CZ32045U1 - Sada pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu - Google Patents

Description

Oblast techniky

Řešení se týká sady primerů a sond pro PCR detekci virů Little cherry virus 1 (LChV-1) a Little cherry virus 2 (LChV-2) v biologickém materiálu.

Dosavadní stav techniky

Viry Little cherry virus 1 (LChV-1) a Little cherry virus 2 (LChV-2) patří mezi (+)ssRNA viry z čeledi Closteroviridae a jako takové jsou velmi polymorfní s vysokou rozmanitostí nalezených izolátů. Oba viry lze detekovat ve floému a parenchymatických buňkách napadených rostlin.

Viry LChV-1 a LChV-2 jsou původci onemocnění maloplodost třešní, které postihuje produkční výsadby třešní na celém světě. Kromě třešní může LChV-1 napadat i jiné ovocné druhy, např. višně, slivoně, mandloně a broskvoně. Mezi symptomy patří výrazně zmenšená velikost plodů, špatná vybarvenost plodů a nevýrazná chuť, takže plody nemají tržní hodnotu a pěstitelé zaznamenávají výrazné ekonomické ztráty. Pro omezení tohoto onemocnění je tedy nezbytná včasná a přesná diagnostika.

V současnosti se k detekci příslušných virů používají metody PCR, a to jak v klasickém uspořádání s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy (Eastwell, K.C., 1996; Vitushkina, M., 1997; Rott, M.E., 2001; Bajet, N.B., 2008; Rao, W.-L., 2011; Candresse, T., 2013; Zong, X., 2014; Katsiani, A. T., 2015; Glasa, M., 2015; Osman, F., 2015; Ruiz-García, A.B., 2016), tak i real-time PCR založená na použití interkalačního barviva (Jelkmann, W., 2008; Zong, X., 2015). Nevýhodou obou přístupů je obecně nízká specificita, neboť publikované metody nejsou dle výsledků srovnávací analýzy sekvencí z dostupných databází schopny zachytit všechny izoláty příslušných virů. Další nevýhodou je nutnost separátní PCR reakce pro každý virus zvlášť, což analýzu prodlužuje a prodražuje.

Podstata technického řešení

Nevýhodu nízké specificity a nutnosti provádět individuální PCR reakce pro detekci viru LChV-1 a LChV-2 odstraňuje sada primerů a sond pro PCR detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu podle technického řešení, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsou

Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)

Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)

Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4)

Sonda 2: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), kde hybridizační sondy jsou označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce, přičemž pro PCR detekci viru LChV-1 obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou

Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)

Sonda: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4) a pro PCR detekci viru LChV-2 obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou

Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)

Sonda: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7).

Výše uvedené sady primerů a sond jsou vhodné pro současnou nebo individuální kvalitativní nebo kvantitativní detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu s vysokou specifickou metodou založenou na metodě PCR. Metodou PCR se rozumí klasické uspořádaní PCR reakce s detekcí amplikonů pomocí gelové elektroforézy nebo digitální PCR nebo real-time PCR využívající k detekci interkalační barviva nebo různě značené hybridizační sondy podle technického řešení a další varianty metody PCR známé odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení technického řešení je PCR produkt detekován v reálném čase pomocí real-time PCR, a ještě výhodněji pomocí značených hybridizacních sond. V jedné PCR reakci je tak možné stanovit konkrétní virus, který je zodpovědný za vznik onemocnění.

Hybridizační sondy mohou být pro účely jejich detekce značeny fluorescenčně, radioaktivně, neradioaktivně nebo dalšími způsoby známými odborníkovi v oboru. Ve výhodném provedení technického řešení jsou hybridizační sondy pro detekci jednotlivých virů značeny fluorescenčně, a ještě výhodněji pomocí odlišných fluoroforů pro jejich současnou detekci vjedné PCR reakci.

Návrh sad primerů a hybridizacních sond podle technického řešení pro detekci virů LChV-1 a LChV-2 byl proveden v několika krocích: 1) Analýza sekvencí dostupných izolátů těchto virů; 2) Porovnání specificky detekce těchto izolátů s primery z dosavadního stavu techniky; 3) Návrh sad primerů a hybridizačních sond pro detekci virů LChV-1 a LChV-2.

Detekce virů LChV-1 a LChV-2 může být dle provedení technického řešení provedena v jakémkoliv rostlinném materiálu, s výhodou je rostlinný materiál floém a parenchymatické buňky.

Prvním krokem detekce virů LChV-1 a LChV-2 způsobujících maloplodost třešní v rostlinném materiálu je izolace celkové RNA a její přepis na cDNA pomocí RNA-dependentní DNA polymerázy a sady náhodných primerů metodami známými v oboru.

Vytvořená cDNA je následně analyzována na přítomnost nukleové kyseliny virů LChV-1 a LChV-2 metodou PCR sadami primerů a hybridizačních sond podle technického řešení.

Příklady provedení technického řešení jsou zde uvedeny pouze pro ilustraci a žádným způsobem neomezují rozsah této přihlášky, která je vymezena připojenými nároky a podrobně popsána v popisu technického řešení. Odborník v oboru bude schopen učinit různé modifikace použitého způsobu PCR a uvedených primerů tak, aby nedošlo ke snížení specificky PCR detekce. Modifikací primerů se rozumí zejména zkrácení nebo prodloužení na 3‘ a/nebo 5‘ konci nebo záměna nukleotidů nebo kombinace těchto modifikací, které zachovávají alespoň 80% identitu k uvedeným sekvencím.

Příklady uskutečnění technického řešení

Příklad 1: Návrh sekvencí primerů a sond

Sekvence různých izolátů virů LChV-1 a LChV-2 byly získány z databáze sekvencí GenBank. Pro analýzu variability sekvencí byla použita metoda multiple alignment v programu ClustalW. Specifická primerů dle dosavadního stavu techniky byla stanovena jejich namapováním na uspořádané sekvence a zhodnocením konzervovanosti cílových úseků. Pro navržení sad primerů a hybridizačních sond byly použity konzervované oblasti genomu virů vykazující nejvyšší sekvenční homologii napříč všemi izoláty.

Primery a hybridizační sondy byly navrženy pomocí programu Vector NTI Advance.

Příklad 2; Simplexová kvalitativní detekce viru LChV-1 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádání

Pro detekci viru LChV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných příměrů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:

Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru LChV-1 byl identifikován proužek o velikosti 84 bp.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-1.

Příklad 3: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru LChV-1 v biologickém materiálu metodou real-time PCR

Pro detekci viru LChV-1 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru LChV-1 použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCRBlue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium), V reakci byly použity tyto primery:

Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-1.

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru LChV-1 použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCE; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 400 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:

Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ Π) NO. 1)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)

Sonda: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-1.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru LChV-1 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy LChV-1 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru LChV-1 ve vzorku.

Příklad 4: Simplexová kvalitativní detekce viru LChV-2 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádání

Pro detekci viru LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:

Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U pozitivních vzorků na přítomnost viru LChV-2 byl identifikován proužek o velikosti 149 bp.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-2.

Příklad 5: Simplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru LChV-2 v biologickém materiálu metodou real-time PCR

Pro detekci viru LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru LChV-2 použito interkalační barvivo s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCRBluereakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCb; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; lx EvaGreen (Biotium). V reakci byly použity tyto primery:

Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v HRM kanálu.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny melting analýzou s určením charakteristické křivky tání specifických PCR amplikonů a přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním jejich sekvence s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-2.

V ještě výhodnějším provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci viru LChV-2 použito fluorescenčně značené hybridizační sondy s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM příměry každý; 400 nM sonda. V reakci byly použity tyto primery a sonda:

Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)

Sonda: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.

Pozitivní nálezy získané pomocí real-time PCR byly ověřeny přímým sekvenováním PCR amplikonů a porovnáním s databází sekvencí. Ve všech případech byl potvrzen výskyt viru LChV-2.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost viru LChV-2 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy LChV-2 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Kalibrační křivka byla u pozitivních vzorků použita pro stanovení koncentrace viru LChV-2 ve vzorku.

Příklad 6: Současná multiplexová kvalitativní detekce virů LChV-1 a/nebo LChV-2 v biologickém materiálu metodou PCR v klasickém uspořádání

Pro současnou detekci viru LChV-1 a/nebo LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro PCR reakci s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý. V reakci byly použity tyto primery:

Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)

Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6).

PCR amplifikace probíhala v PCR cykleru Cl000 (Biorad) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s.

Po ukončení reakce byly výsledné PCR amplikony analyzovány elektroforeticky na 3% agarózovém gelu. U vzorků pozitivních na přítomnost viru LChV-1 byl identifikován proužek o velikosti 84 bp; u vzorků pozitivních na přítomnost viru LChV-2 byl identifikován proužek o velikosti 149 bp; u dvojitě pozitivních vzorků na přítomnost virů LChV-1 a LChV-2 byly identifikovány oba příslušné proužky.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR v tomto uspořádání byly porovnány s výsledky ze simplexových detekcí viru LChV-1 a LChV-2, které již byly sekvenačně ověřeny. Ve všech případech nálezy ze současné detekce obou virů v jedné PCR reakci souhlasily s výsledky ze simplexových reakcí.

Příklad 7: Současná multiplexová kvalitativní a kvantitativní detekce viru LChV-1 a/nebo LChV-2 v biologickém materiálu metodou real-time PCR

Pro detekci virů LChV-1 a/nebo LChV-2 byla z infikovaných rostlin izolována celková RNA pomocí soupravy Ribospin™ Plant (GeneAll). Izolovaná RNA byla použita pro přípravu cDNA s využitím náhodných primerů (Roche) a M-MLV Reverse Transcriptase (Invitrogen). Připravená cDNA byla použita jako templát pro real-time PCR reakci.

Ve výhodném provedení technického řešení je pro real-time PCR detekci virů LChV-1 a/nebo LChV-2 použito odlišně fluorescenčně značených hybridizačních sond specifických pro příslušný virus s následujícími reakčními podmínkami: 2 μΐ cDNA; lx PCR Blue reakční pufr (Top-Bio); 2,5 mM MgCh; 200 μΜ dNTP každý; 1U Combi Taq DNA polymeráza (Top-Bio); 500 nM primery každý; 400 nM každá sonda. V reakci byly použity tyto příměry a sonda:

Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Forward primer 2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)

Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)

Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4)

Sonda 2: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7).

Real-time PCR reakce probíhala v zařízení Rotor-Gene Q (Qiagen) s následujícím teplotním profilem: 94 °C/5 minut; cyklování 94 °C/20 s, 58 °C/20 s, 72 °C/20 s, s odečtem fluorescence v příslušném kanálu podle typu značení sondy.

Pozitivní nálezy získané pomocí PCR v tomto uspořádání byly porovnány s výsledky ze simplexových detekcí viru LChV-1 a LChV-2, které již byly sekvenačně ověřeny. Ve všech případech nálezy ze současné detekce obou virů v jedné PCR reakci souhlasily s výsledky ze simplexových reakcí.

Ve výhodném provedení technického řešení byla přítomnost virů LChV-1 a/nebo LChV-2 stanovena kvantitativně. Do real-time PCR běhu byly přidány čtyři standardy LChV-1 a LChV-2 o známé koncentraci v desítkovém ředění pro sestrojení kalibrační křivky. Koncentrace virů LChV-1 a LChV-2 u pozitivních vzorků byla stanovena podle příslušné kalibrační křivky.

Průmyslová využitelnost

Nové sady primerů a hybridizačních sond pro detekcí viru LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu metodou PCR oproti dosavadnímu stavu techniky odstraňují problém falešně negativních vzorků, kdy primery dle dosavadního stavu techniky nemusí umožňovat detekci všech známých izolátů těchto virů. Dále byly navržené primery a hybridizační sondy optimalizovány pro použití v sadě pro současnou detekci obou virů v jedné PCR reakci. Nové sady primerů a hybridizačních sond tedy zrychlují, zpřesňují a zlevňují diagnostiku onemocnění maloplodost třešní, které je způsobeno viry LChV-1 a LChV-2.

Seznam použité literatury:

Bajet, N.B., Unruh, T.R., Druffel, K.L. et al., Occurrence of Two Little Cherry Viruses in Sweet Cherry in Washington Statě. Plant Dis. (2008) 92:234-238.

Candresse, T., Marais, A., Faure, C. et al. Association of Little cherry virus 1 (LChVl) with the Shirofugen Stunt Disease and characterization of the genome of a dívergent LChVl isolate. Phytopathology (2013) 103(3):293-298.

Eastwell, K.C., Bernardy, M.G. Association of high molecular weight double-stranded RNA with little cherry disease. Canadian Joumal of Plant Pathology (1996) 18(3):203-208.

Glasa, M., Benediková, D., Predajňa, L. First report of Little cherry virus-1 in Slovakia. Joumal of Plant Pathology (2015) 97(3):542.

Jelkmann, W., Leible, S. and Rott, M. Little cherry closteroviruses-1 and -2, their genetic variability and detection by real-time-PCR. Acta Hort. (ISHS) (2008) 781:321-330.

Katsiani, A. T., Maliogka, V. I., Amoutzias, G. D. et al. Insights into the genetic diversity and evolution of Little cherry virus 1. Plant Pathology (2015) 64(4):817-824.

Osman, F., Al Rwahnih, M., Golino, D. et al. Evaluation of the phytosanitary status of the prunus species in the national clonal germplasm repository in Califomia: survey of viruses and viroids. Joumal of Plant Pathology (2015) 94(1):249-253.

Rao, W.-L., Li, F., Zuo, R.-J. First report of Little cherry virus 2 in flowering and aweet cherry trees in China. Plant Disease (2011) 95(11):1484.

Rott, M.E., Jelkmann W. Detection andpartial characterization of a second closterovirus associated with Little Cherry Disease, Little cherry virus-2. Phytopathology (2001) 91(3):261-267.

Ruiz-García, A.B., Martínez, C., Santiago, R. et al. First report of Little cherry virus 1 (LChV-1) in sweet cherry in Spain. Plant Disease (2016) 100(11):2340.

Vitushkina, M., Fechtner, B., Agranovsky, A. et al. Development of an RT-PCR for the detection of little cherry virus and characterization of some isolates occurring in Europe. European Joumal ofPlant Pathology (1997) 103(9): 803-808.

Zong, X., Wang, W., Wei, H. et al. A multiplex RT-PCR assay for simultaneous detection of four viruses from sweet cherry. Scientia Horticulturae (2014) 187:118-122.

Zong, X., Wang, W., Wei, H. et al. Incidence of sweet cherry viruses in shandong province, china and a čase study on multiple infection with five viruses. Joumal of Plant Pathology (2015) 97(1):61-68.

NÁROKY NA OCHRANU

Claims (7)

1. Sada primerů a sond pro současnou PCR detekci virů LChV-1 a LChV-2 v biologickém materiálu, vyznačující se tím, že obsahuje primery a značené hybridizační sondy, jejichž sekvence jsou

Forward primer 1: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Forward primer

2: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO. 5)

Reverse primer 1; TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO.

3)

Reverse primer 3: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO. 6)

Sonda 1: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO.

4)

Sonda 2: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO. 7), kde hybridizační sondy jsou označeny pro jejich současnou detekci v průběhu PCR reakce, přičemž pro PCR detekci viru LChV-1 obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou

Forward primer: GCYACTGATACTGATACGTCTAGCTCG (SEQ ID NO. 1)

Reverse primer 1: TTTCTCCTACCGCGACGTGG (SEQ ID NO. 2)

Reverse primer 2: CTAATTTCTTCTACCTCGACGTGG (SEQ ID NO. 3)

Sonda: AATACTTGCGAAACATGAAGAGCTCC (SEQ ID NO. 4) a pro PCR detekci viru LChV-2 obsahuje sada primery a značenou hybridizační sondu, jejichž sekvence jsou

Forward primer: TCTTTAAGTTGAGTTTGGAGYTGGG (SEQ ID NO.

5)

Reverse primer: CACACGCCCCAACTTCGTCAC (SEQ ID NO.

6)

Sonda: CACCTGTTGCAACTCCATACTTTTGTAG (SEQ ID NO.

7).