 0 9*99 • · ♦· · · 0 9 0 9 ·

0 9 0 · 9*99 •999 999 99 999 »· 99 tak, aby kódovaly štěpitelný fúsní protein, tak může být přečištění NS5A nebo PKR snadno provedeno pomocí afinitních přečišúovacích technik. Například, protilátka specifická pro heterologní peptid nebo protein může být použita pro zachycení trvanlivého fúsního proteinu; například na pevném povrchu, koloně atd. NS5A nebo PKR skupina může být uvolněna reakcí s vhodným enzymem, který štěpí vazebné místo.

Snadnost konstrukce cDNA za použití polymerasové řetězové reakce, transfekce a přečištění exprimovaného proteinu umožňuje izolaci malých, ale dostatečných množství NS5A nebo PKR pro charakterizaci fyzikálních a kinetických vlastností proteinu. Pomocí místní mutagenese nebo za použití přirozených mutantních sekvencí umožňuje tento systém stanovení účinků alterované primární struktury na funkci proteinu. Fúsní konstrukty mající doménu NS5A nebo PKR před amino-koncem štěpitelného protinu versus kontrukty mající opačné uspořádání mohou být také geneticky připraveny a může být hodnoceno, který fúsní konstrukt interferuje nejméně, pokud vůbec, s biologickou funkcí proteinu a schopností přečištění.

V tomto aspektu vynálezu může být jakékoliv štěpící místo nebo substrát pro enzymové štěpení geneticky zapracováno mezi NS5A nebo PKR sekvence a druhý peptid nebo protein, který má vazebný protějšek, který může být použit pro přečištění, například jakýkoliv antigen, který může být použit v imunoafinitní koloně.

5.3. Protilátky k NS5A proteinům

Protilátky, které definují produkt NS5A genu, spadají do rozsahu předkládaného vynálezu a zahrnují protilátky schopné specificky rozpoznávat jeden nebo více epitopů produktu NS5A genu, jako je ISDR. Takové protilátky zahrnují například • · • * · · • · · ·

polyklonální protilátky, monoklonální protilátky (mAb), humanizované nebo chimérické protilátky, jednořetězcové protilátky, Fab fragmenty, F(ab')₂ fragmenty, fragmenty produkované Fab expresní knihovnou, anti-idiotypové (anti-Id) protilátky a fragmenty vážící se na epitop jakékoliv z výše uvedených protilátek. Takové protilátky mohou být použity například v detekci produktu NS5A genu v biologickém vzorku, všetně například krevní plasmě a séru. Alternativně mohou být protilátky použity pro inhibici aktivity produktu NS5A genu.

Monoklonální protilátky, které jsou homogenní populací protilátek k určitému antigenu, mohou být získány jakoukoliv technikou, která umožňuje produkci protilátek kultivací buněčných linií. Tyto techniky zahrnují například hybridomní techniku, která je popsána v Kohler and Milstein (1975, Nátuře, 256: 495-497; a U.S. Patentu č. 4376110), hybridomní techniku s lidskými B-buňkami /Kosbor et al., 1983, Immunology Today 4: 72; Cole et al., 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030) a EBV-hybridomní techniku (Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, lne., str. 77-96). Takové protilátky mohou náležet k jakékoliv z imunologických tříd IgG, IgM, IgE, IgA, IgD a k jakýkmkoliv jejich podtřídám. Hybridomy produkující mAb podle předkládaného vynálezu mohou být kultivovány in vitro nebo in vivo.

Dále mohou být použity techniky vyvinuté pro produkci chimérických protilátek (Morrison et al., 1984, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Neuberger et al., 1984, Nátuře,

312: 604-608; Takeda et al., 1985, Nátuře 314: 452-454) využívající sestřihu genů z myší protilátkové molekuly s vhodnou specificitou pro antigen a genů z lidské protilátkové molekuly s vhodnou biologickou aktivitou. Chimérická protilátka je molekula, ve které jsou její různé části získány od jiných druhů zvířat,

například variabilní regiony jsou z myší mAb a konstantní region imunoglobulinu je lidský.

Alternativě mohou být techniky popsané pro produkci jednořetězcových protilátek (U.S. patent č. 49465778; Bird, 1988, Science 242: 423-426; Huston et al., 1988, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883; a Ward et al., 1989, Nátuře 334: 544-546) adaptovány pro produkci jednořetězcových protilátek proti produktům NS5A genu. Jednořetězcové protilátky jsou připraveny spojením fragmentů těžkého a lehkého řetězce Fv regionu pomocí aminokyselinového můstku, což vede ke vzniku jednořetězcového polypeptidu.

Protilátkové fragmenty rozpoznávající specifické epitopy mohou být připraveny známými technikami. Mezi takové fragmenty patří například: F(ab’)₂ fragmenty, které mohou být připraveny trávením protilátkové molekuly pepsinem a Fab fragmenty, které mohou být připraveny redukcí disulfidových můstků F(ab')₂ fragmentů. Alternativně mohou být připraveny Fab expresní knihovny (Huse et al., 1989, Science 246: 1275-1281) umožňující rychlou a snadnou identifikaci monoklonálních Fab fragmentů s požadovanou specíficítou.

5.4. Vyhledávací testy pro identifikaci činidel, která selektivně inhibují interakce mezi NS5A a IFN-indukovanou PKR

Předkládaný vynález se týká in vitro a in vivo metod pro vyhledávání činidel, která působí na virové proteiny obsahující ISDR a na interakci těchto proteinů s IFN-indukovanou PKR proteinkinasou.

Způsoby pro stanovení potenciálu činidel narušovat nebo ovlivňovat účinky viru na translaci mohou být navrženy na základě • ·

• 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 · · · · 4 · *444 444 44 ·44 44 44 objevu vynálezců, že NS5A přímo interaguje s PKR a že pro tuto interakci jsou nutné ISDR a katalytická doména PKR. Způsoby pro stanovení potenciálu činidel narušovat nebo ovlivňovat účinky viru na translaci mohou být dále navrženy na základě objevu vynálezců, že NS5A se váže na dimerizační doménu PKR, aminokyseliny 244-296, což vede k inhibici a represi funkce PKR. Mnoho metod známých v oboru může být snadno adaptováno pro detekci interference s interakcí těchto složek. Například aktivace katalytické aktivity PKR proteinkinasy v odpovědi na testovací činidlo bude ukazovat na schopnost činidla interferovat s inhibici PKR způsobenou NS5A.

Vyšetřování může být provedeno přidáním testovaného činidla k intaktním buňkám, které byly infikovány virem, a potom vyšetřováním vybraných složek jakýmkoliv způsobem, který je známý pro demonstrování účinku viru na tuto složku. Alternativně může být vyšetřování provedeno přidáním testovaného čnidla do translační reakce in vitro a potom zpracováním známou analýzou. V jiném alternativním způsobu mohou být přečištěné nebo částečně přečištěné složky, o kterých bylo určeno, že interagují navzájem, umístěny v podmínkách, při kterých tyto složky normálně interagují, s a bez přidání testovaného činidla, a potom může být známými způsoby analyzována interakce mezi složkami pro hodnocení vlivu testovaného Činidla. V tomto přístupu mohou být přečištěné nebo částečně přečištěné složky připraveny frakcionací extraktů z infikovaných a neinfikovaných buněk nebo mohou být získány expresí klonovaných genů nebo cDNA nebo jejich fragmentů, po které volitelně následuje přečištění exprimovaného materiálu.

Mezi mnoha selekčními metodami in vitro je několik typů metod, které jsou vhodné a/nebo použitelné pro vyšetřování testovaných činidel. Mezi tyto metody patří například metody měřící vazebné interakce mezi dvěma nebo více složkami, metody, které měří

999 9 · ··

9 9

9 999 • 9 9 9

9 9 9

9 · · • · · · • · · · aktivitu enzymu, který je jednou z interagujících složek a metody, které měří aktivitu nebo expresi reporterového proteinu, kterým je enzym nebo jiný detekovatelný nebo selektovatelný protein, který byl umístěn pod kontrolou jedné ze složek.

Vazebné interakce mezi dvěma nebo více složkami mohou být měřeny různými způsoby. Jedním přístupem je označení jedné složky snadno detekovatelným značícím činidlem, umístění označené složky s druhou složkou v podmínkách, při kterých normálně interaguji, provedení separace, při které je separována navázaná označená složka od nenavázané označené složky a potom měření množství navázané složky. Účinek testovaného činidla ve vazebné reakci může být stanoven srovnáním množství označené složky, která se naváže v přítomnosti tohoto činidla, s množstvím navázaným za nepřítomnosti tohoto činidla.

Separace v tomto postupu může být provedena různými způsoby. V jednom přístupu může být vazebný partner pro značenou složku před vazebnou reakcí imobilizován na pevné fázi a nenavázaná označená složka může být odstraněna po vazebné reakco promytím pevné fáze. Navázání vazebného partnera na pevnou fázi mže být provedeno různými způsoby, které jsou v oboru známé, včetně například chemické zkřížené vazby, nespecifické adhese na plastový povrch, interakce s protilátkou navázanou na pevnou fázi, interakce mezi ligandem navázaným na vazebného partnera (jako je biotin) a proteinem vážícím se na ligand (jako je avidin nebo streptavidin) navázaným na pevnou fázi, atd.

Alternativně může být separace provedena po interakci označené sloučeniny s vazebným partnerem v roztoku. Pokud rozdíl velikosti mezi označenou složkou a jejím vazebným partnerem umožňuje takovou separaci, tak může být separace provedena filtrací • 4 · 44 · 4· 4 4 • ••4 · 4 4 4 4 · φ *

44 4 4444

444 4 444 44 4

4 444 4444 •444 444 44 444 44 4· produktů vazebné reakce přes ultrafiltr, jehož póry umožňují průchod nenavázané označené sloučeniny, ale ne vazebného partnera nebo označené sloučeniny navázané na vazebného partnera. Separace může být také provedena za použití jakéhokoliv činidla, které je schopno zachytit vazebného partnera označené sloučeniny z roztoku, jako je například protilátka proti vazebnému partnerovi, protein vážící se na ligand, který může interagovat s ligandem, který byl před tím navázán na vazebného partnera, atd.

Testovací metody, které jsou založeny na měření aktivity enzymu, jsou provedeny podle charkteristik vybraného enzymu. Jak bylo uvedeno výše, mohou být stanoveny různé enzymové aktivity zahrnuté v translačních účincích viru, včetně například kinas, fosfatas, glykosylas, deglykosylas, transferas, lipas, deoxyribonukleas, ribonukleas, proteas, synthetas, polymeras a podobně, stejně jako aktivity enzymů uvedených výše. Obecně vyžaduje měření enzymové aktivity možnost měření produktu reakce za přítomnosti jiných materiálů, a často rozlišení nebo separaci produktu reakce od substrátu pro reakci. Způsoby, které mohou být použity pro měření produktů reakce zahrnují například měření přenosu nebo inkorporace radioaktivně nebo jinak značených atomů nebo skupin, spektrofotometrická nebo kolorimetrická měření koncentrace produktu reakce, měření výdeje světla z luminescentní nebo chemiluminescentní reakce, měření fluorescence fluorescentních produktů, imunotesty, jiné imunochemické postupy a jiné testy využívající kompetitivní vazbu. Enzymová aktivita může být také měřena za použití právě uvedených postupů pro detekci produktu sekundární reakce nebo reakcí, ve kterých je požadovaný reakčí produkt substrátem nebo kofaktorem.

V mnoha případech může být produkt enzymové reakce detekován bez separace tohoto produktu od jiných složek reakční směsi, jak je tomu například v případě, že z bezbarvého chromogenního • * 9 · · ······ • 9 99« 9999 •••9 999 99 ·9· «· 9· substrátu vznikne zabarvený produkt nebo v tom případě, že absorpční spektrum produktu je jiné než absorpční spektrum substrátu, což umožní výběr vlnové délky pro měření absorbance, která měří pouze produkt. Imunotesty, jiné imunochemické postupy a jiné testy kompetitivní vazby mohou být také často provedeny bez separace vybraného produktu.

V jiných případech může být nutné provedení separace produktů od jiných složek reakční směsi před měřením produktu. V takových případech může být nutná separace provedena různými způsoby, včetně například centrifugace, srážení kyselinou trichloroctovou, srážení ethanolem, srážení síranem amonným, vazbou na filtr, jinými diferenciálními sráženími, gelovou filtrací, iontoměníčovou chromatografií, hydrofobní interakční chromatografií, chromatografií na reversní fázi, afinitní chromatografií, diferenciální extrakcí, ísoelektrickým zaměřováním, elektroforesou, isotachoforesou a podobně.

Kromě metod měřících aktivitu enzymu, o kterém se předpokládá, že je zapojen ve virových účincích translace, může být také použita testovací metoda, která je navržena tak, že složka předpokládaná ve virových účincích kontroluje aktivitu nebo expresi reporterového proteinu, t.j. enzymu nebo jiného detekovatelného nebo selektovatelného proteinu. V případě, že ve virových účincích je zapojena například kinasa, může být test navržen tak, že fosforylace určitého proteinu kinasou vede k aktivaci nebo inhibicí takového proteinu nebo jiného proteinu kontrolovaného tímto proteinem. Například v kvasinkách vede fosíorylace eIF2-a GCN2 proteinem (nebo savčí PKR kinasou substituovanou za GCN2) k inhibicí iniciace translace, což vede potom ke zvýšení syntézy GCN4 proteinu, který potom indukuje syntézu dalších proteinů obsažených v biosyntéze aminokyselin. Reportérové proteiny mohou být snadno fúzovány na GCN4 protein ·· · * · ·· • · · • · · • · · ·· ··♦

na genetické úrovni tak, že syntesa těchto reportérových proteinů je účinně indukována počáteční fosforylací katalyzovanou GCN2 nebo savčí PKR.

Podobné způsoby mohou být použity pro detekci modulace různých jiných složek, které se mohou účastnit virových efektů na translaci, testovanými činidly. Vliv testovaných činidel na proteasy, například, může být sledován sledováním přetrvávání reporterového proteinu, který je cílem pro tuto proteasu, v in vitro reakci. Podobně mohou být vlivy testovaného činidla na nukleasu sledovány podle objevení se translační reakce in vitro nebo transkripční - translační reakce in vitro, ve které je reportérovy protein translatován z vhodně uspořádané kódující sekvence účastnící se reakce.

Proteiny vhodné pro použití jako reportérové proteiny v takových testech zahrnují, bez omezení, snadno testovatelné enzymy jako je β-galaktosidasa, luciferasa, S-glukuronidasa, chloramphenikolacetyltransferasa a secernovaná embryonální alkalická fosfatasa; proteiny, pro které jsou snadno dostupné imunotesty, jako jsou hormony a cytokiny; proteiny, které udělují buňkám selektivní růstovou výhodu, jako je adenosindeaminasa, aminoglykosidfosfotransferasa (produkt neo genu), dihydrofolatreduktasa, hygromycin B-fosfotransferasa, thymidinkinasa (pokud je použita s HAT mediem), xantin-guanin fosforibosyltransferasa (XGPRT); a proteiny, které poskytují biochemickou aktivitu chybějící v auxotrofních organismech; proteiny, která způsobují růstovou nevýhodu u buněk, jako jsou například enzymy, které mění netoxické substráty na toxické produkty, jakoje thymidinkinasa (pokud je použita s mediem obsahujícím bromdeoxyuridin) a orotidin-5'-fosfatdekarboxylasa (pokud je použita s kyselinou 5-fluoroctovou); a proteiny, které jsou toxické, jako je ricin, choleratoxin nebo difterický toxin.

Mnoho z metod dosud popsaných pro selekci testovaných činidel obsahuje stanovení vlivu těchto činidel na interakci mezi dvěma nebo více složkami in vitro reakce. Interagujíčí složky mohou být také kontaktovány místo v reakcích in vitro v buňkách. V tomto přístupu je kódující sekvence kódující část nebo celou složku nebo složky vložena do vybraného typu buněk. Kódující sekvence pro tento přístup zahrnují klonované geny nebo cDNA nebo jejich fragmenty nebo fragmenty amplifikované polymerasovou řetězovou reakcí nebo přirozené RNA nebo transkribované RNA a podobně. Existuje několik vatiací tohoto postupu. V jedné variaci je kódující sekvence pro první složku vložena do buňky, o které je známo, že obsahuje složky, se kterými první složka interaguje.

Tak například, kódující sekvence pro virovou složku je vložena do buňky, která je normálním cílem pro infekci vybraným virem.Jsou testovány činidla a jsou vybrána ta činidla, která blokují efekt virové složky v buňce, do které byla vložena kódující sekvence. V jiné variantě mohou být kódující sekvence pro dvě nebo více složek, které interagují navzájem, vloženy do buňky a činidla jsou potom testována na schopnost ovlivňovat interakci mezi těmito složkami, kde tato interakce je sledována známými postupy vhodnými pro tento účel. Buňkou, do které je kódující sekvence vložena, může být buňka, která je normálně cílem pro infekci vybraným virem. Alternativně a výhodně to může být buňka, která může být snadno kultivována, manipulována a testována, jako je například kvasinka. Kromě toho, existují různé výhody při rekonstrukci translačních kontrolních mechanismů v heterologních buňkách, ve kterých jsou interakce mezi složkami snadněji studovatelné než tehdy, jsou-li tyto složky v přirozeném prostředí. V případě kvasinek často umožňují účinné genetické techniky identifikaci a izolaci kvasinkových homologů genů vyšších eukaryotických organismů, která je rychlejší než izolace a identifikace příslušných genů ve vyšších eukaryotických organismech.

Z uvedeného popisu je jasné, že odborník v oboru si může vybrat z mnoha metod v každém stupni identifikace složek zahrnutých v ovlivnění translace virem, v charakterizaci interakcí mezi těmito složkami a v provedení vyhledávacích testů pro výběr sloučenin, které ovlivňují nebo ruší interakce mezi těmito složkami.

Dále je uveden podrobnější popis specifických vyhledávacích testů a souvisejících postupů, které jsou použitelné v předkládaném vynálezu. Je uveden způsob pro vyhledávání činidel účinně interferujících s inhibici PKR proteinkinasy virovými proteiny exprimujícími ISDR. Jak je podrobně uvedeno v příkladu, vybraný systém je takový systém, ve kterém je virus schopen produkovat virový inhibitor, který interferuje s aktivitou interferonem indukované, dvouřetězcovou RNA-aktivované proteinkinasy hostitelské buňky. Jak bylo uvedeno výše, tento příklad nijak neomezuje rozsah vynálezu a pouze dokládá široký rozsah vynálezu.

Způsob obecně obsahuje stupeň inkubace proteinkinasy, virového inhibitoru a testované sloučeniny, za podmínek umožňujících interferenci virového inhibitoru s aktivací prtoeinkinasy, a vyšetření směsi na interferenci. Vynález obsahuje čtyři obecná provedení, jak jsou podrobně uvedena dále.

5.4.1 Vyšetřovací testy in vitro

V jednom příkladu je způsob použit pro skríning sloučenin účinných při inhibici replikace viru v hostitelské buňce, kdeuvedený virus produkuje virový inhibitor, který je schopen vazby na PKR proteinkinasu a blokování její aktivace dvouřetězcovou RNA (dsRNA). Inkubační stupeň zde obsahuje inkubaci směsi za podmínek umožňujících vazbu virového inhibitoru • · · · · ·····> • * ··· · · 9 · ···· ··· ·· «·« ·« na proteinkinasu a vyšetřovací stupeň obsahuje stanovení vazby proteinkinasy na virový inhibitor.

Inkubace může být provedena například v roztoku a vyšetřovací stupeň obsahuje průchod směsi filtrem, který zachycuje virový inhibitor pouze tehdy, je-li navázán na proteinkinasu.

Alternativně může být proteinkinasa navázána na pevný nosič, virový inhibitor může být značen reportérovou sloučeninou a vyšetřovací stupeň může obsahovat měření množství reportérové sloučeniny navázané na pevný nosič.

Alternativně může být inkubace provedena za podmínek , při kterých je proteinkinasa autofosforylovaná, za absence vazby na virový inhibitor, a vyšetřovací stupeň je potom proveden stanovením rozsahu fosforylace PKR kinasy.

Ve druhém příkladu obsahuje inkubační stupeň inkubaci směsi za podmínek účinných pro aktivaci PKR kinasy za absence virového inhibitoru a vyšetřovací stupeň obsahuje stanovení aktivity PKR kinasy za přítomnosti inhibitoru.

Inkubace může být provedena například za použití přečištěné nebo částečně přečištěné PKR kinasy a vyšetření obsahuje měření autofosforylace kinasy nebo fosforylace eIF2-a nebo histonového substrátu pro kinasu.

Alternativně může být inkubace provedena v in vitro translační směsi obsahující PKR kinasu a vyšetření obsahuje měření množství reporterového polypeptidu produkovaného translací specifické mRNA. mRNA může být taková mRNA, jejíž translace je redukována aktivací PKR kinasy, nebo to může být takové mRNA, jejíž translace je zvýšena, jako je například chimérická RNA, jejíž ·· • · · ···· · tf * ·· ♦ · · · • · · · « • · · · · · • · · · · *·· ·· ··

5¹-netranslatovaná vedoucí sekvence je řízena kvasinkovým GCN4 genem.

Ve třetím příkladu je způsob použit pro vyšetřování sloučenin účinných v blokování virové replikace viru, který produkuje virový inhibitor schopný aktivace složky hostitelské buňky, která je v aktivované formě schopna blokovat aktivaci proteinkinasy nebo inhibice aktivované kinasy. Zde obsahuje vytvořená směs složku hostitelské buňky (v aktivované formě), inkubace je provedena za podmínek, při kterých je proteinkinasa aktivována, za absence aktivované složky, a vyšetření obsahuje stanovení inhibice proteinkinasové aktivity ve směsi. Alternativně obsahuje vytvořená směs složku hostitelské buňky v neaktivované formě a virový inhibitor, který aktivuje složku hostitelské buňky, inkubace je provedena za podmínek, při kterých je proteinkinasa aktivována, za absence virového inhibitoru a aktivované složky hostitelské buňky, a vyšetření obsahuje stanovení inhibice proteinkinasové aktivity ve směsi.

5.4.2 Vyšetřovací testy in vivo

Předkládaný vynález se také týká vyšetřovacích testů in vivo vhodných pro identifikaci sloučenin účinně inhibujících replikaci viru v hostitelských buňkách. Pro tyto testy mohou být hostitelské buňky, do kterých jsou přidávány testované sloučeniny, geneticky upraveny tak, aby exprimovaly jak NS5A, tak PKR nebo jejich fragmenty, jak jsou popsané v části 5.2. Exprese NS5A a PKR v hostitelských buňkách může být přechodná, indukovatelná nebo konstitutivní, nebo stabilní. Schopnost testované sloučeniny interferovat s interakcemi NS5A/PKR může být měřena pomocí přidání testované sloučeniny do hostitelské buňky a přímým měřením PKR aktvity, t.j.testem PKR na známém substrátu; nebo nepřímo, t.j. pomocí současné transfekce reporterového genu, • ·· · jehož exprese je závislá na přítomnosti aktivované PKR kinasy.

Pro tyto účely mohou být ve vyšetřovacích testech podle předkládaného vynálezu použity různé hostitelské buňky, včetně, například, buněk tkáňových kultur, savčích buněk, kvasinek a bakterií. Každý typ buněk má své výhody a nevýhody. Savčí buňky, jako jsou například kultivované jaterní buňky, mohou být výhodným typem buněk, na kterých mohou být provedeny testy podle předkládaného vynálezu, ale buňky tohoto typu se někdy obtížně kultivují. Bakterie a kvasinky se relativné snadno kultivují, ale zpracování proteinů se liší od savčích buněk. Vyšetřovací způsob in vivo bude ilustrován na expresním systému s kvasinkami, ale principy postupu mohou být aplikovány na jakékoliv geneticky upravené hostitelské buňky, jak jsou popsány v části 5.2, dále.

V příkladném provedení vynálezu je virový nebo virem aktivovaný inhibitor exprimován ve kvasinkách a je konstruován tak, aby zvyšoval expresi reporterového polypeptidu za přítomnosti aktivované PKR kinasy a vyšetřovací stupeň obsahuje vyšetření kvasinek na zvýšenou expresi reporterového polypeptidu.

Jedním z kvasinkových proteinů, který se účastní kontroly translace, je protein GCN2. Protein je kinasa, která je aktivována vazbou na tRNA bez náboje, která se akumuluje tehdy, je-li nedostatečný přísun aminokyselin. Aktivovaný protein inhibuje translaci ve kvasinkách, prostřednictvím fosforylace α-podjednotky iniciačního faktoru eIF2. Jiným důsledkem aktivace GCN2 je zvýšená produkce kvasinkového proteinu GCN4, který potom aktivuje anabolickou dráhu pro syntézu aminokyselin.

Konstrukt použitý v předkládaném vynálezu pro in vivo skríning je kvasinka, ve které je GCN2 gen nahrazen savčím PKR genem pod kontrolou regulovaného promotoru. Buňka také obsahuje další modifikace popsané dále. Vložení PKR genu do kvasinky může být

provedeno standardními rekombinantními technikami pro vloženívybrané kódující sekvence do kvasinky. Stručně, PKR gen je umístěn pod kontrolu promotoru, jehož účinnost je možno snižovat, a selekce buněk probíhá za stavu se sníženou účinností promotoru. Toto je provedeno proto, že ve kvasinkách je PKR konstitutivně aktivován, pravděpodobně působením dsRNA, a pokud je exprimován v příliš vysokých hladinách, tak inhibuje buněčnou translaci v aktivovaném stavu.

Kvasinky jsou dále konstruovány tak, aby schopny regulace PKR, která je testována stanovením hladin reporterového polypeptidu, jehož produkce je závislá na přítomnosti aktivovaného PKR enzymu. Takový reportér může být produkován z β-gal genu fúsovaného na GCN4 gen kvasinky. GCN4 gen je exprimován při aktivaci GCN2 a bylo prokázáno, že je v kvasinkách, ve kterých by GCN2 nahrazen PKR, pod kontrolou PKR fosforylaČního systému. Proto vede přítomnost aktivované PKR ke snížení celkové translace ve kvasince, ale ke zvýšení produkce fušovaného GCN4/E-gal proteinu. Exprese fušovaného proteinu může být snadno měřena stanovením β-gal aktivity.

Vyšetřovací systém je navržen pro vyhledávání léků, které jsou účinné pro narušení obrany virového patogenu proti pokusu hostitele snížit translaci, který je proveden aktivací PKR proteinu. Virová obrana může obsahovat, mimo jiné, (a) VA1,

EBER-l nebo TAR virovou inhibiční RNA, která obsazuje vazebná místa na PKR a brání vazbě dsRNA na PKR a aktivaci PKR, nebo (b) schopnost viru, například viru chřipky, indukovat nebo aktivovat buněčnou složku, která účině brání aktivaci PKR nebo která deaktivuje aktivovaný enzym, nebo (c) virové proteiny, jako je σ3 protein reoviru nebo K3L a E3L proteiny viru vakcinie, které blokují aktivaci nebo aktivitu PKR, nebo (d) komplex buněčné složky s virovou RNA, jako je komplex využívaný poliovirem pro degradaci PKR kinasy.

V případě virových inhibitorů jsou kvasinky použité pro vyšetřování dále konstruovány tak, že obsahují gen pro virový inhibitor pod kontrolou indukovatelněho promotoru. Za neindukujících podmínek, při kterých není virový inhibitor exprimován (ale PKR protein je), je PKR protein aktivován, pravděpodobně působením endogenní dsRNA, jak bylo uvedeno výše, a přítomnost aktivovaného PKR je manifestována relativně vysokými změřenými hladinami GCN4/S-gal fúsního proteinu. Za indukujících podmínek, například když obsahuje kultivační medium induktor pro indukovatelný promotor, který kontroluje expresi virového inhibitoru, jsou v buňce přítomny nízké hladiny PKR z důvodů působení virového inhibitoru a toto je manifestováno relativně nízkými hladinami GCN4/E-gal fúsního proteinu. Potenciální antivirová činidla jsou testována hodnocením jejich vlivu na hladiny GCN4/S-gal fúsního proteinu za indukujících podmínek pro virový inhibitor. Jsou vybrána ta činidla, která umožňují syntézu relativně vysokých hladin fúsního proteinu, protože se jedná o činidla, která brání interferenci virového inhibitoru s aktivací PKR endogenní dvouřetězcovou RNA.

V případě buněčné složky indukované nebo aktivované virem, která brání aktivaci PKR kinasy nebo která inhibuje aktivovanou kinasu je genpro tuto buněčnou složku umístěn v kvasince použité pro test pod kontrolou indukovatelného promotoru (místo virového inhibitorového RNA genu popsaného výše). Kvasinkový kmen je potom použit pro skríning v podstatě stejně, jak bylo popsáno pro virové inhibitory. Tak není za neindukujících kutivačních podmínek buněčná složka exprimována a jsou pozorovány relativně vysoké hladiny GCN4/S-gal fúsního proteinu, což odráží přítomnost PKR aktivované endogenní dvouřetězcovou RNA. Za indukujících kutivačních podmínek jsou hladiny GCN4/S-gal fúsního proteinu

···· · · · ·· · · · · · nižší, což odráží inhibici aktivace nebo aktivity PKR buněčnou složkou. Potenciální antivirová činidla jsou testována hodnocením jejich vlivu na hladiny GCN4/S-gal fúsniho proteinu za indukujících podmínek pro buněčnou složku a jsou vybrána ta činidla, která umožňují syntézu relativně vysokých hladin fúsniho proteinu.

Podobný způsob je upraven pro případ komplexu mezi buněčnou složkou a virovou složkou, který degraduje PKR kinasu. V tomto případě bude kvasinkový kmen připraven tak, aby obsahoval geny jak pro buněčnou složku, tak pro virovou složku, oba pod indukovatelnou kontrolou, a skríning bude potom proveden v podstatě způsobem uvedeným výše.

Dále uvedené příklady dokresluj i skríningové metody uvedené výše, ale nijak neomezují rozsah předkládaného vynálezu.

5.5 Ovlivnění NS5A v léčbě HCV

Různé techniky a prostředky mohou být použity pro ovlivnění NS5A ve smyslu inhibice jeho aktivity nebo inhibice interakcí mezi NS5A a IFN-indukovanými proteiny, což bude inhibovat infekci HCV.

Například, mezi sloučeniny použitelné v předkládaném vynálezu patří jakákoliv sloučenina, která ovlivňuje NS5A ve smyslu inhibice jeho aktivity nebo inhibice interakcí mezi NS5A a IFN-indukovanými proteiny, včetně, bez omezení, neutralizačních protilátek proti NS5A nebo ISDR. Jiné příklady sloučenin jsou peptidy (jako jsou například peptidy představující ty regiony NS5A, které jsou nutné pro jeho interakci s IFN-indukovanou PKR, jako je ISDR), fosfopeptidy, malé organické nebo anorganické molekuly, nebo protilátky (včetně například polyklonálních,

monoklonálních, humanizovaných, anti-idiotypických, chimérických nebo jednořetězcových protilátek, a Fab, F(ab')₂ a fragmentů Fab expresních knihoven a jejich fragmentů vážící se na epitop).

Techniky pro stanovení účinných dávek a podání takových sloučenin jsou popsány dále, v části 5.6., dále.

Dále patří mezi sloučeniny použitelné v předkládaném vynálezu intracelulární léčiva, která inhibují aktivitu NS5A kompetitivní ligandy, které brání interakci IFN-indukované PKR s NS5A.

Postupy genové terapie mohou být také použity v předkládaném vynálezu pro inhibici interakcí NS5A a IFN-indukovaných proteinů. Mezi sloučenin, které mohou narušit interakci NS5A,zejména ISDR, s jejich buněčnými cíly, patří protismyslné molekuly, ribozymové a trojšroubovicové molekuly. Takové molekuly jsou navrženy tak, aby inhibovaly expresi cílového genu, NS5A, v HCV-infikovaných hostitelských buňkách. Techniky pro produkci a použití protismyslných, ribozymových a/nebo troj šroubovícových molekul jsou v oboru dobře známé a mohou být navrženy s ohledem na nukleotidovou sekvenci kódující aminokyselinovou sekvenci ISDR, jak je uvedena na obr. IA.

Protismyslné DNA a RNA molekuly přímo blokují translaci mRNA prostřednictvím hybridizace na cílovou mRNA a bráněním translace proteinu. Při použití protismyslné DNA jsou preferovány oligodeoxynukleotidy získané z iniciačního místa pro translaci, například -10 až +10 regionů vybrané nukleotidové sekvence cílového genu.

Ribozymy jsou enzymatické RNA molekuly schopné katalyzovat specifické štěpení RNA. (Pro přehled viz Rossi, J., 1994, Current Biology 4: 469-471). Mechanismus účinku ribozymů obsahuje

sekvenčně specifickou hybridizaci ribozymové molekuly na komplementární cílovou RNA, po čemž následuje endonukleolytické štěpení. Ribozymové molekuly musí obsahovat jednu nebo více sekvencí komplementárních k mRNA cílového genu, a musí obsahovat dobře známou katalytickou sekvenci odpovědnou za štěpení mRNA.

Pro tyto sekvence viz U.S. patent č. 5093246, který je zde uveden jako odkaz ve své úplnosti. Předkládaný vynález zahrnuje geneticky upravené ribozymové molekuly obsahující hammerhead motiv, které specificky a účině katalyzují endonukleolytické štěpeni RNA sekvencí kódujících proteiny cílového genu.

Specifická štěpící místa pro ribozym v jakémkoli potenciálním RNA cíly jsou nejprve identifikována skenováním vybrané molekuly na štěpící místa pro ribozym, která obsahují sekvence GUA, GUU a GUC. Po identifikaci mohou být krátké RNA sekvence o 15 - 20 ribonukleotidech odpovídající regionu cílového genu obsahujícího štěpící místo vyšetřovány na předpokládané strukturální vlastnosti, jako je sekundární struktura, která může způsobit nepoužitelnost oligonukleotidu. Vhodnost vybrané sekvence může být také hodnocena testovánímjeji přístupnosti pro hybridizaci s komplementárními oligonukleotidy, za použití ribonukleasových ochranných testů.

Molekuly nukleové kyseliny, které jsou použity pro tvorbu trojšroubovice pro inhibicí transkripce, by měly být jednořetězcová a měly by se skládat z deoxynukleotidů. Složení baží těchto oligonukleotidů musí být navrženo tak, aby vyvolávaly tvorbu troj šroubovice podle Hoogsteenových pravidel párování baží, která obecně vyžadují přítomnost dostatečně dlouhých řetězců purinů nebo pyrimidinů na jednom řetězci dvoušrobovice. Nukleotidové sekvence mohou být pyrimidinové, což vede ke vzniku tripletů TAT a CGC* ve třech asociovaných řetězcích výsledné trojšroubovice. Molekuly bohaté na pyrimidiny poskytují baze ·· · · • · · · ·* · • · · ··· · · · · • · · · ···« • · · · · · · · • ·· · · ··· · · ·· komplementární k regionům bohatým na puriny v jednom řetězci dvoujšroubovíce v paralelní orientaci k tomuto řetězci. Kromě toho mohou být molekuly nukleové kyseliny vybrány tak, aby byly bohaté na puriny, například aby obsahovaly řetězec G zbytků. Tyto molekuly budou tvořit trojšroubovici s DNA dvoujšroubovicí, která je bohatá na GC páry, ve které je většina purinových zbytků umístěna na jednom řetězci cílové dvoušrobovice, což vede ke vzniku tripletů GGC ve třech řetězcích výsledné trojšroubovice.

Alternativně může být potenciál sekvencí, které mohou být použity pro tvorbu trojšroubovic, zvýše vytvořením takzvaných serpentinových molekul nukleové kyseliny. Serpentinové molekuly jsou syntetizovány alternujícím 5'-3', 3'-5’ způsobem, takže se její baze párují nejprve s první řetězcem dvoujšroubovice a potom s druhým řetězce dvojšroubovice, což eliminuje nutnost přítomnosti dostatečně dlouhých řetězců purinů nebo pyrimidinů na jednom řetězci dvojšroubovice.

V případech, že jsou zde popsané protismyslné, ribozymové a/nebo trojšroubovicové molekuly použity pro inhibici exprese mutantního genu, tak je možné, že tyto techniky mohou účinně redukovat nebo inhibovat transkripci (trojšroubovice) a/nebo translací (protismyslné molekuly, ribozym) mRNA produkované normálními alelami cílového genu, což může nastat tehdy, je-li koncentrace produktu normálního cílového genu nižší, než je koncentrace nutná pro normální fenotyp. V takových případech mohou být pro zajištění v podstatě normálních hladin aktivity cílového genu vloženy do buněk technikami genové terapie molekuly nukleové kyseliny kódující a exprimující polypeptidy cílového genu, které mají normální aktivitu cílového genu, takže nejsou obsaženy sekvence citlivé na protismyslné, ribozymové nebo trojšroubovicové molekuly. Alternativně, v případech, kdy cílový gen kóduje extracelulární protein, může být výhodné současné podání normálního proteinu cílového genu, což umožní udržení nutných hladin aktivity cílového genu.

Protismylsné DNA a RNA, ribozymy a trojšroubovice podle předkládaného vynálezu mohou být připraveny jakýmkoliv způsobem známým v oboru pro syntézu molekul DNA a RNA. Tyto způsoby zahrnují techniky pro chemickou syntézu oligodeoxyribonukleotidů a oligoribonukleotidů, které jsou dobře známé v oboru, jako je například fosforoamiditová chemická syntéza na pevné fázi. Alternativně mohou být RNA molekuly připraveny in vitro a in vivo transkripcí DNA sekvencí kódujících protismyslné RNA molekuly. Takové DNA sekvence mohou být vloženy do různých vektorů, které obsahují vhodné promotory pro RNA polymerasu, jako je T7 nebo SP6 polymerasový promotor. Alternativně mohou být konstrukty obsahující protismyslnou cDNA, která syntetizuje konstitutivně nebo indukovatelně protismyslnou RNA - podle použitého promotoru, stabilně vloženy do buněčných linií.

Mohou být připraveny různé dobře známé modifikace DNA molekul, které zvyšují intracelulární stabilitu a poločas. Možné modifikace zahrnují napříkad přidání sousedních sekvencí ribonebo deoxynukleotidů k 5'- a/nebo 3'-koncům molekuly, nebo použití fosforothioatové nebo 2'-O-methylové vazby místo fosfodiesterasových vazeb, v oligodeoxyribonukleovém skeletu.

5.6 Farmaceutické prostředky a způsoby podání

Předkládaný vynález obsahuje nová antivirová činidla identifikovaná vyšetřovacími technikami podle předkládaného vynálezu ve farmaceutických prostředcích a terapeutické způsoby pro léčbu virových infekcí za použití proteinů obsahujících ISDR jako cílů pro intervenci. V jednom provedení předkládaného vynálezu mohou být nová antivirová činidla identifikovaná • · vyšetřovacími testy podle předkládaného vynálezu použita v kombinaci s jinými známými antivirovými činidly pro léčbu virové infekce.

5.6.1 Antivirová činidla použitelná v kombinaci s inhibitory NS5A

Podle předkládaného vynálezu mohou být nová antivirová činidla identifikovaná vyšetřovacími testy podle předkládaného vynálezu použita v kombinaci s jinými terapeutickými činidly pro zvýšení antivirového účinku. Výhodně je inhibitor NS5A použit v kombinaci s jiným antivirovým činidlem. V jiném provedení předkládaného vynálezu může být činidlo, které indukuje expresi IFN v takovém množství, že je překonána inhibice PKR způsobená NS5A, použito v kombinaci s jiným antivirovým činidlem. Mezi taková činidla, která mohou být použita s inhibitorem NS5A, patří například činidla, která působí na jiné cílové molekuly účastnící se replikace viru, jako jsou například inhibitory preferenční translace; činidla, která působí na jiné cílové molekuly účastnící se přenosu viru; činidla působící na jinou oblast stejné molekuly; a činidla bránící vzniku nebo redukující vznik resistence viru. Odborníkům v oboru budou známa mnohá taková činidla, která mají výše uvedené mechanismy účinku.

V jednom provedení předkládaného vynálezu mohou být nová antivirová činidla identifikovaná vyšetřovacími testy podle předkládaného vynálezu použita v kombinaci s terapií IFN. Antivirová činidla identifikovaná vyšetřovacími testy podle předkládaného vynálezu mohou být také použita v kombinaci s exogenními nebo endogenními činidly, které indukují expresi IFN.

V ještě jiném provedení jsou inhibitory NS5A použity v kombinaci s inhibitory preferenční translace proto, aby bylo působeno na dvě různé molekuly nutné v životním cyklu viru.

Pro hodnocení terapeutické účinnosti inhibitorů NS5A v kombinaci s antivirovými činidly popsanými výše mohou být tyto kombinace testovány na jejich antivirovou účinnost způsoby známými v oboru.

Sloučenina podle předkládaného vynálezu může být podána člověku samostatně nebo ve farmaceutickém prostředku, ve kterém je smísena s vhodnými nosiči nebo přísadami, a je podána v dávce účinné pro léčbu nebo zmírnění různých stavů při infekci HCV. Termín terapeuticky účinná dávka označuje takové množství sloučeniny, které je dostatečné pro inhibici infekce HCV. Terapeuticky účinná dávka může být podána samostatně nebo jako pomocná terapie v kombinaci s jinou léčbou pro HCV infekci nebo doprovodné choroby. Techniky pro přípravu farmaceutických prostředků a pro podání sloučeniny podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny například v Remington¹s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA, poslední vydání.

5.6.2 Způsoby podání

Mezi vhodné způsoby podání patří například orální, rektální, transslizniční nebo střevní podání; parenterální podání, včetně intramuskulárního, subkutáního, intramedullárního, stejně jako intrathekálního, přímého íntraventrikulárního, intravenosního, intraperitoneálního, intranasálního, nebo intraokulárního injekčního podání, a volitelně mohou být podávané prostředky v depotní formě nebo ve formě s oddáleným uvolňováním.

Dále je možné podání činidel podle předkládaného vynálezu v systému pro cílené podání léků, jako jsou například liposomy určené pro podání do jater. Liposomy jsou potom selektivně vychytávány v jaterních buňkách.

5.6.3 Prostředky/příprava prostředků

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu mohou být vyrobeny známým způsobem, například běžným míšením, rozpouštěním, výrobou dražé, levitací, emulsifikací, výrobou kapslí, zachycením v určitých strukturách nebo lyofilizací.

Farmaceutické prostředky podle předkládaného vynálezu tak mohou být vyrobeny známým způsobem za použití jednoho nebo více farmaceuticky přijatelných nosičů obsahujících přísady a pomocná činidla, která usnadňují zpracování aktivních sloučenin do přípravků, které mohou být použity farmaceuticky. Vlastní výroba je závislá na vybraném způsobu podání.

Pro injekce jsou činidla podle předkládaného vynálezu připravena ve vodných roztocích, výhodně vě fyziologicky přijatelných pufrech, jako je Hankův roztok, Ringerův roztok nebo fyziologický roztok. Pro slizniční podání jsou v prostředku použita činidla umožňující penetraci aktivních složek přes sliznici. Taková činidla jsou v oboru známá.

Pro orální podání mohou být sloučeniny snadno připraveny smísením aktivních sloučenin s farmaceuticky přijatelnými nosiči, které jsou dobře známé v oboru.

Takové nosiče umožňují přípravu sloučenin podle předkládaného vynálezu ve formě tablet, pilulek, dražé, kapslí, roztoků, gelů, sirupů, kaší, suspenzí a podobně, vše pro orální podání pacientům. Farmaceutické prostředky pro orální podání mohou být získány za použití přísady v pevné formě, volitelně rozemletím získané směsi a zpracováním směsi granulí, po přidání vhodných pomocných přísda, pokud je to vhodné, na tablety nebo jádra dražé. Vhodnými přísadami jsou, například, plnidla jako jsou tt · * · · · · · · • · · · · · · · · · · · • · · · · · « » · • · · · · ······ • 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 999 99 99 cukry, včetně laktosy, sacharosy, manitolu nebo sorbitolu; přípravky celulosy, jako je například kukuřičný škrob, pšeničný škrob, rýžový škrob, bramborový škrob, želatina, tragant, methylcelulosa, hydroxypropylmethylcelulosa, karboxymethylcelulosa sodná, a/nebo pólyvinylpyrrolidon (PVP).

9 »9 «9 9· · «

9 9 9

9 9 9 •999 9·· 99 ·· 99 > ·· 9 ► 9 9 9 * 9 9 9 » 9 9 9 • 9 99 směs sloučeniny a vhodné práškové baze, jako je laktosa nebo škrob. Sloučeniny mohou být připraveny pro parenterální injekční podání, například bolusovou injekcí nebo kontinuální infusí. Prostředky pro injekce mohou být připravyny v jednotkových dávkových formách, například v ampulích, nebo v zásobnících obsahujících více dávek, ve kterých je přidáno konzervační činidlo. Tyto prostředky mohou být ve formě suspenzí, roztoků nebo emulzí v olejových nebo vodných vehikulech a mohou obsahovat suspendační, stabilizační a/nebo dispergační činidla.

Farmaceutické prostředky pro parenterální podání zahrnují vodné roztoky aktivních sloučenin ve formě rozpustné ve vodě.

Dále mohou být připraveny suspenze aktivní sloučeniny jako vhodné olejové injekční suspenze. Mezi vhodná lipofilní rozpouštědla nebo vehikula patří oleje jako je sesamový olej, nebo syntetické estery mastných kyselin, jako je ethyloleat nebo triglyceridy, nebo liposomy. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat substance, které zvyšují viskozitu suspenze, jako je karboxymethylcelulosa sodná, sorbitol nebo dextran. Volitelně mohou suspenze obsahovat vhodná stabilizační činidla nebo činidla, která zvyšují rozpustnost sloučenin, což umožní přípravu vysoce koncentrovaných roztoků.

Alternativně může být aktivní složka ve formě prášku pro rekonstituci vhodným vehikulem, například sterilní apyrogenní vodou, před použitím.

Sloučeniny mohou být také připraveny ve formě prostředků pro rektální podání, jako jsou čípky nebo rektální nálevy, a mohou obsahovat například vhodné čípkové baze, jako je kakaové máslo nebo jiné glyceridy.

Kromě prostředků popsaných výše mohou být sloučeniny také ·· · *· 9 tt 99 • ··· 9 9 99 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 • · 9 9 9 9 9 9 9

9999 999 99 ··· ·· ·· připraveny ve formě depotních prostředků. Takové dlouhodobě působící prostředky mohou být podány implantací (například subkutánní nebo intramuskulární implantací), nebo intramuskulární injekcí. Sloučeniny mohou být například připraveny s vhodným polymerickým nebo hydrofobním materiálem (například jako emulze v přijatelném oleji) nebo s iontoměničovou pryskyřicí, nebo jako pomalu rozpustné deriváty, například jako pomalu rozpustné sole.

Liposomy a emulse jsou dobře známými příklady vehikul nebo nosičů pro hydrofobní léky. Mohou být také použita některá organická rozpouštědla, jako je dimethylsulfoxid, ačkoliv obvykle zvyšují toxicitu. Dále mohou být sloučeniny podány za použití systému se zpomaleným uvolňováním, jako jsou semipermeabilní matrice ze solidních hydrofobních polymerů obsahujícíterapeutické činidlo. Byly vyvinuty různé materiály se zpomaleným uvolňováním a j sou v oboru dobře známé. Kapsle se zpomaleným uvolňováním mohou - podle svého cehmického charakteru - uvolňovat sloučeniny po dobu několika týdnů až 100 dnů. V závislosti na chemickém charakteru a biologické stabilitě terapeutických činidel mohou být vyvinuty další strategie pro stabilizaci proteinu.

Farmaceutické prostředky mohou také obsahovat pevné nebo gelové nosiče nebo přísady. Příklady takových nosičů nebo přísad zahrnují například uhličitan vápenatý, fosforečnan vápenatý, různé cukry, škroby, deriváty celulosy, želatinu a polymery jako j sou polyethylenglykoly.

Mnoho ze sloučenin podle předkládaného vynálezu identifikovaných jako inhibitory interakce mezi NS5A a IFN-indukovanou PKR může být připraveno ve formě soli s farmaceuticky přijatelnými ionty. Farmaceuticky přijatelné soli mohou být tvořeny s mnoha kyselinami, včetně například kyseliny chlorovodíkové, sírové, octové, mléčné, vinné, jablečné,

jantarové atd.; nebo se zásadami. Soli jsou obvykle lépe rozpustné ve vodných nebo jiných protonických rozpouštědlech než příslušné volné baze. Příklady farmaceuticky přijatelných solí, nosičů nebo přísad jsou v oboru dobře známé a jsou uvedeny například v Remington's Pharmaceutical Sciences, 18. vydání,

A.R. Genaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990. Mezi takové soli patří například sodné, draselné, lithné, vápenaté, hořečnaté soli, soli železa, zinku, hydrochloridové, hydrobromidové, hydrojodidové, octanové, citratové, vinanové, jablečnanové soli a podobně.

5.6.4 Účinné dávkování

Farmaceutické prostředky vhodné pro použití v předkládaném vynálezu zahrnují prostředky, ve kterých jsou aktivní složky obsaženy v účinném množství pro zamýšlený účel. Přesněji, terapeuticky účinné množství označuje množství účinné pro prevenci vzniku nebo pro zmírnění existujících příznaků u léčeného jedince. Stanovení účinných množství je odborníkům v oboru známé, zejména s ohledem na zde uvedený podrobný popis.

Pro jakoukoliv sloučeninu použitou ve způsobu podle předkládaného vynálezu může být terapeuticky účinné množství stanoveno nejprve z testů na buněčné kultuře. Data z těchto testů mohou být použita pro stanovení přesnějších dávek pro člověka.

Terapeuticky účinné množství označuje takové množství sloučeniny, které vede ke snížení intenzity infekce nebo ke zmírnění příznaků nebo prodloužení přežívání pacienta. Toxicita a terapeutická účinnost takových sloučenin může být stanovena standardními farmaceutickými, farmakologickými a toxikologickými postupy provedenými na buněčných kulturách nebo na pokusných zvířatech, například pro stanovení LD_so (dávky letální pro 50% ·· · *· · ·« ·« • · · · · · · · β 9 9 · ♦ · 9 9 9 9 9 9 9 • ··»· 9 9 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9 9 9 ·

9999 ··· ·· 999 99 99 populace) a ED_sq (dávky terapeuticky účinné v 50% populace).

Poměr dávek mezi toxickými a terapeutickými účinky je terapeutický index a může být vyjádřen jako poměr mezi LD_so a ED_sq. Výhodné jsou ty sloučeniny, které mají vysoký terapeutický index. Data získaná z testů na buněčných kulturách a studií na zvířatech mohou být použita pro stanovení rozsahu dávek pro člověka. Dávkování takových sloučenin spočívá výhodně v rozmezí cirkulujících koncentrací, které zahrnují ED_so, s malou nebo žádnou toxicitou. Dávkování se může v tomto rozmezí značně lišit, v závislosti na použité dávkové formě a na způsobu podání. Přesná dávková forma, způsob podání a dávkování může být vybráno lékařem podle stavu pacienta. (Viz například Fingl et al., 1975, v The Pharmacological Basis of Therapeutics, kap. 1, str. 1).

Velikost dávky a interval mohou být individuálně upraveny tak, aby byly dosaženy takové plasmatické koncentrace aktivní složky, které jsou dostatečné pro udržení požadovaných modulačních účinků, neboli minimální účinné koncentrace (MEC). MEC se liší pro každou sloučeninu, ale může být stanovena z in vitro dat; například jako koncentrace nutná pro dosažení 50-90% inhibice infekce HCV, která je stanovena pomocí testů, které jsou zde popsány. Dávky nutné pro dosažení MEC budou záviset na charakteristikách jedince a na způsobu podání. Nicméně, pro stanovení plasmatických koncentrací mohou být použity HPLC testy, biotesty nebo imunotesty.

Intervaly mezi dávkami mohou být také stanoveny pomocí MEC. Sloučeniny by měly být podávány v takové režimu, který bude udržovat plasmatické koncentrace vyšší než MEC po 10-90% doby, lépe po 30-90% doby a nejlépe po 50-90% doby.

V případech lokálního podání nebo selektivního vychytávání nemusí účinné lokální koncentrace odpovídat plasmatické »· • · · ·· · • · ·« • · · • « 999 9 · »· • V 99 • * · » • 9 9 « « · · a • ta ·

9 9 9 koncentraci.

Dávka podané sloučeniny bude samozřejmě záviset na léčeném jedinci, na jeho hmotnosti, závažnosti postižení, způsobu podání a na rozhodnutí ošetřujícího lékaře.

Při imunizaci bude množství imunogenu a imunizační protokol určen odborným lékařem a imunogen bude podáván podle imunitní odpovědi a titru protilátek hostitele.

5.6.5 Balení

Prostředky mohou být - pokud je to žádoucí - obsaženy v balení nebo zásobním prostředku, který může obsahovat jednu nebo více jednotek dávkové formy obsahující aktivní složku. Balení může například obsahovat kovovou nebo plastovou folii, jako je blistrové balení. Balení nebo zásobní prostředek může obsahovat příbalvý leták. Také mohou být připraveny sloučeniny podle předkládaného vynálezu připravené v kompatibilním farmaceutickém nosiči, umístěné ve vhodném zásobníku a označené pro léčbu uvedených stavů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: NS5A a PKR interaguj i in vitro

Následující pokusy in vitro demonstrují, že HCV protein NS5A se asociuje s interferonem indukovanou PKR in vitro a tyto pokusy bylo provedeny pro testování hypotézy, že HCV NS5A přímo potlačuje aktivitu PKR prostřednictvím fyzikální interakce s kinasou.

44	4		• 4		•	44
4 4	44	•		•	44	•	4	•
•	4	4		4	•	»	4	4
4	4	•		•	•	•	4	4
4444	• 44		44		444	44

1. Materiály a metody

Konstrukce plasmidů: Při výrobě přirozených HCV la NS5A konstruktů byl kompletní kódující region pro NS5A z pSPns% (HCV-la) amplifikován PCR za použití oligonukleotidových primerů A, 5’-GGAATTCGAGCTCGCCCG a B, 5'-GCTCTAGAAGCACACGACATCTTC (místa pro EcoRI a Xbal jsou podtržena). Výsledný produkt byl přímo klonován do pCR2.1 (Invitrogen) za zisku plasmidů pNS5A/CR2.1. Kódující region pro NS5A byl odstraněn z pNS5A/CR2.1 jako EcoRI fragment pro inserci do pBD (Stratagene) za zisku pBD-NS5A, nebo jako EcoRI-Xbalfragment pro inserci do pcDNA3.l/His a pYES2 (Invitrogen), za zisku pcDNA3.1/His-NS5A a pYES2-NS5A, v příslušném pořadí. Pro přípravu ISDR delečních mutantů NS5A byly připraveny jednotlivé N-koncové a C-koncové kódující fragmenty, každý bez ISDR. N-koncový region, kódující aminokyseliny 1-236, byl amplifikován PCR za použití primerů A a primerů C, 5'CCACTCGAGCGGACAGTTGGCTGG (místo pro Xhol je podtrženo).

C-koncový region, kódující aminokyseliny 278-447, byl amplifikován PCR za použití primerů B a primerů D, 5'CCGCTCGAGTGGTGATTCTGGTCTC (místo pro Xhol je podtrženo). Výsledné PCR produkty byly klonovány přímo do pCR2.1 za vzniku pN/CR2.1 a pC/CR2.1, v příslušném pořadí. N-koncový kódující region NS5A byl potom odstraněn z pN/CR2.1 pro inserci do pcDNA-3.l/His za vzniku pcDNA-3.1/His-NS5A 1-236. ISDR deleční konstrukt byl připraven inserci C-terminálního kódujícího fragmentu do Xhol a Xbal míst pcDNA-3.1/His-NS5A 1-236 fušovaného v čtecím rámci s aminokyselinami 278-447, čímž byla provedena delece celého ISDR. Insert z pcDNA-3.l/His- ISDR byl potom subklonován do 2μ kvasinkových expresních vektorů pBD a pYES2, za zisku pBD- ISDR a pYES2- ISDR, v příslušném pořadí. Pro získání NS5A kódujícího regionu z HCV-lb byla virová RNA extrahována ze 100 μΐ séra (Chomczynski and Sacchi, 1987, Anal. Biochem. 162: 156-159) získaného za informovaného souhlasu od pacientů s genotypem lb, kteří selhali v odpovědi na IFN. Odpověď na IFN byla stanovena

RT-PCR a bDNA testy, jak byly dříve popsány (Gretch et al., 1993,

J. Clin. Micro. 31: 289-291). Verifikace HCV genotypu byla provedena kombinací RFLP a genotypově specifické PCR analýzy virového 5'-netranslatovaného regionu a sekvence kódující jaderný protein, v příslušném pořadí (Davídson et al., 1995, J. Gen.

»1

Virol. 76: 1197-1204; Okamoto et al., 1992, J. Gen. Virol. 73: 673-679) . Virová cDNA byla syntetizována reversní transkripcí za použití primeru 5'-GTGGTGACGCAGCAGAGAGT (který odpovídá nukleotidům 7681-7700 HCV-J (Bukh et al., 1995, Semin. Liver Dis. 15: 41-63), po které následovalo první kolo PCR za přidání kódujícího primeru 5'- CAGCCTCACCATCACTCAGC (který odpovídá nukleotidům 6256-6275 HCV-J). Pro přímé klonování NS5A byly produkty prvního kola PCR dále amplifikovány za použití sady oligonukleotidových primerů specifických pro NS5A

5'-CCTTCCATGGGCTCCGGCTCGTGGCTAAAG a 5'-ATCGGATCCTTAGGACATTGAGCAGCAGACGA {místa pro Ncol a BamHl jsou podtržena, v příslušném pořadí). Po trávení restrikčními enzymy byly přečištěné produkty PCR klonovány do příslušných míst pACT2 (Clontech) za vzniku pAD-NS5A, který kóduje AD-NS5A fúsní prtoein odpovídající HCV-lb. Ačkoliv vztahy mezi ISDR a aminokyselinovou sekvencí HCV-la a sensitivitou na IFN nebyly přesně stanoveny, má tento region NS5A (aminokyseliny 237-276) významnou identitu aminokyselin s prototypem ISDR sekvence resistentní na IFN, jak byla definována výše (Enomoto et al., 1996, N. Engl. J. Med. 334: 77-81; Enomoto et al., 1995, J. Clin. Invest. 96: 224-230) a které je přítomná v našem klonu HCV-lb NS5A (obr. IA). Konstrukce PKR plasmidů PBD PKR K296R, pAD-PKR aa konstrukty K296R, 1-242, 244-551, 244-366, 367-551 a pAD-p58^XI?Kwt byly popsány dříve (Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). pBD-PKR 99-551 byl konstruován odstraněním 1,6 kb Ndel/BamHI fragmentu z ρΕΤΙΙΑ-PKR M7 (Barber et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15: 3188-3146) a jeho klonováním • · do odpovídajícího místa pGBTlO (Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). pEMBLYex4-K3L obsahuje celý K3L gen viru vakcinie insertovaný do pEMBLYex4 a je popsán ve zvláštním spisu. GST-NS5A byl připraven vložením BamHl fragmentu z NS5A pSPns5 klonu HCV-la do plasmidu pGEX2T (Smith and Johnson, 1988, Gene 67: 31-40) za zisku pGST-NS5A. Tento konstrukt kóduje aminokyseliny 1-427 NS5A a je fúsován ve čtecím rámci s glutathion-S-transferasou. Nukleotidové sekvence všech konstruktů použitých v této studii byly potvrzeny analýzou sekvence dvouřetězcové DNA provedené na automatickém sekvenátoru (Applied Biosystems).

Analýza proteinových interakcí in vitro: E. coli nesoucí pGEX2T nebo pGST-NS5A byly kultivovány v kapalné kultuře a exprese GST nebo GST-NS5A byla indukována přidáním isopropylthiogalaktopyranosidu do kultivačního media. Bakterie byly sklízeny a byly připraveny extrakty pro analýzu vazby (Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). Pro vazebné analýzy byla exprese GSTr nebo GST-NS5A potvrzena v rekombinantních extraktech imunobotovou analýzou za použití buď GST-specifického antiséra, nebo antiséra specifického pro fúsní protein superoxiddismutasa-NS5 (anti-NS5; Chiron Corporation). Pozitivní rekombinantní extrakty byly použity pro vazebnou analýzu in vitro. Přirozená lidská PKR a deleční mutanty PKR byly in vitro transkribovány z T7 promotoru pcDNAlneo a byly tranlatovány za přítomnosti [^3sS]-methioninu, jak bylo popsáno dříve (Katze et al., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 5497-5505). Pro in vitro vazebné analýzy bylo přibližně 1 x 10^s materiálu vysrážitelného kyselinou trichloroctovou z každé translační reakce přidáno k surovým E. coli extraktům obsahujícím buď GST, nebo GST-NS5A a tento materiál byl zpracován způsobem popsaným výše (Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16:

4172-4181).Značené proteiny, které se vázaly na GST nebo • ·

GST-NS5A, byly separovány SDS-PAGE a byly vizualizovány autoradiografii sušeného gelu.

In vitro test funkce PKR: Pro PKR in vitro kinasové testy byl GSTNS5A přečištěn z E. coli extraktů pomocí glutathion-agarosové afinitní chromatografie. Přirozená PKR byla afinitně přečištěna z lidských 293 buněk ošetřených IFN (Galabru and Hovanessian, 1987, J. Biol. Chem. 262: 15538-15544). Koncentrace všech přečištěných proteinů byla hodnocena kvantitativní SDS-PAGE za použití BSA jako standardu. In vitro kinasové testy byly provedeny popsaným způsobem (Tang et al., 1996, J. Biol. Chem.) s tou výjimkou, že PKR byla pre-inkubována se stoupajícími koncentracemi GST nebo GST-NS5A před přidáním histonových substrátů a [³²P]-rATP. Produkty kinasové reakce byly separovány SDS-PAGE a vizualizace fosforylováných substrátů byla provedena autoradiografií sušeného gelu. Bylo prokázáno již dříve, že existuje přesná korelace mezi fosforylací histonů a aktivací eIF-2a PKR in vitro (Katze et al., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 5497-5505).

6.2. Výsledky

NS5A získaný z HCV-la (obr. 1) byl použit pro testování schopnosti NS5A přímo interagovat s PKR. NS5A připravený jako fúsní protein s glutathion-S-transferasou (GST) v E. coli (GST-NS5A) specificky interagoval s in vitro translatovanou kompletní PKR, jak bylo stanoveno v testu snížení GST. Jak je uvedeno na obr. 2, aminokyseliny 244-551 PKR byly nutné a dostatečné pro tvorbu komplexů s GST-NS5A. Tak může rekombinantní NS5A specificky tvořit komplexy s PKR in vitro, když interaguje s katalytickou doménou PKR obsaženou v C-konci.

Příklad 2: NS5A interaguje s katalytickou doménou PKR kinasy in vivo

Následující pokusy byly provedeny pro stanovení interakcí mezi NS5A a PKR in vivo.

1. Materiály a metody

Analýza proteinových interakcí in vivo: Pro analýzu proteinových interakcí byly ve dvouhybridním testu použity kvasinky kmene Saccharomyces cerevisiae Hf7c (MATa ura 3-52 his 3-200 lys 2-801 ade 2-101 trp 1-901 lea 2-3, 112 gal 14-542 LYS2::GAL1-HIS3 URA3::(GAL4 17-mery)₃-cycl-lacZ) (Fields and Song, Nátuře 340: 245-246). Ve dvouhybridním testu a za použití kvasinek popsaných dále byly buňky transfektovány uvedenými expresními konstrukty lithiumacetatovou metodou. Pro dvouhybridní analýzu byla nejprve verifikována exprese AD- a BD- fúsních proteinů v transfektováných kvasinkových klonech imunoblotovou analýzou za použití anti-AD nebo anti-BD monoklonálních protilátek (Clontech), podle návodu výrobce. V kvasinkách kmene Hf7c je syntéza histidinu závislá na interakci 2-hybridních proteinů. Proto budou za přítomnosti interakce dvouhybridního proteinu kvasinky růst na mediu bez histidinu. Syntéza HIS reporterového proteinu byla použita pro testování interakce 2-hybridního proteinu, za použití nedávno popsaného způsobu (Gale, Jr., et al., 1996, výše). Počáteční transfektanty byly selektovány na SD mediu bez aminokyselin Trp a Leu (+His medium). Potom byly transfektanty přeneseny na SD medium bez aminokyselin His, Trp a Leu (-His medium) a byly kultivovány po dobu 3-6 dnů pro depleci zbytkového histidinu. Kolonie byly znovu přeneseny na -His medium a jejich růst byl vyšetřován po 3-7 dnech. Indukce exprese reporterového genu v našich 2-hybridních kvasinkových klonech byla potvrzena měřením LacZ exprese za použití testu v • · kapalině a fluorogenního substrátu 4-methylumbelliferyl-S-galaktosidu (MUG), jak byl popsán dříve (Cao and Gebale, 1994,

Virology 205: 151-160).

Test potlačení růstu kvasinek pro stanovení funkcí NS5A a PKR in vivo: Pro určení funkcí NS5A a PKR in vivo byl použit kmen Saccharomyces cerevisiae RY1-1 (MATa ura3-52 leu2-3 leu2-112 gcn2 trpí- 63 LEU2::(GAL-CYC1-PKR)₂, který nese 2 kopie lidského genu pro PKR integrovaného do LEU2 lokusu pod kontrolou galaktosou indukovatelného GAL1-CYC promotoru (Romano et al,

1995, Mol. Cell Biol. 15: 365-378). Při růstu v indukujícím mediu má tento kmen fenotyp pomalého růstu z důvodů fosforylace kvasinkového eIF-2o? způsobené PKR. Exprese proteinu byla verifikována imunoblotovou analýzou za použití bud' anti-PKR mAb (Laurent et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 4341-4345) nebo antiséra generovaného proti rekombinantnímu MS5 proteinu (a-MS5). Oba konstrukty, NS5A a ISDR, byly účinně exprimovány z pYes plasmidu. Kromě toho bylo zjištěno, že současná exprese NS5A a ISDR nemá žádný vliv na hladiny PKR, která byla exprimována stejně účinně v obou transfektováných kmenech. Pro hodnocení růstu RY1-1 transfektantů byly kvasinkové kolonie přeneseny na uráčil-deficientní SD medium a SGAL medium popsané Romano et al., (Romano et al., 1995, výše). Růst byl hodnocen 3-7 den po naočkování kolonií.

2. Výsledky

Pro potvrzení a rozšíření těchto výsledků byly provedeny studie interakce NS5A-PKR za použití kvasinkového 2-hybridního systému a hodnocení růstu na histidin-deficitním mediu, který ukazuje na pozitivní interakci 2-hybridního prtoeinu. Pro srovnání byly použity hodnocení interakce p58^IE,:K-PKR, jak byly popsány dříve (Gale, Jr., et al., 1996, výše). Bylo zjištěno, že • · · · · kompletní NS5A z IFN-resistentního izolátu kmene HCV-lb fúsovaný na GAL4 aktivační doménu (AD-NS5A) specificky interaguje s inaktivním kompletním PKR mutantem, PKR K296R a zkráceným mutantem PKR 98-551, které byly všechny fúsovány na GAL4 DNA vazebnou doménu (BD) (Obr. 2). BD-PKR 98-551 postrádá první dsRNA vazebnou doménu (obr. 1B) a je deficientní ve vazbě na dsRNA (Barber et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 3138-3146). Proto může, podobně jako buněčný inhibitor PKR, p58^IFK, NS5A HCV-lb fyzikálně interagovat s PKR. Kromě toho tyto výsledky naznačují, že interakce NS5A-PKR není dějem zprostředkovaným dsRNA.

Schopnost BD-NS5A z izolátu HCV-la interagovat s AD-PKR in vitro za použití 2-hybridního testu, jak je vidět na obr. 4, BD-NS5A z HCV la specificky interaguje s AD PKR K296R ve kvasinkových kotransfektantech, jak je určeno jejich růstem na -His mediu. Proto může NS5A z nezávislých kmenů HCV-la a HCV-lb fyzikálně interagovat s PKR in vivo. Pro určení NS5A interaktivního regionu PKR byla použita serie AD-PKR mutantnů pro transfekci kvasinek nesoucích HCV-la BD-NS5A konstrukt. BD-NS5A specificky interaguje s katalytickou doménou PKR, které je v aminokyselinách PKR 244-366, protože AD-konstrukty PKR 244-551 a PKR 244-366 oba rostou na -His mediu (obr. 4). Poloha NS5A interaktivního regionu PKR byla vyloučena jak v C-koncových 184 aminokyselinách, tak v N-koncových 242 aminokyselinách, protože kvasinkové kotransfektanty nesoucí AD-PKR 367-551 a AD PKR 1-242 nerostly na -His mediu. Tyto výsledky naznačují, že HCV NS5A interaguje se strukturami v katalytické doméně PKR. NS5A interaktivní region PKR (aminokyseliny 244-366) obsahuje region, který interaguje s buněčným inhibitorem PKR, ρ58^Ι3?κ (obr. 1B) (gale, Jr. et al., 1996). Tento region katalytické domény proteinkinasy se účastní vazby nukleotidů a katalýzy (Hanks et al. , 1988, Science 241: 42-52; Bossemeyer, 1995, FEBS. Lett. 369: 57-61; Taylor et al., 1993, Mol. Cell. Biol. 16: 6295-6302).

Příklad 3: NS5A potlačuje funkci PKR

Následující pokusy byly provedeny pro určení toho, zda může vést interakce mezi NS5A a PKR k inhibici funkce PKR.

1. Materiály a metody

Analýza proteinových interakcí in vitro: E. coli nesoucí pGEX2T nebo pGST-NS5A bzlz kultivovánz v kapalné kultuře a exprese GST nebo GST-NS5A byla indukována přidáním isopropylhiogalaktopyranosidu do kultivačního media. Bakterie byly sklízeny a byly připraveny extrakty pro analýzu vazby (Gale Jr. et al., 1996) . Pro vazebné analýzy byla exprese GSTr nebo GST-NS5A potvrzena v rekombinantních extraktech imunobotovou analýzou za použití buď GST-specifického antiséra, nebo antiséra specifického pro fúsní protein superoxiddismutasa-NS5 (anti-NS5; Chiron Corporation). Pozitivní rekombinantní extrakty byly použity pro vazebnou analýzu in vitro. Přirozená lidská PKR a deleční mutanty PKR byly in vitro transkribovány z T7 promotoru pcDNAlneo a byly translatovány za přítomnosti [³⁵S]-methioninu, jak bylo popsáno dříve (Katze et al., 1991, Mol. Cell Biol. 11: 5497-5505). Pro in vitro vazebné analýzy bylo přibližně 1 x 10^s materiálu vysrážitelného kyselinou trichloroctovou z každé translační reakce přidáno k surovým E. coli extraktům obsahujícím buď GST, nebo GST-NS5A a tento materiál byl zpracován způsobem popsaným výše (Gale Jr. et al., 1996).Značené proteiny, které se vázaly na GST nebo GST-NS5A, byly separovány SDS-PAGE a byly vizualizovány autoradiografií sušeného gelu.

In vitro test funkce PKR: Pro PKR in vitro kinasové testy byl GSTNS5A přečištěn z E. coli extraktů pomocí glutathion-agarosové afinitní chromatografie. Přirozená PKR byla afinitně přečištěna z lidských 293 buněk ošetřených IFN (Galabru and Hovanessian, • · · · · · ·· 9 · · • * · · · ··«· • 999 999 ·· 9·· ··

1987, J. Biol. Chem. 262: 15538-15544). Koncentrace všech přečištěných proteinů byla hodnocena kvantitativní SDS-PAGE za použití BSA jako standardu. In vitro kínasové testy byly provedeny popsaným způsobem (Tang et al., 1996, J. Biol. Chem.) s tou výjimkou, že PKR byla pre-inkubována se stoupajícími koncentracemi GST nebo GST-NS5A před přidáním histonových substrátů a [³²P]-τΑΤΡ. Produkty kinasové reakce byly separovány SDS-PAGE a vizualizace fosfóry1ováných substrátů byla provedena autoradiografií sušeného gelu. Bylo prokázáno již dříve, že existuje přesná korelace mezi fosforylací histonů a aktivací eIF-2o! PKR in vitro (Katze et al., 1991) .

2. Výsledky

Nejprve byla provedena in vitro analýza PKR aktivity za přítomnosti rekombinanního NS5A. Inkubace přečištěné přirozené PKR s rekombinantním GST-NS5A z HCV-la vedla ke specifické inhibici jak autofosforylace PKR, tak fosforylace exogenních histonových substrátů (obr. 5). Stojí za zaznamenání, že 0,2 pmol NS5A může inhibovat 1,8 pmol PKR. V současnosti nemůže být určeno, zda je to důsledkem relativně malé aktivní frakce PKR, nebo zda může být NS5A účinný v těchto nízkých koncentrací například narušením PKR dimerů vyššího řádu. Ztráta PKR aktivity nebyl způsobena degradací PKR ani hydrolýzou ATP způsobenou NS5A. Kromě toho, ačkoliv je možné, že inhibice PKR a fosforylace histonů v našem in vitro testu může být způsobena

GST-NS5A-zprostředkovanou fosfatasovou aktivitou, zdá se toto nepravděpodobné, protože NS5A nemá žádné strukturální vlastnosti, které by ukazovaly na fosfatasovou funkci. Stejné molární množství GST nemá žádný vliv na aktivitu PKR (obr. 5, dráhy 6-9). Proto, podobně jako jiné virem kódované proteiny inhibují PKR, může NS5A specificky inhibovat funkci PKR in vitro, pravděpodobně přímým účinkem na interakci PKR-NS5A.

Exprese PKR ve kvasinkách poskytuje in vivo funkční test pro přímé měření aktivity PKR (Romano et al, 1995, Mol. Cell Biol.

15: 365-378). Prostřednictvím eIF-2a fosforylační aktivity potlačuje PKR při expresi ve kvasinkách jejich růst. Současná exprese PKR s transdominantními inhibičními PKR mutanty nebo virově kódovanými PKR inhibičními proteiny, jako je HIV Tat nebo K3L viru vakcinie, revertuje fenotyp pomalého růstu určený PKR u kvasinek prostřednictvím inhibice PKR a současného snížení fosforylace eIF-2a (Romano et al., 1995; McMillan et al., 1995;

M. Kobayashi, E. Locke, J. Silverman, T. Ung and T. Dever, rukopis odevzdán). Pro testování vlivu NS5A na funkci PKR jsme exprimovali NS5A po kontrolou GAL1 galaktosou indukovatelného promotoru ve kvasinkách kmene RY1-1, který byl vyvinut Romano et al., (1995). RY1-1 vlastní 2 integrované kopie lidského PKR pod kontrolou GAL1-CYC1 galaktosou indukovatelného promotoru a při kultivaci na galaktosovém mediu udržuje fenotyp pomalého růstu určovaný PKR. Pro srovnání jsme provedli paralelní analýzu Ryl-1 nesoucího dobře charakterizovaný PKR inhibitor viru vakcinie,

K3L, také pod kontrolou GAL1-CYC1 promotoru (M. Kobayashi, E. Locke, J. Silverman, T. Ung and T. Dever, rukopis odevzdán). Vyšetřování funkce NS5A bylo zahájeno stanovením růstových charakteristik RY1-1 transfektantů. Ačkoliv všechny transfektanty rostly na neindukujícím dextrosovém (SD) mediu (obr. 6, vlevo), pouze transfektanty nesoucí NS5A nebo K3L byly schopné pomalého růstu za podmínek exprese PKR (obr. 6, vpravo). Transfektanty transfektováné kontrolním vektorem měly fenotyp hodně pomalého růstu, který odpovídá růstové supresivní aktivitě spojené s vysokými koncentracemi PKR (obr. 6) (Romano et al., 1995) . Tyto výsledky ukazují, že NS5A je dostatečný pro zvrácení potlačení růstu zprostředkovaného PKR u kvasinek, což naznačuje, že NS5A může přímo potlačovat funkci PKR. Pro potvrzení toho, že funkce PKR byla v přítomnosti NS5A potlačena jsme stanovily hladinu fosforylace eIF-2a v RY1-1 transfektantech. Podobně jako K3L vede exprese NS5A k přibližně 11-násobnému zvýšení hladiny nefosforylovaného eIF-2a vzhledem k hladině pozorované v kontrolních transfektantech nesoucích vektor samotný (obr. 7). Ačkoliv zůstávala většina eIF-2o! v těchto buňkách v nefosforylováném stavu, naznačují tyto výsledky, že relativně malé změny v celkových hladinách fosforylace eIF-2a mohou mít dramatický vliv na růst buněk. Dohromady tato pozorování naznačují, že prostřednictvím interakce s PKR může NS5A potlačovat funkci PKR in vivo, což vede k alteraci fosforylace substrátu PKR, eIF-2a.

Příklad 4: Molekulární mechanismus inhibice funkce PKR NS5A

Následující pokusy byly provedeny pro stanovení mechanismu interakce NS5A-PKR a vlivu mutací ISDR na NS5A regulaci PKR.

1. Materiály a metody

Plasmidy pGBTIO a pGAD425 kódují GAL4 DNA vazebnou doménu (BD) a transkripční aktivační doménu (AD), v příslušném pořadí (Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). pAD-PKR K296R, pAD-PKR 244-5515, pAD-PKR 244-296 kódují uvedené AD-PKR fúsní konstruktty a byly popsány dříve (Gale, Jr. et al., 1996) . Všechny NSSA-lb expresní konstrukty byly generovány z pAD-NS5A, který obsahuje přirozený NS5A z klinického izolátu HCV-lb resistentního na interferon (Gale et al., 1997, Virology 230: 217-227) . Pro usnadnění analýzy 2-hybridní proteinové interakce na kvasinkách byl pAD-NS5A štěpen Ndel a BamHI restrikčními enzymy a 1,4 kb insert kódující kompletní NS5A (aminokyseliny 1973-2419) byl klonován do odpovídajících míst pGBTIO za zisku pBD-NS5A lb-wt. pBD-NS5A1973-2361 kóduje BD-fúsy NS5A aminokyselin 1973-2361 a byl připraven subklonováním Ndel/Sall insertu z pBD-NS5A lb-wt do příslušných míst pGBTIO. pBC-NS5A ·· · ·· · ·· ·· • · · · ···· « · · · • · · * · · · * · « t • · ··· · » · 9

9999 999 99 999 99 99

2120-2274 kóduje BD-fúsy NS5A aminokyselin 2120-2274 a byl připraven ligací vnitřního EcoRI/BstYl fragmentu z pBD-NS5A lb-wt do EcoRl/BamHI míst pGBTIO. pBD-NS5A 1973-2208, pBD-NS5A 2209-2274 a pBD-NS5A 2180-2251, kódují BD-fúse NS5A aminokyselin 1973-2208, 2209-2274 a 2180-2251, v příslušném pořadí, a byly připraveny PCR amplifikací příslušného pBD-NS5A lb-wt kódujícího regionu za použití párů oligonukleotidových primerů vázaných na restrikční místo, které jsou uvedeny v tabulce 3 (výše). Produkty PCR byly přímo klonovány do pCR2.1 (Invitrogen) podle návodu výrobce. Produkty PCR kódující NS5A aminokyseliny 1973-2208 a 2209-2274 byly uvolněny z pCR2.1 trávením kombinací restrikčních enzymů Ndel/Sall nebo EcoRl/SalI, v příslušném pořadí. Výsledný DNA insert byl ligován do příslušných míst pGBTIO a pGBT9 (Clontech) za vzniku pBD-NS5A 1973-2208 a pBD 2209-2274. Produkt PCR kódující NS5A aminokyseliny 2180-2251 byl uvolněn z pCR2.1 trávením Nco/BamHI a výsledný 213 bp fragment byl ligován do příslušných míst pAS2-l (Clontech) za vzniku pBD-NS5A 2180-2251. PBD-lambdaISDR kóduje ISDR deleční mutant NS5A HCV-la resistentního na interferon (Gale et al., 1997, Virology 230: 217-227).

Místně cílená mutagenese (Chameleon Double-Stranded Site-directed Mutagenesis Kit; Stratagene) byla použita pro vložení mutací ISDR odpovídajících kmenům HCV-lb sensitivních na IFN do pBD-NS5A lb-wt. Mutagenese byly provedeny podle návodu výrobce za použití mutagenních primerů uvedených v tabulce 3 (níže). Templátová DNA byla denaturována inkubací při 100 °C po dobu 5 minut, po které následovalo tepelná zpracování uvedeného mutagenního primerů a Seal až Stul selekčního primerů 5¹-GTGACTGGTGAGGCCTCAACCAAGTC (restrikční místo pro Stul je podtrženo), Produkty extense primerů T7 DNA polymerasou byly ligovány a selektovány pro mutace kódované primerem trávením Seal restrikčním enzymem a následnoíu transformací do XlmutS E. coli • · • 0 <

• 0 4 • · 99 »··· (STratagene). Touto metodou byla připravena sada NS5A isogenních konstruktů identických s NS5A lb-wtt s výjimkou definovaných mutací vložených do ISDR (viz tabulka 1). pBD-NS5A lb-2 a pBD-NS5A lb-4 byly připraveny přímo z pBS-NS5A Ib-wt a kódují jedinou (A2224V) nebo vícečetné (P2209L, T2214A a T2217G) ISDR mutace v ISDR, v příslušném pořadí (tabulka 1). pBD-NS5A-5 kóduje mutace v ISDR P2209L, T2214A, T2217G a A2224V a byl připraven vložením A2224V mutace do pBD-NS5A-4.

Pro expresi NS5A v S. cerevisiae byl celý 1,4 kb insert pBD-NS5A lb-wt amplifikován PCR za použití oligonukleotidů vázaných na restrikční enzym, jak jsou uvedeny v tabulce 3 (horní část). Produkty PCR byly klonovány do Srfl místa pCR-Script (Stratagene) a byly uvolněny z výsledného plasmidu trávením HindlII. DNA insert přečištěný na gelu byl klonován do HindlII místa pYES2 (Invitrogen) za zisku plasmidu pYES-NS5A lb-wt exprimujícího NS5A pod kontrolou galaktosou indukovatelného GAL1 promotoru. Konstrukce pYES-NS5A lb-2, pYES-NS5A lb-4 a pYES-NS5A lb-5 byla usnadněna nahrazením vnitřního 1,1 kb SacII/SacI fragmentu pYES-NS5A lb-wt vnitřním Sacll/Sall fragmentem z příslušného pBD-konstruktu.

Pro expresi NS5A v savčích buňkách byl celý 1,4 kb kódující region pro NS5A pYES-NS5A lb-wt a pYES-NS5A lb-5 uvolněn trávením HindlII a byl klonován do HindlII místa pFLAG-CMV2 (Eastman Kodak Co.). Výsledné plasmidy, pFLAGNSSA lb-wt a pFLAGNSSA lb-5, v příslušném pořadí, kódují kompletní přirozený NS5A a mutantní NS5A fušovaný na N-konci na 8 aminokyselinovou tag sekvenci FLAG epitopu (FLAG-NS5A) po kontrolou CMV okamžitého-časného promotoru. pNeo-NS5A la-wt byl připraven klonováním 1,4 kb HindlII/Xbal insertu pYES2-NS5A (Gale et al., 1997, Virology) do příslušných míst pcDNAlNEO. pNeo-PKR K296R kóduje kompletní inaktivní lidský PKR K296R mutant (Barber et al., 1993, J. Biol.

Chem. 170: 17423-17428). Pro konstrukci pGST-NS5A lb-wt byl izolován 1,4 kb Ncol/Xhol DNA insert z pAD-NS5A (Gale et al., 1997, Virology 230: 217-227) a 3'konec byl doplněn Klenow polymerasou (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, 2. vydání, Cold Spring Harbor Press). Výsledná tupě zakončená DNA byla klonována do Smál místa pGex-2TK (Pharmacia Biotech), za úfúsování kódujícího regionu pro NS5A ve čtecím rámci do plasmidu kódujícího GST protein. pGST-K3L kóduje GST fúsi na 88 aminokyselinový K3L protein viru vakcinie. pGST-NSl kóduje GST fúsi na NS1 protein viru chřipky. Fuse mezi N-koncovými 132 aminokyselinami cl represoru fágu lambda a katalyticky inaktivní PKR K296R byla připravena v pel168 za vzniku pcI-PKRK296R. Sekvence každého nového konstruktu byla verifikována dideoxanukleotidovou analýzou sekvence (Applied Biosystems).

Buněčná kultura a transfekce

NIH3T3, Cos-1 (ATCC) a nádorové buněčné linie byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově mediu (DMEM) obsahujícím 10% fetální hovězí séru, za použití dříve pospaného způsobu (Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 28660-28666). Pro dočasnou transfekci byly kombinace expresních plasmidů vloženy do Cos-l buněk DEAE-dextran/chlorochinovou technikou, jak byla popsána dříve (Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 28660-28666) nebo za použití postupu využívajícího Superfect transfekční činidla, jak je popsán výrobcem (Qiagen). Každá sada transfekci obsahovala subkonfuentní 25 cm² kultury přibližně 6x10^s buněk současně transfektovaných 5 μ<3 každého expresního plasmidu v následujících kombinacích: pcDNAlneo/pNeoPKR K296R a pNeoNS5Ala-wt/pNeoPKR K296R, nebo pFLAG/pNeoPKR K296R, pFLAGNS5Alb-wt/pNeoPKR K296R nebo pFLAGNS5A lb-5/pNeoPKR K296R. Buňky byly sklízeny 48 hodin po transfekci a extrakty byly zpracovány imunoprecipitací nebo imunoblotovými analýzami, jak bylo dříve popsáno. NIH3T3 buněčné

• · · • · • · · • · • 99 9 linie stabilně exprimující PKR inhibiční protein p58^XE>K byly popsány dříve (Barber et al., 1994, Proč. Nattl. Acad. Sci. 91: 4278-4282). NIH3T3 buněčné linie obsahující kontrolní vektor nebo linie exprimující NS5A la-wt byly získány transfekci buněk DEAE-dextran/chlorochínovou technikou s 3-10 μ<3 pcDNAlneo nebo pNeoNS5A la-wt, v příslušném pořadí. Transfektovane buňky byly selektovány kultivací na mediu obsahujícím 600 ^g/ml neomycinového analogu G418. Byly izolovány klony resistentní na lék, tyto klony byly expandovány a byly testovány na stabilní expresi NS5A. Touto technikou bylo izolováno několik klonů exprimujicích vysoké nebo nízké hladiny NS5A. Pro další analýzu byly vybrány dva representativní klony, 5C6 (s vysokou expresí) a 4A1 (s nízkou expresí).

Proteinová analýza

Kvasinkové extrakty byly připraveny získáním buněk z 20 ml kapalných kultur, promytím jedenkrát vodou, resuspendováním v ledově chladném pufru pro lýzu kvasinek (40 mM PIPES (pH 6,6),

100 mM NaCl, 1 mM DTT, 50 mM NaF, 37 mM β-glycerolfosfatu, 120 mM AMSO₄, 10 mM 2-aminopurinu, 15 mM EDTA, 0,2 mM fenylmethylsulfonylfluoridu (PMSF)) a byla provedena lýza buněk dříve popsaným způsobem (Gale Jr. et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181). Extrakty 3T3, Cos-1 a nádorových buněk byly připraveny v pufru I (50 mM KC1, 50 mM NaCl, l mM EDTA, 1 mM DTT, 20% glycerol, 0,5% Triton X-100 jednotek/ml aprotininu, 1 mM PMSF, 20 mM Tris (pH 7,5)), přesně podle popsaného způsobu (Tang et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 28660-28666). Extrakty byly projasněny centrifugací při 4 °C při 120000 xg, supernatanty byly odebrány a uskladněny při -70 °C. Koncentrace proteinu v buněčných extraktech byla stanovena pomocí BioRad Bradford testu, podle návodu výrobce (BioRad).

• ·

Stanovení exprese proteinu bylo provedeno imunoblotovými analýzami 25-50 μ<3 celkového proteinu z buněčných extraktů. Proteiny byly separovány SDS-PAGE a byly přenesena na nitrocelulosové membrány. Navázané proteiny byly detekovány sondováním membrán primárními monoklonálními protilátkami specifickými pro NS5A, (anti-NS5A), lidskou PKR (anti-PKR (Laurent et al., 1985, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 82: 4341-4345), FLAG-epitop (anti-FLAG, Eastman Kodak Co.), GAL4 aktivační doménu nebo GAL4 DNA vazebnou doménu (Anti-AD a anti-BD, v příslušném pořadí (Clontech)). Proteiny byly vizualizovány zesílenou chemiluminiscencí (ECL) a autoradiografií. Pro kontrolu potenciálních chyb v obsahu proteinů byly bloty také sondovány monoklonální protilátkou specifickou pro aktin (anti-aktin; ICN).

Imunoprecipitace byly provedeny z extraktů představujících 2 x 10^e Cos-1 buněk. Extrakty (150 μί) se nechaly roztát na ledu a byly předzpracovány 1 hodinovou inkubací s protein G-agarosovými korálky (Boehringer Mannheim) při 4 °C. Supernatanty byly získány centrifugací při 4 °C, 12000 x g, a byly smíseny s anti-NS5A (1:500) nebo antiFLAG M2 afinitním gelem (Eastman Kodak, Co.) v konečném objemu 600 μΐ pufru I a byla provedena inkubace při 4 °C po dobu 2 nebo 16 hodin, v příslušném pořadí. Anti-NS5A imunokomplexy byly získány další inkubací s protein G-agarosovými korálky uvedenými do rovnováhy v pufru 1. Imunokomplexy byly promyty 5-krát 1 ml ledově chladného pufru 1. Imunokomplexy v anti-FLAG M2 afinitním gelu byly dále promyty 3-krát chladným TBS (50 mM Tris (pH 7,5)) a byly eluovány adicí kometitivního FLAG peptidů, podle návodu výrobce (Eastman Kodak Co.). Imunokomplexy byly získány centrifugací, byly ředěny v SDS-vzorkovém pufru a byly po dobu 5 minut inkubovány při 100 °C. Produkty imunoprecipitace byly rozděleny elektroforesou na 12% akrylairtidových/SDS gelech a byla připraveny pro imunoblotovou analýzu způsobem uvedeným výše.

Pro isoelektrické fokusování eIF-2a byly kvasinky kultivovány 16 hodin v bezuracilovém syntetickém definovaném mediu obsahujícím 2% dextrosu (SD), byly ředěny na 0D_goo 0,4 v bezuracilovém syntetickém definovaném mediu obsahujícím 2% raffinosu a 10% galatosu (SGAL) a byly kultivovány po dalších 4-9 hodin při 30 °C. Kvasinkové extrakty byly připraveny způsobem popsaným pro imunoblotovou analýzu. Proteiny (16 μg) byly separovány vertikálním isoelektrickým fokusováním (Dever et al., 1993, Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 4616-4620) a byly přeneseny na nitrocelulosové membrány. eIF-2a byl detetkován imunoblotovou analýzou za použití králičího polyklonálního antiséra specifického pro kvasinkový eIF-2a. V těchto pokusech ukazuje zvýšení koncentrace méně kyselé, bazálně fosforylované formy eIF-2a na současné snížení koncentrace hyperfosforylováného eIF-2a, který je fosforylován PKR na šeřinu 51 (Dever et al.,

1993, Proč. Nati. Acad. Sci. 90: 4616-4620; Romano et al., 1995, Mol. Cell. Biol. 15: 365-378). Koncentrace bazálně fosforylovaného eIF-2a vzhledem k celkovému eIF-2o! byly kvantifikovány skenovací laserovou densitometrií a jsou uvedeny jako procento celkového eIF-2a pro každý vzorek.

Kvasinkové metody

Podrobnosti kvasinkového 2-hybridního testu byly důkladně popsány (Gale, Jr. et al., 1996). Tento test využívá specifickou indukci His reporterového genu pro podporu růstu kvasinek kmene Hf7c (Clontech) na bezhistidinovém mediu, což ukazuje na interakce 2-hybridního proteinu. Saccharomyces cerevisiae kmene Hf7c (MATa ura 3-52 his 3-200 lys 2-801 ade 2-101 trp 1-901 lea 2-3, 112 gal 14-542 LYS2::GAL1-HIS3 URA3::(GAL4

17-mery) -cycl-lacZ) byly transformovány uvedenými 2μ Trpí a Leu2 expresními plasmidy nesoucími odpovídající GALA AD- a BD-fúsní konstrukty. Transformované kmeny byly umístěny na SD medium bez tryptofanu a leucinu (+His). Po 3 dnech při 30 °C byly kmeny přeneseny na SD medium bez tryptofanu, leucinu a histidinu (-His) a byly inkubovány po dobu 3-6 dnů při 30 °C. Výsledné kolonie histidin-depletované kolonie byly dvojmo přeneseny na +His a -His medium a byla provedena inkubace po dobu 3-5 dnů při 30 °C. Specifický růst na -His mediu ukazoval na pozitivitu 2-hybridní proteinové interakce.

Pro stanovení PKR a NS5A funkce in vivo byly přirozené nebo mutantní NS5A Ura3 expresní plasmidy transformovány v Saccharomyces cerevisiae RY1-1 (MATa ura3-52 leu2-3 leu2-112 gcn2 trpí- 63 LEU2::(GAL-CYC1-PKR)₂ (Romano et al., 1995). Tomuto kmenu chybí GCN2 kvasinové eIF-2a kinasy a nese 2 kopie lidského genu pro PKR integrovaného do LEU2 lokusu pod kontrolou galaktosou indukovatelného GAL1-CYC hybridního promotoru. Při kultivaci na SGAL mediu je PKR exprimována a fosforyluje endogenní eIF-2a na šeřinu 51, což vede k inhibici mRNA translace a supresi růstu (Dever et al., 1993; Romano et al., 1995) .

Naopak, současná exprese přirozeného NS5A potlačuje tyto toxické účinky spojené s funkcí PKR v tomto systému, což umožňuje růst kmenů exprimujícíeh funkční NS5A na SGAL mediu (Gale et al.,

1997). RY1-1 kmeny nesoucí uvedené NS5A expresní konstrukty byly umístěny na neindukující bezuracilové SD medium a byly inkubovány při 30 °C po dobu 3 dnů. Jednotlivé kolonie byly odebrány a byly kultivovány po dobu 16 hodin při 30 °C na bezuracilovém kapalném SD mediu. Alikvóty každé kultury byly normalizovány na OD_eoo 0,2 a byly sériově ředěny v 10-násobných ředěních sterilní H^O. 2 μΐ každého ředění byly aplikovány dvojmo na bezuracilové SD a SGAL medium a byly inkubovány po dobu 3-6 dnů při 30 °C. Kmeny byly vyšetřovány na růst na SGA1 mediu při vysokém ředění, který ukazuje na NS5A-zprostředkované potlačení PKR (Gale et al.,

1997) .

« · · · ·

Test narušení dimerizace

Test pro měření narušení dimerizace PKR byl popsán dříve (Hu, 1990, Science 250: 1400-1403; Hu, 1995, Structure 3: 431-433). Tento test využívá sensitivity k fágem lambda zprostředkované lýze buněk jako ukazatele dimerizace ci-PKR K296R fúsního proteinu exprimovaného z pcI-PKR K296R v E. coli. pcI-PKR K296R je replikovaný pod kontrolou pl5A ori a jedná se proto o replikon s nízkým počtem kopií, který je kompatibilní s plasmidy, které obsahují colEi ori, včetně pGEX serie vektorů (Smith et al.,

1988, Gene 67: 31-40). E. coli kmen AG1688 (Hu, 1990) současně exprimující ci-PKR K296R a uvedený GST fúsní protein byl testován na resistenci k buněčné lýze způsobené cl-delečním mutanttem lambdaKH54 fágu lambda (Hu, 1990). AG1688 E. coli byly kultivovány do střední logaritmické fáze v kapalných kulturách skládajících se z Luria bujónu doplněného 10 mM MgSO₄ a 0,2% maltosou. Bakterie (2,5 μΐ alikvoty) byly smíseny se stejným objemem sériových 10-násobných ředění lambdaKH54 obsahujících 10²-l0^s plaky tvořících jednotek. Směs bakterií a fágů byla umístěna na antibiotické-agarové plotny obsahující 0,1 mM isopropylthio-B-D-galaktosid (IPTG) pro indukci exprese fúsních proteinů kódovaných plasmidem. Plotny byly sušeny na vzduchu, byly inkubovány po dobu 16 hodin při 37 °C a byly testovány na resistenci na lýzu způsobenou lambdaKH54, která je ukazatelem in vivo tvorby funkčních ci-PKR K296R homodimerů. Exprese každého fúsního proteinu kódovaného plasmidem byla potvrzena imunoblot ovou analýzou.

Analýza buněčného růstu a testy tumorigenicity

Byly určeny růstové charakteristiky stabilních NIH3T3 buněčných linií konstitutivně exprimujících transfektováný NS5A nebo p58^IE>K (Barber et al., 1994) a jsou uvedeny v tabulce 2. Pro analýzu nádorových fenotypů byly nádory excidovány z nu/nu myší za sterilních podmínek, byly promyty ve fosfátem pufrovaném salinickém roztoku (PBS) a byly rozřezány na 1-5 mm fragmenty. Nádorové fragmenty byly homogenizovány nejprve inkubací v 1% kolagenase/O,1% Dispase (Gibco BRL) v PBS a potom míšením v Dounce homogenizačním přístroji. Homogenizované nádory byly inkubovány při 37 °C po dobu 2 hodin, byly centrifugovány po dobu 10 minut při 600 x g a byly resuspendovány v čerstvém DMEM s 10% FCS. Buněčné suspenze byly umístěny do mnohojamkových ploten pro získání klonálních nádorových buněčných linií.

2. Výsledky

Mechanismus regulace PKR NS5A: Narušení dimerizace proteinkinasy

Virová kontrola PKR probíhá na několika úrovních definujících specifické stupně při zrání PKR, aktivaci PKR a katalytických procesech. Tyto stupně zahrnují, bez omezení, modulování koncentrací PKR, regulaci vazby na dsRNA, dimerizaci proteinkinasy a regulaci katalytické aktivity PKR. Jak je zde popsáno, byla zjištěna vazba NS5A na rozsáhlou oblast katalytické domény PKR definovanou aminokyselinami 244-355 PKR. Pro pochopení regulace PKR zprosttředkované NS5A byl nejprve studován molekulární mechanismus vazby NS5A na proteinkinasu. Pro identifikaci vazebné domény NS5A pro proteinkinasu byla provedena analýza interakce proteinů za použití (wt) NS5A z izolátu HCV-lb resistentního na IFN (lb-wt, viz tabulka 1) fúsovaného na GAL4 DNA vazebnou doménu (BD-NS5A lb-wt). Byla etstována schopnost tohoto konstruktu zprostředkovat interakci s PKR delečními mutanty fušovanými na GAL4 transkripční aktivační doménu (AD) ve kvasinkovém 2-hybridním testu. 2-hybridní proteinová interakce byla určena schopností transformovaných kvasinek růst na bezhistidinovém (-His) mediu, která je určena aktivací Hf7c His reportéru. Bylo zjištěno, že každý konstrukt byl účinně exprimován v příslušnném kmenu. Jak je vidět na obr. 8, kvasinky kmene Hf7c současně exprimující BD-NS5A lb-wt a AD-PKR (PKR K296R) nebo AD-PKR deleční konstrukty, PKR 244-551 a PKR 244-296, všechny rostly na -His mediu, což ukazuje na přítomnost 2-hybridní proteinové interakce v těchto kmenech. Tak bylo zjištěno, že 52 aminokyselinová sekvence PKA definovaná aminokyselinami 244-296 je dostatečná pro interakci s NS5A. Tyto výsledky definují NS5A vazebnou doménu PKR mezi aminokyseliny 244-296, které jsou zde označeny jako doména zásadní pro dimerizaci PKR.

Schopnost NS5A lb-wt interferovat s dimerizaci PKR in vivo byla testována za použití genetického testu založeného na fágu lambda v E. coli. V tomto testu zprostředkují dimerizační proteiny, které jsou fúsované ve čtecím rámci s DNA vazebnou doménou cl represoru fágu lambda, dimerizaci Cl DNA vazebné domény, která je nutná pro vazbu na lambda promotor (Hu, 1995, Structure 3: 431-433). Při expresi v E. coli zprostředkuje hybridní Cl represor resistenci na lýzu buněk indukovanou Cl-delečním mutantem fágu lambda (lambdaKH54; Hu, 1990, Science 250: 1400-1403)) dimerizaci a vazbou na lambda promotor. Toto vede k potlačení exprese fágového genu v E. coli infikovaných lambdaKH54, které exprimuji hybridní Cl-represor. Naopak, současná exprese inhibitoru dimerizace v tomto systému uvolňuje represi lambda genu prostřednictvím narušení Cl dimerů, což vede k lýze E. coli. Exprese kompletní inaktivní PKR K296R fušované na N-konci na Cl DNA-vazebnou doménu (Cl-PKR) je dostatečná pro potlačení exprese lambda genu při infekci E. coli lambdaKH54.

Toto j e uvedeno na obr. 9, kde nemá současná exprese GST žádný vliv na CI-PKR zprostředkovanou represi lambda genu, protože resistence na buněčnou lýzu byla pozorována i po expouici vysokým • · « · · «··· ···· ··· ·· ··· ·· ·· koncentracím fágu (obr. 9, dráha 1). Protousnadňuje PKR složka CI-PKR dimerizaci proteinu a represi lambda genu in vivo. Resistence na buněčnou lýzu zprostředkovanou lambdaKH54 byla v E. coli exprimujících CI-PKR s GST-NS5A redukována přibližně 1000-krát (srovnej dráhy 1 a 2, obr. 9), což naznačuje, že NS5A byl narušen v procesu dimerizace Cl-PKR. Bylo prokázáno, že tento efekt GST-NS5A lb-wt je specifický pro CI-PKR. Proto NS5A specificky narušuje proces dimerizace PKR in vivo.

Dále, narušení dimerizace PKR způsobené NS5A odpovídá regionu vyhledávanému NS5A pro vazbu na PKR, který je lokalizován do PKR dimerizační domény (viz obr. 8). Kromě toho, GST konstrukty kódující jiné virové inhibiotory PKR, včetně K3L viru vakcinie (GST K3L, dráha 3) a NS1 viru chřipky (GST NS1, dráha 4), které se vážou na PKR-substrát (Craig et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 24526-24533; Gale, Jr., et al., 1996, Mol. Cell. Biol. 16: 4172-4181) a -dsRNA interakce (Katze et al., 1991) nemají vliv na resistenci E. coli k buněčné lýze způsobené lambdaKH54, pokud jsou exprimovány současně s CI-PKR. Proto představuje NS5A novou třídu inhibitorů PKR, které inhibují funkci PKR narušením dimerizace PKR, což určuje krok dimerizace jako základní složku v procesu maturace PKR, její aktivace a katalytické funkce a proto také kllíčový cíl pro vyšetřovací testy zaměřené na identifikaci nových antivirových činidel.

Příklad 5: NS5A, regulace PKR a sensitivita na IFN: nové definování ISDR

Nedávno provedené molekulární epidemiologické studie identifikovaly ISDR jako konzervovaný region v genomu HCV kmenů HCV-lb resistentních na interferon. Vynálezci určili, že NS5A z HCV genotypů la a lb resistentních na IFN se mohou vázat na PKR a potlačovat funkci kinasy in vivo a že tento proces je závislý na • 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 · 9

9999 999 99 999 99 99

ISDR. Za použití NS5A ISDR variant isogenních s NS5A lb-wt vynálezci prokázali, že mutace v ISDR mohou zrušit PKR-regulační vlastnosti NS5A in vivo.

1. Identifikace domény NS5A interagující s PKR: ISDR je nutný, ale ne dostatečný pro tvorbu komplexů NS5A-PKR

Podrobná strukturální analýza interakce NS5A-PKR byla provedena za použití kvasinkového 2-hybridního testu pro určení role ISDR v této interakci. TRPÍ plasmidy kódující kompletní BD-NS5A lb-wt nebo jeho deleční mutanty (obr. 10A, viz tab. 1) byly vloženy do kvasinek kmene Hf7c nesoucích LEU2 plasmid kódující AD-PKR. Všechny konstrukty byly účinně exprimovány v současně transformovaných kmenech (obr. 10C). Všechny kmeny nesoucí každý BD-NS5A konstrukt a AD-PKR nebo AD-vektor (kontrola s negativní interakcí) rostly na mediu obsahujícím histidin. Interakce-negativní kontrolní kmeny nerostly na -His mediu, což ukazuje na specificitu popsané interakce. Významné je, že bylo zjištěno, že 66 aminokyselinový region NS5A obsahující ISDR byl nutný pro tvorbu komplexů s PKR in vivo (obr. 10). Samotných 236 N-koncových aminokyselin NS5A nebylo dostatečných pro interakci s AD-PKR, jak bylo určeno neschopnoostí kmenů nesoucích tento konstrukt růst na -His mediu (Obr. 10B). Kromě toho bylo zjištěno, že konstrukt obsahující ISDR kódující aminokyseliny 2180-2251 NS5A nepodporoval růst na -His mediu při expresi s AD-PKR. Naopak, kmeny nesoucí BD-NS5A konstrukty 1973-2419, 1973-2361 nebo 2120-2274 rostly na -His mediu, což ukazuje na přítomnost 2-hybridní proteinové interakce. Těmito analýzami bylo stanoveno, že PKR vazebný region NS5A je lokalizován v regionu o 66 aminokyselinách obsahujícím ISDR a sousedních 26

C-terminálních aminokyselin (obr. 10B, dole). Proto je ISDR nutný, ale ne dostatečný, pro interakci NS5A-PKR.

•v «· « ·· ··

2. Interakce NS5A-PKR je závislá na sekvenci ISDR

Kvasinkový 2-hybridní test byl použit pro stanovení efektu mutací ISDR na in vivo tvorbu komplexu mezi NS5Á a PKR. Byla připravena série NS5A expresních plasmidů kódujícíh přirozený (wt) ISDR a ISDR varianty NS5A odpovídající iFN-resistentním a IFN-sensitivním kmenům HCV, v příslušném pořadí. Spíše než náhodné mutace ISDR byla pro konstrukci ISDR variant NS5A použita místně řízená mutagenese založená na definovaných mutacích dříve identifikovaných v klinických izolátech IFN-sensitivních kmenů HCV (Enomoto et al., 1996, N. Eng. J. Med. 334: 77-81). Tyto mutace, uvedené v tabulce 1, byly vloženy do ISDR NS5A lb-wt, který byl izolován z IFN-resistentních HCV (Gale et al., 1997). Byla připravena sada isogenních NS5A konstruktů, lb-2, lb-4 a lb-5, které obsahovaly, v příslušném pořadí, dvě, čtyři a pět aminokyselinových změn vzhledem k prototypu ISDR sekvence z IFN-resistentního HCV. Tyto konstrukty mají sekvenci identickou s NS5A lb-wt s výjimkou definovaných mutací v ISDR, což umožňuje stanovení vlivu specifických ISDR mutací na funkci NS5A HCV lb. Tabulka.1 srovnává ISDR sekvenci a IFN-odpověď prototypu IFN-resistentního HCV-J kmenu (Kato et al., 1990, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87: 9524-9528) s s ISDR sekvencí a odpovědí na IFN určenou pro příslušné virové izoláty pro každý wt a mutantní NS5A konstrukt.

BD-NS5A konstrukty kódující kompletní lb-wt NS5A a isogenní ISDR varianty (tabulka 1) byly transformovány do Hf7c kvasinek nesoucích plasmid kódující AD-PKR nebo AD-kontrolní vektor. Jako další kontroly bylo použito paralelní hodnocení kmenů nesoucích plasmidy kódující AD-PKR a HCV-la NS5A konstrukty BD-la-wt (pozitivní kontrola) nebo BD- ISDR (negativní kontrola), kde poslední uvedený nemá kompletní ISDR konstrukt odpovídající la-wt konstruktu (Gale et al., 1977). Výsledné kvasinkové kmeny byly

umístěny na +His a -His medium. Jak je uvedeno na obr. 11, všechny kmeny rostly na -ι-His mediu. Nicméně, pouze kmeny exprimující BD-NS5A konstrukty lb-wt, lb-2 nebo la-wt kontrolu rostly na -His mediu, což ukazuje, že tyto konstrukty mohou vázat PKR in vivo. Podobně jako ISDR kontrola selhaly ISDR varianty BD-NS5A lb-4 a lb-5 v interakci s AD-PKR, protože kmeny obsahující tyto konstrukty nerostly na -His mediu (obr. 11A). Imunoblotové analýzy prokázaly, že všechny BD-NS5A konstrukty a AD-PKR konstrukty byly účinně exprimovány v současně transformovaných kvasinkách (obr. 11B). Tak interaguji isogení NS5A konstrukty lišící se ve své ISDR sekvenci různě s PKR in vivo. Vložení jedině bodové mutace v ISDR (NS5A lb-2) nebylo dostatečné pro zrušení interakce NS5A-PKR, zatímco vícečetné mutace ISDR zrušily tvorbu komplexů s PKR (obr. HA). Neschopnost vazby NS5A na PKR může být proto přisouzena mnohočetným mutacím v ISDR, které jsou asociovány s HCV sensitivními na IFN.

3. Mutace ISDR ruší funkci NS5A

NS5A potlačuje funkci PKR přímou interakcí s proteinkinasou (Gale et al., 1997) . Vícečetné mutace ISDR narušují tvorbu komplexu NS5A-PKR (Obr. 11). Proto byla schopnost regulace funkce PKR wt NS5A a ISDR variantními NS5A srovnávána in vivo. Expresní plasmidy kódující NS5A konstrukty lb-wt, lb-2, lb-4 a lb-5 pod kontrolou Gal promotoru byly vloženy do gcn2 S. cerevisiae kmene RYl-l (Romano et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 365-378). Tento kmen postrádá endogenní GCN2 proteinkinasu a nese dvě integrované kopie přirozené lidské PKR pod kontrolou galaktosou indukovatelného GAL/CYC hybridního promotoru. Při kultivaci na galaktosovém mediu je PKR exprivována a fosforyluje serin 51 na eIF-2a, což vede k supresi růstu buněk (Romano et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 365-378). Jak je vidět na obr. 12A, kmeny nesoucí příslušný NS5A expresní plasmid nebo expresní plasmid samotný • 4 4 4 (vektor; kontrola) rostly stejně při sériovém umístění ekvivalentů buněk na neindukující medium obsahující dextrosu jako jediný zdroj uhlíku (levý panel). Naopak, pouze kmeny současně exprimující NS5A lb-wt rostly na indukujícím mediu (obr. 12A, pravý panel). Touto metodou bylo určeno, že kmeny současně exprimující NS5A lb-wt a PKR mají více než 100-násobné zvýšení účinnosti kultivace při kultivaci na galaktosovém mediu ve srovnání s kmeny současně exprimujícími NS5A lb-4 nebo lb-5 a PKR. Byla také pozorována snížená účinnost kultivace, odpovídající 10-100-násobnému snížení, u kmenů současně exprimujících PKR a NS5A lb-2 (obr. 12A). Toto bylo překvapivé, protože tento konstrukt byl schopen vazby na PKR v našem kvasinkovém 2-hybridním testu (viz obr. 11). Tyto výsledky ukazují, že vložení jedné aminokyselinové bodové mutace (A252V) do ISDR lb-wt bylo dostatečné pro narušení tvorby komplexu NS5A-PKR. Vícečetné aminokyselinové mutace ISDR, odpovídající kmenům HCV sensitivním na IFN, vedly ke ztrátě růst-obnovujícího fenotypu spojeného s isogenním NS5A lb-wt. Tyto výsledky naznačují, že NS5A lb-wt potlačuje translační regulační vlastnosti PKR in vivo, což vede k obnovení růstu buněk a stimulaci syntézy proteinů. Ztráta funkce spojená s ISDR variantami NS5A naznačuje, že PKR-regulační vlastnosti NS5A byly narušeny vložením mutací v ISDR.

Pro stanovení efektu mutací ISDR na PKR-regulační funkci NS5A byla provedena analýza in vivo fosforylace endogenního substrátu PKR, eIF-2a. Potlačení funkce PKR v RYl-l kvasinkách vede k redukci koncentrace hyperfosforylované formy eIF-2o;, který je fosforylován výlučně PKR na šeřinu 51 (Romano et al., 1995, Mol. Cell Biol. 15: 365-378). Za použití jednorozměrového isoelektrického fokusování (IEF) může být hyperfosforylovaná forma eIF-2a elektroforeticky separována od méně kyselé, hypofosforylováné formy, které chybí fosforylace na šeřinu 51 (Dever et al., 1993). Obr. 10 ukazuje imunobloty z IEF gelu extraktů připravených z RY1-1 kmenů uvedených na obr. 12, které byly sondovány antisérem specifickým pro kvasinkový eIF-2ce. Jako kontroly byly použity extrakty ze kmenů nesoucích expresní plasmid, bez insertu (V, dráha 1), nebo transdominantně negativní PKR rnutant, PKR 295-300 (obr. 12, dráha 6). PKR 295-300 inhibuje wt PKR při současné expresi ve kvasinkách, což vede ke snížení fosforylace šeřinu 51 a obnovení růstu buněk na galaktosovém mediu (Romano et al., 1995). Jak je vidět na obr.

13, kmeny exprimující NS5A lb-wt nebo PKR 295-300 vykazovaly statisticky významnou redukci množství hyperfosforylovaného eIF-2a, jak je doložena současným zvýšením množství hypofosforylované isoformy eIF-2a vzhlkedem ke kmenu s kontrolním vektorem /srovnej dráhy 1 a 2). Kmeny exprimující isogenní NS5A varianty, lb-2, lb-4 nebo lb-5 obsahují především hyperfosforylované isoformy eIF-2a, podobně jako kmeny s kontrolním vektorem (obr. 13, srovnej dráhy 3-5 a dráhou 1). Příslušná hladina eIF-2a s fosforylovaným serinem 51 odpovídá růstovému fenotypu každého kmenu na galaktosovém mediu (obr.

12A), kde exprese NS5A lb-wt usnadňuje růst na galaktose a redukuje fosforylaci šeřinu 51. Tento fenotyp byl změněn vložením mutací ISDR do NS5A. Dohromady tyto výsledky ukazují, že ISDR mutace odpovídající IFN-sensitivním HCV (tabulka 1) mohou narušovat PKR-regulační vlastnosti NS5A. Kromě toho, neproběhnutí PKR vazebných dějů z NS5A řízené inhibice PKR pozorované v naší analýze NS5A lb-2 konstruktu (viz obr. 11 a 12) naznačuje, že narušení funkce NS5A může proběhnout na mnoha úrovních a není omezeno na narušení tvorby komplexu NS5A-PKR.

4. Interakce NS5A-PKR v savčích buňkách je narušena mutacemi ISDR

NS5A z IFN-resistentních HCV potlačuje translační regulační vlastnosti PKR při expresi v savčích buňkách (Gale et al., 1997).

• 9 9 ·0 · 99 ··

9999 0099 9909

000 0999

00·· ··♦··♦ • 0 090 0009

9999 909 00 ··* ·· ♦·

Podle výsledků z kvasinkového 2-hybridního testu (obr. 11) a testů růstu (obr. 12) je pravděpodobné, že NS5A-řízená represe PKR v savčích buňkách byla podobně zprostředkována přímou interakcí NS5A-PKR. Přihlašovatelé chtěli stanovit, zda může tvořit NS5A a PKR stabilní komplexy v savčích buňkách a jaký mají vliv mutace ISDR na tvorbu komplexů. Imunoprecipitací byly analýzovány Cos.l buňky přechodně současně transfektovane plasmidy kódujícími wt nebo ISDR varianty NS5A a kompletní inaktivní lidskou PKR. V těchto analýzách byly použity plasmidy kódující NS5A z IFN-resistentních HCV-la (la-wt), lb-wt a lb isogenní varianty, lb-5; poslední uvedená odpovídá HCV sensitivnímu na interferon (tabulka 1). Imunoblotová analýza extraktů připravených ze současně transfektovaných buněk ukázala, že všechny konstrukty byly účinně exprimovány během 48 hodin po transfekci (obr. 14). PKR byla získána z anti-NS5A imunoprecipitátů připravených z buněk současně transfektovaných la-wt a z anti-FLAG imunoprecipitátů připravených z buněk nesoucích lb-wt s navázaným FLAG (obr. 14A a 14B, v příslušném pořadí). Pro srovnáni, žádná PKR nebyla detekována v imunoprecipitátech lb-5 s navázaným FLAG (srovnej dráhy 5 a 6; obr. 14). Zpětný zisk PKR byl závislý na přítomnosti NS5A v extraktu, protože jsme nebyli schopni detekovat PKR v NS5A-specifických imunoprecipitátech připravených z extraktů bez wt NS5A (obr. 10A a 10B, dráhy 1 a 4, v příslušném pořadí). Tyto výsledky ukazují, že NS5A IFN-resistentních kmenů HCV-la a HCV-lb mohou tvořit stabilní a specifické komplexy s PKR při expresi v savčích buňkách. Podobně jako ve kvasinkovém 2-hybridním testu (obr. 11) narušují mutace v ISDR odpovídající IFN-sensitivním HCV (tabulka 1) interakce NS5A-PKR v savčích buňkách. Soulad výsledků z těchto testů a z testů na kvasinkách (viz obr. 11 a 12) potvrzuje kvasinkový model jako vhodný model pro studium interakcí NS5A-PKR a vlivů těchto interakcí na funkci PKR.

• · « · · · · ·»···♦ • · »»« · · · · ·*·· ··· «* ··· ·· ··

Příklad 6: NS5A má onkogenní potenciál

Protože je PKR regulační dráha vázána na kontrolu buněčného růstu, položili si přihlašovatelé otázku, zda může regulace PKR NS5A ovlivňovat vývoj malignit spojených s chronickou infekcí HCV. V této studii bylo předpokládáno, že onkogenní transformace se vyskytuje prostřednictvím represe PKR-dependentní fosforylace eIF-2a a deregulace translace mRNA. NS5A z IFN-resistentních HCV se váže na PKR (obr. 14) a potlačuje vlastnosti PKR regulující translaci v savčích buňkách. Výsledky z kvasinkových systémů naznačují, že NS5A má růstové-stimulační vlastnosti zprostředkované potlačením PKR-zprostředkované fosforylace eIF-2o! (viz obr. 12 a 13). Pro stanovení toho, zda potlačení PKR způsobené NS5A podobně přispívá ke stimulaci růstu savčích buněk byly připraveny NIH-3T3 buňky konstitutivně exprimující NS5A la-wt z CMV okamžitého-časného promotoru. Pro studii byly vybrány dvě takové buněčné linie, NS5A 5C6 a NS5A 4A1. Imunoblotové analýzy ukázaly, že NS5A 5C6 exprimuje vysoké hladiny NS5A (obr. 15), zatímco NS5A 4A1 buňky exprimuji významně nižší hladiny NS5A (data nejsou uvedena). Byly vyšetřovány růstové charakteristiky těchto buněčných linií včetně schopnosti tvorby nádorů při injekci do athymických nu/nu myší (tabulka 2). Jako kontroly byly použity následující kontrolní buněčné linie: NIH 3T3 buněčná linie připravená podobným způsobem za použití prázdného transfekčního plasmidu (neo 5-10), nebo dříve popsaná buněčná linie P58-20, která nadměrně exprimuje PKR inhibiční protein p58^I3?K (Barber et al., 1994). Podobně jako P58-20 buněčná linie vykazují NS5A 5C6 buňky přibližně 40% redukci zdvojovacího času a 2,5-3-násobné zvýšení saturační hustoty kultury, ve srovnání s neo 5-10 kontrolou (tabulka 2). Rychlost růstu buněk s nízkou expresí NS5A, NS5A 4A1, se významně nelišila od rychlosti růstu neo 5-10 kontrol. Nicméně, tyto buňky vykazovaly reprodukovatelné 2-násobné zvýšení saturační hustoty kultury, ve srovnání s

4· 4 44 · ·· ·· • · 4· 4444 4444

444 4444 < · * 4 4 444 *4 ·

4 444 4444

4444 444 44 444 44 44 kontrolními kulturami (tabulka 2). Proto podporuje konstitutivní exprese NS5A v NIH 3T3 buňkách dělení buněk v post-konfluentních kulturách a je spojena s vyšší rychlostí růstu buněk. Tyto výsledky byly v souladu s fenotypem maligně transformovaných

P58-20 kontrolních buněk (Barber et al., 1994).

Pro další charakterizaci fenotypu NS5A buněčných linií byla hodnocena schopnost nezakotveného růstu těchto buněk in vitro a schopnost tvorby nádorů u athymických myší. Podobně jako P58-20 kontroly tvořily NS5A 5C6 buňky kolonie při kultivaci na měkkém agaru, se zřetelným 14-násobným zvýšením účinnosti klonování ve srovnání s neo 5-10 buňkami. Růst nezávislý na ukotvení byl také pozorován pro NS5A 4A1 buňky, i když s nižší frekvencí (tabulka 2). Významné je, že obě NS5A buněčné linie tvořily tumory po injekci athymickým myším. NS5A 5C6 buňky agresivně tvořily nádory u 5/5 myší s latencí od 17-25 dnů po injekci buněk. Pozorovaly jsme významně delší latentní periodu tvorby nádorů (22-44 dnů) u maší, kterým byly podány NS5A 4A1 buňky. Myši, kterým byly podány kontrolní P58-20 buňky, vykazovaly agresivní růst nádorů s latencí od 12-20 dnů, což je v souladu s dříve publikovanými výsledky (Barber et al., 1994). Exprese NS5A byla potvrzena v nádorových buňkách získaných z nádorů tvořených NS5A 5C6 (obr.

15) a 4A1 na myších. Kromě toho, předběžné vyšetření těchto buněk ukázalo, že byla významně snížena fosforylace endogenního eIF-2a, což je v souladu s NS5A-zprostředkovanou represí PKR. Tato studie prokázala, že konstitutivní exprese NS5A, odpovídající IFN-resistentním HCV-la, může indukovat deregulaci buněčného růstu a maligní transformaci u NIH-3T3 buněk.

Výsledky naznačují, že NS5A~řízená represe PKR nemá vliv pouze na to, jak odpovídá HCV na terapii IFN, ale že může také přispívat k vzniku malignit spojených s chronickou HCV infekcí. Tak tato zjištění naznačují, že vyšetřovací testy pro identifikaci antivirových činidel, které ihhibují NS5A způsobené narušení dimerizace PKR mohou.také identifikovat činidla, která inhibují vznik malignit spojených s chronickou infekcí HCV.

Bylo citováno mnoho prací, které jsou zde uvedeny jako odkazy ve své úplnosti.

Předkládaný vynález není omezen na uvedená provedení, která jsou míněna pouze jako ilustrace jednotlivých aspektů vynálezu, a funkčně ekvivalentní způsoby a složky spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Odborníkům v oboru budou jasné po prostudování přihlášky a připojených různé modifikace předkládaného vynálezu. Takové modifikace spadají do rozsahu připojených patentových nároků.

♦ · « · · »·· · ·

Tabulka 1: ISDR sekvence a příslušná sensitivita na IFN isogenních NS5A expresních konstruktů

Název®

ISDR sekvence lb-pt P SLKATCTTHHD S PDAD LIEANLLWRQEMGGNITRV

ESEN lb-wt lb-2

-R-----VR/S lb-4

L----A—GRlb-5

L----A—GR-----Vla-wt

-AN·· ·· • 9 9 9

9· 9

9 9 4 • · · *

99

Odpověď Odkaz na IFN^to (Enomoto et al., 1996) (Clements and Zink, 1996) (Enomoto et al., 1996; Zeuzem et al., 1997) (Enomoto et al., 1996) (Gale et al., 1997b) ®pt, HCV-J prototypová referenční sekvence (GenBank™ přírůstkové č. D90208; we, přirozený původní HCV-lb klon (GenBank™ přírůstkové č. AF034151 (pouze NS5A kódující region).

R, resistentní na IFN; S, sensitivní na IFN; R/S, nezávisle popsaný jako sensitivní na IFN v jiných studiích. Fenotyp odpovědi na IFN odpovídající lb-4 nebyl stanoven. Nicméně, podle publikovaných studií (Enomoto et al., 1996; Kurosaki et al.,

1997) předpokládáme, ze tato sekvence je asociována se sensitivitou na IFN.

·· • · · • · · • · 9 φ · Φ • Φ • · φ · ·φ· φφ φ* φφφ · φ ♦ • · φ · φ ·· *«* φφ ΦΦ

Tabulka 2: Růstové charakteristiky buněk exprimuj ích NS5A

Klon“	Zdvojovači	Saturační	Účinnost	Myši S	Latence —
	čas (hod)to	hustota	klonování	nádorem/	(dny)ů
		(buněkxl0 3/cm2)	(%)c	celkem'3
neo5-10	27,6±0,1	l,6±0,l	0	0/5	-
NS5A5C6	17,7+0,6	4,0+0,2	14	5/5	17-25
NS5A4A1	22,4+2,1	3,3±0,1	4	4/5	22-44
P58-20	17,3±1,5	3,7±0,2	15	5/5	12-20

“neo5-10 a P58-20 představují - a + kontrolní buněčné linie, v příslušném pořadí. NS5A 5C6 buňky exprimují NS5A v množství přibližně 5-krát vyšším než NS5A 4A1 buňky.

Buňky byly umístěny v množství přibližně 10^s buněk/55 mm kultivační plotnu v selektivním DMEM obsahujícím 10% fetální hovězí sérum (FBS) a 400 Mg/ml G418. Počet buněk byl stanovován každých 24 hodin a saturační hustota byla určena měřením celkového počtu buněk v kultuře 4. den po dosažení konfluence. Počty jsou uvedeny jako průměry 4 pokusů.

^c5xl0², 5xl0³ nebo 5x1O⁴ buněk bylo suspendováno v 0,35% agar/DMEM roztoku s 20% FBS a byly dvojmo umístěny do 6-jamkových kultivačních ploten obsahujících 0,7% agar/DMEM s 10% FBS. Účinnost klonování byla určena o 14 dní později a je vyjádřena jako procento pozorovaného počtu kolonií/celkovému počtu buněk umístěných na plotně. Kolonie byly definovány jako izolované uskupení 4 nebo více buněk.

^ů4-6 týdnům starým athymickým holým myším (nu/nu (Charles River)) bylo podkožní injekcí do oblasti levé zadní končetiny podáno 2xlO^s buněk v PBS. Myši byly umístěny v mikroizolátorových boxech v bezpatogenním prostředí a byly poozorovány po dobu až 100 dnů. Latence byla definována jako doba ve dnech, po které vznikly nádory o průměru 3 mm.

Tabulka 2: Růstové charakteristiky buněk exprimujích NS5A

Konstrukt	Kódující	Protismyslná	nukleotidy
	sekvence	sekvence
NSSA lb-wt	5'TAAGCTTATGGGCT	S’CAAGCTTGGATCCT	6260-7598
1973-2419	CCGGCTCGTGGCT	TAGGACATTGAGC
NSSA	5'CATATGGGCTCCGG	5'GTCGACCGCAGACA	6260-6965
1973-2208	CTCGTGGCTA	ACTGGCTAGCTGA
NS5A	5'GAATTCCCTTCCTT	5’ATCGGATCCTTATA	6966-7165
2209-2274	GAAGGCAACATGC	CCACCTTATTCTCTGA
NS5A	5'CCTTCCATGGCCCA	5’ATCGGATCCTTATA	6877-7094
2180-2251	CATTACAGCAGAGACG	CCACCTTATTCTCTGA
Konstrukt	Mutagenní primer	Mutace
NS5A lb-2	5’GACTCCCCAGATGTTGACCTCATC	A2224V
NS5A lb-5
NS5A lb-4	5'TTGTCTGCGCTTTCCTTGAAGGCAGCATGCACT	P2209L,
	GGCCGTCACGAC		T2214A,T2217G

^a aminokyselinové a nukleotidové pozice odpovídají

PCR-amplifikovanému regionu. Číslování baží je podle prototypové HCV-J sekvence (Kato et al., 1990).

Podtržené sekvence označují klonovací restrikční místo (popsané v textu).

° Podtržené kodony odpovídají uvedeným aminokyselinovým mutacím.

Claims (14)

1. Έ* a. fc. θ n t θ v θ n a ar o Jc yy

   1. Způsob pro vyhledávání nových antivirových činidel účinných v inhibici aktivity virových proteinů obsahujících region určující sensitivitu na interferon (ISDR) vyznačující se tím, že obsahuje:

   inkubaci směsi obsahující PKR proteinkinasu, virový protein a testované činidlo, a měření aktivity PKR proteinkinasy, a srovnání aktivity PKR proteinkinasy za absence testovaného činidla.
2. 2. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že antivirové činidlo inhibuje replikaci viru hepatitidy C.
3. 3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že virovým proteinem je NS5A.
4. 4. Způsob pro vyšetřování nových antivirových činidel účinných v inhibici přímé interakce mezi virovým proteinem obsahujícím ISDR s interferonem indukovanou PKR proteinkinasou vyznačující se tím, že obsahuje:

   inkubaci směsi obsahující protein obsahující ISDR, PKR proteinkinasu a testované činidlo, a měření vazby proteinu obsahujícího ISDR a PKR proteinu, a srovnání vazby za absence testovaného činidla.
5. 5. Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, že virovým proteinem je NS5A.
6. 6. Způsob podle nároku 4vyznačující se tím, že antivirové činidlo inhibuje replikaci viru hepatitidy C.
7. 7. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že PKR proteinkinasa a protein obsahující ISDR jsou exprimovány ve kvasinkách geneticky upravených pro vyšší expresi reporterového genu za přítomnosti PKR proteinkinasy, který dále obsahuje měření hladiny exprese reporterového genu v přítomnosti a nepřítomnosti testovaného činidla.
8. 8. Způsob podle nároku 7vyznačující se tím, že reportérovy protein je fúsovaný na GCN4/S-gal protein.
9. 9. Kvasinková buňka pro použití v testech pro vyhledávání antivirových činidel, která je geneticky upravena tak, aby exprimovala:

   (a) polypeptid obsahující ISDR region; a (b) interferonem-indukovanou PKR proteinkinasu; a (c) reportérovy gen, jehož exprese je zvýšena v reakci na aktivaci PKR proteinkinasy.
10. 10. Kvasinková buňka podle nároku 9, kde polypeptidem obsahujícím ISDR region je NS5A.
11. 11. Kvasinková buňka podle nároku 10, kde je reporterový gen fúsován na GCN4/S-gal gen.
12. 12. Způsob inhibice replikace viru hepatitidy C (HCV) v buňkách infikovaných HCV vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství činidla, které interferuje s interakcí mezi NS5A a PKR uvedené buňce.
13. 13. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že činidlem je inhibitor NS5A.
14. 14. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že činidlem je protismyslná molekula komplementární k ISDR.